CZ425198A3

CZ425198A3 - Použití oxidované celulosy a jejích komplexů pro hojení chronických ran

Info

Publication number: CZ425198A3
Application number: CZ984251A
Authority: CZ
Inventors: Paul William Watt; Wilson Harvey; Elaine Lorimer; David Wiseman
Original assignee: Johnson & Johnson Medical Limited
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 1999-05-12
Also published as: EP0918548A1; ES2287406T3; DE69724257D1; EP0918548B1; CA2258990C; PT918548E; DE69737741D1; GB2314842A; DE69737741T2; BR9710177A; GB9613682D0; ATE362381T1; EP1325754B1; KR20000022287A; ATE247493T1; JP2000513258A; CA2258990A1; GB2314842B; JP4401438B2; DE69724257T2

Description

Použití oxidované celulosy a jejích komplexů pro hoj ení_A taný

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití oxidované celulosy a jejích komplexů se strukturálními proteiny jako je kolagen pro chronické hojení ran.

Dosavadní stav techniky

Oxidovaná celulosa je produkována oxidací celulosy, například s oxidem dusičitým. Tento proces přeměňuje primární alkoholové skupiny na sacharidových zbytcích na karboxylové skupiny, za tvorby zbytků kyseliny uronové v řetězci celulosy. Oxidace neprobíhá s úplnou selektivitou a v důsledku toho jsou občas hydroxylové skupiny na uhlíku 2 a 3 přeměněny na keto formy. Tyto ketonové jednotky způsobují vazbu labilní v alkalickém prostředí, které při pH 7 nebo vyšším způsobují rozklad polymeru tvorbou štěpením laktonového a cukerného kruhu. V důsledku toho je oxidovaná celulosa biodegradovatelná a bioabsorbovatelná za fyziologických podmínek.

Výhodnou oxidovanou celulosou pro praktické použití je oxidovaná regenerovaná celulosa (ORC) připravená oxidací regenerované celulosy, jako je umělé hedvábí. Po nějakou dobu je známo, že ORC má hemostyptické vlastnosti. ORC je dostupná jako hemostyptický produkt nazývaný SURGICEL (registrovaná obchodní známka od Johnson & Johnson Medical, lne.) od roku 1950. Tento výrobek je produkován oxidací pleteného umělého hedvábí.

• ·

Modifikace poréznosti, hustoty a charakteru pletení vedlo k výrobě druhé ORC tkaniny, INTERCEED {registrovaná obchodní známka - Johnson & Johnson Medical, lne.), u které bylo prokázáno, že redukuje rozsah post-chirurgických adhesí při břišním chirurgickém zákroku.

US-A-2517772 (Doub et al.) popisuje zlepšené hemostyptické materiály získané impregnací ORC tkaniny trombinem.

EP-A-0437095 popisuje neutralizovaný ORC materiál připravený kontaktem syntetizovaného kyselého ORC materiálu s roztokem zásadité soli slabé organické kyseliny, jako je octan sodný. Vzniklý neutralizovaný produkt je určen pro hemostasu a prevenci adhesí.

Kolagen, který je strukturálním proteinem živočišného původu, je v různých formách známý jako materiál pro krytí ran.

GB-A-1515963 popisuje zesíčované kolagen-mukopolysacharidové kompozitní materiály pro použití v lékařských a chirurgických aplikacích, cévních štěpech a všech formách chirurgických náhrad. Kompozitní materiál obsahuje alespoň 0,5% hmotnosti mukopolysacharidu, který je ireversibilně vázán na kolagen. Mukopolysacharid je živočišný polysacharid obsahující hexosaminové zbytky, jako je kyselina hyáluronová, chondroitinsulfat nebo heparinsulfat. Uvádí se, že kompozitní materiály vykazují vyšší resistenci na resorpci a lepší kompatibilitu s krví než pouze kolagenové, materiály.

US-A-4614794 popisuje komplexy tvořené mezi kolagenem a polyaniontovými rostlinnými poiysacharidy jako je alginat * · · · • 0 · «4 • 0 · « sodný. Komplexy jsou výhodně tvořeny kombinováním proteinů a polysacharidu při pH, které není vyšší než izoelektrický bod proteinu. Uvádí se, še vzniklé komplexy jsou vhodné pro různé .lékařské a chirurgické aplikace, včetně krytí ran. Není zde popsáno použití oxidované celulosy místo polyaniontového rostlinného polysacharidu. Přihláška také uvádí, že mohou být použity jiné proteiny než kolagen, jako je fibrin nebo elastin, při tvorbě použitelných komplexů protein/polysacharid.

GB-A-2280850 popisuje implantáty s léčivou přísadou pro léčbu onemocnění periodontu obsahující kolagenový film s léčivou přísadou obohacený o vrstvu bioresorbovatelného polymeru, kterým může být ORC. Kolagenová matrice může obsahovat rozložená ORC vlákna nebo fragmenty.

EP-A-0177064 popisuje použití pletené tkaniny z oxidované celulosy jako chirurgického hemostyptika.

EP-A-0562826 popisuje bioabsorbovatelné houbovité materiály pro použití jako implantáty do ran. Tyto materiály obsahují kolagenní houbovitou matrici mající orientovanou substrukturu. Matrice a/nebo substruktury mohou obsahovat oxidovanou regenerovanou celulosu. Není zde popsáno použití takových materiálů pro léčbu chronických ran.

GB-A-1006606 popisuje hemostyptické krytí ran obsahující krystalické agregáty oxidované celulosy v gelové matrici. Je popsáno použití takových hemostyptických gelů v chirurgii. . .

Výše uvedené kolagenové nebo kolagen/polysacharidové materiály pro krytí ran mají významné výhody. Materiály jsou íf • »* · · přirozeného, biologického původu (ačkoliv jsou někdy chemicky modifikované), a proto mají tendenci být málo ántigenní. Materiály jsou obecně bioabsorbovatelné, což redukuje trauma spojené s odstraněním běžného materiálu pro krytí.ran z povrchu rány. Kromě toho, některé z těchto materiálů mohou mít pozitivní terapeutický účinek na hojení rány. Například, některé živočišné polysacharidy jako je kyselina hyaluronová vykazují chemotaktický efekt na buňky spojené s hojením ran jako jsou fibroblasty, a tak podporují růst a vývoj takových buněk. Nicméně, stále existuje potřeba vylepšených materiálů pro krytí ran tohoto obecného typu, které by vykazovaly ještě lepší kontrolu fyzikálních charakteristik a rychlosti biologické absorpce, ještě lepší terapeutický účinek na hojení ran a které by byly levnější.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu jsou materiály pro krytí ran u savců, a zejména u lidí, pro krytí chronických ran jako jsou žilní ulcerace, proleženiny a diabetické ulcerace. Takové chronické defekty obecně vykazují slabé nebo žádné krvácení nebo adhesi k jiným tělesným tkáním, a proto nebyla oxidovaná celulosa dříve indikována pro léčbu takových ran.

Nyní bylo zjištěno, že oxidovaná celulosa je účinným krycím materiálem pro léčbu chronických ran.

. .V souladu s tím .předkládaný vynález poskytuje použití oxidované celulosy pro přípravu materiálu pro krytí ran pro léčbu chronických ran.

·· · · «

Oxidovaná celulosa je výhodně oxidovaná regenerovaná celulosa (ORC). Výhodně je oxidovaná celulosa ve formě tkané, netkané nebo pletené vláknité hmoty, která je nerozpustná v .tekutině přítomné v ranách. Například, oxidovaná celulosa může být ve formě jedno z výrobků SURGICEL (RTM) nebo INTERCEED (RTM), které jsou v oboru známé. V jiných výhodných provedeních je oxidovaná celulosa ve formě vláken, jako jsou mletá vlákna, nebo prášku, výhodně rozptýleného ve vhodném vehikulu pro lokální podání.

Výhodně má oxidovaná celulosa průměrnou molekulovou hmotnost vyšší než 50000. Taková oxidovaná celulosa je v podstatě nerozpustná v kapalině přítomné v ranách, ale podléhá velmi postupné přeměně na bioresorbovatelné fragmenty při fyziologickém pH.

Výhodně není oxidovaná celulosa neutralizovaná. Nicméně, předkládaný vynález obsahuje použití částečně nebo zcela neutralizovaných materiálů, jak jsou popsány v EP-A-0437095 pro přípravu léčiv pro léčbu chronických ran, jak zde byly definovány.

. Výhodně je oxidovaná celulosa v uvedeném materiálu pro krytí ran komplexu se strukturálním proteinem.

Výhodně tvoří protein (kde je přítomen) a oxidovaná celulosa dohromady více než 75% hmotnosti materiálu pro krytí ran, lépe více než 90% hmotnosti materiálu. Jiné složky materiálu mohou obsahovat 0 - 25% hmotnosti jednoho nebo více jiných biokompatibilních pólysacharidů, například alginatů jako je alginat sodný nebo alginat vápenatý, derivátů škrobu jako je

• ··	0 · 0	00 »0
00 0 «	0	•	• 9	« 0 «	0
					0
0	• ·	•	9	0 000 9·	0
φ 0 00 0 ··	0 9 9	*	0 00 0	0 99 00	9

glykolát sodný škrobu, derivátů celulosy jako je methylcelulosa nebo karboxymethylcelulosa, nebo glykosaminoglykanů jako je kyselina hyaluronová nebo její soli, chondroitinsulfat nebo heparinsulfat. Materiál může také obsahovat více než 20% hmotnosti, lépe více než 10% hmotnosti vody. Materiál může také obsahovat 0-40% hmotnosti, lépe 0-20% hmotnosti změkčujícího činidla, výhodně polyhrického alkoholu jako je glycerol.

Materiál může také obsahovat 0-10% hmotnosti, lépe 0-5% hmotnosti jednoho nebo více terapeutických činidel pro hojení ran, jako jsou nesteroidní protizánětlivá léčiva, například .acetaminofen, steroidy, antibiotika (například peniciliny nebo streptomyciny), antiseptika (například sulfadiazin stříbrný nebo chlorhexidin) nebo růstové faktory (například fibroblastový růstový faktor nebo růstový faktor odvozený od destiček).

Výhodně je poměr hmotnosti proteinu k oxidované celulose od 1:99 do 99,99:1. Lépe je poměr hmotnosti v rozmezí 1:10 až 99,9:1, ještě lépe v rozmezí 2:1 až 95:1.

Materiál podle předkládaného vynálezu může být v jakékoliv vhodné formě, jako je prášek, mikrosféry, vločky, pruhy nebo film. Nicméně, výhodně je materiál podle předkládaného vynálezu ve formě semisolidní nebo gelové masti pro lokální aplikaci nebo ve formě lyofilizovaného materiálu nebo ve formě houbovitého materiálu získaného vysušením rozpouštědla.

V souladu s tím předkládaný vynález také poskytuje sterilně balenou semisolidní nebo gelovou mast pro lokální aplikaci na chronické rány, kde uvedená mast obsahuje od 0,05% do 50% hmot./obj. oxidované celulosy.

4« ·* 4 44 4 4

4 4 4 4 44 · 4 · • 44 44 4 4444

44«4· 4 4 4 ·♦· 444 « 4 4 4 4 4

444 44 44 444 44 4·

Výhodně mast obsahuje od 0,1% do 20% hmot./obj., lépe od 1% do 10% hmot./obj. oxidované celulosy ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Vhodné nosiče zahrnují: hydrogely .obsahující deriváty celulosy, včetně hydroxyethylcelulosy, hydroxymethylcelulosy, karboxymethylcelulosy, hydroxypropylmethylcelulosy a jejich směsí; a hydrogely obsahující kyselinu polyakrylovou (Carbopoly). Vhodné nosiče také zahrnují krémy/masti používané pro farmaceutické prostředky pro lokální podání, například krémy založené na cetomakrogolové emulgaČní masti. Výše uvedené nosiče mohou obsahovat alginat (jako zahušúovačí činidlo nebo stimulans), konzervační činidla jako je benzylalkohol, pufry pro kontrolu pH jako je hydrofosforeČnan sodný/dihydrofosforečnan sodný, činidla upravující osmolaritu jako je chlorid sodný a stabilizační Činidla jako je EDTA.

Výhodně je oxidovaná celulosa v masti v komplexu s proteinem, jak je zde popsáno.

Předkládaný vynález dále poskytuje lyofilizované nebo rozpouštědlem-vysušené bioabsorbovatelné houbovité materiály pro aplikace na chronické rány, kde tampon obsahuje od 0,1% do 50% hmot./hmot. oxidované celulosy a od 50% do 99,9% hmot./hmot. jednoho nebo více strukturálních proteinů. Výhodně je průměrná velikost pórů tamponu v rozmezí 10 - 500 μιη, lépe okolo 100 - 300 μιη.

Vhodné proteiny pro tvorbu komplexů s oxidovanou celulosou podle předkládaného vynálezu zahrnují strukturální proteiny jako je fibronektin, fibrin, laminin, elastin a kolagen.

Výhodně je proteinem kolagen, a ještě lépe je složen v podstatě

0 0

•	00		• 0	0	0 0
0 0	0	0	0	0 0	* 0 0
0	000	0 ·	0	0 0	0 0 0
0 0 ·· 00	0	0 00	0 0 0 0	00

jen z kolagenu. Kolagen může být z*ískán z jakéhokoliv přirozeného zdroje, včetně mikrobiologických zdrojů, ale výhodně je kolagen získán z hovězí kůže, která byla v .podstatě zbavena nekolageních složek, například tuku, nekolageních proteinů, polysacharidů a jiných uhlovodíků, jak je popsáno v US patentech č. 4614794 a 4320201, jejichž obsah je zde uveden jako odkaz ve své celistvosti. Kolagenem může být kolagen typu I, II nebo III, nebo jím může být také chemicky modifikovaný kolagen, například atelokolagen získaný odstraněním imunogenních telopeptidů z přirozeného kolagenu. Kolagen může také obsahovat solubilizovaný kolagen nebo rozpustné fragmenty kolagenu mající molekulovou hmotnost v rozmezí od 5000 do 100000, výhodně 5000 - 50000, které jsou získány ošetřením přirozeného kolagenu pepsinem, které je v oboru známé.

Výhodně obsahuje oxidovaná celulosa oxidovanou regenerovanou celulosu (ORC). Oxidovaná regenerovaná celulosa (ORC) může být získána způsobem popsaným v US patentu č. 3122479, jehož celý obsah je zde uveden jako odkaz. Tento materiál nabízí mnoho výhod včetně toho, že je biokompatibílní, biodegradovatelný, neimunogenní a snadno komerčně dostupný. ORC je dostupná s různým stupněm oxidace a proto s různou rychlostí degradace.

ORC může být pouyžita ve formě nerozpustných vláken, včetně tkaných nebo netkaných nebo pletených produktů. V jiném výhodném provedení je ORC ve formě fragmentů o nízké molekulové hmotnosti rozpustných ve vodě, které jsou získány alkalickou hydrolýzou ORC. .... ......

Snadná dostupnost kolagenu i ORC majících škálu kontrolovatelných vlastností znamená, že vlastnosti materiálů

« ·* 9 9?	9*	9 • 9	♦ 9 • 9 9
•	*
• · 9 ·	• 9	9	9	* · 9 ·
< 9	9	9	9	«
• 9 9«		9*	• »·	• ·

použitých v předkládaném vynálezu mohou být kontrolovány výnikajícím způsobem. Konkrétně může být kontrolována rychlost biologické absorpce, poréznost a hustota materiálů.

Překvapivě bylo také zjištěno, že komplexy protein/oxidovaná celulosa použité ve výhodném aspektu předkládaného vynálezu mají výbornou schopnost vazby růstových faktorů, zejména růstového faktoru odvozeného od destiček. V souladu s tím také předkládaný vynález poskytuje použití oxidované celulosy nebo jejích komplexů se strukturálními proteiny pro vazbu jednoho nebo více růstových faktorů. Výhodně je buněčným růstovým faktorem růstový faktor odvozený od destiček (PDGF).

Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro separaci buněčných růstových faktorů z biologického vzorku nebo organismu, kde uvedený způsob obsahuje:

(i) uvedení biologického vzorku nebo organismu do kontaktu s materiálem obsahujícím oxidovanou celulosu nebo její komplex se strukturálním proteinem jak je zde definován, kdy kontakt je proveden in vivo nebo in vitro, pro vazbu růstových faktorů na materiál; a (ii) odběr navázaných růstových faktorů z materiálu.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro přípravu aktivního materiálu pro krytí ran, který obsahuje kroky:

(i) uvedení oxidované celulosy nebo jejího komplexu se strukturálním proteinem, jak je zde definován, do kontaktu s biologickým mediem obsahujícím buněčné růstové faktory pro ·>.)

· · · · · · • 4 ·· ·· vazbu buněčných růstových faktorů na materiál;

(ii) promytí a sušení materiálu majícího na sebe navázané růstové faktory za vzniku uvedeného aktivního materiálu pro krytí ran. Výhodně je buněčným růstovým faktorem růstový faktor odvozený od destiček.

V jiném aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob pro léčbu chronických ran u savců, jako jsou například proleženiny, vředy při žilní insuficienci nebo diabetické vředy. Způsob obsahuje aplikaci krycího materiálu obsahujícího oxidovanou celulosu nebo její komplex se strukturálním proteinem, jak je zde definován, na ránu.

Výhodně je oxidovaná celulosa aplikována na chronickou ránu na dobu alespoň 1 hodiny, lépe alespoň 6 hodin a nejlépe alespoň.12 hodin. Léčba oxidovanou celulosou může být prodloužena na několik dnů nebo týdnů pro léčbu chronických ran, s výměnou přípravku s oxidovanou celulosou, pokud je vhodná. Toto kontrastuje s hemostyptickou aplikací ORC, která typicky trvá pouze několik sekund nebo minut.

Bez vazby nma jakoukoliv určitou teorii se soudí, že oxidovaná celulosa a její komplexy podporují hojení chronických ran alespoň některým z následujících způsobů. Za prvé, oxidovaná celulosa váže růstové faktory jako je PDGF, EGF a FGF a tak udržuje tyto růstové faktory v místě rány. Jinak mají tyto faktory tendenci k odplavování z rány exsudatem. Postupný rozklad oxidované celulosy při fyziologickém pH vede k . postupnému uvolňování růstových faktorů zpět do rány. Druhým důvodem je, že oxidovaná celulosa je plně bioresorbovatelná a fyziologicky přijatelná. Třetím důvodem může být, že

• «4	• 4	«	• • 4	4 4 4 4 • 4 4 4
•· « ·	4

» ···	» 4		4	• 4	444 4*4
4 >	•		1	4	» 4
• 44 44		»4		4 44	·« · «

oligosacharidové fragmenty produkované při rozkladu oxidované celulosy in vivo sami o sobě podporují hojení chronických ran.

Výhodně je chronická rána vybrána ze skupiny skládající se z vředů při žilní insuficienci, proleženin a diabetických vředů. Výhodně chronická rána krvácí minimálně nebo nekrvácí vůbec. Termín chronická rána nezahrnuje poruchy nebo onemocnění periodontu.

Komplexy protein/oxidovaná celulosa podle předkládaného vynálezu mohou být vyrobeny procesem obsahujícím kroky: získání vodné disperse proteinu; ponořením nebo disperzí oxidované celulosy do vodné disperze; potom odstraněním vody z vodné disperze za zisku materiálu obsahujícího protein v komplexu s oxidovanou regenerovanou celulosou.

Volitelně jsou další složky v materiálech podle předkládaného vynálezu výhodně zapracovány do vodné disperze před odstraněním vody z vodné disperze.

Výhodně je pH disperze upraveno na pH 3 - 4,5. Toto rozmezí pH je menší než izoelektrické pH kolagenu.

Voda může být odstraněna z vodné disperze odpařením, například odpařením z disperze za zisku filmu materiálu.

Nicméně, výhodně je voda odstraněna sublimací ze zmraženého stavu (lyofilizaci) nebo vysušením rozpouštědla za zisku materiálu- v houbovité formě. Výhodně- obsahuje vodná disperze 5-30 mg/ml kolagenu. Výhodně je kolagenový houbovitý materiál vyroben lyofilizaci v podstatě tak, jak je popsáno v US-A-2157224.

• ·

Výhodně proces dále obsahuje ošetření proteinu a polysacharidu v disperzi, nebo v suchém materiálu, zesilujícím činidlem, jako je karbodiimid, hexamethylendiisokyanat (HMDI) nebo glutaraldehyd. Alternativně může být zesíťování provedeno dehydrotermálně. Způsob zesítění může významně ovlivnit konečný produkt. Například, HMDI zesíťuje primární aminoskupiny na proteinu v komplexu, zatímco karbodiimid zesíťuje uhlovodany na ORC vazbou na primární amino skupiny na proteinu.

Oxidovaná celulosa může být přidána do vodné disperze proteinu've formě'suspenze nebo roztoku oxidované celulosy, výhodně s přibližně stejným pH jako má roztok kolagenu, a potom následuje míšení nebo homogenizace. Alternativně mohou být suchá vlákna nebo tkanina oxidované celulosy ponořeny do vodné disperze kolagenu.

Specifická provedení předkládaného vynálezu budou nyní popsána podrobněji, pomocí příkladů, s odkazem na připojené výkresy, kde:

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 ukazuje graf růstu fibroblastů (v arbitrážních jednotkách) na sérem ošetřených filmech skádajících se z (a) pepsinem solubilizovaného kolagenu, (b) pepsinem solubilizovaného kolagenu v komplexu s ORC fragmenty majícími průměrnou molekulovou hmotnost 8000, (c) pepsinem solubilizovaného kolagenu v· komplexu s ORC fragmenty majícími průměrnou molekulovou hmotnost přibližně 20000, a (d)pepsinem solubilizovaného kolagenu v komplexu s heparinsulfatem (pro srovnání);

I • fcfc

Obrázek 2 ukazuje graf procentuální vazby růstového faktoru odvozeného od destiček (PDGF) na následující materiály: (a) plastics, (b) kolagenní houbovitý materiál, (c) kolagenní/solubilizovaná ORC houbovitý materiál, (d) INTERCEED (RTM) ORC, a snadnost odstranění tohoto růstového faktoru z těchto materiálů; a

Obrázek 3 ukazuje graf relativního množství MMP vazby měřené pro kolagenní houbovitý materiál a SURGICEL (RTM) ORC tkaninu (srovnávací měření) pro houbovitý materiál z kolagenu v komplexu s 10%, 20% a 30% (hmot.) vláknité ORC.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava houbovitého materiálu z kolagenu/vláknité ORC

Lyofilizovaný kolagen, připravený podle US patent č. 4614794 a 4320201, se resuspenduje v chladné 0,05 M kyselině octové v koncentraci 10 mg/ml. Mletý ORC prášek (mletá Surgicel^Rtkanina) se přidá do suspense v poměru 1:3 ORC:kolagenu a homogenizuje se za použití Waring Blendor při nízké rychlosti po dobu 3 x 30 s. Suspenze komplexu se odplynuje ve vakuu v průběhu 10 minut a potom se nalije ve vrstvě 3 mm a rychle se zmrazí. Zmrazená suspenze se potom buď suší sublimací ze zmraženého stavu a dehydrotermálně zesíúuje za použití programovatelného Edwards lyofilizátoru s vybavením pro zvyšování teploty, nebo-se suší za použití procesu vysušení rozpouštědla jak je popsáno v US-A-2157524.

i

99·

V ·« ·· • · « * « « * I · · » b · · · « « K b · b I «· · i« ·«

9 9

9 9 • 99 9

Příklad 2: Příprava houbovitého materiálu z kolagenu/ORC oligosacharidu

Rozpustný kolagen se připraví podle publikované metody (E.J. Miller a R.K. Rhodes Preparatíon and Characterisation of Different Types of Collagen, Methods. Enzymol. svazek.· 82, i, str. 33 - 64 (1982) . Rozpustné oligosacharidy jsou připraveny způsobem popsaným v související patentové přihlášce podané stejný den jako tato přihláška a obecně s ní spojené. Stručně, ORC oligosacharidy jsou připraveny ošetřením komerčně dostupné

ORC 6M roztokem hydroxidu sodného při 37 °C po dobu 45 minut, neutralizací a dialýzou pro odstranění fragmentů a nečistot majících molekulární hmotnost nižší než 1000. Vzniklé rozpustné oligosacharidy ORC se pomalu přidávají za míšení do rozpustného kolagenu (0,075 mg/ml) (oba v chladné 0,05 M kyselině octové), dokud neustane další srážení komplexu. Vysrážený komplex se izoluje centrifugací, promyje se ve fosfátovém pufru při pH 7,2 a resuspenduje se homogenizací při 30% hmot./obj. ve stejném pufru. Suspenze se nalije na výšku 3 mm, rychle se zmrazí při -30 °C a suší se sublimací ze zmraženého stavu.

Příklad 3: Příprava kolagen/ORC filmu

Kolagen/ORC film pro aplikaci na rány se vyrobí způsobem popsaným v kterémkoliv z prvních dvou příkladů s tou výjimkou, že suspenze se nesráží, ale suší vzduchem oproti mražení a lyofilizaci. Pro přípravu flexibilních filmů může být do ‘ suspenze přidáno malé množství glycerolu, ' .

• · *4 · ·· 44 * 44*· 4 4·· ♦ 4 4* 4 · 4 ·

4·A » φ 4 4 « ··4 4·· • * d * 4 4 • · · 4 4 4 4 · 4 4 4« 4 4

Příklad 4: Příprava kolagenového/ORC houbovitého materiálu za použití pregelatinizace ORC

ORC tkanina (SURGICEL) se suspenduje (4% hmot./obj.) v ředěné zásadě (NaHCO₃) při pH 8,0 po dobu, která je dostatečná pro přeměnu tkaniny na gel. Kolagenová kaše se přidá při stejném pH za zisku konečného solidního obsahu Surgicelu^R a kolagenu o 1% hmot./obj. Kaše se míchá a pH se upraví na pH 3,0 - 4,0 za použití kyseliny octové. Finální kaše se odleje, zmrazí se a suší se sublimací ze zmraženého stavu ve vakuu.

Příklad 5

Krytí vhodné pro aplikaci na vředy při žilní insuficienci, prolezeninách nebo diabetů se připraví nastříháním 5 cm x 5 cm²INTERCED (RTM) tkaniny získané od Johnson & Johnson Medical, lne.

Příklad 6

Gel pro léčbu ran pro lokální aplikaci na rány se připraví, následujícím způsobem.

SURGICEL (RTM) tkanina se namele skrz 1 mm síto a vzniklá vlákna se dispergují v 3,0¾ hmot./hmot. koncentraci v 3% hmot./hmot. vodném gelu karboxymethylcelulosy (CMC). Gel se balí v pokovených polymerových pytlících a sterilizuje se T-zářením.

Příklad 7

Neutralizované krytí vhodné pro aplikaci na vředy při žilní

fefefe *í S Ϊ 1 * ’ί ί fe 4 • « · fe insuficienci, proleženinách nebo diabetů se připraví způsobem popsaným v EP-A-0437095. Stručně, 71,9 g tkaniny z oxidované regenerované celulosy (ORC) s obsahem karboxylové kyseliny 15,2%, která je dostupná jako INTERCEED (RTM) od Johnson & Johnson Medical, lne., se omotá okolo perforovaného jádra a umístí se v reaktoru vybaveném cirkulační pumpou. Reaktor se naplní směsí 3 litrů vody a 2 litrů methylalkoholu. Brookfield EX-100 lázeň s konstantní teplotou a s vestavěným čerpadlem pro zevní cirkulaci se zapojí pro pumpování rozpouštědla přes centrum perforovaného jádra a přes vlákna tkaniny omotané okolo jádra. Rozpouštědlo protéká přes vnější hranici a recirkuluje přes čerpadlo zpět do jádra.

Stochiometrické množství trihydratu octanu sodného rovné počtu molů karboxylové kyseliny na tkanině se přidá do roztoku, t.j. 71,9 x 15,2% = 10,92 g karboxylové kyseliny; ekvivalentní množství trihydratu octanu sodného je 33,05 g.

33,05 g trihydratu octanu sodného se přidá do vodného alkoholového roztoku a cirkuluje za použití čerpadla okolo a skrz tkaninu po dobu 30 minut. Po.30 minutách dosáhne pH cirkulujícího roztoku konstantní hodnoty {pH 4,6). Tkanina se potom odstraní z reaktoru a umístí se na dobu 10 minut do 600 ml methanolu, methanol se odstraní a nahradí se dalšími 600 ml Čerstvého methanolu. Po druhém promytí se tkanina zavěsí a suší se na vzduchu. Kus tkaniny velikost 5 cm x 5 cm se ustřihne pro použití jako krytí ran podle předkládaného vynálezu.

Výhodné vlastnosti materiálů podle předkládaného vynálezu připravených způsoby uvedenými výše byly určeny následovně:

«

Postup 1: Podpora růstu fibroblastů

Film složený z komplexu kolagen/ORC rozpustná v alkalickém prostředí byl připraven v Petriho miskách jak je popsáno v příkladech 2 a 3 a na film bylo nalito sérum a bylo inkubováno . při 37 °C přes noc. Sérum bylo potom odstraněno a byl měřen účinek na fibroblastový růstový faktor (obrázek 1). Byl pozorován buněčný růst pro film z pepsinem solubilizovaného kolagenu (PSC) (kontrola), PSC plus ORC oligosacharidů majících průměrnou molekulovou hmotnost přibližně 8000 a přibližně 20000 připravený jak bylo popsáno výše á PSC plus hepařinu, který byl· použit jako pozitivní kontrola. Výsledky ukazují, že film složený z kolagenu/ORC fragmentů vázal faktory ze séra stimulující buněčný růst.

Postup 2: Vazba růstového faktoru odvozeného od destiček

PDGF vazebné studie byly provedeny následujícím způsobem: Malé řezy testovaného materiálu (čtverce INTERCEED (RTM) ORC tkaniny o přibližně 1 cm², a přibližně 1 cm x 0,5 cm x 0,4 cm řezy kolagenním houbovitým materiálem) byly zváženy a namočeny v 100 mM fosforečnan sodný dibazickém pufru obsahujícím 150 mM chloridu sodného (celkový objem 1 ml) po dobu alespoň jedné hodiny při pokojové teplotě. Vzorky byly potom inkubovány s 2% hovězím sérovým albuminem (BSA) ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Potom bylo do každého vzorku přidáno 22 ng PDGF v 250 μΐ PBS obsahujícím 2% BSA a vzorky byly potom inkubovány po dobu dalších 4 hodin při 37 °C. Každý vzorek byl potom promyt třikrát 250 μΐ PBS a potom zvyšující se koncentrací chloridu sodného. Nakonec byl každý vzorek promyt 4,0 M močoviny. Byla provedena PDGF ELISA analýza původních PDGF přípravků a různých výplachů. Data uvedená na obrázku 2 ukazují, že růstový faktor mohl být úplně zpětně získán z kompozitu kolagenu a ORC, .zatímco jednotlivé složky neuvolňovaly všechen růstový faktor. Vazebné charakteristiky jsou také jedinečné pro komplex kolagen/ORC ve srovnání s jednotlivými složkami. Tato pozorování naznačují, že komplex má jedinečnou vazbu PDGF, která může být využita jak pro exogenní vazbu, tak pro endogenní vazbu a uvolňování růstového faktoru.

Postup 3: Vazba metaloproteinasy matrix'

Účinek kompelxu mezi kolagenem a ORC na vazbu metaloproteinasy matrix (MMP) byl hodnocen následujícím způsobem.

Kolagen/vláknitá ORC houbovitý materiál obsahující 0%, 20% a 30% hmotnosti vláknité ORC byly připraveny podle příkladu l. Kolagenní houbovitý materiál ORC byl připraven pro srovnání. Vzorek SURGICEL (RTM) ORC tkaniny byl také připraven pro srovnání.

Stručně, 50 mg každého materiálu byly umístěno v 15 ml plastové kádince obsahující 2,5 ml kapaliny z akutní rány ředěné 1:50 v proteolytickém pufru {50 mM Tris/HCl pH 7,8, 50 mM CaCl₂, 0,5 M NaCl) a byla provedena inkubace při 37 °C v třepací vodní lázni po dobu 3 hodin. Kapalina z akutní rány. obsahuje různé proteinasy, včetně metaloproteinas matrix a mnoho z těchto enzymů se přednostně váže na různé krycí materiály. Nadbytek kapaliny absorbované každým materiálem byl mechanicky vytlačen za použití kovové lžičky a odstraněn..

• * ♦ «

Φ·* • * · φ • φ φ • φ φ » φ φ · · φ · · · φ • φ φ

Φ 6 · * · ·

Zbytek krycího materiálu byl umístěn do předem připravených 2 ml injekčních stříkaček (každá stříkačka obsahovala 0,5 ml objem 2,5 mm skleněných korálků). 4 ml proteolytického pufru byly protlačeny stříkačkou v 1 ml aliquotách a odstraněny. V tomto stadiu promytí byly všechny nenavázané proteinasy a proteinasy, které byly pouze slabě navázané na krycí materiál odstraněny z materiálu a zůstaly pouze pevněji navázané formy. Pufrem propláchnutý krycí materiál byl potom přenesen do jiné 15 ml plastové kádinky. 1 ml nedenaturačního vzorkového pufru (6,3 ml, 0,05 tris/HCl.c pH 6,8, 2,5 ml glycerolu, 0,5 g SDS, 16,2 ml vody a bromfenolová modř) bylo přidáno do každého vzorku, který byl potom umístěn na orbitální třepačce s nastavením na 6 na dobu 2 hodin. Vzorkový pufr odděluje pevně navázané proteinasy od materiálů které jsou přítomny ve vzorkovém pufru samotném. Po této proceduře se z každého kontaineru odebere 20 μΐ vzorkového pufru a podrobí se SDS-polyakrylamidové gélové elektroforese s želatinovým substrátem (zymografii) jak je popsáno v Heussen C. and Dowdle E.B. Anal. Biochem. 102: 196 - 202 (1980).

Oblasti jednotlivých zón projasnění na gelech, které jsou způsobeny proteinasovou aktivitou, byly přesně měřeny za použití Optilab^R systému. Toto bylo provedeno opakováním každého vazebného pokusu (n = 3) a statistickou analýzou výsledků Student t testem, kde p s 0,05. Analýza byla provedena proti kontrolám z čistého kolagenu.

Výsledky, ukázané na obrázku 3,-ukazují překvapivé synergnízlepšení v MMP vazbě pro komplexy kolagenu s ORC. Data jsou presentována pro proenzymové formy (PR02 a PRO9) matrixové metaloproteinasy 2 (gelatinasa A) a matrixové metaloproteinasy ·· »* 4» ·* ·· « · 4 4 ·* 44«·

4t « «44* « · 4 « 4 4 4 ·«· *· · {gelatinasa B). Be2 vazby na určitou teorii se soudí, že zlepšení může být v souvislosti s neutralizací opačných elektrostatických nábojů kolagenu a ORC při tvorbě komplexů.

Postup 4

Vazba přečištěných růstových faktorů na tkaninu z čisté ORC a neutralizované ORC byla zkoumána následujícím způsobem.

Vzorky 200 ^g PDGF, EGF a FGF byly přidány na čtverečky INTERCEED (RTM) a neutralizovaného Interceed (z příkladu 2) velikosti 1 .cm x 1 cm a množství nenavázaného růstového faktoru bylo měřeno HPLC. Studie zkoumala účinek iontové síly a karboxylace na vazbu růstového faktoru. ORC materiály byly inkubovány s růstovým faktorem po dobu 1 hodiny při 37 °C, potom byly promyty dvakrát 1 ml 0,05 nebo 0,03 M NaCl po dobu 5 minut. Výplachy byly odebrány, shromážděny a testovány na růstový faktor za použití HPLC. Výsledky jsou ukázány v tabulce

1.

* 0 ·,0 2 · · · ·♦ · · · * ♦ t v 000 « * a 0 · · 0 ♦ 0 0 0 0 · · 0 ·♦♦ 0 » 0 0 0 0 0 «it ««. ii ni 00 0·

Tabulka 1

Interceed™	pH	% COOH	% navázaného	% navázaného	% navázaného PDGF konc. soli nízká vysoká
EGF konc. nízká	soli vysoká	FGF konc. nízká	soli vysoká
Interceed™	2,0	15¾	97	87	100	100	97 95
nTC7	5,4	15%	0	0	0	98	84 99
Interceed™	2,0	6%	97	33	91	89	98 64 '
nTC7	5,4	6%	0	0	100	84	100 84
Výsledky ukazují, že	mezi	85 a 100	% PDGF,	FGF a	EGF se váže

na INTERCEED. Nicméně, pouze FGF a EGF se váží na neutralizovaný INTERCEED. Může být řečeno, že EGF se neváže z důvodů rozdílu v izoelektrických bodech růstových faktorů (PDGF = 9,6, FGF = 10 a EGF = 4,8).

Výše uvedené příklady jsou míněny pouze jako ilustrace. Odborníků v oboru budou zřejmá různá další provedení předkládaného vynálezu, která spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

Claims

Lertonto^xě ‘η ár ο R y

1. Použití oxidované celulosy pro přípravu léku pro léčbu chronických ran.
2. Použití podlé nároku 1, kde je oxidovaná celulosa ve formě tkané, netkané nebo pletené vláknité hmoty, která je nerozpustná v kapalině přítomné v ranách.
3. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, kde je oxidovaná celulosa ve formě rozptýlených vláken nebo prášků.'
4. Použití podle nároku 3, kde jsou uvedená vlákna nebo prášek rozptýleny v semi-solidním vehikulu pro lokální aplikaci.
5. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, kde má oxidovaná celulosa průměrnou molekulovou hmotnost vyšší než 50000.
6. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, kde oxidovaná celulosa obsahuje oxidovanou regenerovanou celulosu (ORC) .
7. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, kde je oxidovaná celulosa v komplexu se strukturálním proteinem.
8. Použití podle nároku 7, kde oxidovaná celulosa a strukturální protein (pokud je přítomen) tvoří dohromady alespoň 75% hmotnosti materiálu.

4 *· ·· Β/ , · >ΊΙ$1 ·> Β · * · · b ·?·····-’ Β * í*w · φ · Β * b ·'/.'·*» ' • ·· · · fc · » ···-'·· • ·**»' *

4« » ·· · · Β·· · · · ·
9. Použití podle nároku 8, kde oxidovaná celulosa a strukturální protein (pokud je přítomen) tvoří dohromady alespoň 90% hmotnosti materiálu.
10. Použití podle nároku 7, 8 nebo 9, kde materiál je houbovitý materiál sušený sublimací ze zmraženého stavu nebo vysušením rozpouštědla.
11. Použití podle nároku 7, 8 nebo 9, kde materiál je solidní film.
12. Použití podle jakéhokoliv z nároků 7 až 11, kde je poměr hmotností proteinu a oxidované celulosy od 1:99 do 99,99:1.
13. Použití podle nároku 12, kde je poměr hmotností proteinu a oxidované celulosy v rozmezí 1:10 až 99,9:1.
14. Použití podle jakéhokoliv z nároků 7 až 13, kde protein zahrnuje kolagen, fibronektin, fibrin, laminin nebo elastin.
15. Použití podle nároku 14, kde protein se skládá v podstatě z kolagenu.
16. Použití podle nároků 14 nebo 15, kde protein zahrnuje částečně hydrolyzovaný, rozpustný kolagen mající molekulovou hmotnost v rozmezí 5000 - 100000.
17. Použití podle nároků 14 nebo 15, kde kolagen je vláknitý, významně nerozpustný kolagen.
18. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, kde ·♦ ..· ·* 4 ·♦ 44

4 4 · 4 *4 r 4 4 4

4 4 4* ♦ 4 4 » 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 · · » ··· • 4 4 4 4 4 oxidovaná celulosa obsahuje fragmenty oxidované celulosy rozpustné ve vodě mající molekulové hmotnosti v rozmezí 5000 50000.
19. Použití podle jakéhokoliv z předešlých nároků, kde je uvedená chronická rána vybrána ze skupiny skládající se z vředů při žilní insuficienci, proleženinách a diabetů.
20. Způsob pro separaci buněčných růstových faktorů z biologického vzorku nebo organismu vyznačující se tím, že obsahuje:

(i) uvedení biologického vzorku nebo organismu do kontaktu s materiálem obsahujícím oxidovanou celulosu nebo její komplex se strukturálním proteinem, kdy kontakt je proveden in vivo nebo in vitro, pro vazbu růstových faktorů na materiál; a (ii) odběr navázaných růstových faktorů z materiálu.
21. Způsob pro přípravu aktivního materiálu pro krytí ran vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(i) uvedení oxidované celulosy nebo jejího komplexu se strukturálním proteinem do kontaktu s biologickým mediem obsahujícím buněčné růstové faktory pro vazbu buněčných růstových faktorů na materiál;

(ii) promytí a sušení materiálu majícího na sebe navázané růstové faktory za vzniku uvedeného aktivního materiálu pro krytí ran.

00 • · · * 0 • « 0 0 0 0 00 00 0 0 0 0 0 t 00* • 0 0 0 «00 00 0 i · i 0 0 0 0 • 0 · 0 0-¹ 0 · 0 0 0 0‘ 00
22. Způsob podle nároku 20 nebo 21 vyznačuj ící se tím, že buněčné růstové faktory zahrnují růstový faktor odvozený od destiček.
23. Použití podle nároku 1, kde uvedený lék je sterilně balená semisolidní nebo gelová mast pro lokální aplikaci na chronické rány,, kde uvedená mast obsahuje od 0,05% do 50% hmot./obj. oxidované celulosy.
24. Použití podle nároku i, kde uvedený lék je bioabsorbovatelný houbovitý materiál pro aplikaci na chronické' rány, kde uvedený houbovitý materiál obsahuje od 0,1% do 50% hmot./hmot. oxidované celulosy a od 50% do 99,9% jednoho nebo více strukturálních proteinů.