KR20000022287A

KR20000022287A - 만성 창상 치료용 산화된 셀룰로오스와 이의 복합체의 용도

Info

Publication number: KR20000022287A
Application number: KR1019980710709A
Authority: KR
Inventors: 폴 윌리암 와트; 윌슨 하비; 엘라인 로리머; 데이비드 와이즈맨
Original assignee: 존슨 앤드 존슨 메디칼 리미티드
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2000-04-25
Also published as: ATE247493T1; CZ425198A3; DE69737741T2; GB9613682D0; ES2287406T3; JP2000513258A; EP0918548A1; GB2314842A; WO1998000180A1; BR9710177A; DE69737741D1; CA2258990C; PL330824A1; AU3269297A; GB2314842B; ES2205237T3; CA2258990A1; ATE362381T1; EP1325754A1; JP4401438B2

Abstract

본 발명은 만성 창상의 치료용 창상 드레싱의 제조를 위한, 산화된 셀룰로오스, 바람직하게는 산화된 재생 셀룰로오스(ORC), 및 콜라겐과 같은 구조 단백질과의 이의 복합체의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 드레싱은 창상 드레싱으로서 창상 표면에 직접 사용하기에 적합한 ORC의 편직물, 직물 또는 부직포, 또는 분산된 ORC 섬유 또는 분말을 함유하는 국소용 연고, 또는 콜라겐/ORC 스폰지이다. 바람직하게는 만성 창상은 정맥성 궤양, 욕창 궤양 또는 당뇨성 궤양이다.

Description

만성 창상 치료용 산화된 셀룰로오스와 이의 복합체의 용도

본 발명은 만성 창상 치료를 위한 산화된 셀룰로오스와 콜라겐과 같은 구조 단백질과의 이의 복합체의 용도에 관한 것이다.

산화된 셀룰로오스는 셀룰로오스를 예를 들면 사산화이질소로 산화시켜 제조한다. 이 공정은 사카라이드 잔기상의 1차 알콜 그룹을 카복실산 그룹으로 전환시켜, 셀룰로오스 쇄내에 우론산 잔기를 형성시킨다. 상기 산화 공정은 완전히 선택적으로 진행되지 않으며, 2번 및 3번 탄소상의 하이드록실 그룹이 종종 이의 케토형으로 전환된다. 이들 케톤 단위는 알칼리에 불안정한 링크를 도입시키는데, 이는 pH 7 이상에서 락톤의 형성과 당 환 분해를 통하여 중합체의 분해를 개시시킨다. 그 결과, 산화된 셀룰로오스는 생리학적 조건하에서 생분해성이며 생체흡수성이다.

실용적인 용도에 바람직한 산화된 셀룰로오스는 레이온과 같은, 재생 셀룰로오스의 산화에 의해 제조된 산화된 재생 셀룰로오스(ORC)이다. 얼마전부터 ORC는 지혈 특성이 있는 것으로 알려졌다. ORC는 1950년부터 SURGICEL(Johnson & Johnson Medical, Inc.의 등록 상표명)로 명명된 지혈 제품으로 입수가능하다. 이 제품은 편직된 레이온 물질의 산화에 의해 생산된다.

다공도, 밀도 및 편직 패턴을 개질시켜 제2의 ORC 직물 제품인 INTERCEED (등록 상표명 - Johnson & Johnson Medical, Inc.)가 발매되었는데, 이는 복부 외과 수술에 있어서 수술후 접착 정도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

US-A-2517772(Doub et al.)에는 ORC 직물에 트롬빈을 함침시켜 수득한 개선된 지혈 물질이 기술되어 있다.

EP-A-0437095에는 합성된 산성 ORC 물질을 나트륨 아세테이트와 같은, 약한 유기산의 염기성 염 용액으로 접촉시켜 제조한 중화 ORC 물질이 기술되어 있다. 생성된 중화 제품은 지혈작용 및 접착 방지용으로 나타나 있다.

동물성 구조 단백질인 콜라겐은 창상 드레싱 물질로서 다양한 형태로 사용되는 것으로 공지되어 있다.

GB-A-1515963에는 의료 및 수술용, 혈관 이식 및 모든 형태의 외과적 인공보철술에 있어서 사용하기 위한 가교결합된 콜라겐-뮤코폴리사카라이드 복합물이 기술되어 있다. 상기 복합물은 콜라겐에 비가역적으로 결합된 뮤코폴리사카라이드를 0.5 중량% 이상 함유한다. 뮤코폴리사카라이드는 히알루론산, 콘드로이틴 황산염 또는 헤파린 황산염과 같은, 헥소스아민 잔기를 함유하는 동물성 폴리사카라이드이다. 상기 복합물은 단순한 콜라겐 물질보다 재흡수에 대한 내성이 더 크고 혈액 화합성이 더욱 양호한 것으로 밝혀졌다.

US-A-4614794에는 콜라겐과, 나트륨 알기네이트와 같은 다중음이온성 식물성 폴리사카라이드간에 형성된 복합체가 기술되어 있다. 상기 복합체는 단백질을 폴리사카라이드와 단백질의 등전점 보다 더 높지 않은 pH에서 합함으로써 바람직하게 형성된다. 생성된 복합체는 창상 드레싱을 포함하여, 다양한 의료 및 외과용으로 적합한 것으로 밝혀졌다. 다중음이온성 식물성 폴리사카라이드 대신 산화된 셀룰로오스를 사용하는 것에 대한 기술은 없다. 상기 명세서는 또한 피브린 또는 엘라스틴과 같은, 콜라겐 이외의 단백질을 유용한 단백질/폴리사카라이드 복합체의 형성에 사용할 수 있음을 교시하고 있다.

GB-A-2280850에는 ORC일 수 있는, 생체재흡수성 중합체 층으로 강화시킨 약물처리된 콜라겐 필름을 포함하는 치근막 질환 치료용 약물처리된 임플란트가 기술되어 있다. 콜라겐 매트릭스는 분산된 ORC 섬유 또는 단편을 함유할 수 있다.

상기한 콜라겐 또는 콜라겐/폴리사카라이드 창상 드레싱 물질은 중요한 잇점을 제공한다. 상기 물질은 천연의 생물학적 기원 (때때로 화학적으로 개질된 것임에도 불구하고)의 것으로 항원성이 낮은 경향이 있다. 상기 물질은 일반적으로 생체흡수성으로, 이는 창상 표면으로부터 통상의 창상 드레싱 물질을 제거하는 것과 관련된 손상을 감소시킨다. 또한, 이들 물질 중 일부는 창상 치료에 있어서 포지티브 치료 효과를 가질 수 있다. 예를들면, 히알루론산과 같이 일부 동물성 뮤코폴리사카라이드는 섬유아세포와 같은 창상 치료 세포에 대해 화학적 효과를 발휘하여, 상기와 같은 세포의 성장 및 발달을 증진시키는 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 물리적 특성과 생물학적 흡수율의 조절이 더욱 양호하고, 창상 치료에 대한 치료 효과가 더욱 양호하며, 단가가 싼, 상기 일반적인 타입의 개선된 창상 드레싱 물질에 대한 필요성이 남아 있다.

본 발명의 목적은 포유동물, 특히 사람에 있어서, 정맥성 궤양, 욕창 궤양 및 당뇨성 궤양과 같은 만성 창상용의, 개선된 창상 드레싱 물질을 제공하는 것이다. 상기와 같은 만성 창상은 일반적으로 다른 체조직의 출혈 또는 접착이 거의 또는 전혀 없으며, 따라서 산화된 셀룰로오스는 상기와 같은 창상의 치료용으로 제시된 바 없었다.

본 발명에 이르러 산화된 셀룰로오스가 만성 창상의 치료용으로 효과적인 창상 드레싱 물질임이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 만성 창상의 치료용 창상 드레싱 물질의 제조를 위한 산화된 셀룰로오스의 용도를 제공한다.

바람직하게는, 산화된 셀룰로오스는 산화된 재생 셀룰로오스(ORC)이다. 바람직하게는, 산화된 셀룰로오스는 창상 유체중에 불용성인 섬유상의 직물, 부직포 또는 편직물 형태이다. 예를들면, 산화된 셀룰로오스는 당해 분야에 공지된 SURGICEL(RTM) 또는 INTERCEED(RTM) 직물중 하나의 형태일 수 있다. 다른 바람직한 양태로, 산화된 셀룰로오스는 분쇄된 섬유와 같은 섬유, 또는 분말의 형태로, 바람직하게는 적합한 국소적 의료용 비히클중에 분산된 형태이다.

바람직하게는, 산화된 셀룰로오스는 평균 분자량은 50,000 이상이다. 상기와 같은 산화된 셀룰로오스는 창상 유체중에서 실질적으로 불용성이지만, 생리학적 pH에서는 매우 점진적으로 생체 재흡수성 단편으로 분해된다.

바람직하게는, 산화된 셀룰로오스는 중화되지 않은 것이다. 그러나, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 만성 창상의 치료를 위한 의약 제조에 대한 EP-A-0437095에 기술된 바와 같은 부분적으로 또는 완전하게 중화된 물질의 용도를 포함한다.

바람직하게는, 산화된 셀룰로오스는 상기 창상 드레싱 물질중의 구조 단백질과 복합체화된 것이다.

바람직하게는 단백질 (존재하는 경우)과 산화된 셀룰로오스는 함께 창상 드레싱 물질의 75 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상을 차지하는 것이다. 창상 드레싱 물질의 다른 성분으로는 0 내지 25 중량%의 하나 이상의 다른 생체화합성 폴리사카라이드, 예를들어 나트륨 알기네이트 또는 칼슘 알기네이트와 같은 알기네이트, 나트륨 전분 글리콜레이트와 같은 전분 유도체, 메틸 셀룰로오스 또는 카복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체, 또는 히알루론산 또는 이의 염과 같은 글리코스아미노글리칸, 콘드로이틴 황산염 또는 헤파란 황산염일 수 있다. 창상 드레싱 물질은 또한 물을 20 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하로 포함할 수 있다. 상기 물질은 또한 가소제, 바람직하게는 글리세롤과 같은 다가 알콜을 0 내지 40 중량%, 바람직하게는 0 내지 25 중량% 함유할 수 있다. 상기 물질은 또한 비-스테로이드성 소염 약물(예, 아세트아미노펜), 스테로이드, 항생제(예, 페니실린 또는 스트렙토마이신), 방부제(예, 은 술파디아진 또는 클로르헥시딘), 또는 성장 인자(예, 섬유아세포 성장 인자 또는 혈소판 유래 성장 인자)와 같은, 하나 이상의 치료적 창상 치료제를 0 내지 10 중량%, 바람직하게는 0 내지 5 중량% 포함할 수 있다.

바람직하게는, 단백질 대 산화된 셀룰로오스의 중량비는 1:99 내지 99.99:1이다. 더욱 바람직하게는, 상기 중량비의 범위는 1:10 내지 99.9:1, 더욱 바람직하게는 2:1 내지 95:1의 범위이다.

본 발명에 따르는 물질은 분말, 미세구, 플레이크, 매트 또는 필름과 같은 편리한 형태일 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명에 따르는 물질은 국소 투여용 반고체 또는 겔 연고, 또는 동결-건조된 또는 용매-건조된 스폰지 형태이다.

따라서, 본 발명은 또한 산화된 셀룰로오스를 0.05 내지 50% w/v 포함하는, 만성 창상 국소 투여용의 멸균 포장된 반고체 또는 겔 연고를 제공한다.

바람직하게는, 상기 연고는 약제학적으로 허용되는 담체중에 산화된 셀룰로오스를 0.1 내지 20% w/v, 더욱 바람직하게는 1 내지 10% w/v 포함한다. 적합한 담체로는 다음과 같은 것이 있다: 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시메틸 셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 및 이들의 혼합물을 포함한, 하이드로겔 함유 셀룰로오스 유도체 및 하이드로겔 함유 폴리아크릴산(Carbopol). 적합한 담체로는 또한 국소 약제학적 제제용으로 사용되는 크림/연고가 있으며, 예를들면 세토매크로골 유화 연고를 기재로 하는 크림이 있다. 상기 담체는 또한 알기네이트 (농후제 또는 자극제로서), 벤질 알콜과 같은 방부제, 인산수소이나트륨/인산이수소나트륨과 같은 pH 조절용 완충제, 염화나트륨과 같은 삼투 조절제, 및 EDTA와 같은 안정화제가 포함될 수 있다.

바람직하게는, 연고중의 산화된 셀룰로오스는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 단백질에 복합체화되어 있다.

본 발명은 또한 만성 창상에 사용하기 위한, 동결-건조된 또는 용매-건조된 생체흡수성 스폰지를 제공하며, 스폰지는 0.1 내지 50% w/w의 산화된 셀룰로오스와 50 내지 99.9% w/w의 하나 이상의 구조 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 상기 스폰지의 평균 기공 크기의 범위는 10 내지 500 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 100 내지 300 ㎛이다.

본 발명에서 산화된 셀룰로오스에 대한 복합체화용으로 적합한 단백질로는 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 엘라스틴 및 콜라겐과 같은 구조 단백질이 있다. 바람직하게는, 상기 단백질이 콜라겐을 포함하는 것이며, 더욱 바람직하게는 필수적으로 콜라겐으로 이루어진 것이다. 콜라겐은 미생물 공급원을 포함한, 천연 공급원으로부터 수득한 콜라겐일 수 있지만, 본 명세서에서 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 제4614794호 및 제4320201호에 기술된 바와 같이, 비-콜라겐 성분, 예를들면, 지방, 비-콜라겐성 단백질, 폴리사카라이드 및 기타 탄수화물이 대부분 제거된 소의 진피로부터 수득한 콜라겐이 바람직하다. 콜라겐은 타입 I, II 또는 III 콜라겐일 수 있거나, 화학적으로 개질된 콜라겐, 예를들면 천연 콜라겐으로부터 면역원성 텔로펩티드를 제거함으로써 수득한 아텔로콜라겐일 수 있다. 콜라겐은 또한 가용화된 콜라겐 또는 공지된 방식으로 천연 콜라겐을 펩신 처리하여 수득한, 분자량 범위가 5,000 내지 100,000, 바람직하게는 5,000 내지 50,000인 가용성 콜라겐 단편을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 산화된 셀룰로오스는 산화된 재생 셀룰로오스(ORC)를 포함한다. 산화된 재생 셀룰로오스(ORC)는 본 명세서에서 참고로 인용되는, 미국 특허 제3122479호에 기술된 방법으로 수득할 수 있다. 상기 물질은 생체화합성, 생체 분해성, 비-면역원성 및 상업적 입수용이성 특징을 포함한 수많은 잇점을 제공한다. ORC는 산화 정도가 변화되어 분해 속도가 변화되는 것으로 입수할 수 있다. ORC는 직물, 부직포 및 편직물을 포함한 불용성 섬유의 형태로 사용될 수 있다. 다른 바람직한 양태로, ORC는 ORC의 알칼리 가수분해에 의해 수득되는 수용성 저분자량 단편의 형태이다.

조절가능한 범위의 특성을 갖는 콜라겐과 ORC 모두 입수가 용이하다는 것은 본 발명에서 사용되는 물질의 특성을 예외적인 정도로 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 특히, 상기 물질의 생물학적 흡수율, 다공도 및 밀도를 조절할 수 있다.

놀랍게도, 본 발명의 바람직한 양태에서 사용되는 단백질/산화된 셀룰로오스 복합체가 성장 인자, 특히, 혈소판 유래 성장 인자에 대한 결합능이 탁월하다는 것이 또한 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 하나 이상의 세포 성장 인자를 결합시키기 위한 산화된 셀룰로오스 또는 구조 단백질과의 이의 복합체의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다.

본 발명은 또한

(i) 생물학적 샘플 또는 기관을, 상기 정의된 바와 같은 산화된 셀룰로오스 또는 구조 단백질과의 이의 복합체를 포함하는 물질과 생체내 또는 시험관내에서 접촉시켜 상기 물질에 성장 인자를 결합시키는 단계; 및

(ii) 결합된 성장 인자를 상기 물질로부터 회수하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 또는 기관으로부터의 세포 성장 인자 분리방법을 제공한다.

본 발명은 또한

(i) 상기 정의된 바와 같은 산화된 셀룰로오스 또는 구조 단백질과의 이의 복합체를 세포 성장 인자를 함유하는 생물학적 매질과 접촉시켜 상기 물질에 세포 성장 인자를 결합시키는 단계; 및

(ii) 결합된 세포 성장 인자를 갖는 상기 물질을 세척 및 건조시켜 활성 창상 드레싱 물질을 형성시키는 단계를 포함하는, 활성 창상 드레싱 물질의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 세포 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자를 포함한다.

다른 양태로, 본 발명은 욕창 궤양, 정맥성 궤양 또는 당뇨성 궤양과 같은, 포유동물에 있어서의 만성 창상의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 정의된 바와 같은 산화된 셀룰로오스 또는 구조 단백질과의 이의 복합체를 포함하는 드레싱을 창상에 적용시킴을 특징으로 한다.

바람직하게는, 산화된 셀룰로오스를 1시간 이상 동안, 더욱 바람직하게는 6시간 이상, 가장 바람직하게는 12시간 이상 만성 창상에 적용시킨다. 산화된 셀룰로오스 처치는 경우에 따라 만성 창상의 경우, 산화된 셀룰로오스 드레싱을 교환시키면서 수일간 또는 수주간 연장시킬 수 있다. 이는 전형적으로 수초 또는 수분간만 지속되는, ORC의 지혈성 적용과 대조적이다.

이론에 얽매이지 않고, 산화된 셀룰로오스 및 이의 복합체는 다음 방법 중 적어도 일부에서 만성 창상 치료를 증진시키는 것으로 생각된다. 먼저, 산화된 셀룰로오스는 PDGF, EGF 및 FGF와 같은 성장 인자에 결합하여 이들 성장 인자를 창상 부위에 남도록 한다. 또는, 이러한 성장 인자는 창상 유출물과 함께 창상 부위로부터 떠내려가는 경향이 있다. 생리학적 pH에서 산화된 셀룰로오스가 점진적으로 분해되어 창상중으로 성장 인자가 점진적으로 다시 방출되도록 한다. 두번째 이유는 산화된 셀룰로오스가 완전히 생체재흡수성이며 생리학적으로 허용된다는 것이다. 세번째 이유는 생체내에서의 산화된 셀룰로오스 자체의 분해에 의해 생산된 올리고사카라이드 단편이 만성 창상 치료를 증진시킨다는 것이다.

바람직하게는, 만상 창상은 정맥성 궤양, 욕창 궤양 및 당뇨성 궤양으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 만성 창상은 실질적으로 또는 완전히 비-출혈성이라는 것이다. 용어 "만성 창상"은 치근막 질환 또는 질병을 포함하지 않는다.

본 발명에서 사용되는 단백질/산화된 셀룰로오스는 단백질의 수성 분산액을 제공하는 단계; 산화된 셀룰로오스를 상기 수성 분산액중에 침지 또는 분산시키는 단계; 및 수성 분산액으로부터 물을 제거하여 산화된 재생 셀룰로오스와 복합체화된 단백질을 포함하는 물질만을 남기는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따르는 물질중의 임의의, 추가 성분은 수성 분산액으로부터 물을 제거하기전에 수성 분산액에 포함시키는 것이 바람직하다.

상기 분산액의 pH를 3 내지 4.5로 조절하는 것이 바람직하다. 상기 pH 범위는 콜라겐의 등전점 pH 보다 낮다.

물은 증발에 의해 수성 분산액으로부터 제거할 수 있으며, 예를들면, 트레이중의 분산액으로부터 증발에 의해 물질의 필름만을 남길 수 있다. 그러나, 물을 동결-건조(동결건조) 또는 용매-건조에 의해 제거하여 스폰지 형태로 물질을 생산하는 것이 바람직하다. 수성 분산액이 콜라겐을 5 내지 30 ㎎/㎖ 함유하는 것이 바람직하다. 콜라겐-계 스폰지는 실질적으로 US-A-2157224에 기술된 바와 같이 동결건조시켜 형성시키는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 상기 방법은 또한 분산액 또는 건조된 물질중의 단백질과 폴리사카라이드를 카보디이미드, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDI) 또는 글루타르알데히드와 같은 가교결합제로 처리함을 특징으로 한다.

별법으로, 가교결합을 탈수소열적으로 수행할 수 있다. 가교결합 방법은 최종 생성물에 현저한 영향을 줄 수 있다. 예를들면, HMDI는 복합체내에서 단백질상의 1급 아미노 그룹을 가교-결합시키는 반면, 카보디이미드는 ORC상의 탄수화물을 단백질상의 1급 아미노 그룹에 가교-결합시킨다.

산화된 셀룰로오스는 단백질의 수성 분산액에 산화된 셀룰로오스의 현탁액 또는 용액의 형태로, 바람직하게는 콜라겐 현탁액에 대해 화합성인 pH에서 가한 다음, 교반 또는 균질화에 의해 혼합시킬 수 있다. 별법으로, 산화된 셀룰로오스의 무수 섬유 또는 직물을 콜라겐의 수성 분산액에 침지시킬 수 있다.

본 발명의 특정 양태가 첨부되는 도면을 참고로 하여 실시예에 의해 추가로 설명된다.

도 1은 (a) 펩신 가용화된 콜라겐, (b) 평균 분자량이 8,000인 ORC 단편과 복합체화된 펩신 가용화된 콜라겐, (c) 평균 분자량이 약 20,000인 ORC 단편과 복합체화된 펩신 가용화된 콜라겐, 및 (d) 헤파란 황산염과 복합체화된 펩신 가용화된 콜라겐 (대조용)으로 이루어진 혈청 처리된 필름상에서의 섬유아세포 세포 성장 (임의 단위로)의 그래프이다.

도 2는 다음 물질: (a) 플라스틱, (b) 콜라겐 스폰지, (c) 콜라겐/가용화된 ORC 스폰지, (d) INTERCEED (RTM) ORC에 대한 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)의 결합%, 및 상기 물질로부터 상기 성장 인자의 회수 용이성 그래프이다.

도 3은 콜라겐 스폰지 및 SURGICEL (RTM) ORC 직물 (비교 측정) 및 10 중량%, 20 중량% 및 30 중량%의 섬유상 ORC로 복합체화된 콜라겐의 스폰지에 대해 측정한 상대적인 MMP 결합량의 그래프이다.

실시예 1

콜라겐/섬유상 ORC 스폰지의 제조

미국 특허 제4614794호 또는 제4320201호에 기술된 바와 같이 제조된 동결건조된 콜라겐을 10 ㎎/㎖의 농도로 냉 0.05M 아세트산중에 재현탁시킨다. 분쇄된 ORC 분말 (분쇄된 Surgicel: 등록상표 포(cloth))을 상기 현탁액에 1:3 ORC:콜라겐의 비율로 가하고 Waring Blendor를 사용하여 3x30s 저속에서 균질화시킨다. 상기 복합체 현탁액을 진공 오븐중에서 10분간 탈기시킨 다음 3 ㎜ 깊이로 붓고 급속 동결시킨다. 동결된 현탁액을 동결-건조시켜 온도 변환식 설비를 갖춘 프로그램화 Edwards 동결-건조기를 사용하여 탈수소열적으로 가교-라이닝시키거나, US-A-2157524에 기술된 바와 같은 용매 건조법을 사용하여 건조시킨다.

실시예 2

콜라겐/ORC 올리고사카라이드 스폰지의 제조

가용성 콜라겐을 문헌에 공개된 방법으로 제조한다[참조: E. J. Miller and R. K. Rhodes "Preparation and Characterisation of the Different Types of Collagen", Methods Enzymol Vol. 62, pages 33-64 (1982)]. ORC의 가용성 올리고사카라이드를 본원과 동일자로 출원되어 본원과 동일인에게 양도된 계류중인 특허원에 기술된 바와 같이 제조한다. 간략하면, ORC 올리고사카라이드는 상업적으로 입수가능한 ORC를 6M 수산화나트륨 용액으로 37 ℃에서 45분간 처리한 다음 중화시키고 투석하여 분자량이 1000 이하인 단편과 불순물을 제거하여 제조한다. 생성된 ORC의 가용성 올리고사카라이드를 교반시키면서 가용성 콜라겐 (0.075 ㎎/㎖) (둘다 냉 0.05M 아세트산중)에 복합체의 추가 침전이 일어나지 않을 때까지 천천히 가한다. 복합체 침전물을 원심분리로 분리하여 pH 7.2에서 인산염 완충액중에서 세척하고 균질화에 의해 30% w/v 로 동일 완충액중에 재현탁시킨다. 상기 현탁액을 깊이 3 ㎜로 붓고 -30 ℃에서 급속 동결시켜 동결건조시킨다.

실시예 3

콜라겐/ORC 필름의 제조

창상에 적용시키기 위한 콜라겐/ORC 필름은 상기 실시예 1 및 2 중의 하나에 기술된 방법으로 제조하는데, 현탁액을 침전시키지 않고 동결 및 동결-건조보다는 공기-건조시키는 점이 상이하다. 유연성 필름을 제조하기 위하여 소량의 글리세롤을 상기 현탁액에 가할 수 있다.

실시예 4

ORC의 예비-겔화방법을 사용한 콜라겐/ORC 스폰지의 제조

ORC 직물(SURGICEL)을 희석 알칼리(NaHCO₃)에 pH 8.0에서 직물이 젤라틴성 물질로 전환되기에 충분한 시간 동안 현탁(4% w/v)시킨다. 콜라겐 슬러리를 동일 pH에서 가하여 Surgicel 및 콜라겐의 최종 고형분 함량이 둘다 1% w/v가 되도록 한다. 상기 슬러리를 교반시키고 아세트산을 사용하여 pH 3.0 내지 4.0으로 pH 조절한다. 최종 슬러리를 성형시켜 동결시키고 진공하에서 동결-건조시킨다.

실시예 5

정맥성 궤양, 욕창 궤양 또는 당뇨성 궤양에 사용하기에 적합한 창상 드레싱은 Johnson & Johnson Medical, Inc.로부터 수득한 5 ㎝ x 5 ㎝ INTERCEED (RTM)을 절단하여 제조한다.

실시예 6

창상에 국소적으로 사용하기 위한 창상 처치 겔을 다음과 같이 제조한다:

SURGICEL (RTM) 직물을 1 ㎜ 스크린을 통하여 분쇄하고 생성된 섬유를 3.0% w/w 카복시메틸 셀룰로오스(CMC) 수성 겔중에 3.0% w/w 농도로 분산시킨다. 상기 겔을 금속화 중합체 파우치로 포장하여 γ- 조사로 멸균시킨다.

실시예 7

정맥성 궤양, 욕창 궤양 또는 당뇨성 궤양에 사용하기에 적합한 중화된 ORC 창상 드레싱을 EP-A-0437095에 기술된 바와 같이 제조한다. 간략하면, Johnson & Johnson Medical, Inc.로부터 INTERCEED(RTM)으로 입수가능한, 카복실산 함량이 15.2%인 산화된 재생 셀룰로오스(ORC) 직물 71.9g을 천공시킨 코어 주변에 감아 순환 펌프가 장착되어 있는 반응기에 넣는다. 상기 반응기를 물 3ℓ와 메틸 알콜 2ℓ의 혼합물로 채운다. 용액의 외부 순환을 위하여 내장식 펌프가 있는 Brookfield EX-100 항온욕을 틀어 천공된 코어의 중심 및 코어 주변을 감싸는 포의 파일을 통하여 용매를 펌핑시킨다. 용매를 배출 라인을 통하여 유동시키고 펌프를 통하여 다시 재순환시켜 코어로 되돌린다.

포상의 카복실산의 몰수와 대등한 화학양론적 양의 나트륨 아세테이트 삼수화물을 상기 용액에 가한다: 즉, 71.9 x 15.2% = 카복실산 10.92g; 나트륨 아세테이트 삼수화물 33.05 g과 등가.

나트륨 아세테이트 삼수화물 33.05g을 알콜 수용액에 가하고 직물 주변과 직물을 통하여 30분간 펌핑시킨다. 30분후 순환 용액의 pH가 일정한 값(pH 4.6)에 도달한다. 이어서 직물을 반응기로부터 회수하여 메탄올 600 ㎖에 10분간 넣는다. 메탄올을 제거하고 다시 신선한 메탄올 600 ㎖를 넣는다. 2차 세척후, 매달아서 공기건조시킨다. 5cm x 5cm 조각의 포를 본 발명에 다르는 창상 드레싱으로 사용하기 위하여 절단한다.

상기한 바와 같이 제조한 본 발명에 따르는 물질의 유리한 특성을 다음과 같이 측정한다:

방법 1: 섬유아세포 세포 성장의 증진

콜라겐/알칼리-가용성 ORC 복합체 필름을 실시예 2/3에 기술된 바와 같이 페트리 접시에서 제조하여, 상기 필름상에 혈청을 부어 37 ℃에서 밤새 배양시킨다. 혈청을 제거하고 섬유아세포 세포 성장에 대한 효과를 측정한다(도 1). 세포 성장을 펩신 가용화된 콜라겐(PSC) 필름에 대해 관찰하고(대조군), PSC + 상기한 바와 같이 제조된, 평균 분자량이 약 8,000 내지 약 20,000인 ORC 올리고사카라이드, 및 PSC + 헤파린을 포지티브 대조군으로서 포함시킨다. 결과는 콜라겐/ORC 단편 필름이 세포 성장을 자극하는 혈청으로부터의 인자에 결합하는 것으로 나타났다.

방법 2: 혈소판 유래 성장 인자의 결합

PDGF 결합 연구를 다음과 같이 수행한다: 시험 물질의 작은 분획(약 1 ㎠의 INTERCEED(RTM) ORC 직물, 및 약 1㎝ x 0.5 ㎝ x 0.4㎝ 분획이 콜라겐 스폰지)을 칭량하여 150mM 염화나트륨을 함유하는 100mM 인산나트륨 이염기성 완충액(총 용적 1ml)중에 1시간 이상 실온에서 침지시킨다. 이어서 샘플을 2% 소 혈청 알부민(BSA)와 함께 인산염 완충된 염수(PBS)중에서 2시간 동안 실온에서 배양시키고, PDGF 22ng을 2% BSA를 함유하는 PBS 250 ㎕중의 각각의 샘플에 가하고, 샘플을 추가로 1시간 동안 37 ℃에서 배양시킨다. 이어서 각 샘플을 PBS 250 ㎕로 3회 세척한 다음, 염화나트륨의 농도를 증가시킨다. 최종적으로, 각 샘플을 4.0M 우레아로 세척한다. 원래의 PDGF 제제의 PDGF ELISA 분석 및 다양한 세척을 수행한다. 도 2에 나타낸 데이타는 성장 인자가 콜라겐과 ORC의 복합물로부터 전체적으로 회수될 수 있으며 이때 각 성분은 성장 인자를 모두 방출시키지는 않는 것으로 나타났다. 결합 특성은 또한 각 성분과 비교하여 콜라겐/ORC 복합체의 경우 독특하게 상이하다. 이들 관찰은 상기 복합체가 독특한 PDGF 결합을 가지며 이는 외인성 결합 및 내인성 결합 둘다 및 성장 인자의 방출에 적절하게 이용될 수 있다.

방법 3: 매트릭스 메탈로프로테인아제 결합

매트릭스 메탈로프로테인아제(MMP)에 대한 콜라겐과 ORC간의 복합체화의 효과를 다음과 같이 평가한다.

0 중량%, 20 중량% 및 30 중량%의 섬유상 ORC를 함유하는 콜라겐/섬유상 ORC 스폰지를 실시예 1에 기술된 방법으로 제조한다. ORC-유리 콜라겐 스폰지를 비교용으로 제조한다. SURGICEL(RTM) ORC 직물의 샘플을 또한 비교용으로 제조한다.

간략하면, 각 물질 50㎎을 단백분해 완충액 (50mM 트리스/HCl pH 7.8, 50 mM CaCl₂, 0.5 M NaCl)중에 1:50으로 희석시킨 급성 창상 유체 2.5 ㎖를 함유하는 15㎖ 플라스틱 비이커에 넣고 37 ℃에서 진탕 수욕중에서 3시간 동안 배양시킨다. 급성 창상 유체는 매트릭스 메탈로프로테인아제를 포함한, 여러가지 프로테인아제를 함유하며 수많은 이들 효소는 여러가지 드레싱 물질에 우선적으로 결합한다. 각 물질에 의해 흡수된 과량의 유체는 금속 스파튤라를 사용하여 기계적으로 표현하여 경사시킨다. 나머지 드레싱은 미리-채운 2㎖ 주사기 (각 주사기는 2.5 ㎜ 유리 비이드가 0.5 ㎖ 용적으로 함유되어 있음)에 넣는다. 단백분해 완충액 4 ㎖를 주사기를 통하여 1 ㎖ 분취량으로 강제로 넣어 이를 경사시킨다. 이 세척 단계에서 모든 비결합 프로테인아제와 드레싱 물질에 단지 약하게 결합된 프로테인아제는 드레싱으로부터 제거되어 더욱 단단하게 결합된 형태가 남게된다. 상기 완충액 세정된 드레싱을 다른 15㎖ 플라스틱 비이커로 제거한다. 비-변성 샘플 완충액 (6.3 ㎖, 0.05M 트리스/HCl, 약 pH 6.8, 2.5 ㎖ 글리세롤, 0.5g SDS, 16.2 ㎖ 물 및 브로모페놀 블루) 1 ㎖를 각 샘플에 가하여 6에 맞춘 오비탈 진탕기상에 2시간 동안 놓는다. 샘플 완충액은 물질로부터 강하게 결합된 프로테인아제를 분리시키며 이는 이후 샘플 완충액 자체로 존재한다. 이후 샘플 완충액 20 ㎕를 각 용기로부터 회수하여 문헌[참조: Heussen C. and Dowdle E. B., Anal. Biochem. 102:196-202 (1980)]에 기술된 바와 같이 젤라틴 기질 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (zymography)시킨다.

프로테인아제 활성에 기인한, 상기 겔상에서의 정화점 면적을 Optilab 시스템으로 정확하게 측정한다. 이는 각 결합 실험을 반복하고(n=3) 결과를 스튜던트 T 시험으로 통계학적으로 분석하여 수행하는데, 여기서 P ≤ 0.05 이다. 순수한 콜라겐의 대조군에 대해서도 분석한다.

도 3에 나타낸 결과는 콜라겐과 ORC와의 복합체에 대한 MMP결합에 있어서 놀라울 정도로 상승적으로 향상됨을 증명한다. 데이타를 매트릭스 메탈로프로테인아제 2 (Gelatinase A) 및 매트릭스 메탈로프로테인아제 9 (Gelatinase B)의 프로효소 형태(PRO2 및 PRO9)에 대해 제공한다. 이론에 속박시키지 않고, 개선은 콜라겐과 ORC상에 반대되는 정전하를 복합체화에 의해 중화시키는 것과 연관될 수 있다.

방법 4

순수한 ORC 및 중화된 ORC 포에 대한 정제된 성장 인자의 결합을 다음과 같이 조사한다. PDGF, EGF 및 FGF 200 ㎍ 샘플을 1㎝ x 1㎝의 INTERCEED(RTM) 및 중화된 Interceed(실시예 2로부터)에 가하여 비결합 성장 인자의 양을 HPLC로 측정한다. 이온 강도의 효과와 성장 인자 결합에 대한 카복실화 효과를 둘다 조사한다. ORC 물질을 성장 인자와 함께 1시간 동안 37 ℃에서 배양시킨 다음 0.05M 또는 0.03M NaCl 2x1 ㎖로 5분간 세척한다. 세척액을 수집하여 모으고 HPLC로 성장 인자에 대해 분석한다. 결과를 표 1에 나타낸다.

Interceed	pH	COOH %	EGF 결합 %	FGF 결합 %	PDGF 결합 %
	저염	고염	저염	고염	저염	고염
Interceed	2.0	15%	97	87	100	100	97	95
aTC7	5.4	15%	0	0	0	98	84	99

Interceed	2.0	6%	97	33	91	89	98	64
aTC7	5.4	6%	0	0	100	84	100	84

상기 결과는 85 내지 100%의 PDGF, FGF 및 EGF가 INTERCEED에 결합함을 나타낸다. 그러나, FGF 및 EGF만이 중화된 INTERCEED에 결합한다. EGF는 성장 인자의 등전점이 상이하기 때문에 (PDGF = 9.6, FGF = 10 및 EGF = 4.8) 결합하지 않는 것으로 추정될 수 있다.

상기 실시예는 설명만을 목적으로 한다. 첨부되는 청구의 범위의 범주내에 속하는 수많은 다른 양태가 숙련가에 있어서 자명할 것이다.

Claims

만성 창상 치료용 약물을 제조하기 위한 산화된 셀룰로오스의 용도.
제1항에 있어서, 산화된 셀룰로오스가 섬유상인 직물, 부직포 또는 편직물 형태이며, 창상 유체에 불용성인 용도.
제1항 또는 제2항에 있어서, 산화된 셀룰로오스가 분산된 섬유 또는 분말의 형태인 용도.
제3항에 있어서, 섬유 또는 분말이 국소용 반-고체 비히클 중에 분산된 형태인 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 산화된 셀룰로오스의 평균 분자량이 50,000 이상인 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 산화된 셀룰로오스가 산화된 재생 셀룰로오스(ORC)를 포함하는 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 산화된 셀룰로오스가 구조 단백질과 복합체화된 용도.
제4항에 있어서, 산화된 셀룰로오스 및 구조 단백질(존재하는 경우)이 함께 재료물의 75 중량% 이상을 차지하는 용도.
제8항에 있어서, 산화된 셀룰로오스 및 구조 단백질(존재하는 경우)이 함께 재료물의 90 중량% 이상을 차지하는 용도.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 재료물이 동결-건조되거나 용매-건조된 스폰지인 용도.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 재료물이 고체 필름인 용도.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 대 산화된 셀룰로오스의 중량비가 1:99 내지 99.99:1인 용도.
제12항에 있어서, 단백질 대 산화된 셀룰로오스의 중량비가 1:10 내지 99.9:1 범위인 용도.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 콜라겐, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌 또는 엘라스틴을 포함하는 용도.
제14항에 있어서, 단백질이 필수적으로 콜라겐으로 이루어진 용도.
제14항 또는 제15항에 있어서, 단백질이, 분자량 범위가 5,000 내지 100,000인 부분적으로 가수분해된 가용성 콜라겐을 포함하는 용도.
제14항 또는 제15항에 있어서, 콜라겐이 실질적으로 불용성 섬유상 콜라겐인 용도.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 산화된 셀룰로오스가 분자량 범위가 5,000 내지 50,000인 수용성 산화된 셀룰로오스 단편을 포함하는 용도.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 창상이 정맥성 궤양, 욕창 궤양 및 당뇨성 궤양으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
(i) 생물학적 샘플 또는 기관을, 산화된 셀룰로오스 및 구조 단백질과의 이의 복합체를 포함하는 재료물과 생체내 또는 시험관내에서 접촉시켜 재료물에 성장 인자를 결합시키는 단계 및

(ii) 결합된 성장 인자를 재료물로부터 회수하는 단계를 포함하여, 생물학적 샘플 또는 기관으로부터 세포 성장 인자를 분리하는 방법.
(i) 산화된 셀룰로오스 또는 이의 구조 단백질과의 복합체를 포함하는 재료물을 세포 성장 인자를 함유하는 생물학적 매질과 접촉시켜 재료물에 세포 성장 인자를 결합시키는 단계 및

(ii) 결합된 세포 성장 인자를 갖는 재료물을 세척 및 건조시켜 활성 창상 드레싱 재료물을 형성시키는 단계를 포함하여, 활성 창상 드레싱 재료물을 제조하는 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서, 세포 성장 인자가 혈소판 유래 성장 인자를 포함하는 방법.
산화된 셀룰로오스를 0.05 내지 50% w/v 포함하는, 만성 창상에 국소용으로 사용하기 위한 멸균 포장된 반고체 또는 겔 연고.
산화된 셀룰로오스 0.1 내지 50% w/w 및 하나 이상의 구조 단백질 50 내지 99.9% w/w를 포함하는, 만성 창상에 사용하기 위한 생체흡수성 스폰지.