KR20240066053A - 키토산, tempo로 산화된 셀룰로오스 나노섬유, 세포외 기질 및 트롬빈을 포함하는 나노복합체 및 이를 포함하는 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물 - Google Patents
키토산, tempo로 산화된 셀룰로오스 나노섬유, 세포외 기질 및 트롬빈을 포함하는 나노복합체 및 이를 포함하는 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 키토산, TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유, 세포외 기질 및 트롬빈을 포함하는 나노복합체 및 이를 포함하는 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노복합체 및 이를 포함하는 조성물이 혈액 응고 능력, 지혈 및 상처 치유 효과가 우수함을 확인하였는 바, 지혈, 재생 및/또는 다중 기능 창상 치료와 관련된 시장/산업에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은, 키토산, TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유, 세포외 기질 및 트롬빈을 포함하는 나노복합체 및 이를 포함하는 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물에 관한 것이다.
수술 중 및 수술 후 출혈은 수술 과정에서 가장 중요한 문제이다. 외상으로 인한 사망의 30% 이상이 조절되지 않는 내부 또는 외부 출혈로 인해 응급 치료를 받기 전에도 전 세계적으로 발생한다. 간 손상과 관련된 환자의 50%는 입원 24시간 후 사망하고 80%는 수술 후 사망하는 것으로 보고되었고, 출혈을 멈추기 위한 즉각적인 개입은 주요 외상으로 고통받는 환자의 생존에 중요한 역할을 한다.
최근에는 깊은 내부 손상(비장 또는 간과 같은)에 이용할 수 있는 흡수성 지혈 재료가 큰 관심을 받고 있다. 이러한 지혈제는 향상된 상처 치유 및 조직 재생 능력이 필요한 바, 수술 중 출혈을 조절하기 위해 다양한 접착제, 실런트(sealant) 및 지혈제가 제작되었다. 그러나, 상기 제제들은 세포독성, 비생분해성, 감염 및 기타 기본적인 단점이 존재한다. 또한, 섬유소 또는 젤라틴 기반 붕대, 가교 알부민, 시아노아크릴레이트(cyanoacrylate) 등과 같은 상업적으로 이용 가능한 많은 지혈제들이 출혈을 조절하는 데 효과적으로 사용되었으나, 깊은 상처나 중요한 장기 손상에는 부적절하다는 문제점이 존재한다.
일 양상은 키토산(Chitosan), 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber), 세포외 기질(extracellular matrix), 및 트롬빈(Thrombin)이 가교 결합된 나노복합체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 키토산(Chitosan), 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber), 세포외 기질(extracellular matrix) 및 트롬빈(Thrombin)을 포함하는 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 시트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 키토산(Chitosan) 용액에 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber)를 첨가하는 단계;
상기 나노섬유가 첨가된 키토산 용액에 세포외 기질(extracellular matrix)을 추가하는 단계; 및
상기 세포외 기질이 추가된 키토산 용액에 트롬빈(Thrombin) 용액을 혼합하는 단계;를 포함하는, 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 나노복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 키토산(Chitosan), 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber), 세포외 기질(extracellular matrix), 및 트롬빈(Thrombin)이 가교 결합된 나노복합체를 제공한다.
상기 용어 "키토산(Chitosan)"은 자연계에 존재하는 다당류의 일종으로, 게, 새우의 껍질, 오징어 뼈, 곰팡이, 버섯류 및 세균 등의 미생물의 세포벽에 함유되어 있는 키틴(chitin)을 탈아세틸화하여 얻어지는 천연물질을 의미한다.
상기 용어 "TEMPO"은 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실 또는 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥시다닐로 알려져 있으며, (CH2)3(CMe2)2NO의 화학식을 갖는 화합물을 의미한다.
상기 용어 "셀룰로오스 나노섬유"는 보통 직경(폭)이 5~100 nm, 길이가 수 마이크로 미터(μm)에서 수십 마이크로 미터(μm)인 섬유를 의미한다.
상기 용어 "수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유(TEMPO-oxidized cellulose nanofiber)"은 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실 또는 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥시다닐로 알려져 있는 TEMPO의 수성형태를 이용하여 산화된 섬유를 의미한다.
상기 용어 "세포외 기질(extracellular matrix)"은 조직 내 또는 세포 외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체를 의미한다. 상기 세포외 기질은 세포의 유형 또는 세포의 분화 정도에 따라 그 성분이 달라질 수 있으며, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유성단백질과 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 등의 복합단백질, 그리고 파이브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 당단백질로 구성될 수 있다.
상기 용어 "트롬빈(Thrombin)"은 혈액 응고에 관여하는 단백질 분해효소를 의미한다. 상기 트롬빈은 혈관 손상이나 출혈시에 피브리노겐(Fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 변화시키는 역할을 하여 혈액을 응고시킨다.
상기 용어 "가교 결합"은 중합체를 연결하는 하나 이상의 결합(전형적으로 공유 결합)을 의미한다.
일 실시예에 있어서, 상기 결합은 아미드 결합(Amide bond), 수소 결합(hydrogen bond), 인산화 결합(phosphate bond), 이황화 결합(disulphide bond) 및 에스테르 결합(ester bond)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 결합은 아미드 결합(Amide bond)일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 나노복합체는 생분해성일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 나노복합체는 30 ㎛ 내지 200 ㎛ 직경의 기공을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 나노복합체는 30 ㎛ 내지 200 ㎛, 30 ㎛ 내지 190 ㎛, 30 ㎛ 내지 180 ㎛, 35 ㎛ 내지 200 ㎛, 35 ㎛ 내지 190 ㎛, 30 ㎛ 내지 180 ㎛, 40 ㎛ 내지 200 ㎛, 40 ㎛ 내지 190 ㎛ 또는 40 ㎛ 내지 180 ㎛ 직경의 기공을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 키토산(Chitosan), 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber), 세포외 기질(extracellular matrix) 및 트롬빈(Thrombin)을 포함하는 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물을 제공한다.
상기 "키토산", "수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유", "세포외 기질", "트롬빈" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 용어 "지혈(hemostasis)"은 출혈을 멈추게 하는 과정으로, 손상된 혈관 내의 혈액을 유지시키는 것을 의미한다.
상이 용어 "창상(wound)"은 외부의 압력에 의하여 조직의 연속성이 파괴되거나, 일부 영역에 결손이 생기는 상태를 의미한다. 또한, 상기 창상은 외부 조직인 피부에 생긴 창상만을 의미하는 것이 아닌 신체 내부 조직의 창상을 포함한다.
상기 용어 "치료(treatment)"는 일 양상에 따른 조성물에 의해 개체의 창상 상태가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 개체는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 키토산의 농도는 0.05% w/v 내지 7% w/v일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 키토산의 농도는 0.05% w/v 내지 7% w/v, 0.05% w/v 내지 5% w/v, 0.05% w/v 내지 3% w/v, 0.1% w/v 내지 7% w/v, 0.1% w/v 내지 5% w/v, 0.1% w/v 내지 3% w/v, 0.5% w/v 내지 7% w/v, 0.5% w/v 내지 5% w/v 또는 0.5% w/v 내지 3% w/v일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 나노섬유의 농도는 0.01% w/v 내지 5% w/v일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 나노섬유의 농도는 0.01% w/v 내지 5% w/v, 0.01% w/v 내지 3% w/v, 0.01% w/v 내지 1% w/v, 0.05% w/v 내지 5% w/v, 0.05% w/v 내지 3% w/v, 0.05% w/v 내지 1% w/v, 0.1% w/v 내지 5% w/v, 0.1% w/v 내지 3% w/v 또는 0.1% w/v 내지 1% w/v일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 세포외 기질의 농도는 0.01% w/v 내지 5% w/v일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세포외 기질의 농도는 0.01% w/v 내지 5% w/v, 0.01% w/v 내지 3% w/v, 0.01% w/v 내지 1% w/v, 0.05% w/v 내지 5% w/v, 0.05% w/v 내지 3% w/v, 0.05% w/v 내지 1% w/v, 0.1% w/v 내지 5% w/v, 0.1% w/v 내지 3% w/v 또는 0.1% w/v 내지 1% w/v일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 세포외 기질은 탈세포화된 것일 수 있다.
상기 용어 "탈세포화(decellularization)"는 세포 또는 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다.
일 실시예에 있어서, 상기 세포외 기질은 간, 위, 대장, 췌장, 유방, 폐, 직장 및 자궁 세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세포외 기질은 간으로부터 유래된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 트롬빈의 농도는 50 NIH/ml 내지 150 NIH/ml일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트롬빈의 농도는 50 NIH/ml 내지 150 NIH/ml, 50 NIH/ml 내지 130 NIH/ml, 50 NIH/ml 내지 110 NIH/ml, 70 NIH/ml 내지 150 NIH/ml, 70 NIH/ml 내지 130 NIH/ml, 70 NIH/ml 내지 110 NIH/ml, 90 NIH/ml 내지 150 NIH/ml, 90 NIH/ml 내지 130 NIH/ml 또는 90 NIH/ml 내지 110 NIH/ml일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 비용혈성(non-hemolytic)일 수 있다.
상기 용어 "비용혈성(non-hemolytic)"은 용혈성(hemolytic)과 반대로 적혈구가 파괴되지 않는 것을 의미한다.
상기 용어 "용혈성(hemolytic)"은 적혈구가 파괴되어 내용물(세포질)이 주변 액체(예: 혈장) 안으로 용해되는 것을 의미한다.
일 실시예에 있어서, 상기 지혈 기능은 지혈 시간을 단축시키는 것일 수 있다.
상기 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다.
상기 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다.
상기 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물은 비경구투여에 적합하도록 제조될 수 있다.
따라서, 상기 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제등을 포함할 수 있고, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
상기 비경구투여는 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 사용하여 이루어질 수 있다.
또한, 상기 피부 외용제의 형태로 제조될 수 있다.
상기 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물은 목적하는 신체 부위에 따라 그 제형이 특별히 한정되지 않으며, 당업계의 공지기술을 참조하여 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 오일제, 왁스제, 유탁액제, 현탁액제, 겔제 또는 에어로졸제 등 형태로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물은 통상적인 첨가제, 예를 들어 보존제, 의약 침투를 보조하는 용매, 연고 및 크림의 경우 연화제 등을 포함할 수 있으며, 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 통상적 담체를 함유할 수 있다.
상기 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물은 상술한 성분에 한정되지 않고, 필요에 따라 통상의 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물에 배합되는 다른 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기 또는 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한 (制汗)제, 정제수 등을 포함할 수 있다.
일 실시예에서는 키토산(Chitosan), 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber), 세포외 기질(extracellular matrix) 및 트롬빈(Thrombin)을 포함하는 조성물의 전혈 응고 분석을 수행한 결과, 상기 조성물의 혈액 응고 능력이 우수하고, 비용혈(non-hemolytic) 활성을 가지며, 지혈 특성을 현저하게 개선시킴을 확인하였다(실시예 2.(4) 참조).
다른 실시예에서는 상기 조성물의 세포 적합성을 확인한 결과, 세포에 독성을 나타내지 않으며, 지혈 시간을 단축시킴을 확인하였다(실시예 2.(5) 참조).
또 다른 실시예에서는 상기 조성물의 상처 치유 효과를 확인하기 위해, 간 세포를 손상 후 조성물을 처리한 결과, 간 상처가 치유된 것을 확인하였다(실시예 2.(7) 참조).
또 다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 시트를 제공한다.
상기 "조성물", "지혈 기능", "창상", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 키토산(Chitosan) 용액에 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber)를 첨가하는 단계;
상기 나노섬유가 첨가된 키토산 용액에 세포외 기질(extracellular matrix)을 추가하는 단계; 및
상기 세포외 기질이 추가된 키토산 용액에 트롬빈(Thrombin) 용액을 혼합하는 단계;를 포함하는, 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 나노복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 "키토산", "수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유", "세포외 기질", "트롬빈", "지혈 기능", "창상", "치료", "나노복합체" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 추가하는 단계에서 상기 세포외 기질은 탈세포화된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 추가하는 단계에서 상기 세포외 기질은 간, 위, 대장, 췌장, 유방, 폐, 직장 및 자궁 세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 추가하는 단계에서 상기 세포외 기질은 간으로부터 유래된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 첨가하는 단계 이후 추가하는 단계 이전에 상기 키토산 용액을 교반하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 추가하는 단계 이후 혼합하는 단계 이전에 상기 세포외 기질이 추가된 키토산 용액을 동결 건조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 나노복합체 및 이를 포함하는 조성물이 혈액 응고 능력, 지혈 및 상처 치유 효과가 우수함을 확인하였는 바, 지혈, 재생 및/또는 다중 기능 창상 치료와 관련된 시장/산업에 활용될 수 있다.
도 1은 CN/CS/EM-Th 생분해성 지혈 나노복합체 제조공정의 모식도이다.
도 2a는 제조된 지혈 나노복합체의 기공의 표면(a' 내지 d'), 단면(e' 내지 h'), 고배율(i' 및 j') SEM 현미경 이미지(표면, 단면 및 고배율 이미지는 50X, 100X 및 2000X 배율)를 나타내는 도이다(용해되지 않은 현탁된 ECM 입자는 노란색 화살표로 표시).
도 2b는 CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th 나노복합체의 기공 직경의 퍼센트 빈도를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 2c는 TEMPO 산화 셀룰로오스 나노 섬유(TOCN), 키토산(Chitosan) 및 세포외 기질(ECM), 트롬빈(Th)의 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 스펙트럼을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 2d는 TOCN에 키토산, ECM 및 트롬빈을 포함시킨 후, 복합 CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th의 흡수 피크를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 L-ECM의 구성을 나타내는 도이다.
도 4a는 다른 시간 간격으로 PBS에 침지한 후 시험관 내 팽윤 거동을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4b 및 도 4c는 PBS 용액을 포함하는 라이소자임(lysozyme)에 14일 동안 37℃로 침지한 후 다양한 복합재료의 시험관 내 분해(b) 및 퍼센트 중량 손실 거동(c)을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4d 내지 도 4f는 액체 치환법에 의한 다양한 나노복합체의 다공성 백분율(d), 탈이온수 및 시트르산 전혈에 의한 복합재의 수분 흡수율(E) 및 혈액 흡수 능력(F)을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5a 내지 도 5e는 시료 표면의 혈전 형성 디지털 사진(a), 150초 후 가장 높은 BCI(혈액 응고 지수)와 가장 느린 혈액 응고 속도를 나타내는 게이지를 대조군으로 사용한 복합 스펀지의 시험관 내 동적 전혈 응고 평가 (b), PBS를 음성으로 Triton X-100을 양성 대조군으로 사용한 복합체의 용혈 활성 디지털 이미지(c), 혈액 용혈비를 측정하여 비교(d), 다른 지혈 복합재료에 대한 혈소판 및 혈구 접착 거동의 SEM 현미경 이미지(e)를 확인한 결과를 나타내는 도이다(스케일 바: 20 μm)(오차 막대는 양방향 ANOVA, n=3)을 사용하여 평균 ± SD(P<0.0001)를 나타냄).
도 6은 제조된 나노복합체의 세포적합성을 평가하기 위해 L929 섬유아세포를 이용하여 1일, 3일 및 7일 후의 광밀도 변화를 비색 MTT assay로 측정(A)하고, 상관 정성적 형광 이미지(B)를 평가한 결과를 나타내는 도이다(FITC 및 HOECHEST에 의해 각각 시각화된 F-액틴 및 핵 스케일 바 200 ㎛).
도 7은 상업적으로 이용 가능한 SURGICEL을 사용한 CN/CS/EM-Th 복합재의 지혈 평가 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 2주 및 4주 후 간 이식 영역에서 SURGICEL 및 CN/CS/EM-Th 샘플의 저배율, 고배율 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 이미지를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 쥐 간 출혈 모델에서 CN/CS/EM-Th 복합재료의 지혈 및 간 상처 치유 메커니즘을 나타내는 도이다.
도 10은 α-평활근 액틴(α-SMA) 및 피브로넥틴 면역조직화학적 염색 샘플(Surrgicel 및 CN/CS/EM-Th)이 2주 및 4주 후 쥐 간(A 및 C)에 이식된 영역(Scale bar 100 μm), α-SMA 및 피브로넥틴(B 및 D)의 적분 광학 밀도 백분율을 비교한 히스토그램을 나타내는 도이다.
도 2a는 제조된 지혈 나노복합체의 기공의 표면(a' 내지 d'), 단면(e' 내지 h'), 고배율(i' 및 j') SEM 현미경 이미지(표면, 단면 및 고배율 이미지는 50X, 100X 및 2000X 배율)를 나타내는 도이다(용해되지 않은 현탁된 ECM 입자는 노란색 화살표로 표시).
도 2b는 CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th 나노복합체의 기공 직경의 퍼센트 빈도를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 2c는 TEMPO 산화 셀룰로오스 나노 섬유(TOCN), 키토산(Chitosan) 및 세포외 기질(ECM), 트롬빈(Th)의 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 스펙트럼을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 2d는 TOCN에 키토산, ECM 및 트롬빈을 포함시킨 후, 복합 CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th의 흡수 피크를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 L-ECM의 구성을 나타내는 도이다.
도 4a는 다른 시간 간격으로 PBS에 침지한 후 시험관 내 팽윤 거동을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4b 및 도 4c는 PBS 용액을 포함하는 라이소자임(lysozyme)에 14일 동안 37℃로 침지한 후 다양한 복합재료의 시험관 내 분해(b) 및 퍼센트 중량 손실 거동(c)을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4d 내지 도 4f는 액체 치환법에 의한 다양한 나노복합체의 다공성 백분율(d), 탈이온수 및 시트르산 전혈에 의한 복합재의 수분 흡수율(E) 및 혈액 흡수 능력(F)을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5a 내지 도 5e는 시료 표면의 혈전 형성 디지털 사진(a), 150초 후 가장 높은 BCI(혈액 응고 지수)와 가장 느린 혈액 응고 속도를 나타내는 게이지를 대조군으로 사용한 복합 스펀지의 시험관 내 동적 전혈 응고 평가 (b), PBS를 음성으로 Triton X-100을 양성 대조군으로 사용한 복합체의 용혈 활성 디지털 이미지(c), 혈액 용혈비를 측정하여 비교(d), 다른 지혈 복합재료에 대한 혈소판 및 혈구 접착 거동의 SEM 현미경 이미지(e)를 확인한 결과를 나타내는 도이다(스케일 바: 20 μm)(오차 막대는 양방향 ANOVA, n=3)을 사용하여 평균 ± SD(P<0.0001)를 나타냄).
도 6은 제조된 나노복합체의 세포적합성을 평가하기 위해 L929 섬유아세포를 이용하여 1일, 3일 및 7일 후의 광밀도 변화를 비색 MTT assay로 측정(A)하고, 상관 정성적 형광 이미지(B)를 평가한 결과를 나타내는 도이다(FITC 및 HOECHEST에 의해 각각 시각화된 F-액틴 및 핵 스케일 바 200 ㎛).
도 7은 상업적으로 이용 가능한 SURGICEL을 사용한 CN/CS/EM-Th 복합재의 지혈 평가 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 2주 및 4주 후 간 이식 영역에서 SURGICEL 및 CN/CS/EM-Th 샘플의 저배율, 고배율 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 이미지를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 쥐 간 출혈 모델에서 CN/CS/EM-Th 복합재료의 지혈 및 간 상처 치유 메커니즘을 나타내는 도이다.
도 10은 α-평활근 액틴(α-SMA) 및 피브로넥틴 면역조직화학적 염색 샘플(Surrgicel 및 CN/CS/EM-Th)이 2주 및 4주 후 쥐 간(A 및 C)에 이식된 영역(Scale bar 100 μm), α-SMA 및 피브로넥틴(B 및 D)의 적분 광학 밀도 백분율을 비교한 히스토그램을 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 방법
(1) 실험 재료의 준비
TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유(TOCN: TEMPO-oxidized cellulose nanofiber)(농도 0.5%)는 한국 산림 연구원에서 제공받았으며, 간 세포외 기질(L-ECM: Liver extracellular matrix)은 순천향대학교 조직재생연구소 재생의학과에서 탈세포화 과정을 거쳐 제조하였다. 소듐 도데실 설페이트(SDS: Sodium Dodecyl sulphate) 및 Triton X-100은 각각 Bio-Rad Laboratories 및 Sigma, USA에서 구입하였다. 탈아실화 키틴(Chitin)의 키토산(Chitosan)(>75% 탈아실화) 및 소 혈장의 트롬빈(Thrombin) (157 NIH units/mg protein, T7326-1KU)은 미국 Sigma-Aldrich Co에서 구입하였고, L929 섬유아세포주(L929 fibroblast cell line)는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. 시험관 내 연구는 Eagle's Minimum Essential Medium(CORNING), 태아 소 혈청(FBS; Thermo Fisher Scientific, USA), 페니실린(100 U/ml) 스트렙토마이신(100 U/ml)(PS; ThermoFisher Scientific, USA), Gibco ™ trypsin-EDTA (Thermo Fisher Scientific, USA), Gibco ™ 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT; Thermo Fisher Scientific, USA), Dimethyl sulfoxide 99.5% (DMSO; Daejung Chemicals & Metals CO., Korea), Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA), ethyl alcohol anhydrous 99.5% (Daejung Chemicals & Metals CO., Korea), phosphate buffer saline tablets (PBS; Sigma, USA)를 이용하여 수행하였다. 생체 내 연구를 위해 DBL(Chungcheongbuk, Korea)에서 12주령 수컷 Sprague-Dawley 쥐(Rattus norvegicus)(각각 250 g 내지 300 g)를 획득하였다. 모든 동물 실험 및 프로토콜은 대한민국 순천향대학교 동물윤리위원회에서 검토 및 승인받았다(승인 번호-SCH-0061).
(2) 탈세포화된 간 세포외 기질(L-ECM: liver extracellular matrix)의 준비
신선한 돼지 간은 대한민국 천안의 포크빌 축산경매장(Porkvill Livestock Auction Centre)에서 구입하였으며, -80℃에 보관하였다. 탈세포화 과정을 시작하기 전에 간을 해동하고, 샤프 블레이드(Sharpe blade)를 이용하여 약 5 mm 내지 10 mm로 절단하였다. 절단한 간을 증류수(distilled water)로 10분 간격으로 5회 세척하여 찌꺼기 및 부착된 혈액을 제거하였다. 그 후, 0.5%의 소듐 도데실 설페이트(SDS) (Bio-Rad Laboratories, California, USA) 용액을 넣어 탈세포화 과정을 시작하고, 12시간 마다 용액을 교체하였다. 48시간 처리 후 색이 흰색으로 변했을 때 SDS 농도를 0.1%로 감소시킨 후, 12시간 동안 0.1%의 Triton X-100(Sigma, USA)으로 처리하였다. 탈세포화된 간 세포외 기질(L-ECM) 조각을 증류수로 세척하여 잔류 SDS 또는 Triton X-100을 제거하였다. 또한, 항생제가 첨가된 1X PBS로 추가 세척하고, 4℃에서 4일 동안 보관하였다. 이후, 탈세포화된 간 ECM을 48시간 동안 동결 건조하고, Mixer Mill(Retsch MM 400)에서 액체 질소를 이용해 저온 분쇄하여 L-ECM 분말을 얻었으며, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
(3) 간 세포외 기질(L-ECM: liver extracellular matrix)의 조직학적 및 생화학적 분석
H&E 염색을 통한 조직학적 평가(Histological evaluation), 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 통한 DNA 함량, Sirius Red Collagen Detection assay kit(Chondrex, Inc)를 이용한 콜라겐 함량 및 Blyscan Sulfated glycosaminoglycan assay kit(Biocolor Ltd.)를 이용한 황산화 글리코사미노글리칸 (sGAG: Sulfated glycosaminoglycan) 함량은 제조업체의 지침에 따라 분석하였다.
(4) 나노복합체(nanocomposites)의 제조
키토산(Chitosan) 용액(1% w/v)은 아세트산(acetic acid) 용액(1% v/v)에 용해하여 제조하고, 투명한 연황색 용액(coloured solution)이 형성될 때까지 교반하였다. 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber) 0.5%를 50:50 혼합 부피비로 교반하면서 키토산 용액에 천천히 첨가하였다. 복합물의 조성 및 명명법은 표 1에 나타내었다. 이후, 슬러리(slurry)를 마이크로 호모지나이저(micro homogenizer)(LK Lab, HG1010)를 이용하여 혼합하고, 자석 교반기(magnetic stirrer)에서 실온에서 2시간 동안 유지시켰다. 슬러리의 pH는 1 M의 NaOH를 한 번에 한 방울(dropwise) 첨가하여 아세테이트(acetate)를 제거하고, CN/CS 복합 슬러리를 형성하여 pH를 7로 유지하였다. 그 후, 0.5%의 L-ECM cryogrind 분말을 CN/CS/EM으로 표시된 생성된 슬러리에 첨가하고, 동일한 부피(10 ml)의 CN, CN/CS 및 CN/CS/EM 슬러리를 폴리스티렌 페트리 접시(polystyrene petri dishes)(SPL Life Sciences, Korea, 35 x 10 mm, 충전 깊이 약 10 mm)에 붓고, 상 분리를 방지하기 위해 -20℃ 및 -80℃에서 각각 6시간 및 12시간 동안 구배 동결(gradient freezing)하에 유지하였다. 슬러리 복합물을 탁상형 수직 동결 건조기(table top vertical freeze dryer)(ilShin Biobase Europe Ltd., Netherlands(Model-FD5508))에 2일 동안 두어 나노복합체를 형성하였다. 마지막으로, 소 혈장의 트롬빈(Thrombin)(T7326-1KU)을 증류수에 용해시켜 트롬빈 용액을 제조하고, CN/CS/EM 스캐폴드(scaffold)에 100 NIH/ml 농도로 첨가한 후, 나노복합체를 CN/CS/EM-Th의 후속 생성(subsequent generation)과 함께 다시 동결 건조하였고, 트롬빈 분해를 방지하기 위해 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다(도 1).
| Sample Name | TOCN (%w/v) | Chitosan (%w/v) |
Percent Ratio (T:CS) | L-ECM (% w/v) |
Thrombin (NIH/ml) |
| CN | 0.5 | X | X | X | X |
| CN/CS | 0.5 | 1 | 50:50 | X | X |
| CN/CS/EM | 0.5 | 1 | 50:50 | 0.50 | X |
| CN/CS/EM-Th | 0.5 | 1 | 50:50 | 0.50 | 100 |
CN: TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TOCN: TEMPO oxidized cellulose nanofiber), CS: 키토산(Chitosan), EM: 세포외 기질(Extracellular Matrix(L-ECM)), Th: 트롬빈(Thrombin)
(5) 형태학(Morphology) 및 기공 크기의 평가
동결 건조된 복합 시료(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 표면 및 단면 미세 구조를 전자 현미경(JEOL, JSM-6701F, Tokyo, Japan)을 이용하여 시각화하였다. 동결 건조된 샘플의 작은 조각은 SEM 샘플 홀더(SEM sample holder)에 샘플을 놓기 전에 백금 스퍼터 코팅기(platinum sputter coater)(Cressington Scientific Instrument, UK)를 이용하여 코팅하였고, SEM 이미지를 얻기 위해 10 kV의 가속 전압을 이용하였다. 스캐폴드(scaffold)의 기공 크기는 SEM(JEOL, JSM-6701F, Tokyo, Japan)을 이용하여 기공의 직경을 측정하였다. 스캐폴드 전체(하나에 약 20개)에서 기공의 직경을 측정하고, 백분율 빈도를 표시하였다.
(6) 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR: Fourier transform infrared spectroscopy)을 이용한 FTIR 스펙트럼 분석
복합재료(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th) 및 원료(TOCN, 키토산 및 L-ECM)의 FTIR 스펙트럼은 OMNIC 버전 7.3 소프트웨어의 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR: Fourier transform infrared spectroscopy)(Thermo Scientific Nicolet iS10 spectrometer)을 이용하여 분석하였다. 모든 스펙트럼은 650 내지 4000 cm-1 및 8 cm-1 분해능의 파수 범위에서 기록하였다.
(7) 복합재료의 팽윤 경향(Swelling tendency) 분석
제조된 복합재료의 팽윤 경향(Swelling tendency)은 미리 칭량된 샘플을 실온의 페트리 접시의 PBS(pH 7.2 내지 7.4)에 1분, 30분, 60분, 90분, 120분 및 180분 동안 넣어 관찰하였다. 상기 시간 간격 후에 여과지를 이용하여 샘플에서 잔류 PBS를 제거하고, 저울을 이용하여 젖은 샘플(wet samples)의 무게를 측정하였다. 이때, 퍼센트 팽윤율은 하기 수학식 1로 계산하였고, Wi 및 Ws는 각각 건조 및 팽윤된 샘플의 무게를 나타낸다.
[수학식 1]
(8) 시험관내 분해 거동(Degradation behaviour)의 분석
미리 칭량된 복합재료(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)를 37℃에서 1X-PBS 용액을 포함하는 2 mg/ml Lysozyme(Hen egg white, Sigma-Aldrich)에 1일, 3일, 7일 및 14일 동안 보관하여 분해 거동(Degradation behaviour)을 관찰하였다. 설정된 시간 간격 후에 샘플을 수집하고 탈이온수로 세척하였으며, 동결 건조 후 무게를 측정하였고, 라이소자임(Lysozyme) 용액을 매일 새로운 용액으로 교체하였다. 복합재료 스캐폴드의 나머지 무게는 하기 수학식 2에 의해 결정되었고, Wi 및 Wf는 서로 다른 시간 간격으로 배양한 후 복합재료의 초기 및 최종 중량을 나타낸다.
[수학식 2]
(9) 다공성(Porosity) 및 수분/혈액 흡수 능력의 분석
건조된 복합재료 샘플의 다공성(Porosity)은 동일한 크기(1 cm3)의 샘플을 에탄올에 포화될 때까지 침지하고, 액체 치환법을 이용하여 측정하였다. 다공성은 하기 수학식 3으로 측정하였고, Wi와 Wf는 에탄올에 담그기 전과 후의 샘플의 초기 중량 및 최종 중량을 나타내며, V와 ρ는 각각 건조 샘플의 부피와 절대 에탄올의 밀도(0.785 g/cm3)를 나타낸다.
[수학식 3]
수분 및 혈액 흡수능은 동일한 크기의 미리 칭량된 복합재료를 각각 이중 증류수 및 전혈에 침지하여 측정하고 포화 직후 측정을 수행하였다. 수분 및 혈액 흡수 능력은 하기 수학식 4로 측정하였고, Wd 및 Ws는 각각 건조 및 포화 샘플 중량을 나타낸다.
[수학식 4]
(10) 시험관내 혈액적합성(hemocompatibility) 평가
혈액은 혈장과 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판)로 구성되어 있어 혈전, 용혈, 활성화 또는 생체 물질과 접촉 시, 조성 변화를 일으켜 생명에 해로울 수 있다. 시험관내 전혈 응고 평가 및 용혈 비율 연구는 혈액 응고 및 적혈구에 대한 스캐폴드의 영향에 직접적인 영향을 미친다. 혈소판 부착 및 활성화는 생체 물질에 도입된 후의 생체 물질의 혈전성 형질도입을 위한 주요 기준으로 간주된다. 따라서 CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th 복합재료의 혈액적합성(hemocompatibility)을 혈액 응고 능력, 용혈 비율, 혈소판 및 전혈 부착 행동을 기반으로 평가하였다.
건강한 Sprague-Dawley 쥐(Rattus norvegicus)로부터 1:10 비율의 산 구연산염 덱스트로스(ACD: Acid Citrate Dextrose) 용액을 포함하는 tube(튜브)에서 혈액을 수집하였다. 혈액 응고 지수 및 혈구 부착의 평가를 위해 전혈을 이용하였고, 전혈을 2,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장(PRP: Platelet Rich Plasma)을 제조하고, 침전물로부터 얻은 적혈구를 이용하여 용혈율을 평가하였다.
1) 전혈 응고 능력 평가
전혈 응고 능력은 퍼센트 혈액 응고 지수(BCI: blood clotting index)를 이용하여 측정하였다. 1 cm x 1 cm 크기의 지혈복합체(fixed situation)를 37℃의 고정된 위치에 놓고, 재석회화(recalcification)를 위해 구연산이 처리된 전혈에 0.2 M CaCl2(혈액 중 10 mM)를 첨가하여 응고를 유도하였다. 50 μL의 재석회화된 전혈을 폴리스티렌 웰 플레이트(polystyrene well plates)의 예열된 복합재료에 넣은 후, 외과용 거즈를 대조군으로 구현한 37℃에서 30초, 60초, 90초, 120초 및 150초 동안 배양하였다. 그 후, 10 ml의 초순수 탈이온수를 응고되지 않도록 미리 설정된 시간 간격 후에 각 웰 플레이트에 첨가하였다. 상등액으로부터 3개의 복제물을 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에서 채취하고, PerkinElmer, VictorTMX3 다중표지 판독기를 이용하여 540 nm 파장에서 관찰하였다. 50 μL의 재석회된 전혈과 10 ml의 탈이온수는 참조 값을 얻기 위한 음성 대조군으로 이용하였다. 복합재료의 혈액 응고 지수는 하기 수학식 5에 의해 측정되었고, Is와 Ir은 각각 시료의 흡광도와 기준값을 나타낸다.
[수학식 5]
2) 시험관내 용혈 분석
구연산 혈액을 원심분리한 후, 침전물을 PBS로 두 번 세척한 후 적혈구를 획득하였다. 세척된 적혈구를 분석을 수행하기 위해 2%(v/v)의 PBS로 추가 희석하였다. PBS로 37℃에서 24시간 동안 배양하여 제도된 복합재료(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th) 추출물을 이용하여 분석하였다. 그 후, 0.2 ml의 적혈구 현탁액을 0.1% Triton-X100 및 PBS와 함께 10 ml의 각 샘플 추출물에 각각 양성 및 음성 대조군으로 도입하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 마지막으로 혼합된 적혈구 현탁액을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 PerkinElmer, VictorTMX3 multilabel reader를 이용하여 540 nm에서 상등액의 흡광도를 측정하여 용혈율을 측정하였다. 용혈율은 하기 수학식 6에 의해 결정되었고, As, Ap 및 An은 각각 샘플, 양성 대조군 및 음성 대조군 상등액의 흡광도를 나타낸다.
[수학식 6]
3) 복합재료의 혈소판 및 전혈 상호작용 분석
복합재료의 혈소판 및 전혈 상호작용의 분석은 X. Zhao, B. Guo, H. Wu, Y. Liang, P.X. Ma, Injectable antibacterial conductive nanocomposite cryogels with rapid shape recovery for noncompressible hemorrhage and wound healing, Nature communications 9(1) (2018) 1-17 및 F. Cheng, C. Liu, X. Wei, T. Yan, H. Li, J. He, Y. Huang, Preparation and characterization of 2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPO)-oxidized cellulose nanocrystal/alginate biodegradable composite dressing for hemostasis applications, ACS Sustainable Chemistry & Engineering 5(5) (2017) 3819-3828.에 기재된 바와 같이 혈소판 풍부 혈장(PRP: Platelet rich plasma) 및 산 구연산염 덱스트로스(ACD: Acid Citrate Dextrose) 전혈과 함께 복합재료(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)를 이용하여 수행하였다. 모든 샘플은 실험 전에 두 그룹으로 나누어 1 cm2 크기로 절단하여, 37℃에서 보관하였다. 그 후, ACD 전혈을 한 번에 한 방울씩(dropwise) 첨가하고, 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 샘플에 전혈을 원심분리하여 만든 PRP를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, PBS 용액으로 3회 세척하여 부착되지 않은 혈구를 제거하였다. 혈구-복합체 상호작용을 시각화하기 위해 세척된 복합재료를 2.5%의 글루타르알데히드 용액(glutaraldehyde solution)으로 2시간 동안 고정한 후, 10분 간격으로 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100%의 에탄올 계열로 탈수를 수행하였다. 마지막으로 백금으로 스퍼터 코팅(sputter coating)한 후 SEM(JEOL, JSM-6701 F, Tokyo, Japan)을 이용하여 샘플을 관찰하기 위해 흄 후드(fume hood)에서 24시간 동안 공기 건조하였고, SEM 이미지를 얻기 위해 10 kV 가속 전압(acceleration voltage)을 이용하였다.
(11) 시험관 내 세포 생존 및 세포 증식 연구
L929 섬유아세포는 EMEM, 10% HS(Horse serum, Gibco), 1% 페니실린(100 U/ml) 및 스트렙토마이신(100 U/ml)이 포함된 배지에서 37℃ 및 5% CO2 대기의 습도 조절 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 생존 및 증식 연구를 위해 세포 파종 전에 모든 샘플을 Ethelene Oxide 챔버(Hanshin Medical Co, Ltd.)에서 밤새 노출시켜 멸균하고, 1 cm2 크기로 절단하였으며, 24웰 매달린 삽입 세포 배양 플레이트(24 well hanging insert cell culture plates)에 넣었다.
제조된 복합 샘플의 세포 독성 수준을 결정하기 위해 표준 시험 프로토콜을 이용하고, 비색 MTT 분석을 통해 시험관내 세포 생존력 분석을 수행하였다. 샘플을 매달린 삽입물(hanging insert)에 놓고, 24웰 세포 배양 플레이트에서 세포에 L929 세포 현탁액(약 2 x 104개 세포/웰)을 접종하였다. 샘플이 없는 웰을 대조군으로 사용하였고, 모든 매달린 삽입물(hanging insert)을 배양 배지로 채웠다. 세포가 접종된 플레이트(Cell seeded plates)는 37℃ 및 5% CO2에서 1일, 3일 및 7일 동안 유지하였다. 100 ㎕ MTT 용액(5 mg/ml)의 분취량을 각 웰에 첨가한 다음 4시간 동안 재인큐베이션하여 포르마잔 결정(formazan crystal)을 형성하였다. 이후, 포르마잔 층을 건들이지 않고, MTT 용액을 흡인한 후 각 웰에 400 μl DMSO(Dimethyl Sulfoxide)를 도입하고, 가용화를 위해 교반하면서 37℃에서 추가로 30분 동안 배양하였다. 광학 밀도(OD: optical density)는 다중 라벨 판독기(multilabel reader)(PerkinElmer, VictorTMX3)를 이용하여 570 nm 파장에서 측정하였다. 서로 다른 샘플에서 L929 세포의 점진적인 세포 증식 및 형태는 1일, 3일 및 7일 동안 37℃ 및 5% CO2 가습 대기(humidified atmosphere)에서 배양된 약 2×104개의 세포가 파종된 24웰 매달린 삽입 세포 배양 플레이트(24 well hanging insert cell culture plates)에서 관찰하였다. 플레이트 바닥의 세포는 다음 날 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)(Sigma-Aldrich)로 고정하고, Triton-X100(Bio-Rad, USA)으로 투과시키고, 소 혈청 알부민으로 차단하여 비특이적 단백질 결합을 방지하였다. 25 μg/ml 플루오레세인 이소티오시아네이트가 결합된 팔로이딘(Fluorescein isothiocyanate conjugated Phalloidin)(FITC, Sigma-Aldrich) 및 1 μg/ml Hoechest 33342(Invitrogen, USA)를 이용하여 필라멘토스 액틴(filamentous actin)과 핵(nuclei)을 염색하고, NIS-Elements AR 5.20 Viewer 소프트웨어와 결합된 형광 현미경(Nikon, ECLIPSE-Ti2, Tokyo, Japan)으로 각각 시각화하였다.
(12) 생체 내 실험
1) 생체 내 지혈 성능 평가
제조된 복합재료의 지혈 거동(hemostatic behaviour)은 쥐 꼬리 절단 모델(rat tail amputation model)과 쥐 간 박리 모델(rat liver avulsion model) 모두에서 평가하고, 산화 재생 셀룰로오스(oxidised regenerated cellulose)로 구성된 상업적으로 이용 가능한 서지셀 게이지(Surgicel gauge)(대조군)와 비교하였다. 생후 10주된 Sprague-Dawley(Rattus norvegicus) 쥐(평균 250 gm 무게)를 충분한 음식과 물이 있는 표준 케이지에 보관하였고, 적응을 위해 7일 동안 상온(25℃)에서 사육하였다. 모든 동물 실험은 대한민국 순천향대학교 동물연구승인위원회(승인번호 SCH21-0061)에 따라 수행하였다.
꼬리 절단 모델에서 지혈 평가를 위해 6 마리의 쥐를 두 그룹으로 나누고, 이소플루란(Isoflurane)(Terrel, USA), 산소 및 N-2O 가스의 혼합물로 마취시켰다. 꼬리의 50%를 수술용 가위로 자르고, 15초 동안 출혈을 기다렸다. 이후, 트롬빈 로딩 복합 샘플(thrombin-loaded composite sample)(CN/CS/EM-Th) 또는 시판되는 Surgicel을 출혈 부위에 적용하고, 출혈 시간을 스톱워치로 기록하였다. 사전 가중 게이지, 샘플 및 Surgicel 게이지를 이용하고 각 샘플 그룹에서 분비된 혈액을 수집하여 손상 부위의 혈액 손실을 평가하였다.
간 박리 모델에서 지혈 평가를 위해 6 마리의 쥐를 두 그룹으로 나누고, 꼬리 절단 모델과 유사하게 마취시킨 후 마취 유지를 위해 3% 이소플루란(Isoflurane)을 투여하였다. 털을 제거하고, 70% 에탄올과 포비돈 요오드 용액(povidone iodine solution)으로 세척한 후 상복부(upper abdomen)의 정중선 절개(midline incision)를 통해 간의 좌엽(Left lobe)을 포셉(forceps)으로 늘렸다. 이후, 5 mm 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 간 상처(직경 5 mm)를 만들고, 간 코어(core)를 제거하여, 비압축성 상처를 준비하고 15초 동안 출혈을 기다렸다. 출혈 후, 트롬빈 로딩 복합 샘플(thrombin-loaded composite sample)(CN/CS/EM-Th) 또는 시판되는 Surgicel을 출혈 부위에 적용하고, 출혈 시간을 스톱워치로 기록하였다. 사전 가중 게이지, 샘플 및 Surgicel 게이지를 이용하고 각 샘플 그룹에서 분비된 혈액을 수집하여 손상 부위의 혈액 손실을 평가하였다.
2) 생체 내 간 상처 치유 평가
간 상처 치유 평가를 위해 12 마리의 쥐를 상업적인 Surgicel을 사용하는 그룹과 CN/CS/EM-Th 샘플을 사용하는 그룹(각각 6 마리, 2주 동안 3 마리, 4주 동안 3 마리의 연구)으로 나누어 앞에서 설명한 것과 유사하게 마취하고, 마취 유지를 위해 3% 이소플루란을 지속적으로 투여하였다. 털을 제거하고, 70% 에탄올과 포비돈 요오드 용액(povidone iodine solution)으로 세척한 후 상복부(upper abdomen)의 정중선 절개(midline incision)를 통해 간의 좌엽(Left lobe)을 포셉(forceps)으로 늘렸다. 이후, 5 mm 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 간 상처(직경 5 mm)를 만들고, 간 코어(core)를 제거하여, 비압축성 상처를 준비하였다. 간강(cavity of the liver)은 Surgicel 또는 CN/CS/EM-Th 복합재료(n=3)로 채우고 복부 절개를 봉합하였다. 수술 후 진통제와 항생제로 트라마돌(Tramadol)과 엔로플록사신(Enrofloxacin)을 근육 주사하였다. 동물은 2주와 4주 동안 충분한 음식과 물을 섭취하였고, 예상 기간(2주 및 4주)에 이소플루란을 과량 투여하여 쥐를 안락사하였다. 복부를 다시 열고, 간에 이식된 샘플을 4% 파라포름알데히드에서 수집하였다.
(13) 조직학적 분석
포름알데히드로 고정된 샘플은 세척하고 단계별 에탄올로 탈수한 후, 파라핀 블록에 포매하고, 마이크로톰(microtome)(Thermo Scientific, USA)을 이용하여 5 μm 두께로 절단하고, 제조업체 프로토콜 (Abcam, ab245880)에 따라 Hematoxylin 및 Eosin(H&E)으로 염색하였다. 염색된 조직 슬라이드는 카메라(Olympus DP72)와 결합된 광학 현미경(Olympus, BX53)으로 시각화하고 Cellsens 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
(14) 면역조직화학(IHC: Immunohistochemistry) 분석
면역조직화학염색(Immunohistochemical staining)은 HRP(horseradish peroxidase)/3, 3' Diaminobenzidine(DAB) 검출 IHC 키트(Abcam 64264, UK)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 간단히 말해서, 탈파라핀화되고 재수화(rehydrated)된 파라핀 포매 조직 절편(5 μm)을 구연산나트륨 완충액으로 95℃에서 10분 동안 가열하였다.
실온에서 냉각시킨 후 슬라이드를 과산화수소 블록 및 단백질 블록으로 덮고(각각 10분), 세척 완충액으로 세척하고 항-α-평활근 액틴(anti-α-smooth muscle actin)(1:100, #ab5694, Abcam) 및 항-피브로넥틴(1:100, #ab2413, Abcam) 1차 항체에 대항하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 슬라이드는 DAB 크로모젠(DAB chromogen)으로 배양한 후 비오틴화된(biotinylated) 염소 항-다가(goat anti-polyvalent) 및 스트렙타비딘 퍼옥시다제(streptavidin peroxidase)를 적용하였다. 대조 염색을 위해 조직 섹션의 핵을 제조사의 지침에 따라 헤마톡실린(hematoxylin)(H&E Stain Kit, Abcam, UK)으로 염색하고, 카메라(Olympus DP72)와 결합된 광학 현미경(Olympus, BX53)으로 시각화하고, Fiji-ImageJ 소프트웨어를 사용하여 퍼센트 광학 밀도(optical density)(%IOD)를 측정하였다.
(15) 통계 분석
모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시하였고, 통계적 분석은 Graph Pad Prism 7을 이용하여 t-test, 일방향 및 이방향 분산 분석(one-way and two-way analysis of variance)(ANOVA)을 이용하여 수행하였다. p < 0.05*, p < 0.001** 및 p < 0.0001*** 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
2. 실험 결과
(1) 복합재료들(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 기공 크기 확인
모든 동결 건조 샘플들(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)은 SEM을 통해 표면 및 단면 미세 구조로 시각화하였다(도 2a 내지 도 2d). 모든 샘플은 거친 표면을 포함하므로 CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th는 CN 스캐폴드를 나타낸 도 2a(a' 내지 d')에 비해 조밀하고, 거친 표면 구조를 나타냄을 확인하였다. 또한, 서로 연결된 다공성 구조를 관찰하였으나, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 시료의 조성에 따라 기공의 직경에 차이가 있음을 확인하였고, 스폰지 스캐폴드의 이러한 상호 연결성은 유체 및 기체 수송을 용이하게 함을 확인하였다. 해면질 생체 물질의 상호 연결된 다공성 네트워크는 형태학적 구조 외에도, 세포 부착, 조직 성장, 영양소 수송 및 유전자 발현을 위해 중요하다.
기공의 일관된 분포는 도 2a(e' 내지 h')의 다양한 스캐폴드의 단면 이미지를 통해 시각화하였으며, CN은 다른 모든 복합재료 중에서 150 ㎛ 내지 250 ㎛의 가장 큰 기공 직경을 나타냄을 확인하였고, 기공의 직경은 CN/CS 복합재료에 키토산을 첨가함으로써 50 ㎛ 내지 100 ㎛(전체 기공의 약 80%)로 크게 감소함을 확인하였다(도 2b). CN/CS/EM 스캐폴드를 형성하는데 사용된 비가용화된 ECM 분말의 추가는 기공 크기 분포에 거의 영향을 미치지 않았으나, 50 ㎛ 내지 100 ㎛ 기공의 빈도는 가장 높은 비율로 유지됨을 확인하였다. CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th의 단면 SEM 이미지에서 확인된 ECM 함유 복합 샘플의 반복된 동결 건조로 인해 트롬빈(Th)의 첨가에 따라 기공의 형태 및 크기가 약간 변경됨을 확인하였다(도 1, 도 2a(g') 및 도 2a(h')). 복합재료의 대표적인 기공 크기 분포 히스토그램(도 2b)은 CN/CS/EM-Th의 기공 직경이 CN/CS/EM보다 약간 큼(50 ㎛ 내지 150 ㎛)을 나타내었다. 이러한 미세 기공은 모세관 작용을 제공하고, 혈액/상처 삼출물 유지에 도움이 되며, 이는 트롬빈이 로딩된 CN/CS/EM-Th의 상호 연결되고 균일한 기공이 지혈제로 적합한 후보임을 의미한다. 탈세포화된 L-ECM 입자는 고배율 SEM 이미지에서 노란색 화살표로 표시된 CN/CS/EM-Th 복합재 전체에 걸쳐 현탁하여 시각화하였다 (도 2a(j')). ECM은 콜라겐 및 기타 통합 성장 인자의 공급원으로서, 손상 부위에 이식된 복합재의 분해 시 치유를 촉진한다.
(2) 복합재료들(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 FTIR 스펙트럼 확인
도 2c 및 도 2d는 원료(TOCN, 키토산, L-ECM 및 트롬빈)와 CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th 복합재료의 대표적인 FTIR 스펙트럼을 나타내고, TOCN에 대한 3351 및 2899 cm-1 흡수 피크는 O-H 및 C-H의 신축 진동에 기인함을 확인하였다. 1644 및 1060 cm-1 피크는 O-H 및 C-O-C 진동으로 구별되고, 키토산(CS)의 1641-1646 cm-1 및 1585 cm-1에서 특성 피크는 각각 C=O 스트레칭(아미드 I) 및 N-H(아미드 II) 벤딩 진동을 보유하고 있음을 확인하였다. 주로 콜라겐으로 구성된 탈세포화된 L-ECM의 포함(도 3); 1649 cm-1, 1545 cm-1 및 1390 cm-1에서의 흡수 밴드는 아미드 I의 C-O 스트레칭 진동, 아미드 II의 N-H 벤딩 진동 및 아미드 III의 스트레칭 진동은 콜라겐의 -CONH2 결합을 나타낸다. 트롬빈은 1600-1650 cm-1에서 C=O 스트레칭 진동, 1200-1360 cm-1에서 C-N 및 N-H 벤딩 진동의 특성 밴드를 포함하고, TOCN의 카르복실기(-COOH)는 가교제 없이 아미노(-NH2)기와 결합 형성 능력을 나타내었다. 따라서 CN/CS를 형성하는 키토산의 아미노기(-NH2)와 TOCN의 카르복실기(-COOH) 사이에 아미드 결합(Amide bond)이 형성되었다. L-ECM 및 Th의 특징적인 피크는 CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th 모두에서 확인하였고, 고유 분자의 피크와 유사하기 때문에 혼입이 잘 이루어짐을 확인하였다. 건조된 다공성 스폰지 복합 스캐폴드는 많은 양의 생물학적 유체를 흡수할 수 있고, 액체 물질과 접촉하면 최대 용량까지 팽윤하기 시작하며, 이 능력은 스캐폴드 구성에 사용된 재료의 유형에 따라 다르다. 도 4a에 나타낸 바와 같이 PBS 용액에서의 CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th 복합 스캐폴드를 포함하는 TOCN(CN)의 팽윤 특성을 확인하였고, 60분 후, 팽윤은 최고 수준에 도달하였으며, 나머지 관찰 시간 동안 일정한 수준을 유지함을 확인하였다.
(3) 복합재료들(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 팽윤율 확인
CN은 1분 후 최대 3,200%까지 팽윤하는 것을 확인하였고, 도 2a(e')에 나타낸 바와 같이 미세 구조에서 더 큰 기공의 존재로 인해 다른 모든 복합재료 중에서 팽윤이 가장 높음을 확인하였다. 팽윤율은 TOCN(CN) 및 키토산(CS)을 첨가한 후 1668%로 감소하였고, 이는 CN/CS 스캐폴드에 나타난 미세 기공의 존재로 인한 것임을 확인하였다. 또한, CN/CS에 L-ECM과 트롬빈을 첨가한 후, 팽윤율은 각각 1847%(CN/CS/EM)와 1963%(CN/CS/EM-Th)로 약간 증가하였으며, ECM의 액체 흡수 특성 및 반복 동결 건조로 인해 기공의 크기가 증가하였다. 그러나 PBS로 모든 스캐폴드를 포화시킨 후 CN/CS/EM-Th는 2127%까지 말단 팽윤을 나타냄을 확인하였다.
조직 치유를 지원하는 이식 가능한 생체 재료는 새로운 조직 형성 속도와 유사한 적절한 생분해성을 가질 필요가 있다. 인체의 체액에는 라이소자임이 포함되어 있으며, 라이소자임의 활성으로 인해 키토산과 같은 생체고분자의 분해가 일어난다. 따라서, 제조된 복합재료의 시험관내 생물학적 분해능은 37℃ 생리학적 온도에서 14일 동안 완충된 라이소자임 용액을 이용하여 잔류 거동 백분율로 평가하였다. 도 4b 및 도 4c에 나타낸 바와 같이 모든 키토산 함유 복합재료들(CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)은 CN(TOCN) 스펀지보다 현저하게 더 잘 분해되었음을 확인하였고, 14일 후 CN/CS/EM-Th는 CN, CN/CS 및 CN/CS/EM 스캐폴드(93.4 ± 4.65%, 30.57 ± 5.68%, 21.1 ± 4.55%)보다 가장 낮은 중량 잔존율(16.5 ± 5.73%)을 나타내었다. 스캐폴드의 분해는 CN과 CS 사이의 결합 붕괴에 의해 촉발되고, L-ECM은 효소 활동에 반응하여 분해되기 쉽다. 또한, 다공성 물질은 인접한 유체의 많은 부분을 흡수하고, 구조물 전체를 통과하여 샘플의 안정성을 감소시킬 수 있다. 이러한 모든 상황은 샘플을 포함하는 L-ECM의 가장 높은 저하로 이어진다.
생체 물질의 체액 흡수 및 보유 능력은 적혈구, 혈소판 및 기타 요인을 농축시키는 지혈에 유익한 역할함을 의미한다. 도 4e 및 도 4f에 나타낸 바와 같이 CN과 함께 CS의 첨가에 의해 흡수가 증가된 제조된 복합재료의 물 및 혈액 흡수 거동을 확인하였다(물에 대해 CN/CS-29.72 ± 5.53배 및 혈액에 대해 40.27 ± 2.53배). 또한, 복합재료(CN/CS/EM)에 L-ECM을 추가하는 경우, 스캐폴드의 흡수 능력이 증가함을 확인하였다(물은 32.63 ± 1.14배, 혈액은 42.63 ± 1.34배). 마지막으로, 트롬빈을 투여한 CN/CS/EM-Th 샘플은 수분 흡수(31.63 ± 0.34배)에 유의미한 영향을 미치지 않았으나, 복합재료 내부의 혈구 유지와 응고 형성으로 인해 전혈 흡수가 48.41 ± 1.13배 잘 이루어짐을 확인하였다.
(4) 복합재료들(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 전혈 응고 분석 확인
혈액 응고에 대한 모든 생체 재료의 영향은 해당 생체 재료의 혈전 생성 및 응고 촉진 활성에 대한 지식을 제공하는 전혈 응고 분석으로 평가할 수 있다. 지혈성 생체 재료가 우수한 경우, 전혈이 혈액 내에 적혈구가 갇혀 있는 바이오 소재와 직접 접촉해 흡수성이 낮은 초순수를 추가해도 헤모글로빈(hemoglobin)을 터뜨려 배출할 수 없게 되면서 응고가 발생한다. 그러나, 항응고 물질은 더 높은 흡광도 값을 나타내어 응고 속도가 더 느리다는 것을 알 수 있다.
혈액 응고 능력은 전통적인 게이지가 대조군으로 사용된 퍼센트 혈액 응고 지수(%BCI)를 기반으로 평가하였다. 도 5a 및 도 5b는 CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th 복합재료의 혈액 응고 능력에 대한 시각적 및 그래픽 설명을 나타내며, L-ECM 및 트롬빈 로딩된 CN/CS/EM-Th 복합재료는 모든 시점에서 모든 샘플 중 가장 낮은 BCI를 나타냄을 확인하였다. 게이지의 BCI는 실험이 끝날 때까지 가장 높게 유지되어 물에서 맑은 붉은색을 나타냈고, 나머지 샘플 중 CN/CS의 BCI가 높았고, CN/CS/EM의 BCI가 CN과 비교하여 낮았으며, 이는 CN/CS/EM 복합재료를 포함하는 ECM도 더 나은 혈액 응고 능력을 나타냄을 확인하였다. 또한, 상기 복합재료에 트롬빈을 도입하는 경우, CN/CS/EM-Th 샘플의 혈액 응고 능력이 향상됨을 확인하였다.
지혈성 생체재료의 이용으로 인해 많은 수의 적혈구가 파괴되면 치명적인 질병이 발생할 수 있어, 적혈구 상호작용이 있는 이식형 지혈 복합재료를 평가하는 것이 중요하다. 용혈율은 용해된 적혈구에서 방출되는 유리 헤모글로빈의 흡광도로 측정되는 적혈구에 대한 생체 물질의 영향을 반영한다. 적혈구 현탁액과 함께 모든 복합물, 음성 및 양성 그룹의 원심분리 후 얻은 상등액의 색상은 도 5c에 나타내었고, 모든 복합재료(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 상등액은 음성 대조군(PBS) 그룹과 유사하게 밝은 노란색을 나타내었고, 양성 대조군(Triton X-100) 그룹에서는 밝은 빨간색을 나타내었다. 또한, 도 5d에 나타낸 바와 같이 상등액의 정량적 측정 결과, 모든 복합재료가 5% 미만의 용혈율을 나타냄을 확인하였으며, 이는 제조된 복합 스캐폴드의 비용혈(non-hemolytic) 활성을 나타낸다.
제조된 복합재료의 상호작용과 지혈 기능을 관찰하기 위해 적혈구와 혈소판의 표면 접착력을 연구하였고, 혈소판의 부착 및 활성화는 손상 부위에 도입된 후 생체물질의 혈전 생성에 대한 벤치마크로 간주된다. CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th 복합재료에 대한 적혈구 및 혈소판의 부착 거동을 SEM으로 관찰하였으며, 이는 도 5e에 나타내었다. 도 5e에서 볼 수 있듯이, CN에 부착된 혈소판 및 적혈구의 수는 적은 반면, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th 스캐폴드를 포함하는 L-ECM 및 트롬빈에서 더 많은 수의 혈소판 응집체를 관찰하였다. 또한, CN에서 활성화된 혈소판의 수는 적고, 대부분 고유한 모양을 유지하였으나, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th에서 혈소판 수가 더 많이 활성화되고, CN/CS/EM-Th에서 섬유소 네트워크가 생성됨을 확인하였다(도 5e). 또한, 상기 복합체 중 어느 것도 적혈구에 유해한 영향을 보이지 않고, 규칙적인 형태를 유지하여 제조된 복합재료의 생체 적합성을 나타냄을 확인하였다. 키토산의 혈소판 부착 특성은 혈장 및 세포외 기질 단백질의 존재에서 향상되는 것을 확인하였고, 세포의 음전하를 띤 인지질은 양전하를 띤 키토산과 ECM의 콜라겐을 끌어당겨 정전기적 상호작용을 일으켜 부착과 응집을 촉진하고 혈전을 유발함을 확인하였다. 효과적인 혈액 응고를 위해서는 혈소판의 활성화가 혈소판의 퍼짐과 응집을 통해 달성할 수 있는 핵심 요소이고, 혈액이 콜라겐과 접촉하면 혈소판을 효율적으로 활성화하고 많은 수의 적혈구가 부착되어 응집체를 형성할 수 있으며, L-ECM은 주로 다량의 콜라겐으로 구성되어 있기 때문에(도 3) 혈액 세포의 축적을 돕고 혈전 형성을 생성한다.
따라서, 모든 복합재료는 비용혈성이고, 키토산, L-ECM 및 트롬빈과 TOCN의 조합은 혈액 세포의 효율적인 응집에 의해 지혈 특성을 현저하게 개선하였다. 또한, 혈소판 부착은 트롬빈 이식에 의해 증가되었고, CN/CS/EM-Th는 가장 낮은 %BCI를 나타내어 지혈 효과를 유도하고 향상시킴을 확인하였다.
(5) 복합재료들(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 세포 적합성 확인
생체재료는 지혈제와 상처 드레싱제로 사용하기 위해서는 세포 적합성이 좋아야 한다. 제조된 복합재료의 세포 적합성을 평가하기 위해, L929 섬유아세포를 사용하였으며, 1일, 3일, 7일 간격 후의 광학 밀도 변화를 비색 MTT 어세이로 측정하고, 상관 정성적 형광 이미지를 도 6에 나타낸 바와 같이 평가하였다. 이때, 샘플이 없고 세포만 포함된 세포 배양 플레이트의 웰을 대조군으로 이용하였다. 각 복합재료의 광학 밀도가 점진적으로 증가하면 이들 중 어느 것도 세포독성을 가지고 있지 않다는 것을 알 수 있다. 또한, CN/CS/EM(2.47 ± 0.151) 및 CN/CS/EM-Th(2.52 ± 0.098) 스캐폴드를 포함하는 L-ECM은 대조군(2.00 ± 0.110)에 비해 7일째에 광학적 밀도가 크게 증가하는 것을 확인하였다. 트롬빈의 포함은 세포 적합성에 어떤 영향도 미치지 않음을 확인하였고, L929 섬유아세포 세포와 복합재료를 포함하는 L-ECM의 생체 적합성을 나타낸다.
L-ECM은 잘 알려진 생체 적합성 천연 고분자인 TOCN과 키토산의 조합으로 소개하였고, 이러한 중합체의 양전하와 음전하는 세포의 접착과 증식에 영향을 미칠 수 있다. 여러 성장인자 중 간세포 성장 인자(HGF: hepatocyte growth factor), 염기성 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2: fibroblast growth factor-2), 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1: insulin-like growth factor) 등은 인간 또는 돼지의 탈세포화된 간 ECM에서 가장 많이 발견된다. CN/CS/EM-Th 복합재료의 세포 증식 특성의 현저한 증가는 탈세포화된 간 ECM에 본질적으로 포함된 다양한 유형의 콜라겐(I, III, IV 및 V)과 성장 인자의 영향을 나타낸다.
본 발명자들은 도 7과 같이 쥐 꼬리와 간 손상 모델에서 출혈 시간과 정량적 혈액 손실 평가를 고려하여 생체 내 연구 모델을 설계하였다. CN/CS/EM-Th 복합재료는 두 모델 모두에서 상용 Surgel 게이지와 비교하여 가장 짧은 출혈 시간을 나타내었고, 출혈 시간의 경향과 유사한 CN/CS/EM-Th 스캐폴드에서도 가장 낮은 혈액 손실을 관찰하였다. 또한, 쥐의 간절단과 꼬리 절단 모델에서 Sururgel 및 CN/CS/EM-Th의 지혈시간은 각각 110 ± 36.05초, 41 ± 9.29초, 222.66 ± 17.15초, 71.66 ± 17.55초로 나타남을 확인하였다. 제조된 복합재료에 트롬빈을 첨가함으로써, 출혈 시간이 단축되었으나, 출혈 시간의 현저한 감소는 L-ECM에 유지된 트롬빈과 콜라겐의 상승 효과에 기인한다. 또한, Surgicel과 CN/CS/EM-Th의 출혈량은 0.50 ± 0.23 gm, 2.79 ± 0.40 gm 및 1.02 ± 0.35 gm으로, 두 체내 모델 모두 지혈 시간과 상관관계가 있는 것을 확인하였다(도 7).
(6) 복합재료들(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 지혈 능력 확인
상기 실시예 2.(1) 내지 (5)와 같은 결과들은 상용 Surgel 게이지에 대한 CN/CS/EM-Th 복합 스캐폴드의 우세함을 나타내고, L-ECM 및 트롬빈의 도입은 CN/CS의 지혈 능력을 촉진한다. 활성화된 혈소판과 적혈구는 지혈에 중요한 역할을 하고, 다면체 모양의 적혈구는 골재를 완벽하게 밀봉할 수 있다. CN/CS/EM-Th 나노복합체의 조성에서, 음전하를 띤 CN(TOCN)의 카르복실기는 손상된 적혈구의 Fe3+와 복합체를 형성하는 강력한 능력을 보여 혈소판의 접착 및 활성화를 유발하였다. 또한, 복합체 표면에 양전하를 띤 NH2+ 기의 CS는 혈소판의 부착 및 활성화, 혈전 형성을 용이하게 하는 적혈구의 응집 등을 일으키는 혈액 세포 및 혈장과의 엄청난 정전기 상호작용을 나타내었다. 탈세포화된 L-ECM의 콜라겐은 혈소판 활성화를 자극하여 응고를 촉진할 수 있고, 지혈제로서의 트롬빈은 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 전환하고 다른 응고 인자를 활성화시킴으로써 그 효과를 나타낸다. 마지막으로, 이러한 모든 시너지 효과는 CN/CS/EM-Th 복합재료를 출혈 시간 및 출혈 측면에서 상업적으로 이용 가능한 산화 재생 셀룰로오스 제품인 Surgel과 비교하여 잠재적인 지혈제로 만든다.
나노복합체 스캐폴드의 이식 후 간창 치유 능력은 2주 및 4주 간격 후 H&E와 IHC 염색이 있는 파라핀 포매 조직 절편에서 조사하였다. Surgicel 및 CN/CS/EM-Th의 저배율 및 고배율 H&E 영상은 도 7에 나타내었고, 결함 영역은 이식된 두 스캐폴드로 명확하게 구분되었다. 상업용 Surgel 이식 결손 부위에서 각각 2주 및 4주 후 거대한 혈전과 엄청난 염증이 발생함을 확인하였다.
(7) 복합재료들(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 간 상처 치유 효과 확인
컴팩트 콜라겐 백(CB: collagen bag) 형성은 게이지로의 세포 이동을 제한하여 결손 부위의 더 낮은 세포 침윤 및 더 높은 염증 또는 괴사를 초래하는 Surgel 임플란트 4주 후에 시각화되었다. 그러나, CN/CS/EM-Th 이식된 결손 부위의 경우, 2주 및 4주 후에 혈전이나 콜라겐 백 형성은 관찰되지 않았고, 스캐폴드의 생체 흡수 정도와 상처 재형성 과정의 차이만 확인하였다(도 8). 복합재료 내부의 숙주 세포 침윤 및 축적은 이식 2주 후부터 가시화되었고, 강한 간 성상 세포(hepatic stellate cell)는 4주 후에 손상된 부위를 치유하기 위해 간 손상 후 반응하고 활성화하는 것을 시각화하였다. CN/CS/EM-Th 스캐폴드를 향한 간세포의 이동은 지혈 적용 후 치유를 명확하게 나타내었다. 간 손상 부위의 고유 부위 및 재생 부위는 유사한 형태와 유사한 파란색 점선으로 분리되었는 바, 간 상처가 거의 완벽하게 치유된 것임을 의미하고, 간세포와 유사한 미량의 대식세포가 발견되어 새롭게 재생된 세포외 기질을 도입하였다. 손상 부위에 섬유아세포의 존재는 상처 치유 과정의 최종 단계 마커로 간주된다.
(8) 복합재료들(CN, CN/CS, CN/CS/EM 및 CN/CS/EM-Th)의 간 성상세포 및 섬유아세포 활성화 확인
도 9에 쥐 간 출혈 모델에서 CN/CS/EM-Th 복합재료의 지혈 및 간 상처 치유 메커니즘을 나타내었고, 간 손상은 α-평활근 액틴과 피브로넥틴 면역조직화학적 염색으로 추가 조사하여 Surgicel 및 CN/CS/EM-Th 지혈 스캐폴드의 이식 후 간 성상세포와 섬유아세포의 활성화를 나타내었다. α-평활근 액틴 및 피브로넥틴의 상대적으로 긍정적인 염색 이미지 및 이에 상응하는 백분율 적분 광학 밀도(%IOD) 히스토그램은 도 10에 나타내었다. 구체적으로, α-평활근 액틴 및 피브로넥틴 양성 발현은 모두 수술 2주 후에 나타났으나(21.09 ± 2.56% 및 54.15 ± 0.93%), 대조군에 비해 이식 4주 후 유의하게 증가함(29.48 ± 0.98% 및 71.66 ± 2.88%)을 확인하였다. α-평활근 액틴의 현저한 발현은 특정 간 손상의 재생을 지원하는 간 성상세포의 활성화를 나타낸다. 비가용화된 L-ECM에 존재하는 성장 인자의 존재는 간세포 이동, 증식 및 간 재생에 큰 영향을 미친다. 또한, CN/CS/EM-Th에서 발견되는 예외적인 피브로넥틴 발현은 간 재생에 대한 기능적 마커임을 시사한다.
Claims (19)
- 키토산(Chitosan), 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber), 세포외 기질(extracellular matrix), 및 트롬빈(Thrombin)이 가교 결합된, 나노복합체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합은 아미드 결합(Amide bond), 수소 결합(hydrogen bond), 인산화 결합(phosphate bond), 이황화 결합(disulphide bond) 및 에스테르 결합(ester bond)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 나노복합체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노복합체는 생분해성인, 나노복합체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 나노복합체는 30 ㎛ 내지 200 ㎛ 직경의 기공을 포함하는, 나노복합체.
- 키토산(Chitosan), 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber), 세포외 기질(extracellular matrix) 및 트롬빈(Thrombin)을 포함하는, 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 키토산의 농도는 0.05% w/v 내지 7% w/v인, 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 나노섬유의 농도는 0.01% w/v 내지 5% w/v인, 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 세포외 기질의 농도는 0.01% w/v 내지 5% w/v인, 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 세포외 기질은 탈세포화된 것인, 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 세포외 기질은 간, 위, 대장, 췌장, 유방, 폐, 직장 및 자궁 세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래된 것인, 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 트롬빈의 농도는 50 NIH/ml 내지 150 NIH/ml인, 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 조성물은 비용혈성(non-hemolytic)인, 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 지혈 기능은 지혈 시간을 단축시키는 것인, 조성물.
- 청구항 5의 조성물을 포함하는, 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 시트.
- 키토산(Chitosan) 용액에 수성 TEMPO로 산화된 셀룰로오스 나노섬유 (TEMPO-oxidized cellulose nanofiber)를 첨가하는 단계;
상기 나노섬유가 첨가된 키토산 용액에 세포외 기질(extracellular matrix)을 추가하는 단계; 및
상기 세포외 기질이 추가된 키토산 용액에 트롬빈(Thrombin) 용액을 혼합하는 단계;를 포함하는, 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 나노복합체의 제조방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 추가하는 단계에서 상기 세포외 기질은 탈세포화된 것인, 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 추가하는 단계에서 상기 세포외 기질은 간, 위, 대장, 췌장, 유방, 폐, 직장 및 자궁 세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래된 것인, 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 첨가하는 단계 이후 추가하는 단계 이전에 상기 키토산 용액을 교반하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 추가하는 단계 이후 혼합하는 단계 이전에 상기 세포외 기질이 추가된 키토산 용액을 동결 건조하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
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| KR1020230096923A KR20240066053A (ko) | 2022-11-01 | 2023-07-25 | 키토산, tempo로 산화된 셀룰로오스 나노섬유, 세포외 기질 및 트롬빈을 포함하는 나노복합체 및 이를 포함하는 지혈 기능을 갖는 창상 치료용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240066053A (ko) |
-
2023
- 2023-07-25 KR KR1020230096923A patent/KR20240066053A/ko unknown
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