CN112999408B - 冻凝胶支架的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医用生物复合材料领域，具体公开了冻凝胶支架的制备方法及应用。冻凝胶支架的制备方法，包括下述步骤双键化修饰丝胶制备：丝胶粉干溶于磷酸缓冲液，滴加甲基丙烯酸酐，除杂；丝胶冻凝胶制备：双键化修饰丝胶溶液与过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺溶液混合，冷冻；丝胶冻凝胶支架制备：丝胶冻凝胶置于硝酸银溶液中反应，冻干。丝胶/银复合冻凝胶支架作为止血材料的应用。本发明提供了一种较新的丝胶冻凝胶支架制备方法，更加简单、环保；实现以丝胶作为原料制备冻凝胶；丝胶冻凝胶具有较好的快速吸血止血性能，且抗菌活性较优。

Description

冻凝胶支架的制备方法及应用
技术领域
本发明属于医用生物复合材料领域，尤其涉及冻凝胶支架的制备方法及应用。
背景技术
创伤愈合是指机体在遭受外力作用时，受损组织的修复再生。轻度创伤一般仅限于皮肤，而严重的创伤主要包括骨骼肌、神经及其它脏器的严重缺损、同时伴随着大量失血及骨折等。全球每年创伤死亡人数高达数百万，创伤发生的同时，伴随外伤性出血，其主要分为外出血和内出血两种，未控制的大出血是导致创伤患者死亡的主要原因之一。创伤患者在受伤几天或几周后死亡，通常是由于感染、多器官衰竭或破坏性脑损伤导致。因此，创伤出血后及时止血及预防感染对于减少失血、提高生存率极为重要，寻找有效且适合创伤愈合的止血、抗菌材料一直是国内外研究的热点。
丝胶是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子蛋白，长期以来由于人们对丝胶认识的不足和研究的局限性，导致每年有大量丝胶在缫丝工业中被当作废物处理，浪费了大量宝贵的天然资源，并对环境造成了严重的污染。近年来，如CN 111188194等中展示，由于丝胶具有良好的生物性能如低免疫原性、生物可降解性、抗氧化性、细胞黏附性而被广泛应用于生物医学领域，尤其对皮肤组织、血管组织、骨组织损伤具有优良的修复效果。
为了赋予冻凝胶抗菌活性，抗生素是最常规有效的手段，但抗生素的滥用可能会诱导耐药菌的产生。直接物理负载纳米银Ag容易出现团聚、粒径不均一等问题，导致一定细胞毒性。因此，如何在冻凝胶形成粒径均匀的纳米银是需要解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供冻凝胶支架的制备方法及应用，主要解决了现有冻凝胶抗生素滥用，抗菌纳米粒分布不均匀，没有通过丝胶来制备止血、抑菌冻凝胶的方法等问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
冻凝胶支架的制备方法，包括下述步骤
双键化修饰丝胶制备：丝胶粉干溶于磷酸缓冲液，滴加甲基丙烯酸酐，除杂；
丝胶冻凝胶制备：双键化修饰丝胶溶液与过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺溶液混合，冷冻；
丝胶冻凝胶支架制备：丝胶冻凝胶置于硝酸银溶液中反应，冻干。
一种方式中，还包括
丝胶粉干制备：蚕茧置于Na2CO3溶液，搅拌得胶丝溶液，除杂，透析，冻干。
一种方式中，双键化修饰丝胶制备中，除杂步骤后进行透析，冻干得双键化修饰冻干丝胶。
一种方式中，双键化修饰丝胶制备中：
磷酸缓冲液pH为7.4-9.0，
丝胶粉干以0.02-0.03g/mL比例溶于磷酸缓冲液，
丝胶粉干与甲基丙烯酸酐质量比为1：0.5-1：0.6，
透析截留分子量为3500Da。
一种方式中，双键化修饰丝胶溶液制备：双键化修饰丝胶溶于水中，制成浓度15-20％(W/V)双键化修饰的丝胶溶液。
一种方式中，丝胶冻凝胶制备中，双键化修饰丝胶溶液、过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺溶液按20：(1-1.5)：(1-2)体积比混合。
一种方式中，丝胶冻凝胶制备中过硫酸铵浓度为10-12％(W/V)。
一种方式中，丝胶冻凝胶制备中：
冷冻温度为-20～-25℃，冷冻后取出回温，
丝胶冻凝胶支架制备中：硝酸银溶液浓度为0.001-0.1mol/L。
一种方式中，丝胶冻凝胶支架制备中，丝胶冻凝胶置于硝酸银溶液中反应，清洗得丝胶/银复合冻凝胶，冻干得丝胶冻凝胶支架。
丝胶/银复合冻凝胶支架作为止血材料的应用。
本发明的有益效果是：
提供了一种较新的丝胶冻凝胶支架制备方法，更加简单、环保；实现以丝胶作为原料制备冻凝胶；冻凝胶形成粒径均匀的纳米银；丝胶冻凝胶具有较好的快速吸血止血性能，且抗菌活性较优。
附图说明
图1为丝胶冻凝胶、丝胶/银复合冻凝胶形态、物性性能图；
图2为丝胶/银复合冻凝胶各项性能展示图；
图3为丝胶/银复合冻凝胶抗菌性能展示图；
图4为丝胶/银复合冻凝胶止血性能展示图；
图5为丝胶/银复合冻凝胶对各细胞活力影响情况展示图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明：
冻凝胶支架的制备方法，包括下述步骤
双键化修饰丝胶制备：丝胶粉干溶于磷酸缓冲液，滴加甲基丙烯酸酐，除杂；
丝胶冻凝胶制备：双键化修饰丝胶溶液与过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺溶液混合，冷冻；
丝胶冻凝胶支架制备：丝胶冻凝胶置于硝酸银溶液中反应，冻干。
还包括
丝胶粉干制备：蚕茧置于Na2CO3溶液，搅拌得胶丝溶液，除杂，透析，冻干。
双键化修饰丝胶制备中，除杂步骤后进行透析，冻干得双键化修饰冻干丝胶。
双键化修饰丝胶制备中：
磷酸缓冲液pH为7.4-9.0，
丝胶粉干以0.02-0.03g/mL比例溶于磷酸缓冲液，
丝胶粉干与甲基丙烯酸酐质量比为1/0.5-1/0.6，
透析截留分子量为3500Da。
双键化修饰丝胶溶液制备：双键化修饰丝胶溶于水中，制成浓度15-20％(W/V)双键化修饰的丝胶溶液。
丝胶冻凝胶制备中，双键化修饰丝胶溶液、过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺溶液按20：(1-1.5)：(1-2)体积比混合。
丝胶冻凝胶制备中过硫酸铵浓度为10-12％(W/V)。
丝胶冻凝胶制备中：
冷冻温度为-20～-25℃，冷冻后取出回温，
丝胶冻凝胶支架制备中：硝酸银溶液浓度为0.001-0.1mol/L。
丝胶冻凝胶支架制备中，丝胶冻凝胶置于硝酸银溶液中反应，清洗得丝胶/银复合冻凝胶，冻干得丝胶冻凝胶支架。
丝胶/银复合冻凝胶支架作为止血材料的应用，丝胶/银复合冻凝胶一些物性特征如图1中展示。
下面对其中部分制备方法做进一步说明：
1)丝胶的提取
称取蚕茧(家蚕蚕茧(白玉、皓月)，棹蚕茧(A.mylitta)或蓖麻蚕茧等)，将其剪成碎片，清洗干净，去除水分。
每克蚕茧加入20mL的0.02mol/L Na2CO3水溶液，在100℃条件下搅拌1小时，使丝胶溶解，得到丝胶溶液。
离心去除丝胶溶液中的杂质成分，透析12～72小时，获得澄清丝胶溶液，冻干后得到丝胶粉末。
2)双键化修饰的丝胶的制备
将步骤1)中得到的丝胶或商品化的丝胶以0.02g/mL的比例溶解于10-100mL的磷酸缓冲液(pH 7.4～9.0)中，再按照每克丝胶加入0.6g的比例滴加甲基丙烯酸酐，置于20～45℃下反应24小时。而后将反应溶液透析(截留分子量为3500Da)72小时，冻干后得到双键化修饰的丝胶粉末。
3)双键化修饰的丝胶溶液的配制
将步骤2)获得的双键化修饰的丝胶溶于ddH2O(双蒸水)中，制成浓度为15％-20％(W/V)双键化修饰的丝胶溶液。
4)过硫酸铵溶液的配制
称取1g过硫酸铵溶于10mL ddH2O中，制成浓度为10％(W/V)的过硫酸铵溶液。
5)丝胶冻凝胶的制备
4℃条件下，按体积比100：5：5将双键化修饰的丝胶溶液与过硫酸铵溶液及四甲基乙二胺原液混合后迅速置于-20℃，12小时后取出置于室温，得到所述丝胶冻凝胶。
6)丝胶/银复合冻凝胶支架的制备
将步骤3)获得的丝胶冻凝胶用去离子水清洗三次后置0.001-0.1mol/L的硝酸银溶液中反应1小时，取出后再次用ddH2O清洗五次得到所述丝胶/银复合冻凝胶，冷冻干燥后即为丝胶/银复合抗菌止血冻凝胶支架。
冻凝胶比水凝胶具有更强吸水性的结构。其具有超大孔隙率。冻凝胶前体溶剂在低温环境下结晶，该结晶作为致孔剂，在低温环境下通过物理作用及化学交联形成凝胶。该凝胶因具有比水凝胶更高的孔隙率，故具有更强的吸水性能。将碱水提取法提取的丝胶，经过双键化修饰，而后将其与引发剂混合，在-20℃～-25℃条件下成胶形成丝胶冻凝胶。
在体外及体内测试了该丝胶/银复合抗菌止血冻凝胶支架的性能发现该材料可有效促进创面的快速止血，并能抑制多种细菌的生长，同时具有良好的生物相容性。直接物理负载纳米银Ag容易出现团聚、粒径不均一等问题，导致一定细胞毒性，本发明实现了在冻凝胶形成粒径均匀的纳米银。
实施例1丝胶/银复合冻凝胶支架的制备
步骤1)丝胶的提取
1.称取蚕茧(家蚕蚕茧(白玉、皓月)，棹蚕茧(A.mylitta)或蓖麻蚕茧等)，将其剪成碎片，用ddH2O清洗干净，3500rpm离心5分钟去除水分；
2.每克蚕茧加入20mL的0.02mol/L Na2CO3水溶液，置于恒温水浴锅在100℃条件下搅拌1小时，使丝胶溶解，得到丝胶溶液；
3.将得到的丝胶溶液转入50mL离心管中，3500rpm离心5分钟去除丝胶溶液中的杂质成分，得到澄清溶液；
4.将澄清溶液转入分子截留量为3500Da的透析袋中，于ddH2O中透析72小时，慢速搅拌，每隔6小时换一次水；
5.将丝胶溶液转入50mL离心管中，置于液氮中速冻5分钟后放入冻干机，冻干后得到丝胶粉末，放入-20℃冰箱保存备用。
步骤2)双键化修饰的丝胶的制备
1.将步骤1)中得到的丝胶以0.02g/mL的比例溶解于磷酸缓冲液(pH 7.4～9.0)中，再按照每克丝胶加入0.6g的比例滴加甲基丙烯酸酐，室温下搅拌反应24小时，得到双键化修饰的丝胶溶液；
2.将双键化修饰的丝胶溶液转入到分子截留量为3500Da的透析袋中，置于双蒸水中慢速搅拌透析，每隔6小时换一次水，共透析72小时；
3.将2中的双键化修饰的丝胶溶液冻干，置于-20℃冰箱保存备用。
步骤3)双键化修饰的丝胶溶液的配制
将步骤2)获得的双键化修饰的丝胶粉末每克溶于5mL ddH2O中，制成浓度为20％(W/V)双键化修饰的丝胶溶液。
步骤4)过硫酸铵(APS)溶液的配制
称取1g过硫酸铵(APS)溶于10mL ddH2O中，制成浓度为10％(W/V)的过硫酸铵溶液。
步骤5)丝胶冻凝胶的制备
4℃环境下，按体积比100：5：5将双键化修饰的丝胶溶液与过硫酸铵(APS)溶液及四甲基乙二胺(TEMED)原液混合后迅速置于-20℃，孵育12小时后取出置于室温，得到所述丝胶冻凝胶(SMC)。
步骤6)丝胶/银复合冻凝胶的制备
将步骤5)获得的丝胶冻凝胶用ddH2O清洗三次，分别置于0.001mol/L、0.01mol/L、0.1mol/L的硝酸银溶液中反应1小时，取出后再次用去离子水清洗五次得到所述丝胶/银复合冻凝胶(0.001SMC@Ag、0.01SMC@Ag、0.1SMC@Ag)。(后述SMC@Ag均为0.01SMC@Ag)
步骤7)丝胶/银复合冻凝胶冻干支架的制备
将获得的丝胶/银复合冻凝胶置于-80℃，冷冻24小时后取出迅速将样品置于冷冻真空干燥机中干燥，得到丝胶/银复合冻凝胶冻干支架。
实施例2丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶冻干支架表征检测
图1中A、B、C分别为实施例1制备的丝胶冻凝胶(SMC)、丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)、丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)冻干支架实物图。
图1中D为实施例1制备的丝胶冻凝胶(SMC)和丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)冻干支架扫描电镜图。
观察如图1中D所示，丝胶冻凝胶具有大量疏松的大尺寸孔洞结构，适合作为具有快速吸水或吸血需求的材料。丝胶/银复合冻凝胶上存在单纯丝胶冻凝胶不具有的纳米级球状结构，即为还原生成的银纳米粒子，赋予冻凝胶抗菌活性。
图1中E为丝胶水凝胶(SMH)、丝胶冻凝胶(SMC)与丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)支架傅里叶红外光谱分析结果。与水凝胶相比，丝胶冻凝胶及丝胶银复合冻凝胶的结构没有发生明显改变。
图1中F为丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)支架的X射线光电子能谱图。结果显示丝胶冻凝胶通过其还原性成功原位还原银离子生成了银。
图1中G为丝胶水凝胶(SMH)及丝胶冻凝胶(SMC)压缩模量图。
如图1中G所示，本发明制备的丝胶冻凝胶具有较强的机械性能，适用于压迫止血。并且还原有银纳米粒子的丝胶冻凝胶机械性能得到进一步加强。
图1中H为丝胶冻凝胶(SMC)及丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)支架的降解曲线(37℃)。
将冻凝胶浸泡于磷酸缓冲液(pH 7.4)中，在不同时间点，取出冻干称重。结果如图1中H，冻凝胶在前10天以较快速度降解，第10天后降解速度减缓，还原上银纳米粒子后降解速度则更慢，说明丝胶/银复合冻凝胶具有较好的稳定性，适合用于止血。
图1中I为丝胶/银复合水凝胶(SMH@Ag)及丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)支架的吸水膨胀曲线(37℃)。
丝胶冻凝胶吸水膨胀率的测定是通过将丝胶冻凝胶冻干称重后浸泡于磷酸缓冲液中，在不同时间点，取出按以下公式测定。(其中Ws为膨胀状态下的重量，Wd为干重)。
Figure BDA0002957626310000091
结果如图1中I所示，丝胶冻凝胶的吸水膨胀率几乎为水凝胶的两倍，表明丝胶冻凝胶具有良好的吸水性能。
实施例3丝胶/银复合冻凝胶支架吸血能力测试
一、实验过程
将凝胶冻干称重后浸泡于枸橼酸钠抗凝全血(1:9)中，在不同时间点，取出按以下公式测定。(其中Ws为吸血膨胀状态下的重量，Wd为干重)。
Figure BDA0002957626310000092
二、结果分析
1.如图1中J所示，第5分钟时丝胶冻凝胶的吸血膨胀率是水凝胶的3.37倍，而在第4个小时则为1.6倍，这说明冻凝胶吸血能力强于水凝胶，并且比水凝胶更具有快速吸血的优越性。
2.如图1中K所示，冻凝胶的吸血与吸水膨胀作用是呈正相关的，具有快速吸水吸血的性能。
实施例4丝胶/银复合冻凝胶支架全血凝固时间(CT)测试
一、实验过程
1.准备0.025g商品化明胶止血海绵(广州市快康医疗器械有限公司)、丝胶冻凝胶冻干产物、丝胶/银复合冻凝胶冻干产物；
2.配制含有0.025mol/L CaCl2的HBS缓冲溶液；
3.在商品化明胶止血海绵、丝胶冻凝胶、丝胶/银复合冻凝胶冻干产物中分别加入800μL枸橼酸钠抗凝全血(1:9)，以不加凝胶或海绵的800μL枸橼酸钠抗凝全血(1:9)作为空白对照组；
4.每组加入800μL CaCl2溶液，快速混匀后开始计时，至血液完全凝固停止计时，进行7组平行测试。
二、结果分析
如图2A所示，丝胶冻凝胶的体外全血凝固时间明显低于空白组，且与对照组商品化明胶止血海绵比无明显差异，证明丝胶冻凝胶具有一定的促凝止血作用。而丝胶/银复合冻凝胶相比于丝胶冻凝胶的体外全血凝固时间更低，证明还原有银纳米粒子的丝胶冻凝胶促凝止血作用增强。
实施例5丝胶冻凝胶支架全血凝固程度测试
一、实验过程
1.准备0.025g商品化明胶止血海绵(广州市快康医疗器械有限公司)、丝胶冻凝胶冻干产物、丝胶/银复合冻凝胶冻干产物于24孔板中，37℃温箱预温；
2.配制0.2mol/L的CaCl2溶液，37℃温箱预温；
3.枸橼酸钠抗凝全血(1:9)温箱中放置30分钟温育，取900μL全血加入100μLCaCl2溶液，立即混匀；
4.取出商品化明胶止血海绵(广州市快康医疗器械有限公司)、丝胶冻凝胶冻干产物、丝胶/银复合冻凝胶冻干产物，立即将混匀的复钙全血10μL分别置于其上，与其充分接触，并同时将10μL复钙全血置于24孔板空孔中作为空白对照，置于37℃温箱中；
5.分别于第30s、60s、90s、120s、150s取出，加入2mL双蒸水；
6.取9μL全血加入2mL双蒸水中，再加入1μL CaCl2溶液，作为阴性对照；
7.取出100μL上清，用酶标仪测其在540nm处吸光度，每组4次平行测试，按以下公式计算血凝指数(BCI)。(其中As为各组样本吸光度值，An为阴性对照吸光度值，A0为空白孔本底吸光度值)
BCI(％)＝[(As-A0)/(An-A0)]×100％
二、结果分析
如图2B所示，血凝指数越高，凝血程度越低。丝胶冻凝胶的凝血程度明显高于对照组商品化明胶止血海绵，进一步证明本方法制备的丝胶冻凝胶与明胶海绵相比，具有明显的促凝止血作用。
实施例6丝胶/银复合冻凝胶支架血栓弹力图(TEG)测试
一、实验过程
1.准备0.025g商品化明胶止血海绵(广州市快康医疗器械有限公司)、高岭土试剂(kaolin，Haemoscope Corporation)、0.025g丝胶/银复合冻凝胶冻干产物；
2.将以上材料分别与500μL枸橼酸钠抗凝全血(1:9)混合，以未加任何材料的全血作为空白对照；
3.将20μL 0.2mol/L CaCl2试剂(Haemoscope Corporation)加入TEG分析仪预热的检测杯中后，分别吸取以上混合全血340μL加入杯中，杯槽推上，开始检测。
二、结果分析
1.如图2C，表1所示，丝胶/银复合冻凝胶全血的凝血因子反应时间(R)明显降低，甚至可与激活内源性凝血途径的标准品高岭土相比，证明与丝胶/银复合冻凝胶混合的枸橼酸钠抗凝全血处于高凝状态。
2.如图2中D、E、表1所示，丝胶/银复合冻凝胶全血的血凝块形成时间(K)明显低于对照，血凝块形成速率(Angle)则明显高于对照，进一步证明丝胶/银复合冻凝胶具有良好的促凝作用。
3.如图2中F、表1所示，丝胶/银复合冻凝胶全血形成的血凝块最大强度(MA)与对照组相比没有显著性差异，证明丝胶/银复合冻凝胶对血小板及凝血因子的质量没有影响。
表1为丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)支架血栓弹力图测试的凝血因子反应时间(R)、血细胞凝集块形成时间(K)、血细胞凝集块形成速率(Angle)、血凝块形成的最大强度(MA)统计(如下表)：
Figure BDA0002957626310000121
实施例7丝胶/银复合冻凝胶支架凝血四项测试
一、实验过程
1.准备0.005g丝胶/银复合冻凝胶冻干产物；
2.加入200μL枸橼酸钠抗凝血浆(1:9，200g离心10min获得)于37℃温箱孵育3小时，同时以不加材料的同一份标本200μL全血作为对照；
3.孵育后3000rpm离心15分钟，取上层分离血浆上机(
Figure BDA0002957626310000122
凝血分析仪)分别加入活化试剂后检测凝血四项(PT、APTT、FIB、TT)。
二、结果分析
1.如图2中G、H所示，枸橼酸钠抗凝血浆(1:9)凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)在与丝胶/银复合冻凝胶共孵育后升高，提示在此过程中凝血级联反应的活化导致凝血因子的消耗。
2.如图2中I、J所示，纤维蛋白原(FIB)含量的降低、凝血酶时间(TT)的延长证明共孵育过程中消耗了纤维蛋白原(Ⅰ因子)。
实施例8丝胶/银复合冻凝胶抗菌测试
一、实验过程
1.准备直径6mm的丝胶冻凝胶、丝胶/银复合冻凝胶、0.01mol/L AgNO3溶液滤纸片，以及作为对照组的抗生素药敏纸片；
2.配制0.5麦氏浊度(1.5×108/mL)的菌液，将其用棉拭子在水解酪蛋白(M-H)培养基表面均匀涂抹接种3次；
3.室温下干燥平板5分钟，将丝胶冻凝胶、丝胶/银复合冻凝胶、AgNO3纸片、抗生素药敏纸片分别紧贴于琼脂表面；
4.置35℃温箱后16-18小时记录观察结果。
二、结果分析
1.如图3中A、D，表2所示，接种有甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)的平板上丝胶冻凝胶(SMC)周围并未出现抑菌环，而丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)周围有明显的抑菌环，证明丝胶/银复合冻凝胶具有一定的抑菌活性。
表2为丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)的抑菌环长度统计(如下表)：
Figure BDA0002957626310000131
2.如图3中B、E，表3所示，接种有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的平板上丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)周围仍有明显的抑菌环，证明丝胶/银复合冻凝胶具有良好的抑菌作用。
表3为丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌环长度统计(如下表)：
Figure BDA0002957626310000132
3.如图3中C、F，表4所示，接种有大肠杆菌(ATCC25922)的平板上丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)周围有明显的抑菌环，证明丝胶/银复合冻凝胶对革兰阴性菌同样具有良好的抑菌作用。
表4为丝胶/银复合冻凝胶(SMC@Ag)对大肠杆菌的抑菌环长度统计(如下表)：
Figure BDA0002957626310000141
实施例9丝胶/银复合冻凝胶支架抗菌活性测试
一、实验过程
1.制备0.025g如实施例1所述三种银浓度丝胶/银复合冻凝胶冻干产物0.001SMC@Ag、0.01SMC@Ag、0.1SMC@Ag；
2.配制0.5麦氏浊度(1.5×108/mL)的菌液，吸取10μL菌液分别加于丝胶/银复合冻凝胶之上，使菌液与冻凝胶充分接触，再吸取100μL PBS溶液(PH＝7.4)加入冻凝胶上保证细菌生存所需潮湿环境，将其置于37℃温箱孵育1小时；
3.取出后加入890μL PBS溶液(PH＝7.4)轻轻混匀，吸出10μL滴于LB琼脂平板之上，表面晾干后放入37℃温箱；
4.吸取10μL混合PBS菌液用PBS溶液进行十倍比稀释，共稀释5次，每次倍比稀释后的菌液吸取10μL滴于LB琼脂平板上，24小时后读取结果，计数菌落数，根据稀释倍数计算出最初孵育后存活的细菌数。
二、结果分析
1.如图3中G、J所示，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)的菌落数随着丝胶/银复合冻凝胶银纳米粒子浓度的升高而减少，进一步证明丝胶/银复合冻凝胶具有抗菌活性，并且与银纳米粒子的浓度相关。
2.如图3中H、K所示，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌落数同样随着银纳米粒子浓度的升高而减少，再次证明丝胶/银复合冻凝胶具有良好的抗菌作用。
3.如图3中I、L所示，大肠杆菌的菌落数随着银纳米粒子浓度的升高而减少，说明丝胶/银复合冻凝胶具有良好的抗革兰阴性菌作用。
实施例10丝胶/银复合冻凝胶支架实验动物体内止血测试
一、丝胶/银复合冻凝胶鼠肝损伤出血模型止血测试
1.如图4中A所示，将250g左右SD大鼠腹腔打开暴露肝脏，用医用无菌纱布将腹腔尤其是肝脏周围液体吸尽后，将无菌薄膜、直尺、滤纸依次垫于肝脏左外叶之下，用厚0.04cm的刀片于肝脏左外叶中部横切一道长1cm深0.3cm的创口；
2.从创口出血开始计时，并于5s内将0.04g材料铺于创口之上，每隔10s换滤纸，直至不再有血液溢出，停止计时，并将整个过程中的出血量进行统计，以不加任何材料覆盖的动物出血时间及出血量作为空白对照。
二、丝胶/银复合冻凝胶鼠断尾出血模型止血测试
1.如图4中D所示，将250g左右SD大鼠鼠尾外表面用酒精及生理盐水擦拭干净，将垫有滤纸的培养皿置于鼠尾下，鼠尾中部二分之一处用手术剪剪断；
2.从鼠尾溢血开始计时，同时于5s内将0.04g材料轻轻固定于其上，每隔15秒观察一次，直至不再有血液溢出，停止计时，并将整个过程中的出血量进行统计，以不加任何材料覆盖的动物出血时间及出血量作为空白对照。
三、丝胶/银复合冻凝胶鼠股动脉损伤出血模型止血测试
1.如图4中G所示，将250g左右SD大鼠大腿内侧打开剥开筋膜分离股动脉血管，用医用无菌纱布将周围液体吸尽后，将无菌薄膜、纱布垫于大腿之下，用29G的注射器在其搏动最明显处戳穿；
2.从创口出血开始计时，5s内覆盖上材料并通过医用棉签轻轻施力以免材料被动脉血流冲开，每隔15秒观察一次，直至不再有血液溢出，停止计时，并将纱布与材料的吸血量即整个过程中的出血量进行统计，以不加任何材料覆盖的动物出血时间及出血量作为空白对照，增加一组不加材料的单纯医用棉签轻轻施压对照组(cotton swab)。
四、结果分析
1.如图4中B、C所示，丝胶/银复合冻凝胶用于鼠肝损伤出血模型出血时间明显低于对照，证明丝胶/银复合冻凝胶具有良好的止血效果，出血量虽与对照组明胶止血海绵无统计学差异，但同时也证明其止血性能不输于明胶止血海绵，说明我们的材料在内脏器官出血止血方面具有一定作用。
2.如图4中E、F所示，丝胶/银复合冻凝胶用于鼠断尾出血模型出血时间明显低于各组对照，出血量虽与对照组明胶止血海绵无统计学差异，但在明胶海绵与空白对照无差异的前提下，实验组与空白组的差异显示出丝胶/银复合冻凝胶用于止血的优越性。
3.如图4中H、I所示，结果同样显示丝胶/银复合冻凝胶用于鼠股动脉损伤出血模型具有良好的止血效果，说明丝胶/银复合冻凝胶用于动脉出血止血方面同样具有一定潜力。
实施例11丝胶/银复合冻凝胶体内生物相容性
一、实验过程
1.进行肝损伤出血造模，用丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶支架进行止血，止血成功后将材料留于大鼠体内肝上，缝合腹腔；
2.分别于第3天、第7天取出大鼠心、肝、脾、肺、肾进行HE染色观察。
二、结果分析
如图5中A所示，与不经材料处理的空白组相比，丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶支架处理过的大鼠各脏器、细胞均无明显病理变化，说明丝胶银复合冻凝胶不具有明显的体内器官细胞毒性。
实施例12丝胶/银复合冻凝胶体外细胞相容性
一、实验过程
1.用100μL含有10％FBS的DMEM培养基分别于96孔板中培养小鼠成纤维细胞(L929)、人肝细胞(L02)10000个/孔24小时，以不加细胞作为空白背景；
2. 24小时后各孔加入100μL分别含有0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL丝胶冻凝胶或丝胶银复合冻凝胶支架粉末的DMEM培养基，以不加材料作为空白对照；
3. 24小时、48小时后每孔加入10μL cck-8试剂，37℃孵育1小时后于450nm处测吸光度
二、结果分析
如图5中B、C所示，与空白对照相比丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶处理后小鼠成纤维细胞(L929)、人肝细胞(L02)活力均高于85％，说明丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶不具有明显的细胞毒性。
实施例13丝胶/银复合冻凝胶体外细胞免疫原性
一、实验过程
1.将Raw264.7细胞用1mL含有10％FBS的DMEM培养基培养于20mm共聚焦皿底部，10000个/孔；
2. 24小时后每孔分别加入10μL含有1mg/mL的丝胶冻凝胶、丝胶/银复合冻凝胶支架粉末、脂多糖(LPS)的DMEM培养基，以不加材料DMEM培养基作为空白对照；
3.再24小时后吸弃培养基，PBS清洗3次，4％多聚甲醛固定10min；
4.PBS清洗3次，0.5％TritonX-100破膜10min；
5.PBS清洗3次，FITC标记的鬼笔环肽工作液200μL/孔，室温避光染色40min；
6.PBS清洗3次，200μL/孔hoechst工作液染色10min；
7.PBS清洗3次，共聚焦显微镜观察结果。
二、结果分析
如图5中D所示，与空白组和脂多糖(LPS)对照组相比，丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶不会刺激Raw264.7细胞分化，证明丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶不具有明显的细胞免疫原性，进一步说明丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶具有较好的细胞相容性。
实施例14丝胶/银复合冻凝胶血液相容性
一、实验过程
1.枸橼酸钠抗凝全血(1:9)1000rpm离心10min，取下层血细胞加入1mL PBS缓冲液清洗后再次离心，继续取下层血细胞重复这一过程一次；
2.取下层血细胞用PBS缓冲液稀释成5％血细胞悬液；
3. 500μL血细胞悬液分别加入500μL含有2mg/mL的丝胶冻凝胶或丝胶/银复合冻凝胶粉末的PBS缓冲液，以不加材料的PBS缓冲液作为阴性对照，以含有0.1％TritonX-100的PBS缓冲液作为阳性对照；
4. 37℃孵育1小时后3000rpm离心10min，取上清于570nm测吸光度。
二、结果分析
如图5中E、F所示，丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶不会导致血细胞破裂，证明丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶具有良好的血液相容性，进一步说明丝胶冻凝胶及丝胶/银复合冻凝胶具有良好的生物相容性。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (10)

1.冻凝胶支架的制备方法，其特征在于：包括下述步骤
双键化修饰丝胶制备：丝胶溶于磷酸缓冲液，滴加甲基丙烯酸酐；
丝胶冻凝胶制备：双键化修饰丝胶溶液与过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺溶液混合，冷冻，得凝胶；
丝胶冻凝胶支架制备：丝胶冻凝胶置于硝酸银溶液中反应，冻干。
2.根据权利要求1所述的冻凝胶支架的制备方法，其特征在于：还包括
丝胶粉干制备：蚕茧置于 Na2CO3溶液，搅拌得胶丝溶液，除杂，透析，冻干。
3.根据权利要求1所述的冻凝胶支架的制备方法，其特征在于：双键化修饰丝胶制备中，除杂步骤后进行透析，冻干得双键化修饰冻干丝胶。
4.根据权利要求3所述的冻凝胶支架的制备方法，其特征在于：双键化修饰丝胶制备中：
磷酸缓冲液pH为7.4-9.0，
丝胶粉干以0.02-0.03g/mL比例溶于磷酸缓冲液，
丝胶粉干与甲基丙烯酸酐质量比为1/0.5-1/0.6，
透析截留分子量为3500Da。
5.根据权利要求1所述的冻凝胶支架的制备方法，其特征在于：双键化修饰丝胶溶液制备：双键化修饰丝胶溶于水中，制成浓度15-20%双键化修饰的丝胶溶液。
6.根据权利要求1所述的冻凝胶支架的制备方法，其特征在于：丝胶冻凝胶制备中，双键化修饰丝胶溶液、过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺溶液按20：（1-1.5）：（1-2）体积比混合。
7.根据权利要求1所述的冻凝胶支架的制备方法，其特征在于：丝胶冻凝胶制备中过硫酸铵浓度为10-12%。
8.根据权利要求1所述的冻凝胶支架的制备方法，其特征在于：丝胶冻凝胶制备中：
冷冻温度为-20~-25℃，冷冻后取出回温，
丝胶冻凝胶支架制备中：硝酸银溶液浓度为0.001-0.1 mol/L。
9.根据权利要求1所述的冻凝胶支架的制备方法，其特征在于：丝胶冻凝胶支架制备中，丝胶冻凝胶置于硝酸银溶液中反应，清洗得丝胶/银复合冻凝胶，冻干得丝胶/银复合冻凝胶支架。
10.权利要求9中所述丝胶/银复合冻凝胶支架在制备止血材料中的应用。
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