JP4593277B2 - キトサンと酸化セルロースとを含有する創傷包帯用組成物 - Google Patents

Description

発明の内容の開示

本発明は、酸化セルロースとキトサンとを含有する組成物および、創傷治癒のためのその用途に関するものである。

酸化セルロースは、たとえば四酸化二窒素によるセルロースの酸化によって製造される。このプロセスで、サッカライド残基の第一級アルコール基がカルボン酸基に変わり、セルロース鎖内にウロン酸残基が生成される。この酸化は完全に選択的に進行する訳ではなく、その結果、炭素２と炭素３上の水酸基がケト形に変わる場合がある。これらのケトン単位によりアルカリに対し不安定な結合が導入され、ｐＨ７以上でラクトンの形成と糖環の開裂を介するポリマーの分解が始まるようになる。この結果、酸化セルロースは、生理学的条件下で生分解性および生体吸収性を示すようになる。

実用上好ましい酸化セルロースは、レーヨン等の再生セルロースの酸化によって作製される酸化再生セルロース（ＯＲＣ）である。ＯＲＣが止血性を有することはかなり以前から知られている。ＯＲＣは、１９５０年以来、ＳＵＲＧＩＣＥＬ（ジョンソン・アンド・ジョンソン・メディカル社（Johnson & Johnson Medical, Inc.）の登録商標）という名称の止血性製品として入手可能である。この製品は、レーヨンニット材料の酸化によって製造される。

空隙率、密度およびニットパターンを変更することにより、腹部の外科手術における術後の癒着の程度を減少させる、ＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（ジョンソン・アンド・ジョンソン・メディカル社（Johnson & Johnson Medical, Inc.）の登録商標）という名称の、二つ目のＯＲＣ繊維製品も上市された。

米国特許第２５１７７７２号（Doubほか）には、ＯＲＣ繊維にトロンビンを含浸させることによって得られる、改善された止血性の材料が開示されている。

欧州特許出願公開第０４３７０９５号には、合成された状態の酸性ＯＲＣ材料を、酢酸ナトリウム等の弱い有機酸の塩基性塩の溶液に接触させることにより作製される中性のＯＲＣ材料が開示されている。得られる中性の製品は止血性と癒着防止性とを示す。

欧州特許出願公開第０５６２８６２号には、生体吸収性のスポンジ材料の創傷インプラントとしての使用が開示されている。この材料は、配向性の下部構造を有するコラーゲンスポンジマトリックスを含んでいる。このマトリックスおよび／または下部構造には、酸化再生セルロースが含まれ得る。このような材料を慢性的創傷の治療に使用することについては開示されていない。

国際公開第ＷＯ ９８／００１８０号には、慢性的創傷の治療における酸化再生セルロース（ＯＲＣ）と混合したコラーゲンの凍結乾燥スポンジの使用が開示されている。

欧州特許出願公開第０３９３８２５号には、セルロース繊維とキトサンの混合物を基礎とする吸収体が開示されている。国際公開第 ＷＯ ００／０１１６６号には、キチン質／キトサンまたはそれらの誘導体、アルギン酸カルシウム／ナトリウム、ペクチン／ペクチン酸塩、カラギーナン、ＣＭＣ、セルロースのその他の誘導体、ヒアルロン酸、デンプンおよび／またはコンドロイチンの誘導体から選択され得る、少なくとも二つの多糖体の水性混合物の凍結乾燥によって作製された非繊維性多孔性材料が開示されている。

上記の創傷包帯用材料は重要な利点を提供する。これらの材料は、（化学的に改質されているが）自然の生物由来のものであり、従って低い抗原性を有する傾向がある。これらの材料は、通常、生体吸収性であり、創傷の表面から従来の創傷包帯用材料を除去する場合に生じる外傷を減少させる。さらに、これらの材料には、創傷治癒にプラスの治療効果を与え得るものもある。

しかしながら、ある種の問題点が残っている。たとえば、創傷用包帯の成分としてのコラーゲンは、ガンマ線照射によって殺菌されると変性する傾向がある。コラーゲンは自然の供与源から抽出され、コラーゲンを精製する際に厳密な対策がとられない限り、患者によっては抗原性を示し得る。この厳密な対策はコストを上昇させることになる。

それ故、この一般型の創傷包帯用材料に対し、物性と生物学的な吸収速度の制御、創傷回復への治療効果、コスト削減および抗原反応減少への改良ニーズが存在する。

本発明の目的の一つは、哺乳類の創傷、特に人体の静脈潰瘍、褥瘡性潰瘍および糖尿病性潰瘍等の慢性的創傷、に対する改良された創傷包帯用材料を提供することにある。このような慢性的創傷は、通常、ほとんどまたは全く出血または他の身体組織に対する癒着を示さない。

したがって、本発明の第一の態様では、キトサンと酸化セルロースとを含有する創傷包帯用組成物が提供される。

この酸化セルロースには、好ましくは、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）が含まれる。酸化再生セルロース（ＯＲＣ）は、（参照により開示内容の全体が本明細書に包含される）米国特許第３１２２４７９号に開示されるプロセスによって得ることができる。この材料は、生物学的適合性を有し、生分解性で、免疫原性を有さず、商業的に入手しやすい等、多くの利点を有している。ＯＲＣは、様々な酸化程度、従って種々の分解度、のものが利用可能である。ＯＲＣは、織物、不織物および編み物等の不溶性繊維の形状で使用することができる。ＯＲＣのアルカリ加水分解によって得られる水溶性低分子量フラグメントの形状のＯＲＣを使用する実施形態もある。

好ましい実施形態では、酸化セルロースが繊維状粒子や粉末粒子のような粒子の形状を有し、好ましくは適切な固形状または半固形状の局所薬ビヒクル中に分散された状態にある。特に、これらの材料には、少なくとも８０％の体積割合が２０μｍ〜１，０００μｍの範囲の長さを有するＯＲＣ繊維が含まれることが好ましい。このようなサイズの分布は、たとえば、ＯＲＣ布を粉砕し、ついで、粉砕した粉末を篩い分けし、上記範囲外の繊維を除去することによって得ることができる。ＯＲＣ繊維の平均長さ（体積による平均の長さ）が２５０μｍ〜４５０μｍの範囲にあることが好ましい。この範囲のＯＲＣ繊維の長さを選択すると、ＯＲＣとキトサンの混合が容易になり、高度に均質な製品を得ることができる。ＯＲＣはキトサンとより完全に複合し（complexed）、その結果、スポンジの治療特性が向上する。

酸化セルロースが５０，０００を超える平均分子量を有することが好ましい。このような酸化セルロースは、創傷液に実質的に不溶性であるが、生理学的なｐＨで非常にゆっくりと分解し、生体再吸収性のフラグメントになる。酸化セルロースは中性でない方が好ましい。しかしながら、本発明の範囲には、欧州特許出願公開第０４３７０９５号に開示されたような、前述の慢性的創傷の治療用の薬剤を製造するための部分的にまたは完全に中性の材料の使用も含まれる。

キチン質は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位からなる自然の生体高分子である。キチン質は、エビとカニの外殻から既知の方法で抽出することができる。キチン質は、ついで、たとえば５Ｍ〜１５ＭのＮａＯＨによる処理で部分的に脱アセチル化され、キトサンを生じる。キチン質の完全な脱アセチル化は実際上不可能であるが、キトサンが少なくとも５０％脱アセチル化されていることが好ましく、少なくとも７５％脱アセチル化されていることがより好ましい。これまで、キトサンは、種々の物理的形状（たとえば、溶液／ゲル、フィルム／薄膜、スポンジ、粉末または繊維）で創傷の治療のために使用されてきた。中性に近いｐＨの水中では、遊離塩基の形態のキトサンは膨潤性を示すが実質的に溶解しない。しかしながら、酸中では、キトサン鎖上にアンモニウム基が存在することに起因して、可溶である。キトサンの溶解性は、たとえばエピクロルヒドリンとの架橋により減少させることができる。ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定されたキトサンの平均分子量は、典型的には、約１０⁵ 〜約１０⁶ である。

本発明に係る組成物は、キトサンと酸化セルロースとの均質混合物（intimate mixture）を含有することが好ましい。この均質混合物には、溶媒のような適切なビヒクル中にキトサンと酸化セルロースとを加えた混合溶液もしくは分散体、または、このような溶液もしくは分散体から溶媒を除去して得られる固形状組成物が好ましく含まれる。（ここで、分散体とは、たとえばコロイド分散体や剪断混合によって形成される分散体のような、不連続の固形状粒子がビヒクル中に分散しているものを意味する。）このような均質混合により、キトサンのアミン基と酸化セルロースのカルボキシレート基との間での化学的複合化（complexation）が最大になる。

キトサンが、組成物の少なくとも５％を構成することが好ましく、少なくとも１０％、２０％または３０％を構成することがより好ましい。酸化セルロースもまた、組成物の少なくとも５％を構成することが好ましく、少なくとも１０％、２０％または３０％を構成することがより好ましい。前記キトサンと酸化セルロースとの合計については、創傷包帯用材料の少なくとも２５重量％を構成することが好ましく、５０重量％または７５重量％を構成すること、実施形態によっては、この材料の少なくとも９０重量％を構成することがより好ましい。好ましい実施形態では、本材料が、本質的にキトサンと酸化セルロースとのみから構成される。

本発明に係る材料の他の成分には、０〜２５重量％、たとえば約１重量％〜約２０重量％の、一以上の他の生体適合性を有する多糖体、たとえばアルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カルシウムのようなアルギン酸塩、ナトリウム・デンプングリコレート等のデンプン誘導体、メチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体または、ヒアルロン酸またはその塩のようなグリコサミノグリカン、硫酸コンドロイチンまたは硫酸ヘパラン、を含めることができる。本発明に係る材料には、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンおよびこれらの混合物からなる群から選ばれた一以上の構造性タンパク質を、約２５重量％まで、たとえば約１重量％〜約２０重量％含有させることもできる。このタンパク質はコラーゲンを含むことが好ましく、本質的にコラーゲンのみからなることがより好ましい。本発明に係る上記材料には、約２０重量％までの、好ましくは約２重量％〜約１０重量％の水も含めることができる。本発明に係る上記材料には、０〜４０重量％、たとえば約５重量％〜約２５重量％の可塑剤、好ましくはグリセリンやソルビトールのような多価アルコール、を含めることもできる。

実施形態によっては、本発明に係る上記材料には、約１０重量％までの、たとえば約０．０１重量％〜約５重量％の、典型的には約０．１重量％〜約２重量％の、一以上の治療用創傷治癒剤（therapeutic wound healing agents）｛たとえば、非ステロイド系抗炎症薬（たとえばアセトアミノフェン）、ステロイド、局所麻酔剤、抗菌剤または成長因子（たとえば線維芽細胞成長因子または血小板由来の成長因子）｝を含めることもできる。抗菌剤には、たとえば、防腐剤、抗生物質またはこれらの混合物が含まれ得る。好ましい抗生物質には、テトラサイクリン、ペニシリン、テトラマイシン、エリスロマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリマイシンＢ、ムピロシン、クリンダマイシンおよびこれらの混合物が含まれる。好ましい防腐剤には、コロイド銀等の銀、上記材料を構成する一以上のアニオンポリマーの塩等の銀塩、銀スルファジアジン、クロルヘキシジン、ポビドンヨード、トリクロサン、スクラルファート、第四級アンモニウム塩およびこれらの混合物が含まれる。本発明に係るこれらの薬用創傷包帯用材料は、使用中にこの創傷包帯用材料が分解するにつれ、治療剤を徐々に放出する。

上記パーセンテージは、全て乾燥重量基準によっている。

キトサンと酸化セルロースの重量比は約１：９９〜約９９：１であることが好ましい。この重量比は約１：９〜約９：１の範囲にあることがより好ましく、約４：１〜約１：４の範囲にあることがさらに好ましく、約２：１〜約１：２の範囲にあることがさらにより好ましく、約６０：４０〜約５０：５０であることがもっとも好ましい。実施形態によっては、乾燥重量基準で、上記材料が本質的に約５５重量％のキトサンと約４５重量％の酸化セルロースのみからなる。

本発明に係る組成物は、粉末、ミクロスフィア、フレークス、マットまたはフィルム等の使いやすい形状にすることができる。

実施形態によっては、本発明に係る組成物は、局所塗布用の半固形状またはゲル状の軟膏の形状を有する。

実施形態によっては、本発明に係る組成物は、慢性的創傷に適用するための凍結乾燥型または溶媒乾燥型の生体吸収性のスポンジの形状を有する。スポンジの平均孔径は、１０μｍ〜５００μｍの範囲にあることが好ましく、約１００μｍ〜３００μｍの範囲にあることがより好ましい。適切なスポンジは、本質的にキトサン粒子または繊維およびＯＲＣ繊維よりなる水性分散体を適切な治療剤と共に、凍結乾燥または溶媒乾燥に供することによって作製されたものである。

さらに他の実施形態では、本発明に係る組成物が、可撓性フィルムの形状を有する。この可撓性フィルムは連続体でも、断続体（interrupted）（たとえば穿孔したもの）でもよい。この可撓性フィルムは、グリセリンのような、可撓性を付与するための可塑剤を含んでいることが好ましい。

ある範囲の制御可能な特性を有するキトサンとＯＲＣとの両方が容易に入手できることは、本発明に係る組成物の特性が、非常によく管理できることを意味する。特に、これらの材料の生物学的な吸収速度、空隙率および密度を制御することができる。

本発明の第二の態様では、本発明の第一の態様に係る創傷包帯用組成物を含む創傷用包帯が提供される。

この創傷用包帯は、好ましくはシート形状を有し、本発明に係る組成物の活性層が含まれる。この活性層は、通常、使用中に創傷と接触する層であるが、実施形態によっては、液体透過性表面シートによって創傷から分離することができる。活性層の面積は約１ｃｍ² 〜約４００ｃｍ² が好ましく、約４ｃｍ² 〜約１００ｃｍ² がより好ましい。

この製品は、さらに、創傷対向面の反対側にある活性層上に裏打ちシートが広がっていることが好ましい。裏打ちシートは、活性層より大きく、１ｍｍ〜５０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ〜２０ｍｍ幅の辺縁領域が活性層の周りに広がり、いわゆるアイランド包帯（island dressing）を形成するようになっていることが好ましい。このような場合、裏打ちシートは、少なくともその辺縁領域で、感圧性の医療グレードの接着剤によりコーティングされていることが好ましい。

裏打ちシートは、実質的に液体不透過性であることが好ましい。裏打ちシートは、好ましくは半透過性である。すなわち、裏打ちシートは、水蒸気を透過するが、液状の水または創傷滲出液を透過しないことが好ましい。

裏打ちシートは、微生物不透過性であることも好ましい。適切な連続的な形状順応性の裏打ちシートは、３７．５℃での１００％と１０％との相対湿度差で、裏打ちシートのみの水蒸気透過速度（ＭＶＴＲ）が、３００ｇ／ｍ² ／２４ｈｒｓ〜５，０００ｇ／ｍ² ／２４ｈｒｓであることが好ましく、５００ｇ／ｍ² ／２４ｈｒｓ〜２，０００ｇ／ｍ² ／２４ｈｒｓであることがより好ましい。裏打ちシートの厚さは、１０μｍ〜１，０００μｍの範囲にあることが好ましく、１００μｍ〜５００μｍの範囲にあることがより好ましい。

穿孔シートが包帯を通して水分の移動を部分的に妨害するので、本発明に係る包帯のＭＶＴＲの全体としては、裏打ちシートだけのＭＶＴＲより低い値となる。（包帯のアイランド部分について測定した）包帯のＭＶＴＲは、裏打ちシートだけのＭＶＴＲの２０％〜８０％になることが好ましく、２０％〜６０％になることがより好ましく、約４０％であることが最も好ましい。このような水蒸気透過速度により、包帯の下の創傷が、その周りの皮膚に浸軟を起こすことなく、湿った条件で治癒されるようになることが見出された。

裏打ちシートを形成するのに適切なポリマーには、ＧＢ−Ａ−１２８０６３１に開示されたようなポリウレタン、ポリ（アルコキシアルキルアクリレート）およびポリ（アルコキシアルキルメタクリレート）がある。裏打ちシートには、主に独立気泡型である高密度ブロックポリウレタンフォームの連続層が含まれることが好ましい。適切な裏打ちシート材料の一つに、ＥＳＴＡＮＥ ５７１４Ｆの登録商標で入手可能なポリウレタンフィルムがある。

接着剤層が存在する場合には、その接着剤層は、水蒸気透過性を有するか、または水蒸気が透過できるようなパターンを有するか、または水蒸気透過性を有しかつ水蒸気が透過できるようなパターンを有するようになっていなければならない。接着剤層は、アイランドタイプの創傷用包帯のために従来から使用されているタイプの持続的に水蒸気透過性を有する感圧接着剤層、たとえば、ＧＢ−Ａ−１２８０６３１に例示されるようなアクリレートエステルコポリマー、ポリビニルエチルエーテルおよびポリウレタンをベースとする感圧接着剤の層であることが好ましい。接着剤層の坪量は２０ｇ／ｍ² 〜２５０ｇ／ｍ² が好ましく、５０ｇ／ｍ² 〜１５０ｇ／ｍ² がより好ましい。ポリウレタンをベースとする感圧型接着剤が好ましい。

活性層と保護シートの間には、多層吸着剤製品の層を更に設けることができる。たとえば、これらの層には、使用中に活性層を支持するための穿孔プラスチックフィルムを含めることができる。この場合、フィルム中の穿孔がヒドロゲル層中の穿孔と位置合わせされていることが好ましい。

本包帯は、特に本包帯を滲出性の創傷に使用する場合には、活性層と保護シートの間に更に吸収剤層を含んでいてもよい。このオプションの吸収剤層は、創傷液、血清または血液を吸収するために、創傷の治癒に従来から使用されている、ガーゼ、不織布、超吸収剤、ヒドロゲルおよびこれらの混合物等の、どのような層であってもよい。吸収剤層には、参照によりその全体が本明細書に包含される欧州特許出願公開第０５４１３９１号に準じて作製された、開放気泡型の親水性ポリウレタンフォーム等の吸収剤フォームの層を含めることが好ましい。他の実施形態では、不織布、たとえば、ビスコーススフのカード処理ウエブ、の吸収剤層とすることができる。吸収剤層の坪量は、５０ｇ／ｍ² 〜５００ｇ／ｍ² 、たとえば１００ｇ／ｍ² 〜４００ｇ／ｍ² の範囲にすることができる。吸収剤層の非圧縮厚みは、０．５ｍｍ〜１０ｍｍ、たとえば１ｍｍ〜４ｍｍの範囲にすることができる。生理食塩液について測定された自由な（圧縮されていない状態の）液体吸収性は、２５℃で５ｇ／ｇ〜３０ｇ／ｇの範囲にすることができる。吸収剤層は、単層であっても複数の層であっても、実質的にキトサン／ＯＲＣ層と同等の広がりを有することが好ましい。

本包帯の創傷対向面は、取り外し可能なカバーシートによって保護することが好ましい。このカバーシートは、通常可撓性の熱可塑性材料から作製される。適切な材料には、ポリエステルとポリオレフィンがある。カバーシートの接着剤対向面は、易剥離性の表面であることが好ましい。すなわち、ヒドロゲル層がカバーシートから剥離するのを助けるように裏打ちシート上の活性層と接着剤とにわずかにくっついているだけの表面であることが好ましい。たとえば、カバーシートを、フルオロポリマーのような非付着性のプラスチックから作製することができる。あるいは、シリコーン等の易剥離性のコーティング剤またはフルオロポリマー易剥離性コーティング剤を用いて作製することができる。

本創傷用包帯は、殺菌され、微生物不透過性の容器に詰められることが好ましい。

本発明の第三の態様では、創傷治療用包帯の製造に関する本発明の第一の態様に係る創傷包帯用組成物の使用が提供される。この創傷は慢性的創傷、たとえば、静脈潰瘍、褥瘡性潰瘍および糖尿病性潰瘍からなる群から選ばれた創傷、であることが好ましい。

本発明の第一の態様に係る、キトサン／酸化セルロース組成物は、成長因子、特に血小板由来の成長因子に結合する能力に優れていることが見出された。従って、本発明は、一以上の細胞成長因子と結合させるための、本発明の第一の態様に係る組成物の使用も提供する。細胞成長因子は血小板由来の細胞成長因子（ＰＤＧＦ）であることが好ましい。

本発明は、さらに、生体試料または有機体を、本発明の第一の態様に係る組成物を含む材料と、インビトロまたはインビボで接触させて成長因子をこの材料に結合することを含む、細胞成長因子を生体試料または有機体から分離する方法を提供する。本方法では、ついで、さらに、この材料から結合した成長因子を回収することが好ましい。

本発明は、さらに、
（ｉ）本発明の第一の態様に係る組成物を含む材料を、細胞成長因子を含有する生体培地に接触させて細胞成長因子をこの材料に結合するステップと、
（ｉｉ）結合した細胞成長因子を有する上記材料を洗浄し乾燥し、上記活性創傷包帯用材料を形成するステップと
を含む、活性創傷包帯用材料の製造方法を提供する。この細胞成長因子は血小板由来の成長因子であることが好ましい。

本発明の他の一態様では、褥瘡性潰瘍、静脈潰瘍または糖尿病性潰瘍等の哺乳類の慢性的創傷の治療方法を提供する。本方法には、本発明の第二の態様に係る包帯の創傷への適用が含まれる。

本包帯は、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも６時間、最も好ましくは少なくとも１２時間、慢性的創傷に適用される。本治療法は、慢性的創傷については適宜包帯を取り替えつつ、数日間または数週間続けることができる。これは、典型的にはほんの数秒または数分続くだけのＯＲＣの止血剤としての適用とは対照的である。

キトサン／酸化セルロース組成物は、少なくとも次のやり方のいくつかにより、慢性的創傷の治癒を促進するものと考えられるが、このことは、いかなる理論にも拘束されるものではない。第一に、本複合体（complex）が、ＰＤＧＦ、ＥＧＦおよびＦＧＦ等の成長因子に結合して、これらの成長因子を創傷サイトに保持する。このようになっていないと、このような成長因子は創傷滲出液と共に創傷サイトから運び去られがちになる。生理的ｐＨにおけるキトサン／酸化セルロースの緩慢な分解の結果、成長因子が創傷中にゆっくり再放出されるようになる。第二の理由は、本材料が十分な生体再吸収性を有し、生理学的に許容可能であることである。第三の理由は、インビボにおける酸化セルロースおよびキトサンの分解により生成したオリゴサッカライドフラグメントそのものが慢性的創傷の治癒を促進するということである。

本慢性的創傷は、静脈潰瘍、褥瘡性潰瘍および糖尿病性潰瘍からなる群から選ばれたものであることが好ましい。本慢性的創傷は、実質的にまたは完全に非出血性であることが好ましい。用語「慢性的創傷」は、歯周異常または歯周病には適用されないものであることが好ましい。

本発明で使用されるキトサン／酸化セルロース複合体は、キトサンを適切な溶媒に分散した分散体、好ましくは水性分散体、を作製するステップと、酸化セルロースをこの溶媒に浸漬または分散し、ついで、この分散体から溶媒を除去して、キトサンが酸化セルロースと複合化した状態のものを含む固形材料を得るステップとを含む方法によって作製することができる。

酸化セルロースは、懸濁物または溶液の形態で、好ましくはキトサンの懸濁物に見合うｐＨで、キトサンの水性分散体に添加し、ついで、撹拌またはホモジナイズにより混合することができる。あるいは、酸化セルロースの乾燥繊維または乾燥布帛をキトサンの水性分散体中に分散しまたは浸漬してもよい。

本発明に係る材料中のオプションの付加的な成分については、分散体から溶媒を除去する前に分散体に含めることが好ましい。

分散体のｐＨは、約１〜約１０の範囲に調整することが好ましく、約２〜約８のｐＨに調整することがより好ましい。キトサンは低ｐＨで可溶であり、フィルムのような特定の製品を形成する場合に好ましい。酸化セルロースは、高ｐＨで加水分解して可溶性のフラグメントになる。

溶媒は蒸発によって分散体から除去することができ、たとえばトレイ中の分散体からの蒸発によって除去し、この材料のフィルムを得ることができる。他の実施形態では、溶媒、好ましくは水を、凍結乾燥（lyophilizing）または溶媒−乾燥により除去し、スポンジの形態の材料が得られる。この溶媒分散体は、５ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬのキトサンを含有することが好ましい。凍結乾燥の方法は、米国特許公開第２１５７２２４号中にコラーゲンベースのスポンジについて記載されたのと同様の方法であることが好ましい。なお、米国特許公開第２１５７２２４号については、参照により開示内容の全体が本明細書に包含される。

実施形態によっては、さらに本プロセスに、分散体中または乾燥材料中のキトサンおよび／または酸化セルロースを、エピクロルヒドリン、カルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤｌ）またはグルタルアルデヒド等の架橋剤で処理することを含めることができる。

あるいは、脱水加熱的に（dehydrothermally）架橋を行うこともできる。架橋の方法は、最終製品に著しい影響を及ぼし得る。たとえば、ＨＭＤＩは、複合体中で、キトサンの第一級アミノ基と架橋する。一方、カルボジイミドはＯＲＣの糖質をキトサンの第一級アミノ基と架橋させる。

本発明のいずれの態様に関してもこれまでに説明した付加的または選択的な特徴は、いずれも、本発明の他のいずれかの態様またはその組み合わせに関する代替的または付加的な特徴でもあることに留意すべきである。

ついで、本発明の具体的な実施形態を、添付図を参照して、実施例によりさらに説明する。

［参照例１］コラーゲン／繊維状ＯＲＣスポンジの製造
凍結乾燥コラーゲン／ＯＲＣスポンジは次のようにして製造される。

まず、コラーゲン成分を、次のようにして、ウシの革質部（bovine corium）から作製する。ウシの革質部をウシの皮から切り取り、削り取り、更なる処理中における微生物活動を抑制する目的で次亜塩素酸ナトリウム溶液（０．０３％ｗ／ｖ）中に浸漬する。この革質部を、ついで、水で洗浄し、水酸化ナトリウム（０．２％ｗ／ｖ）と過酸化水素溶液（０．０２％ｗ／ｖ）を含有する溶液で処理し、革質部を環境温度で膨潤し、殺菌する。革質部スプリット（corium split）は、その後、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムおよび重炭酸ナトリウム（それぞれ、０．４％ｗ／ｖ、０．６％ｗ／ｖおよび０．０５％ｗ／ｖ）を含有する溶液中、１２．２を超えるｐＨと環境温度で、タンブリングしつつ、１０日〜１４日間掛けて、アミド窒素レベルが０．２４ｍｍｏｌ／ｇ未満になるまで、アルカリ処理工程を行う。革質部スプリットは、ついで、環境温度とｐＨ０．８〜１．２の条件下、１％塩酸で酸処理工程を行う。この処理を、タンブリングしつつ、革質部スプリットが２．５未満のｐＨになるよう十分に酸を吸収するまで続ける。この革質部スプリットを、ついで、ｐＨ値が３．０〜３．４になるまで水で洗浄する。この革質部スプリットを、ついで、ボウルチョッパー中、最初は粗粉砕設定ついで微粉砕設定で、氷と共に粉砕する。得られたペーストは、６５０ｇの革質部スプリット対１００ｇの（氷の状態の）水の構成比で造られており、次のプロセス段階での使用前に凍結され、保存される。しかしながら、コラーゲンは、次の段階で、ＯＲＣと混合される前に冷凍乾燥されることはない。

凍結乾燥パッドのＯＲＣ成分は、次のようにして作製される。ＳＵＲＧＩＣＥＬ布帛（ジョンソン・アンド・ジョンソン・メディカル社（Johnson & Johnson Medical, Inc.）、アーリントン（Arlington））を、６０℃未満の温度を維持しつつ、スクリーンプレートを通し、回転ナイフカッターを使用して粉砕する。

ついで、粉砕されたＯＲＣ粉末と（固形分として）所要量の凍結コラーゲンペーストを、酢酸で酸性化した十分な量の水に加え、ｐＨ値が３．０で、全固形分濃度が１．０％になるようにする。この混合物を、Ｆｒｙｍａ ＭＺ１３０Ｄホモジナイザーを通してホモジナイズし、漸次沈殿物を減少させて、均質なスラリーを得る。スラリーのｐＨを、２．９〜３．１に維持する。スラリー温度を２０℃未満に維持し、固形分濃度を１％±０．０７に維持する。

得られたスラリーを脱ガス槽へポンプ輸送する。時々撹拌しつつ、真空吸引を最低３０分間行い、スラリーを脱ガスする。ついで、このスラリーを凍結乾燥機トレイに２５ｍｍの深さになるまでポンプ輸送する。これらのトレイを、予め−４０℃にセットされた凍結機棚に置く。ついで、凍結乾燥機のプログラムを開始し、コラーゲンとＯＲＣとを乾燥し、脱水加熱的に架橋して、厚手のスポンジパッドを作製する。このサイクルの完了後、真空を開放し、凍結乾燥したブロックを取り出し、上表面層と下表面層とを分割して取り除き、残りのブロック部分を３ｍｍ厚のパッドに分割する。凍結乾燥ブロックをパッドに分割するステップは、Ｆｅｃｋｅｎ Ｋｉｒｆｅｌ Ｋ１スリッタを使用して行う。最後に、これらのパッドを、ダイカッタで、所望のサイズと形状にダイカットし、包装し、１８ＫＧｙ〜２９ＫＧｙのコバルト６０のガンマ線照射により殺菌する。驚くべきことに、この照射は、コラーゲンの有意な変性を引き起こさない。これは、ＯＲＣの存在によって安定化されていることによるものと思われる。得られた凍結乾燥コラーゲン／ＯＲＣパッドは均一な白色のビロードのような外観を有している。パッドの厚みは、３．２±０．１７ｍｍ（Ｎ＝８バッチ）である。これらのパッドは、以下の手順において、正の対照品として使用される。

［参照例２］アルギン酸塩／繊維状ＯＲＣスポンジの製造
コラーゲンを同量割合のアルギン酸塩に代えた以外は参照例１の記載に従って、アルギン酸塩／繊維状ＯＲＣスポンジを作製した。

アルギン酸ナトリウムはプロノーバ・バイオメディカル（Pronova Biomedical）社から粉末として入手した。この粉末を氷冷水に、パドルスターラーを使用して混合しつつ溶解し、２％ｗ／ｖの濃度にした。ついで、同量の０．１Ｍ酢酸を加え、この溶液の固形分が１％になるように希釈した。ついで、既知量のアルギン酸ナトリウム溶液をＯＲＣに加え、最終材料中で４５％ＯＲＣ／５５％アルギン酸ナトリウムの最終比率となるようにした。ついで、例１と同様にしてスポンジを作製した。

［参照例３］ヒアルロン酸塩／繊維状ＯＲＣスポンジの製造
コラーゲンを同量割合のヒアルロン酸塩に代えた以外は参照例１の記載に従って、ヒアルロン酸塩／繊維状ＯＲＣスポンジを作製した。

平均分子量分布が５００，０００ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムを、ライフコア・バイオメディカル社（Lifecore Biomedical, Inc.）から粉末として入手した。この粉末を氷冷水に溶解し、一昼夜混合して、２％ｗ／ｖの濃度にした。ついで、既知量のヒアルロン酸ナトリウム溶液をＯＲＣに加え、最終材料中で４５％ＯＲＣ／５５％ヒアルロン酸ナトリウムの最終比率となるようにした。ついで、例１と同様にしてスポンジを作製した。

［参照例４］ペクチン／繊維状ＯＲＣスポンジの製造
コラーゲンを同量割合のペクチンに代えた以外は参照例１の記載に従って、ペクチン／繊維状ＯＲＣスポンジを作製した。

リンゴ由来のペクチンを、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）から入手した。この粉末を氷冷水に溶解し、一昼夜撹拌して、２％ｗ／ｖの濃度にした。ついで、既知量のペクチン溶液をＯＲＣに加え、最終材料中で４５％ＯＲＣ／５５％ペクチンの最終比率となるようにした。ついで、例１と同様にしてスポンジを作製した。

［参照例５］β−グルカン／繊維状ＯＲＣスポンジの製造
コラーゲンを同量割合のβ−グルカンに代えた以外は参照例１の記載に従って、β−グルカン／繊維状ＯＲＣスポンジを作製した。

β−グルカンを、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）から、粉末として入手し、氷冷水に溶解し、一昼夜撹拌して、２％ｗ／ｖの濃度にした。最終溶液を同量の０．１Ｍの酢酸で希釈し、０．０５Ｍ酢酸中最終濃度が１％ｗ／ｖの溶液を得た。ついで、既知量のβ−グルカン溶液をＯＲＣに加え、最終材料中で４５％ＯＲＣ／５５％β−グルカンの最終比率となるようにした。ついで、例１と同様にしてスポンジを作製した。

［参照例６］イナゴマメゴム／繊維状ＯＲＣスポンジの製造
コラーゲンを同量割合のイナゴマメゴムに代えた以外は参照例１の記載に従って、イナゴマメゴム／繊維状ＯＲＣスポンジを作製した。

イナゴマメゴムを、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）から、粒状体として入手した。この粒状体を氷冷水に懸濁して２％ｗ／ｖの濃度にした。ついで、この懸濁物をゆっくり９５℃に加熱し、イナゴマメゴムを溶解した。得られた溶液を５，０００Ｇで遠心分離処理して溶液を清澄化し、種皮の不溶片を除去した。ついで、この上澄みを取り出し、固形分を算出し、ついで、０．０５Ｍ酢酸を添加してこの溶液を希釈し、最終濃度を１％ｗ／ｖとした。ついで、既知量のイナゴマメゴム溶液をＯＲＣに加え、最終材料中で４５％ＯＲＣ／５５％イナゴマメゴムの最終比率となるようにした。ついで、例１と同様にしてスポンジを作製した。

［実施例１］キトサン／繊維状ＯＲＣスポンジの製造
コラーゲンを同量割合のキトサンに代えた以外は参照例１の記載に従って、キトサン／繊維状ＯＲＣスポンジを作製した。

実用グレードのキトサン粉末を、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）から入手した。この粉末を氷冷水に溶解し、２％ｗ／ｖの濃度にした。ついで、同量の０．１Ｍの酢酸を加えてこの溶液を希釈し、キトサンを１％ｗ／ｖにした。ついで、既知量のキトサン溶液をＯＲＣに加え、最終材料中で４５％ＯＲＣ／５５％キトサンの最終比率となるようにした。ついで、例１と同様にしてスポンジを作製した。

［実施例２］キトサン／ＯＲＣフィルムの製造
創傷に適用するためのキトサン／ＯＲＣフィルムを次のようにして作製した。

１５グラムのキトサン粉末を、１．５Ｌの水に混合ブレンドした。２ｇのグリセリンをこの混合物にブレンドした。ついで、実施例１に記載されたようにして作製された１５ｇのＯＲＣ繊維を、高剪断混合下に添加した。ついで、得られた混合物を、ＰＴＦＥ製のトレイの底部に、約５ｍｍの厚さになるように投入し、空気乾燥してＯＲＣ／キトサン複合体のフィルムを形成した。

［実施例３］
創傷への局所塗布用の創傷治療用ジェルを次のように作製した。

ＯＲＣ繊維を、実施例１に記載されたようにして作製し、得られた繊維を、２重量％の溶解キトサンクロライドを含有する３％ｗ／ｗカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水性ジェル中に、２％ｗ／ｗ濃度となるように分散した。

手順１：血小板由来の成長因子の結合
ＰＤＧＦの結合の研究を次のようにして行った。

検査材料の小切片（約１ｃｍ² の正方形のＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（ＲＴＭ）ＯＲＣ布帛および約１ｃｍ×０．５ｃｍ×０．４ｃｍの凍結乾燥スポンジの切片）を秤量し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液（全量１ｍＬ）に、少なくとも１時間室温で浸漬した。ついで、試料を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、室温で２時間掛けて、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で培養した。ついで、２２ｎｇのＰＤＧＦを、ＢＳＡを２％含有する２５０μＬのＰＢＳ中のそれぞれの試料に対し添加し、ついで、これらの試料を３７℃でさらに１時間培養した。ついでそれらの試料を、２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄し、つづいて、塩化ナトリウムの濃度を高めた。最後に、それぞれの試料を４．０Ｍの尿素で洗浄した。最初のＰＤＧＦ調製品と種々の洗浄物とのＰＤＧＦ ＥＬＩＳＡ分析を行った。結果は、次の通りであった。

キトサン／ＯＲＣ材料がＰＤＧＦとよく結合し、結合したＰＤＧＦを、活性のロスが相対的に少ない状態で放出することが理解される。これは、ＰＤＧＦに結合し、ついで、材料がインビボで生分解するにつれそれを創傷中に再放出することにより、材料が創傷サイトにおけるＰＤＧＦリザーバとして機能するようにできるので、創傷の治癒に有用である。ここで研究したその他のＯＲＣ／多糖体複合体はどれもこの特性を有していない。

手順２：エラスターゼ阻害
創傷液試料中に存在するニュートロフィル由来のエラスターゼのレベルを、基質活性アッセイを使って、分光蛍光分析により測定した。これらの基質は、適切な酵素切断部位を模倣するように合成された短いペプチドを含有し、加水分解されると放出される蛍光レポーター基（fluorescent reporter group）を含んでいる。酵素活性は、蛍光定量的な化合物である７−アミノ４−メチルクマリンの生産速度を測定することによって決定された。活性は１分あたりの相対的な蛍光量（ＲＦＵ／分）または総タンパク質についての修正蛍光変化（ＲＦＵ／分／ｍｇタンパク質）で表した。それぞれの試料は、６回テストし、その平均値を計算した。基質は、１０ｍＭのストック濃度（stock concentration）で調製し、適切なアッセイ緩衝液で０．５ｍＭの作業濃度に希釈した。マイクロタイターウエル（黒、平底）中で組み合わされた反応混合物は、５μＬの創傷液、１７５μＬのアッセイ緩衝液および２０μＬの基質（最終濃度５０μＭ）を含有していた。マイクロタイタープレートを４５５ｎｍ（励起３８３ｎｍ）で直ちに読み取り、その後の時間、所定時間間隔で測定した。読み取りと次の読み取りとの間はプレートをカバーし、３７℃で培養した。ニュートロフィル由来のエラスターゼ様活性を、蛍光定量性の基質である、メタノールで溶解した、メトキシ−アラニン−アラニン−プロリン−バリン７−アミノ４−メチルクマリン（Ｂａｃｈｅｍ ＵＫ社）を使用して評価した。この酵素の最適活性のために必要とされるアッセイ緩衝液は、０．５ＭのＮａＣｌと１０％のジメチルスルホキシドを含有する、０．１ＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．５であった。

参照例１に記載されたようにして作製されたコラーゲン／ＯＲＣスポンジの試料を正の対照品として使用した。ＳＯＦ−ＷＩＣＫ（登録商標）ガーゼの試料を負の対照品として使用した。

結果を図１に示す。本発明に係る複合体が、２時間後と２４時間後に、エラスターゼ活性の有意な阻害を示すことが理解できる。

手順３：コラゲナーゼ阻害
創傷液試料中に存在するマトリックスメタロプロテイナーゼのレベルを、基質活性アッセイを使って、分光蛍光分析により測定した。これらの基質は、適切な酵素切断部位を模倣するように合成された短いペプチドを含有し、加水分解されると放出される蛍光レポーター基を含んでいる。酵素活性は、蛍光定量的な化合物である７−アミノ４−メチルクマリンの生産速度を測定することによって決定された。活性は１分あたりの相対的な蛍光量（ＲＦＵ／分）または総タンパク質についての修正蛍光変化（ＲＦＵ／分／ｍｇタンパク質）で表した。それぞれの試料は、６回テストし、その平均値を計算した。基質は、１０ｍＭのストック濃度で調製し、適切なアッセイ緩衝液で０．５ｍＭの作業濃度に希釈した。マイクロタイターウエル（黒、平底）中で組み合わされた反応混合物は、５μＬの創傷液、１７５μＬのアッセイ緩衝液および２０μＬの基質（最終濃度５０μＭ）を含有していた。マイクロタイタープレートを４５５ｎｍ（励起３８３ｎｍ）で直ちに読み取り、その後の時間、所定時間間隔で測定した。読み取りと次の読み取りとの間はプレートをカバーし、３７℃で培養した。マトリックスメタロプロテイナーゼ様活性を、メタノールで溶解した基質である、スクシニル−グリシン−プロリン−ロイシン−グリシン−プロリン７−アミノ４−メチルクマリン（Ｂａｃｈｅｍ ＵＫ社）を使用して評価した。ＭＭＰ活性の最大化のために必要とされるアッセイ緩衝液は、２００ｍＭのＮａＣｌと１０ｍＭのＣａＣｌ₂ を含有する、４０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．４であった。

参照例１に記載されたようにして作製されたコラーゲン／ＯＲＣスポンジの試料を正の対照品として使用した。ＳＯＦ−ＷＩＣＫ（登録商標）ガーゼの試料を負の対照品として使用した。

結果を図２に示す。本発明に係る複合体が急速なコラゲナーゼ活性阻害を起こし、２時間後と２４時間後に、ほとんど完全な阻害を示すことが理解できる。

上記の実施例は説明のみを意図するものである。付随するクレームの範囲内にある多くの他の実施形態は、当業者にとって明らかであろう。
なお、本願の実施態様は以下のとおりである。
（１）キトサンと酸化セルロースとを含んでなる創傷包帯用組成物。
（２）前記キトサンと前記酸化セルロースとが前記創傷包帯用組成物中で均質混合された状態にある、実施態様（１）に記載の創傷包帯用組成物。
（３）前記酸化セルロースが、繊維または粉末の分散体の形状を有する、実施態様（１）または（２）に記載の創傷包帯用組成物。
（４）前記酸化セルロースと前記キトサンとが、局所塗布用に、半固形または固形のビヒクル中に分散している、実施態様（１）〜（３）のうちのいずれかに記載の創傷包帯用組成物。
（５）前記酸化セルロースが酸化再生セルロース（ＯＲＣ）を含む、実施態様（１）〜（４）のうちのいずれかに記載の創傷包帯用組成物。
（６）前記酸化セルロースと前記キトサンとの合計が、乾燥重量基準で前記材料の少なくとも２５重量％を構成する、実施態様（１）〜（５）のうちのいずれかに記載の創傷包帯用組成物。
（７）前記酸化セルロースと前記キトサンとの合計が、乾燥重量基準で前記材料の少なくとも５０重量％を構成する、実施態様（６）に記載の創傷包帯用組成物。
（８）前記組成物が、さらに、１以上の創傷治癒治療物質（wound healing therapeutic substances）を、乾燥重量基準で約０．０１重量％〜約５重量％含有する、実施態様（１）〜（７）のうちのいずれかに記載の創傷包帯用組成物。
（９）前記組成物が可撓性のフィルムである、実施態様（１）〜（８）のうちのいずれかに記載の創傷包帯用組成物。
（１０）前記組成物中の前記キトサンと前記酸化セルロースとの重量比が１：１０〜１０：１である、実施態様（１）〜（９）のうちのいずれかに記載の創傷包帯用組成物。
（１１）前記キトサンと酸化セルロースとの重量比が１：４〜４：１の範囲にある、実施態様（１０）に記載の創傷包帯用組成物。
（１２）実施態様（１）〜（１１）のうちのいずれかに記載の創傷包帯用組成物を含んでなる創傷用包帯。
（１３）殺菌され、微生物不透過性の容器に詰められた、実施態様（１２）に記載の創傷用包帯。
（１４）創傷の治療用包帯の製法のための、実施態様（１）〜（１１）のうちのいずれかに記載の創傷包帯用組成物の使用。
（１５）前記創傷が慢性的創傷である、実施態様（１４）に記載の使用。
（１６）前記慢性的創傷が、静脈潰瘍、褥瘡性潰瘍および糖尿病性潰瘍からなる群から選ばれたものである、実施態様（１５）に記載の使用。
（１７）細胞成長因子を生体試料または有機体から分離する方法において、当該方法が、当該生体試料または有機体を、実施態様（１）〜（１１）のうちのいずれかに記載の組成物と、インビトロまたはインビボで接触させて当該成長因子を当該組成物に結合し、ついで、当該組成物を当該試料または有機体から除去することを含む方法。
（１８）さらに、前記除去ステップの後に、前記組成物から前記結合した成長因子を回収するステップを含む、実施態様（１７）に記載の方法。
（１９）活性創傷包帯用材料の製造方法において、
（ｉ）実施態様（１）〜（１３）のうちのいずれかに記載の組成物を細胞成長因子を含有する生体培地に接触させて当該細胞成長因子を当該材料に結合するステップと、
（ｉｉ）前記の結合した細胞成長因子を有する前記材料を洗浄し乾燥し、前記活性創傷包帯用材料を形成するステップと
を含む方法。
（２０）前記細胞成長因子が血小板由来の成長因子を含む、実施態様（１８）または（１９）に記載の方法。

正と負の対照品と比較した、本発明に係る創傷包帯用材料のエラスターゼ活性と時間との関係を示すグラフである。 図１と同じ正と負の対照品と比較した、本発明に係る創傷包帯用材料のコラゲナーゼ活性と時間との関係を示すグラフである。

Claims (12)

1. 創傷包帯用組成物において、
   キトサン、および、前記キトサンと均質混合された酸化セルロースを含み、
   前記組成物が、粉末、凍結乾燥型もしくは溶媒乾燥型の生体吸収性スポンジ、局所塗布用の半固形状もしくはゲル状の軟膏、または、可撓性フィルムの形状であり、
   前記酸化セルロースが、分散された不溶性の繊維の形状である酸化再生セルロース（ＯＲＣ）であり、前記線維の少なくとも８０％の体積割合が、２０μｍ〜１，０００μｍの範囲の長さを有する、創傷包帯用組成物。
2. 請求項１に記載の創傷包帯用組成物において、
   前記酸化セルロースと前記キトサンとの合計が、乾燥重量基準で前記材料の少なくとも２５重量％を構成する、創傷包帯用組成物。
3. 請求項２に記載の創傷包帯用組成物において、
   前記酸化セルロースと前記キトサンとの合計が、乾燥重量基準で前記材料の少なくとも５０重量％を構成する、創傷包帯用組成物。
4. 請求項１〜３に記載の創傷包帯用組成物において、
   前記組成物が、１つ以上の創傷治癒治療物質を、乾燥重量基準で０．０１重量％〜５重量％、さらに含有する、創傷包帯用組成物。
5. 請求項１〜４に記載の創傷包帯用組成物において、
   前記組成物中の前記キトサンと前記酸化セルロースとの重量比が１：１０〜１０：１である、創傷包帯用組成物。
6. 請求項５に記載の創傷包帯用組成物において、
   前記キトサンと酸化セルロースとの重量比が１：４〜４：１の範囲にある、創傷包帯用組成物。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の創傷包帯用組成物を含む、創傷用包帯。
8. 殺菌され、微生物不透過性の容器に詰められた、請求項７に記載の創傷用包帯。
9. 創傷の治療用包帯の製法のための、請求項１〜６のいずれかに記載の創傷包帯用組成物の使用。
10. 前記創傷が慢性的創傷である、請求項９に記載の使用。
11. 前記慢性的創傷が、静脈潰瘍、褥瘡性潰瘍および糖尿病性潰瘍からなる群から選ばれたものである、請求項１０に記載の使用。
12. 活性創傷包帯用材料の製造方法において、
    （ｉ）請求項１〜８のいずれかに記載の組成物を、細胞成長因子を含有する生体培地に接触させて当該細胞成長因子を当該材料に結合するステップと、
    （ｉｉ）前記の結合した細胞成長因子を有する前記材料を洗浄し乾燥し、前記活性創傷包帯用材料を形成するステップと
    を含む方法。

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