CN105709259A - 由水母制成的胶体胶原蛋白凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由水母胶原蛋白制作伤口敷料的方法。提供水母组织，然后添加酸以产生胶原蛋白盐溶液。混合所述溶液以形成粘性胶体凝胶，并且由该凝胶制作膜或膜/织物复合物。

Description

由水母制成的胶体胶原蛋白凝胶

本申请是分案申请，原申请的申请日为2009年1月18日、申请号为200980102011.8、发明名称为“由水母制成的胶体胶原蛋白凝胶”。

技术领域

本发明涉及由胶体胶原蛋白凝胶构成的烧伤伤口敷料(burnwounddressings)，所述胶体胶原蛋白凝胶由水母制成。

更具体而言，本发明涉及膜和膜/织物复合物以及其制备方法，其中所述膜或膜/织物复合物由水母制成并且由胶体胶原蛋白盐组成，所述胶体胶原蛋白盐具有足够的粘度以能够产生用作烧伤伤口敷料膜的稳定的凝胶，而不需要外部交联剂。

背景技术

胶原蛋白在世界范围内被应用在化妆品和药品中。其通常从牛皮、猪皮或各种动物的结缔组织获得，并且其通常作为可溶性胶原蛋白而被提取。动物的胶原蛋白来源带有感染病毒性疾病如BSE或疯牛病、口蹄疫、猪霍乱、禽流感及其它疾病的可能性。对这些动物的皮必需进行的复杂的脱毛、血液和脂肪去除也使工人暴露于上述疾病的感染，并且导致相对高的成本。

水母爆发(jellyfishblooms)在世界范围内越来越多，因此正在变得越来越讨厌并且是严重损害渔业的原因。本发明的目的是帮助将讨厌的或潜在的损害来源转化成有用的和有益的物品。水母包括大约97-98％水和约3％盐。蛋白质占其余固体的大部分并且该蛋白的主要部分是胶原蛋白。

由水母制备的胶原蛋白没有遭受动物疾病的感染。水母相对容易清洁，并且不需要像动物皮那样进行脱毛、血液或脂肪去除，它们也不依赖动物或鱼皮的去除和脱脂。

胶原蛋白形成是严重2度、3度和4度烧伤伤口和一般伤口愈合过程中各阶段的至关重要的部分。胶原蛋白在人体内和通过成纤维细胞在伤口组织更新中产生。成纤维细胞增殖得越快且越有效，胶原蛋白再生组织就可以形成得越快。成纤维细胞增殖通过对胶原蛋白支架，特别是包括I型、II型和/或III型胶原蛋白在内的支架的粘附而增强。由水母构成的胶原蛋白支架与牛胶原蛋白支架相比已经显示优异的人成纤维细胞增殖和生存力(Collagenscaffoldsderivedfrommarinesourcesandtheirbiocompatibility，EunSong，SoYeonKimetal.Biomaterials27：295129612006)。由于所有上述原因，由水母胶原蛋白组成的用于伤口愈合的胶原蛋白膜将是有优势的。到目前为止，来自水母组织的胶原蛋白膜仅应用溶解的胶原蛋白凝胶进行生产，其通常是不稳定的并且在放置后变为橡胶状。在没有引入交联剂的情况下，它们也不是热稳定的，这对于伤口敷料应用可以潜在地具有不利影响。本发明的目的是生产来自非溶解的水母胶原蛋白的、用于伤口愈合的胶原蛋白膜，其将不需要引入交联剂。

早已知道，电解质作用于蛋白质形成非蛋白质化合物。蛋白质与酸和碱化学计量地结合，这仅发生在氢离子浓度高于蛋白质的等电pH——称为等电点——时。如果将倾向于电解解离的蛋白质用恰当浓度的酸进行处理的话，则形成蛋白质盐。这产生胶体溶液，所述胶体溶液由于从分离的蛋白或离子形成聚集体而具有增加的粘度。胶体溶液的稳定性基于胶体颗粒(胶束)和周围液体之间的电位差。添加过多的酸或碱引起颗粒和液体之间的的电位差增加，从而稳定性降低。

在20世纪60年代和20世纪70年代，几个美国和加拿大专利被授予Battista和其它人，其中公开了应用特定浓度的HCl与牛皮胶原蛋白，通过强烈搅动，可能获得粘性胶原蛋白盐，其粘性在几周的时间内保持稳定。这些专利包括加拿大专利号806621，标题为″Coatingsofmicrocrystallinecollagen″；加拿大专利号814301，标题为″Colloidalcompositionsandmethods″；加拿大专利号856216，标题为″Foods，pharmaceuticalsandcosmeticscontainingasaltofcollagen″；美国专利号3,628,974，标题为″Microcrystallinecollagen，anionizablepartialsaltofcollagenandfoods，pharmaceuticalsandcosmeticscontainingsame″；美国专利号3,742,955，标题为″Fibrouscollagenderivedproducthavinghemostaicandwoundbindingproperties″；加拿大专利号953054，标题为"Methodofformingstructuresfrommicrocrystallinecollagen″；以及Zeleznick的加拿大专利号964131，标题为″Microcrystallinecollagenstructuresandmethodofpreparingsame″。

在上述参考专利中公开的所有方法都公开了由动物胶原蛋白来源制备胶原蛋白盐。然而，由水母来源制备胶原蛋白盐还没有被教导。而且由水母来源制备胶原蛋白盐不能以与由动物来源制备胶原蛋白盐相同的方式完成，这归因于胶原蛋白类型、组织的性质以及其它因素的差异。到目前为止，虽然清楚由水母胶原蛋白制成的膜会提供增强的成纤维细胞增殖以及从而提供增强的伤口愈合，但是却没有已知的由水母胶原蛋白制成的伤口敷料膜，这至少部分是因为在交联剂不存在的情况下缺乏热稳定性。

因此，由水母制备胶原蛋白盐凝胶烧伤伤口敷料膜的方法是有优势的，从而使水母的益处最大化，同时保持热稳定的胶原蛋白凝胶而不需要向所述过程中添加交联剂。

发明内容

依照本发明的一个实施方式，提供生产基于胶原蛋白的伤口敷料的方法。该方法包括提供水母组织、向水母组织添加酸以产生胶原蛋白盐溶液、混合胶原蛋白盐溶液以形成粘性凝胶以及由粘性凝胶形成烧伤敷料。伤口敷料可以是膜或膜/织物复合物。

除非另有限定，本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的含义相同的含义。尽管类似于或等价于本文描述的那些方法和材料的方法和材料可以用在本发明的实践或测试中，但适合的方法和材料在下面进行描述。在发生冲突的情况下，将遵循本专利说明书，包括定义在内。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的，并不意图进行限制。

附图说明

在此仅通过实例并参考附图对本发明进行描述。现在具体详细地参考附图，强调的是，显示的细节是以实例方式并且目的仅仅是说明性地论述本发明的各种实施方式，并且其呈现的原因是提供被认为是对本发明原理和概念方面的最有用和容易理解的描述。就此而言，没有试图比对本发明的基本理解所需更详细地显示本发明的结构细节，采用附图进行的描述使得本领域的技术人员显而易见地知晓本发明的几种实施方式可以如何体现在实践中。

在附图中：

图1是依照本发明的实施方式生产水母胶原蛋白膜的方法的流程图；

图2A是依照本发明的一个实施方式的水母胶原蛋白膜的示意性图解；以及

图2B是依照本发明的一个实施方式的水母胶原蛋白膜/织物复合物的示意性图解。

理解的是，为了简单和清楚地图解，在附图中显示的元件不必被精确地绘制或按比例绘制。例如，为了清楚，一些元件的尺寸可以相对于其它元件被放大，或几个物理组件可以包括在一个功能模块(block)或元件中。而且，在认为适当的情况下，参考数字可以在附图之间重复，以说明相应的或相似的元件。并且，附图中描述的一些模块可以组合成单一功能。

具体实施方式

在下面的详细描述中，阐述了许多具体细节，以便提供对本发明的彻底理解。本领域的普通技术人员将理解，本发明的实施方式可以在没有这些具体细节的情况下被实践。在其它情况下，公知的方法、程序、组分和结构可能没有被详细描述，以便不使本发明变得费解。

本发明涉及由胶原蛋白-盐凝胶制成的胶原蛋白膜或膜/织物复合物以及其制备方法。在本发明的实施方式中，胶原蛋白膜由提取自水母组织的胶体形式的胶原蛋白的凝胶或浆体形成。尽管提取自牛组织的胶体形式的胶原蛋白的形成是已知的，但当应用于水母时几种因素使过程变得复杂。首先，水母组织比动物或鱼皮含水更多。例如，牛组织的固态允许其被冷冻干燥并且直接溶于酸中。相反，水母组织是高度含水的，这使冷冻干燥过程非常耗时以及因此是昂贵的。此外，一些种类的水母，如在本申请实施例中使用的地中海水母(Rhopilemanomadicajellyfish)组织，主要由II型和III型胶原蛋白组成，而牛组织主要由I型胶原蛋白组成。I型胶原蛋白由于氨基酸组成、侧链组成、疏水区等的差异而比II型和III型更加热稳定。因此，由水母制作胶体胶原蛋白的参数必须适合其中发现的胶原蛋白的形式的相对热不稳定性。

现在参考图1，其是依照本发明的实施方式形成水母胶原蛋白膜的方法100的流程图。首先，提供水母(步骤102)。在一些实施方式中，水母是地中海水母，其普遍见于沿以色列的海岸。地中海水母具有由两个细胞层——外胚层和内胚层——组成的伞部(umbrella)。位于这两层之间的是中胶层，其为具有呈凝胶状物质的胶原蛋白纤维的非细胞组织。所有这三层都用于本发明中，尽管本发明的实施方式可以包括仅应用中胶层。在其它实施方式中，水母是可以适于形成胶原蛋白膜的任意其它种类的水母。通过去除触角和洗涤以从伞部内胚层去除沙子和粘膜来清洁水母(步骤104)。接下来，将清洁的水母组织切成片并且立即冷冻(步骤106)和储存在例如用于快速冷冻的浅容器中，以避免水母组织中的胶原蛋白变性。接着，将一定量的冷冻的水母组织解冻，并且从剩余的"固体材料"中去除解冻的水分(watercontent)(步骤108)。在本上下文中，"固体材料"指在解冻的水去除后剩余的组织块。然而，大体积的″固体材料″一般也包含水。应当容易想到的是，由于水母组织被冷冻成块，所以可以根据需要解冻期望量的冷冻的水母组织。解冻的水的去除导致一些水母组织中天然存在的盐的去除。然后将剩余的固体材料在去离子冰水中漂洗(步骤110)，以去除过量的盐。可以在大量的水(例如，固体材料体积与水体积1∶10的比率)中进行多次漂洗，以确保盐被充分去除。使用的起始新鲜或冷冻组织的量或浓度大约是牛皮量的三倍，以获得可用胶原蛋白凝胶的类似收率。一般地，在脱盐后原料湿重的约0.1％将保持为干重。其中，胶原蛋白收率为大约90％。

取固体脱盐的伞部片的统计学上代表性的等分试样进行干重和水分测定。对于每个批次的水母，脱盐的皮的代表性样品的等电点通过等电聚焦和其它方法进行测定。各批次可以在一年的不同季节捕捉，并且可以具有等电点和其它参数的微小变化。

接下来，应用例如保持在大约0℃下的冷冻滚筒切碎机(bowlchopper)，将脱盐的、漂洗的组织精细地切碎(步骤111)。切碎可以导致糊状稠度。将切碎的材料放入容器或器皿中，所述容器或器皿可以包括磁性搅拌器或高架式搅拌机构。添加一定量的酸(步骤112)，以达到预先确定的酸浓度(其取决于材料中留下的水的量)。预先确定的酸浓度和当量浓度将取决于组织的等电点，所述等电点如上述对每个批次进行测定(步骤113)。任意给定批次中的组织量可以根据使用的具体水母的可用性而变化，但可以是数百千克重或甚至更多。该测定可以在添加酸以形成胶体胶原蛋白盐的步骤之前适当进行。已知如果蛋白质的pH低于等电点但在等电点附近，则添加的酸越多，转化成盐的非无机蛋白就越多。因此，目标是尽可能最大化这种向蛋白盐胶体的转化并且获得最大的粘度，而不引起过量酸造成的抑制效应。以这种方式，可以最大化可通过酸与水母固体的化学计量结合而得到的蛋白质盐。根据水母组织的等电点将添加的盐酸的量调整在0.001至0.1之间的当量浓度，以及水母组织的计算的干固体含量是1％和3％之间的浓度。

当添加酸时，pH可以被监测以便确定剩余多少游离离子(H⁺)和多少游离离子(H⁺)被蛋白质所利用以形成蛋白质盐。这样，可以避免酸的过量添加。通过搅拌、掺和或搅动将胶原蛋白盐溶液进行混合(步骤114)，以形成粘性凝胶。在一个实施方式中，这通过研磨和形成匀浆来进行。在另一个实施方式中，搅拌可以使用磁性搅拌器来进行。掺和可以通过使用掺和器型设备完成，以充分搅拌酸与切碎的材料。使用掺和器的更加强劲的搅动的应用可能被需要以获得最大量的蛋白质盐形成。搅动必须在不引起过量的残存空气(气穴，airpockets)的情况下实施，所述过量的残存空气可以潜在地使胶原蛋白变性。搅拌的速率可以在例如1,000-10,000rpm范围内，但并不限于这些速度。在一个实施方式中，将温度调整到摄氏0度并且将整个设备放置在真空下。开始缓慢搅动约10分钟，以使酸与伞部组织彻底混合。然后增加搅动并且可以达到10,000rpm。在混合-掺和操作过程中，监测温度，以便不超过25摄氏度。搅动和掺和可以进行10至30分钟，以获得具有期望拉伸强度性质的膜形成所需要的最佳粘度。凝胶的粘度和热稳定性将基于水母组织浓度、酸pH、搅动速度、搅动时间和其它参数而变化。变性热阻可以在不同的温度下进行测试。

在一些实施方式中，在研磨、搅动或搅拌的过程中，可以进行粘度、渗透压、膨胀或其它参数的测定(步骤115)，用于监测目的。例如，粘度测定可以在各种时间间隔应用任意标准粘度计进行。

然后将所得的粘性胶体液体制成(步骤116)膜。该步骤可以包括将粘性胶体液体制成自支撑膜(free-standingfilm)，如图2A中所示，或可以包括织物/膜复合物的形成，如图2B中所示。在一个实施方式中，如图2A中所示的自支撑膜300如下制成。首先，将测量量的粘性液体倾倒入膜模具中并且在相对低的温度(大约20℃-30℃)下在真空炉中真空干燥以制作膜。一旦膜被干燥，可以将温度升高到100℃-110℃并且在真空下加热一段时间(大约24小时)。这一最后步骤如果适当地进行则可以同时提高胶原蛋白的天然交联，提供较高的稳定性，并同时也对膜进行灭菌。如果进行的时间过长或在过高的温度下进行，则胶原蛋白可能开始变性。在其它实施方式中，可以应用适合的压片方法直接将粘性液体制成膜。在一些实施方式中，在膜形成后，可以测试膜或膜样品(步骤118)的成纤维细胞增殖。

膜的厚度可以从25微米至100微米变化。凝胶铺展的越多，膜就会越薄。在一些实施方式中，小量的食品级试剂可以被添加以提高膜柔韧性和/或稳定性。此外，任意增强剂(enhancementagents)如维生素C或其它天然的愈合成分可以被添加。可以测试膜的体外成纤维细胞附着和增殖，并且膜可以用于伤口敷料和其它应用。

在第二个实施方式中，膜/织物复合物400通过将一片织物404浸入凝胶中或通过将粘性胶体液体经注射装置402如注射器注射到该织物片404中而形成。织物404可以是纱布、机织织物或任意其它适合的织物。在一些实施方式中，织物404由结构元件406和孔408组成，结构元件406可以具有绳索状结构、编织状结构或可以允许孔408存在的任意其它结构。在注射后，可以将膜/织物复合物在相对低的温度(大约20℃-30℃)下在真空炉中真空干燥。一旦膜被干燥，可以将温度升高到100℃-110℃并且在真空下加热一段时间(大约24小时)。

本实施方式的一个优势是孔天然存在于材料中，这可以提高渗出和伤口的愈合。在自支撑膜中，如在第一个实施方式中，可能需要引入孔，这可以例如通过脱气然后将空气以固定的比率和速度注射到凝胶中或通过使用激光来进行。

在一些实施方式中，小量的食品级试剂可以被添加以提高膜柔韧性和/或稳定性。此外，任意增强剂如维生素C或其它天然的愈合成分可以被添加。可以测试膜/织物复合物的体外成纤维细胞附着和增殖，并且膜可以用于伤口敷料和其它应用。

尽管已经结合其具体的实施方式对本发明进行了描述，但明显的是，许多替代、修改和变化对本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，意图包含落入所附权利要求的精神和宽范围内的所有此类替代、修改和变化。本说明中提到的所有公开、专利和专利申请在本文中通过引用其全部并入说明书中，达到好像每一个公开、专利和专利申请被具体和单独说明以通过引用而并入本文的程度。此外，本申请中任意参考文献的引用或确认不应当被解释为承认该参考文献可用作本发明的现有技术。

Claims (15)

1.伤口敷料，其包含：

由脱盐并切碎的水母伞部组织制成的胶体胶原蛋白，所述胶体胶原蛋白被设置来放置在伤口上，所述胶体胶原蛋白的生成不需要引入交联剂。

2.权利要求1所述的伤口敷料，其中所述胶体胶原蛋白是膜。

3.权利要求1所述的伤口敷料，其中所述胶体胶原蛋白是膜/织物复合物。

4.权利要求1所述的伤口敷料，其中所述水母伞部组织包括地中海水母组织。

5.权利要求1所述的伤口敷料，进一步包含食品级试剂。

6.权利要求2所述的伤口敷料，其中所述膜被灭菌。

7.权利要求1所述的伤口敷料，其具有增强的成纤维细胞增殖特性。

8.权利要求3所述的伤口敷料，其中所述膜/织物复合物具有多孔结构。

9.权利要求1所述的伤口敷料，其中所述胶体胶原蛋白主要包括II型和III型胶原蛋白。

10.胶原蛋白盐-凝胶组合物，包括不交联的胶原蛋白-盐胶体，所述不交联的胶原蛋白-盐胶体由下列组成：

II型胶原蛋白，从水母伞部的外胚层、中胶层、和内胚层中每一个的非溶解的脱盐的组织获得；和

盐酸。

11.权利要求10所述的组合物，其中所述组合物形成膜形式的伤口敷料。

12.权利要求11所述的组合物，其中所述膜进一步包括织物。

13.胶原蛋白盐-凝胶组合物，其包括不交联的胶原蛋白-盐胶体，所述不交联的胶原蛋白-盐胶体由下列组成：

II型胶原蛋白，所述II型胶原蛋白从非溶解的脱盐的组织获得，所述非溶解的脱盐的组织取自水母伞部的中胶层；和

盐酸。

14.权利要求13所述的组合物，其中所述组合物形成膜形式的伤口敷料。

15.权利要求14所述的组合物，其中所述膜进一步包括织物。