JP5368476B2 - クラゲから製造されるコロイドコラーゲンの火傷包帯 - Google Patents

Description

本発明は、クラゲから作られるコロイドコラーゲンゲルからなる火傷包帯を対象にするものである。

特に、本発明は、フィルム及びフィルム／ファブリック複合材料、並びにそれらの調製方法に関するものであり、ここで、該フィルム又はフィルム／ファブリック複合材料は、クラゲから作製され、外部架橋剤を必要とせずに火傷包帯として使用するため、安定なゲルの生成を可能にするのに十分な粘度を有するコロイドコラーゲン塩からなる。

コラーゲンは、化粧品及び医薬品の分野で世界的に使用されている。それは、通常、牛皮、豚皮、あるいは様々な動物の結合組織から得られており、通常、可溶性コラーゲンとして抽出される。動物由来のコラーゲンの源は、人々がＢＳＥ又は狂牛病、口蹄疫、ブタコレラ、トリインフルエンザ等のウイルス性疾患に感染する可能性がある。また、該動物の皮から必要とされる細心の注意を払った脱毛、血液及び脂肪の除去は、労働者を上述の疾患による感染にさらし、コストも相対的に高くなる。

クラゲの異常発生が世界的に増加し、このため、ますます迷惑なものとなり、水産業に対して深刻な損害を与える原因となっている。本発明の目的は、迷惑なもの又は損害の潜在的原因を有用で有益な商品に転換することを助けることである。クラゲは、およそ９７−９８％の水分と約３％の塩類とからなる。タンパク質が、残りの固体の大部分を占め、このタンパク質の大部分がコラーゲンである。

クラゲから調製されるコラーゲンは、動物疾患による感染の恐れがない。また、クラゲは比較的洗浄するのが容易であり、動物の皮のような脱毛、血液又は脂肪の除去は不要であり、動物や魚の皮の除去および脱脂に依存しない。

コラーゲンの形成は、２度、３度、４度の深刻な火傷及び一般的な創傷の治癒過程の様々な段階においての不可欠な部分である。コラーゲンは、人体及び線維芽細胞による創傷の組織再生に置かれる。線維芽細胞がより急速で且つより効果的に増殖することで、コラーゲンの再生組織が急速に発現することができる。コラーゲンの足場、特にタイプI、II、及び／又はIIIのコラーゲンを含む足場に接着することにより線維芽細胞の増殖が強化される。ウシのコラーゲンの足場と比較すると、クラゲで構成されたコラーゲンの足場は、ヒト線維芽細胞の細胞増殖及び生存率が優れることが示されている（非特許文献１）。これらの理由により、クラゲコラーゲンからなる創傷治療用コラーゲンフィルムは有用と思われる。これまでクラゲ組織からのコラーゲンフィルムは、可溶化コラーゲンゲルを用いて作られるだけであったが、それは一般的に安定でなく、立っているとゴムのようになる。また、それらは、架橋剤を導入しないと熱にも不安定であり、傷口に包帯を巻く用途に逆効果となる可能性がある。本発明の目的は、非可溶化クラゲコラーゲンから創傷治療用コラーゲンフィルムを作ることにあり、架橋剤の導入を必要としない。

タンパク質に作用する電解質が非タンパク質性のコンパウンドを形成することが長く知られている。タンパク質は、化学量理論的に酸及び塩基と結合するが、それは、水素イオン濃度がタンパク質の等電点として知られる等電ｐＨより高い場合にだけ起こる。電離する傾向のあるタンパク質が正しい濃度の酸で処理されると、タンパク質の塩が形成される。これにより、単離したタンパク質又はイオンからの凝集体の形成によって粘度が増大したコロイド溶液をもたらす。コロイド溶液の安定性は、コロイド粒子（ミセル）と周囲の液体との間の電位差に基づいている。多過ぎる酸又は塩の添加により、上記粒子と液体間の電位差の増大を引き起こし、このため、安定性が低下する。

１９６０年代と１９７０年代には、いくつかのＵＳ特許及びカナダ特許が、Ｂａｔｔｉｓｔａらによって発表されたが、ここでは、牛皮コラーゲンと共に、強くかき混ぜながら、特定の濃度のＨＣｌを使用することが開示されており、粘性コラーゲン塩が得られ、その粘度が数週間に亘って安定な状態を保つことができることが開示されている。これら特許には、「微結晶性コラーゲンのコーティング」という題の特許文献１、「コロイド組成物及び方法」という題の特許文献２、「コラーゲンの塩を含有する食品、医薬品及び化粧品」という題の特許文献３、「微結晶性コラーゲン、コラーゲンのイオン化可能な部分塩、並びにそれを含有する食品、医薬品及び化粧品」という題の特許文献４、「止血性及び創傷結合特性を有する繊維状コラーゲン由来の製品」という題の特許文献５、「微結晶性コラーゲンから構造体を形成する方法」という題の特許文献６およびＺｅｌｅｚｎｉｃｋによる「微結晶性コラーゲン構造体及びその調製方法」という題の特許文献７が挙げられる。

上記特許に開示される全部の方法は、動物コラーゲン源からのコラーゲン−塩の調製を開示する。しかしながら、クラゲ源からのコラーゲン−塩の調製は教示されていない。また、コラーゲンの種類、組織の性質及びその他の要因の差異によって、クラゲ源からのコラーゲン−塩の調製は、動物源からのコラーゲン−塩の調製と同様の方法では達成できない。現在、クラゲコラーゲンから作られるフィルムが線維芽細胞の増殖を高め、それにより傷治癒を高めることは明らかであるが、少なくとも部分的に架橋剤なしでは熱安定性に欠けることから、クラゲコラーゲンから作られる創傷包帯フィルムは知られていない。

以上のことから、クラゲからのコラーゲン−塩ゲルの火傷フィルム包帯の製造方法を提供することは有用であり、このようにして、クラゲの利点を最大限に生かしつつ、架橋剤をそのプロセスに加えることを必要とせずに熱的に安定なコラーゲンゲルを保持する。

カナダ特許第８０６６２１号明細書 カナダ特許第８１４３０１号明細書 カナダ特許第８５６２１６号明細書 米国特許第３６２８９７４号明細書 米国特許第３７４２９５５号明細書 カナダ特許第９５３０５４号明細書 カナダ特許第９６４１３１号明細書

海洋源由来のコラーゲンの足場とその生体適合性（Collagen scaffolds derived from marine sources and their biocompatibility），EunSong, So Yeon Kim et al. Biomaterials 27:29512961 2006

本発明の一実施態様によれば、コラーゲン系の創傷包帯を製造する方法を提供する。該方法は、クラゲ組織を準備することと、コラーゲン−塩溶液を作製するためにクラゲ組織に酸を加えることと、粘性ゲルを形成するためにコラーゲン−塩溶液を混合することと、粘性ゲルから火傷包帯を形成することとを含む。該創傷包帯は、フィルムまたはフィルム／ファブリック複合材料とすることができる。

特に定義がない限り、本明細書中で使われる全ての技術用語及び科学用語は、この発明が属する分野における通常の知識を有するものによって共通に理解される意味と同じである。本明細書において記載されたものと同様又は等価な方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用できるが、以下に、適切な方法及び材料を説明する。不一致がある場合は、定義を含む本特許明細書が統制する。加えて、材料、方法および実施例は、一例にすぎず、限定するものではない。

本発明は、一例ではあるが、添付図面を参照しながら、ここに説明される。ここで、図面を特に詳細に参照するが、示される特徴は、一例であり、単に本発明の様々な実施態様を図示して論じるためであり、本発明の原理および概念の最も有用で容易に理解できると思われるものを提供するために表されている。この点で、本発明の基本的な理解のため必要以上に、発明の構造的詳細を示す試みはなされておらず、図面と合わせた説明は、本発明のいくつかの実施態様を実際にどのように具体化するのかを当業者に明らかにさせる。

本発明の実施態様に係るクラゲコラーゲンフィルムの製造方法のフローチャートである。 本発明の一実施態様に係るクラゲコラーゲンフィルムの概略図である。 本発明の一実施態様に係るクラゲコラーゲンフィルム／ファブリック複合材料の概略図である。

当然のことながら、説明図の単純化および明瞭化のために、図面に示される要素は必ずしも正確に又は縮尺どおりに描かれていない。例えば、一部の要素の寸法は、他の要素に比較して明瞭化のために拡大されていたり、いくつかの物理的要素は、一つの機能的ブロックまたは要素内に含まれたりする場合がある。さらに、適当であるとみなされる箇所において、参照番号は、対応する若しくは類似した要素を示すために図面の中で繰り返されていることがある。また、図面において表される一部のブロックを単一の機能に組み合わせることもできる。

以下に示す詳細な説明においては、本発明の十分な理解のため、多数の具体的な詳細を説明する。それらの具体的な詳細がなくても本発明の実施態様を実施し得ることが、当業者によって理解されることになる。他の例では、本発明を不明瞭にしないため、良く知られた方法、手順、成分及び構造については詳細に説明していない。

本発明は、コラーゲン−塩のゲルから作られるコラーゲンフィルム又はフィルム／ファブリック複合材料、及びその調製方法に関するものである。本発明の実施態様において、コラーゲンフィルムは、クラゲ組織から抽出されるコロイド形態のコラーゲンのゲル又はスラリーから形成される。ウシ組織から抽出されるコロイド形態のコラーゲンの形成は知られているが、クラゲに適用する場合、いくつかの因子がその過程を複雑にする。まず、クラゲ組織は、動物や魚の皮と比較して非常に水性である。例えば、ウシ組織の固体性は、それを凍結乾燥させ、酸に直接可溶化させることができる。これに比べ、クラゲ組織は非常に水性であり、凍結乾燥のプロセスには非常に時間がかかり、そのため高価になってしまう。加えて、本願の実施例で使用したＲｈｏｐｉｌｅｍａ ｎｏｍａｄｉｃａのクラゲ組織等の一部の種類のクラゲは、主にタイプII及びIIIのコラーゲンからなる一方で、ウシの組織は、大部分がタイプIのコラーゲンからなる。アミノ酸の組成、側鎖の構成、疎水性領域等の差異により、タイプIコラーゲンは、タイプII及びIIIより熱に安定である。そのようなものとして、クラゲからコロイドコラーゲンを形成するためのパラメータは、ここで見出したコラーゲンの形態の相対的熱不安定性に合わせなければならない。

ここで、本発明の実施態様に係るクラゲコラーゲンフィルムを形成するための方法１００のフローチャートである図１を参照する。まず、クラゲを用意する（工程１０２）。一部の実施態様において、そのクラゲは、イスラエルの海岸沿いで一般的に見つけられるＲｈｏｐｉｌｅｍａ ｎｏｍａｄｉｃａクラゲである。Ｒｈｏｐｉｌｅｍａ ｎｏｍａｄｉｃａクラゲは、外胚葉と内胚葉の二つの細胞層で作り上げた傘を有する。それら二つの層の間には間充ゲルがあり、それはゼラチン状の物質のコラーゲン繊維を有する非細胞組織である。本発明の実施態様は間充ゲル層のみの使用を含み得るが、本発明には３つ全ての層を使用する。他の実施態様において、クラゲは、コラーゲンフィルムの形成に適していると思われる他の種類のクラゲである。触手を除去し、傘の内胚葉から砂及び粘膜を除去するように洗浄することで、クラゲを清浄にする（工程１０４）。次に、清浄にしたクラゲの組織を切り分け、直ちに凍結させ（工程１０６）、例えばクラゲ組織のコラーゲンの変質を避けるため、急速凍結用の浅い容器に貯蔵する。次に、凍結したクラゲ組織の量を解凍し、残りの「固形物」から解凍された水分を除去する（工程１０８）。この文脈において、「固形物」とは、解凍された水を除去した後に残る組織の塊を指す。しかしながら、その「固形物」の多くの量は、一般的に同じく水からなる。クラゲ組織は塊で凍結されるので、凍結されたクラゲ組織の所望量を必要に応じて解凍できることは容易に明らかとなる。解凍された水の除去は、クラゲ組織の中にもともと含まれる塩の一部の除去をもたらす。次に、脱イオン化した氷水で残った固形物のすすぎ洗いをし（工程１１０）、過剰な塩を除去する。塩が十分に除去されることを確保するため、すすぎ洗いを多量の水（たとえば、固形物と水の体積が１：１０の割合）で数回行ってもよい。開始用の新鮮な組織又は凍結した組織の使用量又は使用濃度は、使用可能なコラーゲンゲルの同様の収率のため、牛皮に比べて約３倍である。一般的に、脱塩を受けて、原料の湿重量の約０．１％が、乾燥重量として残る。そのうちコラーゲンの収率は約９０％である。

脱塩した傘状の固体片の統計学的に代表的なアリコートが、乾燥重量と水分の決定に取られる。脱塩した皮の代表的な試料の等電点は、クラゲの各バッチについての等電点電気泳動法及びその他の方法で決定される。バッチはその年の異なるシーズンで捕獲でき、等電点と他のパラメータにおいて少しの変動がありうる。

次に、例えば、およそ０℃に維持された冷蔵保存したボウルチョッパーを用いて、すすぎ洗いをして脱塩した組織を細かく刻む（工程１１１）。細断することでペースト状のコンシステンシーをもたらす。細断した材料を、磁気撹拌器又は頭上撹拌機構を含むことができるコンテナ又はベスルに入れる。所定の酸濃度（材料中に残っている水の量によって決まる）に達する量の酸を加える（工程１１２）。所定の酸濃度と規定度は、組織の等電点に依存し、それは上述したようにバッチごとに決定される（工程１１３）。任意の与えられたバッチの組織量は、使用した特定のクラゲの有効性によって変わることがあるが、数百キログラム相当か、あるいはそれ以上である。この決定は、コロイドコラーゲン塩を形成するために酸を加える工程より前に十分に行うことができる。タンパク質のｐＨ値が等電点よりやや下であれば、更に酸を加えることでより多くの非無機のタンパク質が塩に変形することが知られている。そこで、その目的は、タンパク質塩コロイドへの変形をできる限り最大にし、過剰の酸による抑圧効果を起こさずに最大の粘性を得ることである。このようにして、クラゲの固体と酸の化学量論的結合によって得られるタンパク質塩を最大にすることができる。塩酸の場合、その添加量は、クラゲ組織の等電点によって０．００１と０．１の間の規定度に調整されるが、クラゲ組織の場合には、１〜３％の間の濃度の計算された乾燥固体含量に調整される。

酸を加える間、遊離イオン（Ｈ^＋）がどのくらい残るのか、タンパク質塩を形成させるためにタンパク質をどの程度取り込ませるのかを決定するため、ｐＨを監視することができる。このようにすると、酸の過度な添加を避けることができる。該コラーゲン−塩溶液を、攪拌（stirring）、ブレンディング又はかき混ぜ（agitation）により混合し、粘性ゲルを形成する（工程１１４）。一実施態様では、これは、粉砕し破砕物を形成することにより行われる。他の実施態様では、磁気撹拌器を用いて攪拌を行ってもよい。ブレンディングは、ブレンダー型装置を用いて達成でき、細断した材料と酸を十分に撹拌する。ブレンダーを用いたより激しいかき混ぜの使用は、タンパク質塩の形成を最大限に得るために必要とされ得る。コラーゲンを変性させる可能性のある過剰のエアポケットを起こさずに、かき混ぜを行うことが必要である。攪拌の速度は、例えば１，０００−１０，０００ｒｐｍの範囲であることがあるが、その速度に制限されない。一実施態様では、温度を０℃に調節し、装置全体を真空下に設置する。遅いかき混ぜを開始し、約１０分で酸の傘状組織との完全な混合を可能にする。次いで、撹拌を増大し、１０，０００ｒｐｍに達することができる。混合−ブレンディング操作中に２５℃を超えないように、温度を監視する。望ましい引張強度特性を持つフィルム形成の為に必要な最適粘度を得るため、かき混ぜ及びブレンディングを１０−３０分間行うことができる。ゲルの粘度と熱安定性は、クラゲ組織の濃度、酸ｐＨ、攪拌速度、攪拌時間、及びその他のパラメータに基づき様々である。変性に対する耐熱性は、異なる温度で試験できる。

一部の実施態様において、粉砕、かき混ぜ又は攪拌の過程中、粘度、浸透圧、膨張又はその他のパラメータの測定を監視の目的で行うことができる（工程１１５）。例えば、標準粘度計を用いて様々な間隔で粘度測定を行うことができる。

次に、得られた粘性コロイド液体をフィルムに形成する（工程１１６）。この工程は、粘性コロイド液体の図２Ａに示す独立して立っているフィルムへの形成を含んでもよいし、図２Ｂに示すファブリック／フィルム複合材料の形成を含んでもよい。一実施態様において、図２Ａに示す独立のフィルム３００は、次のように形成される。第１に、測定された量の粘性液体をフィルム金型に注ぎ、比較的低い温度（約２０℃〜３０℃）の真空オーブン中真空下で乾燥させ、フィルムを作る。フィルムが乾燥した時点で、温度を１００℃〜１１０℃に上げ、真空下である期間（約２４時間）加熱することができる。この最終工程は、正しく行えば、コラーゲンの自然架橋、強い安定性の提供、更にはフィルムの滅菌を同時に強化することができる。非常に長時間又は非常に高温度で行うと、コラーゲンは変性し始めることがある。他の実施態様では、適合シーチング法を用いて、粘性液体を直接フィルムに形成することができる。一部の実施態様において、フィルム形成の後に、そのフィルム又は該フィルムのサンプルの線維芽細胞増殖を検査することができる（工程１１８）。

フィルムは２５〜１００ミクロンの厚みで変化しうる。ゲルをより広げると、そのフィルムは薄くなる。一部の実施態様では、フィルムの柔軟性及び／又は安定性を高めるために少量の食品等級剤を加えてもよい。さらに、ビタミンＣやその他の自然治癒要素等の増強剤を加えることもできる。フィルムは、生体外での線維芽細胞の付着及び増殖について検査してもよく、創傷包帯及び他の用途に使用することができる。

第２の実施態様では、ゲル中に一切れのファブリック４０４を浸漬させるか、又は注射器等の注入機器４０２を介して粘性コロイド液体を該ファブリック４０４に注入することによって、フィルム／ファブリック複合材料４００を形成する。ファブリック４０４は、ガーゼ、織物、または他の適したファブリックとすることができる。一部の実施態様において、ファブリック４０４は、構造要素４０６と穴４０８からなる。構造要素４０６は、ロープ状の構造、織物状の構造、又は穴４０８の存在が可能となる他の構造を有することができる。注入後、フィルム／ファブリック複合材料は、比較的低い温度（約２０℃〜３０℃）の真空オーブン中、真空下で乾燥させることができる。フィルムが乾燥した時点で、温度を１００℃〜１１０℃に上げ、真空下である期間（約２４時間）加熱することができる。

この実施態様の利点は、穴が材料に自然に存在することであり、浸出と創傷の治療を強化することができる。独立フィルムには、第１の実施態様のように、穴を導入することが必要である場合があり、例えば、脱気し、次いで固定された割合および速度でゲル中に空気を注入するか、又はレーザーを使用することにより行うことができる。

一部の実施態様において、少量の食品等級剤を、フィルムの柔軟性および／または安定性を高めるために加えることができる。加えて、ビタミンＣやその他の自然治癒要素などの増強剤を加えることができる。フィルム／ファブリック複合材料は、線維芽細胞の生体外での付着及び増殖の試験を行い、創傷包帯と他の用途に使うことができる。

本発明を特定の実施態様に関して説明してきたが、多くの代替、修正および変更が当業者に明らかであることは明白である。従って、特許請求の範囲の精神および広範に亘る範囲に含まれるようなすべての代替、修正および変更を包含することが意図される。本願明細書に記載された全ての出版物、特許及び特許出願は、個々の出版物、特許又は特許出願が具体的に且つ独立して参照することによりここに組み込まれることが示唆されているのと同程度に、本明細書中に参照することにより完全な形で組み込まれる。加えて、本出願におけるあらゆる参考資料の引用又は識別は、かかる参考資料が本発明に対する先行技術として利用できることを認めたとして解釈されるべきではない。

Claims (20)

1. クラゲ組織を準備する工程と、
   前記クラゲ組織を脱塩する工程と、
   前記クラゲ組織を粉砕する工程と、
   コラーゲン−塩コロイドを作製するために、前記クラゲ組織に、前記クラゲ組織の等電点に基づいてあらかじめ定められた所定の濃度およびモル濃度の酸を加える工程と、
   粘性ゲルを形成するために前記コラーゲン−塩コロイドを混合する工程と、
   を含むことを特徴とするコラーゲン系ゲルの製造方法。
2. 前記ゲルからコラーゲンの足場を形成することを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記ゲルからフィルム／ファブリック複合材料を形成することを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記クラゲ組織がＲｈｏｐｉｌｅｍａ ｎｏｍａｄｉｃａクラゲを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 酸を加える前記工程が、１−３％のクラゲ組織溶液に０．００１−０．１Ｍ濃度の範囲の強酸を加えることを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 酸を加える前記工程中にｐＨを監視することを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記混合が、均質化、攪拌、ブレンディング、かき混ぜ、又はそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. かき混ぜの間に、粘度の測定を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 除湿空気又は真空下で一定期間、前記足場を乾燥させることを更に含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
10. 前記足場を滅菌することを更に含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
11. 作製した足場の線維芽細胞増殖を検査することを更に含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
12. 創傷上に置けるように構成されたクラゲ組織から製造したコロイドコラーゲンを備え、前記コロイドコラーゲンは架橋なしで製造したことを特徴とする創傷包帯。
13. 前記コロイドコラーゲンが足場であることを特徴とする請求項１２に記載の創傷包帯。
14. 前記コロイドコラーゲンがフィルム／ファブリック複合材料であることを特徴とする請求項１２に記載の創傷包帯。
15. 前記クラゲ組織がＲｈｏｐｉｌｅｍａ ｎｏｍａｄｉｃａクラゲ組織を含むことを特徴とする請求項１２に記載の創傷包帯。
16. 食品等級剤を更に備えることを特徴とする請求項１２に記載の創傷包帯。
17. 前記足場が、滅菌されたことを特徴とする請求項１３に記載の創傷包帯。
18. 前記足場は、厚さが２５〜１００ミクロンの範囲であることを特徴とする請求項１３に記載の創傷包帯。
19. 強化した線維芽細胞の増殖特性を有することを特徴とする請求項１２に記載の創傷包帯。
20. 前記フィルム／ファブリック複合材料が多孔質構造を有することを特徴とする請求項１４に記載の創傷包帯。

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