CN116196459A - 一种组织修复止血膜及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医用材料技术领域，提供一种组织修复止血膜及其制备方法和应用。所述方法包括：S1、取非人哺乳动物皮肤组织经预处理后取样至真皮层；取下的皮肤组织即分为表皮层和真皮层两面；S2、对步骤S1制得材料经冻融处理以脱去细胞得基质材料；S3、将保护剂施加于所述基质材料并进行冷冻干燥；S4、冷冻干燥后进行揉搓或反复折叠使之柔软。本发明通过使用原料来源广泛，成本低廉的动物皮肤组织，经简单处理后后即得到基质材料，将凝胶材料设置于真皮层上经冻干后即可得到组织修复止血膜，使用的原料来源广泛，成本低廉，材料的处理方法简便，成本较低，且产品用途多样，临床使用操作简便，省时省力，具有良好的实际应用价值。

Description

一种组织修复止血膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种组织修复止血膜及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

脱细胞基质材料是一种生物来源的材料。该材料取自同种异体或异种动物皮肤组织，通过物理、化学或生物学方法去除细胞成分后，保留了细胞外基质网状支架结构。去除细胞成分可以降低免疫排斥反应，保留的网状支架结构可引导宿主细胞在其内生长，促进缺损修复、增强组织韧度。

利用动物皮肤组织制备脱细胞基质材料时，常有以下处理，机械除毛后再进行脱细胞操作。发明人研究发现，机械除毛有除毛不尽、发根残留的问题。除毛后进行组织处理时，常有酶法、化学法等，酶法常常破坏皮肤组织完整性，化学法有溶剂残留问题等。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种脱细胞基质组织修复止血膜及其制备方法和应用。本发明通过使用原料来源广泛，成本低廉的动物皮肤组织，经简单处理后后即得到基质材料，将凝胶材料设置于真皮层上经冻干后即可得到组织修复止血膜，具有良好的实际应用之价值。

本发明的目的之一在于提供一种组织修复止血膜的制备方法。

本发明的目的之二在于提供上述方法制备得到的组织修复止血膜。

本发明的目的之三在于提供上述组织修复止血膜的应用。

为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种组织修复止血膜的制备方法，所述方法包括：

S1、取非人哺乳动物皮肤组织经预处理后取样至真皮层；上述取样过程中尽量不连带真皮下组织；取下的皮肤组织即分为表皮层和真皮层两面；其中，所述预处理至少包括采用激光对皮肤组织进行脱毛处理；

S2、对步骤S1制得材料经冻融处理以脱去细胞得基质材料；

S3、将保护剂施加于所述基质材料并进行冷冻干燥；

S4、取冷冻干燥后的膜片进行揉搓或反复折叠使之柔软。

本发明的第二个方面，提供上述方法制备得到的组织修复止血膜，所述组织修复止血膜其具有极佳的粘附性，且止血效果显著，能够更好促进创面修复愈合，且安全无毒。

本品冷冻干燥后分为两面，一面是细密的表皮真皮层，具有防粘连，阻止胶原纤维长入的作用，另一面具凝胶层可促进血管生成、为新生细胞搭建支架，促进缺损修复。临床应用时根据实际情况区分两面的放置。如，在口腔医学领域，在口腔种植、牙槽外科、牙周科中使用的膜修复产品，可将口腔软组织和骨缺损隔离开来，使用时根据需要将具有阻止胶原纤维长入的表皮真皮层置于外侧，将能为新生细胞搭建支架的具凝胶层置于骨缺损区，此时的修复膜建立一个生物屏障，为骨再生创造一个相对封闭的环境。在临床其他领域使用时，也应根据需求选择两面的朝向。

因此，本发明的第三个方面，提供上述组织修复止血膜在制备医用材料中的应用；所述医用材料具有封闭、防粘连、止血等多重功效。

上述技术方案的有益效果：

上述技术方案以动物皮肤组织为原料，成功制备出一种具有封闭、防粘连、止血等多重功效的脱细胞基质组织修复止血膜，使用的原料来源广泛，成本低廉，材料的处理方法简便，成本较低，易于工业化推广和应用；且产品用途多样，临床使用操作简便，省时省力，具有良好的实际应用之价值。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，利用动物皮肤组织制备脱细胞基质材料时，常有以下处理，机械除毛后再进行脱细胞操作。发明人研究发现，机械除毛有除毛不尽、发根残留的问题。除毛后进行组织处理时，常有酶法、化学法等，酶法常常破坏皮肤组织完整性，化学法有溶剂残留问题等。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种组织修复止血膜的制备方法，所述方法包括：

S1、取非人哺乳动物皮肤组织经预处理后取样至真皮层；上述取样过程中尽量不连带真皮下组织；其中，所述预处理至少包括采用激光对皮肤组织进行脱毛处理；

S2、对步骤S1制得材料经冻融处理以脱去细胞得基质材料；

S3、将保护剂施加于所述基质材料并进行冷冻干燥；

S4、取冷冻干燥后的膜片进行揉搓或反复折叠使之柔软。

其中，所述步骤S1中，所述非人哺乳动物可以为牛、猪等，选定动物年龄为9个月及以下，由于牛、猪等动物皮肤覆盖毛发较多且致密，激光脱毛处理可反复进行，如进行1-12次。每次脱毛处理时间间隔控制为至少间隔一天以及以上，在本发明的一个具体实施方式中，脱毛处理间隔为一周。

待最后一次脱毛后间隔至少一天进行取样处理，所述取样可采用鼓式取皮机、辊刀或者其他取皮装置，在此不做具体限定。

在本发明的一个具体实施方式中，取样厚度可以控制为0.1mm-3mm。

进一步的，取样完成后，采用流水冲洗去掉样品残留的杂质，转移至PBS(pH7.3)缓冲液中，超声震荡10-20分钟，继续用10-20倍量水浸泡冲洗，浸泡时长为0.5-2小时；浸泡反复操作2-10次。

所述步骤S2中，冻融处理具体方法为：膜片材料平铺于平板上放置在-40～-10℃的环境中冷冻，6-24小时后取出至30～40℃水浴中超声震荡10-60分钟；超声震荡后取出置于PBS缓冲液或纯水中浸泡冲洗10-60分钟；自-40～-10℃下进行冻融开始至PBS缓冲液或纯水浸泡冲洗重复操作2-10次。

所述步骤S3中，所述保护剂可以为海藻酸钠、纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、透明质酸及其衍生物、阿拉伯胶、黄原胶、硅酸镁锂中的任意一种或多种，通过加入上述保护剂，从而使得在冻融过程中保护真皮层的三维立体支架结构，为宿主修复细胞长入提供支架，保证修复效果，提高最终制备的修复止血膜性能。同时上述保护剂增强产品粘附性，使得在某些部位使用修复膜时，可进行免缝合操作即可达到密封效果，临床操作简便；而且，上述保护剂为凝胶制剂，可载药并具有缓释效果，实现靶向给药；凝胶带有离子，可凝聚血液形成血栓，具有止血效果。

所述保护剂施加于所述真皮层一面，具体的，可采用如下方法加入保护剂：将保护剂溶解成凝胶状(含量控制为2-6％，w/w)，平铺于平板上，高度小于待处理的皮肤组织；表皮层一侧朝上，将真皮层一侧接触凝胶；或，将皮肤组织平铺于平板上，真皮层一侧朝上，涂覆凝胶状的保护剂。加入保护剂后，为进一步保证其渗透于真皮层中，保证静置10分钟及以上，然后再进行冷冻干燥。

所述冷冻干燥具体程序包括：-40～-30℃预冻1-4h；预冻后抽真空，-40～-30℃保持1-3h；后升温至-30～-25℃，升温时间1-3h，并保持2-3h；后升温至-20℃，升温时间2-3h，并保持2-3h；后升温至-15℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至-10℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至0℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至10℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至20℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至30℃，升温时间2-3h，并保持2-3h。

取冷冻干燥后膜片，进行揉搓或反复折叠使之柔软。

进一步的，所述方法还包括将揉搓或反复折叠柔软后的修复止血膜进行裁切、裁切后进行正反面标记、包装以及灭菌的步骤。如将修复止血膜裁切成合适的规格，后使用泡罩、铝塑袋进行包装；包装完成后进行灭菌，可选择辐射灭菌或环氧乙烷灭菌等，在此不再赘述。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法制备得到的组织修复止血膜，所述组织修复止血膜其具有极佳的粘附性，且止血效果显著，能够更好促进创面修复愈合，且安全无毒。

本品冷冻干燥后分为两面，一面是细密的表皮真皮层，具有防粘连、阻止纤维长入的作用，另一面具凝胶层可促进血管生成、为新生细胞搭建支架，促进缺损修复。临床应用时根据实际情况区分两面的放置。如，在口腔医学领域，在口腔种植、牙槽外科、牙周科中使用的膜修复产品，可将口腔软组织和骨缺损隔离开来，使用时根据需要将具有阻止胶原纤维长入的表皮真皮层置于外侧，将能为新生细胞搭建支架的具凝胶层置于骨缺损区，此时的修复膜建立一个生物屏障，为骨再生创造一个相对封闭的环境。在临床其他领域使用时，也应根据需求选择两面的朝向。因此，本发明的又一具体实施方式中，提供上述组织修复止血膜在制备医用材料中的应用；所述医用材料具有封闭、防粘连、止血等多重功效。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1

基质材料的准备

选择具有合格防疫资质的畜牧场，挑选3月龄的猪，不限雌雄。将猪前肢后肢适当固定，操作时可露出腹部、背部，先使用剃刀大致除毛后使用激光脱毛仪进行脱毛。激光脱毛仪选择市面上常见品牌。使用时仪器参数按照设备说明书设定。一周后重复激光脱毛一次。再一周后取样。取样时使用鼓式取皮机、辊刀或者其他取皮装置，取样至真皮层。厚度约0.2mm。取样后流水冲洗去掉杂质，转移至PBS(pH7.3)缓冲液中，超声震荡15分钟，继续用10倍量以上的纯化水浸泡冲洗，浸泡时长1小时。纯化水浸泡反复操作2次。浸泡后取出进行冻融处理，膜片平铺于平板上放置在-20℃的环境中冷冻。6小时后取出至37℃水浴中超声震荡30分钟。超声震荡后取出置于纯化水中浸泡冲洗1h。自-20℃下进行冻融开始至纯化水浸泡冲洗重复操作2次。之后置于生理盐水中贮存。

凝胶的准备

取硅酸镁锂，加入纯化水中，含量为2％(w/w)，强烈搅拌下分散溶解成透明凝胶。

修复止血膜的制备

取基质材料平整铺于平板中，表皮真皮层与平板接触，另一面朝上，将硅酸镁锂凝胶均匀涂抹于其上。静置1h后进行冷冻干燥。冻干程序如下：-30℃预冻3h。预冻后抽真空，-30℃保持3h；后升温至-25℃，升温时间3h，并保持3h；后升温至-20℃，升温时间3h，并保持3h；后升温至-15℃，升温时间3h，并保持3h；后升温至-10℃，升温时间3h，并保持3h；后升温至0℃，升温时间3h，并保持3h；后升温至10℃，升温时间3h，并保持3h；后升温至20℃，升温时间3h，并保持3h；后升温至30℃，升温时间3h，并保持3h。

膜片的揉搓

取冷冻干燥后的膜片，揉搓使柔软，揉搓可反复进行。

完成后取样品裁切成合适的规格，每个膜片在一角做好标记以区分正反面，后使用泡罩、铝塑袋进行包装。包装完成后进行灭菌，可选择辐射灭菌或环氧乙烷灭菌。

实施例2

基质材料的准备

选择具有合格防疫资质的畜牧场，挑选6月龄的牛，不限雌雄。将牛前肢后肢适当固定，操作时可露出腹部、背部，先使用剃刀大致除毛后使用激光脱毛仪进行脱毛。激光脱毛仪选择市面上常见品牌。使用时仪器参数按照设备说明书设定。两周后重复激光脱毛，重复二次。再一周后取样。取样时使用鼓式取皮机，辊刀或者其他取皮装置，取样至真皮层。厚度约0.6mm。取样后流水冲洗去掉杂质，转移至PBS(pH7.3)缓冲液中，超声震荡30分钟，继续用10倍量以上的PBS缓冲液浸泡冲洗，浸泡时长0.5小时。纯化水浸泡反复操作5次。浸泡后取出进行冻融处理，膜片平铺于平板上放置在-10℃的环境中冷冻。12小时后取出至37℃水浴中超声震荡15分钟。超声震荡后取出置于PBS缓冲液中浸泡冲洗30分钟。自-10℃下进行冻融开始至PBS缓冲液浸泡冲洗重复操作8次。最后一次PBS缓冲液冲洗之后取出，使用纯化水浸泡，浸泡时可使用搅拌器进行低速搅拌1h，期间换水5次。最后一次换水后取出置于纯化水中贮存。

凝胶的准备

取海藻酸钠，加入纯化水中，含量为3％(w/w)，搅拌下分散溶解成透明凝胶。

修复止血膜的制备

取基质材料平整铺于平板中，表皮真皮层与平板接触，另一面朝上，将海藻酸钠凝胶均匀涂抹于其上。静置2h后进行冷冻干燥。冷冻干燥程序如下：-40℃预冻1h。预冻后抽真空，-40℃保持2h；后升温至-30℃，升温时间2h，并保持2h；后升温至-20℃，升温时间2h，并保持2h；后升温至-15℃，升温时间2h，并保持2h；后升温至-10℃，升温时间2h，并保持2h；后升温至0℃，升温时间2h，并保持2h；后升温至10℃，升温时间2h，并保持2h；后升温至20℃，升温时间2h，并保持2h；后升温至30℃，升温时间2h，并保持2h。

膜片的揉搓

取冷冻干燥后的膜片，揉搓使柔软。揉搓可反复进行。

完成后取样品裁切成合适的规格，每个膜片在一角做好标记以区分正反面，后使用泡罩、铝塑袋进行包装。包装完成后进行灭菌，可选择辐射或环氧乙烷方式进行灭菌。

实施例3

基质材料的准备

选择具有合格防疫资质的畜牧场，挑选1月龄的猪，不限雌雄。将猪前肢后肢适当固定，漏出腹部和背部，先使用剃刀大致除毛后使用激光脱毛仪进行脱毛。激光脱毛仪选择市面上常见品牌。按照设备说明书设定使用时的参数。1周后重复激光脱毛，重复1次。再一周后取样。取样时使用鼓式取皮机或者其他取皮装置，取样至真皮层。厚度约1mm。取样后流水冲洗去掉杂质，转移至PBS(pH7.3)缓冲液中，超声震荡60分钟，继续用10倍量以上的PBS缓冲液浸泡冲洗，浸泡时长1小时。纯化水浸泡反复操作10次。浸泡后取出进行冻融处理，膜片平铺于平板上放置在-40℃的环境中冷冻。24小时后取出至37℃水浴中超声震荡60分钟。超声震荡后取出置于PBS缓冲液中浸泡冲洗10分钟。自-40℃下进行冻融开始至PBS缓冲液浸泡冲洗重复操作10次。最后一次PBS缓冲液冲洗之后取出，使用纯化水浸泡，浸泡时可使用搅拌器进行低速搅拌10分钟，期间换水6次。最后一次换水后取出置于PBS缓冲液中贮存。

凝胶的准备

取羧甲基壳聚糖，加入纯化水中，含量为6％(w/w)，搅拌下分散溶解成透明凝胶。

修复止血膜的制备

将羧甲基壳聚糖凝胶平铺于平板上，取基质材料平整铺于平板中，表皮真皮层朝上，另一面与凝胶接触。静置5h后进行冷冻干燥。冷冻干燥时将膜片揭起，凝胶面朝上，平铺于平板上。冷冻干燥程序如下：-40℃预冻4h。预冻后抽真空，-30℃保持3h；后升温至-25℃，升温时间2.5h，并保持2.5h；后升温至-20℃，升温时间2h，并保持2h；后升温至-15℃，升温时间1.5h，并保持1.5h；后升温至-10℃，升温时间1h，并保持1h；后升温至0℃，升温时间1h，并保持1h；后升温至10℃，升温时间1h，并保持1h；后升温至20℃，升温时间1h，并保持1h；后升温至30℃，升温时间3h，并保持3h。

膜片的反复折叠

取冷冻干燥后的膜片，反复折叠使柔软。

完成后取样品裁切成合适的规格，每个膜片在一角做好标记以区分正反面，后使用泡罩、铝塑袋进行包装。包装完成后进行灭菌，可选择辐射或环氧乙烷方式进行灭菌。

对比例1～3

实施例1～3的制备中，除涂抹、浸泡凝胶外，完成其余操作得到的样品分别为对比例1～3。

粘附性试验：

取实施例/对比例中的两个样品，裁切成2cm×4cm大小，两膜片以凝胶面对凝胶面，或真皮面对真皮面粘附，粘附长度2cm，粘附时用纯化水润湿。粘附后静置5分钟，后将粘附后样品两端夹于拉力机的夹头中(不得夹持到粘附部位)，以5mm/min的速度上下拉伸至两样品分离，记录最高拉力值。

表1各实施例和对比例最高拉力值比较

加入凝胶剂后，膜片的粘附力远远大于不加凝胶剂的样品。

止血试验：

取大鼠随机分为3组，分别为实施例组、对比例组和空白对照组，每组3只，给与戊巴比妥溶液腹腔内注射麻醉，腹部备皮后用碘酒进行手术区域的消毒。腹部正中行纵行切口，充分暴露肝脏右叶，切去肝右叶下缘尖端，切去后及时用膜片进行覆盖，观察止血情况，记录完全停止出血的时间，空白对照组不执行主动止血。试验过程中，实施例样品能及时粘附于创面上。止血效果可知，实施例样品止血效果好于比较例样品。

表2各实施例和对比例止血效果比较

口腔粘膜缺损修复试验：

取新西兰大白兔，雌雄不限，试验分为实施例组、比较例组和空白对照组，每组3只。在兔门齿上侧硬腭制备直径为1cm的粘膜缺损，缺损部位植入实施例组、比较例组样品，空白对照组仅常规纱布止血，不做其他处理。28天后观察创面愈合情况，实施例组、比较例组创面完全愈合，空白对照组创面仍有较大缺损。试验兔处死后取下修复创面，测量创面厚度，实施例组厚度大于比较例组。涂抹凝胶后的修复止血膜能更好的促进创面修复。

细胞毒性试验：

取实施例1-3、对比例1-3参考GB/T 16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验进行细胞毒性试验，试验方法如下：实施例1-3，比较例1-3按照1.25cm²/ml的比例加入浸提介质。浸提介质：含血清MEM培养基，浸提温度为37℃31℃，浸提时间为24h32h。取浸提液按照GB/T 16886.5-2017规定的方法进行，以定量方法评价细胞毒性。

表3各实施例和对比例细胞毒性结果

细胞毒性1级表示没有细胞毒性；细胞毒性2级表示轻微细胞毒性；细胞毒性3级表示中度细胞毒性；细胞毒性4级表示重度细胞毒性。

由以上结果可知，实施例及比较例的细胞毒性结果均为1级，满足临床要求。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种组织修复止血膜的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、取非人哺乳动物皮肤组织经预处理后取样至真皮层；取下的皮肤组织即分为表皮层和真皮层两面；其中，所述预处理至少包括采用激光对皮肤组织进行脱毛处理；取样厚度控制为0.1mm-3mm；

S2、对步骤S1制得材料经冻融处理以脱去细胞得基质材料；

S3、将保护剂施加于所述基质材料并进行冷冻干燥；

S4、冷冻干燥后进行揉搓或反复折叠。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述非人哺乳动物为牛或猪，选定动物年龄为9个月及以下，激光脱毛处理反复进行1-12次；每次脱毛处理时间间隔控制为至少间隔一天以及以上。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，待最后一次脱毛后间隔至少一天进行取样处理，所述取样采用鼓式取皮机或辊刀。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，取样完成后，采用流水冲洗去掉样品残留的杂质，转移至PBS缓冲液中，超声震荡10-20分钟，继续用10-20倍量水浸泡冲洗，浸泡时长为0.5-2小时；浸泡反复操作2-10次。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，冻融处理具体方法为：膜片材料平铺于平板上放置在-40～-10℃的环境中冷冻，6-24小时后取出至30～40℃水浴中超声震荡10-60分钟；超声震荡后取出置于PBS缓冲液或纯水中浸泡冲洗10-60分钟；自-40～-10℃下进行冻融开始至PBS缓冲液或纯水浸泡冲洗重复操作2-10次。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述保护剂为海藻酸钠、纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、透明质酸及其衍生物、阿拉伯胶、黄原胶、硅酸镁锂中的任意一种或多种；

所述保护剂施加于所述真皮层一面，具体的，可采用如下方法加入保护剂：

将保护剂溶解成凝胶状，平铺于平板上，高度小于待处理的皮肤组织；表皮层一侧朝上，将真皮层一侧接触凝胶；或，将皮肤组织平铺于平板上，真皮层一侧朝上，涂覆凝胶状的保护剂；加入保护剂后，保证静置10分钟及以上，然后再进行冷冻干燥。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，可进行常规的冷冻干燥处理，所述冷冻干燥具体程序包括：-40～-30℃预冻1-4h；预冻后抽真空，-40～-30℃保持1-3h；后升温至-30～-25℃，升温时间1-3h，并保持2-3h；后升温至-20℃，升温时间2-3h，并保持2-3h；后升温至-15℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至-10℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至0℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至10℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至20℃，升温时间1-3h，并保持1-3h；后升温至30℃，升温时间2-3h，并保持2-3h。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括将处理柔软的修复止血膜进行裁切、裁切后进行正反面标记、包装以及灭菌的步骤。

9.权利要求1-8任一项所述方法制备得到的组织修复止血膜。

10.权利要求9所述组织修复止血膜在制备医用材料中的应用；所述医用材料具有封闭、防粘连、止血的多重功效。