CN114949330B - 脱细胞鱼皮基质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脱细胞鱼皮基质及其制备方法。本发明的脱细胞鱼皮基质的制备方法包括脱细胞处理步骤：将鱼皮组织固定在电极极片上，置于电脱溶液中，利用峰值Vpp＝5～10V的正弦波或矩形波对鱼皮组织进行脱细胞。本发明的制备方法简单，舍去了传统方法中冗长的化学试剂、生物酶脱细胞的步骤，快速且效果好，细胞外基质的形貌保留完整且残留DNA符合行业标准。

Description

脱细胞鱼皮基质及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料制备技术领域，具体涉及脱细胞鱼皮基质及其制备方法。
背景技术
脱细胞化的细胞外基质(ECM)是最接近生物自身组织的支架材料，具有天然组织的复杂成分，包括I型和III型胶原蛋白、粘连蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白和大分子蛋白聚糖等，而且具有与体内微环境相似的三维结构和柔韧性。其是目前较为理想的细胞微环境，已成为仿生型再生医疗产品开发和成果转化热点。目前的ECM原材料主要为猪、牛等哺乳动物，但由于存在疯牛病、蓝耳病、口蹄疫等疾病的传播风险等问题，鱼类来源的脱细胞基质材料越来越受到关注。
目前常用脱细胞方法有化学、物理和酶处理法等。US8613957B2公开了一种来自鱼皮的天然生物细胞外基质的脱细胞支架制备。该鱼皮脱细胞方法包括一种或多种物理处理，一种或多种化学处理，一种或多种酶处理，或其任何组合。处理方式较为复杂。
CN104353111B公开了一种用于腹壁缺损的生物修复材料及其制备方法，其中利用烷基糖苷和核酸酶溶液处理以及冻融方法对腹壁骨骼肌组织进行脱细胞得到骨骼肌脱细胞基质生物薄片，该脱细胞过程耗时较长，操作步骤较为繁琐。
现有的脱细胞方法一般耗时较长、需要多种物理设备、使用多种有毒或腐蚀性化学试剂或使用昂贵的生物酶，限制了脱细胞技术的应用。因此，本领域亟需一种工艺简单、耗时更短的脱细胞方法。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种耗时短、使用无机盐溶液、例如氯化钠溶液作为电脱溶液的电场脱细胞方法，在保持鱼皮表面形态的同时能够去除鱼皮中的大部分免疫原性成分，所制得的脱细胞鱼皮基质中残余DNA量远小于 50ng/mg，符合行业标准，可作为低免疫原性的生物材料用于构建组织工程支架。本发明的方法简单，舍去了传统方法中冗长的化学试剂、生物酶脱细胞的步骤，快速且效果好，细胞外基质的形貌保留完整且残留DNA符合行业标准；利用动态电场，鱼皮组织可以固定在任何一个电极，增加脱细胞效率；使用无机盐电脱溶液，组分简单且无毒。
具体而言，本发明的一个方面提供一种脱细胞鱼皮基质的制备方法，所述制备方法包括脱细胞处理步骤：将鱼皮组织固定在电极极片上，置于电脱溶液中，利用峰值Vpp＝5～10V的正弦波或矩形波对鱼皮组织脱细胞。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞处理步骤中，所述电极极片选自铂金电极、银电极、石墨电极、铜电极和不锈钢电极，优选为石墨电极。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞处理步骤中，所述电脱溶液为无机盐溶液，所述无机盐优选为钠盐，例如选自氯化钠、硫酸钠和磷酸钠中的一种或多种，更优选为氯化钠。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞处理步骤中，所述电脱溶液的浓度为0.1～3mol/L，优选为1～2mol/L。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞处理步骤中，所述电脱溶液的pH 为7.0～7.5。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞处理步骤中，所述电脱溶液的温度为20～30℃。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞处理步骤中，所述电脱溶液与鱼皮组织的体积比为100:1～400:1，优选为200:1～300:1。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞处理步骤中，所述脱细胞过程中的电流为0.5～8A，和/或电压为5～10V。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞处理步骤中，所述脱细胞过程的加电时间≥3分钟、例如3～10分钟。
在一个或多个实施方案中，所述制备方法在脱细胞处理步骤前还包括预浸泡处理步骤：将鱼皮组织放入电脱溶液中进行浸泡处理；和/或在脱细胞处理步骤后还包括清洗步骤：将脱细胞处理后的鱼皮组织用水清洗，得到脱细胞鱼皮基质。
在一个或多个实施方案中，所述预浸泡处理步骤中，所述电脱溶液与鱼皮组织的体积比为100:1～400:1，优选为200:1～300:1。
在一个或多个实施方案中，所述预浸泡处理步骤中，所述电脱溶液为无机盐溶液，所述无机盐优选为钠盐，例如选自氯化钠、硫酸钠和磷酸钠中的一种或多种，更优选为氯化钠。
在一个或多个实施方案中，所述预浸泡处理步骤中，所述电脱溶液的浓度为0.1～3mol/L，优选为1～2mol/L。
在一个或多个实施方案中，所述预浸泡处理步骤中，所述预浸泡处理使得电脱溶液充满鱼皮组织间隙。
在一个或多个实施方案中，在预浸泡处理步骤前还包括：取鱼皮，去鳞，去肉，滤干后用水进行清洗；和/或将无鳞鱼皮切割成与电极极片尺寸匹配的大小。
在一个或多个实施方案中，在清洗步骤后还包括以下步骤：
固定成型：对脱细胞鱼皮基质进行冷冻处理；优选地，将脱细胞鱼皮基质平铺在带孔的网状板上，用上下两个底板固定后进行冷冻处理；优选地，冷冻处理温度为-90℃～-70℃，冷冻时间为1～3小时；和
干燥处理：将固定成型后的脱细胞鱼皮基质放入冷冻干燥机中低温脱水；优选地，冷冻干燥机的温度为-70℃～-60℃，干燥时间为40～60小时。
在一个或多个实施方案中，在干燥处理步骤后还包括灭菌步骤；所述灭菌步骤优选包括采用环氧乙烷进行灭菌。
本发明的另一个方面提供一种脱细胞鱼皮基质，所述脱细胞鱼皮基质采用本文中任一实施方案所述的制备方法制备得到。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞鱼皮基质具有表皮侧有短棘、真皮侧平滑的鱼皮形态。
在一个或多个实施方案中，所述脱细胞鱼皮基质的DNA含量＜50ng/mg。
本发明的另一个方面提供本文中任一实施方案所述的脱细胞鱼皮基质在制备创伤修复材料和/或缝合修复材料中的用途；优选地，所述创伤包括组织损伤、组织穿透、撕裂或病损的创伤，例如切割伤、伸裂伤、组织破裂、褥疮、皮炎、病损、慢性创伤、坏死性创伤、剂型、慢性、外伤性、撕裂、磨损、挫伤、压伤、烧伤。
本发明的另一个方面提供一种脱细胞支架，所述脱细胞支架包含本文中任一实施方案所述的脱细胞鱼皮基质；优选地，所述脱细胞支架包括生物降解医用敷料、生物可降解骨生长导向膜和尿路修复膜。
附图说明
图1为本发明一些实施方案中脱细胞电路示意图。图1中，a为信号发生器，b为电流放大器，c为电脱池。
图2为本发明一些实施方案中脱细胞鱼皮基质制备方法的流程示意图。
图3为对比例1的未脱细胞鱼皮组织、实施例1的电场脱细胞鱼皮基质、对比例2的化学脱细胞鱼皮基质的扫描电镜图。
图4为对比例1的未脱细胞鱼皮组织、实施例1的电场脱细胞鱼皮基质、对比例2的化学脱细胞鱼皮基质的H&E染色图。
图5为对比例1的未脱细胞鱼皮组织、实施例1的电场脱细胞鱼皮基质、对比例2的化学脱细胞鱼皮基质内DNA含量图。
图6为鱼皮细胞毒性图。
图7为对比例1的未脱细胞鱼皮组织、实施例1的电场脱细胞鱼皮基质、对比例2的化学脱细胞鱼皮基质的力学性能图。
图8为鱼皮对动物伤口愈合的影响图。图8中，A为电场脱细胞鱼皮基质处理后的皮肤伤口愈合结果，B为未做处理的皮肤伤口愈合结果，C为利用市售敷料处理皮肤伤口愈合结果，D为利用未脱细胞的鱼皮组织处理皮肤伤口愈合结果。
图9为不同电场和电脱溶液对鱼皮基质内DNA含量的影响图。
具体实施方式
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下仅就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文中，脱细胞鱼皮基质是指鱼皮组织经过脱细胞工艺处理后得到的细胞外基质。细胞外基质是指多细胞有机体中存在于细胞周围的由多种大分子组成的复杂网络。脱细胞支架是指由经化学和物理的方法去除异体或异种组织中的细胞，形成无免疫原性或低免疫原性的材料构建的组织工程支架。
本发明利用电场对鱼皮组织进行脱细胞进而获得脱细胞鱼皮基质。图1展示了可用于本发明的脱细胞电路。其中，装置a为信号发生器，能够提供各种频率、波形和输出电平电信号。各种波形曲线以三角函数方程式来表示，能够产生多种波形，如三角波、锯齿、矩形(含方波)、脉冲和正弦波。装置b为电流放大器，根据电流指令向电流负载提供电流，本质上是受控电流源。装置 c为电脱池，利用其向鱼皮施加电流从而去除鱼皮组织中的免疫原性成分，形成无免疫原性或低免疫原性的材料构建的组织工程支架。
本申请发明人发现在电脱溶液、特别是无机盐溶液中利用信号发生器输出峰峰值Vpp＝5～10V的正弦波或矩形波对鱼皮组织脱细胞，能够得到无免疫原性或低免疫原性的鱼皮脱细胞基质。本发明的制备方法简单，舍去了传统方法中的多种具有细胞毒性的化学试剂、生物酶脱细胞的步骤，只需一步便完成脱细胞的过程，过程简单，快速且效果好，细胞外基质的形貌保留完整且残留DNA 符合行业标准；利用动态电场，鱼皮组织可以固定在任何一个电极，增加脱细胞效率；选择无机盐电脱溶液，组分简单且无毒。
脱细胞鱼皮基质的制备方法
本发明的脱细胞鱼皮基质的制备方法包含利用峰值Vpp＝5～10V、例如6V、7V、8V、9V的正弦波或矩形波对电脱溶液中的鱼皮组织脱细胞的步骤，即脱细胞处理步骤。
本发明中，电脱溶液是指利用电场进行脱细胞时所用的介质溶液。电脱溶液可以为无机盐溶液。本发明中，若无特别说明，溶液是指水溶液。更优选地，电脱溶液为钠盐溶液，包括但不限于NaCl溶液、硫酸钠溶液和磷酸钠溶液。在一些实施方案中，电脱溶液为NaCl溶液。使用NaCl溶液作为电脱溶液时，电脱过程阴极得电子发生还原反应，反应式为2H++2e-＝H2↑；阳极失电子发生氧化反应，反应式为2Cl--2e-＝Cl2↑。脱细胞处理过程中，电脱溶液的浓度可以为0.1～3mol/L，例如0.5mol/L，优选为1～2mol/L。电脱溶液的pH优选为7.0- 7.5，例如7.1、7.2、7.3、7.4。一些无机盐溶液、例如NaCl溶液的理论pH为 7，但考虑到配制溶液所用的水可能不是纯水，无机盐溶液的实际pH可能不为 7，但只要无机盐溶液的实际pH在7.0-7.5的范围内即可用作本发明中的电脱溶液。当无机盐溶液的pH不在7.0-7.5的范围内时，可以根据需要向无机盐溶液中添加适量的酸或碱(例如0.01～0.1mol/L的氢氧化钠溶液)将无机盐溶液的pH值调节至7.0-7.5。电脱溶液的温度优选为20-30℃。在一些实施方案中，脱细胞处理过程中，电脱溶液为1mol/L的NaCl溶液，pH为7.4，温度为25℃。脱细胞处理过程中，电脱溶液与鱼皮组织的体积比可以为100:1～400:1，例如 200:1、300:1。
可以利用电流调控系统在电脱溶液中对鱼皮组织加电。可以利用信号发生器产生输出峰峰值Vpp＝5～10V的正弦波或矩形波。
脱细胞处理过程中，鱼皮组织固定在电极极片上。电极极片可以为铂金电极、银电极、石墨电极、铜电极或者不锈钢电极等，优选为石墨电极。电流范围可以为0.5～8A，例如1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A。电压范围可以为5～10V，例如6V、7V、8V、9V。本发明中，控制电流或者电压在前述范围内有利于提升脱细胞效果。加电时间≥3分钟，例如4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8 分钟、9分钟、10分钟。
在一些实施方案中，脱细胞处理过程中，电脱溶液为pH＝7.4、温度为25℃、浓度为1mol/L的NaCl溶液，NaCl溶液与鱼皮组织的体积比为200:1，施加电流6A或者施加电压10V，加电时间为5分钟。
本发明中，在脱细胞处理前，可以进行预浸泡处理。预浸泡处理包括将鱼皮组织放入电脱溶液中进行浸泡，浸泡的目的是使电脱溶液充满鱼皮组织间隙。
本发明中，鱼皮组织可从整块鱼皮中得到。将鱼皮进行原料初处理，去鳞，去肉，滤干后用水进行清洗；根据需要对无鳞鱼皮进行切割处理，得到适当大小的鱼皮组织，鱼皮组织大小可根据电极尺寸调整。在一些实施方案中，鱼皮组织大小为5±1cm×5±1cm。
预浸泡处理中，电脱溶液为无机盐溶液。更优选地，电脱溶液为钠盐溶液，包括但不限于NaCl溶液、硫酸钠溶液和磷酸钠溶液。在一些实施方案中，电脱溶液为NaCl溶液。预浸泡处理过程中，电脱溶液的浓度可以为0.1～3mol/L，例如0.5mol/L，优选为1～2mol/L。在一些实施方案中，预浸泡处理过程中，电脱溶液为1mol/L的NaCl溶液。预浸泡处理过程中，电脱溶液与鱼皮组织的体积比可以为100:1～400:1，例如200:1、300:1。
本发明中，在脱细胞处理后，可以进行清洗。清洗包括将脱细胞处理后的鱼皮组织用水清洗，得到脱细胞鱼皮基质。
脱细胞组织清洗之后，可进行固定成型。固定成型可以包括对脱细胞鱼皮基质进行冷冻处理。冷冻处理温度可以为-90℃～-70℃、例如-80℃，冷冻时间可以为1～3小时、例如2小时。固定的方式可以是将脱细胞鱼皮基质平铺在模具上，用上下两个底板进行固定。模具优选是带孔的网状板。
固定成型后，还可进行干燥处理和灭菌处理。干燥处理可以是冷冻干燥。可将固定成型的鱼皮脱细胞基质放入冷冻干燥机中低温脱水干燥，冷冻干燥机的温度可以为-70℃～-60℃、例如-65℃，干燥时间可以为40～60小时、例如48 小时。灭菌可以是采用环氧乙烷灭菌。最终脱细胞鱼皮基质可以密封储存在 20～30℃、例如25℃环境中。
在一些实施方案中，本发明的脱细胞鱼皮基质的制备方法包括以下步骤：
(1)原料初处理：取鱼皮，去鳞，去肉，滤干后用去离子水进行清洗；
(2)原料切割处理：切割无鳞鱼皮，根据导电电极片尺寸留下适当大小的鱼皮组织；
(3)预浸泡处理：将鱼皮组织放入电脱溶液中进行浸泡使电脱溶液充满鱼皮组织间隙，电脱溶液优选为NaCl溶液，其中电脱溶液与鱼皮组织的体积比为100:1～400:1、例如200：1，NaCl溶液的浓度为0.1～3mol/L、例如1mol/L；
(4)脱细胞处理：将鱼皮组织固定在电极极片、例如石墨电极极片上，置于电脱溶液中，利用信号发生器输出峰峰值Vpp＝5～10V的正弦波或矩形波对鱼皮组织脱细胞，其中，电脱溶液优选为NaCl溶液，NaCl溶液pH＝7.0～7.5，例如7.4，温度为20～30℃、例如25℃，NaCl溶液与鱼皮组织的体积比为 100:1～400:1、例如200:1，NaCl溶液的浓度为0.1～3mol/L、例如1mol/L，电流为0.5～8A、例如6A，或者电压为5～10V，加电时间≥3分钟、例如为5分钟；
(5)清洗：将脱细胞处理后的鱼皮组织用水清洗，得到脱细胞鱼皮基质；
(6)固定成型：将脱细胞鱼皮基质平铺在带孔的网状板上，用上下两个底板进行固定成型并放入冰箱中-90℃～-70℃、例如-80℃冷冻1～3小时、例如 2小时；
(7)干燥处理：将固定于两个底板之间的脱细胞鱼皮基质放入冷冻干燥机中低温脱水，冷冻干燥机的温度为-70℃～-60℃、例如-65℃，干燥时间为40～60 小时、例如48小时；
(8)灭菌、储藏：密封脱细胞鱼皮基质材料，并采用环氧乙烷进行灭菌，并密封储存在20～30℃、例如25℃环境。
脱细胞鱼皮基质
采用本发明的制备方法制得的脱细胞鱼皮基质保持了表皮侧有短棘、真皮侧平滑的鱼皮形态，力学性能优良，残存DNA含量<50ng/mg、例如40ng/mg、 30ng/mg、20ng/mg、10ng/mg、5ng/mg、2ng/mg、1ng/mg，且无细胞毒性。
脱细胞鱼皮基质的用途
本发明的脱细胞鱼皮基质可用于多种医疗应用，可用于创伤和/或缝合修复，例如将脱细胞鱼皮基质应用于创伤或组织区域上或者其中一部分。所述创伤可包括组织损伤、组织穿透、撕裂或病损的任何创伤，例如切割伤、伸裂伤、组织破裂、褥疮、皮炎、病损、慢性创伤、坏死性创伤、剂型、慢性、外伤性、撕裂、磨损、挫伤、压伤、烧伤等。
脱细胞支架
本发明包括含有本发明的脱细胞鱼皮基质的脱细胞支架，所述脱细胞支架包括但不限于生物降解医用敷料、生物降解骨导向生长膜和尿路修复膜。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)制备方法耗时短，舍去了传统方法中在脱细胞步骤中的多种化学试剂和生物酶的引入，只需一步便完成脱细胞过程；
(2)制备过程安全无毒，仅使用单一无毒的无机盐试剂；
(3)电场脱细胞鱼皮基质形貌保留完整；
(4)电场脱细胞鱼皮基质的DNA残留符合脱细胞基质国际标准(残存 DNA含量<50ng/mg(干重))；
(5)电场脱细胞鱼皮基质无细胞毒性；
(6)电场脱细胞鱼皮基质力学性能优良。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法、试剂和材料，除非另有说明，否则为本领域常规的方法、试剂和材料。实施例中的原料化合物均可通过市售途径购得。
本发明的下述实施例中，所用仪器的厂家、型号如下：临界点干燥仪，Leica， CPD300；场发射扫描电镜，HITACHI，SU8010；冷冻切片机，Thermo Fisher， HM525NX；正置显微镜，NIKON，Ni-U；离心机，Eppendorf，5804R；超微量分光光度计，DeNovix，DS-11EX；拉伸试验机，美国Instron 5944。
部分所用试剂的厂家如下：苏木素、伊红染色剂均购自上海碧云天生物技术有限公司；海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP324)购自TIANGEN；GIBCO DMEM培养基购自Thermo Fisher Scientific；CCK-8试剂盒购自Sigma- Aldrich。
实施例1：电场脱细胞鱼皮基质的制备
制备电场脱细胞鱼皮基质，具体步骤如下：
(1)原料的初处理：取鱼皮，去鳞，去肉，滤干后用去离子水进行清洗；
(2)原料的切割处理：将无鳞鱼皮切割使得留下适当大小(5cm×5cm，电极尺寸)的鱼皮组织；
(3)预浸泡处理：将鱼皮组织放入电脱溶液中进行浸泡使电脱溶液充满鱼皮组织间隙，其中电脱溶液为1mol/L的NaCl溶液，电脱溶液与鱼皮组织的体积比为200：1；
(4)脱细胞处理：将鱼皮组织固定在石墨电极极片上，置于电脱溶液中，利用信号发生器输出峰峰值Vpp＝5V的正弦波对鱼皮组织脱细胞，电流为6A，加电时间5分钟，其中电脱溶液为1mol/L的NaCl溶液，pH＝7.4，温度25℃， NaCl溶液与鱼皮组织的体积比为200:1；
(5)清洗：将脱细胞处理后的鱼皮组织用去离子水清洗，得到脱细胞鱼皮基质；
(6)固定成型：将脱细胞鱼皮基质平铺在带孔的网状板上，用上下两个底板进行固定成型并放入冰箱中，-80℃冷冻2小时；
(7)干燥处理：将固定于两个底板之间的脱细胞鱼皮基质放入冷冻干燥机中-65℃低温脱水48小时；
(8)灭菌、储藏：密封脱细胞鱼皮基质，并采用环氧乙烷进行灭菌，并密封储存在25℃环境待用。
实施例2：电场脱细胞鱼皮基质的制备
制备电场脱细胞鱼皮基质，具体步骤如下：
(1)原料的初处理：取鱼皮，去鳞，去肉，滤干后用去离子水进行清洗；
(2)原料的切割处理：将无鳞鱼皮切割使得留下适当大小(5cm×5cm，电极尺寸)的鱼皮组织；
(3)预浸泡处理：将鱼皮组织放入电脱溶液中进行浸泡使电脱溶液充满鱼皮组织间隙，其中电脱溶液为1mol/L的NaCl溶液，电脱溶液与鱼皮组织的体积比为200：1；
(4)脱细胞处理：将鱼皮组织固定在石墨电极极片上，置于电脱溶液中，利用信号发生器输出峰峰值Vpp＝5V的矩形波对鱼皮组织脱细胞，电流为6A，加电时间5分钟，其中电脱溶液为1mol/L的NaCl溶液，pH＝7.4，温度25℃， NaCl溶液与鱼皮组织的体积比为200:1；
(5)清洗：将脱细胞处理后的鱼皮组织用去离子水清洗，得到脱细胞鱼皮基质；
(6)固定成型：将脱细胞鱼皮基质平铺在带孔的网状板上，用上下两个底板进行固定成型并放入冰箱中，-80℃冷冻2小时；
(7)干燥处理：将固定于两个底板之间的脱细胞鱼皮基质放入冷冻干燥机中-65℃低温脱水48小时；
(8)灭菌、储藏：密封脱细胞鱼皮基质，并采用环氧乙烷进行灭菌，并密封储存在25℃环境待用。
对比例1：未进行脱细胞处理的鱼皮组织
取鱼皮，去鳞，去肉，滤干后用去离子水进行清洗得到鱼皮组织。
对比例2：化学脱细胞鱼皮基质的制备
制备化学脱细胞鱼皮基质，具体步骤如下：
(1)原料初处理：取鱼皮，去鳞，去肉，滤干后用去离子水进行清洗；
(2)原料切割处理：切割无鳞鱼皮，根据盛装脱细胞溶液容器尺寸留下适当大小的鱼皮组织；
(3)将鱼皮组织浸泡在含2.5U/mL中性蛋白酶的PBS溶液中在摇床上进行漂洗3小时，其中溶液与鱼皮组织的体积比为40：1；
(4)去离子水清洗5次后，将鱼皮组织浸泡在含1％十二烷基硫酸钠(SDS) 的PBS溶液中，置于摇床漂洗6小时，其中溶液与鱼皮组织的体积比为40：1；
(5)去离子水清洗5次后，将鱼皮组织浸泡在含25U/mL核酸酶的PBS 溶液中在摇床上进行漂洗3小时，其中溶液与鱼皮组织的体积比为40：1；
(6)去离子水清洗5次后，将鱼皮组织浸泡在含1％十二烷基硫酸钠(SDS) 核酸酶的PBS溶液中，置于摇床漂洗1小时，其中溶液与鱼皮组织的体积比为 40：1；
(7)清洗：将脱细胞处理后的鱼皮组织用去离子水清洗，得到脱细胞鱼皮基质；
(6)固定成型：将脱细胞鱼皮基质平铺在带孔的网状板上，用上下两个底板进行固定成型并放入冰箱中，-80℃冷冻2小时；
(7)干燥处理：将固定于两个底板之间的脱细胞鱼皮基质放入冷冻干燥机中低温脱水，冷冻干燥机的温度为-65℃，干燥48小时；
(8)灭菌、储藏：密封脱细胞鱼皮基质，并采用环氧乙烷进行灭菌，并密封储存在25℃环境待用。
测试例1：脱细胞鱼皮基质形态表征
对实施例1和对比例2的脱细胞鱼皮基质以及对比例1的鱼皮组织进行形态表征，具体步骤如下：
(1)清洗：使用PBS清洗脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织5分钟；
(2)固定：将脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织浸泡在含3％戊二醛的PBS溶液1小时；
(3)清洗：使用去离子水清洗脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织5分钟；
(4)脱水：利用乙醇梯度法去除脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织内水份。使用30％、50％、70％、85％、95％、100％乙醇逐级脱水，每个浓度连续脱水2 次，每级浸泡15分钟；
(5)干燥：将脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织放进预冷的临界点干燥仪进行临界点干燥；
(6)观察：脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织表面喷金处理后，放入场发射扫描电镜下，随机取不同位置观察样品。
结果如图3所示，无论是通过化学脱细胞还是电场脱细胞的鱼皮基质均保持了表皮侧有短棘、真皮侧平滑的鱼皮表面形态。
测试例2：脱细胞鱼皮基质染色
对实施例1和对比例2的脱细胞鱼皮基质以及对比例1的鱼皮组织进行染色，具体步骤如下：
(1)包埋：将脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织放入组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻；
(2)切片：将冷冻好的脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织夹紧于冷冻切片机持承器上进行切片，切片厚度5μm；
(3)染色：切片固定30s后水洗，使用苏木素染色3min，然后进行分化，分化后于碱水中返蓝20s，伊红染色10s，脱水至透明，使用中性树胶封固；
(4)观察，拍摄：将染色的脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织放置于正置显微镜下调焦并进行拍照。
结果如图4所示，未经脱细胞处理的鱼皮组织中含有大量DNA，而化学脱细胞和电场脱细胞鱼皮基质截面中没有发现DNA，并且可以看出电场脱细胞比化学脱细胞更能保持鱼皮组织形态。
测试例3：脱细胞鱼皮基质内DNA含量测定
利用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP324)提取实施例1和对比例2的脱细胞鱼皮基质以及对比例1的鱼皮组织内的DNA，具体步骤如下：
(1)切取不多于30mg的脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织，放入装有200μL GA缓冲液的离心管中，旋振15s；
(2)加入20μL Proteinase K(20mg/mL)溶液，旋混，简短离心后，在56℃放置2小时；
(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟；
(4)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中，13,400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，13,400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，13,400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(8)重复操作步骤7；
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，13,400×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，13,400×g离心2分钟，将溶液收集到离心管中；
(11)利用超微量分光光度计测量上述样品管内DNA含量。
结果如图5所示，经比较发现，未经脱细胞处理的鱼皮组织含有114ng/mg 左右的DNA而化学脱细胞和电场脱细胞鱼皮基质仅存少量DNA，分别为2.9 ng/mg左右和9.2ng/mg左右，两者均符合脱细胞残存DNA含量的标准(＜50 ng/mg)。
测试例4：脱细胞鱼皮基质细胞毒性检测
对实施例1和对比例2的脱细胞鱼皮基质以及对比例1的鱼皮组织进行细胞毒性检测，具体步骤如下：
(1)依据ISO10993-12制备脱细胞鱼皮基质材料浸提液(6cm2/mL)。将脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织放入试管，使用含10％FBS及含抗生素的DMEM培养基(Thermo FisherScientific,GIBCO)，于37±2℃下恒温振荡器中浸提24h，用0.22μm过滤器过滤除菌，4℃保存备用；
(2)利用CCK-8试剂盒(Sigma-Aldrich)评估脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织细胞毒性。将L929细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板，用含血清的 DMEM培养液培养，待细胞贴壁后，实验组中加入100μL的脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织浸提液继续培养，对照组中加入100μL含血清DMEM培养液。在 24小时后加入10％CCK-8试剂并培养2小时，用酶标仪测定450nm波长处的光密度值，计算细胞存活率。
结果如图6所示，所有鱼皮样品的均无细胞毒性(细胞存活率≥75％)，从而证明通过对比例2方法的化学脱细胞处理和本发明的电场脱细胞处理均不会引起细胞毒性。但是电场脱细胞处理组细胞存活率高于化学脱细胞处理组。
测试例5：脱细胞鱼皮基质力学性能检测
对实施例1和对比例2的脱细胞鱼皮基质以及对比例1的鱼皮组织进行力学性能检测，具体步骤如下：
(1)用PBS浸泡脱细胞鱼皮基质或鱼皮组织3小时，然后将其切成50mm ×5mm规格的条状，测量并记录每组样品的厚度，后用100N拉伸双向载荷传感器的夹具固定在拉伸试验机上，待固定好样品后，使用游标卡尺测量样品的实际长度，并记录在拉伸测试软件中；
(2)校准测压元件，并以10mm/min的拉伸速率拉伸样品，直至样品断裂，每个实验组至少重复5次。最后由拉伸测试软件得到的拉伸应力和拉伸应变的数值，作出应力—应变曲线并汇编计算得到杨氏模量。
结果如图7所示，未经脱细胞处理的鱼皮样品具有最高的力学强度，其次是电场脱细胞处理的鱼皮样品，而化学脱细胞处理的鱼皮样品力学强度最低。
测试例6：脱细胞鱼皮基质对动物伤口愈合的影响
考察实施例1的脱细胞鱼皮基质以及对比例1的鱼皮组织对动物伤口愈合的影响，动物实验及相关染色实验具体步骤如下：
(1)术前准备：购入6-8周龄C57BL/6雌鼠(20-22g)，试验前将动物适应性饲养3天，将小鼠用动物呼吸麻醉机进行麻醉，待动物完全麻醉后以趴伏状四肢固定于鼠板上。动物背部用脱毛膏脱毛，将小鼠进行保温恢复。脱毛宜在创面制造前1天进行；
(2)手术程序：将小鼠麻醉后，用碘和酒精交替拭子消毒小鼠背部表面。将其仰卧放置于无菌床单中并系住腿部，用弹性绷带固定动物，呈趴伏状，尽量保证动物背部皮肤平展将其背部皮肤从中线拉起，用5毫米皮肤环钻将用于在基线两侧创建两个对称的全层切除创面，然后将老鼠放在一个温暖的垫子上。将内径6mm、外径12.5mm的硅胶夹板用Krazy快速固化胶放置在缺损区域周围，用6条6.0尼龙缝线将夹板固定到位。
对于实验组，将外径5.5mm样品浸润生理盐水(0.7％NaCl，20分钟)，柔软后放置在侧缺陷上。对于空白对照组，缺损处留空。对于市售敷料Duoderm 对照组，缺损处放置Duoderm。最后用3M Tegaderm无菌创贴将创面完全覆盖，伤口将用自粘弹性绷带包扎。在手术期间和随后的3天内给予小鼠镇痛药和抗生素，在第0、7天和14天揭开自粘弹性绷带并拍摄伤口的照片。在研究的第7和14天，麻醉小鼠，仔细移除Tegaderm透明敷料、缝线和夹板，用16 毫米皮肤环钻切除整个伤口和周围皮肤组织，收集伤口组织样本；
(3)H&E染色：利用H&E组织学观察伤口组织横截面结构。将伤口组织样品切成小片，在10％福尔马林中浸泡过夜。去除福尔马林后，通过使用不同百分比的乙醇(50％、70％、90％和100％)对样品进行脱水，每次浸泡样品15 分钟，100％乙醇浸泡操作3次。然后将样品在二甲苯中保存过夜。第二天，将样品在二甲苯中浸泡2小时，然后将其包埋在石蜡中。使用旋转式切片机，样品在5μm处切片，放在载玻片上，然后进行染色。带有切片样品的载玻片首先通过在二甲苯中浸泡进行脱蜡，然后通过在乙醇(95％、75％、50％)和去离子水中浸泡进行水合。将样品用苏木精染色10分钟，并浸泡在分化溶液中以固定污渍，然后在Scotts自来水中染色1分钟，在曙红中染色30s。然后将染色的样品用加拿大香脂和盖玻片固定，以保存样品并在光学显微镜下观察并拍照。
脱细胞鱼皮基质对鼠皮肤伤口愈合的影响结果如图8所示。图A为用电场脱细胞鱼皮基质处理的皮肤伤口愈合结果；图B为未做处理的皮肤伤口愈合结果；图C为利用市售敷料Duoderm处理皮肤伤口愈合结果；图D为利用未脱细胞鱼皮处理皮肤伤口愈合结果。结果显示，电场脱细胞鱼皮基质处理后的伤口愈合状况良好，伤口完全愈合，一些皮肤附属器包括毛、皮脂腺、汗腺在伤口处也再生。
实施例3：电场和电脱溶液对脱细胞的影响
在不同电场和电脱溶液中制备脱细胞鱼皮基质，具体步骤如下：
(1)原料的初处理：取鱼皮，去鳞，去肉，滤干后用去离子水进行清洗；
(2)原料的切割处理：将无鳞鱼皮切割使得留下适当大小(5cm×5cm，电极尺寸)的鱼皮组织；
(3)预浸泡处理：将鱼皮组织放入电脱溶液(PBS或NaCl溶液)中进行浸泡使电脱溶液充满鱼皮组织间隙，其中NaCl溶液的浓度为1mol/L，电脱溶液与鱼皮组织的体积比为200：1；
(4)脱细胞处理：对于经过NaCl溶液浸泡处理的鱼皮组织，将鱼皮组织固定在石墨电极极片上，置于NaCl溶液中，利用信号发生器输出峰峰值 Vpp＝5V的正弦波对NaCl溶液中鱼皮组织脱细胞，电极间电压为10V，加电时间5分钟，NaCl溶液浓度为1mol/L，pH＝7.4，温度25℃，NaCl溶液与鱼皮组织的体积比为200:1；
对于经过PBS浸泡处理的鱼皮组织，利用直流电源对PBS溶液中鱼皮组织脱细胞，电极间电压为10V，加电时间5分钟，PBS溶液pH＝7.4，温度25℃， PBS溶液与鱼皮组织的体积比为200:1；
(5)清洗：将脱细胞处理后的鱼皮组织用去离子水清洗，得到脱细胞鱼皮基质；
(6)固定成型：将脱细胞鱼皮基质平铺在带孔的网状板上，用上下两个底板进行固定成型并放入冰箱中-80℃冷冻2小时；
(7)干燥处理：将固定于两个底板之间的脱细胞鱼皮基质放入冷冻干燥机中-65℃低温脱水48小时；
(8)灭菌、储存：密封脱细胞鱼皮基质，并采用环氧乙烷进行灭菌，并密封储存在25℃环境待用。
测试例7
采用测试例3的方法测定实施例3的脱细胞鱼皮基质内DNA含量。
结果如图9所示，未经过脱细胞处理的样品含有114.2ng/mg左右的DNA，而实施例3中PBS溶液脱细胞和NaCl溶液脱细胞样品残留DNA，分别为 77.1ng/mg左右和24.3ng/mg左右，仅NaCl溶液脱细胞样品符合脱细胞残存 DNA含量的标准(小于50ng/mg)。

Claims (26)

1.一种脱细胞鱼皮基质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括利用峰值Vpp=5~10V的正弦波或矩形波对电脱溶液中的鱼皮组织脱细胞的步骤；
其中，所述脱细胞过程中所述鱼皮组织固定在电极极片上，所述电脱溶液为氯化钠溶液，所述电脱溶液的温度为20~30℃，所述电脱溶液的pH为7.0~7.5，所述脱细胞过程中的电流为0.5~8A，所述脱细胞过程的加电时间≥3分钟。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞步骤具有以下一个或多个特征：
所述电极极片选自铂金电极、银电极、石墨电极、铜电极和不锈钢电极；和/或
所述电脱溶液的浓度为0.1~3mol/L；和/或
所述电脱溶液与鱼皮组织的体积比为100:1~400:1；和/或
所述脱细胞过程中的电压为5~10V；和/或
所述脱细胞过程的加电时间为3~10分钟。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电极极片为石墨极片。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电脱溶液的浓度为1~2mol/L。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电脱溶液与鱼皮组织的体积比为200:1~300:1。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法在脱细胞处理步骤前还包括预浸泡处理步骤：将鱼皮组织放入电脱溶液中进行浸泡处理，所述电脱溶液为氯化钠溶液；和/或
所述制备方法在脱细胞处理步骤后还包括清洗步骤：将脱细胞处理后的鱼皮组织用水清洗，得到脱细胞鱼皮基质。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述预浸泡处理步骤具有以下一个或多个特征：
所述电脱溶液与鱼皮组织的体积比为100:1~400:1；和/或
所述电脱溶液的浓度为0.1~3mol/L；和/或
所述预浸泡处理使得电脱溶液充满鱼皮组织间隙。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述预浸泡处理步骤中，所述电脱溶液与鱼皮组织的体积比为200:1~300:1。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述预浸泡处理步骤中，所述电脱溶液的浓度为1~2mol/L。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在预浸泡处理步骤前还包括：取鱼皮，去鳞，去肉，滤干后用水进行清洗；和/或将无鳞鱼皮切割成与电极极片尺寸匹配的大小。
11.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在清洗步骤后还包括以下步骤：
固定成型：对脱细胞鱼皮基质进行冷冻处理；和
干燥处理：将固定成型后的脱细胞鱼皮基质放入冷冻干燥机中低温脱水。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，固定成型中，将脱细胞鱼皮基质平铺在带孔的网状板上，用上下两个底板固定后进行冷冻处理。
13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，固定成型中，冷冻处理温度为-90℃~-70℃，冷冻时间为1~3小时。
14.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，干燥处理中，冷冻干燥机的温度为-70℃~-60℃，干燥时间为40~60小时。
15.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在干燥处理步骤后还包括灭菌步骤。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌步骤包括采用环氧乙烷进行灭菌。
17.一种脱细胞鱼皮基质，其特征在于，所述脱细胞鱼皮基质采用权利要求1-16任一项所述的制备方法制备得到。
18.如权利要求17所述的脱细胞鱼皮基质，其特征在于，所述脱细胞鱼皮基质具有表皮侧有短棘、真皮侧平滑的鱼皮形态，DNA含量＜50ng/mg。
19.权利要求17或18所述的脱细胞鱼皮基质在制备创伤修复材料和/或缝合修复材料中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述创伤包括组织穿透或撕裂的创伤。
21.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述创伤为切割伤、伸裂伤、褥疮、皮炎、撕裂、挫伤、压伤或烧伤。
22.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述创伤为组织破裂、病损或磨损。
23.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述创伤为慢性创伤。
24.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述创伤为坏死性创伤。
25.一种脱细胞支架，其特征在于，所述脱细胞支架包含权利要求17或18所述的脱细胞鱼皮基质。
26.如权利要求25所述的脱细胞支架，其特征在于，所述脱细胞支架包括生物降解医用敷料、生物可降解骨生长导向膜和尿路修复膜。
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