CN115869459A - 促伤口愈合的多肽水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促伤口愈合的多肽水凝胶及其制备方法与应用，该多肽水凝胶由抗菌肽与含有8‑Br‑cAMP盐的凝胶触发溶液交联聚合而成。本发明的多肽水凝胶具有抗菌活性、止血性能、对pH、温度敏感、可注射、可自愈、可促进细胞迁移、加速皮肤伤口愈合、无毒副作用、可降解、生物相容性好等优点；同时该多肽水凝胶可以用作药物包裹与缓释。此外，本发明的多肽水凝胶的制备方法工艺简单，操作方便，对人员操作要求低，原料种类简单，制作原料及降解产物均环境友好。

Description

促伤口愈合的多肽水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种多肽水凝胶，尤其涉及一种促伤口愈合的多肽水凝胶及其制备方法与应用，及具有该多肽水凝胶的医疗器械。
背景技术
伤口愈合一直是临床护理中的一个重要问题，尤其是一些开放性伤口，如术后创伤、烧伤、糖尿病引起的不愈合溃疡或循环障碍等，容易受到病原微生物的感染。细菌感染会延缓伤口愈合，导致致命的全身性败血症，给患者、家庭和社会带来巨大的痛苦和影响。根据世界卫生组织的一份报告，每年有30多万人死于烧伤(包括火灾、电力、化学、辐射等)。目前伤口的临床治疗方案包括纱布、敷料等。其主要目的是保持创面清洁，控制渗出，并通过抗菌药物的释放来保护创面不受病原菌感染，但不能促进创面愈合。此外，由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐多药铜绿假单胞菌等多重耐药细菌引起的感染性伤口对伤口愈合提出了严峻的挑战。更糟糕的是，随着人口老龄化和糖尿病溃疡、褥疮患者的增加，在不久的将来，慢性难治性伤口将会增多，这将给伤口愈合带来更大的挑战和经济成本。因此，迫切需要开发既能促进创面愈合，又能防治创面感染的新型创面敷料。
在临床上，伤口敷料常被用来覆盖伤口表面以促进伤口愈合。伤口愈合是一个复杂的过程，涉及凝血、炎症、血管重塑、上皮细胞增殖和迁移、组织重塑等诸多因素。理想的伤口敷料能够保持伤口生理湿润，防止伤口干燥，防止伤口继发感染，具有良好的生物相容性。
水凝胶是一种具有物理或化学交联的三维聚合物或肽链网络，含有大量的水(>90％)。水凝胶是一种具有潜在应用价值的伤口敷料，能为伤口愈合提供水化环境，填补伤口愈合的不规则缺损，对温度、pH值、离子强度等环境刺激能以可逆的方式吸收和释放水分而备受研究者的关注。此外，水凝胶在伤口愈合方面还具有其他一些独特的优点，如抗菌剂、生长因子等治疗药物或细胞在凝胶化前易于包封，包封治疗药物的缓释和控释，多孔性和易透气性等。水凝胶通常由高分子有机化合物通过一些有机溶剂进行交联而成，伤口愈合过程中需要清除其降解产物，此外交联剂通常也有毒性。近年来，多肽水凝胶由于其良好的性能，较高的生物相容性而引起了研究者的关注。
综上所述，尽管已经存在许多用作伤口敷料的材料，但是伤口愈合仍然存在挑战，寻找优良的促伤口愈合并预防和治疗伤口感染的生物材料在当前仍是一项长期而艰巨的任务。基于抗菌肽分子研发新型伤口敷料是促伤口愈合、预防伤口感染及其并发症的一个重要方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型多肽水凝胶及其制备方法与应用，及具有该多肽水凝胶的医疗器械，本发明的多肽水凝胶以抗菌肽作为胶基、以8-Br-cAMP作为交联剂通过交联聚合而成，该多肽水凝胶具有良好的抗菌、止血、促伤口愈合等功效。本发明的发明人经过大量的实验研究，证明该抗菌肽制成的多肽水凝胶具有抗菌、止血、pH敏感、温度敏感、可方便涂覆于伤口表面、促进伤口愈合等优点，同时还可以负载各类药物或生长因子，实现伤口敷料的功能化治疗，在伤口愈合过程中抗菌、抗炎，并为伤口愈合提供湿性环境等功能，同时，该水凝胶具有良好的生物相容性，其降解产物为氨基酸，可以减少因更换伤口敷料而对伤口新生肉芽组织的破坏。
为达上述目的，本发明提供一种多肽水凝胶的制备方法，本发明的多肽水凝胶是在8-Br-cAMP钠盐溶液或者8-Br-cAMP钠盐与磷酸盐混合液中自组装而形成，该制备方法包括以下步骤：
步骤S1：将抗菌肽冻干粉溶于二甲基亚砜，得到抗菌肽的溶解液，备用；
步骤S2：将抗菌肽的溶解液加入至含有8Br-cAMP的凝胶触发溶液中，在超声或搅拌条件下进行离子交联聚合反应，得到多肽水凝胶。
本发明的水凝胶中的溶剂主要为水，次要为二甲基亚砜(DMSO)，其中二甲基亚砜的含量小于5％(v/v)。
本发明的制备方法，优选地还包括以下步骤：
步骤S3：在凝胶触发溶液中还可加入药物和/或生长因子，得到负载药物或生长因子的多肽水凝胶。
本发明的药物优选为抗菌药物或消炎药物，生长因子优选为促伤口愈合生长因子。
本发明的离子交联聚合反应的反应温度为0-60℃，反应时间为1-120min。
本发明以8-Br-cAMP作为交联剂，本发明的凝胶触发溶液中还含有碳酸盐、磷酸盐、亚硫酸盐和DMEM细胞培养液中的至少一种。
本发明的凝胶触发溶液为8-Br-cAMP盐溶液、8-Br-cAMP盐与碳酸盐的混合溶液、8-Br-cAMP盐与磷酸盐的混合溶液、8-Br-cAMP盐与亚硫酸盐的混合溶液、8-Br-cAMP盐与DMEM细胞培养液的混合液等，优选8-Br-cAMP盐与磷酸盐溶液的混合溶液；其中8Br-cAMP钠盐与磷酸盐的混合溶液为8Br-cAMP钠盐、Na2HPO4、KH2PO4、KCl以及NaCl按比例溶解于去离子水中制得。
本发明的离子交联聚合反应过程中还添加蛋白激酶A作为激活剂。
本发明的抗菌肽的溶解液与含有8Br-cAMP的凝胶触发溶液的体积比为3：197-27。
本发明还提供一种多肽水凝胶，该多肽水凝胶由抗菌肽与含有8-Br-cAMP盐的凝胶触发溶液交联聚合而成。
本发明以抗菌肽作为胶基，抗菌肽为具有以下氨基酸序列表示的母体肽：
Pro-Xaa2-Xaa3-Leu-Xaa5-Leu-Xaa7-Leu-NH2
其中，Xaa2＝Phe，homo-Phe或Trp；
Xaa3＝Lys，Aib，Orn，Dab，Dap或Arg；
Xaa5＝Ser，Lys，Orn，Dab，Dap或Arg；
Xaa7＝His，Lys，Orn，Dab，Dap或Arg。
上述母体肽的衍生物或修饰均适用于本发明。
本发明的抗菌肽为选自以下化合物中的任一种：
化合物1(涉及SEQ ID NO:1)：
Pro-Trp-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
PWKLSLHL-NH2，
化合物2(涉及SEQ ID NO:2)：
Pro-Phe-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
PFKLSLHL-NH2，
化合物3(涉及SEQ ID NO:3)：
Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
PWRLSLHL-NH2，
化合物4(涉及SEQ ID NO:4)：
Pro-Phe-Lys-Leu-Lys-Leu-His-Leu-NH2
PFKLKLHL-NH2，
化合物5(涉及SEQ ID NO:5)：
Pro-Phe-Orn-Leu-Ser-Leu-Lys-Leu-NH2
PF-Orn-LSLKL-NH2，
化合物6(涉及SEQ ID NO:6)：
Pro-Phe-Dab-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2
PF-Dab-LKLKL-NH2，
化合物7(涉及SEQ ID NO:7)：
Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2
PFRLSLHL-NH2，
化合物8(涉及SEQ ID NO:8)：
Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2
PFRLRLHL-NH2，
化合物9(涉及SEQ ID NO:9)：
Pro-Phe-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2
PFKLKLKL-NH2，
化合物10(涉及SEQ ID NO:10)：
Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2
PFRLRLRL-NH2，
化合物11(涉及SEQ ID NO:11)：
Pro-Trp-Orn-Leu-Orn-Leu-His-Leu-NH2
PW-Orn-L-Orn-LHL-NH2，
化合物12(涉及SEQ ID NO:12)：
Pro-Trp-Dab-Leu-Ser-Leu-Dab-Leu-NH2
PW-Dab-LSL-Dab-L-NH2，
化合物13(涉及SEQ ID NO:13)：
Pro-Trp-Dap-Leu-Dap-Leu-Dap-Leu-NH2
PW-Dap-L-Dap-L-Dap-L-NH2，
化合物14(涉及SEQ ID NO:14)：
Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2
PWRLRLHL-NH2，
化合物15(涉及SEQ ID NO:15)：
Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2
PWRLSLRL-NH2，
化合物16(涉及SEQ ID NO:16)：
Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2
PWRLRLRL-NH2，
化合物17(涉及SEQ ID NO：17)
Pro-Trp-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2
PWKLKLKL-NH2，
化合物18(涉及SEQ ID NO：18)
Pro-Trp-Lys-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2
PWKLSLRL-NH2，
化合物19(涉及SEQ ID NO：19)
Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2
PFRLSLRL-NH2，
化合物20(涉及SEQ ID NO：20)
Pro-Phe-Lys-Leu-Ser-Leu-Lys-Leu-NH2
PFKLSLKL-NH2。
优选地，本发明的抗菌肽为化合物2和化合物9中的任一种。
本发明的多肽水凝胶为纳米纤维交联而成的3D纤维结构。
本发明的纳米纤维的宽度为0.01um-0.1um。
本发明又提供一种多肽水凝胶在促伤口愈合药物中的应用，该促伤口愈合药物包含负载有药物或生长因子和至少一种药学可接受的药用载体和/或敷料。
本发明的促伤口愈合药物为用于皮肤表面的滴剂、喷剂、油膏、药贴、以及用于注射的无菌溶液中的至少一种剂型。
本发明的药物为抗菌药物或消炎药物，生长因子为促伤口愈合生长因子。
本发明的多肽水凝胶可以直接对创面进行冲洗、喷涂、湿敷或覆盖，制作成方便使用的喷雾剂，直接喷敷于创面形成保护膜，能瞬间止血、保持创面湿润，创造利于上皮细胞的生长和愈合的低氧环境，加速伤口愈合；同时多肽水凝胶中的抗菌肽，起到快速广谱持久的杀菌作用，伤口愈合后抗菌肽分解为氨基酸代谢，避免粘连和残留。
此外，本发明的多肽水凝胶还可依据病症或创面的位置，选择合适的使用方法及制作成相应的适用剂型；例如，创伤、挫伤、擦伤、术后伤口、烧烫伤、溃疡清创后，可将本发明的多肽水凝胶喷涂换出、或湿敷并包扎；痔疮、肛脓肿、肛瘘、肛裂、造口、造瘘、会阴侧切、包皮环切术后可将本发明的多肽水凝胶喷涂或湿敷包扎；放疗前后，可将本发明的多肽水凝胶对局部皮肤进行喷涂或湿敷；糖尿病足、脉管炎、老年性褥疮慢性不愈合伤口，清创后可将本发明的多肽水凝胶喷涂患处；口腔异味、口腔术后护理可将本发明的多肽水凝胶制作成漱口剂直接含于口腔漱口后排出；癣、疱疹、粉刺等，可将本发明的多肽水凝胶喷涂或湿敷于创面；因刺激皮肤出现不适、痛痒、干燥、脱皮等现象，可将本发明的多肽水凝胶直接喷涂或湿敷，以此改善皮肤健康。
本发明的多肽水凝胶还可负载各类药物或生长因子，从而实现功能化治疗。
本发明再在于提供一种医疗器械，该医疗器械具有多肽水凝胶。
本发明的多肽水凝胶可涂覆于医疗器械的至少一个表面上形成材料。
本发明的医疗器械的形式为由医用敷料、纤维、网片、粉末、微球、薄片、海绵、泡沫、缝合锚定器械、导管、支架、外科手术平头钉、板和螺丝、药物递送器械、防粘屏障和组织粘合剂组成的群组中的任一者。
本发明的纤维为织物；薄片为膜或夹片；缝合锚定器械为缝合线或U形钉。
本案的发明人首次发现抗菌肽在8-Br-cAMP盐溶液或8-Br-cAMP盐与碳酸盐、磷酸盐、亚硫酸盐或DMEM细胞培养液等形成的混合溶液中经离子交联聚合反应得到的多肽水凝胶，该多肽水凝胶具有抗菌活性、止血性能、对pH、温度敏感、可注射、可自愈、可促进细胞迁移、加速皮肤伤口愈合、无毒副作用、可降解、生物相容性好等优点；同时该多肽水凝胶可以用作药物包裹与缓释。
此外，本发明的多肽水凝胶的制备方法工艺简单，操作方便，对人员操作要求低，原料种类简单，制作原料及降解产物均环境友好。
附图说明
图1为对比例1、2以及实施例1、5、10、13的多肽水凝胶的图片。
图2为对比例3和实施例5的多肽水凝胶的扫描电镜显微结构图。
图3为实施例5的多肽水凝胶和对照组对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌增殖的抑制作用折线图。
图4为实施例5的E.coli、S.aureus及C.albicans在培养板上的生长情况图。
图5为多肽水凝胶对人红细胞的1-24h溶血作用情况图。
图6为实施例5的多肽水凝胶的体外降解性能图。
图7为实施例5的多肽水凝胶在小鼠体内降解情况图。
图8为本发明中多肽水凝胶在小鼠烫伤伤口模型中促伤口愈合作用，其中显示了伤口模型建立第1、3、5、7、14和21天时伤口愈合情况。
图9为小鼠烫伤模型，使用多肽水凝胶后伤口愈合百分率。
图10为本发明多肽水凝胶在给菌14天和21天时动物伤口模型中抗菌作用。
图11为本发明小鼠烫伤MRSA感染模型中小鼠伤口菌落情况图。
图12为本发明的多肽水凝胶对小鼠肝脏出血模型中的止血作用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。本发明中实施例所用的抗菌肽为化合物2：Pro-Phe-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2、化合物3：Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2、化合物7：Pro-Phe-A rg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2，其是通过Fmoc固相多肽合成法合成，并将其分别命名为“抗菌肽J-1”、“抗菌肽J-2”、“抗菌肽J-3”经HPLC分析，其纯度在95％以上。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一、多肽水凝胶的制备
本发明的多肽水凝胶具有抗菌、促伤口愈合及止血的作用，能作为促伤口愈合的已用敷料使用。该多肽水凝胶由抗菌肽与含有8-Br-cAMP盐的凝胶触发溶液交联聚合而成，抗菌肽自组装成纳米纤维聚合而成3D结构，该抗菌肽纳米纤维的直径为0.01μm-0.1μm。
优选地，本发明的抗菌肽为选自表1中的任一种：
表1化合物1-20的氨基酸序列
Figure BDA0003282590040000081
Figure BDA0003282590040000091
本发明的凝胶触发溶液中还含有碳酸盐、磷酸盐、亚硫酸盐和DMEM细胞培养液中的至少一种。
优选地，本发明的多肽水凝胶是由抗菌肽在8-Br-cAMP钠盐溶液或8-Br-cAMP钠盐与磷酸缓冲液自组装成纳米纤维，然后经离子交联而成。本发明抗菌肽的修饰物或衍生物同样也是用于本发明；再次，本发明也不特别限定8-Br-cAMP钠盐，8-Br-cAMP的修饰物或衍生物，及它们的其它金属盐如钾盐等同样也适用于本发明。
本发明的多肽水凝胶的制备方法具体包括以下步骤：
步骤S1：将抗菌肽溶于二甲基亚砜中，得到浓度为200mg/mL的抗菌肽溶解液，备用；将8-Br-cAMP钠盐溶解于去离子水中，得到8-Br-cAMP钠盐溶液，备用；将Na2HPO4、KH2PO4、KCl以及NaCl按比例溶解于去离子水中，得到磷酸盐缓冲液，备用；
步骤S2：将抗菌肽的溶解液加入至8-Br-cAMP钠盐溶液中，或者8-Br-cAMP钠盐溶液与磷酸盐缓冲溶液的混合液，抗菌肽的终浓度为2-20mg/mL，搅拌或超声条件下多肽分子自组装并离子交联反应，得到多肽水凝胶；
优选地，还可包括步骤S3：在步骤S2制备多肽水凝胶的过程中，提前在磷酸盐缓冲液中加入药物或生长因子，得到负载药物或生长因子的水凝胶。
本发明于步骤S2中，离子交联聚合反应的反应温度为0-60℃，反应时间为1-60min。
本发明于步骤S3中，药物为抗菌药物或消炎药物，生长因子为促伤口愈合的生长因子。
本发明的多肽水凝胶可直接喷涂于伤口表面，用作防感染、促愈合伤口敷料。本发明的多肽水凝胶亦可负载药物，用作功能性防感染、促愈合伤口敷料。
实施例1：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-1母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液中(pH6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比3:197混合，在室温聚合60分钟，即可得到多肽水凝胶，如图1中B所示，经检测其中抗菌肽浓度为3mg/mL。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后成纤维状，冻干后有微米多孔结构。
实施例2：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-1母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液中(pH6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比3:97混合，在室温聚合30分钟，即可得到多肽水凝胶。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后成纤维状，冻干后有微米多孔结构。
实施例3：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-1母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液中(pH6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比1:19混合，在室温聚合20分钟，即可得到多肽水凝胶。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后成纤维状，冻干后有微米多孔结构。
实施例4：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-1母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液与磷酸缓冲液(Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；KCl：2.7mM；NaCl：137mM，pH值为6.0-8.0)的混合液中(两种溶解液体积比为1:9，pH 6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比3:197混合，室温聚合30分钟即可得多肽水凝胶。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后显纤维状，该水凝胶冻干后有微米多孔结构。
实施例5：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-1母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液与磷酸缓冲液(Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；KCl：2.7mM；NaCl：137mM，pH值为6.0-8.0)的混合液中(两种溶解液体积比为1:9，pH 6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比3:97混合，室温聚合20分钟即可得多肽水凝胶，如图1中C所示，经检测其中抗菌肽浓度为6mg/mL；该多肽水凝胶的扫描电镜显微结构图如图2中B所示。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后显纤维状，该水凝胶冻干后有微米多孔结构。
实施例6：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-1母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液与磷酸缓冲液(Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；KCl：2.7mM；NaCl：137mM，pH值为6.0-8.0)的混合液中(两种溶解液体积比为1:9，pH 6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比1:19混合，室温聚合10分钟即可得多肽水凝胶。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后显纤维状，该水凝胶冻干后有微米多孔结构。
实施例7：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-1母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液中(pH6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比1:9混合，在室温聚合2分钟，即可得到多肽水凝胶。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后成纤维状，冻干后有微米多孔结构。
实施例8：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-1母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液与磷酸缓冲液(Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；KCl：2.7mM；NaCl：137mM，pH值为6.0-8.0)的混合液中(两种溶解液体积比为1:9，pH 6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比1:9混合，室温聚合2分钟即可得多肽水凝胶。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后显纤维状，该水凝胶冻干后有微米多孔结构。
实施例9：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-2母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液中(pH6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比3:97混合，在室温聚合30分钟，即可得到多肽水凝胶。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后成纤维状，冻干后有微米多孔结构。
实施例10：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-2母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液与磷酸缓冲液(Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；KCl：2.7mM；NaCl：137mM，pH值为6.0-8.0)的混合液中(两种溶解液体积比为1:9，pH 6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比3:197混合，室温聚合20分钟即可得多肽水凝胶，如图1中E所示，经检测其中抗菌肽浓度为3mg/mL。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后显纤维状，冻干后有微米多孔结构。
实施例11：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-2母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液与磷酸缓冲液(Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；KCl：2.7mM；NaCl：137mM，pH值为6.0-8.0)的混合液中(两种溶解液体积比为1:9，pH 6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比3:97混合，室温聚合20分钟即可得多肽水凝胶。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后显纤维状，冻干后有微米多孔结构。
实施例12：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-3母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液中(pH6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比3:97混合，在室温聚合30分钟，即可得到多肽水凝胶。
本实施例制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后成纤维状，冻干后有微米多孔结构。
实施例13：
本实施例中多肽水凝胶的制备方法如下：将二甲基亚砜溶解的抗菌肽J-3母液(200mg/mL)，加入到8-Br-cAMP钠盐(10mM)去离子水溶解液与磷酸缓冲液(Na2HPO4：10mM；KH2PO4：2mM；KCl：2.7mM；NaCl：137mM，pH值为6.0-8.0)的混合液中(两种溶解液体积比为1:9，pH 6.0-8.0，由HCl和NaOH调节)，按体积比3:97混合，室温聚合20分钟即可得多肽水凝胶，如图1中F所示，经检测其中抗菌肽浓度为6mg/mL。
对比例1：
将抗菌肽J-1溶解在10mM的8-Br-cAMP盐溶液，其结果如图1的A所示，经检测其中抗菌肽浓度为1mg/mL。
对比例2：
将抗菌肽J-2溶解在10mM的8-Br-cAMP盐溶液中的照片，其结果如图1的D所示，经检测其中抗菌肽浓度为1mg/mL。
对比例3：
将抗菌肽J-1溶解于去离子水，并在室温干燥，其结果如图2的A所示。
图1为对比例1、2以及本发明实施例1、5、10、13的多肽水凝胶的图片；其中，A为抗菌肽J-1溶解在10mM的8-Br-cAMP盐溶液的照片，其中抗菌肽浓度为1mg/mL；B为实施例1的多肽水凝胶图片，其中抗菌肽浓度为3mg/mL；C为实施例5的多肽水凝胶图片，其中抗菌肽浓度为6mg/mL；D为抗菌肽J-2溶解在10mM的8-Br-cAMP盐溶液中的照片，其中抗菌肽浓度为1mg/mL；E为实施例10的多肽水凝胶图片，其中抗菌肽浓度为3mg/mL；F为实施例13的多肽水凝胶图片，其中抗菌肽浓度为6mg/mL。图2为对比例3和实施例5的多肽水凝胶的扫描电镜显微结构图；其中，A为抗菌肽J-1溶解于去离子水，并在室温干燥后的电镜图片；B为多肽水凝胶在室温干燥后的电镜照片。由上述实施例、对比例、图1和图2的结果可知，本发明制备的多肽水凝胶经测试可自愈、可注射，室温干燥后显纤维状，冻干后有微米多孔结构。
二、多肽水凝胶抗菌活性测定
以实施例5制备方法得到的多肽水凝胶(记为水凝胶1)为测试样品，抗菌实验所用菌株为革兰氏阴性菌E.coli(ATCC 25922)，革兰氏阳性菌S.aureus(ATCC 29213)，真菌C.albicans(ATCC 14053)。细菌所用培养基为Mueller-Hinton(MH)培养基，真菌所用培养基为Sabouraud dextrose(SD)培养基。测试时先取200μL抗菌肽水凝胶加入到1.5mLEppendorf管中，然后向管中多肽水凝胶上方小心加入400μL菌液(1*106cfu/mL)，然后置摇床中(转速为120rpm)在37℃培养。培养2h、4h、6h、8h、10h和24h后测OD600，以各管中所取菌液的OD600为纵坐标作柱状图，以PBS溶液作为对照组。
如图3所示，为本发明的多肽水凝胶和对照组对E.coli、S.aureus及C.albicans增殖的抑制作用折线图。从图3中可以看出，与对照组相比，水凝胶1能显著抑制所测试细菌和真菌的增殖；在测试OD值前，各管中分别取100μL菌悬液，适当稀释后均匀涂布在准备好的培养板上，然后37℃培养过夜。如图4所示，为本发明的C.albicans、S.aureus及E.coli在培养板上的生长情况图。从图4中可以看出，对照组所取菌液在培养板上长满了菌落，而水凝胶处理的白色念珠菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均无菌落生长。由此可以看出，本发明的水凝胶对细菌和真菌的生长和增殖具有显著的抑制作用。
三、多肽水凝胶溶血活性测定
以实施例5制备方法得到的多肽水凝胶为测试样品。本发明是通过测定其对人红细胞的溶血活性对其生物相容性进行评价。
具体地，测定多肽水凝胶对人红细胞的溶血活性时，以2％(v/v)的Triton x-100为阳性对照。将多肽水凝胶和2％的Triton x-100各取200μL分别加入到1.5mL EP管中，然后每管中加入800μL 8％的人红细胞，在37℃培养箱中孵育1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、12h、24h后离心(1200g)，从每个管中取上清，测定OD490，定量计算溶血率。如图5所示，为各实验组对人红细胞的溶血作用情况图。从图8的结果可以看出，本发明的多肽水凝胶基本不表现溶血活性。由此可以看出，本发明的多肽水凝胶具有良好的生物相容性。
四、多肽水凝胶体外、体内降解性测定
体外降解性测定：
以实施例5制备方法得到的多肽水凝胶为测试样品，多肽水凝胶的体外降解按以下操作方法进行：取200μL的多肽水凝胶置于提前称好重量的1.5mL的EP管里，然后在多肽水凝胶上面加入200μL PBS溶液(pH 7.4)，在37℃培养箱孵育24h后，吸去多肽水凝胶上面的溶液，记录剩余多肽水凝胶的质量；然后在EP管中再加入200μL PBS溶液，再次孵育，直至所有多肽水凝胶全部降解。然后以每周称重的多肽水凝胶质量为纵坐标，以称重的时间(周)为横坐标做柱状图。如图6所示，本发明制备的多肽水凝胶在7周后会逐渐崩解完全，其降解基本与时间呈线性关系降解。
体内降解性测定：
以实施例5方法制备得到的多肽水凝胶为测试样品，对多肽水凝胶的体内降解进行测定。相比于体外环境，体内环境更加复杂，涉及到多种组织液，酶及动物运动的影响。多肽水凝胶在动物体内的降解测定是通过将多肽水凝胶注射到小鼠皮下，其快速在注射部位恢复成胶，并通过B超超声检测多肽水凝胶在小鼠皮下组织的残留情况。
如图7所示，为本发明的多肽水凝胶小鼠体内降解情况图；其中，A为皮下注射多肽水凝胶后的照片，B为注射当天小鼠的B超超声图；C为注射多肽水凝胶第10天的小鼠的照片；D为注射多肽水凝胶第10天的小鼠的B超超声图，从图中可以看出，多肽水凝胶在注射第十天可基本完全降解。
由此可以看出，本发明的多肽水凝胶较稳定，多肽水凝胶在外界PBS溶液环境8周可以逐步分解完全。其可注射、可自愈、在体内可被降解，完全降解所需时间适中，能在逐步分解发挥药效直至完全降解。
五、多肽水凝胶在小鼠烫伤模型中促伤口愈合活性测定
选用野生昆明系小鼠建立烫伤模型，进行伤口创面愈合实验。将昆明系小鼠随机分为两组，每组十只；将小鼠背部剃毛后，腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉，酒精消毒，然后在背部脱毛区用烫伤仪(Jinan Yiyan Science and Technology Development Co.，Ltd，YLS-5Q，China)烫伤3秒钟，产生一个深二度烫伤伤口，将实施例5、实施例13制备的多肽水凝胶涂于创面，生理盐水作为对照组，然后用3M透明敷料作为二级敷料，防止多肽水凝胶掉落；在伤口模型建立后第1、3、5、7、14、21天，对伤口部位进行拍照，使用ImageJ软件测量创面面积。与原始伤口面积相比，所示天数的剩余伤口面积比率按下式计算：伤口愈合率(％)＝[(伤口面积0-伤口面积n)/伤口面积0]*100，(其中伤口面积0为伤口模型建立后最初的伤口面积，伤口面积n为给多肽水凝胶治疗后第n天的伤口面积)。如图8所示，本发明实施例5制备的多肽水凝胶处理组在5天后的伤口明显比盐水对照组缩小；14天后本发明实施例5制备多肽水凝胶处理组伤口基本愈合，而盐水组明显还有完全愈合；第21天本发明多肽水凝胶处理组伤口上的毛基本长出，盐水组的伤口表皮基本愈合。说明本发明实施例5制备的多肽水凝胶能明显促进伤口愈合，比盐水组伤口愈合缩短7天左右。图9显示从第三天开始本发明实施例5多肽水凝胶处理组的伤口愈合率就显著高于盐水处理组，一直到第14天本发明多肽水凝胶处理组的伤口基本愈合，与盐水组的伤口愈合率仍具有显著性差异。此外，令我们惊奇的是，与盐水处理组相比，本发明实施例13制备的多肽水凝胶处理的伤口在第四天时表现出明显的促伤口愈合作用(如图10所示，其中A为盐水处理组，B为本发明实施例13所制备的水凝胶处理组)。
六、多肽水凝胶在小鼠烫伤MRSA感染模型中的抗菌作用
选用雄性Balb/c小鼠建立烫伤感染模型。实验前一天，剃掉小鼠背中部的毛；实验前，用50mg/kg体重的浓度腹腔注射的戊巴比妥麻醉小鼠，烫伤仪(Jinan Yiyan Scienceand Technology Development Co.,Ltd,YLS-5Q,China)以80摄氏度，500g的压力，在小鼠去毛部位作用3秒，产生深二度烫伤伤口，随后在伤口部位涂抹50ul，1*108cfu/mL的MRSA悬浊液，造成烫伤伤口感染。随后将小鼠随机分为两组，对照组每天用saline处理；治疗组，每天用实施例5制备的多肽水凝胶处理。分别在第14天和21天处死部分小鼠，收集伤口周围组织，进行菌落分析，菌落负载量使用平板涂布法计数。如图11所示，多肽水凝胶处理组的伤口菌落数都明显低于盐水处理组。
七、多肽水凝胶在小鼠肝脏出血模型中止血性能测定
选用实施例5制备的多肽水凝胶对止血性能进行测定。测定多肽水凝胶止血性能所用小鼠为雄性昆明系小鼠，体重18-22g，这些小鼠在温度22～24℃，相对温度45％～55％环境下饲养，术前12h对实验小鼠禁食。
肝脏出血模型的建立：实验共分两组，分别为对照组、化合物8水凝胶组，每组8只小鼠。术前用40mg/kg体重的戊巴比妥钠麻醉小鼠，然后将小鼠固定在手术台上，腹部备皮，使用碘伏对手术区域进行消毒；然后在腹部取一个直径为1.5cm左右的纵向切口，逐层分离，充分暴露肝脏右页，随后将事先称好重量的滤纸片垫在肝脏右页下方，用21G的针头将肝脏右页正中间刺穿，随后立即将200μL水凝胶敷在伤口处(对照组不做任何处理)，拍照记录肝脏出血过程。
图12为本发明的多肽水凝胶对小鼠肝脏出血模型中的止血性能图；图12中A为本发明的水凝胶处理组；图12中B图为生理盐水对照组；从图12的结果可以看出，与生理盐水对照组相比，本发明的多肽水凝胶能明显抑制肝脏出血。由此可以证明，本发明的多肽水凝胶具有良好的止血性能。
虽然本发明已以实施例揭露如上然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中具有公知常识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，故本发明的保护范围当视所附的权利要求书所界定的范围为准。
序列表
<110> 广州图微科创生物科技有限公司
<120> 促伤口愈合的多肽水凝胶及其制备方法与应用
<130> GD2387-21P125523
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Trp Lys Leu Ser Leu His Leu
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Pro Phe Lys Leu Ser Leu His Leu
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Pro Trp Arg Leu Ser Leu His Leu
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Pro Phe Lys Leu Lys Leu His Leu
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Orn
<400> 5
Pro Phe Xaa Leu Ser Leu Lys Leu
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Dab
<400> 6
Pro Phe Xaa Leu Lys Leu Lys Leu
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Pro Phe Arg Leu Ser Leu His Leu
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Pro Phe Arg Leu Arg Leu His Leu
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Pro Phe Lys Leu Lys Leu Lys Leu
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Pro Phe Arg Leu Arg Leu Arg Leu
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Orn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Orn
<400> 11
Pro Trp Xaa Leu Xaa Leu His Leu
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Dab
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Dab
<400> 12
Pro Trp Xaa Leu Ser Leu Xaa Leu
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Dap
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Dap
<400> 13
Pro Trp Xaa Leu Xaa Leu Xaa Leu
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
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1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Pro Trp Arg Leu Ser Leu Arg Leu
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Pro Trp Arg Leu Arg Leu Arg Leu
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
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1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Pro Trp Lys Leu Ser Leu Arg Leu
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Pro Phe Arg Leu Ser Leu Arg Leu
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Pro Phe Lys Leu Ser Leu Lys Leu
1 5

Claims (20)

1.一种多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：将抗菌肽溶于二甲基亚砜，得到抗菌肽的溶解液，备用；
步骤S2：将抗菌肽的溶解液加入至含有8Br-cAMP的凝胶触发溶液中，进行离子交联聚合反应，得到多肽水凝胶。
2.根据权利要求1所述的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
步骤S3：在凝胶触发溶液中还加入药物和/或生长因子，得到负载药物或生长因子的多肽水凝胶。
3.根据权利要求2所述的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述药物为抗菌药物或消炎药物，所述生长因子为促伤口愈合生长因子。
4.根据权利要求1所述的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述多肽水凝胶中二甲基亚砜的体积含量小于5％，所述离子交联聚合反应的反应温度为0-60℃，反应时间为1-120min。
5.根据权利要求1所述的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述凝胶触发溶液中还含有碳酸盐、磷酸盐、亚硫酸盐和DMEM细胞培养液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述凝胶触发溶液为8-Br-cAMP盐与磷酸盐的混合溶液。
7.根据权利要求6所述的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述混合溶液为8-Br-cAMP钠盐、Na2HPO4、KH2PO4、KCl以及NaCl按比例溶解于去离子水中制得。
8.根据权利要求1所述的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述离子交联聚合反应过程中还添加蛋白激酶A作为激活剂。
9.根据权利要求1所述的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述抗菌肽的溶解液与含有8Br-cAMP的凝胶触发溶液的体积比为3：197-27。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的多肽水凝胶，其特征在于，所述多肽水凝胶由抗菌肽与含有8-Br-cAMP盐的凝胶触发溶液交联聚合而成。
11.根据权利要求10所述的多肽水凝胶，其特征在于，所述抗菌肽为具有以下氨基酸序列表示的母体肽：
Pro-Xaa2-Xaa3-Leu-Xaa5-Leu-Xaa7-Leu-NH2
其中，Xaa2＝Phe，homo-Phe或Trp；
Xaa3＝Lys，Aib，Orn，Dab，Dap或Arg；
Xaa5＝Ser，Lys，Orn，Dab，Dap或Arg；
Xaa7＝His，Lys，Orn，Dab，Dap或Arg。
12.根据权利要求11所述的多肽水凝胶，其特征在于，所述抗菌肽为选自以下化合物中的任一种：
化合物1：
Pro-Trp-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2，
化合物2：
Pro-Phe-Lys-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2，
化合物3：
Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2，
化合物4：
Pro-Phe-Lys-Leu-Lys-Leu-His-Leu-NH2，
化合物5：
Pro-Phe-Orn-Leu-Ser-Leu-Lys-Leu-NH2，
化合物6：
Pro-Phe-Dab-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2，
化合物7：
Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-His-Leu-NH2，
化合物8：
Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2，
化合物9：
Pro-Phe-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2，
化合物10：
Pro-Phe-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2，
化合物11：
Pro-Trp-Orn-Leu-Orn-Leu-His-Leu-NH2，
化合物12：
Pro-Trp-Dab-Leu-Ser-Leu-Dab-Leu-NH2，
化合物13：
Pro-Trp-Dap-Leu-Dap-Leu-Dap-Leu-NH2，
化合物14：
Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-His-Leu-NH2，
化合物15：
Pro-Trp-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2，
化合物16：
Pro-Trp-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-NH2。
化合物17：
Pro-Trp-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-NH2。
化合物18：
Pro-Trp-Lys-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2。
化合物19：
Pro-Phe-Arg-Leu-Ser-Leu-Arg-Leu-NH2。
化合物20：
Pro-Phe-Lys-Leu-Ser-Leu-Lys-Leu-NH2。
13.根据权利要求12所述的多肽水凝胶，其特征在于，所述抗菌肽为化合物2和化合物9中的任一种。
14.根据权利要求10所述的多肽水凝胶，其特征在于，所述多肽水凝胶为纳米纤维交联而成的3D纤维结构，所述纳米纤维的宽度为0.01um-0.1um。
15.一种根据权利要求10-14任一项所述的多肽水凝胶在促伤口愈合药物中的应用，其特征在于，所述促伤口愈合药物包含负载有药物和/或生长因子的所述水凝胶和至少一种药学上可接受的药用载体和/或辅料。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述促伤口愈合药物为用于皮肤表面的滴剂、喷剂、油膏、药贴、以及用于注射的无菌溶液中的至少一种剂型。
17.一种医疗器械，其特征在于，具有权利要求10-14任一项所述的多肽水凝胶。
18.根据权利要求17所述的医疗器械，其特征在于，所述多肽水凝胶涂覆于所述医疗器械的至少一个表面上形成材料。
19.根据权利要求17所述的医疗器械，其特征在于，所述医疗器械的形式为由医用敷料、纤维、网片、粉末、微球、薄片、海绵、泡沫、缝合锚定器械、导管、支架、外科手术平头钉、板和螺丝、药物递送器械、防粘屏障和组织粘合剂组成的群组中的任一者。
20.根据权利要求19所述的医疗器械，其特征在于，所述纤维为织物；所述薄片为膜或夹片；所述缝合锚定器械为缝合线或U形钉。
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