CN116763720B - 一种多肽自组装水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多肽自组装水凝胶及其制备方法,本发明多肽自组装水凝胶对革兰氏阴性菌和阳性菌都有抑菌效果,实现双重抑菌,具有良好的生物相容性。本发明采取的制备方法,体系简单、反应迅速、不需要额外添加辅助成胶因子,具备较大的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别涉及一种多肽自组装水凝胶及其制备方法。
背景技术
40多年前,科学界就已经发现抗菌肽可以通过在膜表面形成通道来杀死微生物。随后的研究表明,能杀死微生物的成孔毒素在原核生物和真核生物群落中广泛存在。研究还表明,人类宿主的防御肽,如防御素和蛋白酶,都可以通过在细菌的细胞膜表面形成通道破坏细胞膜来杀死入侵的微生物。
多肽分子可以通过其肽键间氢键作用以及氨基酸残基之间的非共价键作用如氢键、π-π堆积、范德华力以及疏水性作用等,自发或触发地自组装形成分子聚集体或超分子结构。使用自组装的多肽来构建材料,可以确定简单的结构和活性关系,因为在单体水平上肽序列的变化可以直接转位到主体材料的抗菌性能。设计具有抗菌活性的水凝胶,可以直接用于治疗伤口,以防止或杀死已有的细菌感染。
目前,多种自组装抗菌肽被开发并应用于包括在生物支架、载药、止血、和抗菌等多个方面。但现阶段,人们对自组装抗菌肽结构与活性的关系认识还不够深入,如何通过肽分子的改造和设计开发出高效、高选择性的抗菌药物也是一个难题。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题,本发明提供了一种多肽自组装水凝胶及其制备方法。本发明多肽自组装水凝胶对革兰氏阴性菌和阳性菌都有抑菌效果,实现双重抑菌,具有良好的生物相容性。本发明采取的制备方法,体系简单、反应迅速、不需要额外添加辅助成胶因子,具备较大的临床应用前景。
本发明的目的之一在于提供一种多肽自组装水凝胶,其特征在于,所述多肽自组装水凝胶的氨基酸选自LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis、DHis-DHis-DHis-DHis-DHis-DHis-DHis-DHis、LArg-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis、LHis-LHis-LHis-LArg-LHis-LHis-LHis-LHis、LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LArg、LArg-LHis-LHis-LArg-LHis-LHis-LHis-LHis、LArg-LHis-LHis-LArg-LHis-LHis-LHis-LArg一种或多种。
优选地,所述多肽自组装水凝胶的氨基酸是选自LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis或DHis-DHis-DHis-DHis-DHis-DHis-DHis-DHis。
本发明的另一目的在于提供了一种多肽自组装水凝胶的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
1)称取多肽粉末,并将其加入盐溶液中,同时调整体系pH至溶液澄清;
2)将步骤1)的反应体系静置,即可得到多肽自组装水凝胶。
优选地,步骤1)中的盐溶液是选自钙盐;
进一步优选地,所述钙盐选自氯化钙、碳酸钙、磷酸氢二钙、醋酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙的水溶液;
优选地,步骤1)中多肽的使用剂量为1-10mg/mL;
优选地,步骤1)中盐溶液的浓度为2-10mM;
优选地,所述合成方法的温度控制在25-37℃之间;
进一步地,本发明提供的一种多肽自组装水凝胶的制备方法的详细合成步骤如下所示:
1)称量多肽粉末10mg于5mL Ep管中,向Ep管中加入2mL 5mM CaCl2水溶液,并逐级滴加0.1M氢氧化钠至Ep管溶液澄清;
2)滴加过程同时进行涡旋混匀处理,经2min静置即可得到多肽自组装水凝胶。
本发明的另一目的在于提供了一种多肽自组装水凝胶在制备抗菌药物中的用途;
优选地,所述细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌;
进一步优选地,所述抑菌是通过将多肽自组装水凝胶与细菌样本接触处理孵育后即可实现抑菌效果。
本发明的优点如下:本发明多肽自组装水凝胶对革兰氏阴性菌和阳性菌都有抑菌效果,实现双重抑菌,具有良好的生物相容性。且采用D型氨基酸替换后的多肽的抑菌活性会有略微下降,但其抑菌活性仍高于其他精氨酸替换的对照组多肽。本发明采取的制备方法,体系简单、反应迅速、不需要额外添加辅助成胶因子。本发明制备得到的自组装水凝胶具备良好的抑菌活性,具备较大的临床应用前景。
附图说明
图1.多肽自组装水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性分析,其中a为大肠杆菌,b为金黄色葡萄球菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明,以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例,仅用于说明本发明,并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下,所获得的其他所有实施例,都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中,若无特殊说明,所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品;在本发明实施例中,若未具体指明,所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1多肽自组装水凝胶的制备
一种多肽自组装水凝胶的制备方法,其包括如下步骤:称量LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis粉末10mg于5mL Ep管中,向Ep管中加入2mL 5mM CaCl2水溶液,并逐级滴加0.1M氢氧化钠至Ep管溶液澄清,滴加过程同时进行涡旋混匀处理,经2min静置即可得到多肽自组装水凝胶。
并通过控制变量法,对上述多肽自组装水凝胶制备方法中的多肽使用浓度(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)、温度(25℃、30℃、37℃)、CaCl2水溶液浓度(2mM、5mM、10mM)进行优化分析其对水凝胶形成的影响。
结果显示:本发明先固定反应温度为37℃和CaCl2水溶液浓度为5mM,伴随着多肽使用浓度的增加,液体的粘度也逐渐加大,当其浓度达到5mg/mL时,足以在该体系下快速形成水凝胶,考虑到水凝胶的实际应用,本发明选择了5mg/mL的多肽。紧接着,本发明在固定多肽浓度为5mg/mL和CaCl2水溶液浓度为5mM时,分析了不同温度下的水凝胶自组装情况。结果显示在25℃环境下,该多肽体系呈现溶液状态,无法形成水凝胶;随着温度升至30℃时,该多肽体系需经过液处理才能由溶液状态转变为水凝胶状态,不利于水凝胶的试剂应用;当升温至37℃时,该多肽体系只需2min静置即可形成水凝胶。最后在固定多肽浓度为5mg/mL和反应温度为37℃下,对CaCl2水溶液浓度为5mM进行优化调整,结果显示,2mM CaCl2水溶液下,多肽需要5h才能自组装形成水凝胶;当CaCl2水溶液浓度提高至5mM下,该多肽体系经2min静置即可形成水凝胶;当CaCl2水溶液浓度提高至10mM下,该多肽体系形成水凝胶的时间并未明显缩短。基于此,综合考虑上述因素,本发明采用的多肽自组装水凝胶体系中多肽的使用浓度为5mg/mL,反应温度为37℃,CaCl2水溶液浓度为5mM。
实施例2多肽自组装水凝胶抗菌活性分析
抗菌性能分析:将革兰氏阴性(E.coli)和革兰氏阳性(S.aureus)细菌分别在LB液体培养基中培养12h,37℃,150rpm/min。然后将细菌在无菌的LB液体培养基中稀释至OD600=2.0,取实施例1多肽自组装水凝胶500μL至1.5mL Ep管中,并取500μL稀释细菌加入所述Ep管,然后置摇床中37℃,150r/min。培养12h后测OD600,以各管中所取菌液的OD600为纵坐标作柱状图,以PBS溶液作为空白组,验证多肽自组装水凝胶的抗菌活性。
同时,为进一步证明本发明所述多肽自组装水凝胶的抗菌活性,发明人还合成了D型氨基酸替换和不同的精氨酸替换的多肽自组装水凝胶作为对照组,具体的氨基酸序列如下所述:
对比例1:DHis-DHis-DHis-DHis-DHis-DHis-DHis-DHis;
对比例2:LArg-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis;
对比例3:LHis-LHis-LHis-LArg-LHis-LHis-LHis-LHis;
对比例4:LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LArg;
对比例5:LArg-LHis-LHis-LArg-LHis-LHis-LHis-LHis;
对比例6:LArg-LHis-LHis-LArg-LHis-LHis-LHis-LArg。
结果如图1所示:经本发明实施例1自组装水凝胶处理12h后,体系中的细菌数量呈现急剧性下降。相比于其他多肽自组装水凝胶而言,采用精氨酸替换的多肽的抑菌活性并未得到改善,反而其抑菌活性会呈现不同程度的下降,尤其以对比例6的多肽的抑菌活性最差。另外,发明人也发现,采用D型氨基酸替换后的多肽的抑菌活性会有略微下降,但是其D型结构的抑菌性能仍高于其他对照组。综上,本发明制备得到的自组装水凝胶具备良好的抑菌活性,具备较大的临床应用前景。
在此有必要指出的是,以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明,并不是对本发明的技术方案的进一步的限制,本发明的方法仅为较佳的实施方案,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种多肽自组装水凝胶,其特征在于,所述多肽自组装水凝胶的多肽为LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis-LHis;
所述的多肽自组装水凝胶的制备方法包括:
1)称取多肽粉末,并将其加入盐溶液中,同时调整体系pH至溶液澄清;
2)将步骤1)的反应体系静置,即可得到多肽自组装水凝胶;
其中,步骤1)中的盐溶液是选自钙盐,所述钙盐选自氯化钙的水溶液;
其中,采用的多肽自组装水凝胶体系中多肽的使用浓度为5mg/mL,反应温度为37℃,CaCl2水溶液浓度为5mM。
2.权利要求1所述的多肽自组装水凝胶的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
1)称取多肽粉末,并将其加入盐溶液中,同时调整体系pH至溶液澄清;
2)将步骤1)的反应体系静置,即可得到多肽自组装水凝胶;
其中,步骤1)中的盐溶液是选自钙盐,所述钙盐选自氯化钙的水溶液。
3.权利要求1所述的多肽自组装水凝胶或权利要求2所述的制备方法制备得到的多肽自组装水凝胶在制备抗菌药物中的用途,其中细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
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