CN110066317B - 一种具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗菌以及免疫调节双功能的二聚体多肽及其应用，属于生物医药领域。该多肽通过常规的多肽固相合成技术分成两段制备，再通过半胱氨酸侧链的巯基配对形成二硫键，最后通过半制备反向高效液相色谱纯化得到。药理学实验研究结果表明该多肽对革兰氏阳性菌有良好的抑制作用；亦能抑制由脂多糖诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中促炎细胞因子TNF‑α、IL‑1β、IL‑6及IL‑17的表达，促进抗炎细胞因子IL‑10的表达。同时，该双功能多肽呈现出低溶血活性，且人工制备便捷、药理活性明确，具有进一步开发价值以及有产业化的潜力。

Description

一种具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有抗菌及免疫调节双重药理功能的二聚体多肽及其制备方法与应用。
背景技术
自1928年亚历山大·弗莱明(Alexander Fleming)从青霉菌中发现了青霉素以来，包括天然及人工合成的抗菌剂的广泛使用，一方面使得细菌感染性疾病得到了很好的治疗，但另一方面又给菌株带来了巨大的选择压力(抵抗抗生素的能力)。
2016年8月5日，中国发布《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》(国卫医发[2016]43号)，成为少数具备与抗生素和耐药性作斗争的全面计划的国家之一。复旦大学附属华山医院抗生素研究所牵头组织的中国细菌耐药协作网(China AntimicrobialSurveillance Network,CHINET)自2005年起对22个地区的30余所综合医院/儿童医院收集相关数据整理分析。2005-2017年间所检出菌株的临床样本来源——呼吸道是最重要的样本来源(占比大于40％)，其次为尿液(占比为20％左右)，再次为血液样本和伤口脓液样本。将历年检出的菌株数据按照革兰染色进行分类统计，结果呈现出“阴盛阳衰”的趋势。所检出的菌株中革兰氏阴性菌占比均大于65％，且在2009年后稳定在70％以上，具有绝对的优势。2017年所检出的134952株革兰氏阴性菌株中，检出率排在前六位为病原细菌菌株分别为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌及嗜麦芽窄食单胞菌。对临床样本中所分离到的36 735株大肠埃希菌的药敏实验分析可知，庆大霉素、氨苄西林/舒巴坦、复方磺胺甲恶唑、环丙沙星、头孢噻肟、头孢呋辛、派拉西林和氨苄西林的的耐药率均超过40％。肺炎克雷伯菌属的临床分离率呈现逐年上升趋势，同时其耐药情况也不容乐观，其对临床上用于治疗院内获得性肺炎、败血症、腹膜炎以及中性粒细胞减少发热等重症感染患者所使用的碳青霉烯类抗生素(如亚胺培南、美罗培南和厄他培南)耐药率也已超过14％。
对于革兰氏阳性细菌，2017年全国34所医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的检出率在10％～65％，平均检出率为35.3％。而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(Methicillin Resistant Coagulase-Negative Staphylococci,MRCNS)的检出率在48.2％～99.4％，平均检出率高达80.3％。近十余年MRSA和MRCNS的检出率变化趋势为：MRSA的检出率呈现出逐年下降趋势，而MRCNS的检出率虽有小幅波动但总体趋稳(71.6％～82.0％)。2017年CHINET数据所统计结果表明：少数对万古霉素和替考拉宁敏感的MRCNS菌株却对利奈唑胺耐药，而MRCNS对利福平相对较敏感(耐药率仅为13.1％)，对其它抗菌药物的耐药率均接近或大于30％。
目前一些从临床样本中分离出的菌株具有非常强的适应性，对一种或多种抗菌剂均具有抗性。这些耐药菌可导致严重的危及生命的疾病或/和并发症，更为不幸的是，由于缺乏强有力的药物来遏制多药耐药病原细菌的威胁，菌株耐药的威胁在不断增加。这种现状导致医院和社区中现行治疗方案效果不佳，且在治疗细菌感染性疾病时需要使用更高剂量的抗菌剂和/或更长的住院时间。在药物使用上的支出与其产生的效益之间的差距越来越大，因此需要发现新型天然抗菌剂，或使用创新的设计策略人工制备新化学实体(NewChemical Entity)来对抗细菌耐药。
由于抗微生物肽(Anti-microbial peptides,AMPs)是一类独特且多样的分子，加之迄今为止已报道超过3 000个多肽序列。除了直接杀死微生物外，AMP还可以通过募集和激活免疫细胞，从而增强杀菌作用和/或控制炎症。当微生物入侵后，免疫细胞产生免疫应答，同时吸引其他免疫细胞并控制炎症。而有趣的是，许多免疫细胞也能分泌具有抗菌作用的AMPs，如中性粒细胞和巨噬细胞。一些AMPs可以产生多种免疫反应：白细胞的激活、吸引和分化；刺激血管生成；降低促炎趋化因子的表达并减轻炎症；控制趋化因子的表达和活性氧和活性氮的产生(Afacan N J,Yeung A T,Pena O M,Hancock R E.2012.Therapeuticpotential of host defense peptides in antibiotic-resistant infections[J].CurrPharm Des,18(6):807-819.)。
目前的AMPs大都是天然序列，而基于人工设计及制备的相对较少，具有优良药理活性、低溶血活性的更是寥寥无几，因此开发一种人工设计、制备且具有良好的双重或多重药理功能的多肽，使其能作为候选的生物药物具有十分重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有抗菌及免疫调节双重药理作用的人工设计、制备的二聚体多肽。
本发明的第二目的在于提供具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的制备方法，所述方法技术路线简单，稳定性强，产物质量容易控制，能满足大量制备及规模化工业生产的需要。
本发明的另一目的在于提供上述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的应用。本发明所述的多肽在μmol/L浓度水平具有抗革兰氏阳性标准菌株及临床分离的耐药菌株的活性。同时，本发明所述的双功能肽可显著抑制脂多糖(Lip opolysaccharides,LPS)诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-17的表达，促进抗炎细胞因子IL-10的表达。
本发明的目的通过以下述技术方案实现：
第一方面，提供一种具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽，所述二聚体多肽由单体1和单体2通过单体上的半胱氨酸形成单体间半胱氨酸二硫键制得；其中，所述的单体1选自SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述的单体2选自SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，该二聚体多肽的理论分子量为3196.93，理论等电点10.08，为碱性阳离子肽。
第二方面，提供上述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的制备方法，所述方法包括：通过FMOC固相合成法分别制备序列为KATIFGLAAWALCLA的单体1和序列为RKCKEKIGKEFKR的单体2，经反相高效液相色谱(Reverse phase-high performance liquidchromatography,RP-HPLC)分离纯化可获得中间产物，在离子型缓冲液介质(Tris-HClbuffer)中利用二硫键的配对将两个肽段连接起来，再经RP-HPLC纯化可获得终产物。
本发明中，采用体外试验检测具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、李斯特菌的抗菌活性；结果表明，本发明所涉及的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽具有较好的抗革兰氏阳性菌的抗菌活性(MICs≤1μM)。除标准菌株外，对临床分离的重要革兰氏阳性病原耐药菌——MRSA亦具有很强的抑制作用(MIC＝2μM)。
本发明进行了具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽下调LPS诱导鼠源性巨噬细胞RAW264.7中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17表达试验，结果表明，本发明的二聚体多肽下调LPS诱导鼠源性巨噬细胞RAW264.7中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17表达，同时促进抗炎细胞因子IL-10的表达，进而发挥调节免疫功能。
第三方面，提供上述二聚体多肽在制备具有抗细菌和/或免疫调节的药物中的应用。
优选地，上述应用中，所述的细菌为革兰氏阳性细菌。
进一步地，上述应用中，所述的革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、李斯特菌。
进一步地，上述应用中，所述的革兰氏阳性细菌为临床分离的耐药菌株；优选为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
优选地，上述应用中，所述的免疫调节为二聚体多肽通过抑制脂多糖诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17的表达，同时促进抗炎细胞因子IL-10的表达进而发挥调节免疫功能。
第四方面，提供一种药物组合物，包含上述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽。
进一步地，上述药物组合物，还包含该二聚体多肽药学上可接受的盐和/或可接受的辅料。
优选地，所述辅料选自水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。
优选地，所述药物组合物为片剂。
优选地，所述药物组合物为注射用冻干粉。
第五方面，提供上述包含具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽在制备具有抗细菌和/或免疫调节的药物中的应用。
溶血实验结果表明，所述的具有抗菌及免疫调节双功能的多肽在浓度高达8μmol/mL时未出现显著的溶血反应，其安全性较高。
上述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽或/和药物组合物可以根据常规制剂方法制备成注射剂、片剂、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。该抗菌或/和免疫调节药物组合物可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。
本发明具有如下优点与效果：本发明所涉及的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽具有良好的抗革兰氏阳性菌作用(包括临床分离的耐药菌)，同时能通过抑制促炎细胞因子的表达以及促进抗炎细胞因子的表达从而发挥其调解免疫功能，且安全性高；其人工合成方便，生产成本低，适合工业化大规模生产；因此在治疗耐药菌感染(特别是革兰氏阳性菌感染)以及免疫调节领域具有良好的开发前景；本发明所述的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽可为开发新的抗菌或/和免疫调节活性物质及其复方制剂提供新的选择。
附图说明
图1是制备的中间体多肽KATIFGLAAWALCLA的HPLC图。
图2是制备的中间体多肽KATIFGLAAWALCLA的质谱图。
图3是制备的中间体多肽RKCKEKIGKEFKR的HPLC图。
图4是制备的中间体多肽RKCKEKIGKEFKR的质谱图。
图5是制备的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的HPLC图。
图6是制备的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的质谱图。
图7是所述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的溶血活性结果。
图8是所述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽抑制LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中细胞因子TNF-α的表达。
图9是所述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽抑制LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中细胞因子IL-1β的表达。
图10是所述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽抑制LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中细胞因子IL-6的表达。
图11是所述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽促进LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中细胞因子IL-10的表达。
图12是所述具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽抑制LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中细胞因子IL-17的表达。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】具有抗菌及免疫调节双功能多肽的中间体KATIFGLAAWALCLA的制备
在该中间体多肽序列的合成中，运用9-芴甲氧羰基(FMOC)保护氨基端基团，选用4-甲基二苯基甲胺树脂(4-methyl-benzhydrylamine resin·HCl,MBHA resin)为固相载体，HOBt/DCC为缩合剂，由羧基末端向氨基末端延长肽链。用96％三氟乙酸、2％水和2％三异丙甲硅烷(TIA)的混合液(均为质量百分比)将其从MBHA树脂上裂解。乙醚反复多次沉淀后，经制备型RP-HPLC纯化。使用C18反相制备柱(20mm×250mm，5μm)；流动相：1‰三氟乙酸，0％-60％(体积百分比)乙腈为流动相，1.0mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，保留时间(retention time,RT)为10.21min，其纯度>98％(图1)，冻干后备用。经ESI-QTOF-MS鉴定，其分子量与拟制备多肽中间体相应的理论分子量一致，m/z 1549.74[M+H]+，m/z775.86[M+2H]2+，m/z 517.56[M+3H]3+(图2)。
【实施例2】具有抗菌及免疫调节双功能多肽的中间体RKCKEKIGKEFKR的制备
在该中间体多肽序列的合成中，运用9-芴甲氧羰基(FMOC)保护氨基端基团，选用4-甲基二苯基甲胺树脂(4-methyl-benzhydrylamine resin·HCl,MBHA resin)为固相载体，HOBt/DCC为缩合剂，由羧基末端向氨基末端延长肽链。用96％三氟乙酸、2％水和2％三异丙甲硅烷(TIA)的混合液(均为质量百分比)将其从MBHA树脂上裂解。乙醚反复多次沉淀后，经制备型RP-HPLC纯化。使用C18反相制备柱(20mm×250mm，5μm)；流动相：1‰三氟乙酸，0％-60％(体积百分比)乙腈为流动相，1.0mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，RT为7.94min，其纯度>95％(图3)，冻干后备用。经ESI-QTOF-MS鉴定，其分子量与拟制备多肽中间体相应的理论分子量一致，m/z 1650.89[M+H]+，m/z 826.43[M+2H]2+，m/z 551.56[M+3H]3+(图4)。
【实施例3】具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的制备
以上述实施例1中制备的中间体多肽KATIFGLAAWALCLA以及实施例2中制备的中间体多肽RKCKEKIGKEFKR为原料。各取1mg与1.5mL EP管中，用1mL浓度为0.2M(pH值为9.0)的Tris-HCl缓冲液溶解，用移液枪轻柔吹吸溶液加速多肽的溶解。将盛有多肽溶液的EP管放入恒温摇床中于26℃～28℃，80rpm孵育约48h。于室温12 000rmp高速离心3min，取上清液。经制备型RP-HPLC纯化。使用C18反相制备柱(20mm×250mm，5μm)；流动相：1‰三氟乙酸，0％-70％(体积百分比)乙腈为流动相，1.0mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，RT为16.42min，其纯度>95％(图5)，冻干后备用。经ESI-QTOF-MS鉴定，其分子量与拟制备多肽中间体相应的理论分子量一致，m/z 1599.13[M+2H]2+，m/z 1066.81[M+3H]3+，m/z 800.09[M+4H]4+，m/z 640.42[M+5H]5+(图6)。本发明制备的二聚体多肽如下所示：
Figure GDA0002063435200000071
【实施例4】具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的抗菌活性测定
使用标准菌株(金黄色葡萄球菌ATCC 25922、屎肠球菌ATCC 35667、肺炎链球菌ATCC 49619、李斯特菌ATCC 19115)及临床分离的耐菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))为待测菌株。其中标准菌株购自中国典型培养物保藏中心(China Center of TypeCulture Collection,CCTCC)，MRSA由武汉大学人民医院检验医学中心提供。采用倍比稀释法测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)，通过MIC值表征该具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的抗菌活性。
具体方法如下：
将待测菌株用三区划线法分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基平板中，于37℃恒温培养箱中倒置培养14小时。用接种环挑取单菌落分别转接到灭菌的液体LB培养基中，于37℃、160rpm条件下在震荡培养至对数生长期。用紫外分光光度计测定600nm波长处菌液的吸光度值(OD600)，根据1OD＝1×109CFU/mL的换算关系，分别将标准菌株以及临床耐药菌株培养基稀释至(1～2)×105CFU/mL。
首先在无菌96孔板中先加入100μL灭菌的LB培养基；接下来将用灭菌的LB培养基溶解的浓度为32μmol/L的多肽溶液100μL加入到第1孔中，混合均匀后取100μL加入第2孔中，从第6孔吸出100μL弃去，依次二倍稀释；最后向各孔中加入浓度为1×105CFU/mL稀释好的菌液100μL，混合均匀。未加入多肽的各空作为阴性对照。
以上各组于37℃震荡培养12～14小时，测定波长为600nm处的吸光度值。最小抑菌浓度(MIC)取检测不到细菌生长(OD600≤0.05)的孔中多肽的终浓度的最低值。阴性对照孔中菌液均浑浊，且在600nm处的吸光度OD600＞3。本专利所述该具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的抗菌活性结果如表1。
表1具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的抗菌活性
Figure GDA0002063435200000081
从表1中的结果可以看出，本发明所涉及的具有抗菌及免疫调节的二聚体双功能多肽具有较好的抗革兰氏阳性菌的抗菌活性(MICs≤1μM)。除标准菌株外，对临床分离的重要革兰氏阳性病原耐药菌——MRSA亦具有很强的抑制作用(MIC＝2μM)。
【实施例5】具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的溶血活性测定
从健康供体获得新鲜血液，分离人红细胞后制成悬液，以灭菌生理盐水为阴性对照、以1％的Triton X-100为阳性对照，测定该双功能多肽的溶血活性。
具体步骤如下：用EDTA抗凝管收集全血，轻轻颠倒使血液充分抗凝，于室温500rpm离心5min，弃去上层血浆保留下层红细胞；加入3倍体积的灭菌生理盐水，轻轻颠倒使离心管使底部的红细胞悬浮，于室温下600rpm离心4min，弃去上清保留沉淀下来的红细胞，重复操作3次，至上清液无色为止；用灭菌生理盐水将红细胞制成2％(v/v)浓度的细胞悬液；用灭菌生理盐水将该多肽溶解并配成16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L浓度的溶液；将100μL该双功能多肽溶液和100μL红细胞悬浮液混合并加入至96孔板中，多肽的终浓度分别为8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L和0.25μmol/L；阴性对照组为用灭菌生理盐悬浮的红细胞，阳性对照为用含1％TritonX-100的灭菌生理盐悬浮的红细胞；将样品放入恒温摇床中，于37℃下100rpm孵育60min；于室温将样品以3000rpm离心5min，每孔中取100μL上清液转移至另一96孔板中；用全波长酶标仪测定490nm波长处的吸光度，并通过以下公式计算溶血百分率，公式中H为490nm波长处的吸光度：溶血率(％)＝(Hsample-Hnegative)/(Hpositive-Hnegative)×100％，如图7所示。
结果表明，本发明所述的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽在终浓度高达8μmol/L时仍未出现明显的溶血作用(溶血率＜10％)。
【实施例6】多肽抑制LPS诱导RAW 264.7细胞中TNF-α的表达
取培养至75％～85％的RAW264.7细胞，吸净培养基，用D-Hanks缓冲液洗两次；加入于适量胰酶于37℃用消化20秒，加入含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基轻柔吹打细胞制成单细胞悬液；调整细胞浓度为2.5×105cells/mL，接种于48孔板中，每孔0.5mL。将培养板于37℃，5％CO2，培养8～12小时，吸出上清液并弃去。空白组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；LPS模型组和实验组中加入0.5mL含有LPS的10％FBS的DMEM培养基(LPS终浓度为10μg/mL)。将培养板于37℃，5％CO2，培养1小时。空白组和LPS模型组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；实验组中加入0.5mL含有本发明所述的多肽的10％FBS的DMEM培养基(终浓度4μmol/L)。将培养板于37℃，5％CO2，孵育～16小时，2000rmp离心8min。取上清液用稀释适当的倍数，用酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay,ELISA)测定上清液中TNF-α的含量。
结果表明，本发明所述的该具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽能明显抑制LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW 264.7中促炎细胞因子TNF-α的表达，如图8所示。
【实施例7】多肽抑制LPS诱导RAW 264.7细胞中IL-1β的表达
取培养至75％～85％的RAW264.7细胞，吸净培养基，用D-Hanks缓冲液洗两次；加入于适量胰酶于37℃用消化20秒，加入含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基轻柔吹打细胞制成单细胞悬液；调整细胞浓度为2.5×105cells/mL，接种于48孔板中，每孔0.5mL。将培养板于37℃，5％CO2，培养8～12小时，吸出上清液并弃去。空白组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；LPS模型组和实验组中加入0.5mL含有LPS的10％FBS的DMEM培养基(LPS终浓度为10μg/mL)。将培养板于37℃，5％CO2，培养1小时。空白组和LPS模型组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；实验组中加入0.5mL含有本发明所述的多肽的10％FBS的DMEM培养基(终浓度4μmol/L)。将培养板于37℃，5％CO2，孵育～16小时，2000rmp离心8min。取上清液用稀释适当的倍数，用酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay,ELISA)测定上清液中IL-1β的含量。
结果表明，本发明所述的该具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽能明显抑制LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW 264.7中促炎细胞因子IL-1β的表达，如图9所示。
【实施例8】多肽抑制LPS诱导RAW 264.7细胞中IL-6的表达
取培养至75％～85％的RAW264.7细胞，吸净培养基，用D-Hanks缓冲液洗两次；加入于适量胰酶于37℃用消化20秒，加入含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基轻柔吹打细胞制成单细胞悬液；调整细胞浓度为2.5×105cells/mL，接种于48孔板中，每孔0.5mL。将培养板于37℃，5％CO2，培养8～12小时，吸出上清液并弃去。空白组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；LPS模型组和实验组中加入0.5mL含有LPS的10％FBS的DMEM培养基(LPS终浓度为10μg/mL)。将培养板于37℃，5％CO2，培养1小时。空白组和LPS模型组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；实验组中加入0.5mL含有本发明所述的多肽的10％FBS的DMEM培养基(终浓度4μmol/L)。将培养板于37℃，5％CO2，孵育～16小时，2000rmp离心8min。取上清液用稀释适当的倍数，用酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay,ELISA)测定上清液中IL-6的含量。
结果表明，本发明所述的该具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽能明显抑制LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW 264.7中促炎细胞因子IL-6的表达，如图10所示。
【实施例9】多肽抑制LPS诱导RAW 264.7细胞中IL-10的表达
取培养至75％～85％的RAW264.7细胞，吸净培养基，用D-Hanks缓冲液洗两次；加入于适量胰酶于37℃用消化20秒，加入含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基轻柔吹打细胞制成单细胞悬液；调整细胞浓度为2.5×105cells/mL，接种于48孔板中，每孔0.5mL。将培养板于37℃，5％CO2，培养8～12小时，吸出上清液并弃去。空白组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；LPS模型组和实验组中加入0.5mL含有LPS的10％FBS的DMEM培养基(LPS终浓度为10μg/mL)。将培养板于37℃，5％CO2，培养24小时。空白组和LPS模型组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；实验组中加入0.5mL含有本发明所述的多肽的10％FBS的DMEM培养基(终浓度4μmol/L)。将培养板于37℃，5％CO2，孵育16～24小时，2000rmp离心8min。取上清液用稀释适当的倍数，用酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay,ELISA)测定上清液中IL-10的含量。
IL-10是一种具有抗炎活性的细胞因子，主要功能为直接抑制炎症细胞的活化。结果表明，本发明所述的该具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽能明显促进LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW 264.7中抗炎细胞因子IL-10的表达，如图11所示。
【实施例10】多肽抑制LPS诱导RAW 264.7细胞中IL-17的表达
取培养至75％～85％的RAW264.7细胞，吸净培养基，用D-Hanks缓冲液洗两次；加入于适量胰酶于37℃用消化20秒，加入含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基轻柔吹打细胞制成单细胞悬液；调整细胞浓度为2.5×105cells/mL，接种于48孔板中，每孔0.5mL。将培养板于37℃，5％CO2，培养8～12小时，吸出上清液并弃去。空白组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；LPS模型组和实验组中加入0.5mL含有LPS的10％FBS的DMEM培养基(LPS终浓度为10μg/mL)。将培养板于37℃，5％CO2，培养1小时。空白组和LPS模型组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；实验组中加入0.5mL含有本发明所述的多肽的10％FBS的DMEM培养基(终浓度4μmol/L)。将培养板于37℃，5％CO2，孵育～16小时，2000rmp离心8min。取上清液用稀释适当的倍数，用酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay,ELISA)测定上清液中IL-17的含量。
结果表明，本发明所述的该具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽能明显抑制LPS诱导的鼠源性巨噬细胞RAW 264.7中促炎细胞因子IL-17的表达，如图12所示。
【实施例11】片剂
取本发明所述的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽0.1g、淀粉2g、糊精2g混合，质量浓度为30％的药用级聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为粘合剂，制粒，压片，既得片剂。
【实施例12】注射用冻干粉
取本发明所述的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽1.0g、甘露醇15g，置于容器中，加适量PBS缓冲液(0.1M,pH7.4)溶解，加注射用水至250mL，摇匀，加4～6g针用活性炭，室温搅拌30～60分钟，粗滤，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，每瓶1mL，采用速冻的方法，每分钟降温10～15℃，降温至-45℃，维持2.5h，抽真空，在真空状态下缓慢升温，升温速度每小时2～10℃，温度升至30℃时停止升温，待温度接近室温后取出，加盖密封，既得冻干粉针剂。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Ala Thr Ile Phe Gly Leu Ala Ala Trp Ala Leu Cys Leu Ala
1 5 10 15
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Lys Cys Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg
1 5 10

Claims (9)

1.一种具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽，其特征在于，所述二聚体多肽由单体1和单体2通过单体上的半胱氨酸形成单体间半胱氨酸二硫键制得；其中，所述的单体1选自SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述的单体2选自SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，该二聚体多肽的理论分子量为3196.93，理论等电点10.08，为碱性阳离子肽。
2.权利要求1所述的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括：通过FMOC固相合成法分别制备序列为KATIFGLAAWALCLA的单体1和序列为RKCKEKIGKEFKR的单体2，经反相高效液相色谱分离纯化可获得中间产物，在离子型缓冲液介质Tris-HCl缓冲液中利用二硫键的配对将两个肽段连接起来，再经RP-HPLC纯化可获得终产物。
3.权利要求1所述的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽在制备具有抗革兰氏阳性细菌和/或免疫调节的药物中的应用，其特征在于，所述的革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、李斯特菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的免疫调节为二聚体多肽通过抑制脂多糖诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17的表达，同时促进抗炎细胞因子IL-10的表达进而发挥调节免疫功能。
6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，还包含权利要求1所述的具有抗菌及免疫调节双功能的二聚体多肽药学上可接受的盐和/或可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述辅料选自水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。
9.根据权利要求6-8任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂。
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