CN109354606B - 一种双功能ndm-1碳青霉烯酶抑制肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双功能NDM‑1碳青霉烯酶抑制肽及其应用，属于生物医药领域。其序列为：Ile‑Phe‑Gly‑Arg‑Ile‑Arg‑Gly‑Phe‑Ile‑Lys‑Asn‑Ile‑Trp‑Ser‑Asp，可利用常规的多肽固相合成技术制备，通过高效液相色谱纯化。该多肽与β‑内酰胺类抗生素联合使用可抑制产NDM‑1酶的革兰氏阴性细菌，而单独使用该多肽可抑制革兰氏阳性细菌。该双功能多肽具有低溶血活性及高盐环境稳定性，制备便捷、抗菌活性明确、具有产业化的潜力，本发明进一步涉及包括所述双功能肽的药品和/或饲料和/或化妆品和/或日用化学品。

Description

一种双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽及其应用。

背景技术

耐碳青霉烯类抗生素的菌株主要为肠杆菌科细菌，为革兰氏阴性菌家族，其对多种抗生素表现出抗性。耐碳青霉烯肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae,CRE)是社区和院内获得性细菌感染的主要原因，例如泌尿道、血液、手术部位和腹腔内感染。由于其对多种抗生素表现出抗性，由其所引起的感染通常难以治疗，导致死亡率显着增加。根据美国疾病控制和预防中心(Centers for Disease Controland Prevention,CDC)2013年发布的报告，全美每年有超过9000名住院患者被CRE感染，其中一半因败血症而最终导致死亡。此外，大约600例死亡病例是由耐碳青霉烯的克雷伯氏菌和大肠杆菌这两种最常见的CRE感染引起的。更重要的是，中国学者最近对于抗菌素耐药性的研究也表明我国CRE菌株的流行率也越来越高(Zhang R,Liu L,Zhou H,Chan EW,Li J,Fang Y,Li Y,Liao K,Chen S.,Nationwide surveillance of clinical carbapenem-resistant Enterobacteriaceae(CRE)strains in China,EBioMedicine.2017,19:98-106.)。

CRE对碳青霉烯类抗生素产生抗性的主要机制之一是菌株能产生碳青霉烯酶，碳青霉烯酶能水解几乎所有的β-内酰胺抗生素从而使其无效。这些广谱碳青霉烯酶可分为A、B和D类β-内酰胺酶，其中水解碳青霉烯类抗生素能力最强的是B类金属-β-内酰胺酶(metallo-β-lactamases,MBLs)。MBL活性中心含有金属锌离子，其作为必需的辅因子来催化抗生素结构中的β-内酰胺环水解。MBL可根据其氨基酸序列可进一步分为三个亚类(B1，B2和B3)，其中新的德里金属-β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)属于B1亚类。临床上，该亚类MBL是最重要和最普遍的碳青霉烯酶，特别是NDM-1。全球迅速传播的产生NDM-1“超级细菌”进一步说明其在赋予菌株的耐药性方面所起到的重要作用(表1)，以及迫切需要开发有效的NDM-1抑制剂。

表1携带blaNDM-1质粒基因的耐药菌的菌株

目前临床上可选择的β-内酰胺酶抑制品种较少，主要有克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦，均为小分子化合物，但对于NDM-1碳青霉烯酶无抑制效果，因此开发一种NDM-1碳青霉烯酶抑制剂，使抗生素能发挥作用从而杀死耐药菌株具有重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一种具有抑制NDM-1碳青霉烯酶活性和能破坏细菌细胞膜的双功能多肽。

本发明的另一目的在于提供上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽的应用。将本发明所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽与β-内酰胺类抗生素联合用于抑制产NDM-1的革兰氏阴性耐药菌时，可显著提高β-内酰胺类抗生素的抗菌活性。同时，单用本发明所述的该双功能多肽可通过破坏细菌细胞膜从而杀死革兰氏阳性菌。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽，为15个氨基酸组成的线性肽，所述多肽具有抑制NDM-1碳青霉烯酶的活性，亦能够破坏细菌细胞膜，其氨基酸序列为Ile-Phe-Gly-Arg-Ile-Arg-Gly-Phe-Ile-Lys-Asn-Ile-Trp-Ser-Asp，如SEQ ID NO:1所示，理论分子量1822.14，理论等电点10.84，为碱性阳离子肽。

上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽可通过固相合成法制备，经反相高效液相色谱(Reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC)分离纯化可获得终产物，技术路线简单，稳定性强，产物质量容易控制，能满足大量制备及规模化工业生产的需要。

上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽在制备抗细菌药物中的应用。

优选地，所述的细菌为因产NDM-1碳青霉烯酶而具有水解β-内酰胺类抗生素能力的耐药细菌。

优选地，所述的细菌为革兰氏阳性菌。

上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽在制备抑制NDM-1碳青霉烯酶的药物中的应用。

一种药物组合物，包含上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽。

上述药物组合物，还包含该抑制肽可接受的盐和/或可接受的载体。

上述药物组合物，还包含β-内酰胺类抗生素，优选为氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、氟氧头孢、头孢替唑、头孢噻肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢吡肟、头孢洛林、亚胺培南、美罗培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲南中的一种或多种。

上述药物组合物，还包含β-内酰胺类抗生素可接受的盐和/或可接受的载体。

上述包含双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽和β-内酰胺类抗生素的抗菌组合物在制备抗耐药细菌药物中的应用，所述的细菌为因产NDM-1碳青霉烯酶而具有水解β-内酰胺类抗生素能力的耐药细菌。

所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽与β-内酰胺类抗生素具有良好的协同作用，能明显抑制产NDM-1酶耐药菌的生长并且大幅度降低β-内酰胺类抗生素的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration，MIC)。该抑制肽通过抑制NDM-1碳青霉烯酶活性从而保护β-内酰胺类抗生素的关键结构(β-内酰胺环)免于被该类酶水解，从而发挥抗生素的抗革兰氏阴性菌活性。

所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽除了具有抑酶活性外，同时具有破坏细菌细胞膜的作用，上述包含双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽和该抑制肽可接受的盐和/或可接受的载体的药物组合物可抑制革兰氏阳性菌。

上述包含双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽和β-内酰胺类抗生素，还包含该抑制肽和β-内酰胺类抗生素可接受的盐和/或可接受的载体的的抗菌组合物在制备抑制细菌(特别是耐药菌)的生长的药物中的应用，所述的β-内酰胺类抗生素优选为氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、氟氧头孢、头孢替唑、头孢噻肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢吡肟、头孢洛林、亚胺培南、美罗培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲南中的一种或多种。更优选的，所述的β-内酰胺类抗生素为美罗培南或亚胺培南。

溶血实验结果表明，所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽在浓度高达4mg/mL时未出现显著的溶血反应，其安全性较高。高盐环境下的稳定性实验结果表明，所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽在高盐的环境仍具有活性。

上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽或/和药物组合物可以根据常规制剂方法制备成注射剂、片剂、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。该抗菌药物组合物可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。

本发明具有如下优点与效果：本发明的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽具有良好的抑制NDM-1碳青霉烯酶活性，且安全性高，在高盐的环境仍具有活性；其人工合成方便，生产成本低，适合工业化大规模生产；将其与β-内酰胺类抗生素联合使用可避免抗生素被酶水解破坏而失效，在与美罗培南联用时，当所述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽的终浓度为20μM时，美罗培南的抗菌活性(MIC值)提高了至少256倍，因此在治疗耐药菌感染(特别是革兰氏阴性菌感染)领域具有良好的开发前景；同时因该肽自身具有破坏细菌细胞膜的作用，对革兰氏阳性菌也具有抑制作用；本发明所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽可为开发新的抗菌活性物质及其复方制剂提供新的选择。

附图说明

图1是制备的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽的HPLC图。

图2是制备的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽的质谱图。

图3是双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽抑酶活性测定结果图。

图4是双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽作用于菌体细胞膜电镜图。

(图4A为阴性对照；图4B为经多肽处理后的菌体)

图5是不同浓度双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽的溶血活性结果。

图6是不同浓度盐对双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽抗菌活性的影响。

(图6A为10μM的肽在不同盐浓度环境中与β-内酰胺抗生素联用抑制革兰氏阴性菌E.coli BL21(DE3)-pET30a-NDM-1时美罗培南的MIC值；图6B单独使用该多肽抑制革兰氏阳性菌MRSA是的多肽的MIC值)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例中表达NDM-1碳青霉烯酶所使用的工程菌E.coli BL21(DE3)-pET30a-NDM-1的构建及NDM-1酶的原核表达、纯化方法参照发明人于2013年发表的论文(Shen B,YuY,Chen H,Cao X,Lao X,Fang Y,Shi Y,Chen J,Zheng H.Inhibitor discovery of full-length New Delhi metallo-β-lactamase-1(NDM-1)[J].PLoS One,2013,8(5):e62955.)。

实施例1双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽的制备

双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽的氨基酸序列为Ile-Phe-Gly-Arg-Ile-Arg-Gly-Phe-Ile-Lys-Asn-Ile-Trp-Ser-Asp。

在多肽序列的合成中，运用9-芴甲氧羰基(FMOC)保护N端基团，选用4-甲基二苯基甲胺树脂(4-methyl-benzhydrylamine resin·HCl,MBHA resin)为固相载体，HOBt/DCC为缩合剂，由羧基末端向氨基末端延长肽链。用95％三氟乙酸、2％水和3％三异丙甲硅烷(TIA)的混合液(均为质量百分比)将其从MBHA树脂上裂解。乙醚反复多次沉淀后，经制备型RP-HPLC纯化。使用C18反相制备柱(20mm×250mm，5μm)；流动相：0.1％三氟乙酸，0％-75％(体积百分比)乙腈为流动相，1mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，其纯度>95％(图1)，冻干后备用。经ESI-QTOF-MS鉴定，其分子量与拟制备多肽相应的理论分子量一致，m/z 1823.04[M+H]⁺，m/z 912.46[M+2H]²⁺，m/z 608.56[M+3H]³⁺(图2)。

实施例2双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽对NDM-1酶抑制活性的测定以美罗培南为报告底物，实验分为3组，保持温度为～35℃：

①美罗培南+NDM-1碳青霉烯酶组：向10μL浓度为4mM的美罗培南与80μL浓度为25mM的HEPES缓冲液(pH7.2)的混合溶液中加入10μL浓度为0.5μM的NDM-1碳青霉烯酶，总体积为100μL。

②美罗培南+NDM-1碳青霉烯酶+酶抑制肽组：向10μL浓度为4mM的美罗培南与70μL浓度为25mM的HEPES缓冲液(pH7.2)的混合溶液中加入10μL浓度为0.5μM的NDM-1碳青霉烯酶与10μL浓度为1μM的上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽，总体积为100μL。

③美罗培南组：向10μL浓度为4mM的美罗培南中加入90μL浓度为30mM的HEPES缓冲液(pH7.2)，总体积为100μL。

底物美罗培南被NDM-1酶水解后其β-内酰胺环被打开从而导致吸光度下降，因此可通过测定波长为300nm的吸光度的变化表征底物的水解程度。结果如图3所示：①组吸光度下降最快，说明NDM-1碳青霉烯酶能高效地水解底物美罗培南；②组吸光度虽然也有一定程度的降低，但相对于①组，其下降的程度及速率明显缓慢得多，说明本发明所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽对NDM-1碳青霉烯酶具有明显的抑制作用；③组为阴性对照，吸光在整个过程中基本无变化，说明底物美罗培南在实验过程中自身结构稳定，不存在自身降解的可能，因此①组中其水解是由NDM-1碳青霉烯酶所催化，且与酶促反应体系中缓冲液等物质无关。

实施例3双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽联合抗生素协同抗菌作用测定

使用产NDM-1碳青霉烯酶人基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET30a-NDM-1作为耐药菌株，并将仅含有空载体的E.coli BL21(DE3)-pET30a菌株作为阴性对照，这样既能够开展协同抗菌实验，又可避免使用相对危险的临床菌株。采用倍比稀释法测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)，通过MIC值的变化体现本发明所述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽与β-内酰胺类抗生素的协同抗菌作用。

具体方法如下：

将表达NDM-1碳青霉烯酶的工程菌菌株E.coli BL21(DE3)-pET30a-NDM-1以及对照菌株E.coli BL21(DE3)-pET30a用三区划线法分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基平板中，于37℃恒温培养箱中倒置培养12小时。用接种环挑取单菌落分别转接到灭菌的液体LB培养基中，于37℃、150rpm条件下在震荡培养至对数生长期。用紫外分光光度计测定600nm波长处菌液的吸光度值(OD₆₀₀)，根据1OD＝1×10⁹CFU/mL的换算关系，分别将表达NDM-1碳青霉烯酶的工程菌以及对照菌株用灭菌的LB培养基稀释至(1～2)×10⁵CFU/mL。

实验组均使用能表达NDM-1碳青霉烯酶的工程菌E.coli BL21(DE3)-pET30a-NDM-1。

实验组①：在无菌96孔板中加入灭菌的LB培养基100μL；将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为512μg/mL的β-内酰胺类抗生素溶液100μL加入到第1孔中，混合均匀后取100μL加入第2孔中，依次二倍稀释，从第12孔吸出100μL弃去；最后向各孔中加入浓度为1×10⁵CFU/mL的菌液100μL，混合均匀。

实验组②：在无菌96孔板中加入灭菌的LB培养基100μL；将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为512μg/mL的β-内酰胺类抗生素溶液100μL加入到第1孔中，混合均匀后取100μL加入第2孔中，从第12孔吸出100μL弃去，依次二倍稀释；向各孔中加入浓度为2×10⁵CFU/mL的菌液50μL；最后向各孔中加入50μL经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为80μM上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽(各孔中抑制肽的终浓度为20μmol/L)，混合均匀。

实验组③：在无菌96孔板中加入灭菌的LB培养基50μL；向各孔中加入浓度为1×10⁵CFU/mL的菌液100μL；最后加入经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为80μM上述双功能碳青霉烯酶抑制肽的菌液50μL(孔中抑制肽的终浓度为20μM)。

对照组使用含有原核表达空质粒的菌株E.coli BL21(DE3)-pET30a。

对照组：首先在无菌96孔板中先加入100μL灭菌的LB培养基；接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为512μg/mL的β-内酰胺类抗生素溶液100μL加入到第1孔中，混合均匀后取100μL加入第2孔中，从第12孔吸出100μL弃去，依次二倍稀释；最后向各孔中加入浓度为1×10⁵CFU/mL稀释好的菌液100μL，混合均匀。

以上各组于37℃震荡培养12～16小时，测定波长为600nm处的吸光度值。最小抑菌浓度(MIC)取检测不到细菌生长(OD₆₀₀≤0.05)的孔中各β内酰胺类抗生素的终浓度的最低值，结果如表2。

表2双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽与抗生素协同抗菌结果(MIC/(μg/mL))

从表2中MIC数据可知，对照组中各β-内酰胺类抗生素对含有空载体不耐药的菌株E.coli BL21(DE3)-pET30a具有良好的抑制作用(MIC≤0.25μg/mL)，说明不表达NDM-1碳青霉烯酶的菌株对各抗生素均敏感。实验组①中所使用的为能表达NDM-1碳青霉烯酶的耐药工程菌，除单环β-内酰胺类抗生素氨曲南之外，其余各抗生素对该工程菌的MIC值均大于256μg/mL，说明该工程菌因能表达NDM-1碳青霉烯酶而具有多药耐药性。实验组③中菌株E.coliBL21(DE3)-pET30a-NDM-1在终浓度为20μM抑制肽的LB培养基中培养12～16小时后正常生长且菌液浑浊，在600nm处的吸光度OD₆₀₀＞3，说明所述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽本身对革兰氏阴性耐药工程E.coli BL21(DE3)-pET30a-NDM-1无抑明显抑菌活性。实验组②与实验组①相比各抗生素的MIC大幅度降低，说明表2中各β-内酰胺类抗生素与所述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽合用后，由于该多肽抑制了NDM-1碳青霉烯酶，从而阻止了NDM-1酶水解底物β-内酰胺类抗生素的作用，进而使得各β-内酰胺类抗生素不被酶水解破坏而具有抗菌活性。

从实验组的MIC可以看出，当所述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽与各β-内酰胺类抗生素联合使用时，通过协同作用能显著提高各β-内酰胺类抗生素抑制耐药的革兰氏阴性工程菌E.coli BL21(DE3)-pET30a-NDM-1的活性，特别是实验组②中当所述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽的终浓度为20μM时，美罗培南的抗菌活性(MIC值)提高了至少256倍(256μg/mL÷1μg/mL＝256)。

实施例4双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽破坏革兰氏阳性菌体细胞膜

临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)为待测菌株，其标准根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)指南，即通过肉汤稀释法所测定的苯唑西林的MIC值≥4mg/mL的金黄色葡萄球菌判定为MRSA菌株。

利用透射电镜技术观测上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽对革兰氏阳性的作用机制。具体方法如下：用灭菌的LB培养基培养MRSA至指数期，取200μL浓度为1mM上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽加入至800μL的MRSA混悬菌液中。混合后于37℃恒温条件下以150rpm的转速孵育20min；将菌液以1000×g离心10min收集菌体，菌体用0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤数次后用含2％戊二醛的0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)固定1h；于4℃恒温条件下，用1％四氧化锇处理1h；用1％乙酸双氧铀着色后用梯度乙醇溶液脱水(60％乙醇溶液处理15min，70％乙醇溶液处理15min，80％乙醇溶液处理15min以及90％乙醇溶液处理15min，最后用100％乙醇溶液处理10min)。处理后的样品放入环氧树脂中并用1％乙酸双氧铀和柠檬酸铅着色。最后，用透射式电子显微镜观察半薄切片的样品，结果如图4所示。

可以明显看出未经处理的MRSA菌体形态为圆形，具有完整细胞壁和清晰的菌体增殖过程中的细胞膜(图4A)。用上述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽处理20min后，观察到菌体细胞包膜的破坏(图4B)，以及颗粒状细胞质的出现。因此该双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽具有破坏革兰氏阳性菌MRSA菌体细胞膜的作用。

实施例5双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽溶血活性的测定

从健康供体获得新鲜血液，分离人红细胞后制成悬液，以灭菌生理盐水为阴性对照、以1％的Triton X-100为阳性对照，测定该双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽溶血活性。

具体步骤如下：用EDTA抗凝管收集全血，轻轻颠倒使血液充分抗凝，于室温500rpm离心5min，弃去上层血浆保留下层红细胞；加入3倍体积的灭菌生理盐水，轻轻颠倒使离心管使底部的红细胞悬浮，于室温下500rpm离心5min，弃去上清保留沉淀下的红细胞，重复操作3次，至上清液无色为止；用灭菌生理盐水将红细胞制成2％(v/v)浓度的细胞悬液；用灭菌生理盐水将三种防御素多肽溶解并配成8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、500μg/mL和250μg/mL浓度的溶液；将100μL该双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽溶液和100μL红细胞悬浮液混合并加入至96孔板中；阴性对照组为用灭菌生理盐悬浮的红细胞，阳性对照为用含1％TritonX-100的灭菌生理盐悬浮的红细胞；将样品放入恒温摇床中，于37℃下80rpm孵育60min；于室温将样品以2000rpm离心5min，每孔中取100μL上清液转移至另一96孔板中；用全波长酶标仪测定490nm波长处的吸光度，并通过以下公式计算溶血百分率，公式中H为490nm波长处的吸光度：溶血率(％)＝(H_sample-H_negative)/(H_positive-H_negative)×100％，如图5所示。

结果表明，在浓度本发明所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽在终浓度高达4mg/mL时仍未出现明显的溶血作用(溶血率＜5％)。

实施例6双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽耐盐特性测定

将本发明所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽分别用0mM、75mM、150mM、300mM、450mM和600mM灭菌的NaCl溶液溶解，并配成浓度为64μM的多肽溶液。按二倍稀释法，选取⑴实施例3中能表达NDM-1碳青霉烯酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET30a-NDM-1(革兰氏阴性菌)，测双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽(肽的终浓度为10μM)与β-内酰胺抗生素(美罗培南)联合使用时，美罗培南抑菌的MIC值，从而反应高盐环境对其抑制NDM-1碳青霉烯酶活性的影响；⑵另选取实施例4中所使用的MRSA(革兰氏阳性菌)作为测试菌株，测定在不同浓度盐溶液中双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽抑制MRSA的MIC值，结果如图6所示。

图6A中的数据表明，随着盐浓度的升高，本发明所述双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽与β-内酰胺抗生素联用时，美罗培南的MIC值有虽有波动，但MIC值波动在2倍以内，基本稳定(1～2μg/mL)，说明盐浓度对该肽的抑酶活性及通过协同效应抑制产NDM-1酶的革兰氏阴性工程菌E.coli的影响较小；图6B中说明在盐浓度≤300mM时(生理条件下盐浓度约为150mM)，该多肽抑制革兰氏阳性菌MRSA的MIC值无变化(均为4μM)；而当盐浓度高达450mM和600mM时，其MIC值分别为8μM和32μM，较之于生理盐浓度条件下对应的MIC值分别增大了2倍和8倍。

实施例7片剂

取本发明所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽(Ile-Phe-Gly-Arg-Ile-Arg-Gly-Phe-Ile-Lys-Asn-Ile-Trp-Ser-Asp)0.1g、淀粉2g、糊精2g混合，质量浓度为30％的药用级聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为粘合剂，制粒，压片，既得片剂。

实施例8注射用冻干粉

取本发明所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽(Ile-Phe-Gly-Arg-Ile-Arg-Gly-Phe-Ile-Lys-Asn-Ile-Trp-Ser-Asp)1.0g、甘露醇15g，置于容器中，加适量PBS缓冲液(0.1M,pH7.4)溶解，加注射用水至250mL，摇匀，加4～6g针用活性炭，室温搅拌30～60分钟，粗滤，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，每瓶1mL，采用速冻的方法，每分钟降温10～15℃，降温至-45℃，维持2.5h，抽真空，在真空状态下缓慢升温，升温速度每小时2～10℃，温度升至30℃时停止升温，待温度接近室温后取出，加盖密封，既得冻干粉针剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学人民医院（湖北省人民医院）

<120> 一种双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Phe Gly Arg Ile Arg Gly Phe Ile Lys Asn Ile Trp Ser Asp

1 5 10 15

Claims (9)

1.一种双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽，其特征在于，所述肽具有抑制NDM-1碳青霉烯酶的活性，亦能够破坏细菌细胞膜，其氨基酸序列为Ile-Phe-Gly-Arg-Ile-Arg-Gly-Phe-Ile-Lys-Asn-Ile-Trp-Ser-Asp。

2.权利要求1所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽在制备抗产NDM-1酶革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产NDM-1酶革兰氏阴性菌为因产NDM-1碳青霉烯酶而具有水解β-内酰胺类抗生素能力的耐药细菌，所述β-内酰胺类抗生素为氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、氟氧头孢、头孢替唑、头孢噻肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢吡肟、头孢洛林、亚胺培南、美罗培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲南中的一种或多种。

4.权利要求1所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽在制备抑制NDM-1碳青霉烯酶的药物中的应用。

5.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的双功能NDM-1碳青霉烯酶抑制肽或者还包含权利要求1所述的抑制肽可接受的盐和/或可接受的载体。

6.权利要求5所述的药物组合物在制备抑制革兰氏阳性菌药物中的应用。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，还包含β-内酰胺类抗生素或者还包含β-内酰胺类抗生素可接受的盐和/或可接受的载体，β-内酰胺类抗生素优选为氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、氟氧头孢、头孢替唑、头孢噻肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢吡肟、头孢洛林、亚胺培南、美罗培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲南中的一种或多种。

8.权利要求7所述的药物组合物在制备抗产NDM-1酶革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌药物中的应用，其特征在于，所述产NDM-1酶革兰氏阴性菌为因产NDM-1碳青霉烯酶而具有水解β-内酰胺类抗生素能力的耐药细菌，所述β-内酰胺类抗生素为氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、氟氧头孢、头孢替唑、头孢噻肟、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢吡肟、头孢洛林、亚胺培南、美罗培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲南中的一种或多种。

9.根据权利要求5或7所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂或霜剂；所述的药物组合物通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。

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