CN112110993B - 化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽、制备方法及其应用，属于生物医药领域。该多肽通过常规的多肽固相合成技术分成两个片段进行中间体肽段的制备，再通过半胱氨酸残基侧链的巯基基团形成分子内二硫键进行偶联，最后经半制备反向高效液相色谱纯化得到。抗菌实验研究结果表明该多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌均具有良好的抑制作用。更重要的是，该二聚体多肽呈现出低溶血活性、耐盐、耐高温、耐酸碱的特性，且人工制备便捷、抗菌谱广，具有作为候选药物进行深入研发的价值以及产业化的潜力。

Description

化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽、制备方法及 其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽、制备方法及其应用。

背景技术

全球每年因微生物感染而导致上千万人死亡。尽管抗生素以及合成抗菌药曾经能够治疗大多数感染，但随着病原微生物耐药性的越来越严重，已削弱了现有抗微生物药物的有效性。目前临床上使用的抗微生物药物不易抵抗因菌株进化所产生的耐药机制的影响，因此给临床治疗带来了极大的挑战。

根据全国细菌耐药监测网2019年11月19日发布的《全国细菌耐药监测报告》，该报告统计、分析了2017年10月至2018年9月我国的监测数据。纳入分析的细菌总数为3234372株，其中革兰氏阳性菌952023株(占29.4％)，革兰氏阴性菌2282349株(占70.6％)。革兰氏阳性菌分离率排名前五位的是：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌(分别占革兰氏阳性菌的32.5％、10.7％、10.5％、9.6％以及9.5％)。革兰氏阴性菌分离率排名前五位的是：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌(分别占革兰氏阴性菌的28.9％、20.4％、12.4％、9.9％以及4.0％)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)我国的平均检出率为30.9％；耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)平均检出率为75.7％；粪肠球菌、屎肠球菌对万古霉素耐药率平均分别为0.3％和1.4％；大肠埃希菌对第三代头孢菌素、碳青霉烯类、喹诺酮类药物耐药率分别为53％、1.5％和50.8％；肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素、碳青霉烯类药物的耐药率约为32.4％和10.1％；铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药率约为19.3％；鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药率约为56.1％。

多药耐药的微生物不仅出现在医院环境中，而且现在经常在社区环境中被发现，这表明医院之外同样存在着大量抗生素耐药的菌株。菌株对抗菌药物“攻击”的反应是微生物适应和进化结果。“优胜劣汰”是病原体巨大的遗传可塑性的必然结果，菌株可引起特定的反应，从而通过突变、遗传物质的改变或基因表达的改变而适应并生存。经过不断的累积，使其对目前临床上使用的几乎所有抗菌药均获得不同程度的抗性。因此，了解微生物药耐产生的生化和遗传基础对于优化新药设计策略以减少抗药性的出现和传播，以及针对多药耐药菌株开创新治疗方法至关重要。

抗菌肽(antibacterial peptides,AMP)是具有生物活性的小蛋白，它们通过破坏菌株细胞膜，调节免疫反应和调节炎症来发挥作用。AMP具有序列和结构的多样性，同时也具有多重药理学作用，这种特性是目前抗生素和合成抗菌药所不具备的。除了将AMP用于抗菌之外，它们还可用于控制植物病害。天然AMP的合成类似物已在转基因植物中表达以赋予植物自我保护功能、防止感染，并用作商业生物农药的活性成分(Montesinos E,EduardBardají.Synthetic Antimicrobial Peptides as Agricultural Pesticides forPlant-Disease Control[J].Chem Biodivers,2008,5(7):1225-1237)。相关研究表明，重组或合成的AMP可以作为水产养殖中的治疗剂，或者牲畜的食品添加剂(Liu Q,Yao S,ChenY,et al.Use of antimicrobial peptides as a feed additive for juvenilegoats[J].SciRep,2017,7(1):12254.)。自亚历山大·弗莱明(Alexander Fleming)于1922年发现溶菌酶后，直到上世纪90年代中期，才从细菌或真菌感染后的果蝇种鉴定出第一个AMP。果蝇中防御素的3D结构类似于人的β-防御素，是AMP中的一类。抗菌剂耐药性的增长和加速了对新型抗菌剂开发的需求。抗菌肽相对于常规抗生素和合成抗菌药剂具有明显的优势，主要包括耐药性出现较慢，广谱的抗生物膜活性以及具有调节宿主免疫反应的能力。抗菌肽对细菌、真菌等微生物广泛的敏感性同时也为研究微生物的耐药机制以及生物进化提供了另外一种工具。

已有许多肽被鉴定为具有不同功效谱的抗菌剂。AMP的多功能性对于药物和临床开发既有好处，也有缺点，因为有许多潜在可能的药物靶标，但同时也可能导致一些副作用。AMP的使用需要微生物学，药物化学和临床前研究的有机结合，尤其是在临床前领域(药代动力学，制剂以及吸收，分布，代谢，排泄和毒性，即ADME-Tox研究)。天然多肽以及化学合成肽仍有许多未知的特性需要研究，特别是在全身毒性方面。人工合理地设计多肽序列以及优化合成策略可以克服天然序列在体外抗菌活性、克服在稳定性等成药性质方面的不足，规避后续开发的风险。

目前，AMP的开发更倾向于局部给药而不是全身给药，这可以降低研发的难度和风险。通过实验和理论药理学的方法，可以提供有针对性策略，人工进行对天然AMP的改造、研究结构—活性关系，预测分子的相关毒性。目前，天然AMPs研究的较多，但是人工设计的具有广谱抗菌活性且具有良好成药性的人工分子却相对较少。因此，通过人工设计，研发易于制备、活性优良、毒性小以及成药性好的非天然多肽，使其能作为候选的生物药物具有十分重要的意义，也是创新多肽药物发展的重要方向。

发明内容

为了弥补现有技术的缺点与不足，克服抗菌肽的活性较低、抗菌谱较窄等问题。首先，本发明首先提供了一种化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽。该多肽可通过固相合成方法制备中间体肽段，经反向高效液相色谱法纯化后，再通过半胱氨酸侧链巯基形成的二硫键偶联，从而获得最终的多肽分子。

其次，本发明同时提供了该具有抗细菌、真菌活性的二聚体多肽的制备方法，本发明所提供的方法技术路线易于操作，制备工艺稳定性较强，合成的肽段中间体以及最终所获得的完整分子质量易于控制，能满足大规模制备及工业化生产的需要。

再次，本发明的另一目的在于提供上述具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽的应用。本发明所涉及的二聚体多肽在浓度为μM水平时具有抗革兰氏阳性菌、抗革兰氏阴性菌以及真菌的活性。同时，该化学合成、制备的二聚体多肽的具有抗细菌、真菌的作用。除了对标准菌株具有良好的药理活性外，对临床分离的耐药菌株也具有较好的抑制作用。

本发明的目的可以通过以下述技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种具有抗细菌及真菌功能的二聚体多肽，所述二聚体多肽由单体1和单体2通过各单体末端的半胱氨酸形成单体间的二硫键制得；其中，所述的单体1选自SEQ ID NO:1(多肽片段序列：KKKRVSRSARAGLQFPVGRIHRHLKAC)所示的氨基酸序列，所述的单体2选自SEQ ID NO:2(多肽片段序列：CAFKKRRWQWKGM)所示的氨基酸序列，该二聚体多肽共由40个氨基酸残基组成，理论分子量为4823.84，理论等电点约为12.14，为具有较强碱性的阳离子多肽。

第二方面，本发明提供一种上述具有抗细菌及真菌功能的二聚体多肽的制备方法，所述方法包括：通过FMOC多肽固相合成技术分别制备序列为KKKRVSRSARAGLQFPVGRIHRHLKAC的多肽片段单体1和序列为CAFKKRRWQWKGM的多肽片段单体2，经反相高效液相色谱(Reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)去除杂质、分离纯化可获得中间肽段产物，将多肽片段单体1和多肽片段单体2溶液混合于离子型缓冲液介质(Tris-HCl buffer)中，利用多肽片段单体1羧基端半胱氨酸的巯基与多肽片段单体2氨基端半胱氨酸的巯基形成多肽片段之间的二硫键，从而将两个肽段偶联起来，再经RP-HPLC纯化可获得终产物。

本发明所述具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽的体外抗菌活性试验结果表明，其对标准菌株和临床菌株(含临床耐药株)具有较好的活性。具体而言，抑制革兰氏阳性菌标准菌株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、藤黄微球菌)的MIC值≤8μM，抑制临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC值＝16μM；抑制革兰氏阴性菌标准菌株(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌)的MIC值≤16μM，抑制临床耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的MIC值＝32μM；抑制真菌标准菌株(白色念珠菌、克柔念株菌、热带念株菌)的MIC值≤8μM，抑制临床耐氟康唑的白色念珠菌的MIC值＝16μM。

第三方面，本发明提供一种该二聚体多肽在制备具有抗细菌和/或抗真菌药物中的应用。

优选地，上述应用中，所述的细菌为革兰氏阳性细菌(含临床耐药菌)或革兰氏阴性细菌(含临床耐药菌)；所述的真菌为念珠菌属菌株(含临床念珠菌属真菌)。

进一步地，上述应用中，所述的革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、藤黄微球菌；上述应用中，所述的革兰氏阴性细菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和流感嗜血杆菌。

进一步地，上述应用中，所述的真菌为白色念珠菌、克柔念株菌和热带念株菌。

第四方面，本发明提供一种药物组合物，包含上述具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽。

优选地，上述药物组合物，还包含该二聚体多肽药学上可接受的盐和/或可接受的辅料。

进一步地，所述辅料选自水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。

更进一步地，所述药物组合物为片剂、凝胶剂及注射剂。

本发明同时提供上述具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽在制备抗细菌和/或真菌药物中的应用。

溶血实验结果表明，本发明所涉及的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽在浓度高达32μM时未出现显著的溶血反应，其安全性较高。

本发明所涉及的上述具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽或/和药物组合物可以根据常规制剂方法制成注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂、凝胶剂等多种剂型。该具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽药物组合物可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、涂抹、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体，或是外用。

相较于现有技术，本发明具有以下优点和有益效果：

此发明所涉及的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽具有优良的抗革兰氏阳性细菌、抗革兰氏阴性细菌以及抗真菌的作用(包括标准菌株和从临床中分离的耐药病原菌)，该二聚体多肽具有广谱的抗菌活性，且人工合成方便，生产成本低廉，安全性较高，适合企业规模化大量生产。因此，在治疗混合感染领域(特别是耐药菌株引起的混合感染)具有良好的开发和应用前景。综上所述，本发明所涉及的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽可为开发新的抗细菌或/和真菌活性物质及其复方制剂提供新的选择。

附图说明

图1是本发明制备的中间体多肽KKKRVSRSARAGLQFPVGRIHRHLKAC的HPLC图。

图2是本发明制备的中间体多肽CAFKKRRWQWKGM的HPLC图。

图3是本发明制备的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽的HPLC图。

图4是本发明制备的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽的质谱图。

图5是本发明制备的二聚体多肽结构示意图；

图6是本发明中所述具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽的溶血活性结果。

图7是本发明中所述具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽的耐盐特性测定。

图8是本发明中所述具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽的耐高温特性测定。

图9是本发明中所述具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽的耐酸碱特性测定。

具体实施方式

为了阐明本发明实施的目的、技术方案和优势，通过以下实施例对本发明进行清楚、完整地描述。所阐述的实施例是本发明实施的一部分，而不是全部。基于本发明中所阐述的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他的实施例(实施方式)，也均属于本发明保护的范围。

【实施例1】本发明所述具有抗细菌、真菌功能二聚体多肽的中间体肽段KKKRVSRSARAGLQFPVGRIHRHLKAC的制备

在此中间体肽段的合成中，运用9-芴甲氧羰基(FMOC)保护氨基端基团，选用4-甲基二苯基甲胺树脂(4-methyl-benzhydrylamine resin·HCl,MBHAresin)为固相载体，HOBt/DCC为缩合剂，由羧基末端向氨基末端延长肽链。用95％三氟乙酸、2.5％水和2.5％三异丙甲硅烷(TIA)的混合液(质量百分比)将其从MBHA树脂上裂解。经乙醚反复几次沉淀后，通过制备型RP-HPLC纯化。使用C18反相制备柱(250mm×20mm，5μm)；流动相：2‰三氟乙酸，0％～55％(体积百分比)乙腈为流动相，1.5mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，保留时间(retention time,RT)为11.231min，经峰面积归一化法计算，其纯度>95％(图1)，冻干后备用。经ESI-QTOF-MS鉴定，其分子量与拟制备多肽中间体相应的理论分子量一致，m/z 1034.8[M+3H]³⁺，m/z776.4[M+4H]⁴⁺，m/z 620.6[M+5H]⁵⁺。

【实施例2】本发明所述具有抗细菌、真菌功能二聚体多肽的中间体肽段CAFKKRRWQWKGM的制备

在此中间体肽段的合成中，运用9-芴甲氧羰基(FMOC)保护氨基端基团，选用4-甲基二苯基甲胺树脂(4-methyl-benzhydrylamine resin·HCl,MBHAresin)为固相载体，HOBt/DCC为缩合剂，由羧基末端向氨基末端延长肽链。用96％三氟乙酸、2％水和2％三异丙甲硅烷(TIA)的混合液(均为质量百分比)将其从MBHA树脂上裂解。乙醚反复多次沉淀后，经制备型RP-HPLC纯化。使用C18反相制备柱(20mm×250mm，5μm)；流动相：1‰三氟乙酸，0％-60％(体积百分比)乙腈为流动相，1.0mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，RT为9.075min，其纯度>95％(图2)，冻干后备用。经ESI-QTOF-MS鉴定，其分子量与拟制备多肽中间体相应的理论分子量一致，m/z 863.9[M+2H]²⁺，m/z 576.4[M+3H]³⁺，m/z 432.1[M+4H]⁴⁺。

【实施例3】本发明所述具有抗细菌、真菌功能二聚体多肽的制备

以上述实施例1和实施例2中通过固相合成、色谱纯化所制备的中间体肽段KKKRVSRSARAGLQFPVGRIHRHLKAC以及CAFKKRRWQWKGM为原料。各取2.5mg与5mL EP管中，用4mL浓度为0.15M(pH值为11.5)的Tris-HCl缓冲液溶解。拧紧管盖后用Parafilm封口膜密封，确认管口无漏液后，上下颠倒EP管加速多肽的溶解。将盛有多肽溶液的EP管放入恒温摇床中于25℃～28℃，60rpm孵育约40h。于4℃12000rmp高速离心3min，取上清液。经制备型RP-HPLC纯化。使用C18反相制备柱(20mm×250mm，5μm)；流动相：2‰三氟乙酸，0％～75％(体积百分比)乙腈为流动相，1.0mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，RT为15.245min，其纯度>95％(图3)，冻干后备用。经ESI-QTOF-MS鉴定，其分子量与拟制备多肽中间体相应的理论分子量一致，m/z 1206.8[M+4H]⁴⁺，m/z 965.4[M+5H]⁵⁺，m/z 804.6[M+6H]⁶⁺(图4)。本发明制备的二聚体多肽如图5所示。

【实施例4】本发明所述的二聚体多肽的抗细菌、真菌活性测定

革兰氏阳性菌待测菌株包括标准菌株(金黄色葡萄球菌ATCC 25923、表皮葡萄球菌ATCC 35984、枯草芽孢杆菌ATCC 2233、李斯特菌ATCC 19111和藤黄微球菌ATCC9341)以及临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。革兰氏阴性菌待测菌株包括标准菌株(大肠杆菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、铜绿假单胞菌ATCC27853、鲍曼不动杆菌ATCC19606和流感嗜血杆菌ATCC10211)以及临床分离耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌；真菌待测菌株包括标准菌株(白色念珠菌ATCC10231、克柔念珠菌ATCC6258和热带念株菌ATCC66029)以及临床分离的耐氟康唑的白色念珠菌。

其中标准菌株购自中国典型培养物保藏中心(China Center of Type CultureCollection,CCTCC)，临床分离的耐药病原菌由武汉大学人民医院检验医学中心提供。采用倍比稀释法测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)，通过MIC值表征该二聚体多肽的抗菌活性。

具体方法如下：

将待测菌株用三区划线法分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基平板中，于37℃恒温培养箱中倒置培养14小时。用接种环挑取单菌落分别转接到灭菌的液体LB培养基中，于37℃、160rpm条件下在震荡培养至对数生长期。用紫外分光光度计测定600nm波长处菌液的吸光度值(OD₆₀₀)，根据1OD≈1×10⁹CFU/mL的换算关系，分别将标准菌株以及临床耐药菌株的菌液用培养基稀释至(1～2)×10⁵CFU/mL。

首先在无菌96孔板中先加入100μL灭菌的LB培养基；接下来将用灭菌的LB培养基所溶解的浓度为64μmol/L的多肽溶液100μL加入到第1孔中，混合均匀后取100μL加入第2孔中，从第6孔吸出100μL弃去，依次二倍稀释；最后向各孔中加入浓度为1×10⁵CFU/mL稀释好的菌液100μL，混合均匀。未加入多肽的各孔作为阴性对照。

以上各组于37℃震荡培养18～24小时，测定波长为600nm处的吸光度值。最小抑菌浓度(MIC)取检测不到细菌生长(OD₆₀₀≤0.05)的孔中多肽的终浓度的最低值。阴性对照孔中菌液均浑浊，且在600nm处的吸光度OD₆₀₀＞3。本发明所述的该二聚体多肽的抗菌活性结果如表1。

表1本发明所述二聚体多肽的抗细菌、真菌活性

从表1中的结果可以看出，本发明所涉及的二聚体多肽具有较好的抗革兰氏阳性菌、抗革兰氏阴性菌以及抗念珠菌属真菌的活性(抗标准菌株的MIC值≤16μM)。除标准菌株外，对临床分离的革兰氏阳性病原耐药菌(MRSA)、革兰氏阴性临床耐药菌(耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌)和临床耐药真菌(耐氟康唑白色念珠菌)亦具有一定的抑制作用(MIC≤32μM)。

【实施例5】本发明所述具有抗细菌、真菌功能二聚体多肽的溶血活性测定

从健康供体获得新鲜血液，分离人红细胞后制成悬液，以灭菌生理盐水为阴性对照、以1％的Triton X-100为阳性对照，测定该二聚体多肽的溶血活性。

具体步骤如下：用EDTA抗凝管收集全血，轻轻颠倒使血液充分抗凝，于室温800rpm离心3min，弃去上层血浆保留下层红细胞；加入3倍体积的灭菌生理盐水，轻轻颠倒使离心管使底部的红细胞悬浮，于室温下500rpm离心5min，弃去上清保留沉淀下来的红细胞，重复操作3次，至上清液无色为止；用灭菌生理盐水将红细胞制成2％(v/v)浓度的细胞悬液；用灭菌生理盐水将该多肽溶解并配成64μmol/L、32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L和2μmol/L浓度的溶液；将100μL该二聚体多肽溶液和100μL红细胞悬浮液混合并加入至96孔板中，多肽的终浓度分别为32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L和1μmol/L；阴性对照组为用灭菌生理盐悬浮的红细胞，阳性对照为用含1％TritonX-100的灭菌生理盐悬浮的红细胞；将样品放入恒温摇床中，于37℃下100rpm孵育60min；于室温将样品以2500rpm离心6min，每孔中取100μL上清液转移至另一96孔板中；用全波长酶标仪测定490nm波长处的吸光度，并通过以下公式计算溶血百分率，公式中H为490nm波长处的吸光度：溶血率(％)＝(H_sample-H_negative)/(H_positive-H_negative)×100％，如图6所示。

结果表明，本发明所述的二聚体多肽在终浓度高达32μmol/L时仍未出现明显的溶血作用(溶血率≤12.5％)。

【实施例6】本发明所述具有抗细菌、真菌功能二聚体多肽的耐盐特性测定

将本发明所述的二聚体多肽分别用0mM、75mM、150mM、300mM、450mM和600mM灭菌的NaCl溶液溶解，并配成浓度为64μM的多肽溶液。选取革兰氏阳性标准菌株(表皮葡萄球菌ATCC35984)作为测试用菌株，按实施例4中所使用的二倍稀释法测定在不同浓度盐溶液中本发明所述二聚体多肽抑制表皮葡萄球菌ATCC35984的MIC值，结果如图7所示。

图7中的数据表明，随着盐浓度的升高，本发明所述所述二聚体多肽的抗菌活性逐渐减低，MIC值波动在8倍以内(1～8μM)，说明盐浓度对该二聚体多肽的抗菌活性影响不大；值得注意的是在盐浓度≤300mM时(生理条件下盐浓度约为150mM)，该二聚体多肽抗抑制表皮葡萄球菌ATCC35984的活性与实施例4中相应的MIC值无变化(均为1μM)；而当盐浓度高达450mM和600mM时，其MIC值分别为2μM和8μM，较之于生理盐浓度条件下对应的MIC值分别增大了2倍和8倍。

【实施例7】本发明所述具有抗细菌、真菌功能二聚体多肽的耐高温特性测定

将本发明所述的二聚体多肽用灭菌PBS溶液溶解，并配成浓度为128μM的多肽溶液，分别在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃和75℃恒温环境中孵育2小时。按照实施例4中的方法，选择表皮葡萄球菌ATCC35984为测试菌株，测定本发明所述二聚体多肽在不同温度环境下孵育后的抗菌活性的变化，结果如图8所示。

图8中的结果表明，在25℃～45℃范围内该二聚体多肽对所测定的标准菌株表皮葡萄球菌ATCC35984的MIC值与实施例4中的结果无变化。但随着温度继续升高，本发明所述该二聚体多肽的抗微生物活性有所降低。在55℃、65℃、75℃环境中孵育2小时后该二聚体多肽抗表皮葡萄球菌ATCC35984的MIC值较之于实施例4中的MIC值分别升高了的4倍、4倍和8倍。上述结果表明，本发明所涉及的二聚体多肽在25℃～45℃温度范围非常稳定；在55℃～65℃温度范围的环境中活性虽有所降低仍，但仍然具有一定的抗菌活性。

【实施例8】本发明所述具有抗细菌、真菌功能二聚体多肽的耐酸碱特性测定

将本发明所述具有抗细菌、真菌功能二聚体多肽分别用HCl或NaOH调节酸碱度，配成pH值分别为3、5、7、9、11的灭菌PBS溶液，用不同酸碱度的灭菌PBS溶液溶解，并配成浓度为128μM的二聚体多肽溶液。按照实施例4中的方法，选取表皮葡萄球菌ATCC35984测定本发明所述二聚体多肽在不同酸碱度环境下的抗菌活性，结果如图9所示。

图9中的数据表明，在pH 7～9范围内(生理pH约为7.4)其对所测定的标准菌株的MIC值与实施例4中的结果无变化(MIC＝1μM)；随着pH值的升高碱性增强(pH＝11)，本发明所述二聚体多肽的抗菌活性稍有降低(MIC＝2μM)；但随着pH值降低酸性增强，本发明所述二聚体多肽的抗菌活性显著降低(pH＝5，MIC＝4μM；pH＝3，MIC＝16μM)。因此，本发明所述二聚体多肽对酸性环境更敏感，pH＝5、pH＝3时其抑制株菌的MIC值分别是pH＝7时的4倍和16倍，pH＝11时抑制株菌的MIC值是pH＝7时的2倍。上述结果表明，本发明所涉及的二聚体多肽在生理pH环境下活性稳定，碱性环境中其活性具有一定的稳定性，而在酸性环境中稳定性相对较弱。

【实施例9】片剂

取本发明所述的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽0.2g、淀粉2.5g、糊精3g混合，质量浓度为40％的药用级聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为粘合剂，制粒，整粒，压片，既得片剂。

【实施例10】凝胶剂

取12mL蒸馏水，将卡波姆撒于液面上，搅拌使之充分溶胀。加入丙二醇混合均匀，然后边搅拌边加入三乙醇胺使其成为凝胶基质；将本发明所述的具有抗细菌、真菌功能二聚体多肽0.05g溶于浓度为0.15M的PBS缓冲液中(pH＝7.4)，在不断搅拌下将其缓慢加入凝胶基质中。最后加入剩余蒸馏水，制得20g二聚体多肽凝胶。

【实施例11】注射用冻干粉

取本发明所述的具有抗细菌、真菌功能的二聚体多肽1.5g、甘露醇15g，置于容器中，加适量PBS缓冲液(0.15M,pH7.4)溶解，加注射用水至250mL，摇匀，加6～10g针用活性炭，室温搅拌约45分钟，粗滤，用0.22μm灭菌滤膜过滤除菌，分装，每瓶1.5mL，采用速冻的方法，每分钟降温10～20℃，降温至-45～-50℃，维持3小时，抽真空，在真空状态下缓慢升温，升温速度每小时2～6℃，温度升至～25℃时停止升温，待温度接近室温后取出，加盖密封，既得冻干粉针剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 化学合成的具有抗细菌、真菌作用的二聚体多肽、制备方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 多肽片段序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Lys Lys Lys Arg Val Ser Arg Ser Ala Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro

1 5 10 15

Val Gly Arg Ile His Arg His Leu Lys Ala Cys

20 25

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 多肽片段序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Cys Ala Phe Lys Lys Arg Arg Trp Gln Trp Lys Gly Met

1 5 10

Claims (10)

1.一种化学合成的二聚体多肽，其特征在于：所述二聚体多肽由单体1和单体2通过其氨基酸序列中半胱氨酸残基上的巯基形成单体间的二硫键来偶联；所述的单体1为SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，所述的单体2为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，该二聚体多肽共由40个氨基酸残基组成，理论分子量为4823.84，理论等电点12.14，为强碱性阳离子肽。

2.一种制备如权利要求1所述化学合成的二聚体多肽的方法，其特征在于：

所述方法为：通过FMOC固相多肽合成法分别制备序列为SEQ ID NO:1的单体1和序列为SEQ ID NO:2的单体2，经反相高效液相色谱分离纯化及质谱测定分子量可获得中间产物；在离子型缓冲液介质Tris-HCl buffer中，利用单体1和单体2末端半胱氨酸的巯基，通过分子间二硫键配对将两个肽段连接起来，再经RP-HPLC纯化可获得终产物。

3.一种如权利要求1所述化学合成的二聚体多肽在制备具有抗细菌和/或抗念珠菌药剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的细菌为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌或藤黄微球菌中任一种；所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌或流感嗜血杆菌中任一种。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述的念珠菌属真菌为白色念珠菌、克柔念珠菌或热带念株菌中任一种。

7.一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求1所述的二聚体多肽。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于：还包含权利要求1所述的二聚体多肽药学上可接受的盐和/或可接受的辅料。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述辅料为水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂或渗透压调节剂中任一种。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或凝胶剂中任一种。

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