CN112625092B - 一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物及其合成与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学技术领域，特别是涉及一种基于polybia‑MPI的抗菌多肽化合物及其合成与应用，本发明提供了一种基于polybia‑MPI的抗菌多肽化合物，还提供了一种基于polybia‑MPI的抗菌多肽化合物的合成方法，其包括以下步骤：S1、树脂预处理；S2、脱Fmoc保护；S3、缩合反应；S4、肽链的延长；S5、多肽的裂解和S6、粗肽的纯化。本发明通过D‑Ala对polybia‑MPI抗菌肽中的氨基酸逐个扫描，在更接近生理环境下，找到多肽序列中影响体内稳定性的关键位点并分析替换，同时对替换后的类似物进行了稳定性、体内体外抗菌活性、毒副作用的研究，得到稳定性和抗菌活性提高而毒性降低的新型抗菌多肽化合物。

Description

一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物及其合成与应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，特别是涉及一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物及其合成与应用。
背景技术
青霉素等抗生素的不断发现，极大改善了细菌感染类疾病的治疗状况。但是近年来抗生素的过度使用和误用，导致细菌耐药性感染逐渐成为威胁人类健康的全球性问题，因此面对传统抗生素疗效差、甚至无效的现状，新型抗菌药物的开发显得极为必要和迫切。
抗菌肽又称为宿主防御肽，是生物进化过程中保留下来的抵抗病原体感染的第一道防线。抗菌肽分布广泛，在节肢动物、软体动物、鱼类、两栖类、哺乳动物、植物以及细菌等各种生物体中被发现和分离。随着对其研究的不断深入，人们发现抗菌肽除了具有抗菌活性外，还有抗肿瘤、抗病毒、抗生物膜感染、伤口愈合、参与免疫应答等多种生物活性。大部分抗菌肽能通过静电作用吸附于细菌细胞膜表面，通过膜扰动或破坏细胞膜而发挥抗菌活性。相比传统抗生素，抗菌肽具有短时间内快速杀菌的特点，因此抗菌肽对耐药菌有效且不易引起耐药的产生，是目前非常吸引人的抗生素研究热点。然而抗菌肽天然含量极低，合成成本高；易被体内蛋白酶降解而使得半衰期短、生物利用度低；生理条件下易受体内盐离子影响而导致活性降低；存在溶血等毒副作用。虽然目前已有Magainin、Mellittin等抗菌肽家族用于临床抗感染研究，但迄今还没有可用于临床的抗菌肽药物。因此选择有潜力的天然抗菌肽分子，通过化学修饰提高体内稳定性并降低毒副作用，是发现新型抗菌肽类抗生素的有效途径。
多肽分子的稳定性修饰中，常用策略包括多肽序列N端和C端修饰、非天然氨基酸替换、脂肪酸引入、环化及聚乙二醇化等，其中D型氨基酸的替换是一种常用的提高多肽稳定性的方法。体内的蛋白酶能识别由天然L型氨基酸构成的多肽并降解，然而无法有效识别D型氨基酸。现有研究中，针对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白酶的特定水解位点，选择相应的D型氨基酸进行替换，甚至完全用D型氨基酸替换来提高酶解稳定性。如人防御素家族多肽LL-37的片段EFK-17中引入D型氨基酸后稳定性提高了10％；蜂毒抗菌肽全部用相应D型氨基酸替换后，对人血浆中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的稳定性都有明显提高。然而，血浆中的蛋白酶组成和作用非常复杂，包括纤溶酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、外切蛋白酶、基质金属蛋白酶多个家族，仅用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等个别特定的蛋白酶来研究多肽分子的体内稳定性还存在不足，需要针对体内环境发展更为系统性的研究方法。
polybia-MPI是2005年Bibiana M.Souza等从巴西黄蜂的毒液中分离出的阳离子抗菌肽，研究表明polybia-MPI具有广谱的抗菌活性，且对耐药菌有效；可选择性抑制真菌的生长，并以剂量依赖的方式抑制生物膜的形成；具有较好的抗肿瘤活性，且能在低剂量下杀死多药耐药肿瘤细胞，而对正常细胞表现出较低的毒性；研究表明polybia-MPI通过膜裂解机制发挥抗菌和抗肿瘤作用。虽然polybia-MPI能作用于多种病原体，表现出了很好的应用前景，但是polybia-MPI很容易被蛋白酶水解而导致体内稳定性差，限制了在治疗中的进一步应用。目前也有以polybia-MPI稳定性提高为目的进行的化学修饰研究，如YanyanZhao等用D-Lys替换polybia-MPI序列中的Lys，得到类似物D-Lys-MPI虽然血浆稳定性有所提高，但是伴随着抗菌活性的显著下降，另外通过全D型氨基酸替换得到的类似物D-MPI在保留了抗菌活性的同时血浆稳定性有所提高，但是D型氨基酸的成本远高于L型氨基酸，在很大程度上增加了多肽的修饰成本。Beijun Liu等对polybia-MPI进行分子内环化来提高稳定性，但是得到的类似物或者抗菌活性下降，或者表现出较高的溶血副作用。
发明内容
本发明的目的是利用D型氨基酸不易被体内的蛋白酶识别、可有效提高多肽分子体内稳定性的特点，提供一种基于polybia-MPI的稳定性高、抗菌活性好、毒性低的抗菌多肽化合物及其合成与应用方法，通过D-Ala对抗菌肽中的氨基酸逐个扫描，在更接近生理环境下，找到多肽序列中影响体内稳定性的关键位点并分析替换，同时对替换后的类似物进行了稳定性、体内体外抗菌活性、毒副作用的研究，得到稳定性和抗菌活性提高而毒性降低的新型抗菌多肽化合物[D-Ala2]-MPI，解决了上述背景技术中提出的问题。
本发明提供了一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物，其结构如下：Ile-D-Ala-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys-Gln-Ile-Leu-NH2。
本发明还提供了一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物的合成方法，其包括以下步骤：
S1、树脂预处理：向合成仪中加入0.3mmol取代度为0.43mmol/g的MBHA树脂，加入10mL重蒸无水二氯甲烷(DCM)搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干，用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，茚检颜色无改变表明树脂正常；
S2、脱Fmoc保护：在氩气保护条件下，向步骤S1得到的合成仪中加入10mL体积比为20％的哌啶的DMF溶液，搅拌3min后减压抽干，重复2次，再用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，当树脂颜色为蓝紫色时，表明Fmoc保护基已完全脱除；
S3、缩合反应：各称取0.9mmol的Fmoc-氨基酸(Fmoc-AA)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、O-苯并三氮唑-N,N,N’和N’-四甲基脲-六氟磷酸脂(HBTU)，加入少量DMF完全溶解，再加入1.8mmol的二异丙基乙基胺(DIEA)充分混匀，活化氨基酸后立即加入步骤S2得到的含有已脱保护树脂的合成仪中，氩气保护条件下搅拌1h进行缩合反应，反应结束后减压抽干，用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，当树脂显淡黄色透亮时，表明缩合反应完全；
S4、肽链的延长：不断重复进行步骤S2和S3，重复将S3得到的树脂按照[D-Ala2]-MPI由羧基向氨基的序列顺序，依次加入相应的Fmoc-AA进行缩合，直至所有氨基酸连接完毕；
S5、多肽的裂解：按步骤S2的方法，脱去步骤S4氨基酸连接完毕后得到的肽链N-末端最后一个连接的Fmoc保护基，将得到的多肽依次用DCM和甲醇交替洗涤3次，每次3min，密封合成仪，真空抽干时间为2小时以上，树脂完全干燥后加入10mL裂解试剂，室温反应3h，反应期间每隔20min搅拌1min，反应完成后收集裂解试剂，用5mL的TFA洗涤收集到的裂解试剂，洗涤两次，每次5min，合并裂解试剂与所得滤液得到样品溶液，用旋转蒸发仪减压除去所得样品溶液中的裂解试剂及TFA，加入预先冷却的乙醚并用力振荡，静置后滤去上清液，得到样品沉淀，用水充分溶解所得沉淀后，用分液漏斗萃取除去乙醚，收集水相，将收集到的水相冷冻干燥，得到白色固体粉末状的[D-Ala2]-MPI粗肽；
S6、粗肽的纯化：以20％的乙酸溶液作为流动相，选用Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱，对步骤S5得到的粗肽进行脱盐处理，用核酸蛋白紫外检测仪在254nm监测并收集主峰，冷冻干燥后进行高效液相色谱纯化，在220mm处收集主峰后，冷冻干燥得到纯度95％以上的白色固体粉末产物[D-Ala2]-MPI，产物收率为60％。
优选的，步骤S5中，所述裂解试剂的组分为Tis、TFA和H2O，其中各组分的体积比为Tis:TFA:H2O＝25:95:2.5。
优选的，步骤S6中，所述高效液相色谱纯化的具体步骤如下：选用规格为10μm，19×250mm的Waters XBridge BEH130 Prep C18反相柱，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系以20％-80％/60min梯度进行洗脱，洗脱时的流速为8mL/min。
本发明提供了一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物在制备抗菌药物中的应用，其中所述抗菌药物中的菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
本发明的另一个目的在于提供一种抗菌药物。
优选的，所述抗菌药物中的活性成分包括有基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物[D-Ala2]-MPI。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过利用所有D型氨基酸中侧链结构最为简单、成本较低的D-Ala对抗菌肽中的氨基酸进行稳定性扫描，在更接近生理环境下，找到多肽序列中影响体内稳定性的关键位点并分析替换，得到一种基于抗菌肽polybia-MPI的高稳定性抗菌多肽化合物[D-Ala2]-MPI，同时对替换后的类似物进行了稳定性、体内体外抗菌活性、毒副作用的研究，发现其对革兰氏阴性菌和阳性菌均有显著的抗菌活性，同时对正常细胞毒性和溶血副作用较低。同时[D-Ala2]-MPI可以通过膜裂解机制发挥抗菌活性，且不易引起细菌产生耐药性，在小鼠腹膜炎模型中表现出良好的体内抗菌活性，在制备新型抗菌药物中具有很好的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明polybia-MPI的D-Ala扫描类似物的血浆稳定性示意图；
图2为本发明[D-Ala2]-MPI的血浆稳定性示意图；
图3为[D-Ala2]-MPI对小鼠血红细胞的体外溶血活性示意图；
图4为[D-Ala2]-MPI对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7的细胞毒性示意图；
图5为[D-Ala2]-MPI的体内抗菌活性示意图；
图6为[D-Ala2]-MPI作用后E.coli 25922经PI染色后的激光共聚焦图；
图7为SEM观察[D-Ala2]-MPI作用后E.coli 25922的形态学变化图；
图8为[D-Ala2]-MPI对E.coli 25922的诱导耐药作用示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物，其结构如下：Ile-D-Ala-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys-Gln-Ile-Leu-NH2。
本发明以D-Ala对抗菌肽polybia-MPI中的氨基酸进行逐个位点替换扫描，具体构建的类似物结构序列表如表1所示，其中使用的氨基酸除了D-Ala以外，均为L型氨基酸，其中Ile为异亮氨酸，Asp为天冬氨酸，Trp为色氨酸，Lys为赖氨酸，Leu为亮氨酸，Ala为丙氨酸，Gln为谷氨酰胺。
本发明提供了一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物的合成方法，其包括以下步骤：
S1、树脂预处理：向合成仪中加入0.3mmol取代度为0.43mmol/g的MBHA树脂，加入10mL重蒸无水二氯甲烷(DCM)搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干，用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，茚检颜色无改变表明树脂正常；
S2、脱Fmoc保护：在氩气保护条件下，向步骤S1得到的合成仪中加入10mL体积比为20％的哌啶的DMF溶液，搅拌3min后减压抽干，重复2次，再用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，当树脂颜色为蓝紫色时，表明Fmoc保护基已完全脱除；
S3、缩合反应：各称取0.9mmol的Fmoc-氨基酸(Fmoc-AA)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、O-苯并三氮唑-N,N,N’和N’-四甲基脲-六氟磷酸脂(HBTU)，加入少量DMF完全溶解，再加入1.8mmol的二异丙基乙基胺(DIEA)充分混匀，活化氨基酸后立即加入步骤S2得到的含有已脱保护树脂的合成仪中，氩气保护条件下搅拌1h进行缩合反应，反应结束后减压抽干，用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，当树脂显淡黄色透亮时，表明缩合反应完全；
S4、肽链的延长：不断重复进行步骤S2和S3，重复将S3得到的树脂按照多肽由羧基向氨基的序列顺序，依次加入相应的Fmoc-AA进行缩合，直至所有氨基酸连接完毕；
S5、多肽的裂解：按步骤S2的方法，脱去步骤S4氨基酸连接完毕后得到的肽链N-末端最后一个连接的Fmoc保护基，将得到的树脂依次用DCM和甲醇交替洗涤3次，每次3min，密封合成仪，真空抽干时间为2小时以上，树脂完全干燥后加入10mL裂解试剂，室温反应3h，反应期间每隔20min搅拌1min，反应完成后收集裂解试剂，用5mL的TFA洗涤收集到的裂解试剂，裂解试剂的组分为Tis、TFA和H2O，其中各组分的体积比为Tis:TFA:H2O＝25:95:2.5，洗涤两次，每次5min，合并裂解试剂与所得滤液得到样品溶液，用旋转蒸发仪减压除去所得样品溶液中的裂解试剂及TFA，加入预先冷却的乙醚并用力振荡，静置后滤去上清液，得到样品沉淀，用水充分溶解所得沉淀后，用分液漏斗萃取除去乙醚，收集水相，将收集到的水相冷冻干燥，得到白色固体粉末状的粗肽，该粗肽为D-Ala逐个位点扫描的polybia-MPI类似物；
S6、polybia-MPI类似物的纯化：以20％的乙酸溶液作为流动相，选用SephadexG25交联葡聚糖凝胶柱，对步骤S5得到的粗肽进行脱盐处理，用核酸蛋白紫外检测仪在254nm监测并收集主峰，冷冻干燥后进行高效液相色谱纯化，选用规格为10μm，19×250mm的Waters XBridge BEH130 Prep C18反相柱，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系以20％-80％/60min梯度进行洗脱，洗脱时的流速为8mL/min，在220mm处收集主峰后，冷冻干燥得到纯度95％以上的白色固体粉末polybia-MPI类似物，产物收率为60％。
S7、polybia-MPI类似物的纯度分析与表征：选用规格为10μm，4.6×250mm的Waters SunFire C18反相分析柱，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系以10％-90％/30min梯度进行洗脱，洗脱时的流速为1mL/min，通过保留时间计算多肽纯度，用Bruker maXis 4G离子电喷雾质谱(ESI-MS)对纯化后的polybia-MPI类似物进行表征。上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致，其理化特征见表1，表中：a为多肽的理论计算分子质量，b为质谱表征多肽实际测得的分子质量。
表1 D-Ala逐个位点扫描polybia-MPI类似物的序列与理化性质
Figure GDA0003852443670000091
本发明还提供了一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物[D-Ala2]-MPI在制备抗菌药物中的应用，其中：抗菌药物中的菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，抗菌药物中的活性成分包括有基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物[D-Ala2]-MPI。
D-Ala逐个位点扫描polybia-MPI类似物的血浆稳定性分析
取健康昆明系雌性小鼠，摘眼球取血，将血液收集至浓度为2mg/mL、含100μL肝素钠溶液的1.5mL离心管中，在4℃静置12h，在3000rpm下离心15min，吸取上清液即为血浆。将polybia-MPI类似物用生理盐水配制成10mM溶液，将285μL的血浆与15μL的Lpolybia-MPI类似物溶液混匀(其中polybia-MPI类似物含量为5％)。混合后在0min、30min、60min、120min、180min、240min时间点分别取样40μL，立即加入等体积的冰乙腈终止反应，13000×g条件下离心15min，吸取上清液进行HPLC分析。取用规格为5μm，4.6×250mm的Waters SunFire C18反相分析柱，用5％-95％乙腈/水/0.1％三氟乙酸洗脱30min，流速为1mL/min。根据polybia-MPI类似物的分析谱图和含量计算酶解率，计算公式为：酶解率＝(1-各时间点峰面积/0min时的峰面积)×100％
稳定性分析结果如图1所示，[D-Ala1]-MPI、[D-Ala2]-MPI、[D-Ala3]-MPI、[D-Ala11]-MPI的稳定性相比polybia-MPI明显提高，可以发现polybia-MPI体内的主要蛋白酶敏感位点是其1位、2位、3位和11位。
基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物[D-Ala2]-MPI及其合成
一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物[D-Ala2]-MPI，其结构如下：Ile-D-Ala-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys-Gln-Ile-Leu-NH2。
一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物的合成方法，是在MBHA树脂上，通过Fmoc保护的方法，采用逐个接长合成固相多肽，具体包括以下步骤：
S1、树脂预处理：向合成仪中加入0.3mmol取代度为0.43mmol/g的MBHA树脂，加入10mL重蒸无水二氯甲烷(DCM)搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干，用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，茚检颜色无改变表明树脂正常；
S2、脱Fmoc保护：在氩气保护条件下，向步骤S1得到的合成仪中加入10mL体积比为20％的哌啶的DMF溶液，搅拌3min后减压抽干，重复2次，再用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，当树脂颜色为蓝紫色时，表明Fmoc保护基已完全脱除；
S3、缩合反应：各称取0.9mmol的Fmoc-氨基酸(Fmoc-AA)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、O-苯并三氮唑-N,N,N’和N’-四甲基脲-六氟磷酸脂(HBTU)，加入少量DMF完全溶解，再加入1.8mmol的二异丙基乙基胺(DIEA)充分混匀，活化氨基酸后立即加入步骤S2得到的含有已脱保护树脂的合成仪中，氩气保护条件下搅拌1h进行缩合反应，反应结束后减压抽干，用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，当树脂显淡黄色透亮时，表明缩合反应完全；
S4、肽链的延长：不断重复进行步骤S2和S3，重复将S3得到的树脂按照[D-Ala2]-MPI由羧基向氨基的序列顺序，依次加入相应的Fmoc-AA进行缩合，直至所有氨基酸连接完毕；
S5、多肽的裂解：按步骤S2的方法，脱去步骤S4氨基酸连接完毕后得到的肽链N-末端最后一个连接的Fmoc保护基，将得到的树脂依次用DCM和甲醇交替洗涤3次，每次3min，密封合成仪，真空抽干时间为2小时以上，树脂完全干燥后加入10mL裂解试剂，室温反应3h，反应期间每隔20min搅拌1min，反应完成后收集裂解试剂，用5mL的TFA洗涤收集到的裂解试剂，裂解试剂的组分为Tis、TFA和H2O，其中各组分的体积比为Tis:TFA:H2O＝25:95:2.5，洗涤两次，每次5min，合并裂解试剂与所得滤液得到样品溶液，用旋转蒸发仪减压除去所得样品溶液中的裂解试剂及TFA，加入预先冷却的乙醚并用力振荡，静置后滤去上清液，得到样品沉淀，用水充分溶解所得沉淀后，用分液漏斗萃取除去乙醚，收集水相，将收集到的水相冷冻干燥，得到白色固体粉末状的[D-Ala2]-MPI粗肽；
S6、粗肽的纯化：以20％的乙酸溶液作为流动相，选用Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱，对步骤S5得到的粗肽进行脱盐处理，用核酸蛋白紫外检测仪在254nm监测并收集主峰，冷冻干燥后进行高效液相色谱纯化，选用规格为10μm，19×250mm的Waters XBridgeBEH130 Prep C18反相柱，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系以20％-80％/60min梯度进行洗脱，洗脱时的流速为8mL/min，在220mm处收集主峰后，冷冻干燥得到纯度95％以上的白色固体粉末产物[D-Ala2]-MPI，产物收率为60％。
S7、粗肽的纯度分析与表征：选用规格为10μm，4.6×250mm的Waters SunFire C18反相分析柱，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系以10％-90％/30min梯度进行洗脱，洗脱时的流速为1mL/min，通过保留时间计算多肽纯度，用Bruker maXis 4G离子电喷雾质谱(ESI-MS)对纯化后的[D-Ala2]-MPI进行表征，经过质谱和色谱分析检测，证明所得多肽为[D-Ala2]-MPI，表征结果见表1。
抗菌多肽[D-Ala2]-MPI的血浆稳定性分析
取用健康昆明系雌性小鼠，摘眼球取血，将血液收集至浓度为2mg/mL、含100μL肝素钠溶液的1.5mL离心管中，在4℃静置12h，在3000rpm下离心15min，吸取上清液即为血浆。将polybia-MPI类似物用生理盐水配制成10mM溶液，将285μL的血浆与15μL的Lpolybia-MPI类似物溶液混匀(其中[D-Ala2]-MPI含量为5％)。混合后在0min、30min、60min、120min、180min、240min时间点分别取样40μL，立即加入等体积的冰乙腈终止反应，13000×g条件下离心15min，吸取上清液进行HPLC分析。取用规格为5μm，4.6×250mm的Waters SunFire C18反相分析柱，用5％-95％乙腈/水/0.1％三氟乙酸洗脱30min，流速为1mL/min。
根据[D-Ala2]-MPI的分析谱图和含量计算酶解率，计算公式为：
酶解率＝(1-各时间点峰面积/0min时的峰面积)×100％。
稳定性分析结果如图2所示，[D-Ala2]-MPI的稳定性相比polybia-MPI显著提高，在240min时，仅有55％[D-Ala2]-MPI被蛋白酶降解，而有87％的polybia-MPI被蛋白酶降解。
抗菌多肽[D-Ala2]-MPI的盐稳定性分析
模拟体内环境在不同盐离子环境下检测[D-Ala2]-MPI对E.coil(ATCC 25922)的抗菌活性，采用的盐溶液为150mM的NaCl、4.5mM的KCl、6μM的NH4Cl和2mM的CaCl2。具体实验方法为：挑取细菌单克隆于已灭菌的3mL MH培养基中，37℃条件下，180rpm摇床培养5-6h至菌液浓度达到108-109CFU/mL。将菌液用已灭菌的MH培养基稀释至1×106CFU/mL的工作菌液，同时根据二倍稀释法将[D-Ala2]-MPI稀释至1-128mol/L浓度梯度，以MH肉汤为阴性对照，分别取不同浓度[D-Ala2]-MPI溶液50μL加入96孔板中，再加入50μL工作菌液和50μL盐溶液，每组设3个平行样，混匀后于37℃恒温培养箱孵育12-14h，以肉眼可见的菌液完全澄清的孔对应的[D-Ala2]-MPI浓度为MIC值。实验结果如表2所示，[D-Ala2]-MPI的抗菌活性未受钠盐、钾盐和铵盐影响，且仍优于polybia-MPI，说明[D-Ala2]-MPI在模拟体内的盐离子环境下较为稳定。
表2不同盐离子环境中[D-Ala2]-MPI的抗菌活性
Figure GDA0003852443670000131
抗菌多肽[D-Ala2]-MPI的体外抗菌活性分析
采用肉汤微量稀释法，通过检测药物对革兰氏阳性菌和革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度(MIC)来评价抗菌活性，其具体实验方法为：挑取细菌单克隆于已灭菌的3mL MH肉汤培养基中，37℃条件下，180rpm摇床培养5-6h至菌液浓度达到108-109CFU/mL。将菌液用已灭菌MH培养基稀释至1×106CFU/mL的工作菌液，同时根据二倍稀释法将[D-Ala2]-MPI稀释至1-128mol/L浓度梯度，以MH肉汤为阴性对照，分别取不同浓度[D-Ala2]-MPI溶液100μL加入96孔板中(每组设3个平行样)，再加入100μL工作菌液，混匀后置于37℃恒温培养箱孵育12-14h，以肉眼可见菌液无明显浑浊的孔对应的浓度为MIC值。实验结果如表3所示，polybia-MPI对所有测试菌株都表现出了一定的抑菌活性，而[D-Ala2]-MPI除了对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)外，无论是对革兰氏阴性菌如大肠杆菌(E.coli ATCC 25922)、肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniae ATCC 700603)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 27853)，还是对革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌(B.subtilis ATCC 23857)的抗菌活性有了非常显著的提高，表现出较为理想的抗菌活性。
表3 polybia-MPI和[D-Ala2]-MPI的最小抑菌浓度(MIC)
Figure GDA0003852443670000141
抗菌多肽[D-Ala2]-MPI的体外溶血活性分析
抗菌肽常见的的毒副作用主要表现为溶血活性，因此通过测定[D-Ala2]-MPI对小鼠血红细胞的的溶血率评估其毒副作用，其具体实验方法为：取用健康昆明系雌性小鼠，摘眼球取血至含有200μL肝素钠(2mg/mL)溶液的离心管中，1000×g下离心10min，弃去血清后收集血红细胞。用PBS缓冲液轻洗血红细胞3遍，离心收集，并用PBS将其稀释为8％的血红细胞悬液，按照每孔100μL加入96孔板。然后加入不同浓度(12.5-200M)的[D-Ala2]-MPI溶液，同时分别以PBS和0.1％的Triton X-100作为阴性和阳性对照，恒温培养箱37℃孵育1h后，将96孔板在1200×g离心10min，收集上清液，用酶标仪读取450nm吸光值。实验独立重复三次以上，并采用以下公式计算溶血率：
溶血率＝(OD实验组–OD阴性对照)/(OD阳性对照–OD阴性对照)×100％
实验结果如图3所示，[D-Ala2]-MPI在药物浓度达到200μM时，溶血率始终低于6％，相比polybia-MPI降低了10倍，表现出极低的毒副作用。
抗菌多肽[D-Ala2]-MPI的细胞毒性分析
已发现的许多抗菌肽虽然有很好的抗菌活性，但是对宿主细胞也存在着较高的毒性，为了评估[D-Ala2]-MPI对哺乳动物细胞的毒性，采用MTT法测定[D-Ala2]-MPI作用于小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7)的存活率。具体实验方法为：按照细胞密度为1×104个/孔将RAW 264.7细胞种植于96孔板中，37℃于5％的CO2培养箱孵育6h，加入用DMEM配制的不同浓度(6.25-100μM)的[D-Ala2]-MPI溶液100μL，培养箱孵育1h，然后在避光条件下每孔加入10μLMTT，培养箱继续孵育4h。移除含MTT的培养液，加入150μL二甲基亚砜，充分振荡混匀，最后用酶标仪测定其在490nm和570nm处的吸光值。实验独立重复三次以上，并用以下公式计算细胞存活率：
存活率＝(OD实验组/OD对照组)×100％
实验结果如图4所示，RAW 264.7细胞存活率随polybia-MPI浓度的升高逐渐下降，在100μM时仅为6％，而6.25-50μM的[D-Ala2]-MPI处理后，RAW 264.7细胞存活率均大于90％，在药物浓度达到100μM时，细胞存活率仍然是polybia-MPI的3倍，说明[D-Ala2]-MPI对正常细胞的毒性相比polybia-MPI显著降低。
抗菌多肽[D-Ala2]-MPI的体内抗菌活性分析
通过建立小鼠腹腔感染模型来检测[D-Ala2]-MPI的体内抗菌活性，具体实验方法为：6-8周龄雌性昆明系小鼠，分给药组、阴性对照组和阳性对照组，每组6只，适应性饲养一周左右至体重达到19-21g。挑取E.coli(ATCC 25922)单克隆至盛有20mL MH培养基的三角瓶中，37℃恒温摇床180rpm振荡过夜，用生理盐水稀释至工作菌液浊度0.8×107CFU/g，小鼠腹腔注射100μL/只，感染1h后给药。用生理盐水配制浓度为5mg/kg的[D-Ala2]-MPI和polybia-MPI，以及浓度2.5mg/kg的硫酸卡那霉素作为阳性对照，小鼠腹腔注射100μL/只，并以生理盐水为阴性对照，给药1h后眼球取血10μL，生理盐水稀释10倍后滴加到MH平板并涂布均匀，37℃恒温培养16-18h。然后观察平板，数出菌落数，并记录结果。实验独立重复三次以上。
实验结果如图5所示，小鼠腹腔感染E.coli(ATCC25922)后，用阳性对照硫酸卡那霉素可以抑制约1个数量级的菌量，用polybia-MPI能抑制0.5个数量级的菌量。而用[D-Ala2]-MPI治疗能抑制约0.8个数量级的菌量，表明[D-Ala2]-MPI在体内仍然有很好的抑制E.coli(ATCC 25922)的活性，明显优于polybia-MPI。
抗菌多肽[D-Ala2]-MPI的作用机制
(1)碘化丙啶(PI)摄取实验
碘化丙啶(PI)在细胞膜受到损伤后，能够进入细胞并与DNA结合发出红色荧光，因此PI摄取实验可以检测[D-Ala2]-MPI对细胞膜的破坏作用。具体实验方法为：挑取E.coli(ATCC 25922)细菌单克隆于已灭菌的3mL MH肉汤培养基中，37℃条件下，180rpm摇床培养5-6h至对数生长期。将菌液用已灭菌MH培养基稀释至2×108CFU/mL的工作菌液，1000×g离心10min后用已灭菌PBS清洗两次，然后用PBS重悬，并加入等体积的5MIC浓度的[D-Ala2]-MPI，37℃恒温培养1.5h，避光条件下加入20μL PI(浓度100μg/mL)，室温染色10min，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
实验结果如图6所示，[D-Ala2]-MPI与E.coli(ATCC 25922)共孵育，短时间内都能引起细胞膜破裂，导致PI进入细胞内结合DNA而染色。说明抗菌多肽[D-Ala2]-MPI具有细胞膜裂解能力，可以通过破坏细胞膜而导致细菌死亡。
(2)扫描电镜(SEM)观察[D-Ala2]-MPI作用后细菌的形态学改变
通过扫描电镜(SEM)可直接观察[D-Ala2]-MPI作用后E.coil(ATCC 25922)的形态学变化以判断其作用机制，具体实验方法为：挑取E.coli(ATCC 25922)细菌单克隆于已灭菌的5mL MH肉汤培养基中，37℃条件下，180rpm摇床振荡过夜培养至对数生长期。将菌液用已灭菌MH培养基稀释至2×108CFU/mL的工作菌液，1000×g离心10min后用已灭菌PBS清洗两次，然后用PBS重悬，并加入等体积的5MIC浓度的[D-Ala2]-MPI，37℃恒温培养1.5h，10000rpm离心5min后移除上清，加入1mL4％戊二醛固定。4℃静置12h后1000×g离心10min，移除清液后用已灭菌PBS清洗两次。然后分别用20％、50％、80％、100％的乙醇进行梯度脱水，每个浓度脱水10min，脱水后均以1000×g离心10min，最后以少量100％乙醇悬浮沉淀后，将混合物滴加到圆形载玻片上，待无水乙醇挥发后，置于超低温冷冻干燥机中干燥5h，然后扫描电镜观察并拍照。
实验结果如图7所示，[D-Ala2]-MPI与E.coli(ATCC 25922)共孵育1.5h后，可以在扫描电镜下观察到受试菌株表面皱缩，杆状形态发生变化，并伴有膜结构的明显损伤，充分说明[D-Ala2]-MPI是通过膜裂解机制发挥作用。
抗菌多肽[D-Ala2]-MPI的诱导耐药作用分析
抗生素的长期应用是细菌多药耐药性产生的主要原因，因此是否容易引起耐药也是评价新型抗生素的重要指标之一。以硫酸卡那霉素为阳性对照，对[D-Ala2]-MPI进行了诱导耐药实验，具体的实验方法为：首先测试硫酸卡那霉素和[D-Ala2]-MPI对E.coli(ATCC25922)的MIC值，然后分别将[D-Ala2]-MPI和硫酸卡那霉素1/2MIC浓度所对应的三个平行副孔中的菌液转移至1.5mL离心管中，吹打混匀后接种于盛有3mL新鲜MH液体培养基的试管中，37℃条件下180rpm振荡培养5-6h至对数期，用于随后的MIC实验，连续重复20天，实验独立重复三次以上。
实验结果如图8所示，连续二十天诱导耐药实验后，阳性对照硫酸卡那霉素的MIC值由最初的8μM上升到128μM，MIC值增加了16倍。而在同等条件下，类似物[D-Ala2]-MPI的MIC值只增加了4倍，说明[D-Ala2]-MPI相比常规抗生素不易产生耐药性。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (6)

1.一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物，其特征在于，其结构如下：Ile-D-Ala-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys-Gln-Ile-Leu-NH2。
2.一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物的合成方法，其特征在于，其包括以下步骤：
S1、树脂预处理：向合成仪中加入0.3mmol取代度为0.43mmol/g的MBHA树脂，加入10mL重蒸无水二氯甲烷（DCM）搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干，用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，茚检颜色无改变表明树脂正常；
S2、脱Fmoc保护：在氩气保护条件下，向步骤S1得到的合成仪中加入10mL体积比为20%的哌啶的DMF溶液，搅拌3min后减压抽干，重复2次，再用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，当树脂颜色为蓝紫色时，表明Fmoc保护基已完全脱除；
S3、缩合反应：各称取0.9mmol的Fmoc-氨基酸（Fmoc-AA）、1-羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-N,N,N’和N’-四甲基脲-六氟磷酸脂（HBTU），加入少量DMF完全溶解，再加入1.8mmol的二异丙基乙基胺（DIEA）充分混匀，活化氨基酸后立即加入步骤S2得到的含有已脱保护树脂的合成仪中，氩气保护条件下搅拌1h进行缩合反应，反应结束后减压抽干，用DMF洗涤多次，减压抽干后，挑取洗涤后得到的树脂进行茚检，当树脂显淡黄色透亮时，表明缩合反应完全；
S4、肽链的延长：不断重复进行步骤S2和S3，重复将S3得到的树脂按照权利要求1所述的多肽化合物由羧基向氨基的序列顺序，依次加入相应的Fmoc-AA进行缩合，直至所有氨基酸连接完毕；
S5、多肽的裂解：按步骤S2的方法，脱去步骤S4氨基酸连接完毕后得到的肽链N-末端最后一个连接的Fmoc保护基，将得到的多肽依次用DCM和甲醇交替洗涤3次，每次3min，密封合成仪，真空抽干时间为2小时以上，树脂完全干燥后加入10mL裂解试剂，室温反应3h，反应期间每隔20min搅拌1min，反应完成后收集裂解试剂，用5mL的TFA洗涤收集到的裂解试剂，洗涤两次，每次5min，合并裂解试剂与所得滤液得到样品溶液，用旋转蒸发仪减压除去所得样品溶液中的裂解试剂及TFA，加入预先冷却的乙醚并用力振荡，静置后滤去上清液，得到样品沉淀，用水充分溶解所得沉淀后，用分液漏斗萃取除去乙醚，收集水相，将收集到的水相冷冻干燥，得到白色固体粉末状的粗肽；
S6、粗肽的纯化：以20%的乙酸溶液作为流动相，选用Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱，对步骤S5得到的粗肽进行脱盐处理，用核酸蛋白紫外检测仪在254nm监测并收集主峰，冷冻干燥后进行高效液相色谱纯化，在220mm处收集主峰后，冷冻干燥得到纯度95%以上的白色固体粉末产物，产物收率为60%。
3.根据权利要求2所述基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物的合成方法，其特征在于：步骤S5中，所述裂解试剂的组分为Tis、TFA和H2O，其中各组分的体积比为Tis:TFA:H2O=25:95:2.5。
4.根据权利要求2所述基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物的合成方法，其特征在于：步骤S6中，所述高效液相色谱纯化的具体步骤如下：选用规格为10mm，19×250mm的WatersXBridge BEH130 Prep C18反相柱，用含0.1%三氟乙酸的乙腈/水体系以20%-80%/60min梯度进行洗脱，洗脱时的流速为8mL/min。
5.权利要求1所述基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述抗菌药物中的菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌中的一种。
6.一种抗菌药物，其特征在于：所述抗菌药物中的活性成分包括有如权利要求1所述的抗菌多肽化合物。
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