CN113527513B

CN113527513B - 一种杂合抗菌肽Spcrus-APP的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113527513B
Application number: CN202110695127.XA
Authority: CN
Inventors: 张玉
Original assignee: Yi Jihui
Current assignee: Shenzhen Xinrui Gene Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2041-06-23
Also published as: CN113527513A

Abstract

本发明提供了一种抗菌肽Spcrus‑APP，其特征在于所述抗菌肽的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明开发的抗菌肽Spcrus‑APP无论是对于革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，Spcrus‑APP抗菌肽均具有良好的抑菌效果，明显优于常用抗生素头孢曲松钠、莫匹罗星。不易引起哺乳动物红细胞破裂溶解而产生伤害，具有较低的细胞毒性，且具有较高的稳定性，有良好的临床应用前景。

Description

一种杂合抗菌肽Spcrus-APP的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及种杂合抗菌肽Spcrus-APP的制备方法及其应用。

背景技术

抗菌肽是由生物有机体产生的前体经蛋白酶降解形成的具有生物学活性的小分子多肽，主要构成了机体防御的第一道防线。抗菌肽对细菌的作用机制主要是以膜作为靶位点，通过静电力和受体介导的细胞膜作用力，引起膜通透性改变，降低细胞膜稳定性，或插入细胞膜中形成跨膜的孔洞，最终导致细菌内容物外泄而死亡。传统抗生素提高了动物的生产性能，降低了疾病发生率，但同时也导致药物残留、耐药性菌株、环境污染等问题的产生。特别是近些年来滥用抗生素以及耐药性问题呈现日益加剧的趋势，由此可见研发高效且安全的新型饲料对传统抗生素进行替代具有重要意义。抗菌肽是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分,不仅具有抑制、杀灭多种细菌、真菌、病毒、寄生虫的生物学功能，而且可以提高动物机体免疫能力，不存在残留、无任何副作用。。

近年来，抗菌肽替代抗生素已成为的研究热点，许多研究人员致力于从不同物种中开发不同类型的抗菌肽。连凯琪等，作者前期对黏虫进行转录组测序，分析筛选到一种新型抗菌肽APP-1。固相化学合成法合成了少量的APP-1，表明该抗菌肽可以被化学合成，不含有特殊氨基酸残基。APP-1作用大肠杆菌后，其胞内ＤＮＡ减少，可能是因为核酸泄露到胞外所致，也可能是因为ＡＡＰ－１穿过细胞膜，进入胞内降解胞内ＤＮＡ或抑制ＤＮＡ复制所致。透射电镜观察结果进一步证明APP-1破坏了大肠杆菌细胞膜的完整性，降低胞内的电子密度，诱导细菌死亡。该结果从细菌整体形态和结构上证实APP-1对大肠杆菌的抗菌效果。肖旺红等，构建的溶藻弧菌和脂多糖感染的青蟹大眼幼体转录组数据库，筛选获得了一个新的Crustin同源基因，命名为Spcrus 7。Crustin是一种广泛存在于甲壳动物中的抗菌肽，己证明对病原菌感染具有显著的免疫应答能力。

然而，天然抗菌肽也存在诸多问题，例如，抗菌性较弱，在人体内相容性较差，利用生物信息学方法对抗菌肽进行改造具有重要的意义，可大大提高天然抗菌肽的抑菌效果。对抗菌肽进行序列修饰包括以下方法：1、利用生物软件对天然抗菌肽进行结构、空间表位分析，通过人为增加、删除或替代1个或多个残基；2、截取肽链N端或C端部分序列；3、连接不同来源的抗菌肽片断成为杂合抗菌肽等技术手段。近20年来，这种方法已广泛应用于各种等抗菌肽家族的研究中。如何进一步获得抗菌性能好，生物相容性高，稳定性高的抗菌肽，是本领域急需解决的问题。

发明内容

为进一步提高天然来源的抗菌肽抗菌性、稳定性和生物相容性，发明人基于长期的研究，通过生物信息学分析和合成生物学技术，开发出一种抗菌性能好，生物相容性高，稳定性高的抗菌肽Spcrus-APP，其具有优异的临床开发前景。

在一个实施方式中，本发明提供了一种抗菌肽Spcrus-APP，其特征在于所述抗菌肽的序列如SEQ ID NO.1所示。

在一个实施方式中，本发明提供了一种抗菌肽Spcrus-APP的核酸片段，其特征在于所述核酸片段编码如SEQ ID NO.1所示的抗菌肽。

在一个实施方式中，本发明提供了包含所述抗菌肽Spcrus-APP的核酸片段的载体，优选原核表达载体或真核表达载体。

在一个实施方式中，本发明提供了包含所述表达载体宿主细胞，优选真核宿主细胞，更优选为酵母或毕赤酵母。

在一个实施方式中，本发明提供了一种抗菌肽Spcrus-APP的制备方法，其特征在于，所述Spcrus-APP抗菌肽采用固相化学合成法。

在一个实施方式中，本发明提供了一种抗菌肽Spcrus-APP在制备抗菌制剂或抗菌药物中的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明开发的抗菌肽Spcrus-APP无论是对于革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，Spcrus-APP抗菌肽均具有良好的抑菌效果，明显优于常用抗生素头孢曲松钠、莫匹罗星。不易引起哺乳动物红细胞破裂溶解而产生伤害，具有较低的细胞毒性，且具有较高的稳定性，有良好的临床应用前景。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。

实施例1 Spcrus -APP抗菌肽的设计与合成

1. Spcrus-APP抗菌肽的设计

本发明的Spcrus-APP抗菌肽来源于黏虫抗菌肽APP-1和拟穴青蟹抗菌肽SpCrus7的杂合，其中黏虫抗菌肽APP-1序列为ＥＰＲＷＫＶＦＫＫＩＥＫＭＧＲＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＬＧＤＡＫＡＬＧＫ（SEQ ID NO. 2），序列来源可参见文献“新型黏虫抗菌肽ＡＡＰ－１对大肠杆菌的抗菌作用”，连凯琪等，中国畜牧兽医，2020，47（11）：3626-3632。拟穴青蟹抗菌肽SpCrus7的序列为：ＭＬＲＴＶＩＶＡＶＭＶＦＶＭＶＶＥＡＮＰＧＣＲＳＹＣＲＫＰＫＶＥＧＶＰＤＲＡＩＹＣＣＤＰＧＴＧＶＧＫＹＡＥＨＤＧＫＣＰＨＲＰＶＣＰＰＶＲＡＱＴＦＩＰＩＴＰＱＶＣＳＨＤＧＱＣＲＲＮＥＫＣＣＰＤＡＣＬＥＨＨＴＣＬＬＡＤＲＫ（SEQ ID NO. 3）序列来源可参见文献“拟穴青蟹抗菌肽SpCrus7的表达特性和抗菌机制研究”，肖旺红，厦门大学，2019年硕士论文。通过生物信息学分析，获得三者的关键功能区域，通过杂合方式，将拟穴青蟹抗菌肽SpCrus7第44-55位氨基酸片段ＰＧＴＧＶＧＫＹＡＥＨＤ替换黏虫抗菌肽APP-1第14-26位氨基酸片段ＧＲＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰ，获得杂合Spcrus-APP抗菌肽ＥＰＲＷＫＶＦＫＫＩＥＫＭＰＧＴＧＶＧＫＹＡＥＨＤＡＶＡＶＬＧＤＡＫＡＬＧＫ（SEQ ID NO. 1）

2. Spcrus-APP抗菌肽的合成

使用多肽合成仪合成，选用固相有机合成，采用Fmoc保护合成法，合成方向从C端到N端逐一进行，具体步骤如下：

(1)选取已经和C端第一个氨基酸连接的Wang树脂，即Fmoc-A(trt)-Wang(9-芴甲氧羧基-三甲基-A，其中A为C端第一个氨基酸)，使用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡15min左右以除去杂质；用含有20％哌啶的DMF脱除树脂上的Fmoc保护，反应20min，洗涤树脂直至完全。用DMF清洗掉哌啶，剩余的固体悬浮物即是脱保护的A-Wang。用印三酮检测剂检查A-Wang脱保护的质量。

(2)将Fmoc-B(trt)-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-B，B为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)与上述得到的脱保护的Wang树脂进行缩合反应；然后再脱去Fmoc基团。按照这个程序依次从C端到N端逐个延伸，直至将整个肽链合成完毕，当最后一个氨基酸脱保护后，用DMF洗涤8次，再用乙醇和二氯甲烷(DCM)交叉洗涤8次。将三氟乙酸(TFA)：三异丙基氯硅烷(TIS)：水＝95：2 .5：2 .5(体积比)进行混合，配制成为切割试剂与上述得到的多肽20℃下反应2h，把多肽从树脂上切割下来。旋转蒸发仪蒸发TFA，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚沉淀多肽3h，析出白色粉末状固体。真空干燥，得到粗品多肽。

(3)将上述粗品多肽使用90％乙腈水溶液溶解，使用制备色谱柱进行纯化，分析型色谱柱检测纯度。半制备型高效液相色谱仪为Waters Delta Prep 4000，制备色谱柱为Waters X-Bridge C18、5μm反相柱。洗脱液A为含有0 .1％TFA的水溶液，B为含有0 .1％TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm，洗脱方式为45％B～65％B的线性浓度梯度洗脱，流速为30mL/min。收集纯度高于95％的馏分，并冷冻干燥，获得Spcrus-APP抗菌肽。

实施例2 ：Spcrus-APP抗菌肽的体外抗菌效果

本实施例主要探究Spcrus-APP抗菌肽的体外抗菌活性和抗菌谱，采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的测定最小抑菌浓度(MIC)的方法。

1.实验方法

（2）将受试菌株的单菌落挑至MH液体培养基中，37℃，250 rpm振荡过夜培养活化后，转接至MH液体培养基中培养至对数生长期（OD600 nm= 0 .4-0 .6），然后制备成105CFU/mL的菌液，加入96孔无菌细胞培养板内，每孔90 μL。

以PBS缓冲液作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含抗菌肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。同时，以头孢曲松钠和莫匹罗星作为对照，采用上述相同的方式测定最小抑菌浓度

2.实验结果

Spcrus-APP抗菌肽的体外抗菌效果如表1所示。

表1 Spcrus-APP抗菌肽、头孢曲松钠、莫匹罗星的体外抗菌效果

从表1的结果中可看出，无论是对于革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，Spcrus-APP抗菌肽均具有良好的抑菌效果，明显优于常用抗生素头孢曲松钠、莫匹罗星。

实施例3：Spcrus-APP抗菌肽的溶血性检测

本实施例主要探究Spcrus-APP抗菌肽的细胞毒性，通过利用人红细胞测定Spcrus-APP的溶血活性来判断其细胞毒性，主要步骤如下。

1.实验方法

取雌鼠静脉血，使用肝素钠抗凝管收集。采集的血液于4℃，1500rpm离心12 min，用12 mM PBS（pH7 .3）重复洗涤红细胞三次，至上清无色透明，制成8%的红细胞悬浮液。将样品Spcrus-APP溶解于无菌0 .9%生理盐水中，配制成浓度为120 μg/mL的母液，2倍倍比稀释至终浓度为1 μg/mL。各取100 μL红细胞悬浮液和抗菌肽溶液加入到96孔板中，红细胞终浓度为4%（体积浓度）。

将混合液置于37℃恒温培养箱静置孵育，1 h后，4℃，1500 rpm离心5 min，将上清吸取至96孔板中，使用酶标仪在540 nm下检测紫外吸光值。在相同条件下测定生理盐水和0.1% Triton X-100，分别为0%和100%溶血对照实验。

溶血程度计算公式如下：溶血度（%）=[（Abs_{540 nm}抗菌肽－Abs_{540 nm}生理盐水）／（Abs_{540 nm}0 .1% Triton X-100－Abs_{540 nm}生理盐水）] × 100%。

2.实验结果

实验结果显示，抗菌肽Spcrus-APP在120μg/mL浓度下溶血率为0%，不易引起哺乳动物红细胞破裂溶解而产生伤害，具有较低的细胞毒性。

实施例4：Spcrus-APP抗菌肽的稳定性检测

本实施例主要探究Spcrus-APP抗菌肽的热稳定，酶稳定以及PH稳定性，具体方法如下。

1.热稳定性实验

Spcrus-APP抗菌肽放置 20℃、40℃、60℃、80℃和100℃环境孵育 1 h，冷却后、使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液，取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁶个/mL)于各孔中。阴性对照组为生理盐水代替抗菌肽的受试菌液，空白对照组为无菌MH培养基，每个处理三个平行样。将培养板置于37℃恒温培养箱孵育16-18 h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，观察经不同温度处理后肽的MIC改变情况，结果如表2所示。

表2 Spcrus-APP的热稳定性

温度（℃）	MIC（μg/ml）
		20	6.5
40	6.48
		60	6.74
80	6.82
		100	20.56

可见，Spcrus-APP抗菌肽高温耐受能力显著高于母体肽，80℃孵育 1 h活性未发生明显变化。

2.酶稳定性实验

选用胰蛋白酶（250 U/mg，pH8 .0），与抗菌肽冻干粉按1:8（w/w）的比例溶解于上述酶对应的PBS缓冲液中，37℃静置孵育4 h，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液，取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁶个/mL)于各孔中，37℃恒温培养箱孵育16-18 h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，观察经不同蛋白酶处理后肽的MIC改变情况。结果显示，Spcrus-APP抗菌肽在胰蛋白酶处理后抗菌活性均未发生变化，具有良好的酶稳定性。

3.PH稳定性实验

将样品肽分别溶于pH 2 .0、pH4 .0、pH 6 .0、pH 8 .0、pH 10 .0的不同类型的缓冲溶液中，37℃静置孵育2.5h。孵育结束后，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液，取上述溶液50μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁶个/mL)于各孔中。同时未加肽的缓冲液在相同的条件下处理作为阴性对照。37℃恒温培养箱孵育16-18 h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，观察经不同 pH 处理后肽的MIC 改变情况。结果如表3所示。

表3 Spcrus-APP的PH稳定性

PH	MIC（μg/ml）
		2.0	6.11
4.0	6.27
		6.0	6.89
8.0	6.94
		10．0	7.08

由表3可知，Spcrus-APP抗菌肽在各个pH差异并不明显，pH稳定性较高。

实施例5 小鼠皮肤体外感染抗菌效果检测

本实施例主要探究Spcrus-APP抗菌肽对于皮肤感染抗菌的效果，具体如下。

1.实验方法

制备金黄色葡萄球菌悬液，将其浓度调整为10⁶CFU/ml。实验用小鼠为 6周龄，无特定病原体，雌雄性各一半，共20只，随机分为4组，每组5只，体重平均为20g。

采用酒精对小鼠背部进行消毒，做一个15mm×10mm的伤口，在伤口接种10μl金黄色葡萄球菌悬液。3h后，分别对其中三组小鼠的伤口添加浓度10μg/ml 、15μg/m、20μg/ml的Spcrus-APP抗菌肽，第四组小鼠作为阴性对照，添加无菌水。12小时后，处死小鼠，将整个创面解剖并转移到离心管内，加入1ml Kligman缓冲液，涡旋振荡2min，2000rpm离心10分钟，取上清液进行稀释，将稀释液放入血平板37℃培养24h，观察抑菌情况，计算细菌成活率，结果如表4所示。

表4 Spcrus-APP的皮肤体外感染抗菌效果

浓度（μg/ml）	细菌成活率（%）
		10	69.1
15	59.6
		20	8.6
0（H<sub>2</sub>O）	100

由表4可知，Spcrus-APP抗菌肽具有良好的皮肤体外感染抗菌。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 青岛联吉生物医疗科技有限公司

<120> 一种杂合抗菌肽Spcrus-APP的制备方法及其应用

<130> 111

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Glu Pro Arg Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Pro Gly Thr

1 5 10 15

Gly Val Gly Lys Tyr Ala Glu His Asp Ala Val Ala Val Leu Gly Asp

20 25 30

Ala Lys Ala Leu Gly Lys

35

<210> 2

<211> 39

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Glu Pro Arg Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn

1 5 10 15

Ile Arg Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Leu Gly

20 25 30

Asp Ala Lys Ala Leu Gly Lys

35

<210> 3

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Leu Arg Thr Val Ile Val Ala Val Met Val Phe Val Met Val Val

1 5 10 15

Glu Ala Asn Pro Gly Cys Arg Ser Tyr Cys Arg Lys Pro Lys Val Glu

20 25 30

Gly Val Pro Asp Arg Ala Ile Tyr Cys Cys Asp Pro Gly Thr Gly Val

35 40 45

Gly Lys Tyr Ala Glu His Asp Gly Lys Cys Pro His Arg Pro Val Cys

50 55 60

Pro Pro Val Arg Ala Gln Thr Phe Ile Pro Ile Thr Pro Gln Val Cys

65 70 75 80

Ser His Asp Gly Gln Cys Arg Arg Asn Glu Lys Cys Cys Pro Asp Ala

85 90 95

Cys Leu Glu His His Thr Cys Leu Leu Ala Asp Arg Lys

100 105

Claims

1.一种抗菌肽Spcrus-APP，其特征在于，所述抗菌肽的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种抗菌肽Spcrus-APP的核酸片段，其特征在于所述核酸片段编码如SEQ ID NO.1所示的抗菌肽。

3.一种表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述抗菌肽Spcrus-APP的核酸片段。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求3所述表达载体。

5.一种权利要求1所述的抗菌肽Spcrus-APP的制备方法，其特征在于，所述Spcrus-APP抗菌肽采用固相化学合成法。

6.一种权利要求1所述的抗菌肽Spcrus-APP在制备抗菌制剂中的用途。

7.一种权利要求1所述的抗菌肽Spcrus-APP在制备抗菌药物中的用途。