CN116003541B

CN116003541B - 多功能真菌防御素修饰肽、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN116003541B
Application number: CN202210892724.6A
Authority: CN
Inventors: 沈秉正; 陈雅婷; 孟兰霞; 苏可; 宋伟; 张帆; 金丹; 翁超
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2022-07-27
Filing date: 2022-07-27
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2042-07-27
Also published as: CN116003541A

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种多功能真菌防御素修饰肽、其制备方法及应用。该修饰肽首先通过常规的多肽固相合成技术制备肽段，再通过分子内8个半胱氨酸残基中的巯基形成四对分子内的共价二硫键，最后通过半制备反向高效液相色谱纯化得到。较之于天然多肽，该修饰肽对革兰氏阳性菌标准菌株及临床分离的耐药菌株均有抑制作用；亦能抑制由脂多糖诱导的鼠源性巨噬细胞RAW264.7中促炎细胞因子IL‑1β和TNF‑α表达；同时该修饰肽还能促进小鼠成纤维细胞系NIH‑3T3的迁移和伤口修复。修饰肽呈现出低溶血活性，且制备便捷、具有抗菌、抗炎、促进细胞迁移三重药理活性，具有作为候选药物进行深入研发的价值及产业化的潜力。

Description

多功能真菌防御素修饰肽、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种多功能真菌防御素修饰肽、其制备方法及应用。

背景技术

皮肤作为人体对外界的最大的器官和物理屏障，人体皮肤在温度调节和保护、感知、排泄、吸收、新陈代谢和免疫方面都具有至关重要的作用。因此，皮肤的结构完整性对于维持其正常的生理功能至关重要。然而，许多损伤，包括机械、热、化学、辐射、微生物感染等，可以导致皮肤损伤、组织损失以及结构和功能损伤。皮损发生后机体通常会发生一系列高度复杂的生理过程，诸如止血、炎症调控、增值和重塑等，从而完成伤口的修复(表1)。

表1伤口愈合的四个阶段

各种类型的细胞(成纤维细胞、巨噬细胞、血小板和上皮角质形成细胞等)和各种活性物质(炎症因子、生长因子、转化因子等)均可调节皮肤修复的过程。尽管皮肤修复是一个与生俱来的正常过程，但是很多因素都可影响愈合，这些影响因素主要可以分为局部因素和系统因素(表2)。

表2影响伤口愈合的因素

对于局部因素而言，氧供和感染是主要的因素：1.增加供氧可以：加速代谢，预防感染，诱导血管生成，增加角质形成细胞分化、迁移和再上皮化，增强成纤维细胞增殖以及胶原蛋白合成，并促进伤口收缩。2.感染：细菌和内毒素均可导致促炎细胞因子如白细胞介素1(IL-1)和TNF-α的长期升高，并延长炎症期。长时间的炎症导致基质水平升高金属蛋白酶(MMP)。

对于系统因素而言，年龄和性别、性激素水平、压力、药物、糖尿病、肥胖、营养是主要的影响因素：1.年龄：随着年龄的增加炎症反应会发生改变，例如延迟T细胞浸润到伤口区域、趋化因子表达的改变和巨噬细胞吞噬能力的降低、胶原合成和血管生成变慢。2.性激素：雌激素通过调节多种与伤口愈合相关的基因来影响伤口愈合，如再生、基质产生、蛋白酶抑制、表皮功能和基因与炎症相关基因。3.药物：干扰凝血或血小板功能或炎症反应和细胞增殖具有影响伤口愈合的能力，糖皮质激素类固醇、非甾体抗炎药和化疗药物也可减缓伤口愈合。4.精神压力：过大的压力会导致伤口愈合缓慢。5.肥胖：肥胖是许多疾病和健康状况的风险因素，包括心血管疾病、糖尿病、癌症、呼吸系统问题，同样肥胖也能够导致伤口愈合变慢。6.营养：例如葡萄糖是组织形成和血管生成所必需的ATP的主要来源；蛋白质是成纤维细胞增值、蛋白多糖合成、胶原蛋白合成的基础；脂质能促进炎症相关细胞因子的生成、基因的表达以及伤口部位血管的形成。

目前临床上最常用的药物主要包括小分子化合物和生长因子。然而，这些单一类型的药物存在一些局限性：例如，小分子药物因合成收率底而导致生产成本高、或者活性不理想；生长因子类药物需要严格的保存条件，在运输、保存和使用过程中容易失活，且运物流成本增加，更重要的是会使伤口过度修复，从而导致增生性瘢痕。在临床实践中，皮肤创面修复与再生仍面临巨大挑战。因此，发现新型分子并研发成具有良好伤口愈合效果和低生产、运输成本药物的是解决上述问题的有效手段。

发明内容

为了弥补现有技术的缺点与不足，克服现有促伤口愈合药物的疗效不明显，生产、运输成本高等问题。

首先，本发明提供了一种化学合成的具有抗菌、抗炎及促进伤口修复功能的真菌防御素修饰多肽、其制备方法及应用。用固相合成技术制备线性多肽中间体后，在通过分子内的二硫键的配对，形成分子内的二硫键，使其空间结构由无规则的线性分子向具有半管氨酸稳定的α/β结构模体(Cysteine stable-α/β,CSαβ)的转变。最后经过反向高效液相色谱纯化后，获得最终产物——真菌防御素修饰多肽。

其次，本发明同时提供了该具有抗菌、抗炎及促进伤口修复的真菌防御素修饰肽的制备方法，所提供的制备方法所使用的技术路线易于操作，制备工艺稳定性较强，合成的过程中质量通过质谱检测，使其质量易于控制。能够满足大规模制备及后续工业化量产的需要。

再次，本发明的另一目的在于提供上述具有抗菌、抗炎和促进伤口修复的真菌防御素修饰肽的应用。本发明所涉及的修饰肽在浓度为μM水平时具有抗革兰氏阳性菌的活性，对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)以及临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantstaphylococcus aureus,MRSA)均具有较好的抑制作用。同时能够抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激后小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7中促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达。另外，该修饰肽亦能促进成纤维细胞系NIH-3T3的迁移，对于小鼠感染伤口，具有促进愈合的作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

1、第一方面，本发明提供一种多功能真菌防御素修饰肽，其特征在于：所述修饰肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示

(SICCINLPGYSGLCCEAHCRKIGKPGGSCTPQNICTCNRRRRRR)；

通过首先制备线性修饰肽，然后通过序列中的8个半胱氨酸残基形成分子内的四对二硫键，形成环状结构，即环状修饰肽；所述环状修饰肽共由44个氨基酸残基组成，理论分子量为4874.75，理论等电点9.54，为强碱性阳离子肽。

作为优选方案，所述环状修饰肽，其分子内的四对二硫键配对方式为：

更具体地，如图9所示：

第二方面，本发明提供一种制备如上述的多功能真菌防御素修饰肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：

首先：通过FMOC固相多肽合成技术制备的氨基酸序列为线性序列，如SEQ ID NO.1所示(SICCINLPGYSGLCCEAHCRKIGKPGGSCTPQNICTCNRRRRRR)；

其次：在离子型缓冲液介质Tris-HCl中，将分子内半胱氨酸残基侧链的巯基，通过分子内二硫键配对，进而形成环状结构，即即环状修饰肽；

最后：通过RP-HPLC纯化及质谱鉴定获得终产物。

第三方面，本发明提供一种如上所述的真菌防御素修饰肽在制备抗菌和/或抗炎和/或促进伤口修复药物中的应用。

作为优选方案之一，所述细菌为革兰氏阳性细菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

作为优选方案之二，所述真菌防御素修饰肽通过抑制脂多糖诱导的鼠源巨噬细胞系RAW264.7中促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达，从而发挥抗炎作用。

作为优选方案之三，所述真菌防御素修饰肽通过促进鼠源成纤维细胞系NIH-3T3的迁移，从而促进伤口愈合。

第四方面，本发明提供一种药物组合物，其特征在于：包含如上所述的具有抗菌、抗炎、促进伤口修复作用的真菌防御素修饰肽；还包含如权利要求1所述的具有抗菌、抗炎、促进伤口修复作用的真菌防御素修饰肽药学上可接受的盐和/或可接受的辅料。

作为优选方案，所述辅料包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂和渗透压调节剂。

进一步地，所述药物组合物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或凝胶剂中任一种。

因此，与现有技术相比，本发明的多功能的真菌防御素修饰肽对于伤口愈合，特别是感染性伤口的抗感染治疗及伤口修复具有独特的优势。

本发明所涉及的真菌防御素修饰肽的模板来源于丝状真菌淡紫拟青Purpureocillium lilacinum表达的由147个氨基酸残基组成的蛋白Purlisin：序列如下：

MRFVLAALASASLASALCMPSLTCEELSPAADKACNGVCIRQGNPKGGRCLPKDGCPGANICACYPRKRSLDPVQRAEYEDGDAVLRRDLEATLDAGRELTDNVTLVKRSICCINLPGYSGLCCEAHCRKIGKPGGSCTPQNIC TCN(SEQ ID NO.2)

翻译后，经过加工，全长多肽可被蛋白酶切割成下划线标注出的肽段，该肽段由38个氨基酸残基组成，在肽段羧基端(碳端)链接6个精氨酸残基，成为六聚精氨酸修饰的肽。最后通过8个半胱氨酸分子形成分子内的四对二硫键，如图10所示。

经反相高效液相色谱(Reverse phase-high performance liquidchromatography,RP-HPLC)分离纯化可获得该拟肽分子，固相合成制备的线性修饰肽的理论分子量为4882.75，等电点pI为9.54。形成分子内四对二硫键时，因氧化作用脱去8个氢原子，因此，本发明所设计的真菌防御素修饰肽的活性构象的分子量为：4882.75-8＝4874.75Da。

本发明所涉及的含有四对分子内二硫键的多功能真菌防御素修饰肽的分子式为C₁₉₆H₃₂₇N₇₃O₅₇S₈，同源模建出的三维空间结构如图9所示。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

1、本发明提供一种真菌防御素修饰肽，其具有开发成药物的价值；

2、本发明提供上述真菌防御素修饰肽的制备方法，其原料选择合理且容易获得，制备工艺简单，易于产业化；

3、该真菌防御素修饰肽具有抗菌、抗炎、促进细胞迁移多重药理学活性，为多功能分子；

4、该真菌防御素修饰肽具有较低的溶血活性，呈现出较好的安全性。

综上所述，本发明所涉及的真菌防御素修饰肽可为开发新型具有抗菌、抗炎和促进伤口修复的活性物质及其复方制剂提供新的选择。

附图说明

图1是本发明制备的线性真菌防御素修饰肽中间体的HPLC图；

图2是本发明制备的含有分子内二硫键的真菌防御素修饰肽的HPLC图；

图3是本发明制备的含有分子内二硫键的真菌防御素修饰肽的质谱图；

图4是本发明真菌防御素修饰肽的溶血活性结果；

图5是本发明真菌防御素修饰肽抑制LPS诱导RAW 264.7细胞中IL-1β的表达；

图6是本发明真菌防御素修饰肽抑制LPS诱导RAW 264.7细胞中TNF-α的表达；

图7是本发明真菌防御素修饰肽促进成小鼠纤维细胞系NIH-3T3迁移(图中黑色标尺长度为1mm)；

图8是本发明真菌防御素修饰肽促进小鼠伤口愈合(图中黑色标尺长度为5mm)；

图9是本发明多功能真菌防御素修饰肽的氨基酸残基序列及分子内二硫键的配对方式；

图10是本发明所述真菌防御素修饰肽的具体修饰方式和修饰序列。

具体实施方式

为了阐明本发明实施的目的、技术方案和优势，结合以下实施例和附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

【实施例1】线性肽肽段的制备

在此线性肽肽段(SICCINLPGYSGLCCEAHCRKIGKPGGSCTPQNICTCNRRRRRR)的合成中，运用9-芴甲氧羰基(FMOC)作为氨基端的保护基团，选用4-甲基二苯基甲胺树脂(4-methyl-benzhydrylamine resin·HCl,MBHA resin)为多肽合成的固相载体，使用HOBt/DCC为反应的缩合剂，由羧基末端向氨基末端(C端→N端)延长肽链。用90.0％三氟乙酸、4.5％水和5.5％三异丙甲硅烷(TIA)的混合液(质量百分比)将含有44个氨基酸残基的线性修饰肽从MBHA树脂上裂解。经乙醚反复几次沉淀后，通过制备型反向高效液相色谱RP-HPLC纯化。纯化过程：使用C18反相制备柱(250mm×20mm，5μm)；流动相：1.5‰三氟乙酸，0％～65％(体积百分比)乙腈为流动相，1.25mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，保留时间(retention time,RT)为12.64min，经峰面积归一化法计算，其纯度>90％(图1)。收集洗脱液，-80℃冻存12hr后放入冻干机冻干过夜。

【实施例2】二硫键配对后的环状真菌防御素修饰肽的制备

以上述实施例1中通过固相合成、色谱纯化所制备的线性的真菌防御素修饰肽SICCINLPGYSGLCCEAHCRKIGKPGGSCTPQNICTCNRRRRRR为原料。取冻干粉5mg于10mL离心管中，用4mL浓度为0.15M(pH＝10.8)的Tris-HCl缓冲液溶解。拧紧离心管管盖后用Parafilm封口膜密封，确认管口无漏液后，上下颠倒离心管加速多肽的溶解。将盛有多肽溶液的离心管放入恒温摇床中于～26℃，80rpm孵育约32hr。于4℃10000rmp高速离心5min，取上清液。经制备型RP-HPLC纯化。使用C18反相制备柱(20mm×250mm，5μm)；流动相：1.5‰三氟乙酸，0％～50％(体积百分比)乙腈为流动相，1.25mL/min的流速进行梯度洗脱。经RP-HPLC检测，RT为13.81min，其纯度>95％(图2)，冻干后备用。经ESI-Q-TOF-MS鉴定，其分子量与拟制备多肽中间体相应的理论分子量一致，m/z 1625.92[M+3H]³⁺，m/z 1219.55[M+4H]⁴⁺，m/z 975.30[M+5H]⁵⁺，m/z 813.52[M+6H]⁶⁺(图3)。

本发明制备的环状真菌防御素修饰肽如下所示：

【实施例3】真菌防御素修饰肽溶血活性测定

从健康供体获得新鲜血液，分离人红细胞后制成悬液，以灭菌生理盐水为阴性对照、以1％的Triton X-100为阳性对照，测定该真菌防御素修饰肽的溶血活性。

具体步骤如下：用肝素抗凝管收集全血，轻轻颠倒使血液充分抗凝，于室温750rpm离心3.5min，尽量吸尽上层血浆保留下层红细胞；加入3倍体积的灭菌生理盐水，用移液枪轻柔吹吸，使底部的红细胞悬浮，于室温下800rpm离心3min，弃去上清保留沉淀下来的红细胞，重复操作3次，至上清液无色为止；用灭菌生理盐水将红细胞制成2％(v/v)浓度的细胞悬液；用灭菌生理盐水将该本发明所述的真菌防御素修饰配置成128μmol/L、64μmol/L、32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L和4μmol/L浓度的溶液；将75μL该真菌防御素修饰肽溶液和75μL红细胞悬浮液混合并加入至96孔板中，多肽的终浓度分别为64μmol/L、32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L和2μmol/L；阴性对照组为用灭菌生理盐水悬浮的红细胞，阳性对照使用浓度为1％TritonX-100的灭菌生理盐水溶液悬浮的红细胞；将样品放入恒温摇床中，(36.5±0.5)℃下100rpm孵育45min后；于室温将样品以4000rpm离心4min，每孔中取150μL上清液转移至另一96孔板中；用全波长酶标仪测定490nm波长处的吸光度，并通过以下公式计算溶血百分率，公式中H为490nm波长处的吸光度：溶血率(％)＝(H_sample-H_negative)/(H_positive-H_negative)×100％，如图4所示。

结果表明，本发明所述的真菌防御素修饰肽在终浓度高达64μmol/L时仍未出现明显的溶血作用(溶血率≤14％)。

【实施例4】真菌防御素修饰肽的抗菌活性测定

革兰氏阳性菌待测菌株包括标准菌株(金黄色葡萄球菌S.aureus及表皮葡萄球菌S.epidermidis)以及临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。其中标准菌株来自中国典型培养物保藏中心(China Center of Type Culture Collection,CCTCC)，临床分离的耐药病原菌由武汉大学人民医院检验医学中心提供。采用倍比稀释法测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)，通过MIC值表征该真菌防御素修饰肽的抗菌活性。

具体方法如下：

将待测菌株用三区划线法分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基平板中，在恒温培养箱中于37℃倒置培养12小时。用接种环挑取单菌落分别转接到新配置的灭菌液体LB培养基中，于37℃、150rpm条件下在震荡培养至对数生长期。用紫外分光光度计测定600nm波长处菌液的吸光度值(OD₆₀₀)，根据1OD≈1×10⁹CFU/mL的换算关系，分别将S.aureus、S.epidermidis标准菌株以及临床耐药菌株MRSA的菌液用灭菌的液体培养基稀释至浓度为～2×10⁶CFU/mL。

首先在无菌96孔板中先加入75μL灭菌的LB培养基；接下来将用灭菌的LB培养基所溶解的浓度为128μmol/L的多肽溶液75μL加入到第1孔中，混合均匀后取75μL加入第2孔中，依次操作，最后从第6孔吸出75μL弃去，依次二倍稀释；最后向各孔中加入稀释好的浓度为～2×10 ⁶CFU/mL菌液75μL，混合均匀。未加入多肽的各孔作为阴性对照。

以上各组于37℃180rpm培养18～24小时，测定波长为600nm处的吸光度值。最小抑菌浓度(MIC)取检测不到细菌生长(OD₆₀₀≤0.05)的孔中所含真菌防御素修饰肽的终浓度的最低值。阴性对照孔中菌液均浑浊，且在600nm处的吸光度OD₆₀₀＞2.5。本发明所述真菌防御素修饰肽的抗菌活性结果如表3。

表3本发明真菌防御素修饰肽抗菌活性

从表3中的结果可以看出，本发明所涉及的真菌防御素修饰肽具有较好的抗革兰氏阳性菌S.aureus和S.epidermidis(MIC值≤16μM)，以及抗临床分离的耐药病原菌MRSA的作用(MIC值≤32μM)。

【实施例5】真菌防御修饰肽抑制LPS诱导RAW 264.7细胞中IL-1β的表达

取培养至融合率为70％～80％的RAW 264.7细胞，吸净培养基并弃去，用灭菌PBS缓冲液洗两次；加入于适量胰酶于37℃消化20秒，轻轻拍打使细胞使其从培养容器底部脱落，加入含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基轻柔吹打细胞制成单细胞悬液；用培养基稀释细胞，调整细胞浓度为2.5×10⁵cells/mL，接种于24孔板中，每孔0.5mL。将培养板于37℃，5％CO₂，培养8～12小时，吸出上清液并弃去。空白组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；LPS模型组及实验组中加入0.5mL含有LPS的10％FBS的DMEM培养基(LPS终浓度为15μg/mL)。将培养板于37℃，5％CO₂，培养1小时。空白组和LPS模型组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；实验组中加入0.5mL含有本发明所述的真菌防御素修饰肽的10％FBS的DMEM培养基(修饰肽终浓度10μmol/L)。将培养板于37℃，5％CO₂，过夜培养，2 000rmp离心10min。取上清液用稀释适当的倍数，用酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay,ELISA)测定上清液中细胞因子IL-1β的含量。

结果表明，本发明所述的真菌防御素修饰肽能明显抑制LPS诱导的鼠源巨噬细胞系RAW 264.7中促炎细胞因子IL-1β的表达，如图5所示。

【实施例6】多肽抑制LPS诱导RAW 264.7细胞中TNF-α的表达

取培养至融合率为70％～80％的RAW 264.7细胞，吸净培养基并弃去，用灭菌PBS缓冲液洗两次；加入于适量胰酶于37℃消化20秒，轻轻拍打使细胞从培养容器底部脱落，加入含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基轻柔吹打细胞制成单细胞悬液；用培养基稀释细胞，调整细胞浓度为2.5×10⁵cells/mL，接种于24孔板中，每孔0.5mL。将培养板于37℃，5％CO₂，培养8～12小时，吸出上清液并弃去。空白组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；LPS模型组及实验组中加入0.5mL含有LPS的10％FBS的DMEM培养基(LPS终浓度为15μg/mL)。将培养板于37℃，5％CO₂，培养1小时。空白组和LPS模型组中加入0.5mL含10％FBS的DMEM培养基；实验组中加入0.5mL含有本发明所述的真菌防御素修饰肽的10％FBS的DMEM培养基(修饰肽终浓度10μmol/L)。将培养板于37℃，5％CO₂，过夜培养，2 000rmp离心10min。取上清液用稀释适当的倍数，用酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay,ELISA)测定上清液中细胞因子TNF-α的含量。

结果表明，本发明所述的真菌防御素修饰肽能明显抑制LPS诱导的鼠源巨噬细胞系RAW 264.7中促炎细胞因子TNF-α的表达，如图6所示。

【实施例7】真菌防御素修饰肽加快小鼠成纤维细胞系NIH-3T3迁移

取培养至融合率为80％～90％的小鼠成纤维细胞系NIH-3T3细胞，吸净培养基并弃去，用温育后的无菌PBS缓冲液洗两次；加入于适量胰酶于37℃消化15秒，轻轻拍打使细胞从培养容器底部脱落，加入含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基轻柔吹打细胞制成单细胞悬液；用培养基稀释细胞，调整细胞浓度约为5×10⁵cells/mL，接种于6孔板中，每孔2mL。待细胞融合率为90％～95％时，用灭菌的200μL枪头进行划痕(划痕宽度约为700μm)；弃去培养基，并用温育后的灭菌PBS缓冲液轻柔的洗涤6孔板，尽量去除枪头划痕所剥离的细胞。对照组加入2mL DMEM培养基，实验组加入2mL含有本发明所述真菌防御素修饰肽(终浓度32μmol/L)的DMEM培养基。将6孔板置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中，培养12小时观察细胞的迁移情况，并用以下公式计算细胞的迁移率：

迁移率％＝(L₀-L)÷L₀×100％。

其中L₀为枪头划痕后细胞间的距离，L为培养细胞一段时间(本实施例中为细胞迁移12小时后)细胞间的距离。

结果表明，较之于对照组，实验组(含有32μmol/L修饰肽的DMEM完全培养基)细胞的迁移速率更高(图7中A)，且差异具有统计学意义p＜0.01(图7中B)。

【实施例8】真菌防御素修饰肽促进小鼠伤口修复

将成年8周龄体重的20～25g雄性BALB/c小鼠，分为两组(对照组和实验组)，每组6只，按照10mL/kg的给药剂量腹腔注射含量为7.5％的乌拉坦生理盐水溶液。待小鼠麻醉后，用直径为6mm的活检取样器在小鼠背部中间处人为造成皮损伤口。

对照组伤口处滴加10μL灭菌注射用氯化钠溶液，实验组滴加10μL浓度为32μmol/L的真菌防御素修饰肽，等待15～30min使液体基本吸收，最后用无菌敷料覆盖伤口并用小块无菌胶布覆盖并固定敷料。每隔一天给药一次，共给药7次，共计14天。

结果表明，与对照组相比，实验组创伤口修复速度明显较快，第1天、第7天及第14天的代表性伤口如图8所示。

【实施例9】片剂的制备

取本发明所述的真菌防御素修饰肽0.1g、淀粉1.5g、糊精2g混合，质量浓度为35％的药用级聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为粘合剂，制粒，整粒，压片，既得片剂。

【实施例10】乳膏剂的制备

取本发明所述的真菌防御素修饰肽1g、单硬脂酸甘油酯1.4g、硬脂酸4.8g、白凡士林0.4g、液体石蜡2.4g、羊毛脂2.0g、三乙醇胺0.16g、蒸馏水30mL，混匀即得。

【实施例11】凝胶剂的制备

取10mL蒸馏水，将卡波姆撒于液面上，40℃温水浴并搅拌使其充分溶胀。加入丙二醇混合均匀，然后边搅拌边加入三乙醇胺使其成为凝胶基质；将本发明所述的真菌防御素修饰肽0.1g溶于浓度为0.15M的PBS缓冲液中(pH＝7.4)，在不断搅拌下将其缓慢加入凝胶基质中。最后加入剩余蒸馏水，制得20g该修饰肽凝胶。

【实施例12】注射用冻干粉的制备

取本发明所述的真菌防御素修饰肽1.5g、甘露醇15g，置于容器中，加适量PBS缓冲液(0.15M,pH7.4)溶解，加注射用水至250mL，摇匀，加6～10g针用活性炭，室温搅拌约45分钟，粗滤，用0.22μm灭菌滤膜过滤除菌，分装，每瓶1.5mL，采用速冻的方法，每分钟降温10～20℃，降温至-45～-50℃，维持3小时，抽真空，在真空状态下缓慢升温，升温速度每小时2～6℃，温度升至～25℃时停止升温，待温度接近室温后取出，加盖密封，既得冻干粉针剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种多功能真菌防御素修饰肽，其特征在于：所述修饰肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；通过首先制备线性修饰肽，然后通过序列中的8个半胱氨酸残基形成分子内的四对二硫键，形成环状结构，即环状修饰肽；所述环状修饰肽共由44个氨基酸残基组成，理论分子量为4874.75，理论等电点9.54，为强碱性阳离子肽；

所述环状修饰肽，其分子内的四对二硫键配对方式为：

2.一种制备如权利要求1所述的多功能真菌防御素修饰肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：

首先：通过FMOC固相多肽合成技术制备的氨基酸序列为线性序列，如SEQ ID NO.1所示；

其次：在离子型缓冲液介质Tris-HCl中，将分子内半胱氨酸残基侧链的巯基，通过分子内二硫键配对，进而形成环状结构，即环状修饰肽；

最后：通过RP-HPLC纯化及质谱鉴定获得终产物。

3.一种如权利要求1所述的真菌防御素修饰肽在制备抗细菌和/或抗炎和/或促进伤口修复药物中的应用，其特征在于：所述细菌为革兰氏阳性细菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述真菌防御素修饰肽通过抑制脂多糖诱导的鼠源巨噬细胞系RAW264.7中促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达，从而发挥抗炎作用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述真菌防御素修饰肽通过促进鼠源成纤维细胞系NIH-3T3的迁移，从而促进伤口愈合。

6.一种药物组合物，其特征在于：包含如权利要求1所述的真菌防御素修饰肽；还包含如权利要求1所述的真菌防御素修饰肽在药学上可接受的盐和/或可接受的辅料。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述辅料包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂和渗透压调节剂。

8.根据权利要求6或7所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或凝胶剂中任一种。