PT98538B - Processo de preparacao de factor de crescimento humano epidermico (hegf) dos seus congeneres e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

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000-133/SLC/SCC -3-levou a um consenso de que o EGFl-53 humano é a mais potente das porções semelhantes a EGFf sendo outros compostos, incluindo o hEGFl-48, menos activos.

0 EGF foi inicialmente descrito por Stanley Cohen e seus colaboradores. Eles observaram que extractos de glândulas salivares de ratazanas induziam a abertura precoce das pálpebras e o nascimento precoce dos dentes quando administrados a crias recém-nascidas de ratazana. Subsequentemente, purificou-se o péptido EGF a partir destes extractos e caracterizou-se. Mostrou--se que o EGF era um mitogénio potente (i. e., um agente causador ou indutor de mitose ou transformação celular) para uma variedade de tipos celulares. O EGF tem actividades mitogénica e supressora do ácido no tracto GI.

Como indicado, o EGF foi isolado a partir de glândulas salivares de onde e segregado para o lúmen gastrintestinal (i.e., cavidade ou canal). Também é segregado para o tracto GI a partir de uma variedade de outras fontes. Isto levou a numerosas tentativas para caracterizar as actividades do EGF no tracto GI.

Relatórios mostram que o EGF produzia, em cães, uma supressão da secreção do ácido gástrico dependente da dose. Outro trabalho confirmou esta actividade supressora de ácido em várias espécies animais, incluindo humanos. O EGF é menos eficaz como um supressor da secreção do ácido gástrico do que terapias supressoras do ácido, bem conhecidas, como o antagonista da histamina H2 ou os inibidores da bomba de protões. Esta supressão da secreção do ácido gástrico acontece quando o EGF é administrado por injecção (i.e., por administração parenteral), mas não acontece quando o EGF, é tomado através da boca mesmo em doses muito elevadas. 0 EGF administrado ao lúmen gastrintestinal (i.e., ao estômago ou a outro segmento da cavidade ou canal GI) não tem efeitos tróficos. Assim, têm sido descritos aumentos na massa tissular e na síntese do ADN a seguir à administração intragástrica e infusões intralúmen de EGF.

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Também se mostrou que a administração oral do EGF promove a cura de úlceras gástricas e duodenais, induzidas experimentalmente, que foram induzidas por qualquer um de uma variedade de agentes, incluindo ácido acético, tratamento com laser, cisteamina e indometacina. Mais recentemente, verificámos que o mecanismo de acção para esta actividade está relacionado com a capacidade do EGF acelerar a taxa de re-epitelização (i.e., novo crescimento de reparação) das lesões induzidas (FIGURA 1, descrita abaixo). Isto contrasta com as terapias supressoras de ácido que parecem afectar porções do processo de cura que antecede a fase de re-epitelização (FIGURA 2).

Estrutura/Actividade

Como indicado anteriormente, o EGF humano é um péptido de 53 aminoácidos que deriva, como resultado de clivagem de uma proteína muito maior. 0 EGF contém seis resíduos de cisteína que formam três ligações dissulfureto, covalentes. A relação estrutura actividade do EGF tem sido objecto de investigação por um número de laboratórios. As formas moleculares de porções semelhantes ao EGF incluem EGF1-52, EGF1-51, EGF1-49, EGF1-48 e EGF1-47, bem como uma variedade de moléculas clivadas quimicamente e de moléculas com numerosas substituições de aminoácidos. Refere-se que estas formas moleculares de EGF são menos activas do que o EGF1-53 no que respeita à actividade mitogénica e à actividade de ligação a célula receptora. Com a excepção do EGF1-52, nenhum dos fragmentos de EGF foi avaliado quanto à sua actividade in vivo, provavelmente devido, em cada caso, à opinião prevalecente de que ele seria menos eficaz do que o EGF1-53. Apesar de ter sido publicado que estas formas moleculares foram isoladas, nenhuma, com a possível excepção do EGFl-52, foi purificada até à homogeneidade e caracterizada quanto à homogeneidade e identidade. 72960

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Sumário do Invento 0 presente invento baseia-se na existência das espécies de EGF humano (hEGF) puro, especialmente como espécies purificadas até à homogeneidade: polipéptidos sem corte (i.e., de cadeia intacta) EGF1-47, EGF1-48 e EGF1-49; e a espécie de EGF humano (hEGF) puro: polipéptidos com corte (ou de cadeia quebrada) EGF1--47, EGF1-48 e EGF1-49.

Assim, o invento baseia-se no facto de se ter verificado que os meios convencionais de obtenção do EGF1-48 e dos seus congéneres EGF1-47 e EGF1-49 (por vezes referidos aqui como congéneres do EGF) - como por síntese química, proteólise limitada de EGF intacto e técnicas microbianas recombinantes -não produzem a espécie de EGF sozinha, mas produzem o tipo misto da, mistura comigrante com corte e sem corte, até aqui não observada, que, por processos convencionais, incluindo técnicas cromatográficas, antes do presente invento nunca tinham sido isoladas como o tipo puro sem corte e puro com corte, separados (FIGURA 3). O invento proporciona, assim, as formas com corte e sem corte do EGF1-48 humano e dos seus congéneres adjacentes EGF1-47 e EGF1-49, também nas formas com corte e sem corte (cada uma como uma nova entidade molecular, discreta e separada). Estes compostos têm utilidade terapêutica inesperada para o tratamento de lesões gastrintestinais. Assim, o EGF1-48 e os seus congéneres na forma pura com corte ou pura sem corte, possuem, cada um, uma actividade inesperada, única.

Verificou-se, também, que o EGF1-48 puro e os seus congéneres puros, na forma com corte ou sem corte, têm estabilidade estrutural e resistência a degradação enzimática (suco gástrico e tripsina) estabilidade e resistência essas que resultam em utilidade inesperada para o tratamento de lesões gastrintestinais.

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Breve Descricão dos Desenhos

A FIGURA 1 é um gráfico mostrando a resposta à dose do EGF, expressa como a taxa de contractura no tratamento da úlcera gástrica canina; as úlceras foram induzidas através de terapia com laser da cavidade. 0 processo de cura da úlcera foi seguido por exame endoscópico repetido, durante os quais foram obtidas imagens da lesão. Para cada animal, foram medidos os tamanhos das lesões e a taxa de re-epitelização foi determinada como a constante de velocidade para um ajustamento de mínimos quadrados dos tamanhos das lesões ao longo do decurso temporal da experiência; a FIGURA 2 é um esquema das fases de úlcera mostrando a variação no tamanho da úlcera a seguir ao acontecimento iniciador e durante a pré-contractura, contractura e cura. a FIGURA 3 é um gráfico do perfil de separação cromatográfica em relação ao tempo, do hEGFl-48 que elui primeiro como a espécie sem corte (intacta) e, a seguir, como a espécie com corte; a fracção EGF1-48 foi isolada e purificada a partir do caldo de uma fermentação durante a qual a expressão foi induzida. Este cromatograma representativo pôs em evidência uma separação cromatográfica adicional do hEGFl-48 na espécie com corte e intacta usando uma resina de permuta iónica, como aqui descrita. a FIGURA 4 é um gráfico do efeito da dose de EGF, relativamente ao efeito da dose de hEGFl-41, em lesões gástricas induzidas por indometacina na ratazana, expresso como percentagem do melhoramento comparado com o grupo de solução salina; as ratazanas receberam (oralmente) uma dose de indometacina que causa lesão e solução salina ou a dose indicada (oralmente) de EGF ou hEGFl-48. Às 12 horas após a dosagem, os animais foram sacrificados e a extensão do dano gástrico avaliada; a FIGURA 5 é um gráfico de 3 conjuntos comparando a %AUC para o EGF1-49, o EGF1-48 e o EGF, respectivamente; incubaram-se, a 37°C, amostras de cada péptido progenitor, dissolvidas em suco

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000-133/SLC/SCC -7- gástrico humano. Nos tempos indicados, retiraram-se determinou-se a quantidade do péptido progenitor intacto como a área sob a curva do cromatograma de Α2χ4 (absorvância a 214 nanometros); a FIGURA 6 é um gráfico composto mostrando, ao longo do tempo, as percentagens relativas de EGF não hidrolisado (hEGFl--48 e EGF1-53) em tripsina a 1% e 3%; a experiência é a mesma que a descrita na Figura 5 com a excepção de a tripsina ser a fonte de enzima; a FIGURA 7 é um diagrama do "design" do gene para hEGFl-48 mostrando a sequência nucleotídica e sequência de aminoácidos correspondente para a região de codificação do EGF da cassete de expressão de EGF inserida nas estirpes P. Pastoris; para a estirpe contendo apenas a região de codificação do hEGFl-48, os nucleótidos que codificam os resíduos 49-53 não foram incluídos na cassete; a FIGURA 8 é um gráfico mostrando a análise da mitogénese e a de ligação de competição do EGF e do hEGFl-48 em células Balb 3T3; e a figura 9 é um gráfico que mostra o efeito mitogénico do EGF e do hEGFl-48 em células NRK.

Descrição Detalhada e Concretizações preferidas 0 invento, num aspecto, compreende um polipéptido seleccionado de entre hEGFl-48 ou dos seus congéneres adjacentes ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, polipéptido esse que está puro sem corte ou puro com corte, preferivelmente um polipéptido que é sem corte e, preferivelmente EGF1-48 de fórmula 1: (segue fórmula)

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H. Asn. Ser. Asp. Ser. Glu. Cys. Pro. Leu. Ser. His. Asp. Gly. Tyr-1

I I I-Tyr. Met. Cys. Vai. Gly. ASp. His. Leu. Cys<-> | 25 26 | 1—>Ile. Glu. Ala. Leu. Asp. Lys. Tyr. Ala. Cys-1

I I

I- Tyr. Gly. Vai. Vai. Cys. Asn<-I

I I 1->Ile. Gly. Glu. Arg. Cys. Gin. Tyr-1 48 | HO.Lys.Leu.Asp.Arg<—1

Um sal preferido é o sal trifluoroacetato ou acetato.

Também preferido é um polipéptido de fórmula I que é EGF1-48 com corte ou o seu congénere com corte, adjacente, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, preferivelmente com o corte entre a posição 25-26 da cadeia polipeptídica.

Verificámos que o hEGFl-48 é surpreendentemente mais eficaz do que o hEGFl-53 no tratamento de lesões induzidas experimentalmente no tracto gastrintestinal (FIGURA 4). Um resultado típico, por exemplo, no tratamento de lesões induzidas por indometacina na ratazana era uma aparente redução modesta (16%) no tamanho da lesão (lido após 12 horas) no uso do hEGFl-53 a uma dose oral, no tempo zero, de 1,0 nanomoles por kg. (mas sem redução a dosagem mais elevada). O tamanho da redução observado não era, contudo, estatisticamente diferente do dos controlos. Um resultado típico no uso comparável do hEGFl-48 intacto a várias doses orais (0,5, 1,0, 5,0 e 10,0 nmol por kg) variava de 37 a 46% de melhoramento no tamanho da lesão lido após 12 horas versus controlos, um resultado que se considerou significativo com base na análise pelo teste t. Esta utilidade terapêutica única é intensificada pela inesperada, e até aqui não considerada, estabilidade e resistência estrutural, como é indicado, à degradação enzimática do EGF1-48 com corte e sem corte e dos seus

72960 000-133/SLC/SCC congéneres. Verificou-se que o decurso no tempo da degradação do hEGFl-48 puro, intacto (sem corte), por exemplo, no fluido gástrico, era no caso típico apenas ligeiro à uma hora, ligeiro a moderado às quatro horas e marginalmente mais degradado às 19 horas (FIGURA 5), Em contraste, o decurso no tempo comparável do hEGFl-53 aproximava-se da degradação quase completa à uma hora. Semelhantemente, o decurso no tempo do hEGFl-48 intacto em tripsina a 1% ou a 3% (p/p) era ca. de 10% e ca. de 25%, respectivamente, após quatro horas. Em contraste, o decurso no tempo comparável da degradação do hEGFl-53 em tripsina a 1% ou a 3% era ca. de 50% após uma hora e 90-100% após uma hora, respectivamente (FIGURA 6).

Tal como usado aqui, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que mantém a actividade biológica desejada do composto progenitor e não confere efeitos toxicológicos indesejáveis. Exemplos desses sais são (a) sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos, por exemplo ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e semelhantes; e sais formados com ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos naftalenossulfónicos, ácidos naftalenodissulfónicos, ácido poligalacturónico; (b) sais com catiões metálicos polivalentes como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e semelhantes; ou (c) sais formados com um catião orgânico formado a partir de N, N'-dibenziletilenodiamina ou etilenodiamina; ou (d) combinações de (a) e (b) ou (c), e.g., um sal tanato de zinco; e semelhantes. Os sais de adição de ácido preferidos são o sal trifluoroacetato e o sal acetato.

Tal como aqui usado em referência à espécie EGF, o termo "sem corte" significa o polipéptido intacto no qual as três ligações dissulfureto estão intactas ou não quebradas e a cadeia polipeptídica está intacta. 0 termo "com corte" significa que as

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000-133/SLC/SCC -10- três ligações dissulfureto estão intactas e a cadeia polipeptídica tem corte ou está quebrada entre, pelo menos, um par de resíduos adjacentes da cadeia polipeptídica como entre o par de resíduos 25-26. O invento num outro aspecto compreende composições farmacêuticas em forma de dosagem, preferivelmente para administração oral, contendo uma quantidade eficaz do polipéptido descrito (o qual pode ser o EGF1-48 com corte ou sem corte ou o seu congénere adjacente com corte ou sem corte, EGF1-47 ou EGF1-49) e um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável, para a prevenção ou controlo ou tratamento de doenças da mucosa gastrintestinal como doenças inflamatórias ou erosivas, num sujeito. Usa-se uma quantidade do polipéptido que é eficaz para impedir ou controlar a doença no sujeito ou para promover o seu controlo ou cura. Para o tratamento humano, o EGF1-48 sem corte deve ser administrado num regime de dosagem, preferivelmente oral, em quantidades farmacológicas entre cerca de 0,001 nanomoles/kg e pelo menos cerca de 100 nanomoles/kg por dia numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável. O regime para o EGF1-48 com corte ou congénere necessita de uma dosagem mais elevada numa quantidade que varia de cerca de 0,01 nanomoles/kg até pelo menos cerca de 10 micromoles/kg por dia. O tratamento de condições de doença GI pode ser conseguido pela via oral sem inibição da segregação do ácido gástrico no sujeito. 0 invento contempla composições farmacêuticas para a prevenção ou controlo ou tratamento de condições de doença erosiva ou inflamatória como esofagite erosiva ou ulcerosa? condições inflamadas, erosivas ou atróficas (i.e., estar atrofiado) do intestino delgado ou grosso incluindo mas não lhes estando limitadas, gastrite atrófica, úlceras duodenais, úlceras gástricas, duodenite, doença inflamatória do cólon, colite ulcerosa; e semelhantes. Numa concretização preferida de uma forma de dosagem oral e do seu uso, uma quantidade adequada de EGF1-48 com corte ou sem corte ou de um seu congénere adjacente (conforme o caso) é dissolvida em solução aquosa, que pode incluir um estabilizador de celulose, solúvel em água, como descrito na Patente U.S. NB 4 717 717, incorporada aqui para referência, e administrada oralmente.

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Também podem ser usadas outras formas de dosagem oral aqui descritas.

Pode-se administrar terapeuticamente EGFl-48, com corte ou sem corte, ou um congénere adjacente como parte de uma formulação oral comum que inclui um agente anti-úlcera conhecido.

Exemplos de tais agentes anti-úlcera conhecidos na arte são: os chamados antagonistas do receptor da histamina H-2, e.g. cimetidina, ranitidina e famotidina; agentes anti-colinérgicos gástricos, específicos, como a pirenzepina; análogos da prostaglandina E2 como misoprostol ou arboprostil; agentes como sucralfato ou carbenoxolona; inibidores de ATPase H+/K+ como omeprazole; e antiácidos como misturas de hidróxido de alumínio/hidróxido de magnésio. Para uma descrição para leigos desta e de outras drogas, ver Joe Graedon/s The New People/s Pharmacy. Capítulo 5, 134-163, 1985, Bantam Books, Inc., New York, incorporado aqui para referência. 0 agente antiúlcera pode estar presente na composição numa quantidade consistente com a sua actividade terapêutica conhecida. Assim, por exemplo, uma composição oral contendo cimetidina pode conter entre 100 e 1000 mg de cimetidina. A composição farmacêutica oral pode ser formulada por meios conhecidos na arte na forma de, por exemplo, soluções ou suspensões aquosas ou oleosas, emulsões, comprimidos, cápsulas, pastilhas, pastilhas elásticas ou pós dispersáveis.

Num outro aspecto, o invento compreende um processo para a prevenção ou controlo ou tratamento de doenças da mucosa gastrintestinal, incluindo doenças erosivas ou inflamatórias num, sujeito que compreende administrar ao sujeito uma quantidade de EGFl-48 com corte ou sem corte ou do seu congénere adjacente ou um seu sal farmaceuticamente aceitável que seja eficaz para prevenir ou controlar a doença no sujeito ou para promover o controlo ou a própria cura. Para o tratamento de humanos, o EGFl-48 sem corte deve ser administrado num regime de dosagem, de

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000-133/SLC/SCC preferência oral, em quantidades farmacológicas, de preferência entre cerca de 0,001 nanomoles/kg e pelo menos cerca de 100 nanomoles/kg por dia em forma de dosagem farmaceuticamente aceitável. 0 regime para o EGF1-48 com corte ou seu congénere, requer uma dosagem mais elevada numa quantidade que varia de cerca de 0,01 nanomoles/kg até pelo menos 10 micromoles/kg por dia. O tratamento de condições de doença GI pode ser conseguido pela via oral sem inibição da secreção do ácido gástrico no sujeito, o invento contempla o tratamento de condições de doença como esofagite erosiva ou ulcerativa; condições de inflamação, erosão ou atrofia (i.e., estar atrofiado) do intestino delgado ou grosso incluindo, mas não lhes estando limitadas, gastrite atrófica, úlceras duodenais, úlceras gástricas, duodenite, doença inflamatória do cólon, colite ulcerativa? e semelhantes.

Ainda noutro aspecto o invento refere-se a um processo para a preparação de hEGFl-48 sem corte compreendendo os passos de : A. cultivar uma estirpe de expressão de EGF humano da levedura metilotrófica P.pastoris num meio de cultura de fermentação possuindo uma alimentação de metanol, a pH ácido, preferivelmente pH 5, durante um período de crescimento mantido pelo metanol, resultando na formação selectivamente induzida de um caldo de meio de cultura maduro contendo hEGFl-48 sem corte, ou intacto, expresso pela levedura e excluindo o hEGFl-48 com corte, e B. separar o hEGFl-48 do caldo com meios que excluem outras proteínas, especialmente outros tipos de EGF diferentes de hEGFl--48, podendo esses meios de excluir outras proteínas incluir, preferivelmente, tratar primeiro o caldo maduro com tripsina para degradar selectivamente as outras proteínas mantendo intacto o hEGFl-48, empregando por exemplo, tripsina l a 3% no caldo durante uma hora, a 37°C, seguindo-se cromatografia HPLC. A fermentação é realizada a um pH ácido, preferivelmente a pH 5. A porção de alimentação de metanol da fermentação (como descrita aqui, noutra parte) é mantida durante cerca de 24 horas

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000-133/SLC/SCC -13-a cerca de 40 horas, mais preferivelmente, para produção óptima, cerca de 36 horas. Sob estas condições de indução por metanol relativamente curtas, verificámos surpreendentemente gue o único produto de EGF expresso no caldo é o hEGFl-48 sem corte, desejado. Verificámos, contudo, gue quando a porção de alimentação de metanol da fermentação é realizada durante períodos substancialmente mais longos, i.e., um período longo de indução por metanol (e.g., mais do que 40 horas), é obtida uma mistura de ambos os produtos: hEGFl-48 sem corte e hEGFl-48 com corte. Este resultado é exemplificado pelos seguintes ensaios de incubação mantida pelo metanol que são típicos: TABELA I Tempo de Incubação Caldo N= em MeOH %Corte 477 110 horas 50,3 490 40 horas 2,7 O processo empregando a indução curta por metanol é preferido porque facilita o processamento e purificação do hEGFl-48 sem corte, desejado, em forma de sal e sem ser de sal. A separação do hEGF sem corte do caldo pode ser realizada por meios reconhecidos na arte.

Ainda noutro aspecto, o invento refere-se a um processo de produção de hEGF compreendendo os passos de : A. cultivar uma estirpe de expressão de EGF humano da levedura metilotrófica P.pastoris num meio de cultura de fermentação possuindo uma alimentação de metanol, durante um período de crescimento mantido pelo metanol, resultando na formação de um caldo de meio de cultura maduro contendo uma mistura de hEGF sem corte e hEGF com corte, expresso pela levedura,

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000-133/SLC/SCC -14- B. isolar a mistura de hEGF do caldo por passos que compreendem submeter o hEGF a cromatografia em coluna, compreendendo adsorção e eluição a partir de uma resina de forte permuta catiónica sob condições ácidas, para provocar a eluição do hEGF sem corte e do hEGF com corte, respectivamente, como eluatos separados, e C. isolar o hEGF sem corte e o EGF com corte a partir dos respectivos eluatos. Preferivelmente o período do crescimento mantido por metanol é substancialmente mais longo do que 40 horas, até 100 horas ou mais longo, como desejado, para produzir uma quantidade suficiente de hEGF com corte na mistura de caldo.

Uma resina preferida para a cromatografia em coluna é uma resina de sulfoetilaspartamida. Verificámos, surpreendentemente, que apesar de o hEGFl-48 intacto e com corte terem o mesmo tempo de retenção em colunas de HPLC de fase inversa, eles podem ser separados em coluna de forte permuta catiónica sob condições ácidas (FIGURA 3). Sob estas condições, o EGF1-48 com corte tem uma carga positiva adicional quando comparado o EGF1-48 intacto. A coluna preferida é uma coluna de dimensões adequadas, preferivelmente medindo 4,6x200 mm, 300 unidades Angstrom, 5 micra, empregando sulfoetilaspartamida-SCX (disponível em Nest Group). Para a eluição, as fases móveis preferíveis são a fase móvel A compreendendo cinco milimoles de ácido fosfórico, titulado a pH 3 com KOH, e contendo 25% de acetonitrilo e a fase móvel B compreendendo fase móvel A que contém KC1 0,3 molar. As condições preferidas e eluição compreendem um gradiente linear desde a fase A até 70 % de fase B durante, 45 minutos, a 1 ml por minuto. 0 EGF com corte elui após o EGF sem corte e o eluato que o contém é liofilizado na forma pura. Tem o corte entre os resíduos 25 e 26 e verificou-se por sequenciação de proteína que estava totalmente cortado. 0 EGF sem corte é obtido separadamente na forma pura por liofilização do eluato que o contém. 0 invento contempla a produção de qualquer um dos tipos: EGF1-48, EGF1-47 e EGF1-49 por selecção adequada da estirpe de levedura produtora, estirpe que é conhecida ou está disponível por meios reconhecidos na arte.

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Um outro aspecto deste invento é a produção de hEGFl-49. 0 presente processo preferido inclui os passos compreendendo: A. tratar enzimaticamente EGF1-53 por meios adequados, como tratamento com suco gástrico humano, carboxipeptidase ou semelhantes, preferivelmente usando suco gástrico humano como a fonte de enzima, durante um tempo suficiente para converter a maior parte do material de partida em EGF1-49, cerca de duas horas a 37°C em suco gástrico? e B. separar, preferivelmente por procedimentos cromatográficos, o EGFl-49 de outros materiais na mistura reaccional. A reacção enzimática pode ser parada ou extinta por uma variedade de meios incluindo, mas não lhes estando limitados: adição de álcool ou de outro solvente orgânico, ajustamento do pH acima de 3,0 ou imersão do recipiente da reacção num banho gelado para reduzir a temperatura. Na concretização correntemente preferida, os procedimentos cromatográficos descritos para o isolamento do EGF1-48 também foram usados eficazmente para purificar o EGF2-49.

Como indicado, o EGF1-48, com corte e sem corte, e congéneres são, para fins do invento, preferivelmente derivados recombinantemente por processos microbianos, i.e., por técnicas de ADNr.

Produtos EGF por Tecnologia Recombinante 0 conhecimento da sequência de aminoácidos da urogastrona permitiu o projecto e a construção de genes sintéticos que codificam este péptido, o que, por sua vez, permitiu o desenvolvimento de sistemas de expressão recombinantes. Em 1982 descreveu-se o primeiro sistema de expressão recombinante para hEGF que utilizava a bactéria E. coli para produzir hEGF e originando 2,3 mg/1 de material biologicamente activo. Mais tarde, a utilização da sequência de comando do factor de emparelhamento α de S. cerevisiae para dirigir a segregação do hEGF a partir de S. cerevisiae aumentou o nível de expressão de -/7 -16- 72960 000—133/SLC/SCC uma forma do hEGF (1-52) para 5 mg/1. Mais recentemente, descreveu-se um hospedeiro de expressão Bacillus melhorado como segregando 240 mg/1 de hEGF sem degradação apreciável. Com a excepção do sistema Bacillus f para o qual não está disponível informação publicada sobre a produtividade durante o aumento da escala de produção, os níveis de hEGF nestes sistemas recombinantes são baixos. A levedura metilotrófica (que requer álcool metílico como nutriente) Pichia pastoris foi desenvolvida como um hospedeiro melhorado para a produção de produtos recombinantes. As estirpes recombinantes de Pichia pastoris podem segregar, com vantagem, proteínas recombinantes na gama da grama por litro, podem adaptar-se para alimentar culturas em contínuo ou em descontínuo, têm um fenótipo recombinante extremamente estável (i.e., constituição física, bioquímica e fisiológica da levedura) e podem manter rendimentos elevados em aumentos de escala de fermentação de várias ordens. 0 que se segue é uma descrição do desenvolvimento e aumento de escala até uma escala de instalação piloto, incluindo o melhor modo de acordo com o invento, de um processo para a produção e purificação de hEGF bioactivo, para fins ilustrativos usualmente na medida em que o tipo de EGF1-48 é segregado para o meio de crescimento de uma estirpe recombinante de P. pastoris. A. Expressão e Análise Bioquímica de hEGF Segregado por Pichia pastoris 0 promotor de álcool-oxidase (A0X1) usado para actuar a síntese peptídica heteróloga (i.e., tipos diferentes) nos sistemas de expressão P.pastoris é derivado do gene primário da álcool-oxidase. A álcool-oxidase catalisa a oxidação do metanol em formaldeído e peróxido de hidrogénio como o primeiro passo no metabolismo do metanol. 0 desenvolvimento de um protocolo de fermentação que induz a expressão de genes heterólogos regulados por A0X1 foi previamente descrito.

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Resumidamente, a fermentação consiste em três fases distintas. Primeiro, cultivam-se as células em glicerol para acumular biomassa celular enquanto se reprime a expressão do gene heterólogo. Segundo, alimenta-se glicerol a um caudal que mantém o crescimento das células de levedura limitado pelo carbono; a massa celular aumenta mais durante esta fase mas a limitação pelo carbono permite a depressão da via metabólica do metanol de modo que as células se começam a adaptar o crescimento em metanol. Na terceira fase, induz-se a expressão total do péptido heterólogo por introdução de uma alimentação de metanol. Este protocolo foi usado para induzir a expressão de hEGF de três estirpes recombinantes.

Designaram-e duas estirpes de P. pastoris por g+EGF817Sl e G+EGF819S4. Elas contêm duas e quatro cópias, respectivamente, de uma cassete de expressão de hEGF que codifica EGF1-53 integrado no local A0X1 da estirpe hospedeira GS115. Uma terceira estirpe G+EGF206S10 contém seis cópias de uma cassete de hEGF que codifica EGF1-48 integrado no local H1S4 da estirpe hospedeira GS115. Cada cassete de expressão contém o promotor e as sequências de regulação de álcool-oxidase de P. pastoris (A0X1), as sequências que codificam a sequência de comando prepro do factor de emparelhamento a de S. cerevisiae fundida com um gene sintético que codifica, respectivamente, hEGFl-53, hEGFl-53 e hEGFl-48 (FIGURA 7); e a sequência de terminação da transcrição de A0X1. 0 ADN transformante também inclui a sequência HIS4 de P. pastoris.

Utilizou-se rotineiramente a HPLC para quantificar os vários tipos de hEGF presente em caldos isentos de células, de fermentações da estirpe de G+EGF819S4. Nas escalas mais pequenas de fermentação tomou-se, tipicamente, uma série de perfis de HPLC 36 horas após a indução por metanol da expressão de EGF. Nos tempos mais baixos aparecia no cromatograma um único pico de péptido. Às sete ou oito horas da fase de indução por metanol era evidente um segundo pico e representava a espécie principal presente. Após 36 horas de indução por metanol, era evidente um pico principal único, que eluia apreciavelmente mais cedo no -18- 72960 000-133/SLC/SCC gradiente do que os dois picos vistos anteriormente. A análise por espectroscopia de massa e a análise de aminoácidos identificaram os três picos como EGFl-52, EGFl-51 e EGF1-48, respectivamente. Assim, o EGF estava a ser convertido num péptido progressivamente mais curto com o tempo. Verificámos que a conversão do hEGF a partir do EGF1-52 na forma EGF1-48 era dependente do pH. 0 padrão de conversão descrito anteriormente ocorria quando a fermentação era conduzida, preferivelmente a pH 5.

Apenas um tipo de hEGF, hEGFl-47 sem corte, era produzido pela estirpe G+EGF206S10. Esta estirpe contém seis cópias de uma sequência de ADN que codifica o hEGFl-48. B. Actividade Biológica de hEGFl-48 O EGF1-48 humano recombinante, produzido pela levedura foi comparado com o EGF1-53 humano em termos de actividade mitogénica em fibroblastos de rim de ratazanas normais (NRK-49F) e em duas linhas de células murinas. A resposta mitogénica ao EGF é dependente de linha celular. A estimulação máxima na linha de células de ratazana é atingida a cerca de 10"11 M e mantém-se imutável acima de 10“8 M para o EGFl-53. Para o EGF1-48, o efeito é observado a cerca de 10-10 Μ. A resposta mitogénica ao EGFl-53 nas linhas de células murinas ocorre a uma concentração ligeiramente diferente e permanece próxima do máximo numa gama de concentração muito mais estreita (FIGURA 8). A resposta ao EGF1--48 nas linhas de células murinas é muito equivalente à resposta ao EGFl-53 com a excepção de que o efeito máximo ocorre a uma concentração ligeiramente mais elevada e este efeito de pico não é diminuído por aumento adicional da concentração de EGF1-48, em ainda mais contraste com a resposta ao EGFl-53 (FIGURA 8). A avaliação mitogénica utilizando outra linha de célula murina, CH310T1/2, era substancialmente semelhante aos dados para Balb 3T3 com a excepção de que o EGF1-48 parecia ligeiramente mais potente. Em todas as linhas celulares testadas, a resposta máxima ao EGFl-48 é pelo menos tão grande como aquela ao EGFl-53 (FIGURA 8, FIGURA 9).

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C. Aumento de Escala de fermentação e Produção de hEGF à escala de 250 litros

Uma consideração geral no aumento de escala do processo de fermentação é a capacidade de transferência de oxigénio relativamente mais baixa de fermentadores maiores quando comparados com os modelos de laboratório. Esta consideração é especialmente relevante para estirpes de expressão, recombinantes, de Pichia pastoris. A expressão do gene heterólogo é induzida nestas estirpes, pela introdução de uma alimentação de metanol que também é usada para o crescimento das células e para produção de energia metabólica. Devido ao estado altamente reduzido do carbono no metanol relativamente aos hidratos de carbono, o metabolismo do metanol necessita de mais oxigénio por mole de carbono do que o metabolismo dos hidratos de carbono. A elevada necessidade de oxigénio para o metabolismo do metanol é, frequentemente, o factor que limita a taxa de alimentação do metanol e, assim, limita o crescimento e a produtividade.

Fermentação de 15 litros

Investigações preliminares sobre a fermentação mostraram, e isso é uma característica altamente significativa do invento, que a conversão quase quantitativa do hEGF na forma EGF1-48 ocorria após 36 horas de alimentação de metanol. 0 protocolo desenvolvido para uma fermentação de 15 litros permitiu tempo para uma conversão completa da forma EGF1-52 no hEGFl-48 por utilização de um caudal de alimentação de 100 ml/h de metanol que enchia o fermentador até 11 1 em 42 horas. Uma utilização típica de oxigénio de 33 moles de 02/g de metanol medida nestas fermentações recombinantes, em descontínuo, com alimentação, é ligeiramente maior do que as 30 moles de 02/g de metanol descritas para fermentações contínuas de P. pastoris do tipo selvagem. Assim, um caudal de alimentação de 100 ml/h de metanol a um volume de 8 litros necessitaria de uma taxa de transferência de oxigénio de 330 moles de 02 l~1h~1. A fermentação pode ser adaptada a fermentadores com capacidade de transferência de oxigénio mais baixa por redução do caudal de alimentação de

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metanol. Para examinar o efeito da adaptação a fermentadores com capacidade de transferência de oxigénio significativamente mais baixa, a produção de hEGFl-48 foi determinada a caudais de alimentação de metanol de 50 ml/h e 25 ml/h no fermentador de 15 litros. Estes caudais de alimentação reduzidos não originaram diferenças significativas na quantidade de hEGFl-48 produzida, até cerca de 5 gramas por ensaio. Contudo, o tempo necessário para produzir as 5 gramas era 5 dias mais longo a 25 ml/h do que a 100 ml/h. Assim, o processo de fermentação pode ser prontamente adaptado a qualquer fermentador sem perda de rendimento, embora a produtividade seja mais baixa em fermentadores com transferência de oxigénio menos eficiente.

Fermentação de 250 litros A produção de EGF em P. pastoris foi aumentada em escala para um fermentador de 250 litros de instalação piloto (New Brunswick Scientific, Edison, NJ). Um aumento de escala proporcional da alimentação de metanol seria de 1,7 1/h; contudo, tal como antecipado, a capacidade de transferência de oxigénio limitou, inicialmente, o caudal de alimentação de metanol a metade deste caudal. Por isso, a pressão de operação foi aumentada de 34,5 kPa (5 psi) para 68,9 kPa (10 psi) e a aspersão de ar (air sparge) foi enriquecida com oxigénio para aumentar a transferência de oxigénio e permitir um caudal de alimentação de metanol mais elevado. Estas mudanças permitiram um aumento no caudal de alimentação de metanol para 1,2 1/h. Com base em estudos de laboratório, o rendimento volumétrico pode ser mantido a este caudal mais baixo operando o fermentador durante mais 18 horas.

Da inoculação do fermentador até à colheita, as fermentações de 250 litros decorreram durante 80 horas. Estas fermentações consumiram 45 litros de metanol e permitiram recuperação reprodutível por centrifugação do caldo clarificado contendo 50±3 gramas de hEGFl-48. A produção de hEGFl-48 por litro de alimentação de metanol era a mesma à escala de 250 litros que à escala laboratorial.

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000-133/SLC/SCC -21 D. Purificação à Escala Piloto À escala piloto (fermentador de 250 litros), a recuperação e purificação foram monitorizadas por um ensaio de HPLC isocrática, rápida, para hEGFl-48. A purificação foi muito simplificada pelo facto de o hEGFl-48 ser de longe o péptido predominante no caldo. O perfil de HPLC de uma amostra do caldo do fim de um dos ensaios de 250 litros mostrou apenas um pico principal de péptido. No passo inicial de recuperação o péptido foi removido de 200 litros do caldo clarificado por adsorção numa resina de fase inversa. A adsorção foi realizada por passos de modo descontínuo.

Depois de mais do que 90% do EGF estar ligado à resina de fase inversa, o caldo e a resina foram bombeados através de uma coluna onde a resina foi retida por um peneiro de malha de 10 m· A resina foi lavada com ácido acético 0,05 M e o EGF foi, seguidamente, eluido da resina com quatro a oito litros de eluente para se efectuar uma redução de volume do caldo original de quase duas ordens de magnitude. Esta rápida redução de volume reduz o manuseamento de liquido nos passos posteriores. Após um passo de adsorção-dessorção numa resina de permuta catiónica para remover os contaminantes corados, o hEGFl-48 constituía mais do que 85% dos péptidos totais tal como determinado por HPLC analítica. 0 hEGFl-48 foi, depois, submetido a cromatografia por HPLC preparativa, as fracções foram analisadas por HPLC analítica e as fracções seleccionadas foram reunidas. A HPLC foi carregada com uma alíquota contendo 6,7 g de EGF. A recuperação do EGF nas fracções foi de 100%; as fracções mais atrasadas tinham maior pureza. Se os critérios de pureza tivessem sido estabelecidos mais altos, por exemplo 99%, é provável que o carregamento da HPLC tivesse que ser reduzido de modo a evitar perdas apreciáveis nas fracções que não puderam ser reunidas. O acetonitrilo induzido na amostra durante o passo de HPLC foi removido por ligação do EGF a uma resina de permuta catiónica e lavagem com ácido acético 0,05 M. Este passo também removeu a -22- 72960 000-133/SLC/SCC maior parte do ácido trifluoroacético (TFA). O TFA era menos do que 0,1% do produto final que foi liofilizado como um sal acetato.. 0 produto final obtido foi o sal acetato purificado do hEGFl-48 sem corte. Antes da liofilização, o EGF foi esterilizado por filtração através de uma membrana de 2 /tm. 0 procedimento de adsorção-dessorção da permuta iónica usado para a remoção do acetonitrilo é igual ao que resultou na recuperação completa no passo de descoloração. Com base na experiência global com este procedimento, é normal uma recuperação melhor do que 95%. Assim, em operação de rotina à escala de 250 litros, espera-se que o processo descrito produza lotes de mais do que 30 g de EGF purificado.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

A. Estirpes de Produção de EGF

Testaram-se 3 estirpes recombinantes diferentes de P. pastoris quanto à produção de hEGF. Duas estirpes, como foi indicado, continham respectivamente duas e quatro cópias de tuna cassete de expressão de hEGF que codifica o EGF1-53 integrado no local AOX1 da estirpe hospedeira GS115. Uma terceira estirpe G+EGF206S10 contém seis cópias de uma cassete de hEGF que codifica EGF1-48 integrada no local H1S4 da estirpe hospedeira GS115. Cada cassete de expressão contém o promotor de álcool--oxigenase A0X1 de P. pastoris e sequências reguladoras, sequências de ADN que codificam a sequência de comando prepro do factor de emparelhamento α de S. cerevisiae fundida com um gene sintético que codifica respectivamente hEGFl-53, hEGFl-53 e hEGFl-48 (FIGURA 7) e a sequência de terminação de A0X1. 0 ADn transformante também inclui a sequência H1S4 de P. pastoris.

As estirpes recombinantes, produtoras de hEGF, de P. pastoris foram desenvolvidas por transformação da estirpe hospedeira auxotófica de His-Pichia GS115 com vectores contendo dois, cinco ou seis cassetes de expressão de hEGF. 0 vector de expressão constituído por duas cassetes de expressão hEGFl-53 , 72960

000-133/SLC/SCC -23- como indicado, é pA0817 e o que tem cinco cassetes hEGFl-53 é pEGF819. Um vector de expressão constituído por seis cassetes hEGFl-48 é chamado pEGF206. A estirpe GS115 de Pichia pastoris foi o hospedeiro para a transformação com estes vectores.

Depósito de Culturas

Depositaram-se culturas viáveis da estirpe GS115 de P. pastoris. sob os termos do Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA ("ATCC") em 15 de Agosto de 1987 e foi-lhes atribuído o NB de Acesso ATCC 20864, tal como é documentado pela Publicação de Patente PCT Na WO 90/03431, data de Pub., 5 de Abril de 1990, incorporada aqui para referência. 0s vectores não digeridos pA08l7 e pEGF8l9 e o vector linearizado pEGF206 foram transformados em GS115 pelo método do esferoplasto [Cregg et al., Mol. Cell. Biol♦ 5, 3376-3385 (1985), incorporado aqui para referência]. Após selecção e análise por hibridação de Shouthern, indentificaram-se as estirpes seguintes: a estirpe G+EGF817S1 contém duas cópias da cassete que codifica o hEGFl-53 integrada no local A0X1? a estirpe G+EGF819S4 contém quatro cópias da cassete que codifica o hEGFl-53 (uma cópia foi perdida do vector plasmídico de cinco cópias por recombinação durante a transformação) integradas no local A0X1 e a estirpe G+EGF206S10 contém seis cópias da cassete que codifica o hEGFl-48 integradas no local HIS4. B. Protocolos de Fermentação

As fermentações de 15 litros (num fermentador Biolafitte de 15 litros) foram iniciadas num volume de seis litros contendo quatro litros de sais basais [52 ml/1 de ácido fosfórico a 85%, 1,8 g/1 de sulfato de cálcio.2H20, 28,6 g/1 de sulfato de potássio, 23,4 g/1 de sulfato de magnésio.7H20, 6,5 g/1 de hidróxido de potássio] e 400 g de glicerol. Após esterilização, adicionaram-se 25 ml de solução de sais vestigiais PTM^ [6,0 g/1 de sulfato cúprico.5H220, 0,08 g/1 de iodeto de sódio, 3,0 g/1 de -24- 72960 000-133/SLC/SCC sulfato de manganês.H20, 0,2 g/1 de molibdato de sódio.2H20, 20 g/1 de cloreto de zinco, 0.02 g/1 de ácido bórico, 0,5 g/1 de cloreto de cobalto, 65 g/1 de sulfato ferroso.7H20, 0,2 g/1 de biotina e 5,0 ml/1 de ácido sulfúrico (conc.)] e o pH foi ajustado e mantido subsequentemente mantido a 5,0 pela adição de amoníaco gasoso durante toda a fermentação. A formação excessiva de espuma foi controlada pela adição de antiespuma Struktol J673 a 5%. 0 fermentador foi inoculado com um volume de 500 ml de uma cultura de uma noite (D0600=1 a 4) da estirpe que expressa EGF em Base Azotada de Levedura (YNB), 2% de glicerol, fosfato de potássio 0,1 M, pH 6. O oxigénio dissolvido foi mantido acima de 20% por aumento do caudal de ar até 20 litro/minuto, a agitação até 1000 rpm e/ou a pressão do fermentador até 150 kPa durante a fermentação.

Após a exaustão da carga de glicerol inicial,iniciou-se uma alimentação de glicerol a 50%, contendo 12 ml/1 de sais vestigiais PTM^, a um caudal de 120 ml/h; a alimentação de glicerol foi continuada durante 6 horas, tempo ao qual se iniciou a alimentação de metanol, 100% de metanol mais 12 ml/1 de sais vestigiais PTM1# a um caudal de 20 ml/h. A alimentação de metanol foi aumentada em 10% a cada meia hora até se atingir um caudal de 100 ml/h. A fermentação foi, então, continuada durante 25-35 horas.

As condições para os fermentadores de 2 litros e de 250 litros foram transformadas proporcionalmente em escala a partir do fermentador de 15 litros, com a excepção de que o caudal final de metanol foi limitado ao caudal máximo ao qual a concentração de oxigénio dissolvido podia ser mantida acima de 20 % de saturação de ar. Nos fermentadores de 2 litros e de 250 litros, o pH foi controlado com NH40H em vez de NH3 e no fermentador de 250 litros, a aspersão de ar foi suplementada com 02 em alguns ensaios. C. HPLC Analítica

As amostras de caldo a serem ensaiadas por HPLC foram

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000-133/SLC/SCC -25-tratadas por centrifugação durante três minutos numa microcentrifuga para remover células. A HPLC de fase inversa foi realizada numa coluna Waters Bondapak C18 (0,25X30 cm) com uma coluna de protecção C18. A fase móvel A consistia em 0,1% em peso de TFA em água desionizada e a Fase Móvel B era 95% de acetonitrilo/5% de H20 com 0,1% de TFA. A coluna foi equilibrada com uma mistura de 80% de A e 20% de B a um caudal de 1 ml/min. durante 20 minutos, antes de cada ensaio.

Cada ensaio analítico foi de 50 minutos. Os primeiros cinco minutos foram isocráticos a 80% de A, 20% de B; depois a concentração de B foi aumentada linearmente durante os 25 minutos seguintes para 30% de B; e, finalmente, a concentração de B foi aumentada linearmente para 55% durante os 20 minutos finais. A absorvância UV foi seguida a 210 nm. Os diferentes sistemas de HPLC usados em vários locais deram resultados comparáveis.

Um procedimento de HPLC analítico mais curto foi desenvolvido por processos de controlo à escala piloto. O procedimento mais^curttr^eonsistia num ensaio de 10 minutos às condições'Isocráticas de 72% de A, 28% de B. D. Espectrometria de Massa Analítica

Purificaram-se pequenas quantidades de EGF1-47, EGF1-48, EGFl-51 e EGFl-52 a partir do caldo de fermentação por HPLC de fase inversa. Estas amostras purificadas foram analisadas por espectrometria de massa de bombardeamento com átomos rápidos. E. Ensaios de Bioactividade A estimulação mitogénica (i.e., replicação celular) por hEGFl-48 foi determinada em três linhas celulares por absorção de timidina tritiada. Puseram-se em placas de 24 alvéolos, células murinas Balb 3T3, células C3H10T1/2 e células de fibroblastos de rim de ratazana normais (NEK-49F) em DMEM (4,5 g/1 de glucose), vermelho isento de fenol, contendo 5% de soro de vitelo Colorado (Colorado Serum Company) . As células foram cultivadas a 37°C em

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000-133/SLC/SCC atmosfera de 5% de co2. 0 meio foi mudado todos os três dias. As células atingiram a confluência em cerca de três a quatro dias e deixaram-se permanecer à confluência durante 24-48 horas antes do ensaio. 0 meio foi removido e substituído por DMEM contendo BSA 0,1% (Sigma) e 10 U/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco). As células foram deixadas sem soro durante 22 horas, após o que se adicionaram EGF1-53 e EGF1-48 na gama de dosagem 0,0 a 30,0 nM, durante 24 horas. Fizeram-se diluições a partir de uma solução não diluída de cada tipo de EGF cujas concentrações foram determinadas por análise de aminoácido. Para máxima estimulação, as células foram incubadas com soro de vitelo a 5%. Após o período de incubação de 24 horas, adicionaram-se 100 000 cpm/alvéolo de [3H]Timidina (Amersham) e incubaram-se as placas a 34°C, durante 90 minutos. As células foram, seguidamente, tratadas com 1,5 ml de PBS frio, seguindo-se uma incubação de 20 minutos a 4°C em l ml de fixador frio (50% de metanol, 10% de ácido acético e 40% de PBS). 0 fixador foi retirado por aspiração e substituído por 0,4 ml de SDS a 1%. As placas foram colocadas num agitador orbital durante cerca de 15 minutos ou até as células se destacarem. A suspensão de células foi, depois, transferida para frascos de cintilação e adicionaram-se 10 ml de fluido de cintilação (ScintiVerse BD, Fisher Scientific). Os frascos foram agitados em vórtex e colocados num contador beta (LKB 1219, Rackbeta). Por estes ensaios o hEGFl-48 intacto tinha actividade mitogénica comparável à do hEGFl-53, F. Protocolos de Purificação à Escala de 250 litros 0 caldo contendo EGF humano foi separado das células por centrifugação a um caudal de alimentação de 3 LPM e 40 segundos de tempo de impulso (i.e., 40 segundos de intervalo entre as descargas) numa centrífuga, de descarga intermitente, de disco em pilha ("stacked disc"), Alfa-Laval BTPX205, a aproximadamente 13 OOOxg. 0 concentrado celular foi diluído com água desionizada até ao seu volume original e centrifugado como anteriormente. Os caldos clarificados das duas separações foram combinados e clarificados adicionalmente por centrifugação de novo a um caudal

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íi· -27- de alimentação de 6 LPM com um tempo de impulso de 20 minutos. 0 EGF humano foi removido do caldo resultante por adição por passos de uma resina de fase inversa que tinha sido molhada em dois volumes de metanol (ml/g). Adicionaram-se ao caldo duas alíquotas de 200 g cada (300 g no Ensaio 1) e alíquotas subsequentes de 300 g cada uma de Vydac 281TPB 15-20 e a mistura foi agitada durante 15 minutos após cada adição. Subsequentemente a cada adição de resina, mediu-se a quantidade de EGF não ligado que permanece no caldo pelo procedimento de HPLC analítico mais curto. Adicionaram-se alíquotas adicionais de resina até menos do que 10% do EGF de partida permanecer ligado. A resina foi separada do caldo por bombeagem da mistura resina-caldo através de uma coluna (30 cm de diâmetro, Amicon) com um peneiro de malha de 10 μιη no suporte de fundo; o peneiro de topo foi removido antes do procedimento. Depois do caldo ter passado através da coluna, o peneiro de topo foi recolocado e a resina foi lavada com ácido acético 0,05 M. 0 EGF foi, depois, eluido com duas alíquotas de 4 litros de etanol a 38% acidificado com 3 ml/1 de ácido acético glacial. 0 eluato foi descorado por carga de uma alíquota contendo não mais do que 25 g de EGF numa coluna contendo seis litros da resina de permuta catiónica (Resina Macrosorb KAX-CM, sterling Organics) equilibrada em ácido acético 0,06 mM. O EGF foi, depois, eluido da coluna com 12 litros de acetato de amónio 0,3 M e a coluna foi regenerada, como recomendado pelo fabricante, com acetato de sódio 1 M e hidróxido de sódio 0,1 M antes de descorar alíquotas adicionais.

Carregaram-se alíquotas adicionais do eluato da coluna de permuta catiónica, cada uma não contendo mais do que 8 g de EGF, numa coluna de compressão radial de 5,08 cm (duas polegadas) Waters C18 para HPLC preparativa (Waters Delta prep., Modelo 3000). Lavou-se a coluna com uma mistura de nove partes de A e uma parte de B (90% de A, 10% de B, a mesma composição descrita para a HPLC analítica); eluiu-se o EGF num gradiente linear de 40 minutos, aumentando B de 10% para 25%. Recolheram-se amostras (40 ml) de 15 minutos a 30 minutos e avaliou-se a pureza do EGF por

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000-133/SLC/SCC -28- HPLC analítica. Seleccionaram-se e reuniram-se as amostras para se obter uma pureza final superior a 95%. Para remover o acetonitrilo, carregaram-se as fracções reunidas numa coluna de permuta catiónica de 6 litros (resina Macrosorb KAX-CM) e lavaram-se com ácido acético 0,05 M até a concentração de acetonitrilo no eluente ser inferior a 10 ppm, como determinado por cromatografia gasosa. 0 EGF foi eluido com acetato de amónio 0,3 M. 0 eluato foi filtrado através de um filtro âe 2 ju e liofilizado até um teor em humidade final de 8%. 0 produto obtido era hEGFl-48 sem corte puro. A descrição mostra em detalhe meios para a produção de hEGF e, especialmente de hEGFl-48 na forma sem corte, pura. 0 invento foi descrito em detalhe com respeito às suas concretizações particulares, mas contemplam-se pela presente descrição e pela reivindicações anexas, variações e modificações, dentro do espírito e âmbito da presente descrição.

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REIVINDICACÕES 1 - Processo de preparação de factor de crescimento humano epidérmico, hEGFl-48, sem corte caracterizado por compreender os passos de: A. cultivar uma estirpe de expressão de EGF humano, da levedura metilotrófica P. pastoris, num meio de cultura de fermentação, possuindo uma alimentação de metanol, durante um período de crescimento mantido pelo metanol, resultando na formação selectivamente induzida de um caldo de meio de cultura maduro contendo hEGFl-48 sem corte ou intacto expresso pela levedura e excluindo o hEGFl-48 com corte, e B. separar o hEGF do caldo, com meios que excluem outras proteínas incluindo outros tipos de EGF diferentes do hEGFl-48. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fermentação se realizar a pH 5 com uma alimentação de metanol durante um período que optimize a expressão de hEGFl-48 sem corte. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fermentação se realizar com uma alimentação de metanol que termina antes da expressão do hEGF com corte. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a alimentação do metanol ser mantida durante 36 horas. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido meio que exclui outras proteínas compreender tra tar o caldo maduro com tripsina, para degradar selectivamente as outras referidas proteínas, deixando intacto o hEGFl-48, e separação do hEGFl-48 intacto do caldo por meios compreendendo meios cromatográficos. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado por o polipéptido obtido ser puro. 7

Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5,

Claims (23)

1. 72960 000-133/SLC/SCC -30- caracterizado por se formar um sal de EGF1
2. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o sal ser um sal farmaceuticamente aceitável.
3. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se formar o sal trifluoroacetato ou acetato.
4. 10 - Processo de preparação de hEGFl-48 caracterizado por compreender os passos de: A. cultivar uma estirpe de expressão de EGF humano, da levedura metilotrófica P. pastoris, num meio de cultura de fermentação, possuindo uma alimentação de metanol, durante um período de crescimento mantido pelo metanol, resultando na formação de um caldo de meio de cultura maduro contendo uma mistura de hEGFl-48 sem corte e com corte expressa pela levedura, B. isolar o hEGFl-48 do caldo, submetendo o hEGFl-48 a cromatografia de coluna por meio de adsorção sobre e eluição a partir de uma resina de permuta catiónica forte, sob condições ácidas que permitam que o hEGFl-48 sem corte e o hEGFl-48 com corte sejam eluídos como eluídos separados, respectivamente; e C. isolar o hEGFl-48 sem corte e o hEGFl-48 com corte dos eluídos correspondentes.
5. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o período de crescimento ser substancialmente superior a 36 horas.
6. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a referida resina compreender resina sulfoetilaspartamida.
7. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por empregar a fase móvel A compreendendo cinco milimoles de ácido fosfórico titulado a pH 3 com KOH e contendo acetonitrilo a 25% e a fase móvel B compreendendo fase móvel A que contém KC1 0,3 molar.
8. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracteri- -31- 72960 000-133/SLC/SCC zado por as condições de eluição compreenderem um gradiente linear desde a fase A até 70% da fase B, durante 45 minutos a 1 ml por minuto.
9. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os polipéptidos obtidos serem EGFl-48 com e sem corte puros.
10. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se formar um sal de EGFl-48 com ou sem corte.
11. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o sal ser um sal farmaceuticamente aceitável.
12. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por se formar o sal trifluoroacetato ou acetato.
13. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o EGFl-48 com corte, puro, ter a fórmula I: H.Asn.Ser.Asp.Ser.Glu.Cys.Pro.Leu.Ser.His.Asp.Gly.Tyr Tyr. Met. Cys. Vai. Gly. Asp. His. Leu. Cys 25 26 Ile.Glu.Ala.Leu.Asp.Lys.Tyr.Ala.Cys Tyr.Gly.Vai.Vai.Cys.Asn Ile.Gly.Glu.Arg.Cys.Gin.Tyr 48 HO.Lys.Leu.Asp.Arg tendo um corte entre as posições 25 e 26.
14. 20 - Processo de produção de hEGFl-49 caracterizado por compreender os passos de: A. tratar hEGFl-53 por reacção com uma enzima para converter substancialmente todo o referido hEGFl-53 em hEGFl-49; B. interromper a reacção enzimática; e C. separar o hEGFl-49 assim produzido da mistura reaccional e purificação do mesmo. -32- 72960 000-133/SLC/SCC
15. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracteri-zado por a enzima ser suco gástrico humano.
16. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracteriza-do por a reacção se realizar a 37°C durante duas horas e em seguida ser interrompida.
17. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracteri-zado por o polipéptido obtido ser EGF1-49 puro.
18. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracteri-zado por se formar um sal de EGF1-49.
19. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracteri-zado por o sal ser um sal farmaceuticamente aceitável.
20. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracteri-zado por se formar o sal trifluoroacetato ou acetato.
21. 27 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica em forma de dosagem para a prevenção ou tratamento de doenças da mucosa gastrintestinal incluindo doenças inflamatórias e erosivas, caracterizado por compreender a associação de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um polipéptido de acordo com as reivindicações anteriores e de um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
22. 28 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se usar o EGFl-48 ou um seu congénere, ambos com corte.
23. 29 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se usar o EGFl-48 ou um seu congénere, ambos sem corte. Lisboa, “5. 4$J. 199} Por INDU PARIKH 0FICIAL= 1/10

    Dose-resposta: EGF em

    (oxoaq.uoo op %) EjmgoEjguoo ep exej, Dose (ug/kg/d) CDLL