JP3195793B2 - 成長因子の組成、調製および使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は抗潰瘍性を有する物質の新しい成長因子の組
成に関するものである。その成分は新たに見出された上
皮成長因子（EGF）ファミリーの種である蛋白質様ポリ
ペプチドホルモンまたはペプチド（アミノ酸の鎖）であ
る。より詳しくは、それらの成分は新しい、ニック入り
（すなわち損傷鎖）とニックの入らない（無損傷鎖）ヒ
トEGF:hEGF1−48、およびその同属体hEGF1−47、および
hEGF1−49から成る。本出願は純粋なhEGF1−48、投与型
hEGF1−48、hEGF1−48を用いた投与方法、および純粋hE
GF1−48の調製法を含んでいる。

発明の背景 ヒトEGFは53個のアミノ酸から成るポリペプチドで分
子量は約6,000ドルトンである。アミノ酸組成はわかっ
ている。既知のhEGF1−53はRNA、DNAおよび蛋白質合成
の刺戟、さらに細胞増殖の刺戟や胃酸分泌の阻害など種
々の生物学的／薬理学的作用を有する。EGFはほかのポ
リペプチドホルモンであるウロガストロンと同族である
ことがわかっている。文献では時にこのペプチドをEGF
−ウロガストロンとして同定しており、その文献の抄
録、すなわち抄録3492、メルク インデックス、第11
版、552（1989）を引用文献としてここに含める。

EGF、ウロガストロンおよびこれのフラグメントであ
るEGF1−47、EGF1−48およびEGF1−51に関する特許は、
Gregory et al.U.S.特許番号3,883,497;4,032,633;4,03
5,485;および4,820,690の特許、さらにCamble et al.U.
S.特許番号3,917,824の特許を含む。

生物学的活性 EGFの生物学的活性に関する既知の情報から導かれる
一つのコンセンサスは、ヒトEGF1−53は、より活性の低
いhEGF1−48を含む他の化合物を含めたEGF様化合物群の
中で最も強力なものであるということである。

EGFは最初にStanley Cohenとその共同研究者により記
載された。彼らはラットの唾液腺の抽出物をラットの新
生仔に投与すると早期の眼瞼開きと歯の萌出を誘起する
ことを観察した。その後、これらの抽出物からペプチド
EGFが精製され、同定がなされた。EGFは種々の細胞型に
対する強力なマイトジェン（すなわち、有糸分裂または
細胞形質転換を誘起または引き起こす物質）であること
がわかった。EGFは胃腸管中で有糸分裂誘発活性と酸抑
制活性の両活性を有する。

前に示したように、EGFは唾液腺から分離されたが、
そこから胃腸内腔（たとえば窩腔またはチャネル）中に
分泌される。それはまた他の種々のソースから胃腸管中
へ分泌される。このことから胃腸管内のEGFの活性の特
性をしらべるたくさんの試みがなされた。

複数の報告が示すところによるとEGFは犬の胃酸分泌
を用量依存的に抑制するという。他の研究によりこの酸
抑制活性はヒトを含む数種の動物種について確認され
た。胃酸分泌の抑制物質としてEGFは、ヒスタミン−H₂
−アンタゴニストまたはプロトンポンプ阻害剤のような
よく知られた酸抑制療法よりも効力は弱い。このような
胃酸分泌の抑制はEGFを注射（すなわち、非経口投与に
より）で投与した場合には起こるが、EGFを経口的に摂
取した場合には非常に高い用量であっても抑制しない。

胃腸内腔（すなわち、胃または胃腸窩腔あるいはチャ
ネルの他のセグメント）中に投与されたEGFは栄養効果
を有する。すなわち、EGFを胃内投与や内腔中への輸注
を行ったあと、組織質量とDNA合成の増大が起こること
が報告されている。

EGFの経口投与は、酢酸、レーザー照射処置、システ
アミンおよびインドメサシンを含む種々の作用物質のど
れかによって実験的に誘起された胃および十二指腸潰瘍
の治癒を促進することもわかっている。より最近になっ
てわれわれはこの活性に関する作用機構は、EGFによる
誘起病変の上皮再形成（すなわち、新しい修復成長）速
度を促進する能力と関連することを見いだした（図１、
以下記載）。これは上皮再形成フェーズの前の治癒プロ
セスのいくつかの部分に作用すると思われる酸抑制療法
と逆である（図２）。

構造／活性 上に示したように、ヒトEGFは53個のアミノ酸ペプチ
ドであり、これははるかに大きな蛋白質から開裂によっ
て得られる。EGFは６個のシスティン残基を含み、これ
らが３個の共有ジスルフィド結合を作っている。

EGFの構造活性相関はいままでいくつかの研究室での
研究課題になってきた。EGF様化合物群の分子形はEGF1
−52、EGF1−51、EGF1−49、EGF1−48、およびEGF1−47
を含むだけでなく、種々の化学的開裂分子や多数のアミ
ノ酸置換分子を含む。EGFのこれらの分子形は有糸分裂
誘発活性および受容体細胞係合活性に関してEGF1−53よ
りも活性が低いと報告されている。EGF1−52を例外とし
て、EGFのフラグメントでin vivo活性の評価がなされた
ものはなく、これはおそらくEGF1−53よりも効力が少い
だろうという考えがそれぞれの化合物について広まって
いることによると思われる。これらの分子形はすでに分
離されたものとして論文発表されているが、おそらくEG
F1−52だけを例外として均質にまで精製されて均質化と
同一性が特性づけられたものは何もない。

発明の要約 本発明は純粋なヒトEGF（hEGF）種を基礎としてお
り、とくに以下に示すような均一にまで精製された種を
もとにしている：ニックの入らない（または無損傷鎖）
ポリペプチドEGF1−47、EGF1−48、およびEGF1−49;お
よび純粋なヒトEGF（hEGF）種：ニックの入った（また
は損傷鎖）ポリペプチドEGF1−47、EGF1−48、およびEG
F1−49。

このように本発明は、EGF1−48とその同属体EGF1−47
およびEGF1−49（ここでは時にEGF同属体と呼ばれる）
を得る在来法…化学合成、天然EGFの制限蛋白分解、お
よび組換え微生物法のような…はEGF種だけを生成しな
いで、従来検知できなかった同時移動のニックの入った
ものと入らないものの混合物を生成し、これらはクロマ
トグラフ法を含む従来法では本発明以前は分離された純
粋なニツク入りと純粋なニックの入らない種として分離
されたことはなかったものである（図３）。

このように本発明はヒトEGF1−48のニック入りとニッ
クの入らない形、それにまたEGF1−48の隣接EGF1−47と
EGF1−49同属体についてもニック入りとニックの入らな
い形（それぞれ分離分別された新しい分子種として）で
提供する。これらの化合物は胃腸傷害の治療に関して意
外な治療上の効用を有する。こうして、純粋なニック入
りまたは純粋なニックの入らない形のEGF1−48とその同
属体は、それぞれが独得な、そして意外な活性をもって
いる。

純粋なEGF1−48とその純粋な同属体はまた、ニック入
りまたはニックの入らない形で構造的に安定していて酵
素的分解（胃酸およびトリプシン）に対して抵抗性もも
っており、このような安定性と抵抗性の結果、胃腸傷害
の治療に意外な有用性をもたらすのである。

図の簡略な解説 図１はイヌの胃潰瘍の治療におけるEGFの用量反応性
を拘縮率として表わしたグラフである；ここで潰瘍は幽
門洞のレーザー治療により誘起したものである。潰瘍の
治癒過程はくり返し内視鏡で検査することによって追跡
し、その間に病変の画像を得た。各動物について病変の
大きさを測定し、実験のタイムコースに対する病変の大
きさを最小二乗法でフィットした速度定数として上皮再
形成速度を決定した； 図２は潰瘍作成事象と前拘縮期間、拘縮および治癒の
後の潰瘍の大きさの変化を示す潰瘍フェーズの概要図で
ある； 図３は最初にニックの入らない（非損傷）hEGF1−48
を溶出し、そのあとニック入りの種を溶出した場合の時
間経過に対するクロマトグラフ分離プロフィルのプロッ
トである;EGF1−48画分を分別して醗酵のブイヨンから
精製する−この醗酵中に発現が誘起される。この典型的
なクロマトグラムはさらに精製hEGF1−48を、文中に記
述したようにイオン交換樹脂を用いてニック入りと無損
傷種にクロマトグラフで分別できることを証明した； 図４はラットのインドメサシン−誘起胃病変に対す
る、EGFの用量効果をhEGF1−48の用量効果とくらべなが
ら、生理食塩水投与群と比較した改善百分率である；ラ
ットには傷害用量のインドメサシン（経口）および生理
食塩水または指示用量（経口）のEGFかhEGF1−48を与え
た。投与12時間後に動物を屠殺して胃損傷の程度を評価
した； 図５はそれぞれEGF1−49、EGF1−48、およびEGFにつ
いての％AUCを比較した３つのグラフセットである；そ
れぞれの親ペプチドの試料をヒト胃液中に溶解して37℃
でインキュベートした。指定した時間に一定量を取って
無損傷親ペプチドの量をA₂₁₄（214nmでの吸光度）クロ
マトグラムの曲線下面積として測定した； 図６は１％と３％トリプシン中で加水分解されなかっ
たEGF（hEGF1−48とEGF1−53）の相対百分率を時間経過
に従って示したものである；トリプシンが酵素由来であ
ることを除いて実験条件は図５に述べたのと同じであ
る； 図７はhEGF1−48に関する遺伝子計画ダイアグラムで
ある;P.pastoris系中に挿入されたEGF発現カセットのEG
Fコーディング領域に関するヌクレオチドとそれに対応
するアミノ酸配列を示している;hEGF1−48コーディング
領域のみを含む系に関しては、49−53残基に対するヌク
レオチドコーディングはカセット中には含めなかった； 図８はBalb 3T3細胞中のEGFおよびhEGF1−48の有糸分
裂誘発と競合的結合解析を示すグラフである；そして 図９はNRK細胞中のEGFとhEGF1−48の有糸分裂誘発作
用を示すグラフである。

詳細な記載および好ましい態様 一つの見地における本発明はhEGF1−48またはその隣
接同属体または製剤学的に許容しうるそれらの塩から選
択されたポリペプチドから成り、そのポリペプチドは純
粋なニックの入らないまたは純粋のニック入りで、好ま
しくはニックの入らないポリペプチド、そしてまた好ま
しくはつぎのような構造式Ｉである： 一つの好ましい塩はトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩で
ある。

さらにまた好ましいのは、ニックの入ったEGF1−48ま
たはそれのニック入り隣接同属体またはそれの製剤学的
に許容される塩で、ポリペプチド鎖の25と26の間にニッ
クの入ったものが好ましい。

hEGF1−48は胃腸管内に実験的に誘起した病変の治療
において、hEGF1−53よりも驚くほど効力が大きいこと
をわれわれは見出した（図４）。たとえば、一つの典型
的な結果はラットのインドメサシン−誘起病変の治療に
ついてであり、ゼロタイムでkg当り経口用量で1.0nmol
のhEGF1−53を使用したとき、病変の大きさ（12時間後
に測定）は明らかに中程度の減少（16％）を示した（た
だしより高用量では減少なし）。しかし観察された大き
さの減少は統計的に対照との差はなかった。無傷のhEGF
1−48を種々の経口用量（0.5、1.0、5.0および10.0nmol
/kg）で比較して使用した場合の典型的な結果は12時間
目に測定した病変の大きさ減少では37〜46％の改善がみ
られ、ｔ−検定解析により有意なことがわかった。この
独特の治療上の有用性は思いがけない、そして以前には
真価が認められなかった、ニックの入った、そしてニッ
クの入らないEGF1−48とその同属体の構造上の安定性と
酵素分解に対する抵抗によって強められている。たとえ
ば、胃液中での純粋な無傷（ニックの入らない）hEGF1
−48の分解のタイムコースは、典型的なケースでは１時
間ではごく軽微であり、19時間では限界に近いまでさら
に一層分解される（図５）。反対に、hEGF1−53のタイ
ムコースを比較すると、１時間でほとんど完全な分解に
近づいている。同様に、１％または３％トリプシン（w/
w）中の無傷hEGF1−48の分解のタイムコースは４時間後
でそれぞれ約10％と約25％であった。これに対して、１
％と３％トリプシン中のhEGF1−53の分解のタイムコー
スを比較すると、１時間後でそれぞれ約50％と90−100
％であった（図６）。

ここで用いた“製剤学的に許容しうる塩”とは、親化
合物の望ましい生物活性を保持する一方で望ましくない
いかなる毒性作用も新たに付加されていないような塩化
合物を指す。このような塩の例は（ａ）たとえば以下に
示すような無機塩で作られた酸付加塩である：塩酸、臭
化水素酸、硫酸、燐酸、硝酸および同様のもの；および
以下に示すような有機酸で作られる塩である：たとえば
酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマ
ール酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビ
ン酸、安息香酸、タンニン酸、パモイン酸、アルギニン
酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタ
レンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、（ｂ）亜鉛、
カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アル
ミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムおよび
類似のものなど多価金属との塩；または（ｃ）N,N′−
ジベンチルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンか
ら作られた有機カチオンで作られた塩または（ｄ）上に
述べた（ａ）および（ｂ）または（ｃ）の組み合せ、た
とえばタンニン酸亜鉛塩；およびそれと同じようなも
の。好ましい酸付加塩はトリフルオロ酢酸塩と酢酸塩で
ある。

EGF種に関連してここで用いた“ニックの入らない”
という言葉は、３個のジスルフィド結合が無傷で損傷さ
れていない無傷のポリペプチドを意味し、そのポリペプ
チド鎖は無傷のものである。“ニックの入った”という
言葉は、３個のジスルフィド結合は無傷であるがポリペ
プチド鎖にニツクが入っているか、または残基の25−26
対のようなポリペプチド鎖の隣接残基の少なくとも一対
の間がこわされているものを意味する。

他の視点からみた本発明は投与形、より好ましくは経
口投与のための製剤学的組成から成る：この投与形は記
載したポリペプチド（おそらくニックの入った、または
ニックの入らないEGF1−48またはそのもののニック入り
またはニックの入らない隣接同属体EGF1−47またはEGF1
−49であろう）、および被験者におけるびらん性または
炎症性疾患のような胃腸粘膜の疾病の予防または管理ま
たは治療のための製剤学的に許容される稀釈薬または担
体を含む。被験者の疾病を予防または管理し、またはそ
の疾病の管理または治癒を促進するのに効果のあるポリ
ペプチド量を用いる。ヒトの治療に関しては、ニックの
入らないEGF1−48は一つの投与方式、好ましくは経口
で、製剤学的に許容される投与形で１日あたり約0.001n
mol/kgと少なくとも100nmol/kgの間の薬理学的量を投与
すべきである。ニックの入ったEGF1−48または同属体の
投与方式は１日あたり約0.01nmol/kgから少なくとも約1
0μmol/kgというより高い用量を必要とする。胃腸病状
態の治療は被験者の胃酸分泌を阻害することなく経口ル
ートで行うことができるだろう。本発明はびらん性また
は潰瘍性食道炎のようなびらん性または炎症性疾患状態
に対する予防または管理に関する薬理学的組成を企図し
ている；炎症の起こった、びらん性または萎縮性（すな
わち、萎縮した）状態の小腸または大腸で、以下のよう
なものが含まれるが、これらに限るわけではない：萎縮
性胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、十二指腸炎、炎症性腸
疾患、潰瘍性、大腸炎および類似のもの。経口投与形と
その使用の好ましい態様では、ニツクの入ったまたはニ
ックの入らないEGF1−48または隣接同属体（おそらくそ
の場合として）の適当量を水溶液に溶解する：この溶液
は米国特許番号4,717,717に記載されているような水可
溶性セルロース安定剤を含むであろうし、これは参考と
してここに取り入れて、経口的に投与する。ここで記載
したその他の経口投与形も用いることができる。

ニック入りまたはニックの入らないEGF1−48または隣
接同属体は、既知の抗潰瘍剤を含む通常の経口製剤の一
部として治療的に投与してもよい。

技術的に知られているこのような抗潰瘍剤の例として
はつぎのものがある：いわゆるヒスタミンＨ−２受容体
アンタゴニスト、たとえばシメチジン、ラニチジン、お
よびファモチジン；ピレンゼピンなどの胃特異性抗コリ
ン作用性剤；ミソプロストーロまたはアーゼプロスチル
のようなプロスタグランジン同族体；サクラルフェート
またはカーベノキソロンなどの薬剤；オメプラゾールの
ようなH⁺/K⁺AT Pase阻害剤；および水酸化アルミニウ
ム／水酸化マグネシウム混合体のような制酸薬。上記の
ものおよび他の薬剤についての一般向の記載については
引用文献としてこの中に組み入れた Joe Graedon't Th
e New People's Pharmacy,第５章,134−163,1985.Banta
m Books,Inc,New Yorkを参照のこと。

既知の抗潰瘍剤は知られているそのものの治療活性に
一致する量が組成中に存在するであろう。すなわち、た
とえばジメチジンを含む経口組成分は100mgと1000mgの
間のシメチジンを含む。

経口製剤成分は技術的に知られている方法で、たとえ
ば水溶性または油状溶液または懸濁液、乳剤、錠剤、カ
プセル、口内錠、チューインガムまたは分散粉末の形に
製剤される。

もう一つの他の視点において、本発明は被験者におけ
るビラン性または炎症性疾患を含む胃腸粘膜の疾病の予
防または管理または治療に関する方法を含んでおり、そ
の治療は被験者に対してその病気を予防または管理し、
または管理または治癒を促進させるのに有効な量の、ニ
ック入りまたはニックの入らないEGF1−48またはそれの
隣接同属体またはそれの製剤学的に許容される塩を投与
することを含む。ヒトの治療については、ニックの入ら
ないEGF1−48は好ましくは経口投与方式で１日あたり約
0.001nmol/kgと少なくとも約100nmol/kgの間の薬理学的
量を製剤学的に許容しうる投与型で投与すべきである。
ニック入りEGF1−48または同属体についての投与方式は
１日あたり約0.01nmol/kgから少なくとも約10μmol/kg
にいたる範囲のより高用量を必要とする。胃腸病状態の
治療は被験者の胃酸分泌を阻害することなく経口ルート
で実施するのがよい。本発明はビラン性または潰瘍性の
食道炎のような疾病状態の治療を企図している；すなわ
ち萎縮性胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、十二指腸炎、炎
症性腸疾患、潰瘍性腸炎；および類似のものを含むが、
しかしこれらに限定されない小腸または大腸の炎症を起
こした、ビラン性または萎縮性（すなわち、萎縮した）
状態。

なおその他の視点で本発明は以下のステップから成る
ニックの入らないhEGF1−48を作る方法にも関係する： A.メチル依存性酵母P.pastorisのヒトEGF発現系をメタ
ノール投与された醗酵成長培地中、酸性pH、好ましくは
pH5で、メタノール−維持成長期間にわたり増殖させ、
その結果としてニックの入らない、つまり無傷のhEGF1
−48を発現する酵母を含む一方でニック入りhEGF1−48
を除外した成熟成長培地ブイヨンの選択的な誘起生成が
起こる、そして B.他の蛋白質、とくにhEGF1−48以外のEGF種を除外する
方法を用いてブイヨンからhEGF1−48を分離する。この
分離において他の蛋白質を除外するには、たとえばブイ
ヨン中で１から３％のトリプシンを37℃で１時間作用さ
せることによって無傷のhEGF1−48を残しながらその他
の蛋白質を選択的に分解するために成熟ブイヨンをまず
処理し、そのあとHPLCクロマトグラフ法を行うのが好ま
しい。

醗酵は酸性pH、好ましくはpH5で実施する。醗酵のメ
タノール投与部分（この中のどこかで記述したように）
は約24時間から約40時間保持され、最適産生のためには
約36時間がより好ましい。このような比較的短いメタノ
ール誘導の条件下で、意外なことにブイヨン中で発現さ
れた主なEGF産物は望んでいたニックの入らないhEGF1−
48であることがわかった。しかし、醗酵のメタノール投
与部分を十分に長く実施した場合には、すなわち、長い
メタノール誘導期（たとえば40時間以上）のときは、ニ
ックの入らないhEGF1−48とニック入りhEGF1−48両産物
の混合物が得られる。この結果は以下のメタノール−投
与下でのインキュベーション実施の典型例に示される。

短時間のメタノール誘導を用いる方法が好ましい：な
ぜならその方が作業の仕上げと無塩または塩の形での望
みのニックなしhEGF1−48の精製が容易だからである。
ニックの入らないhEGFをブイヨンから分離するのは技術
的によく知られた方法で実施できるだろう。

さらに他の視点では、本発明はhEGFを作る方法に関係
しておりそれは以下のステップから成る： A.メチル依存性酵母P.pastrisのヒトEGF発現系をメタノ
ール投与された醗酵成長培地中、メタノール−維持成長
期間にわたって増殖させ、その結果としてニックの入ら
ないhEGFとニック入りhEGFを発現する酵母の混合物を含
む成熟成長培地ブイヨンが生成する、 B.hEGFをカラムクロマトグラフ法で処理するというステ
ップでブイヨンからhEGFを分離する：このクロマトグラ
フ法の手順はまず吸着させ、ついで酸性条件下強力な陽
イオン交換樹脂で溶出させてニックの入らないhEGFとニ
ック入りhEGFをそれぞれ別々の溶出体として溶出するよ
うにし、そして C.それぞれの溶出体からニックなしのhEGFとニック入り
EGFを分離する。好ましくは、メタノール−維持成長の
期間は40時間よりは十分に長く、100時間またはそれ以
上にすれば、望んだように、ブイヨン混合体中に十分な
量のニックの入ったhEGFが生成する。

カラムクロマトグラフ法のために好ましい樹脂はスル
フォエチルアスパルトアミド樹脂である。無傷とニック
入りhEGF1−48は逆相HPLCカラム上で同じ保持時間を有
するのに、酸性条件下強力な陽イオン交換カラム上で両
者が分離できるということを意外にも見出した（図
３）。これらの条件下、ニックの入ったEGF1−48は無傷
のEGF1−48に比べて１個余分の陽電荷を有する。好まし
いカラムは、できれば4.6×200mm、300Å単位、５μの
適当な大きさのカラムで、スルフォエチルアスパルトア
ミド−SCX（Nest Groupから入手可能）である。溶出の
ための好ましい移動相は、KOHでpH3まで滴定する5mmol
硫酸と25％アセトニトリルを含む移動相Ａと、0.3モルK
Clを含む移動相Ａから成る移動相Ｂである。好ましい溶
出条件はＡ相から70％Ｂ相への線形グラジンエントを１
分間あたり1mlで45分間にわたり実施することである。
ニックの入ったEGFはニックの入らないEGFのあとに溶出
し、それを含む溶出物は純粋な形で凍結乾燥される。ニ
ックは残基25と26の間に入っており蛋白質配列決定から
ニックは完全に入っていることがわかった。ニックの入
らないEGFは、それを含む溶出物を凍結乾燥することに
よって純粋な形で分離して得られる。本発明は、既知の
手段または技術的に認められる手段で得られる産生酵素
を適当に選択することによってEGF1−48、EGF1−47およ
びEGF1−49などの種のどれでも産生することを企図して
いる。

本発明のもう一つの視点はhEGF1−49の産生である。
目下の好ましい方法は以下のステップを含んでいる： A.EGF1−53を以下のような適当な方法で酵素的に処理す
る：すなわち、ヒト胃液、カルボキシペプチダーゼまた
は類似のもの、好ましくは酵素の起源としてはヒト胃液
を用いて、胃液中37℃で出発物質の大半がEGF1−49に変
換するのに十分な時間、約２時間処理する；そして B.好ましくはクロマトグラフ法を用いて反応混合物中の
EGF1−49を他の物質から分離する。酵素反応は以下に示
すような、ただしそれらに限定されない種々の方法によ
って停止または消去できるだろう：アルコールまたはそ
の他の有機溶媒の添加、pHを3.0以上に調整、または温
度を下げるために反応容器を氷冷バス中に浸す。現在の
好ましい態様では、EGF1−48の分離のために記載された
クロマトグラフ手順もまたEGF1−49の精製に効率よく用
いられている。

以上に示したように、発明の目的として、ニック入り
およびニックなしのEGF1−48と同属体は好ましくは微生
物法、すなわちrDNA技法による組換えから得られる。

組換え技術によるEGF産物 ウロガストロンのアミノ酸配列がわかった結果、この
ペプチドをコードする合成遺伝子を計画して構成するこ
とが可能になり、このことが組換え発現系の開発を可能
にした。1982年までに、hEGFに関する最初の組換え発現
系が報告され、そこでは大腸菌（E.Coli）を用いてhEGF
を産生し、生物学的に活性な物質2.3mg/リットルを得
た。その後、S.cerevisiaeからのhEGFの分泌を促すS.ce
revisiae α−交配リーダー配列を用いることによっ
て、hEGFの（１−52）形の発現レベルが5mg/リットルに
まで増加した。スケールアップ中の産生性に関する情報
が何も発表されていないBacillus系を例外として、これ
らの組換え系におけるhEGFの発現レベルは低い。

メチル依存性（栄養としてメチルアルコールを必要と
する）酵母、Pichia pastorisは組換え産物の産生のた
めに改善された宿主として開発された。組換えPichia
pastoris株は有利に組換え蛋白質をg/リットルの大きさ
の範囲で分泌することができ、一回きりまたは連続的培
養を行うのに適応することができ、極端に安定な組換え
表現型（すなわち、酵母の物理的、生化学的および生理
学的構成）を有し、そして醗酵スケールアップの数桁以
上の高収率を維持することができる。

つぎに続くのは、発明に従って生物活性hEGFの産生と
精製に関するプロセスをパイロットプラント規模にもっ
ていく最良の方法を含むスケールアップと開発の記載で
あり、これは通常P.pastorisは組換え株の成長培地中へ
分泌されるEGF1−48種としての実例を示すことを目的と
している。

A.Pichia pastorisにより分泌されたhEGFの発現と生化
学的分析 P.pastoris発現系中での異種（すなわち、異なる種）
ペプチド合成を推進するのに用いるアルコールオキシダ
ーゼ（AOX1）は１次アルコールオキシダーゼ遺伝子から
得られる。アルコールオキシダーゼはメタノール代謝に
おける第１段階としてのメタノールのホルムアルデヒド
および過酸化水素への酸化を触媒する。AOX1−調節異種
遺伝子の発現を誘起する醗酵プロトコールは以前に記載
されている。

簡単に述べれば、醗酵は３つの明確に区別できる段階
から成る。第１に、細胞をグリセロール上で増殖させて
異種遺伝子の発現を抑えながら細胞の塊りにまで増や
す。第２に、グリセロールを酵母細胞増殖が炭素−制限
を保つような速度で補給する；細胞塊はこの段階で一層
増大するが炭素制限のためにメタノール代謝系路の抑制
がとれて、細胞はメタノール上での増殖に適応しはじめ
る。第３段階では、メタノール投与の導入によって異種
ペプチドの完全発現が誘起される。このプロトコールは
３つの組換え株からのhEGFの発現を誘起するのに用いら
れる。

２つのP.pastoris株はＧ＋EGF817S1とＧ＋EGF819S4と
命名された。これらは宿主系GS115のAOX1遺伝子座中へ
組込まれたEGF1−53をコードするhEGFの発現カセットの
それぞれ２および４コピーを含んでいる。３番目の系で
あるＧ＋EGF206S10は宿主株GS115のH1S4遺伝子座に組込
まれたEGF1−48をコードするhEGFカセットの６コピーを
含んでいる。各発現カセットはP.pastorisアルコールオ
キシダーゼ（AOX1）プロモーターおよび調節配列、それ
ぞれhEGF1−53、hEGF1−53およびhEGF1−48をコードす
る合成遺伝子と融合したS.cerevisiae α−交配因子プ
レプロリーダー配列をコードするDNA配列（図７）；そ
してAOX1転写終結配列を含んでいる。形質転換DNAもP.p
astoris HIS4配列を含んでいる。

HPLCは日常業務的にＧ＋EGF819S4株の醗酵からの無細
胞ブイヨン中に存在する種々のhEGF種を定量するのに用
いられる。より小さな醗酵規模では、HPLCプロフィルの
シリースは典型的にはEGF発現のメタノール誘起のあと3
6時間にわたって得られる。最も早い時間に単一のペプ
チドピークがクロマトグラム上に現われた。メタノール
誘起フェーズに入ってから７または８時間までに２番目
のピークが明瞭になり、主要な種が存在することを示し
た。メタノール誘起の36時間後に、前に見られた２つの
ピークよりもグラジエントではかなり早く溶出した単一
の主要ピークが明瞭になった。質量分析とアミノ酸分析
からこれら３つのピークはそれぞれEGF1−52、EGF1−5
1、およびEGF1−48と同定された。こうして、EGFは時間
とともに次第により短いペプチドへと変換された。われ
われは、EGF1−52からEGF1−48型へのhEGFの変換はpHに
依存することを見出した。上に述べた変換パターンは醗
酵をなるべくpH5で実施したときにみられた。

唯一のhEGF種であるニックの入らないhEGF1−47はＧ
＋EGF206S10によって産生された。この株はhEGF1−48を
コードするDNA配列の６個のコピーを含んでいる。

B.hEGF1−48の生物活性 酵母で産生された組換えヒトEGF1−48を、正常ラット
腎臓線維芽細胞（KRK−49F）および２つのネズミの細胞
系中での有糸分裂誘発活性に関してヒトEGF1−53と比較
した。EGFに対する有糸分裂誘発反応は細胞系に依存し
た。EGF1−53については、ラット細胞系中、約10^-11Mで
最高刺戟に達し、約10^-8Mまで不変に保たれた。EGF1−4
8については、その効果は約10^-8Mで観察された。ネズミ
系でのEGF1−53に対する反応は若干異なる濃度で起こ
り、よりずっと狭い濃度範囲にわたって最大値近くにと
どまっている（図８）。ネズミの細胞系中でのEGF1−48
に対する反応は、最大効果が若干高い濃度で起こるこ
と、そしてこのピーク効果はEGF1−53に対する反応とは
反対にEGF1−48の濃度の増大によっても消滅しないこと
を除いてEGF1−53に対する反応とほぼ等価である（図
８）。他のネズミ細胞系であるCH310T1/2を用いた有糸
分裂誘発活性を評価したが、それはEGF1−48が若干より
強力であったことを除いてBalb 3T3のデータと実質的に
同じであった。テストしたすべての細胞系で、EGF1−48
に対する最大反応は、少なくともEGF1−53のそれと同じ
大きさであった（図８、図９）。

C.醗酵のスケールアップと250−リットル規模でのhEGF
産生 醗酵過程のスケールアップにおいて一般に考えられる
ことは実験室モデルに比べてより大きな醗酵器では酵素
転移能が相対的に低いことである。この問題はとくに組
換えPichia pastoris発現株に関連する。これらの株で
はメタノール投与の導入によって異種遺伝子発現が誘起
され、そのメタノールはまた細胞増殖と代謝的エネルギ
ー生成の両方に使われる。炭水化物に比べてメタノール
では炭素が非常に減少した状態のため、炭水化物代謝に
おけるよりも炭素のモル当りより多くの酸素を必要とす
る。メタノール代謝に関して多くの酸素を必要とするこ
ととはしばしばメタノール投与の速度を制限し、したが
って増殖と生産性を制限することになる。

15−リットル醗酵 予備的な醗酵研究からわかったことは、そしてこれは
本発明の極めて重要な特色であるが、メタノール投与後
36時間でhEGFからEGF1−48型へのほとんど定量的な変換
が起こるということである。15−リットル醗酵に関して
開発されたプロトコールでは、42時間で醗酵器を11リッ
トルまで満たすようなメタノールの投与速度、100ml/h
を用いることによってEGF1−52型がhEGF1−48へ完全に
変換するための時間がとられている。これらの投与バッ
チ組換え醗酵中で測定された33モルO₂/gメタノールとい
う典型的な酸素使用は、野生型P.pastorisの連続醗酵の
場合に報告されている30モルO₂/gメタノールよりも若干
高い。このように、８−リットル容量での投与速度100m
l/hメタノールは330モルO₂/リットル/hの酸素転移速度
を必要とするであろう。メタノール投与速度を減らすこ
とによって低い酸素転移能の醗酵器に醗酵を適応させる
ことができる。著るしく低い酸素転移能の醗酵器への適
応の効果を験べるために、15−リットル醗酵器中で50ml
/hおよび25ml/hのメタノール投与速度におけるhEGF1−4
8の産生を測定した。このような投与速度の減少は、１
回あたり約5gまでは産生するhEGF1−48の量に有意の差
を生じさせなかった。しかし、5gを産生するに必要な時
間は100ml/hよりも25ml/hの方が長かった。このよう
に、醗酵プロセスは収率が減少することなくどんな醗酵
器にも容易に適応させることができるが、生産性は酸素
転移の効率が低い醗酵器では低くなるであろう。

250−リットル醗酵 P.pastoris中でのEGF産生を250−リットルパイロット
プラント醗酵器（New Brunswick Scientific,Edison,N
J）にまで規模拡大した。それに比例したメタノール投
与のスケールアップは1.7リットル/hになるだろう；し
かし、予測されるように、まず酸素転移能によってメタ
ノール投与速度はこの速度の半分に制限される。したが
って、操作圧を5psigから10psigに増やし、空気噴霧に
酸素を混入して酸素転移を増やしてより高いメタノール
投与速度にする。このように変えることでメタノール投
与速度が1.2リットル/hにまで増大する。実験室での研
究を基礎にして、醗酵器を18時間長く運転することによ
ってこのような低い投与速度で体積測定上の収率を維持
することができる。

醗酵器の播種から収穫まで、250−リットル醗酵器は8
0時間稼働した。このような醗酵は45リットルのメタノ
ールを消費し、50±3gのhEGF1−48を含む透明なブイヨ
ンを遠心することによって再現性の良い回収ができた。
250−リットル規模でのメタノール投与１リットル当り
のhEGF1−48の産生は実験室規模でのそれと同じであっ
た。

D.パイロット規模精製 パイロット規模で（250−リットル醗酵器）、hEGFの
回収と精製をhEGF1−48のための迅速アイソクラティッ
クHPLC定量法でモニターした。ブイヨン中でhEGF1−48
は断然圧倒的に多いペプチドであるということから精製
は非常に容易であった。250−リットル稼働の一つの端
からのブイヨンの試料のHPLCプロフィルはただ１つの主
要ペプチドピークを示した。最初の回収ステップでその
ペプチドは逆相樹脂上への吸着によって200リットルの
透明ブイヨンから取り除かれた。吸着はバッチ方式で段
階的に実施した。

EGFの90％以上が逆相樹脂に結合したあと、樹脂を10
μ網目スクリーンで保持した円筒を通じてブイヨンと樹
脂を吸み上げた。樹脂を0.05M酢酸で洗滌し、ついでEGF
を４から８リットルの溶離液で溶出し、この場合もとの
ブイヨンの容積からほとんど２桁の大きさほどの減少が
達成されるようにする。この迅速な容積減少によって後
半段階での液体の操作を減らせる。着色汚染物を除去す
るための陽イオン交換樹脂上での吸着−脱着ステップを
行うと、そのあとhEGF1−48は全ペプチドの85％以上に
なることが分析HPLCでわかる。ついでhEGF1−48を分離
用HPLCでクロマトにかけ、各画分を分析HPLCで分析し、
選択画分を貯える。HPLCに6.7gEGFを含む一定量を負荷
した。各画分中のEGFの回収は100％であった；後半の画
分はより高い純度をもっていた。純度基準をぐんと高
く、たとえば99％以上に設定したとすれば、貯蔵できな
い画分中でのかなりのロスを避けるためにHPLCの負荷を
減らすべきであろうということになりそうである。

HPLC段階で試料中に導入されたアセトニトリルは陽イ
オン交換樹脂へEGFを結合させて0.05M酢酸で洗滌するこ
とによって除去する。この段階で大部分のトリフルオロ
酢酸（TFA）も除去される。TFAは酢酸塩として凍結乾燥
した最終産物の0.1％以下である。得られた最終産物は
ニックの入らないhEGF1−48の精製酢酸塩である。凍結
乾燥の前にEGFは0.2μの膜を通して濾過滅菌した。

アセトニトリル除去に用いた陽イオン交換吸着−脱着
手続きは脱色段階で完全な回収がみられた手続きと同じ
ものである。この手続きによる全般的な経験を基礎にす
れば、通常95％以上の好回収が得られる。こうして、25
0−リットル規模での日常業務的操作で、30g以上の精製
EGFのバッチをここに記載したプロセスで産生すること
が期待される。

実験方法 A.上皮成長因子のEGF生産菌株 P.pastorisの３種類の異なった組換え菌株について、
hEGFの生産の試験を行った。指摘したように、２種類の
菌種は、それぞれ、宿主の菌種GS115のAOX1遺伝子座に
組込まれたEGF1−53をコードするhEGF発現カセットの、
２つまたは４つのコピーを含んでいた。３番目の菌種Ｇ
＋EGF206S10は、宿主菌種GS115のH1S4遺伝子座に組込ま
れたEGF1−48をコードするhEGFのカセットの６つのコピ
ーを含んでいる。各発現カセットは、P.pastorisアルコ
ールオキシダーゼAOX1促進剤、また調節配列、hEGF1−5
3、hEGF1−53とhEGF1−48をそれぞれエンコードする合
成遺伝子に融合したS.cerevisiaeα−交配因子プレプロ
リーダー配列をコードするDNA配列（図７）、そしてま
たAOX1転写終結配列を含んでいる。形質転換DNAはま
た、P.pastoris H1S4配列を含んでいる。

P.pastorisの組換えhEGF−生産菌株は、2,5または６
つのhEGF発現カセットを含むベクターをもった栄養要求
性His−Pichia宿主菌株GS115の形質転換によって発生し
た。２つのhEGF1−53発現カセットからなる発現ベクタ
ーは、指摘したように、PA0817であり、また５つのhEGF
1−53カセットをもつものはPEGF819である。６つのhEGF
1−48カセットからなる発現ベクターは、PEGF206と呼ば
れる。

Pichia pastoris菌株GS115は、これらのベクターに
よる形質転換のための宿主であった。

培養菌の寄託 P.pastoris菌株GS115の能力のある培養菌は、ブタペ
スト條約の約定に基づき、1987年８月15日に米国のメリ
ーランド、ロックビルのアメリカン基準培養菌保存機関
（“ATCC"）に預けられ、1990年４月５日付け発行のPCT
特許公報番号WO90/03431により文書で証明されたように
ATCC受託番号20864に指定され文献で引用してある。消
化されないベクターのPA0817とPEGF819及び線型ベクタ
ーのPEGF206は、スフェロプラスト法〔文献に引用、Cre
gg et al.,Mol.Cell.Biol.5,3376−3385（1985）〕でGS
115に転換した。サザンハイブリッド形成による選別と
分析の後に次の菌株を同定した：菌種Ｇ＋EGF817S1は、
AOX1遺伝子座に組込まれたhEGF1−53−コード化カセッ
トの２つのコピーを含んでいる；菌種Ｇ＋EGF819S4は、
AOX1遺伝子座に組込まれたhEGF1−53コード化カセット
の４つのコピー（形質転換中、組換えによる５つのコピ
ープラスミドベクターの中１つのコピーを失った）を含
み、また、菌種Ｇ＋EGF206S10は、HIS4遺伝子座に組込
まれたhEGF1−48−コード化カセットの６つのコピーを
含んでいる。

Ｂ・発酵計画 15リットル発酵（15リットルのバイオラヒテ発酵槽）
は、４リットルの基礎塩〔52ml/の85％燐酸、1.8g/
二水硫酸カルシウム、28.6g/硫酸カリウム、23.4g/
七水硫酸マグネシウム、6.5g/水酸化カリウム〕と400
gのグリセリンを含む６リットル容量で開始した。殺菌
後、25mlのPTM₁微量塩〔6.0g/五水第一硫酸銅、0.08g
/沃化ナトリウム、3.0g/一水硫酸マグネシウム、0.
2g/二水モリブデンナトリウム、20g/塩化亜鉛、0.0
2g/ホウ酸、0.5g/塩化コバルト、65.0g/七水硫酸
第一鉄、0.2g/ビオチン及び5.0ml/硫酸（濃厚）〕
を添加し、pHを調整し、その後発酵中アンモニアガスを
添加して5.0に維持した。過剰の泡立ちは５％ストラク
トルJ673泡消剤を添加して調整した。発酵は、酵母窒素
ベース（YNB）、２％グリセリン、0.1M燐酸カリウム、p
H6で、EGF−発現菌株の500mlの一夜培養｛OD₆₀₀＝１か
ら４｝によって接種した。溶解した酸素は、空気流入速
度を20リットル／分まで、また撹拌を1000rpmまで、あ
るいはまた発酵中の発酵槽の圧力を1.5バールまで増加
することによって20％に維持した。

最初のグリセリン供給量が消費された後、12ml/のP
TM₁微量塩を含む50％のグリセリンの供給を120ml/hの速
度で開始した；グリセリン供給を６時間続けた時点で、
100％メタノール＋12ml/PTM₁微量塩のメタノール供給
を20ml/hの速度で開始した。メタノール供給は、100ml/
hになるまで30分に10％づつ増加した。発酵をその後25
〜35時間継した。

溶解酸素濃度が20％以上の空気飽和状態に維持される
ように最終メタノール供給速度を制限した以外は、２リ
ットルと250リットル発酵の條件は15リットルの発酵槽
から比例的に計算した。２リットルと250リットル発酵
槽中で、pHはアンモニアよりもむしろ水酸化アンモニウ
ムで調整し、また250リットル発酵槽では、空気散布
は、いくつかの実験で酸素を補充した。

C.分析HPLC HPLCで分析される肉汁試料は、細胞を除くためにミク
ロ遠心機で３分間遠心分離処理を行った。逆相HPLCは、
C18保護カラムを備えたウオーターズボンドパックC18
（0.25×30cm）カラムで行った。移動相Ａは、脱イオン
水中の重量換算で0.1％のTFAからなり、移動相Ｂは、95
％アセトニトリル/0.1％TFAを含む５％水であった。カ
ラムは、各処理前に、80％Ａと20％Ｂの混合液を流速1m
l/分で20分間処理して平衡状態にした。

各分析時間は50分であった。最初の５分間は、80％
Ａ、20％Ｂを無勾配で流した；次にＢの濃度を25分間に
30％Ｂまで直線的に増加させた；そして最後にＢの濃度
を最後の20分間に55％まで直線的に増加させた。UV吸収
は210nmでモニターを行った。色々な場所で用いた異な
ったHPLC系は同じような結果を示した。

より迅速な分析HPLC法が、パイロット規模におけるプ
ロセス制御で開発された。迅速な方法は、72％Ａ、28％
Ｂの無勾配條件で10分で行われた。

D.分析マススペクトル法 小量のEGF1−47、EGF1−48、EGF1−51及びEGF1−52を
逆相HPLCにより発酵肉汁から精製した。これらの精製試
料を高速原子衝撃マススペクトル法で分析した。

E.生物活性分析 hEGF1−48によるマイトジエン（すなわち細胞複製）
刺戟は、３つの細胞系について、トリチウム化されたチ
ミジンの摂取量で決定された。マウスのバルブ3T3細
胞、C3H10T 1/2細胞及び正常ラットの腎臓繊維芽細胞
（NRK−49F）細胞を、５％コロラド子牛血清（コロラド
血清会社）を含むDMEM（4.5g/グルコーズ）、フェノ
ールレッド−フリー中の24のウエルプレート中に置い
た。細胞は５％炭酸ガス雰囲気中に37℃で増殖させた。
培地は３日毎に変えた。細胞は、３日か４日で集密状態
に達し、分析前24〜48時間の間集密状態で残すようにし
た。培地を除き、0.1％BSA（シグマ）と10U/mlのペニシ
リン／ストレプトマイシン（ギブコ）を含むDMEMと取り
替えた。細胞を22時間血清欠乏状態にした後、EGF1−53
とEGF1−48を0.0から30.0nMの用量範囲で添加し24時間
おいた。稀釈液は、アミノ酸分析で濃度が決められた各
EGF種の保存溶液から作られた。刺戟を最大にするた
め、細胞を５％子牛血清で培養した。24時間の培養期間
後、〔3H〕チミジン（アマーシャム）の100,000cpm/ウ
エルを添加し、プレートを34℃で90分培養した。次に細
胞を1.5mlの冷たいPBSで洗い、その後1mlの冷たい固定
液（50％メタノール、10％酢酸及び40％PBS）により４
℃で20分間培養した。固定液を吸い出し、１％SDSの0.4
mlと取り替えた。プレートを軌道振とう機に15分間また
は細胞が脱離するまで置いた。細胞懸濁液を次にシンチ
レーション瓶に移し、10mlのシンチレーション流体（シ
ンチバースBD、フイッシャーサイエンティフィック）を
添加した。瓶を渦状にしてベータカウンター（LKB121
9、ラックベータ）に置いた。これらの分析により、無
損傷hEGF1−48は、hEGF1−53のそれと同等のマイトジエ
ン活性を示した。

F.250リットル規模での精製計画 ヒトEGF含有肉汁は、アルファ−ラバルBTP×205積重
ねディスク中で、間欠放出、約13,000×ｇの連続遠心分
離で、3LPMの供給速度と40秒のシュート時間（すなわ
ち、40秒の放出間隔）で細胞から分離した。細胞濃度を
元の容量まで脱イオン水で稀釈し、前と同様に遠心分離
した。２回の分離から得たきれいな肉汁を一緒にして、
再び20分のシュート時間で6LPM供給速度の遠心分離によ
ってきれいにした。

ヒトEGFは、２倍量のメタノール（ml/g）中で湿った
逆相樹脂の段階的添加によって、処理した肉汁から取除
いた。ビダック281TPB15〜20の各200g（実験１は300g）
の２個の分割量とその後の各300gの分割量を肉汁に加
え、それぞれの添加後に15分間撹拌した。各樹脂添加
後、肉汁中に残った結合しないEGFの量を迅速分析HPLC
法で測定した。結合せずに残ったEGFが開始時の10％よ
りも少なくなるまで、さらに樹脂分割量を添加した。

底の支持部に10μメッシュふるいをもったカラム（30
cm直径、アミコン）に、ポンプによって樹脂…肉汁混合
液を通し、肉汁から樹脂を分離した；頂部のふるいは処
理前に取りはづした。肉汁がカラムを通過した後、頂部
ふるいを戻し、樹脂を0.05M酢酸で洗浄した。次に、3ml
/氷酢酸で酸性にした38％エタノールの４リットル分
割量２個でEGFを溶出した。0.06mM酢酸中で平衡状態の
カチオン交換樹脂（マクロソルブKAX−CM樹脂、スター
リングオルガニクス）の６リットルを含むカラム中に、
25gEGF以下の量を含んだ分割量を加えることによって溶
出液を脱色した。次に、EGFを0.3M酢酸アンモニウム12
リットルでカラムから溶出し、カラムは、業者の推せん
のように、追加分割量の脱色前に1Mの酢酸ナトリウムと
0.1Mの氷酢酸ナトリウムで再生した。

各8gEGF以下の量を含むカチオン交換カラムから得た
溶出液の分割量は、調整用HPLC（ウオーターズデルタプ
レプ、モデル3000）の２インチ径の放射状加圧ウオータ
ーズC18カラムに加えた。カラムを、９部のＡと１部の
Ｂ（90％Ａ、10％Ｂ、分析HPLCで述べたのと同様の組
成）の混合液で洗浄した;EGFは、Ｂを10％から25％に増
加させた40分の直線勾配で溶出した。15分から30分の間
の試料（40ml）を集め、EGF純度を分析HPLCで検定し
た。最終純度が95％以上になるように試料を選別し一緒
にした。アセトニトリルを除くために、一緒にしたフラ
クションを、６リットルのカチオン交換カラム（マクロ
ソルブKAX−CM樹脂）に加え、溶出液中のアセトニトリ
ル濃度が、ガスクロマトグラフ法による測定で10ppm以
下になるように0.05M酢酸で洗浄した。EGFは0.3M酢酸ア
ンモニウムで溶出した。溶出液は0.2μフィルターを通
して濾過し、最終水分含量が８％になるように凍結乾燥
した。得られた生成物は純粋な、ニックの入らないhEGF
1−48であった。

説明は、hEGFを生産する詳細な方法の中に、そして特
に純粋な、ニックの入らない形のhEGF1−48について示
してある。

発明は、特別な実施例の観点から詳細な説明を行った
が、この明細書の思想と範囲内での妥当な変化と修正
は、この明細書と附属の請求範囲によって予想される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アマラント，タンチム イスラエル国76 100 レホボト，ラム バム ストリート 68 (72)発明者 ググリエッタ，アントニオ アメリカ合衆国48105 ミシガン州アン アーバー，ナンバー 137，ウインド ウッド ドライブ 2750 (56)参考文献 特開 昭60−231617（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−77823（ＪＰ，Ａ) 米国特許3917824（ＵＳ，Ａ) ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＨＡＲＭＡＣ ＯＬＯＧＹ（1980）Ｖｏｌ．17，Ｎｏ. ３，ｐ．314−320 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/485 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリペプチド鎖にニックが入っていない、
   純粋なhEGF1−48、その近隣の純粋なhEGF1−47とhEGF1
   −49同属体及び医薬として許容しうるそれらの塩からな
   る群から選ばれるポリペプチド。
2. 【請求項２】医薬として有効な量の請求の範囲第１項記
   載のポリペプチドおよび医薬として許容しうる稀釈剤ま
   たは担体を包含する、胃腸粘膜の疾患を含むびらん性及
   び炎症性粘膜疾患の予防または管理または治療のための
   投与量形態の医薬組成物。
3. 【請求項３】hEGF1−48またはその同属体はニックが入
   っていない請求の範囲第２項の組成物。