JPH01502746A - インシュリン向性ホルモン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 インシュリン向性ホルモン 発明の背景 産業上の利用分野 本発明は、プレホルモン、プログルカゴンのある種のペプチドフラグメントがホ ルモン様活性を有し、ホルモン、即ちインシュリンの合成および分泌を刺激する のに使用し得るという発見に関するものである。これらのペプチドフラグメント は、糖尿病の治療に有用膵臓の島（ランゲルハンス島）細胞における内分泌は血 液−骨代謝（グルコース、アミノ酸、カテコールアミン等）のみならず、局所の バラクリンの影響等、複雑なコントロール下にある。主な膵島ホルモン（グルカ ゴン、インシュリンおよびソマトスフチン）は、それらに特異的な細胞型（夫々 、Ａ、ＢおよびＤ型細胞）の間で相互作用し、代謝物質によって伝達（ｍｅｄｉ ａｔｅ）される分泌応答を変１１（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する。インシュリン分泌 は、血中の糖（グルコース）濃度によって優先的にコントロールされているが、 グルカゴンおよびソマトスフチンもグルコースによって伝達されるインシュリン の分泌応答を、夫々、刺激および抑制する。既に提案されているインシ二リン分 泌に対する島内のバラクリン制御以外に、腸内にもインシュリン向性因子が存在 することを示す証拠がある。この概念は、経口摂取されたグルコースのインシュ リン分泌刺激作用が、同等量の静脈内投与されたグルコースに比べてはるかに強 いという観察結果に基いている。

ヒトホルモン、グルカゴンは、膵Ａ細胞で産生される２９アミノ酸のペプチドホ ルモンである。このホルモンは、セクレチン、胃酸抑制性ペプチド、血管作用性 腸ペプチドおよびグリセンチン等、構造上、似通ったペプチドの、マルチ遺伝子 ファミリーに属している。

これらのペプチドは、炭水化物代謝、胃腸の運動性、および分泌工程等を様々に 制御している。しかしながら、膵グルカゴンの基本的な作用として認識されてい るのは、グリコーゲン分解と糖新生の促進作用であり、その結果としての血中糖 濃度上昇作用である。このことに関連し、グルカゴンの作用はインシュリンと反 対の制御効果を顕し、糖尿病を伴った高血糖症をもたらすことになる［Ｄ　ｉａ ｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ、ルンドら（Ｌｕｎｄ、　Ｐ、に、）Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、ＵＳＡ　７９：３４５−３４９（１９８２）１ ゜グルカゴンは、インシュリン産生細胞の表面に存在する特異的リセブターと結 合し得ることが見出された。これらのりセブターと結合すると、グルカゴンは該 細胞を刺激してｃＡＭＰの迅速な合成をもたらす。次いで、ｃＡＭＰが、インシ ュリン発現を刺激することが見出された［コーマンら（Ｋｏｒｅａｎ、　Ｌ、Ｙ 、）、Ｄ　１ａｂｅｔｅｓ、　３４　ニア１７−７２２（１９８５）］。インシ ュリンはグルカゴン合成阻害作用を有する［Ｒｅｖｉｅｖ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａ ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、ゲノング（Ｇ　ｅｎｏｎｇ＋Ｗ、Ｆ、）、１９７９ 、Ｌ　ａｎｇｅ出版、ロス・アトラス、カリフォルニア、ｐ、２７３コ。このよ うに、グルカゴンの発現は、インシュリンにより、究極的には血中糖濃度により 、注意深く制御されてＬＸる。

グルカゴンの遺伝子は、まず、６３０塩基対の前駆体が翻訳されてポリペプチド 、プレプログルカゴンとなる（ルンドら、１９８２）。

次いで、このポリペプチドがプロセッシングされてプログルカゴンになる。パフ ＪＬルトら（Ｐ　ａｔｚｅｌ　ｔ＋　Ｃ、）、Ｎａｔｕｒｅ、　２８２　：２６ ０−２６６（１９７９）は、プログルカゴンがグルカゴンと第２のペプチドとに 開裂されることを示した。ルンドら（Ｌｕｎｄ、　Ｐ、　Ｋ、）、ロペッら（Ｌ ｏｐｅｚ、　Ｌ、Ｃ，）およびベルら（Ｂｅｌｌ、Ｇ、　１．）（Ｎａｔｕｒｅ ）３０２　ニア１６−７１８（１９８３）は、リジン−アルギニンジペプチド残 基の直ぐ後方でプログルカゴン分子が開裂されることを示した。海峡の研究にお いて、この動物のグルカゴンも隣接するアルギニン−リジンジペプチド残基およ びアルギニン−アルギニンジペプチド残基の直ぐ後方で開裂されることが示され た［アンドリューら（Ａ　ｎｄｒｅｖｓ。

Ｐ、Ｃ０）　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６０：３９１０−３９１４ （１９８５）］。

ロベツら（Ｌｏｐｅｚ、Ｌ、Ｃ，）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、　８０：５４８５−５４８９（１９８３）］およびベルら（Ｂｅ１１． Ｇ、１．）は、哺乳類のプログルカゴンは、リジン−アルギニンジペプチドまた はアルギニン−アルギニンジペプチドの部位で開裂されること、並びに、プログ ルカゴン分子は３つの異なった、高度にホモローガスなペプチド分子、即ち、グ ルカゴン、グルカゴン様タンパク質１（ＧＬＰ−１）およびグルカゴに様タンパ ク質２（ＧＬＰ−２）を含有していることを示した。ロペッらは、グルカゴン様 タンパク質１は３７アミノ酸残基の長さであってグルカゴン様タンパク質２はア ミノ酸残基３４の長さであると結論した。ラットのプレプログルカゴンの構造に 関する同様の研究でも、タンパク分解的開裂のパターンについて、隣接するりジ ン−アルギニンジペプチドか、アルギニン−アルギニンジペプチドの間で開裂さ れ、グルカゴン、ＧＬＰ−１、およびＧＬＰ−２が生成されることが分った［ハ インリッヒら（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ、Ｇ、）、　Ｅ　ｎｄｃｒｉｎｏｌ、にＬ」シ ：２　１　７６−２　１８　１（１９８４）コ。

ヒト、ラット、ウシおよびハムスターのＧＬＰ−１の配列は同一であることが分 うた［ギグリオンら（Ｇ　ｈｉｇｌｉｏｎｅ、　Ｍ、　）、Ｄ　ｉａｂｅｔｏｌ ｏｇｉａ。

、？ニヱー：５９９−６００（１９８４）コ。

ロベツらのＧＬＰ−１の大きさに関する結論はラテンタルら（Ｕｔ臓に存在する ＧＬＰ−１の分子型を調べた。彼等の研究により、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２ は、夫々、３７アミノ酸および３４アミノ酸からなるペプチドとして膵臓に存在 していることが示された。

ＧＬＰ−１とグルカゴンとの類似性は、多くの初期の研究者に、ＧＬＰ−１にも 生物学的活性が存在し得るという示唆を与えていた。

ある研究者達は、ＧＬＰ−１がラット脳細胞のｃＡＭＰ合成を誘発し得ることを 見出した［ツーサインら（Ｈｏｏｓｅｉｎ、　Ｎ　、　Ｍ、　）　Ｆ　ｅｂｓ、 　Ｌ　ｅｔｔ。

１ユ８：８３−８６（１９８４）］が、他の研究者達はＧＬ、Ｐ−１になんらの 生理学的作用を同定することもできなかった（ロベツら）。ＧＬＰ−１の生理学 的作用の同定における失敗は、研究者達に、ＧＬＰ−１が実際にホルモンである か否か、およびグルカゴンとＧＬＰ−１との近縁関係は人為的なものではないか という疑問を抱かせた（ギグリオンら）。

結局、従来技術では、グルカゴンホルモンの前駆体がプロセッングされて、広範 囲にわたってホモロジーな１組のペプチドが生じることが認識されたことになる 。当該技術分野における°多くの人々が、これらの高度に関連しているグルカゴ ン様ペプチドには当然生物学的活性があると考えていた。にもかかわらず、これ ら分子の生物学的作用の解明を目指した多くの研究者が不成功に終ったのである 。

発明の要約 ホルモングルカゴンは、高分子量の前駆体として合成され、それがタンパク分解 的に開裂されて３つのペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ −１）およびグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）となることが知られている 。ＧＬＰ−１は、プロセッングされない状態では３７アミノ酸からなる。本発明 は、未プロッセシングＧＬＰ−１が自然に、ＧＬＰ−１の７−３７アミノ酸を有 する３１アミノ酸長のペプチド（７−３７ベブチド）に変換されることを開示す るものである。このプロセッングは、膵臓および腸管内で起こる。この７−３７ ベブチドはこれまで報告されたことのないインシュリン向性（インシ１リノトロ ピック）ホルモンである。このホルモンの作用は膵β細胞に特異的であり、該細 胞のインシュリ１　ン生合成を誘導すると思われる。プロフセシングされていな いＧＬＰ７１は、本質的に、インシュリンの生合成の誘発を伝達することができ ない。このインシュリン向性ホルモンは、インシュリン分泌の動力学が異常にな っている、成年期発現性の糖尿病の病因研究に有用である。

図面の簡単な記述 第１図は、ヒト、う・ノドおよびハムスターのプレプログルカゴンのＤＮＡ構造 および対応するアミノ酸配列を示す模式図である。プレプログルカゴンは、丸で 示した部位でタンパク分解的に開裂される。

第２図はラット島細胞種の細胞内ｍＲＮＡレベルに対するＧＬＰ−１ペプチドの 影響を示す図である。

第３図はラット島細胞種の細胞内アンギオテンシノーゲンｍＲＮＡレベルに対す るＧＬＰ−１ペプチドの影響を示す図である。

第４図はラット島細胞種の細胞内アクチンｍＲＮＡレベルに対するＧＬＰ−１の 影響を示す図である。

第５図は、ＧＨ４細胞内プロラクチンｍＲＮＡレベルに対するＧＬＰ−１（１− ３７）の影Ｊを示すＸ線図である。

第６図は、ＡＬＴ−２０細胞内ＡＣＴＨｍＲＮＡレベルに対するＧＬＰ−１（１ −３７）の影響を示す図である。

好ましい実施態様 決定されたヒトＧＬＰ−１のアミノ酸配列から選択されたペプチド部分（断片） は本発明を含む開発の出発物質である。ＧＬＰ−１のアミノ酸配列は、数人の研 究者によって報告されている［ロペッら（１９８３）、ベルら（Ｂｅ１１．Ｇ、 １．）Ｎａｔｕｒｅ％３０２ニア１６　７１８（１９８３）、ハインリッヒら（ １９８４）、ギグリオンら（１９８４）コ。プレプログルカゴン遺伝子の構造お よび対応するアミノ酸配列を第１図に示す。この図面は、前駆体遺伝子がタンパ ク分解的プロッセシングを受けてグルカゴンと２つのグルカゴン様ペプチドが産 生される状態をも示すものである。本明細書中、ＧＬＰ−１（１−３７）という 表記は１（Ｎ末端）から３７（Ｃ末端）までの全アミノ酸を含有するＧＬＰ−１ ポリペプチドを指す。同様に、’ＧＬＰ−１（７−３７）は、７（Ｎ末端）から ３７（Ｃ末端）までの全アミノ酸を含。

有スるＧＬＰ−１ポリペプチドを意味する。

１つの実施態様では、ペプチド断片は、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ 、　Ｊ、Ｍ、）［Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、８５：２１４９（１９６２）コおよび スチュワード（Ｓ　ｔｅｖａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）［５ｏｌｉｄ　 Ｐｈａｓｅ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、　（Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｓａ ｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ｌ　９５９）、２７′６６頁コ記載の周知の固相ペ プチド合成法で合成する。しかしながら、タンパク分解的な酵素を用い、天然に 存在するアミノ酸を断片化してプログルカゴンポリペプチドまたはＧＬＰ−１断 片を得ることもできる。さらに、マニアティスら（Ｍａｎｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、 ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ１９８２）の記載 による組換えＤＮＡ技術を用いてプログルカゴンペプチドの所望の断片を得るこ ともできる。

本発明は、天然に存在するアミノ酸配列から誘導された、インシュリン向性のペ プチド断片を提供するものである。

本発明は、式： ％式％ で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片、並びにその機能的な誘導体であ って、実質上、天然の不純物を含まず、インシュリン向性作用を有するものを提 供するものである。

特に興味深いペプチドは、式： ％式％ ［式中、Ｒ薯まＯＨ，ＯＭまたは−ＮＲ宜Ｒ３であって、ここに、Ｍは薬学的に 許容し得る陽イオンまたは低級の（Ｃ，−Ｃ，）分枝鎖または非分枝鎖アルキル 基、Ｒ１およびＲ３は水素および低級（Ｃ’−Ｃつ分枝鎖または非分枝鎖アルキ ル基からなる群から選択される互いに同一または異なる基、Ｘは上記のアミノ酸 配列またペプチドフラグメントを表すコ で示されるペプチド、 （２）その酸付加塩、並びに （３）その保護された、または部分的に保護された誘導体である。

本発明は、インシュリンの発現を促進する方法であって、哺乳類の膵Ｂ型島細胞 に、有効量の上記インシュリン向性ペプチドを与えることからなる方法を提供す るものでもある。

本発明範囲には、インシュリン向性ホルモンとして機能し得る上記ペプチド中の アミノ酸配列も含まれる。また、担体タンパク質、またはインシュリン向性効果 を向上するために加えられるアミノ酸残基類との結合（カップリング）を促進す るのに用いられる付加的なアミノ酸も包含される。ある物質は、正常な天然状態 で該物質に随伴して見出される物質から精製されていれば、それは、「実質上、 天然の不純物を含有しない」と言われる。ＧＬＰ−１（７−３７）に伴う天然の 不純物の例として、他のペプチド、炭水化物、グリコジル化されたペプチド、脂 質および膜物質等がある。また、ある物質の試料（サンプル）中にこれらの不純 物が含有されていないときにも、その物質は、実質上、゛天然の不純物を含有し ないと表される。

相互に交換可能な語句、「ペプチド断片」と「ペプチド゛部分」は、いずれも、 天然に存在するアミノ酸配列から導かれる、合成および天然に存在するアミノ酸 配列誘導体の両方を包含する意味で用いられる。

ペプチドは、それを天然に存在する配列を断片化して得ることができる場合、あ るいは天然に存在するアミノ酸配列の配列に関する知識、または該配列をコード している遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する知識に基いて合成し得る場合 には、「天然に存在する配列から誘導された」と表現される。

さらに本発明は、選択された配列のもの以外に、天然に存在する配列中には含ま れていないｌまたはそれ以上のアミノ酸が付加された、あるいは欠失されたポリ ペプチドであって、選択されたポリペプチドと同様の機能を有するポリペプチド にも関するものである。

それら本発明のポリペプチドはＧＬＰ−１（７−３７）と実質上、同様のインシ ュリン向性活性を示すことを条件として、「機能的誘導体」と表現される。

「インシュリン向性活性（作用）」とは、ホルモンインシュリンの合成または発 現を刺激する能力、あるいは、刺激を引き起こす能力に関連する語句である。

当業者ならば分かることであるが、アミノ酸残基は、適当なアミノ保護基または カルボキシ保護基を用いて、保護された形または保護されていない形のいずれを をもとり得る。有用な陽イオンは、アルカリ金属陽イオンまたはアルカリ土類基 陽イオン（例えば、Ｎａ。

Ｋ、Ｌｉ、１／２Ｃａ、１／２Ｉ３ａ等である）、またはアミン陽イオン（例え ば、アルキル基がＣ，−Ｃ，１の、テトラアルキルアンモニウム、トリアルキル アンモニウム等である）。

様々な長さのペプチドは、遊離アミン形（Ｎ末端）またはその酸付加塩の形であ ってよい。一般的な酸付加塩は、ハロゲン化水素の塩、即ち、ＨＢｒ％Ｈ１より 好ましくは、ＨＣＩの塩である。

化合物のインシュリン向性は、該化合物を動物細胞に与えるか、動物に注射し、 それぞれ、培地または動物の循環系への免疫反応性のインタ１リン（ＩＲＩ）の 放出を監視することにより決定される。

ＩＲＩの存在は、インシュリンを特異的に検出し得るｉジオイムノアッセイを用 いて検出することができる。ＩＲＩの存在を検出し得。

るラジオイムノアッセイであれば、どれを採用してもよいが、アルバノら（Ａ　 １ｈａｎｏ、　Ｊ　、Ｍ、　Ｄ、　）［Ａ　ｃｔａ　Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏ！、 ユＯ：４８７−５０９（１９７２）］の分析法を改良した方法が好ましい。この 改良法では、ホスフェート／アルブミン（ｐＨ７，４）緩衝液を用いる。りん酸 緩衝液５００ｕ１２、パーフセエー）　（ｐｅｒｆｕｓａｔｅ）試料液５０ｕｉ ２またはパーフセエート中ラットインシーリン標準液５０　ｕＱ、抗インシュリ ン抗血清１００ｕｌ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｌ　：４ ０＋　０００希釈）、および［１１！■コインシニリン１００ｕｌを、１０１０ Ｘ７５の使い捨てガラス管内で全量７５０ｕｌとし、連続的な条件下でインキュ ベージ１ンを行った。４℃で２−３日間インキュベージ１ンした後、。

炭素分離法によって、ａｍのインシュリンを、抗体と結合したインシュリンから 分離した。アッセイの感度は１−２ｕＵ／ｉＱであった。

組織培養中で培養した細胞の培地中に放出されたＩＲＩを測定するために、放射 活性に標識したプロインシュリンを導入することが好ましい。ポリペプチドをラ ベリング（標識すること）シ得る放射活性標識ならば何でも使用可能であるが、 ′Ｈロイシンを用いて標識化プロインシュリンを調製することが好ましい。ラベ リングは、検出可能に標識されたプロインシュリン分子のプールを形成するのに 充分な期間（時間）をかけて行えばよいが、放射活性標識の存在下、細胞を６０ 分間インキュベートすることが好ましい。化合物が、インシュリン向性作用を有 するか否かの決定には、インシュリンを発現し得る細胞ならば何でも用いること ができるが、ラットの島細胞腫細胞、および、特に、ＲＩＮ−３８ラツト島細胞 腫細胞を用いることが好ましい。そのような細胞は、適当なあらゆる培地で培養 し得るが、０．１％ＢＳＡおよび２５ｍＭグルコースを含有するＤＭＥ培地を用 いることが好ましい。

化合物のインタ１リン向性特性は、膵浸出によってもめられる。

潅流したラット膵標品を自体そのままで単離して、改良ベンホス法（Ｐ　ｅｎｈ ｏｓ、　Ｊ　、　Ｃ，）［Ｄ　１ａｂｅｔｅｓ、１旦ニア３３−７３８（１９６ ９）］とした。絶食させた雄性チャールス・リバ一種白子ラット（体重３５０− ６００９）を、アミクール・ナトリウム塩（Ａｇ＋１ｔａｌ’Ｓ　ｏｄｉｕｓ。

Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　ａｎｄ　Ｃｏ、、１６０ｎｇ／Ｋｇ）の腹腔内注射によっ て麻酔゛した。腎臓、副腎、胃、および下方結腸の血管を枯葉した。十二指腸約 ４ｃｍ、下行結腸および直腸以外の全腸管を摘出した。従って、腸の小部分が潅 流されたにすぎず、グルカゴン様免疫反応性を有する腸性物質による干渉を最小 限に止めることができた。潅流は、４％デキストランＴ７０および０．２％ウシ 血清アルブミン（フラクションＶ）を含有する改良クレブス−リンゲル重炭酸塩 緩衝液を用い、９５％０．および５％ＣＯ１を吹き込んで行った。非パルス（搏 動）性液流の４流路（チャンネル）ローラーベアリングポンプ［バッチエラー・ ポリスタテ４−／り（Ｂｕｃｈｌｅｒ　Ｐｏ１ｙｓｔａｔｉｃ）Ｂｕｃｈｌｅｒ 　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＤｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｎｕｃｌｅａｒ−Ｃｈｉｃａ ｇｏ　Ｃｏｒｐ、コを用い、一方の潅流源からもう一方への切り替えを３方向フ ツク（蛇口）で行った。潅流の完了の様子を監視し、ワイアーらの方法（Ｗｅｉ ｒ、Ｇ、Ｃ，）［Ｊ、Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ、、旦４：１４０３− １４１２（１９７４）］に従って解析した。

ＧＬＰ−１（７−３７）またはその機能的な誘導体を薬学的に許容し得る担体賦 形剤と混合して製剤化することができる。適当な賦形剤およびその製剤としては 、他のヒトペプチド、例えば、ヒト血清アルブミン等がレミントンの薬学［Ｒｅ ｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐ　ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳ　ｃｉｅｎｃｅｓ（ 第１６版オスロ（Ａ、０ｓｌｏ）編、Ｍａｃｋ、　Ｅ　ａｓｔｏｎ　Ｐ　Ａ　（ １９８０）］に記載されている。効果的な投与に適した薬学上許容し得る組成物 が得られれば、そのような組成物は、ＧＬＰ−１（７−３７）またはその機能的 な誘導体を適量の担体賦形剤と一緒に含有しているであろう。

ＧＬＰ−１（７−３７）またはその機能的な誘導体を含有する組成物は、静脈内 、筋肉内、または皮下から、約１ｐｇ／ｋｇ（体重）〜１，０００ｕｇ／ｋｇ（ 体重）の範囲の用量で投与されるが、それ以下またはそれ以上の用量を用いるこ ともできる。必要とされる用量は、患者の症状の重篤度、および患者の身長、体 重、性、年令、および病歴等の判断基準により左右される。

非経口投与のためには、ＧＬＰ−１（７−３７）含有組成物を蒸留水に溶かし、 ｐＨ値を約６−８に調節する。凍結乾燥工程を促進し。

て適当な生産物を得るためには、ラクトースを溶液に加えるとよい。

次いで、得られた溶液を滅菌濾過し、バイアルに入れ、凍結乾燥する。これらの 組成物中のＧＬＰ−１（７−３７）の濃度は１０−”Ｍから１０−’Ｍの間で変 化し得る。

さらに他の薬学的手法を用いて作用の持続性をフントロールすることもできる。

放出コントロール製剤は、ＧＬＰ−１（７−３７）またはその機能的な誘導体と コンプレックスを形成するか、それを吸着するポリマーを用いて得ることができ る。到達のコントロールは、放出をコントロールするための、適当な高分子（例 えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニ ル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、および硫酸プロタミン等 ）、高分子の濃度、および導入方法を選択することにより実行される。放出コン トロール製剤によって作用の持続性をフントロールするための別法は、ポリエス テル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、またはエチレンと酢酸ビニル の共重合体等のポリマー原料の粒子にＧＬＰ−１（７−３７）を導入することか らなる。

別法として、これらのポリマー粒子にＧＬＰ−１（７−３７）を導入する代りに 、例えば、夫々、ヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチン−マイクロカプ セルおよび（メチルメタクリレート）マイクロカプセル等の、コアセルベーショ ン技術または界面重合法によって調製されたマイクロカプセルにＧＬＰ−１（７ −３７）を捕獲させるか、あるいは、リポソーム、アルブミン微粒子（マイクロ スフェア−）、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル等のコロ イド状薬物供給系（デリバーリーシステム）、またはマクロエマルシロン中に取 り込ませることができる。そのような方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａ ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に記載されている。

実施例１ 移植可能なラットの島細胞腫［ガザーら（Ｇａｚｄａｒ、　Ａ、　Ｆ、）、Ｐ　 ｒｏｅ。

Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、ニア：３５１９−３５２３（１ ９８０）］から樹立された連続的な島細胞系統（セルライン）、ＲＩＮ−ｒから 、細胞系統ＲＩＮ−３８、ラット島細胞腫細胞を得た。この細胞を、１０％熱不 活化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン１００Ｕ／ＨＱおよびストレプト マイシン１００　ｕｇ／　ｚＱを補充した、グルコース濃度４，５００ｚｇ／Ｌ のＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に維持した。空気９５％、二酸化炭素５％中、３７ ℃でインキニベーションを行った。

上記の方法の下で増殖した細胞を洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミンと２５１ ０Ｍ５１０ＭグルツースするＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁した。様々な濃度 のＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬ、Ｐ−１（７−３７）またはＧＬＰ　１（７３ ６ｄｅｓ−ｇｌｙ−ａｒｇ）と−緒に６時間インキュベートした後、これらの物 質の内、どれがインシュリンｍＲＮＡの発現に影響を及ぼすかを決定した。以下 のごとくにして、細胞性ＲＮＡをインシュリン特異的ｍＲＮＡにつき、分析した 。固形腫瘍および細胞をグアニジンチオシアネート中でホモジナイズし、塩化セ シウムツブシテン中を沈降させることにより、細胞性ＲＮＡを抽出した。オリゴ ｄＴセルロース・クロマトグラフィー！ニーよってｐｏｌｙＡ’ＲＮＡを単離し た［アビブら（Ａｖｉｖ、　Ｈ，）Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ 　ｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、６９：１４０８−１４１２（１９７２）］。各試料から得た全Ｒ ＮＡ２０ｕｇを、グリオキサール中で変性した後、１．４％アガロースゲル電気 泳動にかけてサイズ分画し、次いで、ナイロン・メンプラン（Ｎｙｔｒａｎ；５ ｃｈｌｅｉｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｌｌ）に電気的に移した。

ブロッティングした（はん点の付いた）メンプランを減圧下、８０°Ｃで２時間 焼き、ＩＭ　ＮａＣ１１０ＳＤＳ／１０％硫酸デキストラン中、５０℃で一夜、 プレハイブリダイズした後、標識したプローブ（３５Ｘ　１０　’ｃｐｓ／ｍｌ ）を加え、同温で２４時間ノーイブリザイズさせた。次いで、ｌＸ５ＳＣ（０， １５Ｍ　ＮａＣ１１０，０１５Ｍクエン酸Ｎａ）／１％５ＤＳ）中で５５℃にお いて２回洗浄し、−７０℃において、様々な時間、強化スクリーンを用いてＸ線 フィルムに露出させた。全てのケースでペプチド濃度は１０”Ｍであった。

この実験の結果を第２図に示す。レーン１−３（対照細胞）、４−６（ＧＬＰ− １（１−３７））、７−９（ＧＬＰ−１（７−３７））、１Ｏ−１２（ＧＬＰ　 １（１３６ｄｅｓ−ｇｌｙａｒｇ−ａｍｉｄｅ））は、産生されたインシュリン 特異的＋ａＲＮＡの量を示している。各ペプチドについて、３回の繰り返し実験 の結果が示されている。

マイクロデンシトメーターを用い、インシュリン特異的ｍＲＮＡの相対量をめた 。この実験により、同一ペプチド濃度において、ＧＬＰ−１（１−３７）は、対 照（非処理）細胞より３倍以上高（、インシュリン遺伝子の発現を刺激すること が分かった。

実施例２ 細胞系統ＲＩＮ−３８のラット島細胞腫細胞を実施例１記載のごとく、ＤＭＥ培 地中で培養した。１０−’Ｍのａｔ、ｐ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３ ７）およびＧＬＰ−１（１−３６）と−緒にインキ一ベートした後、細胞培養培 地中のインシュリン濃度をラジオイムノ　・アッセイ（既述）によって測定した 。６時間インキュベートした後、インシュリンタンパク質濃度を測定した。実験 結果を表１に示す。

色」。

インシュリン生産量 加えられたペプチド　（マイクロユニット／Ｍ（１’）なし　２８００ ＧＬＰ−１（１−３７）　５０００ 生存ラツトの膵臓を、上記のごとく、様々な濃度のＧＬＰ−１（１−３７）およ びＧＬＰ−１（７−３７）で潅流した。１分間隔で、ラジオイムノアッセイ（上 記）によってラットの血清インシュリン濃度（ピコグラム／　ｗａｓ　ｐｌ／　 ｘＱ＞を測定した。この実験の結果を表２に示す。潅流は、ペプチド濃度、５Ｘ １０−’Ｍ、５Ｘ１０−”Ｍ％　５Ｘ１０″′ｅＭ、　５　Ｘ　１０−”Ｍ、お よび５Ｘ１０″′！Ｍで行ツタ。０分の血清中濃度測定後、ペプチドを加えた。

ＧＬＰ−１（１−３７）は、濃度５ｘ１０−？Ｍでラットの膵臓に潅流すると、 血清中のインシュリン濃度の３．４倍増を伝達することが分かった。このペプチ ドは、濃度５Ｘ１０１Ｍでは、血清中インシュリン濃度の２倍増を伝達し得たに すぎない。また、濃度５×１０−１６Ｍでは、このペプチドは血清中インシュリ ン濃度を２０％増加させただけである。

ＧＬＰ−１（７−３７）は、濃度５Ｘ１０−’Ｍでラットの膵臓に供給されると 、血清中のインシュリン濃度の１３２倍増倍増側激することが分かった。１０倍 低い濃度（５Ｘ１０−１Ｍ）では、このペプチドは、インシュリンの血清中濃度 の２１１倍増命令することができるにすぎなかった。濃度１０ＸＩＯ弓ＯＭでは 、ＧＬＰ−１（７−３７）は、血清中インシュリン濃度の増加を伝達することが できた（３２倍）。５Ｘ１０−”Ｍでも、ａｔ、ｐ−１（７−３７）は、インシ ュリン濃度を１５倍増加させることができたが、ＧＬＰ−１（１−３７）は無効 であった。

この実験は、ＧＬＰ−１（７−３７）が、インシュリンのインビボ発現の刺激作 用に関してＧＬＰ−１（１−３７）の１．０００倍以上の効力を有することを示 している。しかも、これらの同じ実験において、ＧＬＰ−１ペプチドは、ペプチ ドホルモングルカゴンおよびソマトスフチンの放出に何の作用も示さなかった。

このように、ＧＬＰ−１の刺激作用は、ベータ細胞に特異的であり、膵臓のアル ファまたはデルタ細胞には作用しないといえる。

ＧＬＰ−１１６６００２０７００７４００２４００５０ＧＬＰ−１１４７００６ ０００６００１８０５０３　２２００　２０００　４３０　３４０　５Ｇ実施例 ４ グルカゴン様タンパク質が細胞性ｃＡＭＰ濃度に影響を及ぼし得るか否かを調べ るために、ＲＩＮＳ−３８島細胞腫細胞におけるｃＡＭＰ濃度に対するＧＬ、Ｐ −１（７−３７）およびＧＬ、Ｐ−１（１−３７）の影響を調べた。実施例１記 載のごとくにして２６ウエルの培養皿中で細胞を培養した。培養ウェルに、種々 の量のグルカゴン様ペプチドを加え、３回繰り返した。１０分間インキュベーシ ョンを行った後、全細胞培地をｃＡＭＰについて検査し、ｃＡＭＰ濃度を測定し た。この実験の結果を表３に示す。各培養液２０ｕｌを分析した。

表３ 産生されたｃＡＭＰのピコモル ペプチド２度（Ｍ　験■　＝験■ １０−＠　４００　１７０ １０−’　３７０　１２０ １０−・　４９４　１６０ １０−”　５１５　１００ １０”　２５３　９０ １０°”　５３３　９０ この実験により、ＧＬＰ−１（７−３７）は、濃度１０−”Ｍで存在する場合に も、ｃＡＭＰ濃度を刺激することが分かった。ｃＡＭＰ濃度の増加はＧＬＰ−１ （７−３７）が細胞リセプターと相互作用し得ることを示唆するものである。

寒奥皿五 ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（１−３６）およびＧＬＰ−１（７−３７ ）の作用がインシュリンに特異的であるり、非特異的な遺伝子発現を誘導または 刺激することがないことを証明するために、これらのペプチドの、アクチンおよ びアンギオテンシノーゲンのｍＲＮＡの濃度に対する影響を調べた。実施例１に 記載のごとくにしてＲＩＮＳ−３８島細胞腫細胞を培養し、ＧＬＰ−’１（１− ３７）、ａｔ、ｐ−ｔ（７−３７）またはＧＬＰ−Ｈｌ　３６）ｄｅｓ−Ｇｌｙ 　ａｒ（（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ’１ｅｓ）の存在下にイン キ一ベートした。ペプチド濃度は全て１０−’Ｍであった。インキニベーション 時間は６時間であった。インシュリン、アクチンまたはアンギオテンシノーゲン に特異的な５ＲＮＡを実施例１記載のごとく、ノーザン／％イブリザイゼーシッ ンによって同定した。この実験の結果を第２図（インシュリンＩＩＲＮＡ）、第 ３図（アンギオテンシノーゲンｍＲＮＡ）および第４図（アクチンｍＲＮＡ）に 示す。第２．３および４図のＲＮＡゲルの走査（スキャニング）フィルムから得 た人為的な濃度計単位でｍＲＮＡ濃度を決定した。ｍＲＮＡ濃度を表４に示す。

衣−土 ＲＩＮＳ−３８島細胞腫細胞における、インシュリン、アクチンおよびアンギオ テンシノーゲンをコードする鳳ＲＮＡＱ細胞内濃度に対するグルカゴン様ペプチ ドの影響 ＲＮＡ ＩＣ１チＦ＊　イｊヴ４３２Ｌン、　Ｌｉりと　７ンキオテンシ！−ゲンＧＬＰ −１（７−３７）　４．２３±０．７４　０．８２±０．０８　２．７８土０． ４６ＧＬＰ−１（１−３７）　１．８７±０．５６　０．９１±０．０２　２． ２Ｓ±０．２００ＬＰ−１（１−３６）ｄｅｓ−Ｇｌｙ　２．７Ｂ±０．８０　 ０．８８±０．０３　２．５６±０．２２ＧＬＰ−１（１−３７）が、インシュ リン以外のホルモンの生合成を誘導するか否かを決定するために実験した。即ち 、ＧＬＰ−１（１−３７）（濃度１０　”Ｍ）をラットのグルカゴン産生性の島 細胞系統および、夫々、ホルモンであるプロラクチンおよびＡＣＴＨを産生ずる ２つの脳下垂体細胞系統（ＧＨ４およびＡｔＴ−２０）に加え、実施例１記載の ごとく、２４時間後に産生されたホルモン特異的ｍＲＮＡの量を測定した。ＧＬ Ｐ−１ペプチドと一緒にインキユベーシヨンした後の、ＧＨ４脳下垂体細胞内の プロラクチンｍＲＮＡ濃度を第５図に示す。また、ＧＬＰ−１ペプチドと一緒に インキ二ベーシ璽ンした後の、Ａｔ’ｒ−２０脳下垂体細胞内のＡＣＴＨｍＲＮ Ａ濃度を第６図に示す。これらの実験の結果、ＧＬＰ’−１（１−３７）は、こ れらのペプチドホルモンをコードしているｇ＋ＲＮＡの量になんらの検出可能な 影響を及ぼさないことが分かった。

実施例７ ＧＬＰ−１（７−３７）のＲＩＮＳ−３８島細胞腫細胞におけるインシュリン遺 伝子およびアクチン遺伝子の転写に及ぼす影響を調べた。遺伝子の転写速度は、 対照およびＴＰＡ処理細胞由来の核内での発生期のグルカゴンおよびベーターア クチンのＲＮＡ転写物を定量することによって決定された。核性ＲＮＡを、ニト ロセルロースに結合させた、過剰量のクローニングした特異的ＤＮＡと／翫イブ リザイズさせ、フィルターを洗浄した［マツフナイトら（ＭｃＫ　ｎｉｇｈｔ。

ｃ、ｓ、）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４：９０５０　９０５８（１９ ７９）コ。

ラフトグルカゴン［ハインリブヒら（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ、　Ｇ、）、Ｅ　ｎｄｃ ｒｉｎｏｌｏｇｙ＋１１５：１−６（１９８４）コおよび、対照として、ニワト リのベーターアクチンｃＤＮＡ［クリーブランド博士（Ｄｒ、　Ｄ、　Ｃ１ｅｖ ｅｌａｎｄ）、ジ璽−ンホブキンス大学医学部、ボルチモア、メアリーランドか ら提供されたちの］を用いた。ハイブリザイゼーション効率を、［”Ｈ］ＵＴＰ グルカゴンｅＤＮＡのハイブリザイゼーシコン溶液を加えることによってコント ロールした。実験を２回行い、結果をｃＤＮＡ挿入体のｐｐｍ／　ｋｂとして表 し、ハイブリザイゼーシヲン効率について補正した（４０−５０％）。細胞を、 濃度１０−’ＭのＧＬＰ−１（７−３７）と−緒に４時間インキュベートした。

０．１、および４時間目に核を細胞から調製し、発生期のインシュリン遺伝子転 写物およびアクチン遺伝子転写物の分析におけるニューフレアーラン（ｎｕｃｌ ｅａｒｒｕｎ）により評価した（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｃ，ｓ、ら）。この実験の 結果を表５に示す。実験結果から、ＧＬＰ−１（７−３７）が、インシュリン遺 伝子の転写率を増大させるが、アクチン遺伝子の発現率には検出可能な効果を示 さないことが分った。

表５ グルカゴン様ペプチドＩ（７−３７）の、ＲＩＮＳ−３８島細胞腫細胞中でのイ ンシュリンおよびアクチン遺伝子の転写に及ぼす影響％　インシュリン遺伝子　 アクチン遺伝子０　１７．４　３４．１ １　７６．２　２９．９ ４　９．０　２５．０ 本明細書には本発明の全容が記載されているので、当該技術分野における通常の 技術者が僅かな修飾を施して同様のことを行うことができ、それらも本発明の技 術思想に包含されることは明らかである。

丈丁ρ瘍、　ＧｒＪ−Ｘ　（１−３７）絢に　、＝；ｊ　清；−：す３＝顕、・ 灯、Ｑｆ、　ＧＬＰ−１（１−３７） 国際調査報告 １″″Ｉ″１１“ｍｋ　、、〒ｌ釘く真フ７Ｍ＾＾（

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．式： 【配列があります】 で示される配列のペプチドフラグメント、並びにその機能的な誘導体であって、 天然の不純物を実質的に含有せず、インシュリン向性活性を有するものである該 フラグメントおよび該機能的な誘導体。
2. ２．（１）式： Ｈ２Ｎ−−Ｘ−−ＣＯ−Ｒ１ （式中、Ｒ１はＯＨ、ＯＭまたは−ＮＲ２Ｒ３であって、ここにＭは薬学的に許 容し得る陽イオンまたは低級の分枝鎖または非分枝鎖アルキル基、Ｒ３およびＲ ４は水素および低級の分枝鎖または非分枝鎖アルキル基からなる群から選択され る互いに同一または異なる基であり、Ｘは請求項１記載のペプチドフラグメント を表す）で示されるペプチド、 （２）その酸付加塩、並びに
3. （３）保護された、または部分的に保護された誘導体。 ３．式： 【配列があります】 で示される配列を有する請求項１記載のペプチド。
4. ４．哺乳類の膵Ｂ型島細胞に請求項１記載のインシュリン向性ペプチドの有効量 を供給することからなるインシュリンの発現を促進する方法。
5. ５．哺乳類の膵Ｂ型島細胞に請求項２記載のインシュリン向性ペプチドの有効量 を供給することからなるインシュリンの発現を促進する方法。
6. ６．哺乳類の膵Ｂ型島細胞に請求項３記載のインシュリン向性ペプチドの有効量 を供給することからなるインシュリンの発現を促進する方法。
7. ７．請求項１記載のペプチドフラグメントの有効量と、インシュリン向性医薬と しての使用に適した薬学上許容し得る担体とを含有する医薬組成物。
8. ８．請求項２記載のペプチドフラグメントの有効量と、インシュリン向性医薬と しての使用に適した薬学上許容し得る担体とを含有する医薬組成物。
9. ９．請求項３記載のペプチドフラグメントの有効量と、インシュリン向性医薬と しての使用に適した薬学上許容し得る担体とを含有する医薬組成物。