JP3352128B2 - 安定性の改善された新規な合成イソヒルジン - Google Patents
安定性の改善された新規な合成イソヒルジンInfo
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- JP3352128B2 JP3352128B2 JP32525592A JP32525592A JP3352128B2 JP 3352128 B2 JP3352128 B2 JP 3352128B2 JP 32525592 A JP32525592 A JP 32525592A JP 32525592 A JP32525592 A JP 32525592A JP 3352128 B2 JP3352128 B2 JP 3352128B2
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- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【０００１】本発明は、Ａｓｐ〜Ｇｌｙモチーフの領域
における交換により安定性が改善された新規な合成イソ
ヒルジンに関する。これにより、一方では操作時の収率
の増大、他方ではそのまま直接注射できる溶液として医
薬組成物の調製が可能になる。
における交換により安定性が改善された新規な合成イソ
ヒルジンに関する。これにより、一方では操作時の収率
の増大、他方ではそのまま直接注射できる溶液として医
薬組成物の調製が可能になる。
【０００２】ヒトの医薬として使用することにより血栓
療法に著しい進歩をもたらすことが期待される、薬用ヒ
ルからの医薬的に価値のある高親和性血栓インヒビター
は公知である。これらのペプチド様インヒビターはヒル
ジンと呼ばれ、配列中の数個のアミノ酸のみが相違する
天然のイソヒルジンも多数知られている。天然のイソヒ
ルジンは、たとえば、ＥＰ−Ａ １４２ ８６０、ＥＰ−
Ａ １５８ ５６４、ＥＰ−Ａ １５８ ９８６、ＥＰ−Ａ
１６８ ３４２、ＥＰ−Ａ １７１ ０２４、ＥＰ−Ａ
１９３ １７５、ＥＰ−Ａ ２００ ６５５、ＥＰ−Ａ ２
０９ ０６１、ＥＰ−Ａ ２２７ ９３８に記載されてい
る。この１０年間における組換えＤＮＡ技術の発展によ
り、現在では、遺伝子操作によって修飾された微生物を
使用して、工業的規模でヒルジンを取得することが可能
になっている。天然の配列に基づくイソヒルジンの製造
方法も、たとえば、ＥＰ−Ａ １７１ ０２４およびＥＰ
−Ａ２００ ６５５ならびにそれに引用された文献に記
載されている。
療法に著しい進歩をもたらすことが期待される、薬用ヒ
ルからの医薬的に価値のある高親和性血栓インヒビター
は公知である。これらのペプチド様インヒビターはヒル
ジンと呼ばれ、配列中の数個のアミノ酸のみが相違する
天然のイソヒルジンも多数知られている。天然のイソヒ
ルジンは、たとえば、ＥＰ−Ａ １４２ ８６０、ＥＰ−
Ａ １５８ ５６４、ＥＰ−Ａ １５８ ９８６、ＥＰ−Ａ
１６８ ３４２、ＥＰ−Ａ １７１ ０２４、ＥＰ−Ａ
１９３ １７５、ＥＰ−Ａ ２００ ６５５、ＥＰ−Ａ ２
０９ ０６１、ＥＰ−Ａ ２２７ ９３８に記載されてい
る。この１０年間における組換えＤＮＡ技術の発展によ
り、現在では、遺伝子操作によって修飾された微生物を
使用して、工業的規模でヒルジンを取得することが可能
になっている。天然の配列に基づくイソヒルジンの製造
方法も、たとえば、ＥＰ−Ａ １７１ ０２４およびＥＰ
−Ａ２００ ６５５ならびにそれに引用された文献に記
載されている。
【０００３】しかしながら、現在では、薬剤に求められ
る要求は治療活性に限られてはいない。長期にわたる使
用という観点から、製造の経済性、臨床上の簡便性およ
び高度な安定性等が要求される。
る要求は治療活性に限られてはいない。長期にわたる使
用という観点から、製造の経済性、臨床上の簡便性およ
び高度な安定性等が要求される。
【０００４】経済上の観点を含めて、多数の患者が改善
された治療法の利益を享受できるようにするためには、
薬剤の製造経費を低く抑えることが必要である。遺伝子
操作産物の場合には、これは最適発現系の開発によって
達成することができるが、同時に薬剤をこの種類の系に
適合させることも行われる。この点において、構造的に
最適化したイソヒルジンが、例えば、ＥＰ−Ａ ３２４
７１２およびＥＰ−Ａ４４８ ０９３に記載されてい
る。
された治療法の利益を享受できるようにするためには、
薬剤の製造経費を低く抑えることが必要である。遺伝子
操作産物の場合には、これは最適発現系の開発によって
達成することができるが、同時に薬剤をこの種類の系に
適合させることも行われる。この点において、構造的に
最適化したイソヒルジンが、例えば、ＥＰ−Ａ ３２４
７１２およびＥＰ−Ａ４４８ ０９３に記載されてい
る。
【０００５】長期にわたる使用の点からは、分解精製物
の形成に基づく治療的および薬理的合併症を防止できる
ように、薬剤の高い安定性が考慮されなければならな
い。この点、ヒルからの既知のイソヒルジンならびに遺
伝子操作によって修飾された微生物からのデスルファト
ヒルジンは、その構造により、内部的化学変換によって
副生成物を形成しやすいため、満足できるものではな
い。処理過程の経済性の点からも、副生成物の形成を予
め防止することは、その除去を省けるので有利である。
これにより、収率も改善される。
の形成に基づく治療的および薬理的合併症を防止できる
ように、薬剤の高い安定性が考慮されなければならな
い。この点、ヒルからの既知のイソヒルジンならびに遺
伝子操作によって修飾された微生物からのデスルファト
ヒルジンは、その構造により、内部的化学変換によって
副生成物を形成しやすいため、満足できるものではな
い。処理過程の経済性の点からも、副生成物の形成を予
め防止することは、その除去を省けるので有利である。
これにより、収率も改善される。
【０００６】安定性が改善されればさらに、最小の経費
で、薬剤を保存および使用できる処方が可能になる。ヒ
ルジンの場合、安定で、そのまま直接注射できる溶液が
この種類の処方であり、これはさらに長期にわたる使用
可能で抜きんでたものでなければならない。この点、既
知のイソヒルジンでは、その化学的不安定性が実際に限
定因子になっている。溶解した状態における温度依存性
の副生成物の形成により、冷蔵庫に保存しても、この種
の処方の使用期限は限られ（短く）、経済性を達成する
ことは極めて困難である。
で、薬剤を保存および使用できる処方が可能になる。ヒ
ルジンの場合、安定で、そのまま直接注射できる溶液が
この種類の処方であり、これはさらに長期にわたる使用
可能で抜きんでたものでなければならない。この点、既
知のイソヒルジンでは、その化学的不安定性が実際に限
定因子になっている。溶解した状態における温度依存性
の副生成物の形成により、冷蔵庫に保存しても、この種
の処方の使用期限は限られ（短く）、経済性を達成する
ことは極めて困難である。
【０００７】既知の天然イソヒルジンと医薬の開発のた
めにそれから誘導されたデスルファトヒルジンは、数個
のアミノ酸単位で相違するのみで、配列における可変お
よび保存領域の識別が可能である。保存領域には、配列
−Ｓｅｒ32−Ａｓｐ(Ａｓｎ) 33−Ｇｌｙ34−および−Ａ
ｓｎ52−Ａｓｐ（Ａｓｎ）53−Ｇｌｙ54−Ａｓｐ55−が
包含される。この番号は、Dodtら〔FEBS Letters 165(1
984)：180〜183〕によって報告された６５個のアミノ酸
を有する配列の番号である。ヒルジン分解生成物の蛋白
化学分析の結果、これらの配列モチーフがヒルジンの化
学的不安定性に最も関与していることが明らかにされて
いる。アスパラギンのアスパラギン酸への脱アミノ化
は、他の天然イソヒルジン構造を導くので、この場合、
考慮する必要がない、ヒルジンの重要な分解は、２個の
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−配列における異性化およびラセミ化
である。蛋白の分解におけるこれらの反応の重要性は文
献で知られている(JBC 262：785〜793、1987およびJBC
264：6164〜6170、1989)。血栓への高親和性結合におけ
るヒルジンのカルボキシ末端構造の重要性も同様に公知
である。天然に保存される配列を有し、結合に関与して
いる領域のアミノ酸の変換は、親和性の喪失の危険を伴
う。しかしながら、驚くべきことに、保存領域における
ある種の安定性改善のための修飾は、血栓に対する親和
性を損なうことなく、したがって活性を失うことなく実
施できることが見出された（例７、表１および例８、図
２参照）。
めにそれから誘導されたデスルファトヒルジンは、数個
のアミノ酸単位で相違するのみで、配列における可変お
よび保存領域の識別が可能である。保存領域には、配列
−Ｓｅｒ32−Ａｓｐ(Ａｓｎ) 33−Ｇｌｙ34−および−Ａ
ｓｎ52−Ａｓｐ（Ａｓｎ）53−Ｇｌｙ54−Ａｓｐ55−が
包含される。この番号は、Dodtら〔FEBS Letters 165(1
984)：180〜183〕によって報告された６５個のアミノ酸
を有する配列の番号である。ヒルジン分解生成物の蛋白
化学分析の結果、これらの配列モチーフがヒルジンの化
学的不安定性に最も関与していることが明らかにされて
いる。アスパラギンのアスパラギン酸への脱アミノ化
は、他の天然イソヒルジン構造を導くので、この場合、
考慮する必要がない、ヒルジンの重要な分解は、２個の
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−配列における異性化およびラセミ化
である。蛋白の分解におけるこれらの反応の重要性は文
献で知られている(JBC 262：785〜793、1987およびJBC
264：6164〜6170、1989)。血栓への高親和性結合におけ
るヒルジンのカルボキシ末端構造の重要性も同様に公知
である。天然に保存される配列を有し、結合に関与して
いる領域のアミノ酸の変換は、親和性の喪失の危険を伴
う。しかしながら、驚くべきことに、保存領域における
ある種の安定性改善のための修飾は、血栓に対する親和
性を損なうことなく、したがって活性を失うことなく実
施できることが見出された（例７、表１および例８、図
２参照）。
【０００８】さらに、驚くべきこくに、１個以上のアミ
ノ酸の交換を行ったにもかかわらず、その抗原性の増大
は全くみられないことが明らかになったのである。
ノ酸の交換を行ったにもかかわらず、その抗原性の増大
は全くみられないことが明らかになったのである。
【０００９】さらにまた、２つの−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−配
列は、ヒルジンの不安定性に同様に寄与していることが
明らかになった。両配列領域の修飾によってのみ、副生
成物の形成を実質的に低減させることができる（例９、
表２）。
列は、ヒルジンの不安定性に同様に寄与していることが
明らかになった。両配列領域の修飾によってのみ、副生
成物の形成を実質的に低減させることができる（例９、
表２）。
【００１０】親化合物および最適化デスルファトヒルジ
ンによる酸性（例１１、図３）および生理的pH（例１
０、図４）での副生成物形成の時間経過から、アミノ末
端は安定性に影響せず、したがってその修飾は安定化に
寄与しないことを示している。これから、たとえば〔Ａ
ｌａ1,Ｔｈｒ2〕−デスルファトヒルジンについて示さ
れた最適化は、異なるアミノ末端を有するイソヒルジン
（たとえば〔Ｖａｌ1，Ｖａｌ2〕−および〔Ｉｌｅ1,Ｔ
ｈｒ2〕−デスルファトヒルジン）にも適用可能である
ことがわかる。
ンによる酸性（例１１、図３）および生理的pH（例１
０、図４）での副生成物形成の時間経過から、アミノ末
端は安定性に影響せず、したがってその修飾は安定化に
寄与しないことを示している。これから、たとえば〔Ａ
ｌａ1,Ｔｈｒ2〕−デスルファトヒルジンについて示さ
れた最適化は、異なるアミノ末端を有するイソヒルジン
（たとえば〔Ｖａｌ1，Ｖａｌ2〕−および〔Ｉｌｅ1,Ｔ
ｈｒ2〕−デスルファトヒルジン）にも適用可能である
ことがわかる。
【００１１】しかしながら、各種合成イソヒルジン、た
とえば〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｕ53〕−デス
ルファトヒルジンについての安定性の詳細な分析により
（図３および４）、アスパラギン酸の単純な交換では最
適効果を生じないことが示された。〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,
Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52,Ｇｌｕ53,Ａｌａ54〕−デスルファ
トヒルジンおよび〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ
52,Ｇｌｕ53,Ｇｌｕ55〕−デスルファトヒルジンの優れ
た安定性は、驚くべきことに、さらに５２位のアスパラ
ギンのグルタミンへの変換が安定化に必須の寄与をもた
らすことを示している。
とえば〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｕ53〕−デス
ルファトヒルジンについての安定性の詳細な分析により
（図３および４）、アスパラギン酸の単純な交換では最
適効果を生じないことが示された。〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,
Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52,Ｇｌｕ53,Ａｌａ54〕−デスルファ
トヒルジンおよび〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ
52,Ｇｌｕ53,Ｇｌｕ55〕−デスルファトヒルジンの優れ
た安定性は、驚くべきことに、さらに５２位のアスパラ
ギンのグルタミンへの変換が安定化に必須の寄与をもた
らすことを示している。
【００１２】本発明は、したがって、３３位にＧｌｕ、
５２位にＧｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＡｓｐ、５３位
にＧｌｕ、５４位にＧｌｙまたはＡｌａ、５５位にＧｌ
ｕまたはＡｓｐを有する、安定性の改善されたイソヒル
ジンに関する。
５２位にＧｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＡｓｐ、５３位
にＧｌｕ、５４位にＧｌｙまたはＡｌａ、５５位にＧｌ
ｕまたはＡｓｐを有する、安定性の改善されたイソヒル
ジンに関する。
【００１３】好ましい化合物は、式Ｉ
【化２】 （式中、Ａ1はＬｅｕ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＶａｌで
あり、Ａ2はＴｈｒまたはＶａｌであり、ＢはＧｌｕで
あり、ＣはＧｌｎまたはＧｌｕであり、ＤはＧｌｕであ
り、ＥはＧｌｙまたはＡｌａであり、ＦはＡｓｐまたは
Ｇｌｕである）を有する。
あり、Ａ2はＴｈｒまたはＶａｌであり、ＢはＧｌｕで
あり、ＣはＧｌｎまたはＧｌｕであり、ＤはＧｌｕであ
り、ＥはＧｌｙまたはＡｌａであり、ＦはＡｓｐまたは
Ｇｌｕである）を有する。
【００１４】特に好ましい化合物は、〔Ａｌａ1または
Ｌｅｕ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52−Ｇｌｕ53−Ａｌ
ａ54−〕デスルファトヒルジンおよび〔Ａｌａ1または
Ｌｅｕ1,−Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52−Ｇｌｕ53,Ｇｌ
ｕ55−〕デスルファトヒルジンである。
Ｌｅｕ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52−Ｇｌｕ53−Ａｌ
ａ54−〕デスルファトヒルジンおよび〔Ａｌａ1または
Ｌｅｕ1,−Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52−Ｇｌｕ53,Ｇｌ
ｕ55−〕デスルファトヒルジンである。
【００１５】本発明の合成ヒルジン誘導体は、微生物に
よりまたは化学合成により、製造できる。パン酵母また
は大腸菌中での産生が好ましい。
よりまたは化学合成により、製造できる。パン酵母また
は大腸菌中での産生が好ましい。
【００１６】最適化イソヒルジンの化学的安定性は、効
率の高い発現系の採用とあいまって、処理工程を比較的
に単純化し、したがって低コスト化を可能にする。これ
に関連して、それ自体公知の生化学的方法の組合わせに
より、互いにわずかずつ異なる工程が採用される。本発
明はまた、少しずつ違うこの種類の工程を包含する。た
とえば、〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2〕デスルファトヒルジンの
誘導体は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ ４４８ ０９３に開示
された発現系で製造できる。この場合、処理工程はわず
か数工程からなる。すなわち、発酵終了時の細胞懸濁液
または細胞除去濾液をpH２〜４の酸性とし（たとえば、
ギ酸、塩酸による）、その際生成した蛋白含有沈殿を遠
心分離または濾過によって分離できる。生成物は、最も
簡単な場合、澄明な上清から逆相クロマトグラフィーに
よって高度に濃縮することが可能で、これは使用した培
地によって採用が可能になる。他方、複雑な培地が使用
される場合には、溶液の塩濃度を、たとえば限外／透析
濾過によって減少させ、ついで陽イオン交換樹脂、たと
えばFractogelR EMD-SO3 -上、イオン交換クロマトグラ
フィーに付す、限外濾過に代えて、たとえば欧州特許出
願ＥＰ−Ａ ３１６６５０に記載されているような適当
な樹脂上での疎水性吸着を行うこともできる。陽イオン
交換クロマトグラフィーからの生成物をついで、そのま
ま逆相クロマトグラフィー（たとえば、LichropreR RP1
8上）に付すことができ、これにより高純度の生成物が
得られる。残った不純物の除去が必要な場合は、さらに
陰イオン交換クロマトグラフィーを、たとえばQ-Sephar
oseで行うことができる。各段階を最適化することで、
５０％を越える収率を達成することが可能である。
率の高い発現系の採用とあいまって、処理工程を比較的
に単純化し、したがって低コスト化を可能にする。これ
に関連して、それ自体公知の生化学的方法の組合わせに
より、互いにわずかずつ異なる工程が採用される。本発
明はまた、少しずつ違うこの種類の工程を包含する。た
とえば、〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2〕デスルファトヒルジンの
誘導体は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ ４４８ ０９３に開示
された発現系で製造できる。この場合、処理工程はわず
か数工程からなる。すなわち、発酵終了時の細胞懸濁液
または細胞除去濾液をpH２〜４の酸性とし（たとえば、
ギ酸、塩酸による）、その際生成した蛋白含有沈殿を遠
心分離または濾過によって分離できる。生成物は、最も
簡単な場合、澄明な上清から逆相クロマトグラフィーに
よって高度に濃縮することが可能で、これは使用した培
地によって採用が可能になる。他方、複雑な培地が使用
される場合には、溶液の塩濃度を、たとえば限外／透析
濾過によって減少させ、ついで陽イオン交換樹脂、たと
えばFractogelR EMD-SO3 -上、イオン交換クロマトグラ
フィーに付す、限外濾過に代えて、たとえば欧州特許出
願ＥＰ−Ａ ３１６６５０に記載されているような適当
な樹脂上での疎水性吸着を行うこともできる。陽イオン
交換クロマトグラフィーからの生成物をついで、そのま
ま逆相クロマトグラフィー（たとえば、LichropreR RP1
8上）に付すことができ、これにより高純度の生成物が
得られる。残った不純物の除去が必要な場合は、さらに
陰イオン交換クロマトグラフィーを、たとえばQ-Sephar
oseで行うことができる。各段階を最適化することで、
５０％を越える収率を達成することが可能である。
【００１７】安定な〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2〕デスルファト
ヒルジンの誘導体の製造のため、欧州特許出願ＥＰ−Ａ
３１６ ６５０に開示されている発現系を使用する場合
には、同様に処理を行うことができるが、この場合に
は、たとえば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ ３１６ ６５０に
記載されているようなバッチ陰イオン交換工程により、
陽イオン交換クロマトグラフィーの前に生成物をさらに
濃縮することが得策である。
ヒルジンの誘導体の製造のため、欧州特許出願ＥＰ−Ａ
３１６ ６５０に開示されている発現系を使用する場合
には、同様に処理を行うことができるが、この場合に
は、たとえば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ ３１６ ６５０に
記載されているようなバッチ陰イオン交換工程により、
陽イオン交換クロマトグラフィーの前に生成物をさらに
濃縮することが得策である。
【００１８】例１：ベクターｐＣＭＴ２０３の構築 種細胞バンクの設立または株の発酵のようなバイオテク
ノロジー操作は、用いられた宿主／ベクター上、選択し
た圧力下に行うのが好ましい。これは異種微生物による
汚染の危険を最小限にする。米国保険局の指針に従い、
組換え蛋白質の製造過程には、抗生物質アンピリシンは
使用しない。
ノロジー操作は、用いられた宿主／ベクター上、選択し
た圧力下に行うのが好ましい。これは異種微生物による
汚染の危険を最小限にする。米国保険局の指針に従い、
組換え蛋白質の製造過程には、抗生物質アンピリシンは
使用しない。
【００１９】プラスミドｐＣＭ７０５１およびｐＣＭ７
０５３は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ４４８ ０９３に記載
されている。上述の点でのプラスミドの改良は、ベクタ
ーＤＮＡを既知のテトラサイクリン抵抗性での延長によ
って達成できる。
０５３は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ４４８ ０９３に記載
されている。上述の点でのプラスミドの改良は、ベクタ
ーＤＮＡを既知のテトラサイクリン抵抗性での延長によ
って達成できる。
【００２０】この実施には、プラスミドｐＣＭ７０５１
のＤＮＡをＮｒｕ Ｉで線状化し、プラスミドｐＣＭ７
０５３からの単離した１.１kb Ｎｒｕ Ｉフラグメント
に凍結する。このＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐ
ＣＭ７０５１にはないテトラサイクリン抵抗性遺伝子の
５′末端部分を含有する。大腸菌株Ｍｃ１０６１のコン
ピーテント細胞を連結反応混合物で形質転換して、１
２.５mg／リットルテトラサイクリン含有ＮＡ寒天平板
にプレーティングする。３７℃で一夜インキュベートし
た後、形質転換細胞が得られる。それから、プラスミド
ＤＮＡを再び単離し、制限分析によって性質を調べる。
正しいプラスミドのＤＮＡを次に、製造業者の指示に従
って、酵素Ａｖａ ＩおよびＮｄｅ Ｉと反応させ、ゲル
電気泳動によって分画する。２つのフラグメントの大き
い方を単離し、突出末端をクレノウポリメラーゼで充填
する。ついで、フラグメントを自己連結させ、再び、大
腸菌Ｍｃ１０６１に形質転換する。制限分析によってＤ
ＮＡの性質を決定し、所望のプラスミドをｐＣＭＴ２０
３と命名する（図１）。
のＤＮＡをＮｒｕ Ｉで線状化し、プラスミドｐＣＭ７
０５３からの単離した１.１kb Ｎｒｕ Ｉフラグメント
に凍結する。このＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐ
ＣＭ７０５１にはないテトラサイクリン抵抗性遺伝子の
５′末端部分を含有する。大腸菌株Ｍｃ１０６１のコン
ピーテント細胞を連結反応混合物で形質転換して、１
２.５mg／リットルテトラサイクリン含有ＮＡ寒天平板
にプレーティングする。３７℃で一夜インキュベートし
た後、形質転換細胞が得られる。それから、プラスミド
ＤＮＡを再び単離し、制限分析によって性質を調べる。
正しいプラスミドのＤＮＡを次に、製造業者の指示に従
って、酵素Ａｖａ ＩおよびＮｄｅ Ｉと反応させ、ゲル
電気泳動によって分画する。２つのフラグメントの大き
い方を単離し、突出末端をクレノウポリメラーゼで充填
する。ついで、フラグメントを自己連結させ、再び、大
腸菌Ｍｃ１０６１に形質転換する。制限分析によってＤ
ＮＡの性質を決定し、所望のプラスミドをｐＣＭＴ２０
３と命名する（図１）。
【００２１】例２：Ｎ−末端アミノ酸としてアラニンを
有するヒルジン変異体の構築 アラニンで始まるヒルジン変異体は、大腸菌中で発現さ
れる。クローニングには、例１に記載のベクターｐＣＭ
７０５３およびｐｃｍＴ２０３、ならびにＥＰ−Ａ １
７１ ０２４に記載されていて、ＤＮＡ配列Ｉと呼ばれ
るヒルジンの合成ＤＮＡ配列を有する図３のプラスミド
わ使用した。このプラスミドは、以下、プラスミドｐＫ
１５２と呼ぶ。さらに、以下のオリゴヌクレオチドを、
Applied Biosystems製のＤＮＡ合成装置「３９１ ＤＮ
Ａシンセサイザー」を用いて合成した。
有するヒルジン変異体の構築 アラニンで始まるヒルジン変異体は、大腸菌中で発現さ
れる。クローニングには、例１に記載のベクターｐＣＭ
７０５３およびｐｃｍＴ２０３、ならびにＥＰ−Ａ １
７１ ０２４に記載されていて、ＤＮＡ配列Ｉと呼ばれ
るヒルジンの合成ＤＮＡ配列を有する図３のプラスミド
わ使用した。このプラスミドは、以下、プラスミドｐＫ
１５２と呼ぶ。さらに、以下のオリゴヌクレオチドを、
Applied Biosystems製のＤＮＡ合成装置「３９１ ＤＮ
Ａシンセサイザー」を用いて合成した。
【００２２】
【化３】
【００２３】例２ａ：プラスミドｐＳＣＨ１３中ヒルジ
ン変異体１３（Ａｌａ1,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52,Ｇｌｕ53,
Ｇｌｕ55）の構築 プラスミドｐＫ１５２のＤＮＡを酵素ＢａｍＨ Ｉおよ
びＫｐｎ Ｉと反応させ、得られた２つのフラグメント
をゲル電気泳動によって互いに分離する。大きい方のフ
ラグメントを単離し、予め二重鎖にハイブリダイズした
オリゴヌクレオチド配列Ｈｉｒ５およびＨｉｒ６と、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ反応で反応させる。コンピーテント
大腸菌Ｍｃ１０６１細胞を連結反応混合物で形質転換す
る。これと平行して、ｐＫ１５３ベクターフラグメント
を自己連結反応でそれ自体に連結し、同様に形質転換す
る。形質転換混合物を２０mg／リットルのアンピリシン
を含有するＮＡ平板上にプレーティングし、３７℃で一
夜インキュベートする。実験は翌朝、評価する。オリゴ
ヌクレオチドフラグメントへの連結反応が自己連結反応
よりも、少なくとも１００倍の形質転換細胞を生成した
場合、クローニングは有望とみなす。ついでプラスミド
ＤＮＡをクローニング反応からの形質転換細胞より単離
し、制限分析によって性質を調べた。Ａｓｐ55がＧｌｕ
55によって交換されたヒルジンペプチド配列３２〜６５
を含むＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを、正
しい制限パターンを示すプラスミドＤＮＡから単離す
る。このフラグメントをＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIで
開裂したベクターｐＣＭ７０５３に連結する。得られた
ものがプラスミドｐＣＭ７０５３Ｖａｒ３である。この
プラスミドは、位置５５にアミノ酸Ｇｌｕを有する修飾
ヒルジンのＤＮＡ配列を含有する。
ン変異体１３（Ａｌａ1,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52,Ｇｌｕ53,
Ｇｌｕ55）の構築 プラスミドｐＫ１５２のＤＮＡを酵素ＢａｍＨ Ｉおよ
びＫｐｎ Ｉと反応させ、得られた２つのフラグメント
をゲル電気泳動によって互いに分離する。大きい方のフ
ラグメントを単離し、予め二重鎖にハイブリダイズした
オリゴヌクレオチド配列Ｈｉｒ５およびＨｉｒ６と、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ反応で反応させる。コンピーテント
大腸菌Ｍｃ１０６１細胞を連結反応混合物で形質転換す
る。これと平行して、ｐＫ１５３ベクターフラグメント
を自己連結反応でそれ自体に連結し、同様に形質転換す
る。形質転換混合物を２０mg／リットルのアンピリシン
を含有するＮＡ平板上にプレーティングし、３７℃で一
夜インキュベートする。実験は翌朝、評価する。オリゴ
ヌクレオチドフラグメントへの連結反応が自己連結反応
よりも、少なくとも１００倍の形質転換細胞を生成した
場合、クローニングは有望とみなす。ついでプラスミド
ＤＮＡをクローニング反応からの形質転換細胞より単離
し、制限分析によって性質を調べた。Ａｓｐ55がＧｌｕ
55によって交換されたヒルジンペプチド配列３２〜６５
を含むＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを、正
しい制限パターンを示すプラスミドＤＮＡから単離す
る。このフラグメントをＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIで
開裂したベクターｐＣＭ７０５３に連結する。得られた
ものがプラスミドｐＣＭ７０５３Ｖａｒ３である。この
プラスミドは、位置５５にアミノ酸Ｇｌｕを有する修飾
ヒルジンのＤＮＡ配列を含有する。
【００２４】プラスミドｐＫ１５２からのＤＮＡを制限
酵素Ｋｐｎ ＩとＢｓｔｂ Ｉで切断する。ゲル電気泳動
で分画化したのち、大きい方のベクターフラグメントを
単離する。このフラグメントを、予め二重鎖にハイブリ
ダイズしたオリゴヌクレオチドＨｉｒ ＩおよびＨｉｒ
IIに連結する。上述の方法により、プラスミドｐＫ１５
３の誘導体を生成させる。これを変異体１と呼ぶ。この
プラスミドからのＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIフラグメ
ントを単離して、ＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIで開裂し
たベクターｐＣＭ７０５３に連結する。位置５２、５３
および５５にアミノ酸Ｇｌｎ、ＧｌｕおよびＧｌｕを有
する修飾ヒルジンをコードするプラスミドｐＣＭ７０５
３Ｖａｒ１が得られる。このプラスミドは、さらに制限
酵素ＥｃｏＲ Ｉの認識部位を有する点で、プラスミド
ｐＣＭ７０５３と区別される。
酵素Ｋｐｎ ＩとＢｓｔｂ Ｉで切断する。ゲル電気泳動
で分画化したのち、大きい方のベクターフラグメントを
単離する。このフラグメントを、予め二重鎖にハイブリ
ダイズしたオリゴヌクレオチドＨｉｒ ＩおよびＨｉｒ
IIに連結する。上述の方法により、プラスミドｐＫ１５
３の誘導体を生成させる。これを変異体１と呼ぶ。この
プラスミドからのＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIフラグメ
ントを単離して、ＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIで開裂し
たベクターｐＣＭ７０５３に連結する。位置５２、５３
および５５にアミノ酸Ｇｌｎ、ＧｌｕおよびＧｌｕを有
する修飾ヒルジンをコードするプラスミドｐＣＭ７０５
３Ｖａｒ１が得られる。このプラスミドは、さらに制限
酵素ＥｃｏＲ Ｉの認識部位を有する点で、プラスミド
ｐＣＭ７０５３と区別される。
【００２５】プラスミドｐＣＭ７０５３Ｖａｒ１および
ｐＣＭ７０５３Ｖａｒ３のＤＮＡを、酵素Ｋｐｎ Ｉお
よびＭｌｕ Ｉで二重消化し、ゲル電気泳動で分画化す
る。各場合とも２つのフラグメントが生成し、ｐＣＭ６
０５３Ｖａｒ１混合物の場合にはその２つの大きい方を
単離し、ｐＣＭ７０５３Ｖａｒ３の場合には２つのフラ
グメントの小さい方を単離する。この２つのフラグメン
トを混合し、連結反応を行うと、大腸菌Ｍｃ１０６１で
発現する新たなプラスミドｐＶａｒ１３が得られる。ヒ
ルジンは例５のようにして単離し、アミノ酸分析によっ
て定性する。プラスミドｐＶａｒ１３の正しい構築は予
想されるアミノ酸組成によって確認される。
ｐＣＭ７０５３Ｖａｒ３のＤＮＡを、酵素Ｋｐｎ Ｉお
よびＭｌｕ Ｉで二重消化し、ゲル電気泳動で分画化す
る。各場合とも２つのフラグメントが生成し、ｐＣＭ６
０５３Ｖａｒ１混合物の場合にはその２つの大きい方を
単離し、ｐＣＭ７０５３Ｖａｒ３の場合には２つのフラ
グメントの小さい方を単離する。この２つのフラグメン
トを混合し、連結反応を行うと、大腸菌Ｍｃ１０６１で
発現する新たなプラスミドｐＶａｒ１３が得られる。ヒ
ルジンは例５のようにして単離し、アミノ酸分析によっ
て定性する。プラスミドｐＶａｒ１３の正しい構築は予
想されるアミノ酸組成によって確認される。
【００２６】次に、プラスミドｐＣＭＴ２０３およびｐ
Ｖａｒ１３のＤＮＡを、制限酵素Ｍｌｕ ＩおよびＰｖ
ｕ Ｉと反応させ、ゲル電気泳動で分画する。各場合と
も２つのフラグメントが生成し、いずれの場合も大きい
方を単離する。この方法で単離されたフラグメントを混
合し、リガーゼ反応を行うと、プラスミドｐＳＣＨ１３
が得られる。その構造は制限酵素分析およびＤＮＡ配列
分析で確認される。このプラスミドを、既知の方法での
形質転換により、欧州特許出願ＥＰ−Ａ ４８８０９３
に記載された大腸菌Ｋ１２分泌変異株に導入する。
Ｖａｒ１３のＤＮＡを、制限酵素Ｍｌｕ ＩおよびＰｖ
ｕ Ｉと反応させ、ゲル電気泳動で分画する。各場合と
も２つのフラグメントが生成し、いずれの場合も大きい
方を単離する。この方法で単離されたフラグメントを混
合し、リガーゼ反応を行うと、プラスミドｐＳＣＨ１３
が得られる。その構造は制限酵素分析およびＤＮＡ配列
分析で確認される。このプラスミドを、既知の方法での
形質転換により、欧州特許出願ＥＰ−Ａ ４８８０９３
に記載された大腸菌Ｋ１２分泌変異株に導入する。
【００２７】例２ｂ：プラスミドｐＳＣＨ８３中ヒルジ
ン変異体８３（Ａｌａ1,Ｇｌｕ33,Ｇｌｕ53）の構築 例２ａに記載のＫｐｎ Ｉ／Ｂｓｔｂ Ｉ ｐＫ１５２ベ
クターフラグメントを、予め二重鎖にハイブリダイズし
たオリゴヌクレオチド配列Ｈｉｒ１３およびＨｉｒ１４
連結する。変異体８と呼ばれるプラスミドが生成する。
このプラスミドからのＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIフラ
グメントを例２の場合と同様にして単離し、ＢａｍＨ
Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIで開裂したベクターｐＣＭ７０５３中
に導入する。プラスミドｐＣＭＶａｒ８が生成し、これ
の小さい方のＫｐｎ Ｉ／ＭｌｕＩフラグメントを単離
する。これを、プラスミドｐＣＭＶａｒ３からの大きい
Ｋｐｎ Ｉ／Ｍｌｕ Ｉフラグメントに連結する。プラス
ミドｐＶａｒ８３は、大腸菌株Ｍｃ１０６１中で発現す
るように製造される。ヒルジン誘導体の単離、ついでア
ミノ酸分析ののち、プラスミド構造を確認し、Ｍｌｕ
Ｉ／Ｐｖｕ Ｉフラグメントを例２ａのようにして単離
し、プラスミドｐＣＭＴ２０３からの大きいＭｌｕ Ｉ
／Ｐｖｕ Ｉベクターフラグメントに連結し、プラスミ
ドｐＳＣＨ８３を得る。このプラスミドを上述の分泌変
異株に導入する。
ン変異体８３（Ａｌａ1,Ｇｌｕ33,Ｇｌｕ53）の構築 例２ａに記載のＫｐｎ Ｉ／Ｂｓｔｂ Ｉ ｐＫ１５２ベ
クターフラグメントを、予め二重鎖にハイブリダイズし
たオリゴヌクレオチド配列Ｈｉｒ１３およびＨｉｒ１４
連結する。変異体８と呼ばれるプラスミドが生成する。
このプラスミドからのＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIフラ
グメントを例２の場合と同様にして単離し、ＢａｍＨ
Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIで開裂したベクターｐＣＭ７０５３中
に導入する。プラスミドｐＣＭＶａｒ８が生成し、これ
の小さい方のＫｐｎ Ｉ／ＭｌｕＩフラグメントを単離
する。これを、プラスミドｐＣＭＶａｒ３からの大きい
Ｋｐｎ Ｉ／Ｍｌｕ Ｉフラグメントに連結する。プラス
ミドｐＶａｒ８３は、大腸菌株Ｍｃ１０６１中で発現す
るように製造される。ヒルジン誘導体の単離、ついでア
ミノ酸分析ののち、プラスミド構造を確認し、Ｍｌｕ
Ｉ／Ｐｖｕ Ｉフラグメントを例２ａのようにして単離
し、プラスミドｐＣＭＴ２０３からの大きいＭｌｕ Ｉ
／Ｐｖｕ Ｉベクターフラグメントに連結し、プラスミ
ドｐＳＣＨ８３を得る。このプラスミドを上述の分泌変
異株に導入する。
【００２８】例２ｃ：プラスミドｐＳＣＨ９３中ヒルジ
ン変異体９３（Ａｌａ1,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52,Ｇｌｕ53,
Ａｌａ54）の構築 プラスミドｐＳＣＨ９３は例２ｂと同様にして構築す
る。これには、最初のクローニング工程で、Ｂｓｔｂ
Ｉ／Ｋｐｎ Ｉ ｐＫ１５２フラグメントを、二重鎖にハ
イブリダイズしたオリゴヌクレオチド配列Ｈｉｒ１５お
よびＨｉｒ１６と反応させ、変異体９と呼ばれるプラス
ミドを生成させなければならない。
ン変異体９３（Ａｌａ1,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52,Ｇｌｕ53,
Ａｌａ54）の構築 プラスミドｐＳＣＨ９３は例２ｂと同様にして構築す
る。これには、最初のクローニング工程で、Ｂｓｔｂ
Ｉ／Ｋｐｎ Ｉ ｐＫ１５２フラグメントを、二重鎖にハ
イブリダイズしたオリゴヌクレオチド配列Ｈｉｒ１５お
よびＨｉｒ１６と反応させ、変異体９と呼ばれるプラス
ミドを生成させなければならない。
【００２９】例３：プラスミドｐＳＣＨ１３、ｐＳＣＨ
８３およびｐＳＣＨ９３の発現 プラスミドｐＳＣＨ１３、ｐＳＣＨ８３およびｐＳＣＨ
９３は、振盪フラスコ中、および欧州特許出願ＥＰ−Ａ
４４８ ０９３に記載の１０リットル規模の容器の両方
で発現される。このためには、その出願に記載された株
および変異種を使用する。立方メートル規模による培養
体の発現の培地、誘導条件および発酵時間は本技術分野
の熟練者にはよく知られたそれらの性質によって変動さ
せる。
８３およびｐＳＣＨ９３の発現 プラスミドｐＳＣＨ１３、ｐＳＣＨ８３およびｐＳＣＨ
９３は、振盪フラスコ中、および欧州特許出願ＥＰ−Ａ
４４８ ０９３に記載の１０リットル規模の容器の両方
で発現される。このためには、その出願に記載された株
および変異種を使用する。立方メートル規模による培養
体の発現の培地、誘導条件および発酵時間は本技術分野
の熟練者にはよく知られたそれらの性質によって変動さ
せる。
【００３０】例４：ヒルジン変異体１３および９３のパ
ン酵母中でクローニングおよび発現 天然の配列が修飾されて、Ｎ−末端アミノ酸ロイシンを
有する合成ヒルジンは、欧州特許出願ＥＰ−Ａ ３２４
７１２に記載されている。このヒルジンは、変異体１３
および９３について前述した修飾をロイシンに続くアミ
ノ酸２からの配列に行った場合、同様にさらに最適化が
可能である。この関係では、たとえばこの出願に記載さ
れたベクターおよび株が使用される。ヒルジンの分泌を
起こす他のすべての酵母発現系、またはその変異株も同
様に使用できることは、本技術分野の熟練者には自明の
通りである。
ン酵母中でクローニングおよび発現 天然の配列が修飾されて、Ｎ−末端アミノ酸ロイシンを
有する合成ヒルジンは、欧州特許出願ＥＰ−Ａ ３２４
７１２に記載されている。このヒルジンは、変異体１３
および９３について前述した修飾をロイシンに続くアミ
ノ酸２からの配列に行った場合、同様にさらに最適化が
可能である。この関係では、たとえばこの出願に記載さ
れたベクターおよび株が使用される。ヒルジンの分泌を
起こす他のすべての酵母発現系、またはその変異株も同
様に使用できることは、本技術分野の熟練者には自明の
通りである。
【００３１】欧州特許出願ＥＰ−Ａ ３２４ ７１２に記
載のクローニングベクター７を、ＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎ
ｄ IIIで開裂し、各場合とも、プラスミドｐＳＣＨ１３
またはｐＳＣＮ９３から単離され、それぞれのクローニ
ングベクターが欠けるヒルジン配列のカルボキシ末端部
分のアミノ酸からなるＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIフラ
グメントに連結する。プラスミドｐ７１３およびｐ７９
３が生成され、これを制限分析で定性する。ついで、こ
れらのプラスミドの正しいＤＮＡから、ＥｃｏＲ Ｉ／
Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを単離し、突出末端をクレノ
ウポリメラーゼ反応で充填する。この方法で調製された
フラグメントを、各場合とも、欧州特許出願ＥＰ−Ａ
３２４ ７１２の例１に記載されたプラスミドｙＥＰ１
３からのブラント末端ベクターフラグメントに連結す
る。挿入されたフラグメントの配向性に関してのみ相違
し、アミノ酸Ｌｅｕ1、Ｇｌｕ33、Ｇｌｎ52、Ｇｌｕ53
およびＧｌｕ55を有するヒルジン誘導体をコードするプ
ラスミドｐＨＡＢＶａｒ１３１およびｐＨＡＢＶａｒ１
３２、ならびに同様に挿入されたフラグメントの配向性
のみ相違し、アミノ酸Ｌｅｕ1、Ｇｌｕ33、Ｇｌｎ52、
Ｇｌｕ53およびＡｌａ54を有するヒルジン誘導体をコー
ドするプラスミドｐＨＡＢＶａｒ９３１およびｐＨＡＢ
Ｖａｒ９３２が生成される。これらのプラスミドを、た
とえば、その出願に記載された酵母株に形質転換する。
ヒルジン誘導体の発現および精製は、それに記載の方法
で実施できる。精製に際して、たとえば、ミリポアペリ
コン限外濾過系を用いた場合、遠心分離および以後の吸
着クロマトグラフィーを省略できることが知られてい
る。ここで使用される方法は、実験室規模についてのも
のである。立方メートル規模での培養には、他の発酵時
間、培養条件および後処理工程が必要である。これは本
技術分野の熟練者にはよく知られている。
載のクローニングベクター７を、ＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎ
ｄ IIIで開裂し、各場合とも、プラスミドｐＳＣＨ１３
またはｐＳＣＮ９３から単離され、それぞれのクローニ
ングベクターが欠けるヒルジン配列のカルボキシ末端部
分のアミノ酸からなるＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIフラ
グメントに連結する。プラスミドｐ７１３およびｐ７９
３が生成され、これを制限分析で定性する。ついで、こ
れらのプラスミドの正しいＤＮＡから、ＥｃｏＲ Ｉ／
Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを単離し、突出末端をクレノ
ウポリメラーゼ反応で充填する。この方法で調製された
フラグメントを、各場合とも、欧州特許出願ＥＰ−Ａ
３２４ ７１２の例１に記載されたプラスミドｙＥＰ１
３からのブラント末端ベクターフラグメントに連結す
る。挿入されたフラグメントの配向性に関してのみ相違
し、アミノ酸Ｌｅｕ1、Ｇｌｕ33、Ｇｌｎ52、Ｇｌｕ53
およびＧｌｕ55を有するヒルジン誘導体をコードするプ
ラスミドｐＨＡＢＶａｒ１３１およびｐＨＡＢＶａｒ１
３２、ならびに同様に挿入されたフラグメントの配向性
のみ相違し、アミノ酸Ｌｅｕ1、Ｇｌｕ33、Ｇｌｎ52、
Ｇｌｕ53およびＡｌａ54を有するヒルジン誘導体をコー
ドするプラスミドｐＨＡＢＶａｒ９３１およびｐＨＡＢ
Ｖａｒ９３２が生成される。これらのプラスミドを、た
とえば、その出願に記載された酵母株に形質転換する。
ヒルジン誘導体の発現および精製は、それに記載の方法
で実施できる。精製に際して、たとえば、ミリポアペリ
コン限外濾過系を用いた場合、遠心分離および以後の吸
着クロマトグラフィーを省略できることが知られてい
る。ここで使用される方法は、実験室規模についてのも
のである。立方メートル規模での培養には、他の発酵時
間、培養条件および後処理工程が必要である。これは本
技術分野の熟練者にはよく知られている。
【００３２】例５：〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌ
ｎ52,Ｇｌｕ53,Ｇｌｕ55〕−デスルファトヒルジンの精
製 １リットルあたり３.６ｇのヒルジンを含有する、細胞
を含まない培養上澄液にギ酸を加えて、pHを３に調整し
た。室温に１時間放置して生成した沈殿をＣＥＰＡ遠心
分離装置によって沈降させた。透明な上澄液の伝導度
を、透析濾過によって、＜２.５mS／cmに低下させた。
ついで生成物をFractogelR EMD-SO3-、LichroprepR Ｒ
Ｐ１８およびＱ−Sepharoseで、連続クロマトグラフィ
ー工程によって高純度に調製した。
ｎ52,Ｇｌｕ53,Ｇｌｕ55〕−デスルファトヒルジンの精
製 １リットルあたり３.６ｇのヒルジンを含有する、細胞
を含まない培養上澄液にギ酸を加えて、pHを３に調整し
た。室温に１時間放置して生成した沈殿をＣＥＰＡ遠心
分離装置によって沈降させた。透明な上澄液の伝導度
を、透析濾過によって、＜２.５mS／cmに低下させた。
ついで生成物をFractogelR EMD-SO3-、LichroprepR Ｒ
Ｐ１８およびＱ−Sepharoseで、連続クロマトグラフィ
ー工程によって高純度に調製した。
【００３３】残留した塩および緩衝液成分は、Ｑ−Seph
arose溶出液から、限外／透析濾過の組合わせによって
除去し、ついで生成物を凍結乾燥により、乾燥物質とし
て得ることができた。
arose溶出液から、限外／透析濾過の組合わせによって
除去し、ついで生成物を凍結乾燥により、乾燥物質とし
て得ることができた。
【００３４】例６：〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌ
ｎ52,Ｇｌｕ53,Ａｌａ54〕−デスルファトヒルジンの精
製 発酵終了後、培養溶液を細胞物質の存在下にpH３の酸性
にした。バイオマスおよび生成した沈殿をセパレーター
中で除去した。透明な上澄液に５％w/v DiaionHP20を加
えるとヒルジンの定量的吸着を生じた。濾過して母液を
除去したのち、樹脂を１回水で洗浄した。ついで、pH３
の酸性とした３０％濃度のイソプロパノールで脱着させ
た。透明な溶出液をさらに、陽イオン交換クロマトグラ
フィーで始めて例５の場合と同様に処理し、ついで凍結
乾燥すると高純度の乾燥工程生成物が得られる。
ｎ52,Ｇｌｕ53,Ａｌａ54〕−デスルファトヒルジンの精
製 発酵終了後、培養溶液を細胞物質の存在下にpH３の酸性
にした。バイオマスおよび生成した沈殿をセパレーター
中で除去した。透明な上澄液に５％w/v DiaionHP20を加
えるとヒルジンの定量的吸着を生じた。濾過して母液を
除去したのち、樹脂を１回水で洗浄した。ついで、pH３
の酸性とした３０％濃度のイソプロパノールで脱着させ
た。透明な溶出液をさらに、陽イオン交換クロマトグラ
フィーで始めて例５の場合と同様に処理し、ついで凍結
乾燥すると高純度の乾燥工程生成物が得られる。
【００３５】例７：最適化イソヒルジンについての相対
Ｋi値の測定 Ｋi値はStoneおよびHofsteengeの方法（Biochemistry 2
5：4622〜4628、1986)によって測定した。すなわち、Ｄ
−ＨＨＴ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡの１.２５mM溶液０.
２mlを、２５℃で、０.１Ｍトリス、０.２Ｍ ＮａＣｌ
および０.１％(v/v)トリトンＸ−１００pH８.３、１.７
ml、並びに１４５mM ＮａＣｌ中試験すべきイソヒルジ
ン０.１mlと平衡化した。０.０５mlのトロンビン溶液を
加えて結合を開始させた。１０〜２０分間にわたって、
４０５nmにおける吸収を記録した。
Ｋi値の測定 Ｋi値はStoneおよびHofsteengeの方法（Biochemistry 2
5：4622〜4628、1986)によって測定した。すなわち、Ｄ
−ＨＨＴ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡの１.２５mM溶液０.
２mlを、２５℃で、０.１Ｍトリス、０.２Ｍ ＮａＣｌ
および０.１％(v/v)トリトンＸ−１００pH８.３、１.７
ml、並びに１４５mM ＮａＣｌ中試験すべきイソヒルジ
ン０.１mlと平衡化した。０.０５mlのトロンビン溶液を
加えて結合を開始させた。１０〜２０分間にわたって、
４０５nmにおける吸収を記録した。
【００３６】反応は次式に従う。
【００３７】
【数１】 式中、〔Ｐ〕＝生成物濃度（ニトロアニリン） Ｖo＝初期速度 Ｖs＝平衡状態における反応速度 ｄ＝、ｔ＝０における〔Ｐ〕である。
【００３８】速度定数ｋは非線形回帰によって求めた。
さまざまなインヒビター濃度におけるｋの式
さまざまなインヒビター濃度におけるｋの式
【数２】 による〔ｌ〕への外挿によって、速度定数ｋonおよびｋ
off、したがってＫi＝ｋ on／ｋoffが得られる。
off、したがってＫi＝ｋ on／ｋoffが得られる。
【００３９】
【表１】
【００４０】例８：最適化〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2〕デスル
ファトヒルジン類縁体のルーサスモンキーにおける部分
トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）に対する影響 〔Ｌｅｕ1,Ｔｈｒ2〕デスルファトヒルジン、〔Ａｌ
ａ1,Ｔｈｒ2〕デスルファトヒルジン、〔Ａｌａ1,Ｔｈ
ｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52,Ｇｌｕ53,Ｇｌｕ55〕デスルフ
ァトヒルジン、および〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇ
ｌｎ52,Ｇｌｕ53,Ａｌａ54〕デスルファトヒルジンを体
重６.５±１.６kgの雄性ルーサスモンキーに用量０.５m
g／kgで静脈内投与した。血液サンプルを所定の間隔で
採取し、凝固パラメーターを測定した。部分トロンボプ
ラスチン時間（ＰＴＴ）は次のように測定した（図
２）。すなわち、加クエン酸血漿０.１ml、およびヒト
血小板からのＰＴＴ試薬(Behringwerk社製)０.１mlを予
め３７℃に加熱した試験管中で混合し、３７℃を正確に
２分間保持して内因性凝固を完全に活性化した。つい
で、０.１mlの０.０２５Ｍ塩化カルシウム溶液を加え、
凝固をコアギュロメーターで測定した(Schnitgerおよび
Grossによる）。
ファトヒルジン類縁体のルーサスモンキーにおける部分
トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）に対する影響 〔Ｌｅｕ1,Ｔｈｒ2〕デスルファトヒルジン、〔Ａｌ
ａ1,Ｔｈｒ2〕デスルファトヒルジン、〔Ａｌａ1,Ｔｈ
ｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇｌｎ52,Ｇｌｕ53,Ｇｌｕ55〕デスルフ
ァトヒルジン、および〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2,Ｇｌｕ33,Ｇ
ｌｎ52,Ｇｌｕ53,Ａｌａ54〕デスルファトヒルジンを体
重６.５±１.６kgの雄性ルーサスモンキーに用量０.５m
g／kgで静脈内投与した。血液サンプルを所定の間隔で
採取し、凝固パラメーターを測定した。部分トロンボプ
ラスチン時間（ＰＴＴ）は次のように測定した（図
２）。すなわち、加クエン酸血漿０.１ml、およびヒト
血小板からのＰＴＴ試薬(Behringwerk社製)０.１mlを予
め３７℃に加熱した試験管中で混合し、３７℃を正確に
２分間保持して内因性凝固を完全に活性化した。つい
で、０.１mlの０.０２５Ｍ塩化カルシウム溶液を加え、
凝固をコアギュロメーターで測定した(Schnitgerおよび
Grossによる）。
【００４１】例９：〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2〕デスルファト
ヒルジン類縁体の、pH７および６０℃における２０時間
安定性 試験すべき化合物を、２０mM ＮａＰ、pH７、３００mM
ＮａＣｌ中に、０.５mg／ml溶解し、６０℃で２０時間
インキュベートした。サンプルをｔ＝０およびｔ＝２０
ｈの時間に採取して、RP HPLC(NucleosilR）および陰イ
オン交換クロマトグラフィー（Mono ＱR）によって分析
した。新たに形成された副生成物の含量を計算した。
ヒルジン類縁体の、pH７および６０℃における２０時間
安定性 試験すべき化合物を、２０mM ＮａＰ、pH７、３００mM
ＮａＣｌ中に、０.５mg／ml溶解し、６０℃で２０時間
インキュベートした。サンプルをｔ＝０およびｔ＝２０
ｈの時間に採取して、RP HPLC(NucleosilR）および陰イ
オン交換クロマトグラフィー（Mono ＱR）によって分析
した。新たに形成された副生成物の含量を計算した。
【００４２】
【表２】
【００４３】例１０：〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2〕デスルファ
トヒルジン類縁体の、pH６.５および６０℃における安
定性 凍結乾燥された精製イソヒルジンを水に１mg／ml溶解
し、１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4でpH６.５に調整した。濾過して
滅菌したのち、振盪水浴中６０℃で、遮光下にインキュ
ベートした。時間ｔ＝０、５、２４、４８、７２および
９６時にサンプルを採取し、その中の副精製物の含量
を、RP HPLC(NucleosilR）およびイオン交換クロマトグ
ラフィー（Mono ＱR）によって分析した。ｔ＝ｘにおけ
る純度をｔ＝０における純度に対する相対値として示し
た。各場合とも２つの分析系からの好ましくない方の値
をベースとして使用した（図４）。
トヒルジン類縁体の、pH６.５および６０℃における安
定性 凍結乾燥された精製イソヒルジンを水に１mg／ml溶解
し、１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4でpH６.５に調整した。濾過して
滅菌したのち、振盪水浴中６０℃で、遮光下にインキュ
ベートした。時間ｔ＝０、５、２４、４８、７２および
９６時にサンプルを採取し、その中の副精製物の含量
を、RP HPLC(NucleosilR）およびイオン交換クロマトグ
ラフィー（Mono ＱR）によって分析した。ｔ＝ｘにおけ
る純度をｔ＝０における純度に対する相対値として示し
た。各場合とも２つの分析系からの好ましくない方の値
をベースとして使用した（図４）。
【００４４】例１１：〔Ａｌａ1,Ｔｈｒ2〕デスルファ
トヒルジン類縁体の、pH４および６０℃における安定性 凍結乾燥された精製イソヒルジンを水に１mg／ml溶解
し、１Ｍ酢酸でpH４に調整した。インキュベーションお
よび分析は例１０と同様に行った（図３）。
トヒルジン類縁体の、pH４および６０℃における安定性 凍結乾燥された精製イソヒルジンを水に１mg／ml溶解
し、１Ｍ酢酸でpH４に調整した。インキュベーションお
よび分析は例１０と同様に行った（図３）。
【図１】プラスミドｐＣＭＴ２０３の構造。
【図２】ルーサスモンキーに０.５mg静注後のＰＴＴの
上昇。
上昇。
【図３】６０℃、pH４における苛酷条件でのインキュベ
ーション時における本発明の合成イソヒルジンの安定性
を示すグラフ 。
ーション時における本発明の合成イソヒルジンの安定性
を示すグラフ 。
【図４】６０℃、pH６.５における苛酷条件でのインキ
ュベーション時における本発明の合成イソヒルジンの安
定性を示すグラフ。
ュベーション時における本発明の合成イソヒルジンの安
定性を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 パウル・ハーバーマン ドイツ連邦共和国デー−6239エプシユタ イン／タウヌス．ロセルトシユトラーセ 35 (72)発明者 ドミニク・トリピエ ドイツ連邦共和国デー−6239エプシユタ イン／タウヌス．イム・キルシユガルテ ン16 (72)発明者 ヴオルフガング・ウルマー ドイツ連邦共和国デー−6239エプシユタ イン／タウヌス．ウンターデンウルメン ６ (72)発明者 ゲールハルト・シユミツト ドイツ連邦共和国デー−8000ミユンヒエ ン．ドルフシユトラーセ９アー (56)参考文献 特開 平２−218695（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−233098（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501011（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/815 ZNA A61P 7/02 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】 以下のアミノ酸 ３３位にＧｌｕ ５２位にＧｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＡｓｐ ５３位にＧｌｕ ５４位にＧｌｙまたはＡｌａ ５５位にＡｓｐまたはＧｌｕ を有する、安定性の改善されたイソヒルジン。
- 【請求項２】 式 【化１】 （式中、Ａ1がＬｅｕ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＶａｌで
あり、Ａ2はＴｈｒまたはＶａｌであり、ＢはＧｌｕで
あり、ＣはＧｌｎまたはＧｌｕであり、ＤはＧｌｕであ
り、ＥはＧｌｙまたはＡｌａであり、ＦはＡｓｐまたは
Ｇｌｕである）で表される請求項１記載のイソヒルジ
ン。 - 【請求項３】 位置１がＡｌａまたはＬｅｕであり、Ｔ
ｈｒが位置２、Ｇｌｕが位置３３、Ｇｌｎが位置５２、
Ｇｌｕが位置５３、Ｇｌｙが位置５４、Ｇｌｕが位置５
５に存在する請求項１または２記載のイソヒルジン。 - 【請求項４】 位置１がＡｌａまたはＬｅｕであり、Ｇ
ｌｕが位置３３、Ｇｌｎが位置５２、Ｇｌｕが位置５
３、Ａｌａが位置５４、Ａｓｐが位置５５に存在する請
求項１または２記載のイソヒルジン。 - 【請求項５】 請求項１〜４記載のイソヒルジンをコー
ドするベクター。 - 【請求項６】 宿主細胞の蛋白質をpH≦４での酸沈殿に
より分離し、ついで生成物を培養培地から、少なくとも
１回の陽イオン交換クロマトグラフィーおよび１回のＲ
Ｐクロマトグラフィーからなる連続的クロマトグラフィ
ー精製によって高純度の形態に調製する請求項１〜４記
載のイソヒルジンの製造方法。 - 【請求項７】 請求項１〜４記載のイソヒルジン１種ま
たはそれ以上を活性成分として含有する抗血栓医薬組成
物。 - 【請求項８】 活性成分を非経口投与（ｉ.ｖ．または
ｓ.ｃ．）用に１〜５００mg／mlの濃度、pH４〜８にお
いて溶解した形態で存在させる請求項１〜４記載のイソ
ヒルジンの抗血栓医薬組成物。
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| US7202059B2 (en) * | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
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| DE3583361D1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-08-08 | Ucp Gen Pharma Ag | Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
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| DE3506992A1 (de) * | 1985-02-27 | 1986-08-28 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Modifizierte hirudine, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
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| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
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