JP2001078771A - 新規タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該タンパク質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 上皮細胞増殖因子（Epidermal Growth F
actor : EGF）様活性を有する新規タンパク質、及び、
固相合成法を利用する化学的合成法、遺伝子操作を利用
する生化学的合成法による該新規タンパク質の製造法が
提供される。 【効果】 ＥＧＦ様活性物質の低分子化が可能となっ
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規タンパク質及
び該タンパク質をコードする遺伝子並びに該タンパク質
の製造方法に関する。更に詳細には、本発明は、新規な
上皮細胞増殖因子（Epidermal growth factor : EGF)様
生理活性を有するタンパク質及び該タンパク質を化学的
に合成し、更にリフォールディングさせ、これを採取す
ることを特徴とする該タンパク質の製造法に関する。ま
た、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を組み
込んだブレビバチルス属細菌を培養することにより、該
タンパク質を培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする該タンパク質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＥＧＦは、ヒトや馬の尿中やウサギ、ラ
ット及びマウスの顎下腺から単離されており、哺乳動物
の体内に存在していることが知られている（Adv. Meta
b. Dis., 8, 265(1975)）。ヒト上皮細胞増殖因子（hum
an Epidermal Growth Factor :h-EGF）は、５３個のア
ミノ酸からなる分子量約６，０００のペプチドで、分子
内に３カ所のジスルフィド結合を持ち、配列表の配列番
号５に示されるアミノ酸配列であることが知られている
（H. Gregory, Nature, 257, 325(1975)）。ＥＧＦの生
理活性として現在までに報告されているものは、細胞増
殖作用、胃酸分泌抑制作用、抗潰瘍作用、消化管粘膜保
護作用、ＤＮＡ合成促進作用、角膜修復作用、カルシウ
ム遊離促進作用、創傷治癒促進作用、抗炎症作用、鎮痛
作用、肝細胞障害抑制作用及び毛胞退縮作用などがある
（日本組織培養学会編、細胞成長因子、２０頁、朝倉書
店 １９８４年）。ＥＧＦはこのような作用を有するこ
とから創傷治癒薬、抗潰瘍剤、抗癌剤補助剤などとして
の様々な応用が試みられている（BIO INDUSTRY, 8, 275
(1991)）。

【０００３】このようにＥＧＦについて種々の応用研究
が進められている一方、ＥＧＦの効率的生産方法につい
ても種々検討がなされており、遺伝子組換えによるＥＧ
Ｆの製造方法も種々報告されている。特に恵比須らはバ
チルス・ブレビスＨＰＤ３１（Bacillus brevis HPD31
: なおこの菌株はブレビバチルス・チョーシネンシス
ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株で
ある）を宿主菌としたｈ−ＥＧＦの分泌生産系におい
て、ｈ−ＥＧＦを培地中に約３ｇ／ｌ生産させることに
成功している（特開平６−１３３７８２）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｈ−ＥＧＦ
の医薬面からの有効性を高めるため、全く新しい構造の
ｈ−ＥＧＦを創製する目的でなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
するためになされたものであって、本発明者らは、従来
より、医薬品を目指した試験研究、応用研究はｈ−ＥＧ
Ｆの構造を改変させたものでも行われてきたが、薬剤の
皮膚吸収性等の改善を目的としてより低分子化させたｈ
−ＥＧＦに関する検討は十分なされていなかった点に鑑
み、ｈ−ＥＧＦ様活性を有する低分子化した新規タンパ
ク質を創製するという新規技術課題を設定した。

【０００６】上記技術課題を解決するために、本発明者
らは、鋭意研究の結果、化学合成法又は遺伝子工学的手
法によってｈ−ＥＧＦ様活性をもつ低分子化した新規タ
ンパク質を製造することに成功し、本発明を完成するに
至った。

【０００７】すなわち本発明は、新規タンパク質及び該
タンパク質を化学的に合成し、更にリホールディングさ
せ、これを採取することを特徴とする該タンパク質の製
造法に関する。また、該タンパク質をコードする遺伝
子、該遺伝子を組み込んだブレビバチルス属細菌を培養
することにより、該タンパク質を培養物中に生成、蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする該タンパク質
の製造法に関するものである。以下、本発明を詳細に説
明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の新規タンパク質は、配列
表の配列番号１に示すように３５アミノ酸から成る。ま
た、本タンパク質のＮ末端から数えて８番目のアミノ酸
はＣｙｓｔｅｉｎｅ又はＳｅｒｉｎｅである（配列番号
１において、Ｘａａ：ＣｙｓまたはＳｅｒ）。（図２）

【０００９】本タンパク質は、化学合成法、遺伝子操作
による方法のいずれによっても製造することができる。
化学合成法としては、タンパク質、ペプチドの化学合成
に用いられる公知の方法が適宜使用可能であり、樹脂を
用い、保護基で保護したアミノ酸をＣ−末端側から付加
して合成する固相法等が挙げられる。固相法としては、
保護基としてＢｏｃ基（ブチルオキシカルボニル基）、
Ｆｍｏｃ基（９−フルオレニルメトキシカルボニル基）
をそれぞれ用いたＢｏｃ法ペプチド合成、Ｆｍｏｃ法ペ
プチド合成等が適宜使用され、特にＦｍｏｃ（9-Fluore
nylmethyloxycarbonyl）アミノ酸誘導体を用いたMerrif
ieldの固相合成法（Sin， S. Y., et al, Peptides, 1
6, 205-210(1995)，Sin, S. Y., et al., Int. J. Pept
ide Protein Res., 44, 485-490(1994)）が好適に使用
できる。また、自動固相合成機を利用して本タンパク質
を合成することも可能である。

【００１０】一方、本発明の新規タンパク質の製造方法
として、さらに遺伝子工学的手法を取り入れ、微生物に
生合成させる方法が挙げられる。該タンパク質をコード
する遺伝子は化学的に合成した遺伝子を用いることがで
き、合成遺伝子を用いる場合は発現系の細胞において最
も容認されたコドンを採用した遺伝子が好適に使用でき
る。具体的には配列番号２（ｓ：ｇまたはｃ）及び／又
は配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子などを用い
ることができる。

【００１１】このようにして得た遺伝子を宿主菌内に導
入、保持させるベクターは、宿主菌内で複製可能なプラ
スミドを使用することができる。例えば、宿主菌がブレ
ビバチルス属細菌の系ではｐＵＢ１１０やｐＮＵ２００
（鵜高重三、日本農芸化学会誌、61、669(1987)）、ｐ
ＨＹ７００（ Ebisu，S., et al., Biosci. Biotech,Bi
ochem, 56, 812-813(1992)）、ｐＨＴ１１０（特開平６
−１３３７８２）やこれらの派生体などのプラスミドを
使用できる。

【００１２】これらのプラスミドを構築する方法として
は、公知の方法が適宜用いられ、例えばモレキュラー・
クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Molecu
lar Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1989）に記載の方法などが例
示される。

【００１３】本発明において宿主菌として用いる細菌は
ブレビバチルス属細菌であればいずれの菌株でもよい
が、ブレビバチルス・チョーシネンシス（Brevibacillu
s choshinens）等が好適に使用できる。

【００１４】宿主菌を形質転換する方法は公知の方法で
よく、例えば、Takahashiらの方法(Takahashi et al.,
J. Bacteriol., 156, 1130(1983)）またはTakagiらの方
法(Takagi,H. et al., Agric, Biol, Chem., 53, 3099-
3100(1989)）などが例示される。

【００１５】得られた形質転換体の培養に用いる培地
は、形質転換体が生育して本発明タンパク質を生産しう
るものであれば如何なるものでもよい。培地に含有され
る炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロー
ス、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖蜜、有機酸
などが用いられる。また、窒素源としては、カゼイン、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、尿素、
グリシンなどの有機窒素源、硫酸アンモニウムなどの無
機窒素源などが用いられる。その他、塩化カリウム、リ
ン酸一カリウム、リン酸二カリウム、塩化ナトリウム、
硫酸マグネシウムなどの無機塩が必要に応じて培地に加
えられる。栄養要求性を示す菌はその生育に必要な栄養
物質を培地に添加すればよい。該栄養物質としては、ア
ミノ酸類、ビタミン類、核酸などが挙げられる。

【００１６】また、培養に際して必要があれば、培地に
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必要に
より、消泡剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤
などを加えてもよい。

【００１７】培地の初発ｐＨは５．０〜９．０、さらに
好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通常１５
℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃であり、
培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好ましくは２
４〜９６時間である。

【００１８】本発明で、形質転換体を前記の条件で培養
することによって、培養液中に本発明タンパク質が生
成、蓄積され、安定に生産される。このようにして得ら
れた本発明タンパク質は公知の方法により、例えば膜処
理、硫安分画法、クロマトグラフィーなど（タンパク質
・核酸の基礎実験法、南江堂（１９８５））で精製する
ことができる。

【００１９】このようにして得られた本発明タンパク質
の生理活性については既存の方法で測定することができ
る。例えば細胞増殖活性は、ラットの初代培養肝実質細
胞を用いた細胞増殖試験（J. Antibiotics, 38, 1767-1
773(1985)）や、ＭＴＴによる検出法（Mossmsnn, T.,
J. Immunol. Method, 65, 55-63(1983)）を用いて、Ｈ
ｅｌａ細胞に対する増殖を指標に確認することができ
る。また、ＤＮＡ合成刺激作用は³Ｈ−チミジンのヒト
繊維芽細胞などを用いた取り込み試験（細胞成長因子、
朝倉書店(1984)）で確認することができる。

【００２０】本発明では、新規なタンパク質を創製する
ことによって、今まで天然ＥＧＦでしか適用できなかっ
た分野以外にも、より広範な分野への適用が期待され
る。

【００２１】以下本発明を実施例により更に詳しく説明
するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限
定されるものではない。

【００２２】

【実施例１】［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）の化学
合成 ［Ｓｅｒ⁸］ｈ−ＥＧＦ（１−３５）は、Merrifieldの
固相合成法に基づき、Ｆｍｏｃにて合成した（Shin,S.
Y., et al., Peptides, 16, 205-210(1995)）。合成し
た［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）は天然ｈＥＧＦの
配列において、２０位のＣｙｓをＳｅｒに置換し、Ｎ端
側を１〜１２位、Ｃ端側を４８〜５３位削除したもので
ある。各アミノ酸の保護基として、α−アミノ基はＦｍ
ｏｃ基、側鎖保護基は、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉ
ｓはＯｔＢｕ（1-hydroxybenzotriazole)基、Ｓｅｒ、
ＴｙｒはｔＢｕ（tert-butyl）基、ＡｒｇはＰｍｃ（Ng
-2,2,5,78-pentamethylchroman-6-sulphonyl-L-arginin
e)基をそれぞれ用いた。

【００２３】樹脂へのＦｍｏｃアミノ酸の導入は、以下
に示すＤＣＣ−ＤＭＡＰ法（Wang,S.‐S., et al., In
t. J. Peptide Protein Res., 6, 103-109(1974)）を用
いた。樹脂は、ＨＭＰ（hydroxymethylphenoxy)-PEG(po
lyethyleneglycol)樹脂を用いた。まず、樹脂をＤＣＭ
（dichloromethane)、ＭｅＯＨで洗浄後、ＤＣＭ−ＤＭ
Ｆ（N,N′-dimethylformamide）混合溶媒中で樹脂に対
して３当量のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ、１．５当量のＤＣＣ
（N,N′-dicyclohexylcarbodiimide）、０．１５当量の
ＤＭＡＰ（dimethylaminopyridine）、１．５当量のＤ
ＩＥＡ（N,N′,N″-diisopropylethylamine）を室温で
１．５時間反応させ、ＨＭＰ−ＰＥＧ樹脂にＦｍｏｃ−
Ｌｅｕを導入した。樹脂へのアミノ酸の導入量は、Ｆｍ
ｏｃ−Ｌｅｕ−ＨＭＰ−ＰＥＧ樹脂を３０％piperidine
／ＤＭＦ中、３０分間反応した後に生成するN-9-fluore
nylpiperidineの３０１ｎｍ波長における吸光度を測定
し、Ｆｍｏｃ基のモル吸光係数（６８００）から求め
た。また、樹脂の未反応水酸化メチル基に対するキャッ
ピングは、樹脂に存在するＨＭＰ基に対し、１０当量の
安息香酸無水物、２当量のＤＣＣ、０．２当量のＤＭＡ
ＰをＤＭＦ−ＤＣＭ混合溶媒中、１時間室温で反応させ
行った。

【００２４】ペプチド鎖の伸長は、以下のように行っ
た。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＨＭＰ−ＰＥＧ樹脂を２０％pi
peridine／ＮＭＰ中で３０分間処理し、Ｆｍｏｃ基を除
去した。その後、樹脂をＤＣＭ、ＭｅＯＨで交互に洗浄
し、Ｌｅｕ−ＨＭＰ−ＰＥＧのα−アミノ基とＦｍｏｃ
−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）を縮合反応させた。縮合反応は、
樹脂に導入されたＣ末端アミノ酸に対して、２〜３当量
のＦｍｏｃアミノ酸、ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ（2(1-hydrox
ybenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetrametyluroniumhexa
fluorophosphate）、ＤＩＥＡをＮＭＰ（N-metylpyrorr
idone）中で攪拌しながら、２〜５時間反応させた。こ
のようにしてＣ末端から配列に従って順次縮合を行い、
ペプチド鎖を伸長させた。このようにＦｍｏｃ基の除去
とＦｍｏｃアミノ酸の縮合反応を繰り返すことにより、
保護ペプチド樹脂を得た。

【００２５】ペプチド鎖の脱保護及び樹脂からの切断
は、以下のように行った。縮合反応を終えた保護ペプチ
ド樹脂はＦｍｏｃ基を除去した後、ＴＦＡ処理によりペ
プチドから脱保護、樹脂の切断を行った。ＴＦＡ処理
は、氷冷下、保護ペプチド樹脂（５０〜３００ｍｇ）に
対してＴＦＡ（８．２５ｍｌ）、チオアニソール（０．
５０ｍｌ）、水（０．５０ｍｌ）、フェノール（０．５
６ｇ）、１，２−エタンジオール（０．２５ｍｌ）を加
え、室温で２時間反応させ、反応終了後、樹脂をろ別
し、ろ液中のＴＦＡを減圧濃縮した。次にジエチルエー
テルを加え、冷却下で約１時間静置してスカベンジャー
を除去し、粗ペプチドを５０％アセトニトリルで抽出し
凍結乾燥した。

【００２６】以上の方法により、固相担体には樹脂１ｇ
あたり０．２６ｍｍｏｌのＨＭＰ基を有するＨＭＰ−Ｐ
ＥＧ樹脂を用い、ＤＣＣ−ＤＭＡＰ法により［Ｓｅ
ｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）のＣ末端アミノ酸の誘導体
であるＦｍｏｃ−Ｌｅｕの導入を試みた。その結果、Ｆ
ｍｏｃアミノ酸が０．２０６ｍｍｏｌ／ｇ樹脂導入され
たＨＭＰ−ＰＥＧ樹脂を１．０ｇ得た。

【００２７】

【実施例２】化学合成［Ｓｅｒ⁸］−ｈＥＧＦ（１−３
５）の精製 粗ペプチドは、０．２Ｍ ＤＴＴ（dithiothreitol）お
よび６Ｍグアニジン塩酸塩中に溶解することにより、分
子内にジスルフィド結合を含まない還元型粗ペプチドに
した後、逆相高速液体クロマトグラフィー（reverse-ph
ase high performance liquid chromatography, RP-HPL
C）で精製を行った。カラムは、和光純薬工業製、ＷＡ
ＫＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲカラム（内径：１０ｍｍ、
長さ：３００ｍｍ）を使用した。溶媒はＡ液として０．
１％ＴＦＡ水溶液、Ｂ液として０．１％ＴＦＡ（triflu
oroacetic acid）アセトニトリルを利用し、Ｂ液の直線
的な濃度勾配をつけて目的のペプチドを溶出させた（流
速：５ｍｌ／ｍｉｎ、勾配：１％／ｍｉｎ、検出波長：
２１４ｎｍ）。得られたペプチドをＷＡＫＯＳＩＬ５Ｃ
１８（内径：４．６ｍｍ、長さ：２５０ｍｍ）を用い、
流速１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２１４ｎｍで精製ペプチ
ドの純度を検定した。また、６Ｍ塩酸中、微量の結晶フ
ェノール存在下で加水分解後、アミノ酸分析計（日立L-
8500 Amino Acid Analyzar）によりアミノ酸組成、ア
ミノ酸配列分析装置（島津製作所PPSQ-10）により一次
構造を決定した。

【００２８】以上のように、粗ペプチドは単一物質でな
かったため、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、還元型［Ｓ
ｅｒ²⁰］−ｈＥＧＦ（１３−４７）を得た。精製物をＲ
Ｐ−ＨＰＬＣで単一ピークであることを確認したうえ
で、アミノ酸分析、アミノ酸配列分析を行ったところ、
それぞれ目的とするものに一致した。以上のことより、
還元型［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）が目的どおり
に合成されていることが示唆された。収量はＴＦＡ処理
により、粗還元型［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）は
７５０ｍｇ得られた。その後、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて
精製することにより、還元型［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１
−３５）がそれぞれ６８ｍｇ得られた。

【００２９】精製した［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３
５）を還元、変性処理した後、酸化還元剤の存在下でリ
フォールディングさせた。２．０ｍｇの［Ｓｅｒ⁸］−
ＥＧＦ（１−３５）を２０ｍＭ ＤＴＴ（dithiothreit
ol）、６Ｍグアニジン塩酸塩を含んだ０．２ｍｌの０．
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解し
て９０分還元、変性処理し、アンフォールドした。還
元、変性処理をした［Ｓｅｒ⁸］−ｈＥＧＦ（１−３
５）溶液０．２ｍｌを［Ｓｅｒ⁸］−ｈＥＧＦ（１−３
５）の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるように酸化還元緩
衝液に希釈し、リフォールディングを開始させた（酸化
還元緩衝液：３０ｍＭ酸化型グルタチオン、１０ｍＭ還
元型グルタチオン／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．３））。各経過時間毎に反応溶液を少量分取
し、８８％蟻酸を加えてＳＨ−ＳＳ交換反応を止め、Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣで分取した。

【００３０】このピークを分取し、還元型［Ｓｅｒ²⁰］
−ｈＥＧＦ（１３−４７）６８ｍｇから最終酸化により
得られた酸化型［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）は、
２．３μｍｏｌ（９．３ｍｇ）であり、反応収率は１
３．７％であった。ＷＡＫＯＳＩＬ ５Ｃ１８（内径：
４．６ｍｍ、長さ：２５０ｍｍ）を用い、流速１ｍｌ／
ｍｉｎ、検出波長２１４ｎｍで最終に得られた精製ペプ
チドの純度を検定した。また質量分析の結果、このペプ
チドは、（Ｍ＋Ｈ）⁺＝４０６１．３を示し、この値は
酸化型［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）の理論値Ｍ／
Ｚ ４０６１．７とよく一致した。以上のことから酸化
型［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）が合成されたこと
を確認した。

【００３１】

【実施例３】組換え［Ｃｙｓ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）
のブレビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ３１での生
産 バチルス・ブレビスＨＰ９２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３
８２）が保有するプラスミドｐＨＴ９２６より調製した
プラスミドｐＨＴ１１０−ＥＧＦ（特開平６−１３３７
８２）をＡｐａＬＩとＰｓｔＩで切断後、０．８％アガ
ロース電気泳動を行い、３．３ｋｂのＤＮＡ断片を切り
出し、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ（Bio 101,USA）にて回収
した。［Ｃｙｓ⁸］−ｈＥＧＦ（１−３５）のアミノ酸
配列をコードする合成遺伝子である配列番号３のＤＮＡ
および配列番号４のＤＮＡを常法に従いアニーリング
し、上記３．３ｋｂの回収ＤＮＡ断片とＴ４リガーゼで
ライゲーションし、配列番号１の［Ｃｙｓ⁸］−ＥＧＦ
（１−３５）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を保有
するプラスミドｐＨＴ１１０−［Ｃｙｓ⁸］−ＥＧＦ
（１−３５）を得た。（なお、配列番号３にかえて配列
番号２（ｓ：ｃ）のＤＮＡを用いて同様に処理し、上記
プラスミドを得ることも可能であった。）

【００３２】得られたプラスミド中のタンパク質をコー
ドする塩基配列をダイデオキシ法（Sanger, F., Nickel
en, S.＆ Colusion, A. R., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA,74, 5493(1977)）によって決定し、目的どおりの塩
基配列であることを確認した。本プラスミドｐＨＴ１１
０−［Ｃｙｓ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）をブレビバチル
ス・チョーシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
０８７）にエレクトロポレーション法（ Takagi, H.,et
al., Agric. Biol. Chem., 53, 3099-3100(1989)）に
よって導入した。このプラスミドを保持するブレビバチ
ルス・チョーシネンシスＨＰＤ３１／ｐＨＴ−（ＦＥＲ
Ｍ−６８６２）を２ＳＬ培地（ペプトン４％、酵母エキ
ス０．５％、グルコース２％、ＭｇＳＯ₄ ０．０１
％、ＦｅＳＯ₄ ０．００１％、ＭｎＳＯ₄ ０．００１
％、ＺｎＳＯ₄ ０．０００１％、エリスロマイシン１
０μｇ／ｍｌ ｐＨ７．２）を３ｍｌ分注した試験管を
オートクレーブで１２０℃、１５分滅菌し、冷却後、こ
の１０本に植菌し、３０℃で３日間振とう培養を行っ
た。

【００３３】

【実施例４】組換え［Ｃｙｓ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）
の精製 実施例３で生産した目的ペプチドを含む培養液を遠心分
離し、上清液を回収し、さらに逆相高速液体クロマトグ
ラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製を行った。カラム
は、和光純薬工業製、ＷＡＫＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ
カラム（内径：１０ｍｍ、長さ：３００ｍｍ）を使用し
た。溶媒はＡ液として０．１％ＴＦＡ水溶液、Ｂ液とし
て０．１％ＴＦＡアセトニトリルを利用し、Ｂ液の直線
的な濃度勾配をつけて目的のペプチドを溶出させた（流
速：５ｍｌ／ｍｉｎ、勾配：１％／ｍｉｎ、検出波長：
２１４ｎｍ）。目的ペプチドのピークを含む画分を回収
し、凍結乾燥し、精製組換え［Ｃｙｓ⁸］−ＥＧＦ（１
−３５）を１５ｍｇ得た。

【００３４】

【実施例５】［Ｓｅｒ²⁰］−ＥＧＦ（１−３５）及びの
［Ｃｙｓ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）生物活性の測定 生物活性は、生細胞数を測定するＭＴＴ法を用いて、Ｈ
ｅｌａ細胞に対する増殖あるいは生存維持活性を指標と
した。ＨｅＬａ細胞は、２６０ｍｌフラスコ（８０ｃｍ
²）を用い、３７℃で５％ＣＯ₂存在下１０％の非働処理
したＦＣＳおよび硫酸ストレプトマイシン１００ｍｇ／
ｌ、ペニシリンＧ ５０，０００unit/l、ＮａＨＣＯ₃
０．７ｇ／ｌを含むＤＭＥＭ（増殖培地）１０ｍｌ中
で培養した。血清は非働処理（５６℃、３０ｍｉｎ）し
た牛胎児血清（ＦＣＳ）を使用し、基本培地に血清を１
０％加え増殖培地とした。細胞は４〜５×１０⁶個フラ
スコまで増殖させ、実験に供した。細胞の継代は増殖培
地を１０％トリプシンを含むＤＭＥＭ５ｍｌに置換、５
分間３７℃でインキュベートし細胞を剥離させ、この細
胞懸濁液に増殖培地５ｍｌを加えて１０００ｒｐｍで５
分間遠心し、沈殿した細胞を１×１０⁵個／ｍｌの密度
となるように増殖培地に懸濁、これを各フラスコあたり
１０ｍｌ播種し行った。

【００３５】ＭＴＴ法は、テトラゾリウム塩であるＭＴ
Ｔ（黄色）が生細胞中のミトコンドリア内のデヒドロゲ
ナーゼ酵素によってテトラゾリウム環が開裂し、青紫色
のフォルマザンを形成することから、生細胞数をフォル
マザンの吸光度として測定する方法である。ＨｅＬａ細
胞を２．５％トリプシン処理で離脱後、増殖培地で懸濁
し９６wellプレートに５，０００cells/wellの密度で９
０μｌずつまいた。３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間イン
キュベートした後培地を除去し、ＤＭＥＭ培地（無血
清）を１回洗浄後９０μｌ加え、２４時間培養した。こ
こに各サンプル１０μｌまたはネガティブコントロール
として滅菌水１０μｌ、またはポジティブコントロール
として５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地をそれぞれ１０μｌ加
え、３日間培養した。次に１０μｌのＭＴＴ溶液（１２
ｍＭ ＭＴＴ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ Ｎａ₂
ＨＰＯ₄、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．２５）
を加えさらに４時間インキュベートした。その後、培地
を除去しフォルマザン溶解液（２０％ ＳＤＳ、５０％
ＤＭＦ）を１００μｌ加え、翌日プレートリーダーに
より５５０ｎｍの吸光度を測定した。化学合成［Ｓｅｒ
⁸］−ＥＧＦ（１−３５）と組換え［Ｃｙｓ⁸］−ＥＧＦ
（１−３５）およびネイティブ型ｈＥＧＦの増殖活性に
ついてＭＴＴ法を用いて検討した（図１）。

【００３６】その結果、ネイティブ型ｈＥＧＦは、Ｈｅ
ｌａ細胞に対し濃度依存的に増殖を促進し、１０^-8Ｍで
最大増殖活性を示し、これ以上高い濃度では、逆に阻害
された（ＥＣ₅₀＝５．０×１０^-11Ｍ）。これに対し、
Ｃ末端６残基、Ｎ末端１２残基が削除された、化学合成
された新規［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧＦ（１−３５）および組
換体によって製造された新規［Ｃｙｓ⁸］−ＥＧＦ（１
−３５）はいずれも１０^-7で最大増殖活性を示し、これ
以上の濃度では逆に阻害され、ネイティブ型ｈＥＧＦに
対して約１０分の１の活性を示した（ＥＣ₅₀＝６．０×
１０^-10Ｍ）。

【００３７】

【発明の効果】本発明によって新規タンパク質が提供さ
れた。本タンパク質はｈ−ＥＧＦ様活性を有するが、ｈ
−ＥＧＦよりも低分子化されている点に特徴を有し、経
皮投与剤等医薬品の面で新しい分野への適用が期待され
る。

【００３８】本発明によれば、本タンパク質の製造方法
を新たに開発され、固相合成法による化学的合成法及び
遺伝子工学的手法による生化学的製造法が確立された。
また、後者において使用する本タンパク質をコードする
遺伝子のＤＮＡ配列も明らかにされた。

【００３９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Higeta Shoyu Co., Ltd. <120> Novel Protein, Gene Encoding thereof and Producing Method of the Novel Protein <130> 6188 <141> 1999-9-7 <160> 5 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 1 Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Xaa Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys 20 25 30 Gln Tyr Arg Asp Leu 35 <210> 2 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 gtgcactcgc acttactgtt gctccaatgg ctttcgcata ctgcctccat 50 gacggcgtgt ctatstatat tgaagcacta gacaaatacg catgcaactg 100 tgtagttggc tatattggtg aacgatgcca gtaccgagat ctgtaactgc 150 ag 152 <210> 3 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 3 tgcactcgca cttactgttg ctccaatggc tttcgcatac tgcctccatg 50 acggcgtgtc tatgtatatt gaagcactag acaaatacgc atgcaactgt 100 gtagttggct atattggtga acgatgccag taccgagatc tgtaactgca 150 <210> 4 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 4 gttacagatc tcggtactgg catcgttcac caatatagcc aactacacag 50 ttgcatgcgt atttgtctag tgcttcaata gacatagaca cgccgtcatg 100 gaggcagtat gcgaaagcca ttggagcaac agtaagtgcg agt 143 <210> 5 <211> 53 <212> PRT <213> Urine <400> 5 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu 1 5 10 15 His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg 35 40 45 Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg 50

【図面の簡単な説明】

【図１】天然型ｈＥＧＦ、化学合成［Ｓｅｒ⁸］−ＥＧ
Ｆ（１−３５）、組換え［Ｃｙｓ⁸］−ｈＥＧＦ（１−
３５）によるＨｅＬａ細胞における増殖活性の濃度応答
曲線（ＭＴＴ法）を示す。

【図２】本発明に係る新規タンパク質のアミノ酸配列を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 高木 広明 茨城県鹿島郡波崎町7707−８ (72)発明者 八代 好司 千葉県銚子市三軒町８−９ 第二玄蕃寮 203号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA05 DA07 EA04 GA14 GA19 HA01 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA01 DA08 4B065 AA16X AA16Y AB01 AC14 BA03 CA24 CA44 4H045 AA10 AA20 BA18 CA40 DA20 EA22 EA28 FA34 FA44 FA74 GA25

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示
   される新規タンパク質。
2. 【請求項２】 請求項１記載の新規タンパク質のアミノ
   酸配列をコードする、新規タンパク質遺伝子のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号２又は３の塩基配列で示され
   る、請求項２に記載の新規タンパク質遺伝子のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 固相合成法によることを特徴とする配列
   番号１のアミノ酸配列で示される新規タンパク質の製造
   法。
5. 【請求項５】 Merrifieldの固相合成法によること、を
   特徴とする請求項４に記載の新規タンパク質の製造法。
6. 【請求項６】 請求項１記載のアミノ酸配列をコードす
   る新規タンパク質遺伝子のＤＮＡを組み込んだ発現プラ
   スミドを保有するブレビバチルス属細菌を培養すること
   により、新規タンパク質を培養液中に生成、蓄積せし
   め、これを採取することを特徴とする新規タンパク質の
   製造法。
7. 【請求項７】 新規タンパク質遺伝子のＤＮＡが配列番
   号２又は３のＤＮＡであることを特徴とする請求項６に
   記載の新規タンパク質の製造法。
8. 【請求項８】 ブレビバチルス属細菌がブレビバチルス
   ・チョーシネンシスであることを特徴とする請求項６に
   記載の新規タンパク質の製造法。
9. 【請求項９】 Brevibacillus choshinensis HPD 31/pH
   T-EGF’(FERM BP-6862）。