JP2002516098A

JP2002516098A - 新規な骨誘導活性を有する単量体蛋白質およびそれらからなる骨・軟骨疾患の予防および治療薬

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Publication number: JP2002516098A
Application number: JP2000550995A
Authority: JP
Inventors: 伸治河合; 道夫木村; 祥文村木; 美枝子勝浦
Original assignee: ヘキスト・マリオン・ルセル
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2002-06-04
Anticipated expiration: 2019-05-14
Also published as: EP1078054B1; ATE346151T1; DE69934110T8; PT1078054E; EP1078054A1; WO1999061611A1; ES2272063T3; DE69934110T2; AU3530999A; US20060019886A1; US7638129B2; JPH11335398A; CY1105933T1; US7235241B2; DK1078054T3; JP4272357B2; DE69934110D1; US20080318856A1

Abstract

(57)【要約】軟骨・骨疾患の予防または治療に有効な単量体蛋白質を提供することを目的とする。上記目的は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質の二量体形成に係わるシステインを他のアミノ酸に置き換えたアミノ酸配列を有する単量体蛋白質によって達成される。この単量体蛋白質は相当する二量体蛋白質に比べて、骨芽細胞株に対し２倍の分化誘導活性を有する。置き換えられるべき他のアミノ酸としては、セリン、スレオニン、アラニン、バリンなどが挙げられ、特にアラニンが好ましい。上記蛋白質は、上記単量体を発現しうるＤＮＡ配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞を用いて製造される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】

(１) 発明の属する技術分野本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質の二量体形成に係わ
るシステインを他のアミノ酸に置き換えたアミノ酸配列を有する単量体蛋白質に
関する。また、本発明は上記単量体蛋白質を発現しうるＤＮＡ配列を含むプラス
ミドで形質転換した大腸菌を用いて上記蛋白質を大量かつ高純度で製造する方法
に関する。また、本発明は前記単量体蛋白質からなる軟骨・骨疾患の予防または
治療剤に関する。

【０００２】 (２) 従来の技術現在、骨疾患の予防ないし治療剤としては、エストロゲン、カルシトニン、ビ
タミンＤ３とその誘導体およびビスホスホン酸誘導体などが知られている。また
最近になってＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する骨誘導因子（Bone morphog
enetic protein：以降ＢＭＰと呼ぶ）でＢＭＰ−２からＢＭＰ−1４等の一連の
蛋白質に骨誘導の作用のあることが報告されている。

【０００３】さらにＧＤＦ−５あるいはヒトＭＰ５２と称される蛋白質に骨誘導の作用があ
ることが報告されている（WO 93／16099、WO 95／04819、WO 94／15949 および
Nature，vol.368, 1994, p.639-643)。成熟型ヒトＭＰ５２はＮ末端にアラニン
を有する１２０残基からなる蛋白質であると考えられており、そのアミノ酸配列
はこれらの特許出願に記載されている。

【０００４】これらの蛋白質は、天然には一個所ジスルヒド結合を有するホモダイマーとし
て存在する。また、それらの組み換え体蛋白質の製造に関してもそれらのホモダ
イマーあるいはヘテロダイマーで行われ活性をもった蛋白質が得られている。た
とえば、ヒトＭＰ５２に関しては特開平９−０３１０９８で報告されている。と
ころでＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体には２つの型が知られており、そ
れぞれＩ型受容体、II型受容体と呼ばれている。これら骨誘導因子（二量体）を
含むＴＧＦ−βスーパーファミリーの受容体を介しての細胞内シグナル伝達に関
してはこれらの因子がＩ型受容体とII型受容体の両方に同時に結合することが必
要であり、さらにはそれらが１組以上集まって多量体を形成し、細胞内シグナル
伝達が行われていると考えられており（Bone, vol.19, 1996, p.569-574)、この
多量体形成には因子が二量体であることが重要であろうと考えられているが、単
量体での活性は未だ確認されていない。さらに、これら単量体としての組み換え
体での製造は未だ行われていない。

【０００５】

【発明の要約】

本発明者らは、ヒトＭＰ５２単量体を大腸菌を使って遺伝子工学的手法により
大量に製造することを試みた。すなわちＭＰ５２単量体分子間のジスルヒド結合
に関与している配列表配列番号１のアミノ酸配列８３番のシステイン残基をアラ
ニンに換わるようにコドンを変換した１１９残基よりなる配列表配列番号１のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列のプラスミドを構築した。さらに、このプラ
スミドを導入した大腸菌を用いてヒトＭＰ５２単量体を大量発現させ、さらには
リフォールディングをおこない、配列表配列番号１の蛋白質を単量体として高純
度で極めて収率よく生産することを見出した。

【０００６】驚くべきことに、従来二量体としてのみ骨誘導活性を有すると考えられていた
にもかかわらず、この単量体は、いくつかの細胞株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、ＡＴＤ
Ｃ５）に対し骨細胞への分化誘導活性を有することが確認された。その分化誘導
活性はその二量体に比べ重量あたり２倍の分化誘導活性を示すことを確認し、本
発明を完成した。

【０００７】

【好適な実施態様の説明】

すなわち、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質の二量体
形成に係わるシステインを他のアミノ酸に置き換えたアミノ酸配列を有する単量
体蛋白質、これらの単量体蛋白質の製造方法、及びこれらの単量体蛋白質の一種
または二種以上を含有してなる軟骨・骨疾患の予防または治療用の医薬品組成物
に関する。

【０００８】本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質の二量体形成に係わ
るシステインを他のアミノ酸に置き換えたアミノ酸配列を有する単量体蛋白質に
関する。本発明におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーとはＢＭＰ−２、ＢＭＰ
−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、Ｂ
ＭＰ−1４、ヒトＭＰ５２、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７等がある。置
き換えられるべき他のアミノ酸は、アミノ酸側鎖の大きさを考慮してアラニン、
スレオニン、セリン、バリンからなる群から選ばれるアミノ酸であればどれでも
よい。最も好ましいアミノ酸はアラニンである。

【０００９】本発明は、配列表配列番号１記載のアミノ酸配列を有する単量体蛋白質に関す
る。詳細には、この単量体蛋白質は分子間にジスルヒド結合を有する二量体ヒト
ＭＰ５２の分子間ジスルヒド結合に関与するシステインをアラニンに置き換えた
蛋白質であり、配列表配列番号１のアミノ酸配列８３番目に示されている。本発
明で得られる単量体蛋白質はその二量体蛋白質より重量あたり２倍の分化誘導活
性を有する。

【００１０】また、本発明は、上記単量体蛋白質を発現しうるＤＮＡ配列を含むプラスミド
で形質転換した大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞を用いて発現させる製造
方法に関する。詳細には、本発明は、配列表配列番号２で示されるヒトＭＰ５２
由来の１１９残基の蛋白質を大腸菌を用いて産生する製造方法に関する。すなわ
ち、本発明は、配列表配列番号１で示されるヒトＭＰ５２由来の１１９残基のア
ミノ酸配列で８３番目のシステインをアラニンに換えた配列をコードするＤＮＡ
配列のＮ末端にメチオニンをコードするＤＮＡを含有するプラスミドの構築に関
する。ヒトＭＰ５２ｃＤＮＡは、ＷＯ９３／１６０９９記載のｃＤＮＡを含んだ
プラスミドベクターを鋳型ＤＮＡとして、成熟型部分のみをポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ法）を用いて増幅した。ここで用いるＰＣＲ法とは通常核酸ＤＮＡま
たはＲＮＡの微量断片を米国特許番号４,６８３,１９５に記載されている方法で
増殖することを意味する。

【００１１】本発明は、配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンを
さらに付加したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドを構
築し、そのプラスミドを大腸菌に形質転換し、その大腸菌を培養することよって
得られるインクルージョンボディを可溶化し、精製することによって変性単量体
蛋白質を得た。本発明はリホールディングにより活性を有する蛋白質を製造し、
さらに当該蛋白質を精製することによる配列表配列番号２の単量体蛋白質の製造
方法に関する。すなわち、本発明の単量体蛋白質は大腸菌インクルージョンボデ
ィーを可溶化した後 SP-Sepharose FF カラム（アマシャム・ファルマシア・バ
イオテク社）および Superdex 200 pg カラム（アマシャム・ファルマシア・バ
イオテク社）によりＭＰ５２変性単量体蛋白質を得た。それからリホールディン
グを行った後逆相ＨＰＬＣの RESOURCE RPC カラム（アマシャム・ファルマシア
・バイオテク社）を通すことにより精製された本単量体蛋白質を得る。得られた
本単量体蛋白質の物理化学的性質はＮ末端アミノ酸配列、アミノ酸組成および電
気泳動による分析で解析する。

【００１２】本発明の単量体蛋白質の生物学的活性は、すでにヒトＭＰ５２二量体において
アルカリフォスファターゼ活性を上昇させる効果がみいだされている２種類の骨
芽細胞株を用いてその分化誘導活性により評価した。本発明の単量体蛋白質は従
来の二量体蛋白質に比べ重量あたり２倍の活性を示した。

【００１３】また、本発明は、配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列を有効成分とする
軟骨・骨疾患の予防または治療剤に関する。詳細には、本発明の単量体蛋白質は
分化誘導活性すなわち軟骨・骨誘導活性を有すると考えられるため、骨粗鬆症、
先天性軟骨・骨疾患、変形性膝関節症・変形性股関節症等の変形性関節症または
、骨関節炎、半月損傷等の軟骨損傷、外傷・腫瘍摘出等による骨・軟骨欠損部の
再生、骨・軟骨欠損、骨折、軟骨形成不全症・軟骨発育不全症・軟骨無形成症・
口蓋裂・骨形成不全症等の先天性軟骨・骨疾患、さらには、歯根・歯槽の欠損等
の予防および治療剤に関する。

【００１４】さらに本発明の蛋白質は軟骨・骨誘導活性を有すると考えられるため美容外科
の骨移植の治療等に用いることが出来る。これらの治療には、獣医外科の領域も
含まれる。

【００１５】全身投与方法としては静脈内、筋肉内および腹腔内投与が可能であり、静脈内
投与の場合は通常の静脈内注射の他点滴静注が可能である。

【００１６】注射用製剤としては、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場合は
適当な水溶性賦形剤例えばマンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖
、フルクトース等の一種または二種以上を加えて水で溶解し、バイアルまたはア
ンプルに分注した後凍結乾燥し密封して製剤とすることができる。

【００１７】局所投与方法としてはその部位の軟骨・骨あるいは歯の表面をコラーゲンペー
スト、フィブリンのりまたは他の接着剤を用いて本蛋白質で覆う方法がある。こ
れらのうち骨移植に用いる骨は天然骨の他、従来用いられる人工骨にも利用でき
る。人工骨とは金属、セラミックス、ガラス等の天然素材または人工無機質素材
で出来た骨を意味する。人工無機質素材として好ましくはハイドロキシアパタイ
トがあげられる。例えば、人工骨の内部材料に金属そしてその外側の材料にハイ
ドロキシアパタイトを使用する。さらに、本蛋白質は骨再構築を促進するために
癌性骨組織にも投与出来る。また、軟骨移植にも利用可能である。

【００１８】投与量については、本蛋白質の作用に影響する様々な要因、たとえば、形成が
望まれる骨・軟骨の重量、骨・軟骨損傷の部位及びその状態、患者の年齢、性別
、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因を考慮して担当医が決定する。ま
た、用量は本蛋白質との再構成に用いる担体の種類によって変動し得る。一般的
に、投与量は、支持体との組成物として使用するとき、所望の骨・軟骨湿重量当
たり本単量体蛋白質として約１０〜１０⁶ナノグラム、注射剤として局所及び全
身性に適用するとき、患者１人当たり０.１〜１０⁴マイクログラムを一週間に一
度から一日に一度の頻度で投与することが好ましい。

【００１９】骨・軟骨再生に対して既知の成長因子例えばインスリン様成長因子Ｉ（insuli
n−like growth factor−I）等を同時適用することにより相乗効果が期待できる
。

【００２０】このようにＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質のシステインを置換
した単量体、および単量体としての工業的な規模での製造は未だ報告されておら
ず、軟骨・骨誘導活性を有する軟骨・骨疾患治療剤として有効である。さらに本
発明の単量体蛋白質はその２量体蛋白質に比べ重量あたりの活性が２倍あり、軟
骨・骨疾患治療剤の有効量を半分にすることができる。このことはＴＧＦ−βス
ーパーファミリーに属する前述の骨誘導因子の製造にも応用できる。

【００２１】配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するヒトＭＰ５２由来の単量体
蛋白質はその二量体に比べ骨芽細胞株に対し２倍の分化誘導活性を有し、軟骨・
骨疾患の予防または治療剤として有効である。さらに本発明の単量体蛋白質のア
ミノ酸の改変はシステインを減らすことから、大腸菌を用いた大量かつ純粋な単
量体蛋白質の製造を容易にする可能性がある。

【００２２】

【実施例】

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例
により限定されるものではない。

【００２３】実施例１単量体ヒトＭＰ５２発現ベクターの製作 (１) 変異型ヒトＭＰ５２成熟型部分の単離ヒトＭＰ５２の単量体は、二量体を形成すると考えれているシステイン残基を
別のアミノ酸残基に改変し、ヒトＭＰ５２単量体が二量体を形成しないようにし
て作製した。本発明では、ＷＯ９６／３３２１５の配列表配列番号１記載のプロ
リンから始まる成熟型ヒトＭＰ５２の８３番目のシステインのコドン（ＴＧＣ）
をアラニンのコドン（ＧＣＣ）に変換した。

【００２４】アミノ酸残基の置換は、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology (John
Wiley & Sons, Inc.）に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による変
異法（section 8.5）を参考にし、目的の変異が導入されたＰＣＲプライマー（
順方向）を用いることにより行なった。使用したＰＣＲプライマーの配列は、順
方向プライマーとして配列番号３および逆方向プライマーとして配列番号４に記
載した。

【００２５】ＰＣＲは、ＷＯ９６／３３２１５に記載されたヒトＭＰ５２発現ベクター（p
ＫＯＴ245）を鋳型ＤＮＡ（10ナノグラム）として、同じ試験管内で、順方向お
よび逆方向プライマーそれぞれ１０ピコモル、ｄＮＴＰ（0.4ミリモル）、ＭgＣ
l₂（2.5ミリモル）をＬＡＴaq ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ、寳酒造株式会社、
カタログ番号ＲＲ013Ａ）と共に加えることにより行なった。反応は、変性（９
４℃、１分間）、プライマーアニーリング（５５℃、１分間）、およびプライマ
ー伸長（７２℃、２分間）から成る各サイクルを３０サイクル行なった。ＰＣＲ
生成物は、制限酵素ＮcoＩとＨind IIIで消化後、１.５％低融点アガロース（FM
C BioProducts社、カタログ番号 5170Ｂ）中で電気泳動により分離し、目的の約
１７０塩基対から成るＤＮＡ断片を精製した。

【００２６】単量体ヒトＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ279）は、上記の手法で変異を導入
したＮcoＩ−Hind IIIのＤＮＡ断片を、ＷＯ９６／３３２１５に記載されたヒト
ＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ245）を改造したヒトＭＰ５２発現ベクター（p
ＫＯＴ277）のＮcoＩ−Ｈind III領域と交換することにより構築した。具体的に
は、ＷＯ９６／３３２１５に記載されたヒトＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ245
）のターミネーター下流に存在するＭＰ５２とは逆方向に転写されるlacＺプロ
モーターを除去したヒトＭＰ５２発現ベクター（pＫＯＴ277）を構築し、このＭ
Ｐ５２発現ベクター（pＫＯＴ277）を制限酵素ＮcoＩとＨind IIIで消化後、１.
５％低融点アガロース（FMC BioProducts社、カタログ番号 5170Ｂ）中で電気泳
動により分離し、目的の２７１７塩基対から成るＤＮＡ断片を精製した。このＤ
ＮＡ断片と変異を導入した約１７０塩基対のＤＮＡ断片をＤＮＡＬigation Ｋi
t（寳酒造株式会社、カタログ番号 6021）を用いて連結させ、単量体ＭＰ５２発
現ベクターを構築（pＫＯＴ279、2.9kb）し、日本国茨城県つくば市東１丁目１
−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９８年２月５日に寄
託し（受託番号 FERM P−16625)、その後１９９９年２月３日に原寄託よりブダ
ペスト条約に基づく国際寄託への移管をした（受託番号 FERM BP−6637）。その
後作製した本発明の単量体ヒトＭＰ５２発現ベクターの塩基配列は、ＤＮＡシー
クエンサー（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社、ＡＬＦ）を用いて、目
的の変異が導入されていることと生産されるヒトＭＰ５２の塩基配列（変異を導
入した場所以外の配列）に誤りがないことを確認した。

【００２７】 (２) 形質転換形質転換は、Ｋushnerらの塩化ルビジウム法（Genetic Engineering, p.17, E
lsevier (1978)）に従った。即ち、ｐＫＯＴ２７９を宿主大腸菌Ｗ３１１０Ｍへ
上記の手法に従い移入し、本発明の蛋白質発現大腸菌とした。

【００２８】実施例２培養 (１) 培養本発明の蛋白質発現大腸菌を改変ＳＯＣ培地（Bacto tryptone 20ｇ／L, Bact
o yeast extract ５ｇ／L, NaCl 0.5ｇ／L, MgCl₂ 0.95ｇ／L, Glucose 3.6ｇ／
L）で前培養し、生産用培地（Bacto tryptone 20ｇ／L, Citric acid 4.3ｇ／L,
K₂HPO₄ 4.675ｇ／L, KH₂PO₄ 1.275ｇ／L, NaCl 0.865ｇ／L, FeSO₄・7H₂O 100mg
／L, CuSO₄・5H₂O １mg／L, MnSO₄・nH₂O 0.5mg／L, CaCl₂・2H₂O ２mg／L, Na₂B₄O ₇・ 10H₂O 0.225mg／L, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1mg／L, ZnSO₄・7H₂O 2.25mg／L, CoCl₂・6
H₂O ６mg／L, MgSO₄・7H₂O 2.2ｇ／L, Thiamine HCl 5.0mg／L, Methionine ２ｇ
／L, Glucose ３ｇ／L）５Ｌに対し菌体懸濁液を１００mL添加し、１０Ｌの培養
槽で通気攪拌しながら培養し、対数増殖前期（ＯＤ₅₅₀＝５０）に達した段階で
１mＭの濃度でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さら
にＯＤ₅₅₀が１５０を超えるまで培養した。培養中、温度は３１℃、ｐＨはアン
モニアを添加することにより７.２に制御し、溶存酸素濃度の低下を防ぐために
攪拌速度をあげることにより空気飽和の５０％に溶存酸素濃度を制御した。また
、培養中は高菌体濃度とするために、溶存酸素濃度の急激な上昇を指標として、
０.１Ｍリン酸を含む５０％グルコース溶液をグルコース濃度が０.２％になるよ
うに添加した。

【００２９】 (２) 大腸菌封入体の調製上記方法により得られた培養液を高圧ホモジナイザー（LAB40−10RBFI, APV・
ゴーリン社）に５６０barで３回通すことにより菌体を破砕し、遠心して封入体
を含む沈殿を回収した。

【００３０】実施例３精製 (１) 大腸菌封入体の可溶化回収した封入体を１Ｍ尿素と５mＭＥＤＴＡを含む２０mＭＴris−ＨＣl緩衝
液（pH 8.3）で２回洗浄後、３０００×ｇで３０分間、４℃で遠心し、得られた
沈殿を８Ｍ尿素、５０mＭＮaＣl、６４mＭＤＴＴ及び５mＭＥＤＴＡを含む２
０mＭＴris−ＨＣl緩衝液（pH 8.3）で超音波をかけながら可溶化した。

【００３１】 (２) 変性単量体蛋白質の精製その可溶化液を２００００×ｇで３０分間、４℃で遠心し、その上清を回収し
た。得られた上清を２０mＭＴris−ＨＣl緩衝液（pH 8.3）、６Ｍ尿素、１０m
ＭＤＴＴ、１mＭＥＤＴＡで平衡化した SP-Sepharose FF（アマシャム・ファ
ルマシア・バイオテク社）に通し、同溶液で洗浄後、０.４Ｍ食塩を含む同溶液
で溶出させた。溶出液を２０mＭＴris−ＨＣl緩衝液、ｐＨ８.３、６Ｍ尿素、
０.５Ｍ食塩、１mＭＥＤＴＡ、１０mＭＤＴＴで平衡化した Superdex 200 pg
（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）でゲル濾過を行い、単一な変性単
量体蛋白質を得た。

【００３２】 (３) リホールディング上記で得られた変性単量体蛋白質の溶液に９倍量の５０mＭＮa−Ｇlycine緩
衝液（pH 9.8）、０.５Ｍ食塩、２０mＭＣＨＡＰＳ、３mＭＧＳＳＧ（酸化型
グルタチオン）を加えた後撹拌し２０時間、４℃でリホールディングを行った。

【００３３】 (４) 活性をもつ単量体蛋白質の精製リホールディングされた試料を１４mＭＮaＨ₂ＰＯ₄で２.８倍希釈し、等電点
沈殿を行った。沈殿を３０００×ｇ２０分の遠心で集めた後、０.０５％ＴＦＡ
に溶解した。その溶液を０.０５％ＴＦＡで平衡化しておいた逆相ＨＰＬＣの RE
SOURCE RPC カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）に通し、０.０
５％ＴＦＡ、０〜５０％アセトニトリルグラジェントにより溶出した。溶出液は
吸光光度計を用い２８０nmの吸光度によりモニターし、精製された本発明の単量
体蛋白質画分を得た。これに５ＮのＮaＯＨをｐＨ６.５から７.５の間になるよ
うに加え等電点沈殿をおこなった。沈殿を１０,０００×ｇ１０時間の遠心で集
めた後、２０mＭ塩酸で約３mg／mLになるように溶解させ本発明の活性をもつ単
量体蛋白質を得た。

【００３４】 (ｉ) Ｎ末端配列の分析上記で得られた生成された本発明の単量体蛋白質のアミノ酸組成のＮ末端配列
をシークエンサー（アプライド・バイオシステム社、モデル 476Ａ）により調べ
た。 (ii) アミノ酸組成分析上記で得られた精製された本発明の単量体蛋白質のアミノ酸組成をアミノ酸分
析機（ウオーターズ社、PICO. TAG. WORK STATION）により調べた。 (iii) 電気泳動による分析上記で得られた精製された本発明の単量体蛋白質の分子量を非還元条件下のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ、約１４ＫＤaの分子量を示した。上記(ｉ)、(ii)および(iii)に示された結果より、本発明の単量体蛋白質はＮ
末端が単一に配列表配列番号２で示すＰｒｏから始まる１１９残基からなる単量
体蛋白質であることが解った。

【００３５】実施例４生物学的活性の測定マウス胚細胞由来の軟骨細胞様に分化するＡＴＤＣ５（RIKEN GENE BANK，RCB
0565）と、マウス由来の骨芽細胞様性格を持つＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（RIKEN GENE B
ANK，RCB1126）の２種類の培養細胞株を用いた、上記蛋白質のアルカリフォスフ
ァターゼ亢進活性を指標として、その分化誘導活性として評価した。結果を図２
に示す。

【００３６】ＡＴＤＣ５は５％牛胎児血清を含むＤＦ培地（Gibco社）に、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ
１は１０％牛胎児血清を含むＭＥＭ−α^-培地（Gibco社）に１mLあたり１万個の
濃度で懸濁し、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１mLずつ撒き、５％ＣＯ₂
、３７℃にて３日間培養した。

【００３７】その後、血清未添加のＭＥＭ−α^-培地で細胞をリンスし、０.３％牛アルブミ
ンを含むＭＥＭ−α^-培地にて段階希釈した天然型２量体または単量体蛋白質を
１ウェルあたり０.５mL加え、分化誘導を開始した。３日間培養を行った後、細
胞をＰＢＳ（20mMリン酸緩衝液、150mM NaCl、pH 7.4）で２回洗い、２５０μL
の細胞溶解液（0.2％ NP−40, １mM MgCl₂）を加え２時間３７℃に置いた。その
後、破砕された細胞を含む細胞溶解液全量をマイクロチューブに移し遠心（10,0
00回転、５分間）後の上清をアッセイに用いた。

【００３８】酵素活性の測定は０.１Ｍ glycine buffer、ｐＨ１０.４、１mＭＺuＣl₂、１
mＭＭgＣl₂中に溶解した終濃度１０mＭの p-nitrophenyl phosphate を基質と
して、その分解生成物である p-nitrophenol（pＮp）の４０５nmにおける吸光度
の上昇をみることで行った。吸光度の上昇を２分ごとに４０分間モニターし直線性のみられる範囲のデータ
からアルカリフォスファターゼ活性（μmol pＮp／min）を算出した。また、同じ上清について BCA protein assay kit（アマシャム・ファルマシア
・バイオテク社）を用いて蛋白濃度を求め、蛋白質あたりのアルカリフォスファ
ターゼ活性をμmol pＮp／min／mg protein として表記した。

【００３９】

【配列表フリーテキスト】

<210> １ <223> ＷＯ９５／０４８１９の配列番号１の１番から８２番および８４番から１
１９番のアミノ酸残基に関連する。注：８３番目のアミノ酸残基はシステインがアラニンに変換されている。 <210> ３ <223> 変異導入用順方向ＰＣＲプライマー <210> ４ <223> 変異導入用逆方向ＰＣＲプライマー

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１(２)で得られた本発明の蛋白質の発現ベクター（ｐＫＯＴ２７９）の
プラスミドマップである。

【図２】実施例４で得られた本発明単量体蛋白質とヒトＭＰ５２二量体の骨芽細胞分化
誘導活性を比較したグラフである。(Ａ)はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における活性を
、(Ｂ)はＡＴＤＣ５における活性を示す。白丸は本発明の単量体蛋白質の活性を
、黒丸はヒトＭＰ５２二量体の活性をそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/08 Ａ６１Ｐ 43/00 １０７ 19/10 Ｃ０７Ｋ 14/51 43/00 １０１Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１０７Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ０７Ｋ 14/51 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者勝浦美枝子東京都東村山市栄町２−14−２−106 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA06 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG13 CA02 CA19 CC24 DA01 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA44 CA35 CA53 CA56 DB60 NA14 ZA672 ZA962 ZA972 ZB112 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA30 EA20 FA74 GA06 GA10 GA22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白質の二量体形成
に係わるシステインを他のアミノ酸に置き換えたアミノ酸配列を有する単量体蛋
白質。
【請求項２】他のアミノ酸がセリン、スレオニン、アラニン、バリンから
なる群から選ばれるアミノ酸である請求項１記載の単量体蛋白質。
【請求項３】他のアミノ酸がアラニンである請求項１または２記載の単量
体蛋白質。
【請求項４】配列表配列番号２記載のアミノ酸配列を有する単量体蛋白質
。
【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載の単量体蛋白質を発現しうる
ＤＮＡ配列を含むプラスミドで形質転換した大腸菌、酵母、昆虫細胞または哺乳
動物細胞を用いて発現させる請求項１記載の単量体蛋白質の製造方法。
【請求項６】請求項１〜４のいずれかに記載の単量体蛋白質を有効成分と
する軟骨・骨疾患の予防または治療剤。
【請求項７】軟骨・骨疾患が骨粗鬆症である請求項６記載の軟骨・骨疾患
の予防または治療剤。
【請求項８】軟骨・骨疾患が変形性関節症または骨関節炎である請求項６
記載の軟骨・骨疾患の予防または治療剤。
【請求項９】軟骨・骨疾患が骨折である請求項６記載の軟骨・骨疾患の予
防または治療剤。
【請求項１０】軟骨・骨疾患が歯根・歯槽の欠損である請求項６記載の軟
骨・骨疾患の予防または治療剤。