FI118736B - Luun morfogeneettinen proteiini - Google Patents

Luun morfogeneettinen proteiini Download PDF

Info

Publication number
FI118736B
FI118736B FI20055256A FI20055256A FI118736B FI 118736 B FI118736 B FI 118736B FI 20055256 A FI20055256 A FI 20055256A FI 20055256 A FI20055256 A FI 20055256A FI 118736 B FI118736 B FI 118736B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
bmp
bone
morphogenetic protein
bone morphogenetic
reindeer
Prior art date
Application number
FI20055256A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20055256L (fi
FI20055256A0 (fi
Inventor
Elli Birr
Mari Ulmanen
Oili Hietala
Marja Juustila
Heli Korkala
Pekka Jalovaara
Original Assignee
Bbs Bioactive Bone Substitutes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bbs Bioactive Bone Substitutes filed Critical Bbs Bioactive Bone Substitutes
Publication of FI20055256A0 publication Critical patent/FI20055256A0/fi
Priority to FI20055256A priority Critical patent/FI118736B/fi
Priority to US11/921,069 priority patent/US7910552B2/en
Priority to PCT/FI2006/050214 priority patent/WO2006125868A1/en
Priority to US11/921,104 priority patent/US7851435B2/en
Priority to EP06743556A priority patent/EP1885751B1/en
Priority to EP06725969.7A priority patent/EP1885749B1/en
Priority to AT06743556T priority patent/ATE533781T1/de
Priority to ES06725969.7T priority patent/ES2642591T3/es
Priority to PCT/FI2006/050212 priority patent/WO2006125866A1/en
Publication of FI20055256L publication Critical patent/FI20055256L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118736B publication Critical patent/FI118736B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

118736
Luun morfogeneettinen proteiini Keksinnön alue 5 Tämä keksintö liittyy luun muodostusta indusoiviin proteiineihin, joita kutsutaan luun morfogeneettisiksi proteiineiksi (BMP), varsinkin BMP-3c-proteiiniin, nukleiini-happomolekyyleihin, jotka koodaavat mainittuja proteiineja, vektoreihin, jotka sisältävät mainittuja nukleiinihappomolekyylejä sekä isäntäsoluihin, jotka ekspressoivat mainittua proteiinia. Tämä keksintö liittyy myös näiden luun morfogeneettisten pro-10 teiinien käyttöön hoidettaessa häiriöitä, kuten häiriöitä, jotka liittyvät luun ja ruston muodostukseen. Tämä keksintö lisäksi liittyy osteogeenisiin välineisiin ja farmaseuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät kyseisiä proteiineja.
Keksinnön tausta 15
Lancroix havaitsi vuonna 1945 luun muodostukseen liittyvän ilmiön, kun hän osoitti, että hapan alkoholi-luuekstrakti indusoi heterotrooppisen luun muodostuksen ektooppisissa paikoissa. Kaksikymmentä vuotta myöhemmin Urist työtovereineen dekalsifioi luumatriksin, ja kun tätä implantoitiin lihakseen, hän huomasi implan-20 tointikohtaan muodostuvan uutta rustoa ja luuta. Nämä havainnot johtivat luuta indusoivan aineen, joka nimettiin BMP.ksi, eristämiseen ja puhdistamiseen eri eläinlajien luumatriksista ja vuosia myöhemmin näiden uusien proteiinien cDNA:n kloonaukseen ja karakterisointiin. BMP:n biologista aktiivisuutta on määritetty bio- : analyysillä, joissa BMP implantoidaan rotan tai hiiren lihastaskuun, tai nisäkässo- ·»· : 25 luviljelmissä, joissa mitataan alkaalista fosfataasia (ALP).
• ·· · • · • * · • ·· .* Aikaisemmat tutkimukset vuodesta 1965 alkaen ovat osoittaneet, että BMP:t kuu- • · · :*Y luvat TGF-p-superperheeseen, ja kuten muillakin tämän geeniperheen jäsenillä, φ * · : niillä on moninaisia vaikutuksia solun liikkuvuuteen, kasvuun ja erilaistumiseen :···* 30 varsinkin luun muodostuksen ja kudosten korjausprosessien aikana, mutta myös embryogeneesiin ja syöpiin. Ne ovat molekyylikooltaan pieniä, hydrofobisia glyko- *· • *· proteiineja, jotka liukenevat kaotrooppisiin aineisiin, kuten ureaan ja guanidiinihyd- rokloridiin, mutta ovat resistenttejä useiden proteaasien, kuten kollagenaasien, .···. vaikutukselle.
• · t 35 • · '*:** BMP:t tuotetaan suurina prekursorimolekyyleinä, jotka prosessoidaan proteolyytti- sesti kypsiksi peptideiksi translaation jälkeen. Kuten muutkin TGF-p-superperheen ·:·*: jäsenet, BMP:t sisältävät seitsemän kysteiinitähteen jonon kypsässä C- 2 118736 terminaalisessa osassa. Kypsissä BMP-monomeereissä näiden kysteiinien välissä on kolme disulfidisidosta ja yksi disulfidisidos, joka yhdistää kaksi monomeeriä, jolloin syntyy biologisesti aktiivinen dimeeri.
5 BMP:n vaikutus välittyy kohdesolujen solukalvolla sijaitsevien spesifisten resepto-reiden kautta. BMP-reseptorit ovat seriini-treoniini-kinaaseja, jotka ovat samankaltaisia TGF-p-reseptoreiden kanssa ja ne jaetaan kahteen alaryhmään: tyypin I ja tyypin II reseptoreihin. BMP.t kykenevät sitoutumaan tiukasti ainoastaan sellaiseen reseptoriin, joka muodostaa heterotetrameerisen kompleksin. Tällaisen kompleksin 10 muodostuminen on edellytys sille, että tapahtuu BMP:n signaalin siirtyminen (signal transduction). Kohdesolun sisällä BMP-signaalit siirretään tumaan käyttäen spesifisiä signaalin siirtoon erikoistuneita molekyylejä nimeltään Smadit, jotka kykenevät myös vaimentamaan BMP-signaaleja.
15 Tähän mennessä on karakterisoitu 16 erilaista BMP-molekyyliä, joista seitsemän (BMP:t 2-7 ja 9) on osoitettu kykenevän indusoimaan luun muodostuksen, kun ne on implantoitu ektooppisiin kohtiin. Kypsän osan aminohapposekvenssin perusteella BMP:t jaetaan kahteen alaryhmään. BMP:t 2 ja 4 ovat 86 % identtisiä keskenään ja BMP:t 5, 6 ja 7 ovat 78 % identtisiä. Näiden kahden alaryhmän välinen identti-20 syys on vain noin 56 %. BMP-3:n aminohapposekvenssi on noin 45 % samankaltainen kuin BMP-2:n ja BMP-4:n sekvenssi ja BMP-9 on 50-55 % identtinen . BMP:iden 2, 4, 5, 6 ja 7 kanssa. Johtuen suuresta homologiasta ja vähäisestä : !·. eroavuudesta molekyylien koossa, BMPiiden erottaminen toisistaan, puhdistami- ♦ · · *·] j nen ja identifioiminen proteiinitasolla on melko vaikeaa, hyvin aikaa vievää ja kallis- * «« / 25 ta. Tästä syystä nykyään useimmat BMP:t tuotetaan käyttäen hyväksi molekyyli- ;*V biologian menetelmiä. Erilaisia rekombinanttiproteiinitekniikoita on kokeiltu ja sekä • * * eukaryootti- että prokaryoottisysteemejä on käytetty.
• · • · φ · ·
Suurin osa tutkimuksesta on kohdistunut ihmisen rekombinantti-BMP:hen, mutta 30 mielenkiintoisen tutkimusalueen muodostaa myös Cervidae-heimo, koska niissä tapahtuu tehokas luun induktio sarvissa. Sarvet ovat luuta sisältäviä kallon raken-. nelmia, jotka ovat tyypillisiä Ce/v/dae-heimolle ja jotka eroavat Bovidaen sarvista kasvutapansa vuoksi. Sarvet kasvavat sarven kärjestä, ja urokset pudottavat ne *·:*’ kerran vuodessa. On väitetty, että sarvet ovat nisäkkäiden keskuudessa nopeim- :V: 35 min kasvavat rakennelmat, ja näiden rakenteiden tiedetään olevan ainoita, jotka ·:··: uusiutuvat täydellisesti joka vuosi. Sarvien muodostuessa tapahtuu tietynlainen endokondraalinen ossifikaatio, jossa prosessi etenee runsaan verisuoniston omaavan ruston kautta, joka kalsifioituessaan muodostuu lopulta luuksi. Sarvet muodos- 3 118736 tavat mielenkiintoisen mallin mineralisoituvan kudoksen regeneraatiosta täysikasvuisessa eläimessä, ja luun uusiutuminen jatkuu siihen saakka kunnes sarvet pudotetaan. Vaikka sarvien hämmästyttävän kasvunopeuden perimmäistä syytä ei ole selvitetty, sarvissa tiedetään olevan useita BMP-proteiineja. Hirvieläimen sarvi-5 en on osoitettu tuottavan BMP-2:ta ja BMP-4:ää (Feng et ai. 1997 Biochim Biophys Acta 1350:47-52; Feng et ai. 1995 Biochim Biophys Acta 1263:163-168). Lisäksi poron sarvissa ekspressoidaan BMP-3b-proteiinia (Kapanen et ai. 2002 J Biomed Mat Res 59:78-83). Kuitenkin on myös mahdollista, että sarvissa on yksi tai useampi tuntematon tekijä, joka saa aikaan sarven nopean kasvun.
10
Osteoinduktiivisen ominaisuutensa vuoksi sekä BMP:t, jotka on uutettu deminerali-soidusta luumatriksista, että BMP:t, jotka on tuotettu käyttäen rekombinanttitekniik-kaa, ovat hyvin mielenkiintoisia ja erittäin potentiaalisia vaihtoehtoja luusiirrännäi-sille. Erilaisia BMP-proteiineja on käytetty useissa kokeellisissa ja kliinisissä tutki-15 muksissa.
BMP-3 ja 3b ovat tärkeitä luun induktion ja osteogeneesin säätelymolekyylejä.
BMP-3:n on osoitettu olevan tärkeä komponentti osteogeniinissä, jolla on osteo- geneettistä aktiivisuutta, mutta kuitenkin yhä vielä esiintyy ristiriitaista tietoa ihmi- 20 sen rekombinatti-BMP-3:n biologisen aktiivisuuden suhteen. Joidenkin tutkimusten mukaan sillä on osteogeneettistä aktiivisuutta, mutta jotkut tutkimukset väittävät täysin päinvastaista, jolloin sillä on osoitettu olevan inhibitorinen tehtävä luun : !·. muodostusprosessissa sen ollessa negatiivinen tekijä luun tiheyden säätelyssä.
• · · | Esimerkiksi WO 02/43759 tuo esiin menetelmiä ja koostumuksia vikojen ja tautien, .* / 25 kuten osteoporoosi tai osteopeeniset tautitilat, hoitamiseen. Kyseessä olevassa i*V menetelmässä levitetään osteoporoottiseen tai osteopeeniseen tilaan koostumus- • * · ta, joka käsittää BMP-3-inhibiittoria tai -antagonistia.
* * • * «·· Tähän mennessä BMP-3b on ainoa BMP, joka on karakterisoitu poron sarvikudok- *.·*? 30 sesta (Kapanen et ai. 2002).
• · · • · • » • · · . US 6245889 esittää puhdistetut BMP-2- ja BMP-4-proteiinit ja niiden tuottomene- *:i.: telmät. Myös mainittua BMP-4:ää sisältävä farmaseuttinen koostumus on kuvattu.
• · **:*' Kuten yleisesti alalla tunnetaan, näitä proteiineja ja koostumuksia voidaan käyttää : V: 35 luu- ja rustodefektien hoidossa sekä haavojen parantamisissa ja samankaltaisten *:*·· muiden kudosvaurioiden korjauksessa. Lisäksi edellä esitetty farmaseuttinen koos tumus voi sisältää matriksin, joka kykenee luovuttamaan mainitun BMP-proteiinin luun ja/tai ruston vauriokohtaan tarjoten rakenteen kehittyvälle luulle ja rustolle ja 4 118736 joka myös kyetään optimaalisesti resorboimaan kehoon. Tällaiset matriksit voidaan muodostaa materiaaleista, jotka ovat tällä hetkellä jo käytössä muissa lääketieteellisissä implanttisovelluksissa.
5 US 5399677 esittää DNA-molekyylejä, jotka koodaavat luun morfogeneettisten proteiinien mutanttimuotoja. BMP:n mutanttimuotoja voidaan tuottaa bakteereissa ja laskostaa biologisesti aktiiviseen muotoon joko BMP:n homodimeeriksi tai hete-rodimeeriksi. Menetelmä, jolla kyseinen mutantti BMP tehdään, on myös esitetty. Kyseiset mutanttimuodot ovat hyödyllisiä, koska bakteeri-isännässä tuotettuna ne 10 ovat laskostuneet virheettömästi.
WO 98/51354 esittää osteogeenisiä välineitä ja niiden käyttömenetelmiä luu- ja rustovikojen korjaamiseksi. Menetelmä uuden luun kasvattamiseksi vaurioituneeseen luun kohtaan nisäkkäällä sisältää vaiheen, jossa kalsiumfosfaattimatriksi, joka 15 sisältää ainakin yhtä osteogeenistä proteiinia, implantoidaan vauriokohtaan. Kyseiset osteogeeniset proteiinit käsittävät useita morfogeenejä, kuten luun morfoge-neettisiä proteiineja.
EP 1131087 esittää morfogeneettisten proteiinien, kuten BMP:n, lisäkäytön. On 20 osoitettu, että syöpäsolujen joutuminen kosketuksiin morfogeenien kanssa inhiboi syöpäsolujen kasvua ja saa aikaan niiden erilaistumisen pois syöpäsolun fenotyy-. .·. pistä. Morfogeenien käyttö voi vaikuttaa syöpäsolujen solukohtaloon ja osaltaan lieventää syövän oireita.
• · · • · · * · * · · / / 25 Vaikka joidenkin BMP-proteiinien käyttösovelluksia luun ja ruston muodostuksen • · · indusoijina, samoin kuin syövän oireiden lievittämisessä, tunnetaan, tarvetta on :·:: kuitenkin saada vieläkin parempia menetelmiä näiden proteiinien eristämiseksi ja • ·· varsinkin parempien morfogeneettisten proteiinien saamiseksi, esimerkiksi sellaisten, jotka toimivat tehokkaammin luun indusoijina tai ovat liukoisempia kuin aikai-: 30 semmin. Sellaisilla proteiineilla olisi käyttöä paremmissa terapeuttisissa menetel- missä ja sovelluksissa.
• ·· • · • · · :;j.: Keksinnön yhteenveto • · • · • ·· : Y: 35 Yllättäen tämän keksinnön uusi BMP-3-tyypin proteiini, jota tästä lähtien kutsutaan ·:··· nimellä BMP-3c, löydettiin porosta. Vaikka sillä on suuri homologia sekvenssin suhteen verrattuna muihin jo tunnettuihin BMP-3-proteiineihin, BMP-3c:llä on erittäin hyödyllisiä ominaisuuksia, jotka liittyvät luun ja ruston muodostukseen. Kysei- 5 118736 set ominaisuudet ovat huomattavasti parempia kuin jo tunnetuilla BMP-proteiineilla. Kyseiset, tämän keksinnön luun morfogeneettiset proteiinit ja niiden homologit ovat hyödyllisiä luun ja ruston indusoijina useanlaisissa sovelluksissa, kuten terapeuttisissa sovelluksissa.
5 Tämän keksinnön poron BMP-3c-proteiini on 95 % homologinen jo tunnetun poron BMP-3b-proteiinin kanssa ja 93 % homologinen ihmisen BMP-3b:n kanssa. Koska porolla jo tunnettiin BMP-3b, tämän keksinnön uusi proteiini nimettiin BMP-3c:ksi.
10 Tämän keksinnön yksi näkökohta liittyy eristettyyn morfogeneettiseen proteiiniin, jota sisältää BMP-3c-proteiinin konsensussekvenssin.
Toinen tämän keksinnön näkökohta liittyy eristettyyn DNA-molekyyliin, joka koo-daa kyseessä olevaa morfogeneettistä proteiinia.
15
Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy nukleiinihappovektoriin, joka sisältää kyseisen eristetyn DNA-molekyylin.
Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy rekombinantti-isäntäsoluun, 20 joka sisältää kyseisen DNA-molekyylin tai edellä mainitun nukleiinihappovektorin.
Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy luun morfogeneettiseen proteiiniin, jota on tuotettu kasvattamalla kyseistä isäntäsolua siten, että se ekspressoi : mainittua luun morfogeneettistä proteiinia ja mainittu luun morfogeneettinen prote- ·«· : 25 iini on otettu talteen mainitusta isäntäsolusta.
• * ·
··· I
• · I
• · ·
Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy rekombinantti-isäntäsoluun, • · · J*Y joka ekspressoi mainittua luun morfogeneettistä proteiinia.
• ·
• · · I
• · • · *···* 30 Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy farmaseuttiseen koostumuk seen, joka sisältää mainitun luun morfogeneettisen proteiinin.
• · • · • ·« •
Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy mainittuun, eristettyyn luun morfogeneettiseen proteiiniin käytettäväksi lääkeaineena.
• · · 35 • * **:** Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy mainitun, eristetyn luun morfo- geneettisen proteiinin käyttöön valmistettaessa lääkeainetta, jota voidaan käyttää • * 6 118736 luuhun ja rustoon liittyviin häiriöihin, joissa regeneraatio, vaurion korjaaminen tai kasvu on toivottavaa, tai muihin tauteihin, kuten syöpiin.
Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy osteogeeniseen välineeseen, 5 jolla hoidetaan mainittuja häiriöitä, joka väline sisältää kyseisen luun morfogeneet-tisen proteiinin.
Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy menetelmään, jolla ruston ja/tai luun muodostusta indusoidaan käsittelemällä mainittua rustoa ja/tai luuta 10 mainitulla eristetyllä luun morfogeneettisellä proteiinilla.
Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy menetelmään, jolla hoidetaan kyseisiä luuhun ja rustoon liittyviä häiriöitä, joissa regeneraatio, vaurion korjaaminen tai kasvu on toivottavaa, tai muita sairauksia, kuten syöpiä, antamalla mainit-15 tua eristettyä luun morfogeneettistä proteiinia potilaalle, joka kärsii mainitusta häiriöstä.
Kuvien lyhyt yhteenveto 20 Kuva 1 esittää plasmideja, jotka sisältävät rdBMP-3c-insertit PCR-vektorissa pGEM-T® (Promega).
Kuva 2 esittää plasmideja, jotka sisältävät rdBMP-3c-insertit ekspressiovek- . torissa pTrcHis2A (Invitrogen).
·· : .·. 25 « « · I Kuva 3 esittää plasmideja, jotka sisältävät rdBMP-3c-insertit ekspressiovek- !V torissa pET-22b(+) (Novagen).
• ♦ * ··« · • · * · · •*|4* Kuva 4 esittää pTrcrd3c:stä ekspressoidun poron BMP-3c-proteiinin kypsän :···: 30 osan aminohappo- ja nukleotidisekvenssit. Kypsä osa poron BMP-3c-proteiinista on reunustettu ja kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-3-superperheelle, on merkitty *;’··· lihavoituina.
• · · • * • * • · ·
Kuva 5 esittää pETrd3c:stä ekspressoidun poron BMP-3c-proteiinin kypsän 35 osan aminohappo- ja nukleotidisekvenssit. Kypsä osa poron BMP-3c-proteiinista *·:** on reunustettu ja kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-p-superperheelle, on merkitty :***: lihavoituina.
··# ♦ ♦··· 7 118736
Kuva 6 esittää osan poron BMP-3c:n aminohappo- ja nukleotidisekvenssistä. Kypsä osa on reunustettu ja kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-p-superperheelle, on merkitty lihavoituina.
5 Kuva 7 esittää röntgenkuvat hiiren takajalan lihaksista. A) verrokki ja B) istutettu implantti, joka sisältää tämän keksinnön BMP-3c-proteiinia.
Kuva 8 esittää Coomassie Blue -väriaineella värjättyä SDS-PAGE-geeliä, jossa on HiTrap-pylväästä eluoidut fraktiot (Esimerkki 3C). Vyöhykkeet edustavat 10 1) lähtömateriaali; 2) pylvään läpi virrannut materiaali; 3) ensimmäinen pesu; 4) toinen pesu; 5) pH-gradienttieluutio, pH 8,0; 6) pH-gradienttieluutio, pH 6,2; 7) pH-gradienttieluutio pH 5,3; 8) pH-gradienttieluutio, pH 4,0 ja 9) standardi.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 15
Nisäkkäiden aikaisemmin tunnettujen BMP-3-proteiinien kypsien osien keskinäinen homologia on korkea. Poron BMP-3c:n kypsän osan kloonaus ja karakterisointi osoittivat, että aminohappotasolla korkein homologia oli poron BMP-3b:n kanssa (95 %) ja ihmisen BMP-3b:n kanssa (93 %).
20 BMP-3b:n ja BMP-3-proteiinien nukleotidi- (taulukko 1) ja aminohappo (taulukko 2) -homologiat eri nisäkkäiden välillä on esitetty taulukoissa 1 ja 2. Ihmisen, hiiren ja rotan BMP-3b on jo aikaisemmin karakterisoitu. Homologiavertailu nukleotiditasol- : ·': la vaihtelee 87-92 % välillä ja aminohappotasolla 94-97 % välillä. Aikaisemmin ··· : .·. 25 mainittujen organismien lisäksi BMP-3b on kloonattu myös porosta. Eri nisäkkäistä : peräisin olevan BMP-3b:n aminohappohomologia vaihtelee 94-97 % välillä ja nuk- φ ·1 leiinihappohomologia 87-92 % välillä. Poron BMP-3c:n osittaisen cDNA:n nukleo- • · · j1Y tidisekvenssi ja vastaava aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 6. Yleisesti "I.5 ottaen BMP-3c:llä on homologiaa myös muiden BMP-tyyppien kanssa.
• · • 1 ··1 ·· • · t ·· • · · • · * · • · · 1 · · • · 1 • · · • · • · • · · · · • 4 • · «1« β * · 8 118736
Organismi Ihminen Hiiri Rotta Poro rdBMP-3c ah nt ah nt ah nt ah nt ah nt
Ihminen 100 100 92 88 92 87 89 88 93 89
Hiiri 92 88 100 100 97 96 87 86 91 87
Rotta 92 87 97 96 100 100 87 85 91 86
Poro 89 88 87 86 87 85 100 100 95 96 rdBMP-3c 93 89 91 87 91 86 95 96 100 100
Taulukko 1. Eri nisäkkäiden BMP-3b:n kypsien osien homologia nukleotidi- ja ami-nohappotasolla esitettynä prosentteina (%) (nt = nukleotidit; ah = aminohapot) 5
Organismi Ihminen Hiiri Rotta rdBMP-3c ah nt ah nt ah nt ah nt
Ihminen 100 100 94__88_ 97_ 87__81_J>9_
Hiiri__94 88 100 100 97 92 73 71_
Rotta 97_ 87 97 92 100 100 80 71 . rdBMP-3c 81 69 73 71 80 71 100 100 • · · *· · ·**·“·(^—^* • t · • · · »M *
Taulukko 2. Eri nisäkkäiden BMP-3:n kypsien osien homologia nukleotidi- ja ami-nohappotasolla esitettynä prosentteina (%) (nt = nukleotidit/ah = aminohapot).
»M * , _ . . 10 • · *
Alla oleva linjaus esittää ihmisen ja poron kypsien BMP-3b-proteiinein aminohap-'**·* posekvenssiä ja tämän keksinnön poron BMP-3c:n sekvenssiä (vertailu tehty käyt täen ClustalX 1.8 -ohjelmaa (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. ! *** (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4673-^680), rdBMP-3c = poron BMP-3c, !...: 15 rdBMP-3b = poron BMP-3b, hBMP-3b = ihmisen BMP-3b, tähti osoittaa identtiset aminohapot).
• · • · ··· * ··· * · • · ·· • · 9 118736
rdBMP-3c RKKGQDVFMASSQVLDFDEKTMQKARKKQWDEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF
rdBMP-3b RKKGQDVFMAS SQVLDFDEKTMQKA-KKQVGEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWI X SPKSF
hBMP-3b RKKGQEVFMAASQVLDFDEKTMQKARRKQWDEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF
***★****★*·*★************ -** *******★**★·*****♦****★******* 5
rdBMP-3 c DAYYCSGACEFPMPKMVRPSNHATIQSIVRAVGIVPGIPEPCCVPDKMSSLGVLFLDENR
rdBMP-3b DAYYCSGACEFPMPRWVRPSNHATIQSIVRAVGIVPGIPEPCCAPDKMSSLGVLFLDENR
hBMP-3b DAYYCAGACEFPMPKIVRPSNHATIQSIVRAVGIIPGIPEPCCVPDKMNSLGVLFLDENR
*****.********. ******************.******** * * * * *********** 10
rdBMP-3 c NWLKVYPNMSVETCACQ
rdBMP-3b NWLKVYPNMSVETCACQ
hBMP-3b NWLKVYPNMSVDTCACR
************ · * * * * · 15 "Keksinnön BMP-3-proteiini” tai "keksinnön luun morfogeneettinen proteiini” viit-taavat proteiiniin, jolla on luun morfogeneettistä aktiivisuutta (tai morfogeenistä, joita molempia sanoja voidaan käyttää synonyymeinä), kuten porosta eristetyllä BMP-3c-proteiinilla, joka on kuvattu tässä asiakirjassa (SEQ ID NO:1 sekvenssi tai 20 rdBMP-3c yllä olevassa linjauksessa). Tunnusomaisena piirteenä tämän keksinnön BMPille, esimerkiksi kuten on esitetty edellä olevassa linjauksessa, ovat ne aminohapot, jotka ovat erilaisia kuin muissa tunnetuissa BMP-3-proteiineissa, kuten ne aminohapot, jotka ovat erilaisia ihmisen BMP-3c:n ja poron BMP-3c:n välil-: lä. Edullisesti alueet, joissa nämä aminohapot sijaitsevat, ovat konservoituneita M· • .*. 25 tämän keksinnön BMP-proteiinissa. Aminohapot 26 ja 104 määrittävät alueen, jos- ··· t sa aminohapot eroavat toisistaan kun verrataan poron BMP-3b:hen ja aminohapot 6 ja 138 määrittävät alueen, jossa aminohapot eroavat toisistaan kun verrataan ihmisen BMP-3b:hen.
• · · • · · • ti · ··· • t *···* 30 Toisaalta, lisäykset, poistot ja substituutiot, jotka sijaitsevat kaukana mainitusta tunnusomaisesta alueesta, eivät todennäköisesti aiheuta oleellista muutosta kek- • ί *·· sinnön BMP-proteiinin toimintaan, tehoon tai laskostumiseen. Esimerkiksi homolo- • · · git, joissa on poistoja, kuten muutaman aminohapon poisto, edullisesti 1-10 ami-nohappoa, edullisemmin 1-5 aminohappoa, edullisimmin 1-3 aminohappoa, joko 35 karboksyyli- tai aminoterminaalisessa päässä, jolloin polypeptidi on kooltaan lyhy-"* empi, ovat tämän keksinnön suojapiirissä kunhan kyseiset poistot eivät vaikuta M* !...: keksinnön BMP-proteiinin tunnusomaisiin aminohappoihin. On edullista, että ky- seessä olevilla homologeilla on alkuperäisen poron BMP-4-proteiinin hyödyllisiä 10 118736 ominaisuuksia, jotka liittyvät mainittuihin tunnusomaisiin aminohappoihin Pro6 ja/tai Pro21 ja/tai niiden ympärillä olevaan alueeseen. Mainituissa homologeissa voi olla aminohapposubstituutioita, joilla ei ole olennaisesti vaikutusta mainitun proteiinin toimintaan ja tehoon. Esimerkiksi aminohappo, joka ei sijaitse aktiivisessa kohdas-5 sa tai sen läheisyydessä, voidaan korvata toisella, jolla on samankaltainen rakenne ja/tai kemialliset ominaisuudet (esimerkiksi hydrofobisuus tai hydrofiilisyys), tämä tarkoittaa konservatiivista aminohapon vaihtoa, niin kauan kuin kyseessä oleva substituutio ei olennaisesti muuta kypsän proteiinin toimintaa tai laskostumista. Tällaisia substituutioita tunnetaan ja ymmärretään hyvin alalla. Esimerkkinä näistä 10 aminohappojen ominaisuuksista eri ryhmiin jaettuina ovat hydrofobiset (Met, Ala, Vai, Leu, Ile), neutraalit hydrofiiliset (Cys, Ser, Thr), happamat (Asp, Glu), emäksiset (Asn, Gin, His, Lys, Arg), aminohapot, jotka vaikuttavat ketjun orientaatioon (Gly, Pro) ja aromaattiset (Trp, Tyr, Phe) aminohapot. Substituutiot kyseessä olevien ryhmien sisällä eivät todennäköisesti saa aikaan merkittäviä muutoksia poly-15 peptidiketjun tukirangan rakenteeseen (esimerkiksi laskos tai helikaaiinen konfor-maatio), varaukseen tai molekyylin hydrofobisuuteen tai sivuketjujen kokoon.
Verrattaessa BMP-3c:ta tunnettuun poron BMP-3b:hen, BMP-3c-proteiinissa on 20 yksi lisäaminohappo R26 ja viisi substituoitua aminohappoa W30, D31, K75, M76
ja V104 laskettuna BMP-3c-proteiinin kypsästä osasta, kuten on esitetty SEQ ID
NO:1:ssa. Verrattaessa BMP-3c-proteiinia tunnettuun ihmisen BMP-3b-proteiiniin, BMP-3c-proteiinissa on yhdeksän substituoitua aminohappoa D6, S11, K27, S66 : M76, V95, S109, E133 ja Q138 määriteltynä BMP-3c-proteiinin kypsästä osasta ··· f 25 kuten on esitetty SEQ ID NO:1:ssa. Nämä aminohapot ovat tunnusomaisia tämän IM · ;*.j keksinnön BMP-proteiinille. Kuitenkin, koska E133 ja Q138 sijaitsevat proteiinin kypsän osan karboksiterminaalisessa päässä, niillä ei liene kovin suurta merkitystä • · * |*Y proteiinin toiminnalle.
* · · *·· · • # · • * ’·*·* 30 Kyseinen BMP-3c-proteiini sisältää aminohapot D6, S11, K27, S66, M76, V95 ja S109 numerointia vastaavissa paikoissaan, määriteltynä BMP-3c-proteiinin kyp- ·· : *·* sästä osasta kuten on esitetty SEQ ID NO:1:ssa. Kyseiset paikat voidaan määrit- ·*» tää linjaamalla kyseisten homologien, johdannaisten tai fragmenttien samankaltai-.‘i\ set sekvenssit SEQ ID NO:1 :n sekvenssin kanssa.
• i · .···. 35 • ·
Keksinnönmukainen BMP-3-proteiini sisältää alla esitetyn BMP-3-perheen kon- *«« sensussekvenssin, joka on johdettu ClustalX-linjauksesta, jossa useita eri lajien • •••S • · u 118756 BMP-3-proteiineja on linjattu, kyseessä olevien sekvenssien vastatessa SEQ ID NO:1 :n aminohappoja 26-104.
r-klk-q-w-d-e-p-r-v/n-c-s/a-r-r-y-l-k-v-d-f-a-d-i-g-w-n/s-e-w-i-i-s-p-k-s-f-d-a-
5 Y-Y-C-S-G-A-C-E/Q-F-P-M-P-K-M-V/L-R/K-P-S-N-H-A-T-I-Q-S-I-V-R-A-V-G-I/V-V-F/S-G-I-P-E-P-C-C-V
Myös muita konsensussekvenssejä voidaan määritellä, esimerkiksi sellaiset, jotka käsittävät SEQ ID NO:1:n aminohappojen 6-104, 6-109, tai 6-138 väliset alueet, 10 tai vastaavanlaiset sekvenssit, jotka eroavat pituutensa puolesta, esimerkiksi 1-20 aminohappoa. Tällaisia konsensussekvenssejä voidaan määritellä jäljempänä olevasta linjauksesta tai samankaltaisista linjauksista, joissa on käytetty eri BMP-proteiineja, jotka ovat sukua toistensa kanssa. Linjatut BMP-sekvenssit ovat peräisin porosta, ihmisestä, rotasta ja afrikkalaisesta kynsisammakosta (Xenopus lae-15 vis).
♦ 4 · • · · ··· • · • · · • · · ··· · • · ♦ · · * ·· • · • · • · · • · · ··♦ · • · • · ♦ • · · ··· • * • · ·«· ·« • * • ·* » «·* • · • * *·· «·· • · · • · » ««« • · • · *·· 1 • · • · * · ··· 12 118736
BMP3C_REINDEER RKKGQDVFMASSQVLDFDEKTMQKARKKQWDEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF
BMP3_HUMAN KKKQRKGPHRKSQTLQFDEQTLKKARRKQWIEPRNCARRYLKVDFADIGWSEWIISPKSF
BMP3_RAT KKKQRKGPHQKGQTLQFDEQTLKKARRKQWIEPRNCARRYLKVDFADIGWSEWIISPKSF
BMP3_XEN0PUS KKKLRKGSRQKSQTLQFDEQTLKKARRKQWNEPRNCARRYLKVDFADIGWSEWIISPKSF
5 BMP3B„REINDEER RKKGQDVFMASSQVLDFDEKTMQKA-KKQVGEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF
BMP3 B_HUMAN RKKGQEVFMAASQVLDFDEKTMQKARRKQWDEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF
,*·*· * * 1★*-★··** ·** * * * ★-♦★♦**********i*********
BMP3C_REINDEER DAYYCSGACEFFMPKMVRPSNHATIQSIVRAVGIVPGIPEPCCVPDKMSSLGVLFLDENR
10 BMP3_HUMAN DAYYCSGACQFFMPKSLKPSNHATIQSIVRAVGWPGIPEPCCVPEKMSSLSILFFDENK
BMP3_RAT DAYYCSGACQFPMPKSLKPSNHATIQSIVRAVGWSGIPEPCCVPEKMSSLSILFFDENK
BMP3_XENOPUS DAYYCSGACQFPMPKSLKPSNHATIQSIVRAVGWPGIPEPCCVPEKMSSLSILFLDENK
BMP3B_REINDEER DAYYCSGACEFPMPRWVRPSNHATIQSIVRAVGIVPGIPEPCCAPDKMSSLGVLFLDENR
BMP3B_HUMAN DAYYCAGACEFPMPKIVRPSNHATIQSIVRAVGIIPGIPEPCCVPDKMNSLGVLFLDENR
*****.1.*♦♦*. ..***************..********.****.**.1.
BMP3C_REINDEER nwlkvypnmsvetcacq BMP3_HUMAN nwlkvypnmtvescacr
BMP3_RAT NWLKVYPNMTVDSCACR
20 BMP3_XENOPUS nwlkvypnmtvescacr
BMP3B_REINDEER NWLKVYPNMSVETCACQ
BMP3B_HUMAN nwlkvypnmsvdtcacr **********.*, • · · • · · • · · 25 Eräässä tämän keksinnön toteutusmuodossa kyseessä oleva BMP on mikä tahan-sa BMP-3, joka käsittää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 26-104. Kyseisten amino- • ·*; happojen paikkanumerot on laskettu minkä tahansa yleisen BMP-3-proteiinin kyp- • · « · : .·. sän osan aminoterminaalisesta päästä lukien, kuten SEQ ID NO:1:n BMP-3c- !·*··] proteiinista, jossa aminoterminaalinen sekvenssi alkaa aminohapoilla RKKGQ, ku- • · 30 ten esimerkiksi porolla (katso edellä oleva sekvenssilinjaus tai SEQ ID NO: 1), tai .. vastaavista alueista. Jos kyseisen proteiinin aminohapposekvenssissä on lisäyksiä • · tai poistoja, jotka vaikuttavat numerointiin, tämä pitää ottaa huomioon kun määri- * · ’···* teilaan mainittujen olennaisten aminohappojen paikkoja, esimerkiksi linjaamalla sekvenssit, kuten on kuvailtu, ja sen jälkeen määrittämällä mainittujen aminohap-35 pojen paikat. Kuitenkin minkä tahansa kyseessä olevista BMP-proteiineista pitäisi • · · olennaisilta osiltaan pitää sisällään sellaisen toiminnan ja tehokkuuden, joka on • · *···’ tuotu esille tässä. Koska kuitenkin kaikki tunnetut BMP-3-proteiinit ovat hyvin kon- * ’ servoituneita, kyseisten olennaisten aminohappojen paikkamääritys on yksiselit- 13 118736 teistä, kuten ihmisen BMP-3b:n tapauksessa. Esimerkiksi rdBMP-3b-proteiinissa on yhden aminohapon poisto verrattuna rdBMP-3c-proteiiniin, kuten havaitaan edellä olevasta linjauksesta, mutta siitä huolimatta vastaavat aminohapot vertauksessa mukana olevissa sekvensseissä voidaan määrittää helposti. Kyseiset paikat 5 voidaan myös helposti määrittää muista BMP-proteiineista (katso edellä olevaa linjausta). Yleensä näiden homologia-aste aminohappotasolla voi olla ainakin 70 %, edullisesti 80 %, edullisemmin 93 % ja edullisimmin 95 %.
Eräässä tämän keksinnön toteutusmuodossa BMP on mikä tahansa BMP-3, joka 10 sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 6-104. Eräässä tämän keksinnön toteutus-muodossa BMP on mikä tahansa BMP-3, joka sisältää SEQ ID NO: 1 :n aminohapot 6-109. Eräässä tämän keksinnön toteutusmuodossa BMP on mikä tahansa BMP-3, joka sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 6-138. Vielä eräässä tämän keksinnön toteutusmuodossa BMP on BMP-3-proteiini, joka sisältää SEQ ID NO: 15 1 :n aminohapposekvenssin.
Eräs tämän keksinnön toteutusmuoto tarjoaa nukleiinihappomolekyylin, kuten DNA- tai RNA-molekyylin, joka koodaa mainittua tämän keksinnön BMP:tä, joko hepariinin sitoutumiskohdan tai propeptidin kanssa tai ilman. Johtuen geneettisen 20 koodin degeneratiivisuudesta on olemassa useita erilaisia nukleiinihapposekvens-sejä, jotka koodaavat keksinnön BMP:tä, kyseistä hepariinia sitovaa kohtaa tai propeptidiä. Kaikki sellaiset nukleiinihappovariantit ovat tämän keksinnön suojapii-rissä. Edullisesti kyseinen nukleiinihappomolekyyli on DNA-molekyyli. Esimerkkejä kyseisistä DNA-sekvensseistä on esitetty kuvissa 4-6.
: 25 ··· ·
Eräs tämän keksinnön toteutusmuoto tarjoaa replikoituvan vektorin, joka sisältää • ;*· edellä kuvatun nukleiinihappomolekyylin, yhdistettynä toiminnallisesti sellaiseen ··· · : .·. sekvenssiin, joka kontrolloi sen ekspressiota. Tällaisia vektoreita voidaan käyttää tuottamaan keksinnön mukaisia BMP-rekombinanttiproteiineja sopivassa isän- • · 30 täsysteemissä.
·· • · :..7 Nukleiinihappo, joka koodaa tämän keksinnön BMP:tä, voidaan liittää kyseiseen · ***** replikoituvaan vektoriin kloonausta tai ekspressiota varten. Useita vektoreita on :T: yleisesti saatavilla. Vektori voi olla esimerkiksi plasmidin, kosmidin, viruspartikkelin :‘1: 35 tai faagin muodossa. Tarkoituksenmukainen nukleiinihapposekvenssi voidaan liit- • · · tää vektoriin käyttäen useaa eri menettelytapaa. Yleensä, DNA liitetään sopivaan • · ***** restriktioendonukleaasin katkaisukohtaan käyttäen alalla hyvin tunnettuja mene- * telmiä. Vektorin rakenneosana voi olla esimerkiksi yksi tai useampi signaalise- 14 118736 kvenssi, replikaation alkamiskohta, yksi tai useampi markkerigeeni, enhancer-elementti, promoottori ja transkription lopettamissekvenssi. Rakennettaessa tällaisia sopivia vektoreita, jotka sisältävät yhden tai useamman näistä komponenteista, käytetään hyväksi normaaleja ligaatiotekniikoita, jotka alan ammattilainen tuntee 5 hyvin.
Yleensä kyseinen BMP voidaan tuottaa geeniteknologisesti ekspressoimalla sitä missä tahansa sopivassa isäntäsolussa, kuten bakteerisolussa. Tällaiset menetelmät ovat alalla hyvin tunnettuja ja niistä löytyy tietoa kirjallisuudesta. Oleellista on, 10 että proteiini laskostuu oikeanlaiseen muotoon ekspression aikana ja että se sisältää kaikki tarpeelliset post-translationaaliset modifikaatiot.
Ei ole aina mahdollista tuottaa ja puhdistaa tiettyjä proteiineja asianmukaisesti, esimerkiksi liukoisuuden ja uudelleenlaskostumiseen liittyvistä ongelmista johtuen. 15 Yleensä E coli ei voi tehdä post-translationaalisia modifikaatioita, jotka ovat tyypillisiä nisäkässolusysteemeille. Kuitenkin tämän keksinnön tekijät ovat tuottaneet poron BMP-3c-proteiinin kypsän osan rekombinanttiproteiinina E. colissa ja puhdistamisen ja uudelleen laskostumisen jälkeen osoittaneet sen olevan biologisesti aktiivisessa muodossa.
20
Eräs tämän keksinnön toteutusmuoto tarjoaa isäntäsolun, joka sisältää nukleotidi- molekyylin tai nukleotidivektorin, joka on kuvattu edellä. Käyttökelpoisia soluja ovat kaikki prokaryoottiset ja eukaryoottiset solut, jotka kykenevät ekspressoimaan tä- *»;' män keksinnön proteiinia. Tällaiset isäntäsolut ovat hyvin tunnettuja alalla ja alan : 25 ammattilainen voi helposti valita sopivan isäntäsolun. Eräs toteutusmuoto tarjoaa • · V*: BMP:n, joka on tuotettu kasvattamalla mainittuja soluja siten, että ne ekspressoivat kyseistä proteiinia ja ottamalla talteen mainittu tuotettu proteiini kyseisestä isän-: täsolusta. Mitä tahansa käyttökelpoista menetelmää voidaan käyttää proteiinin tai- • *a · :*·*; teen ottamiseen ja puhdistamiseen ja sellaiset menetelmät ovat alalla hyvin tunnet- 30 tuja.
·· • · • t* Tämän keksinnön BMP:tä voidaan käyttää hoidettaessa häiriöitä, jotka kohdistuvat **:* luun, ruston, jänteen tai hampaiden vikoihin tai sairauksiin tai muuhun vastaavaan, ·.' : jossa niiden uudistuminen, korjaaminen tai kasvu on toivottavaa, tai myös muihin 35 sairauksiin. Tämän keksinnön proteiinia voidaan käyttää myös haavojen paranta- .·!·. miseen, kuten palovammoihin, leikkaushaavoihin ja mahahaavoihin ja vastaaviin • · kudosten korjauksiin ja myös syövän hoitoon, kuten on esitetty julkaisussa EP1131087. Koska BMP-proteiinilta yleisesti puuttuu lajispesifisyys, potilas, joka 15 118736 kärsii kyseisestä viasta, voi olla mikä tahansa soveltuva eläin, edullisesti nisäkäs, kuten ihminen, ja hoidossa käytettävä BMP-proteiini voi olla alkuperältään mistä tahansa sopivasta lähteestä peräisin. Samankaltaisten BMP-proteiinien käyttö monissa terapeuttisissa sovelluksissa tunnetaan alalla hyvin (katso esimerkiksi US 5 6245889 ja WO 98/51354).
’’Häiriöt, jotka liittyvät luun, ruston, jänteen tai hampaiden vikoihin” tässä käytettynä viittaa yleisesti mihin tahansa vaivaan, jossa luun, ruston, jänteen tai hampaiden paraneminen tai uudelleen rakentaminen, ts. regeneraatio, on toivottavaa. Ei-10 rajoittavia esimerkkejä hoitotoimenpiteistä, jotka kohdistuvat luun, ruston, jänteen tai hampaiden häiriöihin tai sairauksiin tai vastaaviin, ovat luun ja hammaskudok-sen regeneraatio, korjaaminen ja kasvu; luun regeneraatio, korjaaminen ja kasvu nisäkkäillä, kuten ihmisellä; hoitotoimenpiteet luun muodostuksessa tai regeneraa-tiossa tapahtuneiden poikkeavuuksien korjaamiseksi; haavan paraneminen, ek-15 tooppinen luun indusointi ja segmentaalisten luuvaurioiden parantaminen selkärankaisilla; hoitotoimenpiteet luurangan häiriöiden ja epämuodostumien korjaamiseksi; suurten luuvaurioiden korjaaminen, jotka johtuvat traumasta, kasvainten poistamisesta tai synnynnäisistä epämuodostumista, implantoidun sisäisen proteesin vuoksi vähentyneiden luuvarastojen rekonstruointi korjausoperaatioissa tai 20 luunmurtumien hidastunut paraneminen tai yhteen liittymättömät luunmurtumat; luun ja ruston vikojen korjaaminen, kuten ’’critical size defectit”, ”non-critical size defectit”, yhteen liittymättömät murtumat, segmentaaliset yhteen liittymättömät murtumat; akuutit murtumat, rustoviat, luu-rusto defektit, rustonalaisen luun viat, paikallinen luun ja ruston muodostus; viat, jotka johtuvat rappeuttavista sairauksis- • · : 25 ta; hampaisiin liittyvät sovellukset, joissa korjataan hammaskudosta, alveolaarista luuta, hammassementtiä, hampaanjuuren membraania, täytetään hampaan juuri-j :*: kanavan sisältöä, hammasimplantin kiinnityksen kehittäminen ja parantaminen. Li- • sää esimerkkejä näistä häiriöistä löytyy julkaisusta Ann Rheum Dis, Volume 62, • · · * .··*. 2003, 73-78: Reddy AH: Cartilage morphogenic proteins: role in joint develop- • · * 30 ment, homeostasis and regeneration.
·« • « • ·*
Muita sairauksia, joissa tämän keksinnön BMP on hyödyllinen, ovat esimerkiksi *"·’ syöpä, fibromyalgia, psoriasis ja muut dermatologiset häiriöt, ja reumaattiset häiriöt :T: ja vastaavat. Esimerkkejä tällaisista syövistä ja menetelmistä ja koostumuksista, 35 joilla niitä hoidetaan, on esitetty julkaisussa EP1131087.
·*« • ·
Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa BMP:n, kuten BMP-3, käytettäväksi missä tahansa tässä kuvatussa sovelluksessa yhdessä yhden tai useamman muun mor- 16 118736 fogeneettisen proteiinin kanssa, kuten toisen BMP-tyypin tai vastaavan kanssa. Yleensä tällä saavutetaan synergiaetuja, kuten alalla tiedetään. Esimerkkeinä muista sopivista BMP-proteiineista ovat, mutta eivät ole rajoittuneet vain näihin, BMP-1, BMP-2, jokin muu BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 ja BMP-8. Myös 5 muita terapeuttisesti hyödyllisiä aineita voidaan käyttää, kuten epidermaalista kasvutekijää, fibroplastista kasvutekijää ja tranformoivaa kasvutekijää (US 6 245 889). Eräässä keksinnön toteutusmuodossa kyseessä oleva täydentävä morfogeneetti-nen proteiini on peräisin porosta, kuten jokin muu poron BMP-proteiini. Eräässä keksinnön toteutusmuodossa BMP tarjotaan käytettäväksi dimeerinä, homodimee-10 rinä tai heterodimeerinä yhdessä toisen BMP-proteiinin kanssa, kuten on kuvattu edellä. Vielä eräässä toteutusmuodossa BMP tarjotaan käytettäväksi dimeerimuo-dossa tai yhdessä jonkin muun tekijän tai proteiinin kanssa, kuten on kuvattu edellä, lääkeaineen valmistukseen, jolla lääkitään häiriöitä, joita on kuvattu selitysosassa.
15
Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa käyttöön osteogeenisen välineen, kuten implantin, joka sisältää tämän keksinnön BMP:tä. Osteogeeninen väline voi sisältää bioyhteensopivan matriksin, kuten kalsiumfosfaatti-, karboksimetyyliselluloosa-, kollageenimatriksin tai näiden yhdistelmiä. Eräässä toteutusmuodossa kyseinen 20 kalsiumfosfaattimatriksi on hydroksiapatiittimatriksi. Kyseinen matriksi voi mahdollistaa BMP-proteiinin hitaan vapautumisen ja/tai sopivan ympäristön BMP-proteiinin luovuttamiselle. Osteogeeninen väline saattaa myös sisältää metallisen implantin, jota mainittu bioyhteensopiva matriksi ympäröi. Eräs esimerkki kyseises-tä metallista on titaani. Joitakin esimerkkejä tällaisista osteogeenisistä välineistä on : 25 esitetty julkaisussa WO 98/51354.
• ♦ • · · • ti • · : Ei-rajoittavia esimerkkejä erilaisista tukimateriaaleista, kantajista tai tuista, joiden
Iti i 1 17 118736 mineralisoitunut luu, biolasi, mikä tahansa biohajoava materiaali ja näiden yhdistelmät; sitoutumiseen käytetyt aineet, jotka on valittu seuraavasta ryhmästä: man-nitoli, dekstraanit, valkovaseliini, alkyyli- ja metyyliselluloosat, kostuttavat aineet kuten natriumsuolat, fobriiniliima, nisäkäsperäinen fibrinogeeni ja trombiini ja näi-5 den yhdistelmät ja sekoitukset. Osteogeeninen väline voi olla esimerkiksi rakenteellisesti stabiili, kolmiulotteinen implantti, joka on muodoltaan kuutio, sylinteri tai blokki tai anatomisesti muotoiltu tai injektoitavassa muodossa. Esimerkkejä osteo-geenisistä välineistä, hyödyllisistä materiaaleista ja tekniikoista on tuotu esiin kirjassa Skeletal reconstruction and bioimplantation (T. Sam Lindholm, 1997, Sprin-10 ger-Verlag, Heidelberg, Germany).
Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa farmaseuttisen koostumuksen, joka sisältää terapeuttisesti tehokkaan määrän tämän keksinnön BMP:tä farmaseuttisesti sopivassa kuljettimessa tai kantajassa. Kyseisiä farmaseuttisia koostumuksia voidaan 15 käyttää sellaisten häiriöiden hoitamiseen, jotka liittyvät luun, ruston, jänteen tai hampaiden vaurioihin tai muihin sairauksiin, haavoihin ja muihin kudosvaurioihin tai mihin tahansa häiriöihin, joita on kuvattu tässä tekstissä.
Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa menetelmän, jolla voidaan indusoida luun, 20 ruston, jänteen, hampaiden tai vastaavien muodostuminen, jossa kyseistä luuta, rustoa, jännettä, hammasta tai vastaavaa käsitellään tämän keksinnön BMP:llä tai sen yhdistelmillä kuten on kuvattu edellä, in vitro tai in vivo. Vielä eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa menetelmän, jolla hoidetaan niitä häiriöitä, joita on kuvattu selityksessä, käsittäen eristetyn keksinnönmukaisen BMP:n antamisen potilaalle, • · · 25 joka kärsii kyseisistä häiriöistä. Kyseistä BMP:tä voidaan antaa farmaseuttisena koostumuksena tai osteogeenisenä välineenä, kuten on kuvattu edellä. Täydentä- : viä morfogeneettisiä proteiineja tai muita hyödyllisiä aineita voidaan antaa yhdessä • ·*: kyseessä olevan tämän keksinnön BMP:n kanssa, kuten on kuvattu edellä, lisää- ··· · .**·. mään terapeuttista vaikutusta.
30 ... Seuraavassa selvityksessä ja esimerkeissä kuvataan sitä, miten poron rekombi- *./.* nanttin BMP-3c:n kypsä osa, kuten on esitetty tämän keksinnön eräässä kohdas- *·;** sa, tuotetaan E. colissa. Puhdistamisen ja laskostamisen jälkeen osteoinduktiivi- :T: nen aktiivisuus varmistettiin bioanalyysillä hiiren takajalan lihastaskussa. Tämä in 35 vivo -bioanalyysi on ollut BMP:n aktiivisuuden määrityksen standardimenetelmä jo y..t proteiinin keksimisestä lähtien. Se käsittää BMP:n implantoimisen hiiren takajalan '***. lihakseen ja heterotrooppisen uuden luun indusoitumisen arvioinnin radiologisesti ja histologisesti 10-21 päivän kuluttua implantaatiosta.
18 118756
Osteoinduktiivisuus havaittiin kaikissa neljässä tutkitussa ryhmässä (1 mg, 3 mg, 5 mg, ja 8 mg poron rekombinantti-BMP-3c-proteiinia) ja vaste kohosi annosta lisättäessä (taulukko 3).
5 BMP-3C138
Annos 1 mg 3 mg 5 mg 8 mg
Poro_____+__- ++_ (+) +__+__+_ (+)__ BMP-3cno 10 __^__
Annos 1 mg 3 mg 5 mg 10 mg
Poro l | l | | l - I + I (+) I + I ++ ++ + + + ++ ++ • ♦ · /"1 Taulukko 3. Poron BMP-3c138- ja BMP-3c110-proteiinien osteoinduktiivisen vas- • 1 · '··'· 1· teen vertailu eri annoksilla.
• 9 5.1·: In vivo -bioanalyysin tulokset on esitetty kuvassa 7. Kuva 7A on verrokki ja 7B on • · : 15 näyte, joka on implantoitu tämän keksinnön BMP-3c-proteiinilla. Bioanalyysi toteu- ·,·1: tettiin kuten on esitetty julkaisussa Marshall R. Urist, J.J. Chang, A. Lietze, Y.K.
Huo, A.G. Brownell and J.DeLange (1987): Preparation and Bioassay of Bone Morphogenetic Protein and Polypeptide Fragments, Methods Enzymol 146: 294-:·. 312.
t ·· 20 I · *·1 Esimerkit
Ml III • · ·
Poron BMP-3c:n cDNA:n kloonaaminen ja homologia-analyysi ···
• I
• ·
Ml · 19 118736 PCR-tuote, joka oli kooltaan noin 400 emäsparia, eristettiin ja kloonattiin pGEM-T® vektoriin. ABI Prism -reaktioista saatu nukleotidisekvenssi analysoitiin tietokoneella ja sitä verrattiin jo tunnettuihin ihmisen BMP-sekvensseihin. Homologiavertai-luissa uusi kloonattu cDNA osoittautui homologisemmaksi ihmisen BMP-3b:n 5 kanssa (nukleotidi homologia 89 % ja aminohappo homologia 93 %) kuin ihmisen BMP-3:n kanssa (nukleotidihomologia 69 % ja aminohappohomologia 81 %) kanssa. Verrattaessa uutta kloonattua cDNA:ta kaikkiin tunnettuihin BMP:ihin, homologia oli suurin poron BMP-3b:n kanssa (nukleotidihomologia 96 % ja aminohappohomologia 95 %). Tästä syystä tämän keksinnön cDNA nimettiin poron BMP-10 3c:ksi.
Poron BMP-3c:n kypsän osan ekspressointi
Aikaisemmissa tutkimuksissa ihmisen BMP-3-proteiinia on tuotettu CHO-soluissa, 15 E. coli -soluissa ja retrovirussysteemillä. Lisäksi ihmisen BMP-3- ja rotan BMP-3b-proteiineja on tuotettu rekombinanttiproteiineina adenovirussysteemissä. Kuitenkaan mitään hirvieläimistä peräisin olevaa BMP-3-geeniperheen jäsentä ei ole tuotettu rekombinanttiproteiinina.
20 Nukleotidimolekyyli, jonka pituus oli 414 nukleotidia, ja joka vastaa 138 aminohapon pituista poron BMP-3c:n kypsää osaa, subkloonattiin pGEM-T®-vektorista TrcHis2A-vektoriin ja transformoitiin E. coli TOP10 -soluihin (Invitrogen), jolloin saatiin vektori pTrcrd3c/138. Rekombinanttiproteiinin ekspressio indusoitiin :.i.: IPTG:llä. Rekombinanttiproteiinin tuotto varmistettiin SDS-PAGE:lla mutta induktio- • · :.! : 25 ta ei havaittu. Proteiinin ekspression aikaansaamiseksi pET22b(+), jossa on His6- tag ja pelB-johtoalue, valittiin ekspressiovektoriksi ja konstruoitiin uusi vektori, joka : nimettiin pETrd3c/138:ksi. Rosetta (DE3) (Novagen) ja Origami B (DE3) (Nova- • :*: gen) E. coli -kantoja käytettiin ekspressioon. Rekombinantin rdBMP-3c:n tuloksel- .···. linen IPTG-induktio varmistettiin SDS-PAGE:lla, mutta ekspressiotaso oli mata- 30 lampi kuin rdBMP-4:n ja rdBMP-6:n ekspressiotasot Qulkaisematon tieto).
• « • · :..7 Poron BMP-3c/110:n ekspressointi • · • · ··* •
Toinen, kooltaan lyhyempi konstrukti valmistettiin rdBMP-3c:stä. Nukleotidimole-:)”i 35 kyyli, jonka pituus oli 330 nukleotidia, joka vastaa 110 aminohapon pituista osaa •*..t poron BMP-3c-proteiinista, subkloonattiin pGEM-T®-vektorista TrcHis2A-vektoriin ****'. ja transformoitiin E. coli TOP 10 -soluihin, jolloin saatiin pTrcrd3c/110-vektori. Re kombinanttiproteiinin ekspressio indusoitiin IPTG:llä. Rekombinanttiproteiinin tuot- 20 118736 to varmistettiin SDS-PAGE:lla, mutta induktiota ei havaittu. Siitä syystä pET22b(+), jossa on His6-tag ja pelB-johtoalue, valittiin ekspressiovektoriksi ja pETrd3c/110-vektori rakennettiin. Rosetta (DE3) ja Origami B (DE3j E. coli -kantoja käytettiin ekspressioon. Tuloksellinen IPTG-induktio varmistettiin SDS-PAGE:lla.
5
Poron BMP-3c/138- ja BMP-3c/110 -rekombinanttiproteiinien biologinen aktiivisuus
Ihmisen BMP-3-rekombinanttiproteiini on osoittanut osteogeneettistä aktiivisuutta bioanalyysissa, kun sitä on tuotettu CHO-soluissa tai E. coli -systeemissä, mutta 10 kun ihmisen rekombinantti BMP-3-proteiinin tuottosysteemeinä on käytetty retrovirus- tai adenovirussysteemeitä, osteogeneettistä aktiivisuutta ei havaittu. Kun BMP-3b proteiinia tuotettiin käyttäen adenovirussysteemiä, sen havaittiin vaikuttavan luun muodostukseen synergeettisesti BMP-2-proteiinin kanssa, mutta se ei kyennyt saamaan aikaan luun induktiota omin neuvoin. Hirvieläimistä (Cervidae-15 heimo) peräisin olevaa BMP-3:a ei kuitenkaan ole edes kloonattu ja jo aikaisemmin kloonatun poron BMP-3b:n biologista aktiivisuutta ei ole testattu.
Tässä tutkimuksessa on osoitettu, että BMP-3-geeniperheen uusi jäsen, poron rekombinantti BMP-3c, jota on tuotettu E. colissa, voi aikaansaada luun muodostus-20 ta, kun sitä implantoidaan kollageenihuovan kanssa hiiren reisilihastaskuihin.
* • i · • · « *«· • « • · · • · 1 • ·« · « 1 ♦ · · • «· • · » · • · · * · · • · « · 1 • 1 I ··· · «·· • » • 1 ** 1 • · « « • ·· ·2 • · • 1 *·1 ··· • · · # · · ··» • · Λ 1
M
• · ♦ f 2 • tt • • » 21 118736
Esimerkki 1: Poron BMP-3c:n cDNA:n 3’-pään kloonaaminen ja sekvensointi A. RNA:n eristäminen 5 Kolmivuotiaan urosporon sarvet leikattiin irti ja jäädytettiin nestetypessä välittömästi teurastuksen jälkeen. Jäätyneet sarvet leikattiin 0,5 cm:n palasiksi ja säilytettiin -70 °C:ssa. Poron sarven mRNA eristettiin käyttäen QuickPrep® Micro mRNA Purification Kit -pakkausta (Pharmacia Biotech). Osa poron sarven kappaleesta pilkottiin pieniksi palasiksi (noin 1 mm3) ja 0,1 g tätä kudosta lisättiin 0,6 10 ml:aan Extraction-puskuria, joka sisälsi guanidiinitiosyanaattia ja N-lauroyylisarkosiinia. Kudosta homogenisoitiin jäissä Ultra Turraksilla kolme kertaa 10 sekuntia ja jäähdytettiin homogenisointikertojen välillä. 1,2 ml Elution-puskuria lisättiin ja suspensiota homogenisoitiin vielä yhden kerran 10 sekunnin ajan. Lopputuloksena oli tasainen suspensio.
15
Poron sarven homogenaatti ja Oligo(dT)-selluloosa sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] yhden minuutin ajan. Oligo(dT)-selluloosapelletin päällä oleva puskuri poistettiin ja kirkas kudoshomogenaatti pipetoitiin sen tilalle. Putkea käännettiin ylösalaisin, jotta Oli-20 go(dT)-selluloosa saataisiin suspensioksi. Suspensiota sekoitettiin varovasti viiden minuutin ajan ja sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmös-. .·. sä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] kymmenen sekunnin ajan. Supernatantti hei- ·*". tettiin pois.
• · · • M « • · • · ·
.* 7 25 Oligo(dT)-selluloosa suspensoitiin uudelleen High-Salt Buffer -puskuriin [10 mM
• · *
Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCI] ja suspensio sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] kymmenen sekunnin ajan. Pesut High-Salt Buffer -puskurilla toistettiin viisi kertaa
ja lisäksi kaksi kertaa Low Salt Buffer -puskurilla [10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM
i.:*i 30 EDTA, 0,1 M NaCI]. 3 ml Low Salt Buffer -puskuria lisättiin ja suspensio siirrettiin :***: MicroSpin-pylvääseen. MicroSpin-pylväs laitettiin Eppendorf-putkeen ja sentrifu- . goitiin täydellä nopeudella viiden sekunnin ajan. Pylvään Oligo(dT)-selluloosa :;j.: huuhdeltiin kolme kertaa Low Salt Buffer -puskurilla.
• ♦ • ♦ • ·ι « s Y: 35 Poron sarven mRNA eluoitiin MicroSpin-pylväästä puhtaaseen Eppendorf-putkeen
·:*·: lisäämällä pylvääseen 0,2 ml 65 °C Elution-puskuria (QuickPrep® Micro mRNA
Purification Kit, Pharmacia Biotech) ja sentrifugoimalla täydellä nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] viiden sekunnin ajan.
22 118736
Eluutiovaihe toistettiin kaksi kertaa. Eristetty mRNA seostettiin lisäämällä jokaiseen eluanttiin 5 μΙ glykogeeniliuosta (5-10 mg/ml DEPC-käsitellyssä H20:ssa), 1/10 tilavuutta K-asetaattiliuosta (2,5 M kaliumasetaatti, pH 5,0) ja 0,5 ml absoluuttista etanolia (jäähdytettynä -20 °C:seen). Saostumisen annettiin tapahtua -20 5 °C:ssa ainakin 30 minuuttia ja mRNA sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, 4 °C:ssa, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] viiden minuutin ajan. Saostettu mRNA säilytettiin -70 °C:ssa niin kauan kunnes cDNA:n synteesi suoritettiin.
B. cDNA synteesi 10
Poron sarven mRNA.n käänteinen transkriptio suoritettiin modifioiden Time Saver™ cDNA Synthesis Kit -pakkauksen (Pharmacia Biotech) ohjeita. 3 pg mRNA:ta lämpödenaturoitiin 65 °C:ssa kymmenen minuutin ajan ja jäähdytettiin jäissä. 0,2 pmol DTT, 0,5 pg Oligo(dT)12_i8-aluketta ja lämpödenaturoitu mRNA 15 lisättiin First Strand -reaktioseokseen, joka sisälsi FPLCpure™ Cloned Murine Reverse Transcriptase, RNAguard™, RNase/DNase-Free BSA, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP ja dTTP) vesipohjaisessa puskurissa (Time Saver™ cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Sekoitettua liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa yhden tunnin ajan. Inkubaation jälkeen First Strand -reaktioseos lisättiin Second Strand 20 -reaktioseokseen, joka sisälsi E. coli RNaasi H:ta ja E. coli DNA polymeraasi !:tä ja dNTP:itä vesipohjaisessa puskurissa (Time Saver™ cDNA Synthesis Kit, Pharma-. .·. cia Biotech). Liuosta sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Syntetisoitu cDNA säilytettiin +4 °C lämpötilassa.
• · · ··· * • t • · · / !*’ 25 C. Poron sarven cDNA:n kartoittaminen » · t • * » ··· · t ·
Osa poron BMP-3c:n cDNA:ta monistettiin PCR-tekniikalla (Polymerase chain reaction) käyttäen degeneratiivisia alukkeita (51- CGCAA(A/G)GACCGCA(A/G)GAAGAA(A/G)GGC-3’) ja s.:V 30 (3’- TC(T/C)GT(A/G)GAGACCTGTGCCTG(T/C)CAA-5’), jotka oli suunniteltu jo tunnettujen eri nisäkäslajien (ihminen, rotta ja hiiri) BMP-3b geenien homologiaan . perustuen. PCR-reactioseos (50 pl) sisälsi 100 ng poron sarvesta valmistettua jll/ cDNA:ta, 40 pmol kutakin aluketta, 0,4 mM dNTP (PCR Core Kit, Roche) ja 0,7 *·;·’ U/pl Expand High Fidelity entsyymiseosta (lämpöstabiili Taq polymeraasi + oikolu- :V: 35 keva polymeraasi, Roche) Expand High Fidelity -puskurissa, joka sisälsi MgCI2 ·:··; (Expand High Fidelity PCR System, Roche). Reaktio suoritettiin käyttäen Master- cycler personal apparatus -laitetta (Eppendorf) seuraavan ohjelman mukaisesti: alkudenaturaatio 94 °C, 4 minuuttia, ja seuraavat 25 sykliä: denaturaatio 94 °C, 1 23 118736 minuutti, alukkeiden liittäminen 55 °C, 1 minuutti, DNA-ketjujen pidentäminen 72 °C, 2 minuuttia. Loppuekstensio suoritettiin 72 °C:ssa 10 minuuttia.
D. Kloonaaminen pGEM- T®-vektoriin 5 PCR-tuote puhdistettiin käyttäen Wizard® PCR Preps DNA Purification System -pakkausta (Promega) ja ligatoitiin pGEM-T®-vektoriin (kuva 1) käyttäen T4 DNA-ligaasia (pGEM-T® Vector System I; Promega). 0,3 pg puhdistettua PCR-tuotetta ja 2,3 pg/ml pGEM-T®-vektoria lisättiin ligaatiopuskuriin, joka sisälsi 18 mM Tris-10 HCI (pH 7,8), 6 mM MgCI2, 6 mM DTT, 0,3 mM ATP, 3 % polyetyleeniglykolia ja 0,14 U/μΙ T4 DNA-ligaasia kokonaistilavuuden ollessa 66 pl. Reaktion annettiin tapahtua +16 °C vesihauteessa, joka viileni yön aikana +4 °C-asteiseksi. Syntynyttä, uutta plasmidia kutsuttiin nimellä pGEMrd3c/142 (kuva 1).
15 E. Kompetenttien Escherichia coli TOP 10 F' -solujen valmistaminen
Kompetentit Escherichia coli TOP 10 F' -solut valmistettiin kalsiumklori-di/magnesiumkloridimenetelmällä. 2 ml LB-kasvatuslientä inokuloitiin E. coli TOP 10 F' -soluilla ja kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa ravistellen (225 rpm). Seuraavana 20 aamuna 100 ml.aan tuoretta LB-kasvatuslientä lisättiin 1 ml yli yön kasvatettua kasvustoa ja sitä kasvatettiin ravistellen (225 rpm) 37 °C:ssa niin kauan kunnes . .*. ODeoo=0,5-0,6. Kasvatetut solut kerättiin sentrifugoimalla (2,500 x g, 5 minuuttia), suspendoitiin 10 ml:aan 0,1 M MgCI2-liuosta ja kerättiin sentrifugoimalla (2,500 x • · · \V \ g, 5 minuuttia). MgCI2-käsittelyn jälkeen solut suspendoitiin 10 ml:aan 0,1 M CaCI2- 25 liuosta, inkuboitiin jäähauteessa 30 minuuttia ja kerättiin taas sentrifugoimalla |*Y (2,500 x g, 5 minuuttia). CaCI2-käsittely toistettiin, muuttaen sitä kuitenkin niin, että !·γ toisella kerralla käytettiin 3,5 ml CaC^-liuosta, ja soluja inkuboitiin yhden tunnin ajan. Suspensioon lisättiin glyserolia (lopullinen konsentraatio 14 % (v/v)) ja suspensio jaettiin 200 μΙ:η eriin. Kompetentit E. coli TOP 10 F' -solut pakastettiin nes-30 tetypessä ja säilytettiin -70 °C:ssa.
··# • t • · ··· . F. Kompetenttien Escherichia coli TOP 10 F' -solujen transformointi ja sellaisten "i.: kloonien valitseminen, jotka sisältävät poron BMP-3c:n • · • · M» :V: 35 Kompetentit Escherichia coli TOP 10 F' -solut sulatettiin jäähauteessa 15 minuutin
·:··: ajan. 20 μΙ ligaatioseosta (kuvattu edellä) lisättiin 100 pl:aan TCM-liuosta (10 mM
Tris-HCI, 10 mM CaCI2, 10 mM MgCI2, pH 7,0) ja sekoitettiin 200 μΙ:η kanssa kompetentteja E. coli -soluja. Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia ennen läm- 24 118736 pöshokkia (43 °C, 3 minuuttia). Lämpökäsittelyn jälkeen lisättiin 800 pl LB-kasvatuslientä ja solujen annettiin elpyä 37 °C:ssa 30 minuuttia. Transformoidut solut kerättiin sentrifugoimalla täydellä nopeudella 2 minuutin ajan ja suspendoitiin 30 pl:aan kasvatuslientä. Solususpensio maljattiin kahdelle LB-maljalle, jotka si-5 söisivät 25 pg/ml ampisilliinia, 1 mmol IPTG (isopropyyli-p-D-tiogalaktopyranosidi) ja 2,4 nmol X-gal (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli^-D-galaktosidi) ja soluja kasvatettiin maljoilla yön yli 37 °C:ssa. Positiiviset kloonit havaittiin siitä, että ne olivat väriltään valkoisia IacZ-geenin α-komplementaation johdosta. Menetelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti kirjassa: Sambrook ja Russel (2001) Molecular Cloning, Cold 10 Spring Harbor Laboratory Press, New York.
G. pGEMrd3c-plasmidien eristäminen ja cDNA-inserttien sekvensointi
Plasmidit eristettiin käyttäen Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System 15 -pakkausta (Promega) ja puhdistettiin lisäksi saostamalia etanolilla. cDNAin identiteetti varmistettiin sekvensoimalla ABI Prism -laitteella (Perkin-Elmer Corporation). Sekvensointireaktio suoritettiin käyttäen DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit -pakkausta (Amersham Pharmacia Biotech) ja Mastercycler Personel PCR -laitetta (Eppendorf). Sekvensoinnissa käytettävät PCR-alukkeet olivat (5’-20 TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’) ja (3’-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-5’) ja käytetty ohjelma: 25 sykliä denaturaa-, .1, tio 94 °C, 30 sekuntia, alukkeiden liittäminen 50 °C, 15 sekuntia, ketjun pidentämi- ·“1, nen 60 °C. Monistetut PCR-tuotteet saostettiin etanolilla. 10 pliaan reaktioseosta "1 ! lisättiin 1 pl 1,5 M Na-asetaatti-250 mM EDTA-puskuria ja 95-100 % etanolia niin / / 25 paljon, että etanolin lopullinen konsentraatio oli 75 %. Saostumisen annettiin ta- • · · ;’·/ pahtua jäähauteessa 7 minuutin ajan ja sen jälkeen seosta sentrifugoitiin 20 mi- nuuttia. Supernatantti heitettiin pois ja pelletti pestiin huoneenlämmössä 125 piillä 70 % etanolia. Seos sentrifugoitiin pikaisesti ja pesussa käytetty etanoli poistettiin niin tehokkaasti kuin mahdollista. Pelletti kuivattiin 37 °C:ssa muutaman minuutin 30 ajan, kunnes kaikki etanoli oli haihtunut. ABI Prism -laitteisto oli Oulun yliopiston lääketieteellisen biokemian ja molekyylibiologian laitoksella ja varsinainen sekven- ··1 . sointi suoritettiin siellä. Kuvassa 6 on esitetty osa poron BMP-3c:n cDNA- molekyylin nukleotidi- ja aminohapposekvenssistä.
• · • 1 ··· • · « « · ♦ · · « · · 25 118736
Esimerkki 2. Poron rekombinantin BMP-3c:n kypsän osan ekspressio Escherichia coli TOP 10 F', Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -soluissa A. Poron BMP-3c:n kypsän osan monistaminen ekspressiovektoria varten 5
Poron BMP-3c:n kypsä osa monistettiin pGEMrd3c/142-plasmidista PCR-menetelmällä käyttäen homologisia alukkeita (5’-GGATCCGAGGAAGAAGGGCCAGGATGTTTTC-3’) ja (3’-AAGCTTTTGGCAGGCACAGGTCTCCAC-5’) (katso esimerkki 2 osa B). En-10 simmäisen alukkeen 5’-päässä oli tunnistuskohta Bam Hl -restriktioentsyymille ja toisen alukkeen 3’-päissä oli tunnistuskohta Hind III -entsyymille.
50 μΙ:η reaktioseos sisälsi pGEMrd3c/142-plasmidin (0,05 pg) ja molempien aluk-keiden (40 pmol) lisäksi 0,4 mM dNTP:itä (PCR Core Kit, Roche) ja 0,7 U/μΙ Ex-15 pand High Fidelity -entsyymiseosta (thermostabiili Taq-polymeraasi + oikolukeva polymeraasi, Roche) ja Expand High Fidelity -puskuria, joka sisälsi MgCI2 (Roche). PCR-reaktio tehtiin Mastercycler Personel -laitteessa (Eppendorf) seuraavan ohjelman mukaisesti: alkudenaturaatio 94 °C, 4 minuuttia, ja seuraavat 25 sykliä: de-naturaatio 94 °C, 1 minuutti, alukkeiden liittäminen 55 °C, 1 minuutti, DNA-ketjujen 20 pidentäminen 72 °C, 2 minuuttia. Loppuekstensio suoritettiin 72 °C:ssa 10 minuuttia. PCR-tuote puhdistettiin PCR-reaktioseoksesta käyttäen Wizard® PCR Preps . .·. DNA Purification System -pakkausta (Promega) ja se ligatoitiin pGEM-T^-vektoriin.
Syntynyttä uutta plasmidia, joka sisälsi poron BMP-3c:n kypsän osan, kutsuttiin i nimellä pGEMrd3c/138 (kuva 1).
’’5 25 : B. Poron BMP-3c:n kypsän osan subkioonaaminen pGEM-T®-vektorista ekspres- : siovektoriin pTrcHis 2A (Invitrogen) ja transformointi kompetentteihin Escherichia coli TOP 10 F' -soluihin 30 Poron BMP-3c:n kypsän osan subkloonaminen pGEMrd3c/138-vektorista eks-pressiovektoriin pTrcHis 2A (kuva 2) toteutettiin irrottamalla kypsä osa ··· . \ pGEMrd3c/138-vektorista Bam Hl ja Hind III -restriktioentsyymeillä ja ligatoimalla
insertti pTrcHis 2A -vektoriin, joka oli digestoitu samoilla entsyymeillä. !»·* pGEMrd3c/138 ja pTrcHis 2A -vektorien (1 pg) digestio Bam Hl (Roche) ja Hind III
;Y: 35 (Roche) -entsyymeillä suoritettiin 10 pl:ssa 10 mM Tris-HCI, 10 mM NaCI, 5 mM
·:··: MgCb, 1 mM 2-merkaptoetanoli, pH 8,0 (SuRE/Cut B, Roche) käyttäen 1 U/μΙ ku takin restriktioentsyymiä. Reaktion annettiin tapahtua 1,5 tuntia 37 °C:ssa, jonka jälkeen restriktioentsyymit inaktivoitiin 65 °C:ssa 20 minuutin ajan ja pakastettiin 26 118736 -20 °C:ssa. Ligaatio (ligaasin pitoisuus 0,1 U/μΙ) suoritettiin 2X Rapid Ligation Buffer -puskurissa (tullut pGEM-T®-vektorin, Promega, mukana) +16 °C vesihauteessa, jonka annettiin hitaasti jäähtyä + 4 °C:seen yön aikana.
5 Uusi konstrukti tarkistettiin sekvensoimalla (menetelmä on kuvattu esimerkissä 1, osassa G) käyttäen alukkeita: (5’-AGAGGTATATATTAATGTATCG -3’) ja (3’-ATGGTCGACGGCGCTATTCAG-5’). Ekspressiovektoria, joka sisälsi pTrcHis 2A:n ja poron BMP-3c:n kypsän osan cDNA.n, kutsuttiin nimellä pTrcrd3c (kuva 2). pTrcrd3c transformoitiin kompetentteihin Escherichia coli TOP 10 F' -soluihin, ku-10 ten on kuvattu esimerkissä 1, osassa F.
C. Poron BMP-3c:n kypsän osan Uittaminen pET22b(+) (Novagen) -ekspressiovektoriin ja transformoiminen kompetentteihin Escherichia coli Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -soluihin 15
Poron BMP-3c:n kypsän osan subkloonaaminen ekspressiovektoriin pET22b(+) (Novagen) (kuva 3) suoritettiin, kuten on kuvattu edellä (katso esimerkki 2 osa B).
Syntynyt uusi plasmidi, joka sisälsi pET22b(+)-vektorin ja siihen ligatoidun poron BMP-3c:n kypsän osan cDNA:n, tarkistettiin sekvensoimalla käyttäen alukkeita 20 (5’-GGATCCGAGGAAGAAGGGCCAGGATGTTTTC-3’) ja (3’-CGCAAGC I i i IGGCAGGCACAGGTCTCCAC-5’) (katso menetelmä, joka on : kuvattu esimerkissä 1 osassa G) ja plasmidia kutsuttiin nimellä pETrd3c (kuva 3).
: Kompetentit Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -solut transformoitiin noudattaen : valmistajan (Novagen) antamia ohjeita.
. * 25 • · · • · · |‘V D. Poron BMP-3c:n kypsän osan rekombinanttiproteiinin ekspressio Escherichia coli -kasvustoissa ja solujen kerääminen • · • ·
Mf E. coli -solut [TOP 10, Origami B (DE3) tai Rosetta (DE3)], jotka sisälsivät joko 30 pTrcrd3c- tai pETrd3c-plasmidin, kasvatettiin yön yli 50 ml:ssa SOB- • · · kasvatuslientä, joka sisälsi ampisilliiniä (100 pg/ml) ja Rosetta (DE3) -solut myös : .·. kloramfenikolia (34 pg/ml), +37 °C:ssa ravistellen (225 rpm). Seuraavana aamuna [···.’ 1200 ml:aan SOB-kasvatusmediumia, joka sisälsi edellä mainitut antibiootit, lisät- • · tiin 24 ml yön yli kasvanutta kasvustoa ja kasvatusta jatkettiin +37 °C:ssa ravistel- • » v.: 35 Ien (225 rpm) kunnes ODeoo oli 0,6, jolloin solut ovat logaritmisen kasvuvaiheen m puolivälin paikkeilla. Tässä vaiheessa rekombinanttiproteiinin indusointi suoritettiin lisäämällä IPTG:tä siten, että lopullinen konsentraatio oli 1 mM. Induktion jälkeen soluja kasvatettiin neljästä viiteen tuntiin, jonka jälkeen ne kerättiin sentrifugoimal- .«*» · · . ·- · · il.--.· · 118736 27 la. Nukleotidisekvensseistä johdetut rekombinantti-proteiinien aminohapposekvenssit on esitetty kuvassa 4 (pTrcrd3c) ja kuvassa 5 (pETrd3c).
Esimerkki 3: Poron BMP-3c:n kypsän osan rekombinanttiproteiinin puhdis-5 taminen ja laskostaminen A. Inkluusiokappaleiden peseminen
Kerätyt solut suspendoitiin ravistellen 50 mM Na-fosfaattipuskuriin (pH 7,0; 220 g 10 soluja/1 litra puskuria). Suspensio sentrifugoitiin 5500 x g 45 minuuttia +4 °C:ssa.
Pesu Na-fosfaattiliuoksella toistettiin kerran. Solupelletti punnittiin ja säilytettiin -70 °C:ssa yön yli. Pakastettu pelletti, jossa oli osittain särkyneitä soluja, sulatettiin ja suspendoitiin (25 mg/ml) 20 mM Tris-HCI -puskuriin, pH 8,5, joka sisälsi 0,5 mM EDTA:ta, ravistellen 2 minuuttia. Suspensio sentrifugoitiin 26 000 x g 40 minuutin 15 ajan +4 °C:ssa ja Tris-HCI-EDTA-pesu toistettiin kerran. Saatu solupelletti punnittiin. Viimeisen pesun jälkeen solupelletti suspendoitiin (35 mg/ml) ravistellen (200 rpm/minuutti, yön yli, huoneenlämmössä) lyysipuskuriin (6 M GuHCI - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI, pH 8,0), jolloin kaikki loput kokonaiset E. coli -solut särkyvät ja inkluusiokappaleet saadaan liukoisiksi. Suspensio sentrifugoidaan (26,000 x g, 20 45 minuuttia, huoneenlämmössä), pelletti heitetään pois, jolloin rekombinanttipro- teiini jää liukoisena supernatanttiin. Lopuksi supernatantti suodatetaan 45 pm suo- ; ·*; dattimen läpi, jotta päästään varmasti eroon kaikista solurippeistä.
··· • · • · · « · · !\ j B. Saostus isoelektrisessä pisteessä (pl) • ·· 25 • · t TV Poron BMP-3c-rekombinanttiproteiini, jota ekspressoitiin pETrd3c-plasmidista Es- • · V.: cherichia coli Origami B (DE3) tai Rosetta (DE3) -soluissa, saostettiin isoelektri- * · *···’ sessä pisteessään pH 9,54 (pETrd3c/138) ja pH 6,35 (pETrd3c/110). Isoelektrinen piste määritettiin tietokonelaskennan avulla poron rekombinantin BMP-3c:n ami- 30 nohapposekvenssistä (kuva 5). Sakka kerättiin sentrifugoimalla (12 000 x g, 30 ·**"·* min, huoneenlämmössä) ja suspendoitiin lyysipuskuriin (6 M GuHCI - 20 mM Na- : !·. fosfaatti - 0,5 M NaCI; pH 8,0).
• · · *·· i t·· • · ’:' * C. Immobilisoitu metalliaffiniteettikromatografia (IMAC) \0 35
·;**: IMAC-menetelmässä käytettiin valmiiksi pakattuja HiTrap Chelating HP
-affiniteettipylväitä (Amersham Pharmacia Biotech). Pylväsmatriksit varattiin Co2+-,
Cu2+- tai Ni2+- ioneilla valmistajan ohjeen mukaan. Suodatettu, pesujen jälkeinen 28 118736 supernatantti saatettiin pylvään pintaan pylväsmatriksin varaamisen jälkeen. Suurin osa epäpuhtauksista poistettiin pesemällä pylvästä lyysipuskurilla (6 M GuHCI -20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI, pH 8,0) 5-10-kertaisella pylvään tilavuudella. Toinen pesukerta, määrältään 5-10-kertainen pylvään tilavuus, suoritettiin lyysi-5 puskurilla, jossa 6 M GuHCI:n tilalla oli 6 M urea. Poron rekombinantti BMP-3c eluoitiin HiTrap-pylväästä käyttäen pH-gradienttia pH 7,0:sta pH 4,0:aan (6M urea - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI). Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla ja puhtaimmat rdBMP-3c-rekombinanttia sisältävät fraktiot yhdistettiin laskostamista varten.
10 D. Rekombinantti-rdBMP-3c:n kypsän osan laskostaminen BMP-3c-fraktiot, jotka oli analysoitu SDS-PAGE:lla, yhdistettiin ja dialysoitiin vettä vastaan. Dialyysissä saostunut proteiini kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin 15 inkuboiden kaksi tuntia 25 °C:ssa 8 M urea - 0,1 M Tris/HCI, pH 8 -liuoksessa, joka lisäksi sisälsi 100 mM DTT, 1 mM EDTA. pH laskettiin pH:hon 3-4 lisäämällä tipoit-
tain 1 M HCI-liuosta. DTT poistettiin täysin dialysoimalla kaksi tuntia 25 °C:ssa 6 M
urea -10 mM HCI -liuosta vastaan. Dialyysiä jatkettiin +4 °C:ssa yön yli 6 M ureaa vastaan. Rekombinantin rdBMP-3c:n laskostaminen suoritettiin kaksi-vaiheisessa
20 dialyysissä. Ensimmäinen dialyysiliuos oli 20 mM Tris-HCI - 150 mM NaCI - 3 M
urea (pH 7,5). Dialyysipuskuri vaihdettiin ainakin kuusi kertaa kahden tai kolmen : päivän aikana. Toisessa vaiheessa kaikki suolat poistettiin perinpohjaisella vesi- * · · : .·. dialyysillä. Näyte, josta suolat oli poistettu, sentrifugoitiin ja pelletti kuivattiin lyofi- .·!: lisoimalla. Tässä vaiheessa BMP-3c:n puhtausaste oli 75 % ja se laskostui 50- • · · .*./ 25 prosenttisesti määritettynä ei-pelkistävällä SDS-PAGE:lla. Poron rekombinantin !'*.* BMP-3c:n laskostuneen dimeerin määrä kvantitoitiin densitometrillä Coomassie • · · **; I,: Brilliant Blue -värjätyistä geeleistä.
• · • · ··*
Esimerkki 4. Poron BMP-3c:n kypsän osan rekombinanttiproteiinin biologi-30 sen aktiivisuuden testaaminen ··· • v • · ··* : !·. Lyofilisoidun poron BMP-3c-rekombinanttiproteiinin biologinen aktiivisuus testattiin • · · *."/ implantoimalla hiiren reisilihaksen taskuun 1 mg, 3 mg tai 5 mg rekombinanttipro- teiinia absorboituna Lyostrypt®-kollageenihuopaan tai punnittuna gelatiinikapseliin.
• · v.: 35 Kontrollina toimi BSA. Takajalat röntgenkuvattiin ja implantaatiokohdat leikeltiin ja *:·*: fiksattiin 10 % neutraalissa formaliiniliuoksessa. Fiksatut implantit leikattiin 7 pm:n leikkeiksi ja värjättiin hematoksyliini-eosiiniliuoksella. Leikkeitä tarkasteltiin valo-mikroskoopilla. Uuden luun muodostus evaluoitiin röntgenkuvauksen avulla mää- 29 118736 rittämällä pinta-ala ja optinen tiheys. Röntgenkuvat siirrettiin tietokoneelle käyttäen optista skanneria (HP Scan Jet, Hewett-Packard, USA). Ektooppisen ja ortotoop-pisen uuden luun muodostuminen arvioitiin röntgenkuvissa nähtävän kalsifioidun kudoksen pinta-alan suhteen (mm2) käyttäen Scion Image Beta 4.02 (Scion Corp., 5 USA) -ohjelmaa. Tietyn alueen keskimääräinen optinen tiheys (mmAl) mitattiin samalla laitteella. Optisen tiheyden kalibrointi suoritettiin käyttäen alumiinista valmistettua levyä (AI), jossa oli 0,25 mmAl askelmat, ja jonka kalibroitu tiheys antoi vaihtelualueen 4 mmAl asti.
10 Tulokset
Poron BMP-3c:n osittaisen cDNA:n kloonaus
Nukleotidisekvenssi, joka saatiin ABI Prism -sekvensointireaktioista, analysoitiin 15 tietokoneen avulla ja verrattiin tunnettuihin BMP-sekvensseihin. Uusi kloonattu cDNA osoittautui homologiavertailujen perusteella kaikkein homologisimmaksi poron BMP-3b:n (nukleotidihomologia 96 % ja aminohappohomologia 95 %) ja ihmisen BMP-3b:n (aminohappohomologia 93 %) kanssa, taulukko 1. BMP-3c-proteiinin homologia verrattuna muihin nisäkkäiden BMP-3-proteiineihin oli korkein 20 ihmisen BMP-3:n kanssa (aminohappohomologia 91 %), taulukko 2.
: Poron BMP-3c:n kypsän osan ekspressointi ♦ ·· • · • · • · · · Ensiksikin, kaksi pituudeltaan erilaista poron BMP-3c:n kypsää osaa liitettiin * ·· 25 pTrcHis2A-vektoriin ja E. coHTOP 10 -solut transformoitiin saaduilla pTrcrd3c/138- i*Y ja pTrcrd3c/110-vektoreilla. Rekombinanttiproteiinin tuotanto indusoitiin IPTG.IIä.
• · » l‘\/ Rekombinanttiproteiinin tuotto varmistettiin SDS-PAGE:lla, mutta kumpikaan vek- ’···' toreista ei indusoitunut. Tämän arveltiin johtuvan monista sellaisista rdBMP-3c:n kodoneista, jotka ovat harvoin käytössä E. colissa. On myös mahdollista, että in-30 dusoitumattomuus johtunee jossain määrin korkeasta GC-pitoisuudesta molempi-:**’.* en rdBMP-3c-proteiinia koodaavien alueiden alussa (BMP-3c/138:n ensimmäisten ·)·. 10 kodonin GC-pitoisuus on 53 % ja BMP-3C/110:n ensimmäisten 10 kodonin GC- • i · "*/ pitoisuus on 63 %).
• * ··» • 0.: 35 Näiden syiden vuoksi päätettiin kokeilla toisenlaista vektorisysteemiä ja erilaista E.
*:··: coli -kantaa. pET22b(+) (Novagen), jossa on His6-tag ja pelB-johtoalue, valittiin uudeksi ekspressiovektoriksi ja Rosetta (DE3) ja Origami B (DE3) uusiksi E. coli -kannoiksi. Molemmat poron BMP-3c-cDNA-molekyylit kloonattiin 30 118736 pET22b(+)-vektoriin ja uusia plasmideita kutsuttiin nimillä pETrd3c/138 ja pETrd3c/110, ja sekä Rosetta (DE3) että Origami B (DE3) -solut transformoitiin näillä vektoreilla. Analyysit SDS-PAGE:lla osoittivat rdBMP-3c-proteiinin ekspres-soituvan (kuva 8). Ekspressiokokeiden perusteella pääasiassa Rosetta (DE3) -5 soluja, jotka sisälsivät pETrd3c-vektorit, käytettiin tuottamaan rdBMP-3c-proteiineja.
rdBMP-3c-proteiinien puhdistaminen 10 Poron rdBMP-3c-rekombinanttiproteiineja tuotettiin E colissa. Pesujen, isoelektri-seen pisteeseen perustuvan saostuksen ja inkluusiokappaleiden solubilisaation jälkeen poron rekombinantin rdBMP-3c:n pitoisuus oli 85 %.
Seuraava puhdistusvaihe oli immobilisoitu metalliaffiniteettikromatografia (IMAC). 15 Näyte eluoitiin pylväästä käyttäen pH-gradienttia ja rdBMP-3c-proteiinin puhtaus oli vähintään 75 % määritettynä SDS-PAGE:lla (kuva 8). Eristetyn rdBMP-3c/138-proteiinin kypsän osan molekyylipaino oli 20 400 Da ja rdBMP-3c/110:n 17 100 Da määritettynä elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa.
20 rdBMP-3c/138- ja rdBMP-3c/110-proteiinien laskostuminen ja aktiivisuuden tes-. taaminen • · a • · t · 1 • · · j Denaturoituneiden rdBMP-3c-proteiinien in vitro -laskostuminen kvantitoitiin mit- « a · .1 / 25 taamalla laskostunut dimeeri Coomassie Brilliant Blue -värjätyiltä geeleiltä densi- i1Y tometrisesti. Ei-pelkistävistä SDS-PAGE-geeleistä määritetty proteiinin laskostu- a a a v 1 minen oli 50 %.
• a a a a a a • aa rdBMP-3c-proteiinin osteoinduktiivinen aktiivisuus lisääntyi annoskokoa suurennet- a 30 taessa aina 5 mg:aan saakka (taulukko 3). Verrattaessa rdBMP-3c/138:n ja rdBMP-3c/110:n biologista aktiivisuutta toisiinsa, vaikuttaa siltä, että rdBMP-: ). 3c/110 oli tehokkaampi luun muodostuksen indusoija.
• a · • aa a a1 a a Tämä keksintö on kuvattu korostaen joitakin edullisia toteutusmuotoja ja sovelluk-v 35 siä. Kuitenkin alan ammattilaisille on ilmeistä, että variaatioita esiintuoduista toteu-*;1·: tusmuodoista voidaan tehdä ja käyttää ja, että keksintöä voidaan käyttää seuraavi- en vaatimusten puitteissa muullakin tavalla kuin mitä on tässä täsmällisesti esitetty.
31 118736
SEQUENCE LISTING
<110> BBS-Bioactive Bone Substitutes Oy 5 <120> Bone morphogenetic proteins <130> OP100919 <160> 1 10 <170> Patentin version 3.1 <210> 1 <211> 138
15 <212> PRT
<213> Rangifer tarandus tarandus <400> 1 20 Arg Lys Lys Gly Gin Asp Val Phe Met Ala Ser Ser Gin Val Leu Asp 15 10 15
Phe Asp Glu Lys Thr Met Gin Lys Ala Arg Lys Lys Gin Trp Asp Glu 20 25 30 25
Pro Arg Val Cys Ser Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala Asp lie 35 40 45
Gly Trp Asn Glu Trp lie lie Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala Tyr Tyr 30 50 55 60
Cys Ser Gly Ala Cys Glu phe Pro Met Pro Lys Met Val Arg Pro Ser 65 70 75 80 35 Asn His Ala Thr lie Gin Ser lie Val Arg Ala Val Gly lie Val Pro 85 90 95 • ! ί ί Gly Ile Pro Glu Pro Cys Cys Val Pro Asp Lys Met Ser Ser Leu Gly . ** 100 105 110 :.:: 40
Val Leu Phe Leu Asp Glu Asn Arg Asn Val Val Leu Lys Val Tyr Pro !.1.i 115 120 125 • · • ϊ : Asn Met Ser Val Glu Thr Cys Ala Cys Gin . 45 130 135
• · I
• 9 · ·1· 9 ··· • 9 • · • 9 9 • · · • 9 · ·1· ··· • · • · *99 • • 9 • ♦ 9 • · · *·« · *99 • · • · • 9· · * 1 · • 9 · • « 9 9 9

Claims (19)

118736
1. Eristetty luun morfogeneettinen proteiini 3 (BMP-3), tunnettu siitä, että se sisältää konsensussekvenssin: 5 r-k-k-q-w-d-e-p-r-v/n-c-s/a-r-r-y-l-k-v-d-f-a-d-i-g-w-n/s-e-w-i-i-s-p-k-s-f-d-a- Y-Y-C-S-G-A-C-E/Q-F-P-M-P-K-M-V/L-R/K-P-S-N-H-A-T-I-Q-S-I-V-R-A-V-G-I/V-V-P/S-G- I-P-E-P-C-C-V.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen luun morfogeneettinen proteiini 3, tunnettu 10 siitä, että se sisältää SEQ ID NO: 1 :n aminohapot 6-104.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen luun morfogeneettinen proteiini 3, tunnettu siitä, että se sisältää SEQ ID NO: 1 :n aminohapot 26-104.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen luun morfogeneettinen proteiini 3, tunnettu siitä, että se sisältää SEQ ID NO: 1 :n aminohapot 6-109.
5. Eristetty luun morfogeneettinen proteiini 3, tunnettu siitä, että se sisältää SEQ ID NO: 1 :n aminohapposekvenssin. 20
6. Eristetty DNA-molekyyli, tunnettu siltä, että se koodaa jonkin edellisen pa- . .·. tenttivaatimuksen mukaista luun morfogeneettistä proteiinia. ··♦ • · • · · • ♦ ·
7. Nukleotidivektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 6 mu- / " 25 kaisen eristetyn DNA-molekyylin.
• · · • · · ··· « • · • · · : 8. Rekombinantti-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 7 mukaisen nukleotidivektorin.
9. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaa- : timuksen 1-5 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin. m • · ♦ · · M*
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, • · että se sisältää kyseistä luun morfogeneettistä proteiinia homodimeerinä, tai hete- :T: 35 rodimeerinä jonkin toisen luun morfogeneettisen proteiinin kanssa. • · • · · • · · • · 118736
11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi jonkin muun luun morfogeneettisen proteiinin, epider-maalisen kasvutekijän, fibroblastisen kasvutekijän tai transformoivan kasvutekijän.
12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin käyttö valmistettaessa lääkeainetta, jolla hoidetaan luuhun, rustoon, jänteeseen tai hampaisiin liittyviä häiriöitä, joissa niiden regeneraatio, korjaus tai kasvu on toivottavaa.
13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin käyttö valmistettaessa lääkeainetta, jolla hoidetaan syöpää, fibromyalgiaa, psoriasista ja muita dermatologisia häiriöitä, ja reumaattisia vaivoja.
14. Osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaati-15 muksen 1-5 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että se sisältää kyseistä luun morfogeneettistä proteiinia homodimeerinä, tai heterodi-meerinä jonkin toisen luun morfogeneettisen proteiinin kanssa. 20
16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, . että se lisäksi sisältää jonkun toisen luun morfogeneettisen proteiinin, epidermaali- • · · sen kasvutekijän, fibroblastisen kasvutekijän tai transformoivan kasvutekijän. • · · ·· · ***· j // 25
17. Jonkin patenttivaatimuksen 14-16 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu · · |*:7 siitä, että se sisältää biologisesti yhteensopivan matriksin. • * · • · · ··· · • · ·
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että kyseinen biologisesti yhteensopiva matriksi sisältää kalsiumfosfaattia, karboksime-30 tyyliselluloosaa tai kollageenia tai näiden yhdistelmiä. ··· • « • · Λ
19. Menetelmä luun, ruston, jänteen tai hampaan luun muodostuksen indusoimi- • · · seksi in vitro, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisella luun *···* morfogeneettisellä proteiinilla käsitellään kyseistä luuta, rustoa, jännettä tai ham- 35 masta. • · • * ♦ * ·· • · 118736
FI20055256A 2005-05-27 2005-05-27 Luun morfogeneettinen proteiini FI118736B (fi)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20055256A FI118736B (fi) 2005-05-27 2005-05-27 Luun morfogeneettinen proteiini
EP06743556A EP1885751B1 (en) 2005-05-27 2006-05-26 Bone morphogenetic protein 6 containing a heparin binding site and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof
PCT/FI2006/050214 WO2006125868A1 (en) 2005-05-27 2006-05-26 Bone morphogenetic proteins containing a heparin binding site and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof
US11/921,104 US7851435B2 (en) 2005-05-27 2006-05-26 Bone morphogenetic protein 3 and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof
US11/921,069 US7910552B2 (en) 2005-05-27 2006-05-26 Bone morphogenetic proteins containing a heparin binding site and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof
EP06725969.7A EP1885749B1 (en) 2005-05-27 2006-05-26 Bone morphogenetic protein 3 and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof
AT06743556T ATE533781T1 (de) 2005-05-27 2006-05-26 Heparin-bindungsstelle enthaltendes knochenmorphogenetisches protein 6 und osteogene vorrichtungen und pharmazeutische produkte, die diese enthalten
ES06725969.7T ES2642591T3 (es) 2005-05-27 2006-05-26 Proteína morfogenética ósea 3 y dispositivos osteogénicos y productos farmacéuticos que contienen la misma
PCT/FI2006/050212 WO2006125866A1 (en) 2005-05-27 2006-05-26 Bone morphogenetic protein 3 and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20055256 2005-05-27
FI20055256A FI118736B (fi) 2005-05-27 2005-05-27 Luun morfogeneettinen proteiini

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20055256A0 FI20055256A0 (fi) 2005-05-27
FI20055256L FI20055256L (fi) 2006-11-28
FI118736B true FI118736B (fi) 2008-02-29

Family

ID=34630191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20055256A FI118736B (fi) 2005-05-27 2005-05-27 Luun morfogeneettinen proteiini

Country Status (1)

Country Link
FI (1) FI118736B (fi)

Also Published As

Publication number Publication date
FI20055256L (fi) 2006-11-28
FI20055256A0 (fi) 2005-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK172503B1 (da) Gen, som koder for BMP-3-protein, vektor indeholdende et sådant gen, celle transformeret med en sådan vektor, BMP-3-protein
EP0646022B1 (en) Prosthetic devices having enhanced osteogenic properties
JPH04505151A (ja) 骨形成因子
WO1996033215A1 (fr) Proteine nouvelle et son procede de fabrication
HU218845B (hu) Új növekedési/differenciáló faktorokat kódoló DNS-szekvenciák, e faktorokat tartalmazó gyógyszerkészítmények, DNS-molekulák, gazdaszervezetek, antitestek, diagnosztikai eljárások
JPH09501305A (ja) Ｂｍｐ−１０組成物
JPH06113854A (ja) 血管内皮細胞増殖因子ｃサブユニット
WO1994001557A1 (en) Bone formation-inducing protein
JP2003506086A (ja) ＴＧＦ−βファミリーの単量体タンパク質
JP4272357B2 (ja) 新規な骨誘導活性を有する単量体蛋白質およびそれらからなる骨・軟骨疾患の予防および治療薬
JP2004514441A (ja) 組み換えｂｍｐ−２の製造
AU2006314713A1 (en) High activity growth factor mutants
EP1885750B1 (en) Bone morphogenetic protein 4 and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof
US7910552B2 (en) Bone morphogenetic proteins containing a heparin binding site and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof
FI118736B (fi) Luun morfogeneettinen proteiini
EP1885749B1 (en) Bone morphogenetic protein 3 and osteogenic devices and pharmaceutical products containing thereof
CA2600951A1 (en) Growth factor mutants with improved biological activity
FI119373B (fi) Luun proteiineja
WO2000021998A1 (en) Bone morphogenetic protein antagonist based on the mature protein
FI121070B (fi) Luun morfogeneettinen proteiini 6, sitä koodaava DNA, nukleotidivektori, rekombinantti isäntäsolu, farmaseuttinen koostumus ja osteogeeninen väline
JP3527760B2 (ja) 新規骨形成誘導蛋白質、それをコードするｄｎａ及び該蛋白質の製造方法並びにそれを有効成分とする骨形成誘導剤
JP3504259B2 (ja) 骨誘導組成物
CN100448890C (zh) 来源于mp－52蛋白质的新型蛋白质及其制备方法和用途
JP2009045142A (ja) 生体内にて基材周囲に骨形成を誘導するための基材処理方法
JPH0584081A (ja) マウス骨肉腫由来骨形成蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118736

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed