JPH06113854A - 血管内皮細胞増殖因子ｃサブユニット - Google Patents
血管内皮細胞増殖因子ｃサブユニットInfo
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- JPH06113854A JPH06113854A JP4121014A JP12101492A JPH06113854A JP H06113854 A JPH06113854 A JP H06113854A JP 4121014 A JP4121014 A JP 4121014A JP 12101492 A JP12101492 A JP 12101492A JP H06113854 A JPH06113854 A JP H06113854A
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】
【構成】ヒト血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットＤＮ
ＡをＰＣＲで調製した。このＤＮＡはヘテロダイマーま
たはホモダイマーとして存在することのできる蛋白質を
コードしている。 【効果】このＤＮＡを含むベクターで形質転換させた培
養細胞が産生する蛋白質はほ乳類血菅内皮細胞のマイト
ジェンであり、血管新生や修復の促進に有用である。こ
の増殖因子は組織の修復促進にも有用である。
ＡをＰＣＲで調製した。このＤＮＡはヘテロダイマーま
たはホモダイマーとして存在することのできる蛋白質を
コードしている。 【効果】このＤＮＡを含むベクターで形質転換させた培
養細胞が産生する蛋白質はほ乳類血菅内皮細胞のマイト
ジェンであり、血管新生や修復の促進に有用である。こ
の増殖因子は組織の修復促進にも有用である。
Description
【０００１】血管内皮細胞に対してみかけ上限定的特異
性を有する新規クラスの細胞由来ダイマー分裂促進因子
が最近確認され、一般に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）
と命名された。分裂促進因子はラットグリオーム細胞の
ならし（conditioned）増殖培地［コーンら、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンスＵＳＡ、第８７巻、第１３２３-１３２７頁、１９
９０年（Conn et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８
７：１３２３−１３２７（１９９０））］、ウシ下垂体
濾胞星状細胞のならし増殖培地［フェララ及びヘンゼ
ル、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーションズ、第１６１巻、第８５１−
８５８頁、１９８９年（Ferrara and Henzel, Biochem.
Biophys.Res. Comm., １６１：８５１−８５８（１９
８９））及びゴスポダロウィック（Gospodarowicz）
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８６巻、第７３１１−７
３１５頁、１９８９年］から精製された。非還元分子量
４３〜５１ｋＤａ及び還元量２３−２９ｋＤａのマウス
ニューロブラストーマ細胞系ＮＢ４１から単離された内
皮細胞増殖因子はレビーら、グロウス・ファクターズ、
第２巻、第９−１９頁、１９８９年［Ｌevy et al., Gr
owth Factors, ２：９−１９（１９８９）］で記載され
ている。コノリー（Connolly）ら［ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第
２６４巻、第２００１７−２００２４頁、１９８９年；
ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーショ
ン（J. Clin. Invest.）、第８４巻、第１４７０-１４
７８頁、１９８９年］ではヒト血管透過因子について記
載するが、これはインビトロで血管内皮細胞を刺激して
分裂させ、治癒ウサギ骨移植片又はラット角膜に投与さ
れた場合に新しい血管の増殖を促進する。内皮細胞増殖
因子はプローエトら、ＥＭＢＯジャーナル、第８巻、第
３８０１−３８０６頁、１９８９年［Ｐlouet et al.,
ＥＭＢＯ Journal, ８：３８０１−３８０６（１９８
９）］によりＡtＴ-２０下垂体細胞系のならし培地から
精製された。その増殖因子は分子量２３ｋＤａのサブユ
ニットから構成されるヘテロダイマーであった。ルーン
グ（Leung）ら［サイエンス（Science）、第２４６巻、
第１３０６−１３０９頁、１９８９年］、ケック（Kec
k）ら（サイエンス、第２４６巻、第１３０９−１３１
２頁、１９８９年）及びコーンら（プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳ
Ａ、第８７巻、第２６２８−２６３２頁、１９９０年）
は血小板由来増殖因子のＡ及びＢ鎖に相同的であるＶＥ
ＧＦ−ＡについてコードするｃＤＮＡを記載している。
血管内皮増殖因子Ｉ（ＶＥＧＦ−Ｉ、ＶＥＧＦ−ＡＡ）
はみかけ分子量４６ｋＤａのホモダイマーであり、各サ
ブユニットはみかけ分子量２３ｋＤａを有する。ＶＥＧ
Ｆ−Ｉは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、即ち大血管
からの血管内皮細胞の分裂促進因子ではなく結合組織細
胞に関する分裂促進因子と明らかな構造類似性を有して
いる。
性を有する新規クラスの細胞由来ダイマー分裂促進因子
が最近確認され、一般に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）
と命名された。分裂促進因子はラットグリオーム細胞の
ならし（conditioned）増殖培地［コーンら、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンスＵＳＡ、第８７巻、第１３２３-１３２７頁、１９
９０年（Conn et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８
７：１３２３−１３２７（１９９０））］、ウシ下垂体
濾胞星状細胞のならし増殖培地［フェララ及びヘンゼ
ル、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーションズ、第１６１巻、第８５１−
８５８頁、１９８９年（Ferrara and Henzel, Biochem.
Biophys.Res. Comm., １６１：８５１−８５８（１９
８９））及びゴスポダロウィック（Gospodarowicz）
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８６巻、第７３１１−７
３１５頁、１９８９年］から精製された。非還元分子量
４３〜５１ｋＤａ及び還元量２３−２９ｋＤａのマウス
ニューロブラストーマ細胞系ＮＢ４１から単離された内
皮細胞増殖因子はレビーら、グロウス・ファクターズ、
第２巻、第９−１９頁、１９８９年［Ｌevy et al., Gr
owth Factors, ２：９−１９（１９８９）］で記載され
ている。コノリー（Connolly）ら［ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第
２６４巻、第２００１７−２００２４頁、１９８９年；
ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーショ
ン（J. Clin. Invest.）、第８４巻、第１４７０-１４
７８頁、１９８９年］ではヒト血管透過因子について記
載するが、これはインビトロで血管内皮細胞を刺激して
分裂させ、治癒ウサギ骨移植片又はラット角膜に投与さ
れた場合に新しい血管の増殖を促進する。内皮細胞増殖
因子はプローエトら、ＥＭＢＯジャーナル、第８巻、第
３８０１−３８０６頁、１９８９年［Ｐlouet et al.,
ＥＭＢＯ Journal, ８：３８０１−３８０６（１９８
９）］によりＡtＴ-２０下垂体細胞系のならし培地から
精製された。その増殖因子は分子量２３ｋＤａのサブユ
ニットから構成されるヘテロダイマーであった。ルーン
グ（Leung）ら［サイエンス（Science）、第２４６巻、
第１３０６−１３０９頁、１９８９年］、ケック（Kec
k）ら（サイエンス、第２４６巻、第１３０９−１３１
２頁、１９８９年）及びコーンら（プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳ
Ａ、第８７巻、第２６２８−２６３２頁、１９９０年）
は血小板由来増殖因子のＡ及びＢ鎖に相同的であるＶＥ
ＧＦ−ＡについてコードするｃＤＮＡを記載している。
血管内皮増殖因子Ｉ（ＶＥＧＦ−Ｉ、ＶＥＧＦ−ＡＡ）
はみかけ分子量４６ｋＤａのホモダイマーであり、各サ
ブユニットはみかけ分子量２３ｋＤａを有する。ＶＥＧ
Ｆ−Ｉは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、即ち大血管
からの血管内皮細胞の分裂促進因子ではなく結合組織細
胞に関する分裂促進因子と明らかな構造類似性を有して
いる。
【０００２】したがって、他の哺乳動物ＤＮＡにはない
新規な血管内皮増殖因子ＣサブユニットＤＮＡを提供す
ることが本発明の目的である。もう１つの目的はＶＥＧ
Ｆ−Ｃサブユニットモノマー又はダイマーを発現できる
組換え遺伝子を提供することである。もう１つの目的は
ＶＥＧＦ−Ａ又はＢ＋Ｃサブユニットに関するＤＮＡ配
列を含んだベクターについて提供することである。他の
目的はＶＥＧＦ−ＡもしくはＢ＋Ｃ又はＶＥＧＦ−Ｃ単
独に関するＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換された
宿主細胞を提供することである。ＶＥＧＦ−Ｃサブユニ
ットを製造するための組換えプロセスを提供することも
目的である。もう１つの目的はＣサブユニットを含む新
規な血管内皮細胞増殖因子を提供することである。これ
にはヘテロダイマーＡＣ及びＢＣとホモダイマーＣＣを
含む。
新規な血管内皮増殖因子ＣサブユニットＤＮＡを提供す
ることが本発明の目的である。もう１つの目的はＶＥＧ
Ｆ−Ｃサブユニットモノマー又はダイマーを発現できる
組換え遺伝子を提供することである。もう１つの目的は
ＶＥＧＦ−Ａ又はＢ＋Ｃサブユニットに関するＤＮＡ配
列を含んだベクターについて提供することである。他の
目的はＶＥＧＦ−ＡもしくはＢ＋Ｃ又はＶＥＧＦ−Ｃ単
独に関するＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換された
宿主細胞を提供することである。ＶＥＧＦ−Ｃサブユニ
ットを製造するための組換えプロセスを提供することも
目的である。もう１つの目的はＣサブユニットを含む新
規な血管内皮細胞増殖因子を提供することである。これ
にはヘテロダイマーＡＣ及びＢＣとホモダイマーＣＣを
含む。
【０００３】血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットＤＮ
Ａはポリメラーゼ鎖反応技術により製造される。そのＤ
ＮＡはヘテロダイマー又はホモダイマーのいずれかとし
て存在するタンパク質をコードする。そのタンパク質は
哺乳動物血管内皮細胞分裂促進因子であり、それ自体が
血管発育及び修復の促進に関して有用である。この独特
な増殖因子は組織修復の促進にも有用である。
Ａはポリメラーゼ鎖反応技術により製造される。そのＤ
ＮＡはヘテロダイマー又はホモダイマーのいずれかとし
て存在するタンパク質をコードする。そのタンパク質は
哺乳動物血管内皮細胞分裂促進因子であり、それ自体が
血管発育及び修復の促進に関して有用である。この独特
な増殖因子は組織修復の促進にも有用である。
【０００４】本発明はグリオーマ細胞ならし培地から単
離かつ精製された独特な血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧ
Ｆと命名）に関し、これは血管内皮細胞の分裂促進刺激
を示す。グリオーマは脳、脊髄、下垂体後葉腺及び網膜
を含めた中心神経系の間質組織を形成する様々なタイプ
の細胞の１つに由来したあらゆる新生物としてここでは
定義される。その結果、本発明の範囲はあらゆる哺乳動
物組織又は細胞系を含めた他の細胞から単離かつ精製さ
れた独特な増殖因子を含めて考えられる。細胞系として
は格別限定されず、Ｃ６、ｈｓ６８３及びＧＳ−９Ｌの
ようなグリオーマ由来細胞系；Ａ−１７２及びＴ９８Ｇ
のようなグリオブラストーマ；ＩＭＲ−３２及びＳＫ−
Ｎ−ＭＣのようなニューロブラストーマ；Ｈ４のような
ニューログリオーマ；ＸＢ−２のようなテトローマ；Ｕ
−８７ＭＧ及びＵ−３７３ＭＧのようなアストロサイト
ーマ；胎生期癌、非形質転換グリア又はアストロサイト
細胞系及びヒトメジュロブラストーマ系ＴＥ６７１があ
るが、ＧＳ−９Ｌ及びＴＥ６７１が好ましい。ＶＥＧＦ
−ＡＢも存在し、卵巣、心臓及び腎臓を含めたラット組
織から単離できる。ＧＨ３及びＨｓ１９９のような下垂
体前葉腫瘍細胞系も用いてよい。本発明のＶＥＧＦはＶ
ＥＧＦを産生できるあらゆる哺乳動物種から得られると
思われ、これには格別限定されずラット及びヒトを含
む。
離かつ精製された独特な血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧ
Ｆと命名）に関し、これは血管内皮細胞の分裂促進刺激
を示す。グリオーマは脳、脊髄、下垂体後葉腺及び網膜
を含めた中心神経系の間質組織を形成する様々なタイプ
の細胞の１つに由来したあらゆる新生物としてここでは
定義される。その結果、本発明の範囲はあらゆる哺乳動
物組織又は細胞系を含めた他の細胞から単離かつ精製さ
れた独特な増殖因子を含めて考えられる。細胞系として
は格別限定されず、Ｃ６、ｈｓ６８３及びＧＳ−９Ｌの
ようなグリオーマ由来細胞系；Ａ−１７２及びＴ９８Ｇ
のようなグリオブラストーマ；ＩＭＲ−３２及びＳＫ−
Ｎ−ＭＣのようなニューロブラストーマ；Ｈ４のような
ニューログリオーマ；ＸＢ−２のようなテトローマ；Ｕ
−８７ＭＧ及びＵ−３７３ＭＧのようなアストロサイト
ーマ；胎生期癌、非形質転換グリア又はアストロサイト
細胞系及びヒトメジュロブラストーマ系ＴＥ６７１があ
るが、ＧＳ−９Ｌ及びＴＥ６７１が好ましい。ＶＥＧＦ
−ＡＢも存在し、卵巣、心臓及び腎臓を含めたラット組
織から単離できる。ＧＨ３及びＨｓ１９９のような下垂
体前葉腫瘍細胞系も用いてよい。本発明のＶＥＧＦはＶ
ＥＧＦを産生できるあらゆる哺乳動物種から得られると
思われ、これには格別限定されずラット及びヒトを含
む。
【０００５】血管内皮細胞増殖因子は様々な前記細胞又
は組織のうち１種以上から単離される様々な微異種形
（微細不均一形）で存在している。ここで用いられる微
異種形とはｍＲＮＡレベルで又は翻訳後に構造的に変え
られた単一遺伝子産物、即ち単一遺伝子単位のＤＮＡか
ら産生されたペプチドに関する。ペプチド及びタンパク
質はここでは互換的に用いられる。微異種形はすべて類
似した分裂促進活性を有する。“生物活性”及び“生物
学的に活性”とは互換的に用いられ、下記のような血管
内皮細胞を含めた標的細胞においてＤＮＡ合成を促進し
て細胞増殖させうるＶＥＧＦの能力としてここでは定義
される。変化はインビボで、又は単離及び精製プロセス
中のいずれかで生じる。インビボの変化は格別限定され
ないが、タンパク質分解、グリコシル化、ホスホリル
化、脱アミド化又はＮ末端におけるアセチル化から生じ
る。タンパク質分解には、１以上の末端アミノ酸が連続
的に酵素開裂されて元の遺伝子産物よりも少ないアミノ
酸を有した微異種形を産生する外タンパク質分解を含
む。タンパク質分解にはアミノ酸配列内の特定箇所でペ
プチドを開裂するエンドプロテアーゼの作用に起因した
内タンパク質分解変化も含む。同様の変化は精製プロセ
ス中にも生じ、微異種形を同じく産生する。精製中に生
じる最も普通の変化はタンパク質分解であるが、これは
通常プロテアーゼ阻害剤の使用で最少に保たれる。ほと
んどの条件下において１種以上の微異種形が天然ＶＥＧ
Ｆの精製後に存在している。天然ＶＥＧＦとはＶＥＧＦ
を産生する細胞から単離かつ精製されたＶＥＧＦに関す
る。血管内皮細胞増殖因子は、エキソン及びイントロン
の異なるプロセッシングによる関連ｍＲＮＡの産生とし
てここでは定義される様々な別にスプライスされた形で
存在してもよい。エキソンとは最終タンパク質産物につ
いてコードする真核細胞遺伝子のＤＮＡ配列の部分とし
て定義される。本発明は、サブユニットをコードする遺
伝子から作られ、異るようにスプライスされたすべての
ｍＲＮＡの全鎖長翻訳産物とアミノ末端分泌リーダーア
ミノ酸配列のタンパク質分解除去により形成されるそれ
らの対応成熟アミノ酸配列からなるとして定義されるＶ
ＥＧＦサブユニットＡ、Ｂ及びＣも包含すると考える。
本発明はダイマー形のときに以下で示される血管内皮細
胞刺激のような生物活性を示す、微異種でかつ異るよう
にスプライスされたＶＥＧＦサブユニットのみを包含す
ると考える。
は組織のうち１種以上から単離される様々な微異種形
（微細不均一形）で存在している。ここで用いられる微
異種形とはｍＲＮＡレベルで又は翻訳後に構造的に変え
られた単一遺伝子産物、即ち単一遺伝子単位のＤＮＡか
ら産生されたペプチドに関する。ペプチド及びタンパク
質はここでは互換的に用いられる。微異種形はすべて類
似した分裂促進活性を有する。“生物活性”及び“生物
学的に活性”とは互換的に用いられ、下記のような血管
内皮細胞を含めた標的細胞においてＤＮＡ合成を促進し
て細胞増殖させうるＶＥＧＦの能力としてここでは定義
される。変化はインビボで、又は単離及び精製プロセス
中のいずれかで生じる。インビボの変化は格別限定され
ないが、タンパク質分解、グリコシル化、ホスホリル
化、脱アミド化又はＮ末端におけるアセチル化から生じ
る。タンパク質分解には、１以上の末端アミノ酸が連続
的に酵素開裂されて元の遺伝子産物よりも少ないアミノ
酸を有した微異種形を産生する外タンパク質分解を含
む。タンパク質分解にはアミノ酸配列内の特定箇所でペ
プチドを開裂するエンドプロテアーゼの作用に起因した
内タンパク質分解変化も含む。同様の変化は精製プロセ
ス中にも生じ、微異種形を同じく産生する。精製中に生
じる最も普通の変化はタンパク質分解であるが、これは
通常プロテアーゼ阻害剤の使用で最少に保たれる。ほと
んどの条件下において１種以上の微異種形が天然ＶＥＧ
Ｆの精製後に存在している。天然ＶＥＧＦとはＶＥＧＦ
を産生する細胞から単離かつ精製されたＶＥＧＦに関す
る。血管内皮細胞増殖因子は、エキソン及びイントロン
の異なるプロセッシングによる関連ｍＲＮＡの産生とし
てここでは定義される様々な別にスプライスされた形で
存在してもよい。エキソンとは最終タンパク質産物につ
いてコードする真核細胞遺伝子のＤＮＡ配列の部分とし
て定義される。本発明は、サブユニットをコードする遺
伝子から作られ、異るようにスプライスされたすべての
ｍＲＮＡの全鎖長翻訳産物とアミノ末端分泌リーダーア
ミノ酸配列のタンパク質分解除去により形成されるそれ
らの対応成熟アミノ酸配列からなるとして定義されるＶ
ＥＧＦサブユニットＡ、Ｂ及びＣも包含すると考える。
本発明はダイマー形のときに以下で示される血管内皮細
胞刺激のような生物活性を示す、微異種でかつ異るよう
にスプライスされたＶＥＧＦサブユニットのみを包含す
ると考える。
【０００６】ラット細胞系ＧＳ−９Ｌのようなグリオー
マ細胞は約１０％新生子ウシ血清（ＮＣＳ）で補充され
たダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）のような細
胞培地中において組織培養フラスコ（約１７５ｃｍ2）
中で 集密化まで増殖される。細胞が集密化したとき培
地を除去し、細胞層を無Ｃａ++、Ｍｇ++リン酸緩衝液
（ＰＢＳ）で洗浄し、約０．１％トリプシン及び約０．
０４％ＥＤＴＡの溶液による処理でフラスコから除去す
る。細胞約１×１０8 を遠心によりペレット化し、約５
％ＮＣＳ含有ＤＭＥＭ約１５００ｍｌに再懸濁し、表面
積６０００ｃｍ2のテンレベルセルファクトリー（ten l
evel cell factory）（ＮＵＮＣ）に入れる。細胞は約
５％ＣＯ2 の雰囲気下で約４８〜約９６時間、好ましく
は７２時間にわたり約３７℃でインキュベートされる。
インキュベート後に培地を除去し、セルファクトリーを
ＰＢＳで約３回洗浄する。ｐＨ約７.４の約１５mＭ Ｈ
ｅｐｅｓ、約５μｇ／ｍｌインシュリン、約１０μｇ／
ｍｌトランスフェリンを約１．０ｍｇ／ｍｌウシ血清ア
ルブミンと共に又はそれなしで含むＨａｍ’ｓ−Ｆ１２
／ＤＭＥＭの約１：２混合物を含有した新鮮培地約１５
００ｍｌを加える。この培地は約２４時間後に新鮮培地
と交換され、その後は４８時間毎に集められる。集めら
れたならし培地は細胞砕片を除去するためワットマン＃
１ペーパーで濾過し、約−２０℃で貯蔵する。
マ細胞は約１０％新生子ウシ血清（ＮＣＳ）で補充され
たダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）のような細
胞培地中において組織培養フラスコ（約１７５ｃｍ2）
中で 集密化まで増殖される。細胞が集密化したとき培
地を除去し、細胞層を無Ｃａ++、Ｍｇ++リン酸緩衝液
（ＰＢＳ）で洗浄し、約０．１％トリプシン及び約０．
０４％ＥＤＴＡの溶液による処理でフラスコから除去す
る。細胞約１×１０8 を遠心によりペレット化し、約５
％ＮＣＳ含有ＤＭＥＭ約１５００ｍｌに再懸濁し、表面
積６０００ｃｍ2のテンレベルセルファクトリー（ten l
evel cell factory）（ＮＵＮＣ）に入れる。細胞は約
５％ＣＯ2 の雰囲気下で約４８〜約９６時間、好ましく
は７２時間にわたり約３７℃でインキュベートされる。
インキュベート後に培地を除去し、セルファクトリーを
ＰＢＳで約３回洗浄する。ｐＨ約７.４の約１５mＭ Ｈ
ｅｐｅｓ、約５μｇ／ｍｌインシュリン、約１０μｇ／
ｍｌトランスフェリンを約１．０ｍｇ／ｍｌウシ血清ア
ルブミンと共に又はそれなしで含むＨａｍ’ｓ−Ｆ１２
／ＤＭＥＭの約１：２混合物を含有した新鮮培地約１５
００ｍｌを加える。この培地は約２４時間後に新鮮培地
と交換され、その後は４８時間毎に集められる。集めら
れたならし培地は細胞砕片を除去するためワットマン＃
１ペーパーで濾過し、約−２０℃で貯蔵する。
【０００７】ＧＳ−９Ｌならし培地は解凍して、１Ｍ
ＨＣｌでｐＨ６.０にする。初回精製ステップはＣＭセ
ファデックスＣ−５０、ファルマシア・モノＳ（Pharma
cia Mono Ｓ）、ゼタクロムＳＰ（Ｚetachrom ＳＰ）及
びポリアスパラギン酸ＷＣＸ（Ｐolyaspartic Ａcid Ｗ
ＣＸ）［ネストグループ（Nest Group）］、好ましくは
ＣＭセファデックスＣ−５０（ファルマシア）のよう
な、様々な基材上の様々な陽イオン交換物質を用いる陽
イオン交換クロマトグラフィーからなる。ＶＥＧＦ含有
培地はＣＭセファデックスＣ-５０と約２ｇ／約２０ｌ
ならし培地で混合し、４℃で約２４時間にわたり低速で
攪拌する。樹脂を静置し、過剰の液体を除去する。樹脂
スラリーはカラムに充填され、残りの培地は除去され
る。未結合タンパク質は約ｐＨ６．０の０.１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ含有０．０５Ｍリン酸ナトリウムでカラムから洗い
出される。ＶＥＧＦ−ＡＢは約ｐＨ６．０の約０.６Ｍ
ＮａＣｌ含有約０．０５Ｍリン酸ナトリウムで溶出され
る。
ＨＣｌでｐＨ６.０にする。初回精製ステップはＣＭセ
ファデックスＣ−５０、ファルマシア・モノＳ（Pharma
cia Mono Ｓ）、ゼタクロムＳＰ（Ｚetachrom ＳＰ）及
びポリアスパラギン酸ＷＣＸ（Ｐolyaspartic Ａcid Ｗ
ＣＸ）［ネストグループ（Nest Group）］、好ましくは
ＣＭセファデックスＣ−５０（ファルマシア）のよう
な、様々な基材上の様々な陽イオン交換物質を用いる陽
イオン交換クロマトグラフィーからなる。ＶＥＧＦ含有
培地はＣＭセファデックスＣ-５０と約２ｇ／約２０ｌ
ならし培地で混合し、４℃で約２４時間にわたり低速で
攪拌する。樹脂を静置し、過剰の液体を除去する。樹脂
スラリーはカラムに充填され、残りの培地は除去され
る。未結合タンパク質は約ｐＨ６．０の０.１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ含有０．０５Ｍリン酸ナトリウムでカラムから洗い
出される。ＶＥＧＦ−ＡＢは約ｐＨ６．０の約０.６Ｍ
ＮａＣｌ含有約０．０５Ｍリン酸ナトリウムで溶出され
る。
【０００８】ＣＭセファデックスＣ−５０カラムから集
められた活性分画はＶＥＧＦ−ＡＢの追加精製のためレ
クチンアフィニティクロマトグラフィーで更に分画され
る。ＶＥＧＦ−ＡＢと結合するレクチンとしては格別限
定されず、コンカナバリンＡ及びレンズマメアグルチニ
ンのようなマンノース残基と特異的に結合するレクチ
ン、小麦麦芽アグルチニンのようなＮ−アセチルグルコ
サミンと結合するレクチン、ガラクトース又はガラクト
サミンと結合するレクチン、シアル酸と結合するレクチ
ンがあるが、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ)が好まし
い。約５ｍｌ充填容量のＣｏｎ Ａアガロース［ベクタ
ー・ラボラトリーズ（Ｖector Ｌaboratories］を含有
した０．９ｃｍ径カラムを洗浄し、約１ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、約１ｍＭＭｎＣｌ2及び約０．６Ｍ ＮａＣｌを含
有した約ｐＨ６．０の約０．０５Ｍ酢酸ナトリウムで平
衡化する。未結合タンパク質は平衡緩衝液でカラムから
洗い出される。ＶＥＧＦ ＡＢは約０．３２Ｍα−メチ
ルマンノシド及び約０．２８Ｍα−メチルグルコシドを
含有した約０．１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で溶出される。
められた活性分画はＶＥＧＦ−ＡＢの追加精製のためレ
クチンアフィニティクロマトグラフィーで更に分画され
る。ＶＥＧＦ−ＡＢと結合するレクチンとしては格別限
定されず、コンカナバリンＡ及びレンズマメアグルチニ
ンのようなマンノース残基と特異的に結合するレクチ
ン、小麦麦芽アグルチニンのようなＮ−アセチルグルコ
サミンと結合するレクチン、ガラクトース又はガラクト
サミンと結合するレクチン、シアル酸と結合するレクチ
ンがあるが、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ)が好まし
い。約５ｍｌ充填容量のＣｏｎ Ａアガロース［ベクタ
ー・ラボラトリーズ（Ｖector Ｌaboratories］を含有
した０．９ｃｍ径カラムを洗浄し、約１ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、約１ｍＭＭｎＣｌ2及び約０．６Ｍ ＮａＣｌを含
有した約ｐＨ６．０の約０．０５Ｍ酢酸ナトリウムで平
衡化する。未結合タンパク質は平衡緩衝液でカラムから
洗い出される。ＶＥＧＦ ＡＢは約０．３２Ｍα−メチ
ルマンノシド及び約０．２８Ｍα−メチルグルコシドを
含有した約０．１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で溶出される。
【０００９】Ｃｏｎ ＡカラムからのＶＥＧＦ−ＡＢ活
性溶出液はｐＨ６．０の約０.０５Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液で前平衡化された４．６×２５０ｍｍのポリアス
パラギン酸ＷＣＸ陽イオン交換高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）カラムに供される。カラムは約６０
分間にわたりリン酸緩衝液中約０〜０.７５Ｍ ＮａＣｌ
の直線勾配で溶出させる。流速は約０．７５ｍｌ／ｍｉ
ｎで維持され、０．７５ｍｌずつの分画を集める。血管
内皮細胞増殖因子ＡＢ活性は約２１.７〜２８.５ｍｌで
溶出する分画中に存在する。
性溶出液はｐＨ６．０の約０.０５Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液で前平衡化された４．６×２５０ｍｍのポリアス
パラギン酸ＷＣＸ陽イオン交換高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）カラムに供される。カラムは約６０
分間にわたりリン酸緩衝液中約０〜０.７５Ｍ ＮａＣｌ
の直線勾配で溶出させる。流速は約０．７５ｍｌ／ｍｉ
ｎで維持され、０．７５ｍｌずつの分画を集める。血管
内皮細胞増殖因子ＡＢ活性は約２１.７〜２８.５ｍｌで
溶出する分画中に存在する。
【００１０】ＶＥＧＦ ＡＢを含有するポリアスパラギ
ン酸ＷＣＸカラムから溶出された活性分画はプールし
て、約ｐＨ７．０に調整し、過剰の塩化銅でチャージさ
れかつ約ｐＨ７.０の約０．０５Ｍリン酸ナトリウムで
平衡化された約２Ｍ ＮａＣｌ及び約０．５ｍＭイミダ
ゾール（Ａ緩衝液）を含有したファルマシアキレーティ
ングセファロース６Ｂの１×１０ｃｍカラムにいれられ
る。ＶＥＧＦ−ＡＢは０〜２０％Ｂで１０分間、２０〜
３５％Ｂで４５分間及び３５〜１００％Ｂで５分間の勾
配により流速０.３ｍｌ／ｍiｎでカラムから溶出される
が、ここでＢ緩衝液とは約２Ｍ ＮａＣｌ及び１００ｍ
Ｍイミダゾールを含有したｐＨ７．０の０.０５Ｍリン
酸ナトリウムである。ＶＥＧＦ−ＡＢ活性を含む活性分
画は約１２．６〜２２．８ｍｌの勾配流出液容量のとき
に溶出した。金属キレートカラムから溶出したＶＥＧＦ
−ＡＢ活性を含むプールされた分画は溶媒Ａ［０.１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）］で既に平衡化された４.
６ｍｍ×５ｃｍバイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ4 逆相ＨＰ
ＬＣカラム（５μｍ粒度）にいれられる。カラムは約０
〜３０％溶媒Ｂの直線勾配で１５分間、３０％Ｂで更に
１５分間、しかる後３０〜４５％Ｂで２２．５分間及び
最後に４５〜１００％Ｂで５．５分間かけて溶出され
る。溶媒Ｂは６７％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有し
た溶媒Ａからなる。流速は約０．７５ｍｌ／ｍｉｎで維
持され、分画は毎分毎に集められる。同種ＶＥＧＦ Ａ
Ｂはこれらの条件下で勾配流出液容量約３２〜約３８ｍ
ｌのときにＣ4カラムから溶出する。
ン酸ＷＣＸカラムから溶出された活性分画はプールし
て、約ｐＨ７．０に調整し、過剰の塩化銅でチャージさ
れかつ約ｐＨ７.０の約０．０５Ｍリン酸ナトリウムで
平衡化された約２Ｍ ＮａＣｌ及び約０．５ｍＭイミダ
ゾール（Ａ緩衝液）を含有したファルマシアキレーティ
ングセファロース６Ｂの１×１０ｃｍカラムにいれられ
る。ＶＥＧＦ−ＡＢは０〜２０％Ｂで１０分間、２０〜
３５％Ｂで４５分間及び３５〜１００％Ｂで５分間の勾
配により流速０.３ｍｌ／ｍiｎでカラムから溶出される
が、ここでＢ緩衝液とは約２Ｍ ＮａＣｌ及び１００ｍ
Ｍイミダゾールを含有したｐＨ７．０の０.０５Ｍリン
酸ナトリウムである。ＶＥＧＦ−ＡＢ活性を含む活性分
画は約１２．６〜２２．８ｍｌの勾配流出液容量のとき
に溶出した。金属キレートカラムから溶出したＶＥＧＦ
−ＡＢ活性を含むプールされた分画は溶媒Ａ［０.１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）］で既に平衡化された４.
６ｍｍ×５ｃｍバイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ4 逆相ＨＰ
ＬＣカラム（５μｍ粒度）にいれられる。カラムは約０
〜３０％溶媒Ｂの直線勾配で１５分間、３０％Ｂで更に
１５分間、しかる後３０〜４５％Ｂで２２．５分間及び
最後に４５〜１００％Ｂで５．５分間かけて溶出され
る。溶媒Ｂは６７％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有し
た溶媒Ａからなる。流速は約０．７５ｍｌ／ｍｉｎで維
持され、分画は毎分毎に集められる。同種ＶＥＧＦ Ａ
Ｂはこれらの条件下で勾配流出液容量約３２〜約３８ｍ
ｌのときにＣ4カラムから溶出する。
【００１１】タンパク質の純度はレムリ、ネーチャー、
第２２７巻、第６８０−６８４頁、１９７０年［Ｌaemm
li, Ｎature, ２２７： ６８０−６８４（１９７０）］
の技術を用いて１２．５％架橋ゲル中ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）により調べる。銀染色ゲルでは、ＶＥＧＦ−Ａ
Ｂは非還元条件下でおよそのみかけ分子量約５８，００
０ドルトンの１バンドからなる。微異種形のＶＥＧＦ−
ＡＢを含有したサンプルが還元条件下で分離された場
合、それは２つの約２３キロドルトン（ｋＤａ）サブユ
ニットとして移動する。精製プロセスすることによりタ
ンパク質のような他の哺乳動物細胞産物を本質的に含ま
ないＶＥＧＦ−ＡＢを得る。組換え誘導ＶＥＧＦ−ＡＢ
も哺乳動物細胞産物を含まない。
第２２７巻、第６８０−６８４頁、１９７０年［Ｌaemm
li, Ｎature, ２２７： ６８０−６８４（１９７０）］
の技術を用いて１２．５％架橋ゲル中ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）により調べる。銀染色ゲルでは、ＶＥＧＦ−Ａ
Ｂは非還元条件下でおよそのみかけ分子量約５８，００
０ドルトンの１バンドからなる。微異種形のＶＥＧＦ−
ＡＢを含有したサンプルが還元条件下で分離された場
合、それは２つの約２３キロドルトン（ｋＤａ）サブユ
ニットとして移動する。精製プロセスすることによりタ
ンパク質のような他の哺乳動物細胞産物を本質的に含ま
ないＶＥＧＦ−ＡＢを得る。組換え誘導ＶＥＧＦ−ＡＢ
も哺乳動物細胞産物を含まない。
【００１２】生物活性は哺乳動物血管内皮細胞を用いた
分裂促進アッセイにより調べられる。ヒトヘソ血管内皮
（ＨＵＶＥ）細胞は約２０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｆ
ＣＳ）含有培地１９９（Ｍ１９９）約５００μｌ中、約
５０００細胞／ウェルの密度でゼラチンコート皿中にお
かれる。調べられるサンプルはプレーティング時に加え
られる。組織培養プレートは約３７℃で約１２時間イン
キュベートし、トリチウム化チミジン（ＮＥＮ、２０Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ）約２マイクロキュリーをアッセイ培地ｍ
ｌ当たりに加える（１．０μＣｉ／ウェル）。プレート
は更に６０時間インキュベートされ、アッセイ培地を除
去し、プレートを約ｐＨ７．５の約２０ｍＭ Ｈｅｐｅ
ｓ及び約０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有し
たハンクスの平衡塩類溶液で洗浄する。細胞を溶解さ
せ、標識されたＤＮＡを水約１００ｍｌ中に炭酸ナトリ
ウム約２ｇ及び水酸化ナトリウム約４００ｍｇを含有し
た溶液約２００μｌに溶解する。取込まれた放射能は液
体シンチレーションカウントで調べられた。ＨＵＶＥ細
胞で１／２最大分裂促進応答を示したＶＥＧＦの濃度は
約２±１ｎｇ／ｍｌであった。陽性コントロールの酸性
繊維芽細胞増殖因子に対する応答を促進させるためにこ
れらのアッセイで１０〜１００μｇ／mlのレベルで要求
されるグリコサミノグリカンヘパリンはＶＥＧＦ−ＡＢ
によるこれら細胞の分裂促進刺激を高めたりしない。
分裂促進アッセイにより調べられる。ヒトヘソ血管内皮
（ＨＵＶＥ）細胞は約２０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｆ
ＣＳ）含有培地１９９（Ｍ１９９）約５００μｌ中、約
５０００細胞／ウェルの密度でゼラチンコート皿中にお
かれる。調べられるサンプルはプレーティング時に加え
られる。組織培養プレートは約３７℃で約１２時間イン
キュベートし、トリチウム化チミジン（ＮＥＮ、２０Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ）約２マイクロキュリーをアッセイ培地ｍ
ｌ当たりに加える（１．０μＣｉ／ウェル）。プレート
は更に６０時間インキュベートされ、アッセイ培地を除
去し、プレートを約ｐＨ７．５の約２０ｍＭ Ｈｅｐｅ
ｓ及び約０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有し
たハンクスの平衡塩類溶液で洗浄する。細胞を溶解さ
せ、標識されたＤＮＡを水約１００ｍｌ中に炭酸ナトリ
ウム約２ｇ及び水酸化ナトリウム約４００ｍｇを含有し
た溶液約２００μｌに溶解する。取込まれた放射能は液
体シンチレーションカウントで調べられた。ＨＵＶＥ細
胞で１／２最大分裂促進応答を示したＶＥＧＦの濃度は
約２±１ｎｇ／ｍｌであった。陽性コントロールの酸性
繊維芽細胞増殖因子に対する応答を促進させるためにこ
れらのアッセイで１０〜１００μｇ／mlのレベルで要求
されるグリコサミノグリカンヘパリンはＶＥＧＦ−ＡＢ
によるこれら細胞の分裂促進刺激を高めたりしない。
【００１３】ＶＥＧＦ ＡＢの精製サンプル約１〜２μ
ｇを約０．１％ＥＤＴＡ、約６Ｍ塩化グアニジニウム及
び約２０ｍＭジチオスレイトールを含有した約ｐＨ９．
５の約０．１Ｍトリス中約５０℃で約２時間かけて還元
する。還元されたタンパク質は約ｐＨ７．８の約０．７
Ｍトリス、約０．１％ＥＤＴＡ及び約６Ｍ塩化グアニジ
ニウム中に約９．２μＭの未標識及び２．８μＭの14Ｃ
−ヨード酢酸を含有した溶液中で約１時間かけてカルボ
キシメチル化される。タンパク質は室温で約１時間かけ
てカルボキシメチル化される。タンパク質は還元及びカ
ルボキシメチル化後に約４.６ｍｍ×５ｃｍのバイダッ
クＣ4カラムにおける逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
で単離される。タンパク質サブユニットは約０．１％Ｔ
ＦＡで前平衡化されたカラムにおかれ、約０．１％ＴＦ
Ａ〜０．１％ＴＦＡ／６７％アセトニトリルの４５ｍｌ
直線勾配により流速約０．７５ｍｌ／ｍｉｎで溶出され
る。還元及びカルボキシメチル化されたタンパク質は約
２３及び２５ｍｌで２つのピークとして溶出したが、そ
の割合は２１０ｎｍにおける吸光度モニタリングで調べ
たところほぼ同等であった。
ｇを約０．１％ＥＤＴＡ、約６Ｍ塩化グアニジニウム及
び約２０ｍＭジチオスレイトールを含有した約ｐＨ９．
５の約０．１Ｍトリス中約５０℃で約２時間かけて還元
する。還元されたタンパク質は約ｐＨ７．８の約０．７
Ｍトリス、約０．１％ＥＤＴＡ及び約６Ｍ塩化グアニジ
ニウム中に約９．２μＭの未標識及び２．８μＭの14Ｃ
−ヨード酢酸を含有した溶液中で約１時間かけてカルボ
キシメチル化される。タンパク質は室温で約１時間かけ
てカルボキシメチル化される。タンパク質は還元及びカ
ルボキシメチル化後に約４.６ｍｍ×５ｃｍのバイダッ
クＣ4カラムにおける逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
で単離される。タンパク質サブユニットは約０．１％Ｔ
ＦＡで前平衡化されたカラムにおかれ、約０．１％ＴＦ
Ａ〜０．１％ＴＦＡ／６７％アセトニトリルの４５ｍｌ
直線勾配により流速約０．７５ｍｌ／ｍｉｎで溶出され
る。還元及びカルボキシメチル化されたタンパク質は約
２３及び２５ｍｌで２つのピークとして溶出したが、そ
の割合は２１０ｎｍにおける吸光度モニタリングで調べ
たところほぼ同等であった。
【００１４】還元及びカルボキシメチル化されたモノマ
ーのサンプルはポリブレンコートガラス繊維フィルター
に適用され、それらのＮ末端配列は製造業者の説明に従
ってＡＢＩ１２０Ａオンラインフェニルチオヒダントイ
ンアナライザーを連結したＡＢＩ気相マイクロシーケン
サーにおいてエドマン分解により調べられる。約２５ｍ
ｌで溶出する吸光度ピークを示すタンパク質（Ａサブユ
ニット又はモノマー）は下記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の
アミノ末端配列を示した：Ａla Ｐro Ｔhr Ｔhr Ｇlu
Ｇly Ｇlu Ｇln Ｌys Ａla Ｈis Ｇlu Ｖal Ｖalこれは
ＶＥＧＦ−ＡＡのＡ鎖モノマーと同一である（コーン
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８７巻、第２６２８−２
６３２頁、１９９０年）。約２３ｍｌで溶出する吸光度
のピーク（Ｂサブユニット又はモノマー）は下記ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２のＮ末端配列： ＡlaＬeu Ｓer Ａla
Ｇly Ａsn Ｘaa Ｓer Ｔhr Ｇlu Ｍet Ｇlu Ｖal Ｖal
Ｐro Ｐhe Ａsn Ｇlu Ｖal と同時に最初の３アミノ酸
残基を欠くがほぼ等量の同配列の端部切除体を示した。
欠失Ｘｘｘ残基はクローン化ｃＤＮＡにおいてＡｓｎ残
基に相当する（下記参照）。この欠失Ａｓｎは古典的Ａ
ｓｎ Ｘｘｘ Ｓｅｒ／Ｔｈｒ Ｎ-グリコシル化配列中に
存在するため、それはグリコシル化されていると思われ
る。Ａサブユニットと、双方のＢサブユニットの合計は
ほぼ等量で回収されたが、これは２つのペプチドがＶＥ
ＧＦ−ＡＢでＡＢヘテロダイマーを形成するように結合
するという解釈を支持している。
ーのサンプルはポリブレンコートガラス繊維フィルター
に適用され、それらのＮ末端配列は製造業者の説明に従
ってＡＢＩ１２０Ａオンラインフェニルチオヒダントイ
ンアナライザーを連結したＡＢＩ気相マイクロシーケン
サーにおいてエドマン分解により調べられる。約２５ｍ
ｌで溶出する吸光度ピークを示すタンパク質（Ａサブユ
ニット又はモノマー）は下記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の
アミノ末端配列を示した：Ａla Ｐro Ｔhr Ｔhr Ｇlu
Ｇly Ｇlu Ｇln Ｌys Ａla Ｈis Ｇlu Ｖal Ｖalこれは
ＶＥＧＦ−ＡＡのＡ鎖モノマーと同一である（コーン
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８７巻、第２６２８−２
６３２頁、１９９０年）。約２３ｍｌで溶出する吸光度
のピーク（Ｂサブユニット又はモノマー）は下記ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２のＮ末端配列： ＡlaＬeu Ｓer Ａla
Ｇly Ａsn Ｘaa Ｓer Ｔhr Ｇlu Ｍet Ｇlu Ｖal Ｖal
Ｐro Ｐhe Ａsn Ｇlu Ｖal と同時に最初の３アミノ酸
残基を欠くがほぼ等量の同配列の端部切除体を示した。
欠失Ｘｘｘ残基はクローン化ｃＤＮＡにおいてＡｓｎ残
基に相当する（下記参照）。この欠失Ａｓｎは古典的Ａ
ｓｎ Ｘｘｘ Ｓｅｒ／Ｔｈｒ Ｎ-グリコシル化配列中に
存在するため、それはグリコシル化されていると思われ
る。Ａサブユニットと、双方のＢサブユニットの合計は
ほぼ等量で回収されたが、これは２つのペプチドがＶＥ
ＧＦ−ＡＢでＡＢヘテロダイマーを形成するように結合
するという解釈を支持している。
【００１５】Ａモノマーのサンプルは当業界で周知の操
作によりリジン及びアルギニン残基のＣ末端側でポリペ
プチドを開裂するプロテアーゼトリプシン、又はリジン
のＣ末端側でポリペプチドを開裂するＬｙｓ Ｃ のいず
れかで処理された。ペプチドは逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ）により単離される。単離されたペプチドのアミ
ノ酸配列は製造業者の説明に従いＡＢＩ１２０Ａオンラ
インフェニルチオヒダントインアナライザーを連結した
ＡＢＩ気相シーケンサーにおいてエドマン分解を用いて
調べられる。アミノ酸配列を図１で示す。
作によりリジン及びアルギニン残基のＣ末端側でポリペ
プチドを開裂するプロテアーゼトリプシン、又はリジン
のＣ末端側でポリペプチドを開裂するＬｙｓ Ｃ のいず
れかで処理された。ペプチドは逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ）により単離される。単離されたペプチドのアミ
ノ酸配列は製造業者の説明に従いＡＢＩ１２０Ａオンラ
インフェニルチオヒダントインアナライザーを連結した
ＡＢＩ気相シーケンサーにおいてエドマン分解を用いて
調べられる。アミノ酸配列を図１で示す。
【００１６】還元及びカルボキシメチル化Ａモノマーは
乾燥して、約０．１％ＥＤＴＡを含有した約ｐＨ７．８
の約０．７Ｍトリス、約６Ｍ塩化グアニジニウム中に溶
解する。Ｖ８プロテアーゼを約ｐＨ８．０の０．１Ｍ炭
酸水素アンモニウム緩衝液に加え、混合液を約３７℃で
約４８時間インキュベートする。プロテアーゼは主にグ
ルタミン酸残基のカルボキシ末端側で開裂する。得られ
たポリペプチドは前記のようにＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣで分
画された。
乾燥して、約０．１％ＥＤＴＡを含有した約ｐＨ７．８
の約０．７Ｍトリス、約６Ｍ塩化グアニジニウム中に溶
解する。Ｖ８プロテアーゼを約ｐＨ８．０の０．１Ｍ炭
酸水素アンモニウム緩衝液に加え、混合液を約３７℃で
約４８時間インキュベートする。プロテアーゼは主にグ
ルタミン酸残基のカルボキシ末端側で開裂する。得られ
たポリペプチドは前記のようにＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣで分
画された。
【００１７】還元及びカルボキシメチル化Ａサブユニッ
トタンパク質溶液は ６Ｎ ＨＣｌでｐＨ約６．８に調整
され、ジチオスレイトールをメチオニンスルホキシドか
らメチオニン残基へ還元するために最終濃度２Ｍまで加
える。約３９℃で約２０時間還元した後、タンパク質は
Ｃ4ＨＰＬＣにより再精製される。産物は乾燥され、アル
ゴン雰囲気下暗所中約２０℃で約２４時間かけて約７０
％（ｖ／ｖ）ギ酸中４０ｍＭ臭化シアン２００μｌによ
りメチオニン残基のカルボキシ末端側で開裂される。開
裂産物はＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣで分画される。アミノ酸配
列は図１に示されている。コーンら、プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵ
ＳＡ、第８７巻、第２６２８−２６３２頁、１９９０年
参照。
トタンパク質溶液は ６Ｎ ＨＣｌでｐＨ約６．８に調整
され、ジチオスレイトールをメチオニンスルホキシドか
らメチオニン残基へ還元するために最終濃度２Ｍまで加
える。約３９℃で約２０時間還元した後、タンパク質は
Ｃ4ＨＰＬＣにより再精製される。産物は乾燥され、アル
ゴン雰囲気下暗所中約２０℃で約２４時間かけて約７０
％（ｖ／ｖ）ギ酸中４０ｍＭ臭化シアン２００μｌによ
りメチオニン残基のカルボキシ末端側で開裂される。開
裂産物はＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣで分画される。アミノ酸配
列は図１に示されている。コーンら、プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵ
ＳＡ、第８７巻、第２６２８−２６３２頁、１９９０年
参照。
【００１８】現在ＶＥＧＦ ＡＡのＡモノマー及びその
ｃＤＮＡコード配列と同一であることがわかったＶＥＧ
Ｆ−ＡＢのＡモノマー又はサブユニットの全鎖長１９０
アミノ酸残基タンパク質翻訳産物は図２及び６で示され
ている。成熟アミノ末端は典型的な疎水性分泌リーダー
配列の直後にある残基２７で始まる。単一の可能なＮ−
グリコシル化部位はＡｓｎ100 に存在する。トリプシン
（Ｔ）、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｌ）、スタフィロコッカス・アウ
レウス（Staphylococcus aureus）Ｖ８プロテアーゼ
（Ｖ８）及び臭化シアン（ＣＢ）開裂のＨＰＬＣ逆相精
製産物とアミノ末端を含む還元及びカルボキシメチル化
された成熟サブユニットの１６４残基のうちほとんど
（１４３アミノ酸残基）は全量５μｇのタンパク質を用
いて直接微量配列決定［アプライド・バイオシステムズ
４７０Ａ（Ａpplied Biosystems ４７０Ａ）］により調
べられた。アミノ酸配列決定で同定されたすべての残基
は、具体的なポリペプチドの鎖長に及ぶ二重頭矢印の上
に、全サブユニットのアミノ末端決定又はポリペプチド
開裂産物から同定された残基に関して残基２７の角型括
弧後で成熟プロセッシング処理配列の直接下に右向きの
矢印で示されている。示された１対のポリペプチドＶ１
８Ａ及びＶ１８Ｂは混合物として配列決定され、したが
ってｃＤＮＡ誘導アミノ酸配列を確認するだけになる
（図１及び５参照）。
ｃＤＮＡコード配列と同一であることがわかったＶＥＧ
Ｆ−ＡＢのＡモノマー又はサブユニットの全鎖長１９０
アミノ酸残基タンパク質翻訳産物は図２及び６で示され
ている。成熟アミノ末端は典型的な疎水性分泌リーダー
配列の直後にある残基２７で始まる。単一の可能なＮ−
グリコシル化部位はＡｓｎ100 に存在する。トリプシン
（Ｔ）、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｌ）、スタフィロコッカス・アウ
レウス（Staphylococcus aureus）Ｖ８プロテアーゼ
（Ｖ８）及び臭化シアン（ＣＢ）開裂のＨＰＬＣ逆相精
製産物とアミノ末端を含む還元及びカルボキシメチル化
された成熟サブユニットの１６４残基のうちほとんど
（１４３アミノ酸残基）は全量５μｇのタンパク質を用
いて直接微量配列決定［アプライド・バイオシステムズ
４７０Ａ（Ａpplied Biosystems ４７０Ａ）］により調
べられた。アミノ酸配列決定で同定されたすべての残基
は、具体的なポリペプチドの鎖長に及ぶ二重頭矢印の上
に、全サブユニットのアミノ末端決定又はポリペプチド
開裂産物から同定された残基に関して残基２７の角型括
弧後で成熟プロセッシング処理配列の直接下に右向きの
矢印で示されている。示された１対のポリペプチドＶ１
８Ａ及びＶ１８Ｂは混合物として配列決定され、したが
ってｃＤＮＡ誘導アミノ酸配列を確認するだけになる
（図１及び５参照）。
【００１９】還元及びカルボキシメチル化された純粋な
ＶＥＧＦ ＡＢ、Ａ及びＢモノマーのサンプルは、リジ
ン残基のＣ末端側でポリペプチドを開裂させるＬｙｓ−
Ｃエンドプロティナーゼで各々切断された。ペプチドは
逆相ＨＰＬＣで単離され、それらのアミノ酸配列が前記
のように調べられた。最終ＶＥＧＦ ＡＢ、Ａ及びＢ配
列中におけるそのペプチドの位置は各々図２及び図３で
示されている。
ＶＥＧＦ ＡＢ、Ａ及びＢモノマーのサンプルは、リジ
ン残基のＣ末端側でポリペプチドを開裂させるＬｙｓ−
Ｃエンドプロティナーゼで各々切断された。ペプチドは
逆相ＨＰＬＣで単離され、それらのアミノ酸配列が前記
のように調べられた。最終ＶＥＧＦ ＡＢ、Ａ及びＢ配
列中におけるそのペプチドの位置は各々図２及び図３で
示されている。
【００２０】Ａサブユニット又はモノマーの全鎖長コー
ド領域は３組の重複ｃＤＮＡクローンから調べられる。
ポリペプチドＬ４２からのアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｍｅｔ
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（残基４２−４７）
及びポリペプチドＴ３８からのＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（残基１６４-１６８）（図１参照）
に基づく縮重オリゴヌクレオチドプライマーがサイキ
ら、サイエンス、第２３０巻、第１３５０−１３５４
頁、１９８５年の操作に従いＶＥＧＦ Ａ鎖に関するｃ
ＤＮＡの中心領域をＰＣＲ増幅させるために用いられ
た。４２０ｂｐで移動する単一バンドがゲル精製され、
ＳａｌＩで切断され、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合さ
れ、配列決定された。得られたヌクレオチド配列（ｐ４
２３８）はフローマン（Ｆrohman）ら、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
ＵＳＡ、第８５巻、第８９９８−９００２頁、１９８８
年で記載されたプロトコールに従いｃＤＮＡの５’及び
３’末端を増幅させるためにアンチセンス及びセンスＰ
ＣＲプライマーをデザインする上で用いられた。これら
の５’及び３’クローンは各々ｐ５−１５及びｐＷ３と
表示される。各組のクローンに関して決定されたプライ
マーを除く完全ＤＮＡ配列の領域はヌクレオチド配列上
に二重頭矢印で示されている。タンパク質配列決定で同
定された１６４アミノ酸分泌形についてコードするｃＤ
ＮＡに加えて、１４６アミノ酸及び２１４アミノ酸形に
ついてコードする２つの別にスプライスされたｃＤＮＡ
がクローニングされ、配列決定される（図４、５及び
６）。
ド領域は３組の重複ｃＤＮＡクローンから調べられる。
ポリペプチドＬ４２からのアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｍｅｔ
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（残基４２−４７）
及びポリペプチドＴ３８からのＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（残基１６４-１６８）（図１参照）
に基づく縮重オリゴヌクレオチドプライマーがサイキ
ら、サイエンス、第２３０巻、第１３５０−１３５４
頁、１９８５年の操作に従いＶＥＧＦ Ａ鎖に関するｃ
ＤＮＡの中心領域をＰＣＲ増幅させるために用いられ
た。４２０ｂｐで移動する単一バンドがゲル精製され、
ＳａｌＩで切断され、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合さ
れ、配列決定された。得られたヌクレオチド配列（ｐ４
２３８）はフローマン（Ｆrohman）ら、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
ＵＳＡ、第８５巻、第８９９８−９００２頁、１９８８
年で記載されたプロトコールに従いｃＤＮＡの５’及び
３’末端を増幅させるためにアンチセンス及びセンスＰ
ＣＲプライマーをデザインする上で用いられた。これら
の５’及び３’クローンは各々ｐ５−１５及びｐＷ３と
表示される。各組のクローンに関して決定されたプライ
マーを除く完全ＤＮＡ配列の領域はヌクレオチド配列上
に二重頭矢印で示されている。タンパク質配列決定で同
定された１６４アミノ酸分泌形についてコードするｃＤ
ＮＡに加えて、１４６アミノ酸及び２１４アミノ酸形に
ついてコードする２つの別にスプライスされたｃＤＮＡ
がクローニングされ、配列決定される（図４、５及び
６）。
【００２１】Ｂサブユニット又はモノマーの全鎖長コー
ド領域は４組の重複ｃＤＮＡクローンから調べられる。
ポリペプチドＬ５０からのアミノ酸配列に基づく縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーはサイキら、サイエンス、
第２３０巻、第１３５０−１３５４頁、１９８５年の操
作に従いＶＥＧＦ ＡＢ、Ｂモノマーに関するｃＤＮＡ
の中心領域をＰＣＲ増幅させるために用いられる。１０
８ｂｐで移動する単一バンドがゲル精製され、ＳａｌＩ
で切断され、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合され、配列決
定された。得られたヌクレオチド配列（ｐＹＧ）はフロ
ーマンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８５巻、第８９９
８−９００２頁、１９８８年で記載されたプロトコール
に従いｃＤＮＡの５’及び３’末端を増幅させるために
アンチセンス及びセンスＰＣＲプライマーをデザインす
る上で用いられた。これらの５’及び３’クローンは各
々ｐ５Ｖ２及びｐ３Ｖ２と表示される。更に５'末端配
列がＧＳ−９ＬポリＡ+ＲＮＡから得られるｃＤＮＡラ
イブラリーから単離されたクローン２０２から決定され
る。各組のクローンに関して決定されたプライマーを除
く完全ＤＮＡ配列の領域はヌクレオチド配列上に二重頭
矢印で示されている。１５８アミノ酸微異種Ｂサブユニ
ット及び１３８アミノ酸微異種Ｂサブユニットに関する
全塩基配列は図７及び８で示されている。
ド領域は４組の重複ｃＤＮＡクローンから調べられる。
ポリペプチドＬ５０からのアミノ酸配列に基づく縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーはサイキら、サイエンス、
第２３０巻、第１３５０−１３５４頁、１９８５年の操
作に従いＶＥＧＦ ＡＢ、Ｂモノマーに関するｃＤＮＡ
の中心領域をＰＣＲ増幅させるために用いられる。１０
８ｂｐで移動する単一バンドがゲル精製され、ＳａｌＩ
で切断され、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合され、配列決
定された。得られたヌクレオチド配列（ｐＹＧ）はフロ
ーマンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８５巻、第８９９
８−９００２頁、１９８８年で記載されたプロトコール
に従いｃＤＮＡの５’及び３’末端を増幅させるために
アンチセンス及びセンスＰＣＲプライマーをデザインす
る上で用いられた。これらの５’及び３’クローンは各
々ｐ５Ｖ２及びｐ３Ｖ２と表示される。更に５'末端配
列がＧＳ−９ＬポリＡ+ＲＮＡから得られるｃＤＮＡラ
イブラリーから単離されたクローン２０２から決定され
る。各組のクローンに関して決定されたプライマーを除
く完全ＤＮＡ配列の領域はヌクレオチド配列上に二重頭
矢印で示されている。１５８アミノ酸微異種Ｂサブユニ
ット及び１３８アミノ酸微異種Ｂサブユニットに関する
全塩基配列は図７及び８で示されている。
【００２２】Ｃサブユニット又はモノマーの全鎖長コー
ド領域は３組の重複ｃＤＮＡクローンから調べられる。
ラットＶＥＧＦ Ｂサブユニットからのアミノ酸配列Ｐ
ｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ及びＧ
ｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに基づ
く縮重オリゴヌクレオチドプライマーはサイキら、サイ
エンス、第２３０巻、第１３５０−１３５４頁、１９８
５年の操作に従いＶＥＧＦ Ｃ鎖のｃＤＮＡの中心領域
をＰＣＲ増幅させるために用いられる。１８０ｂｐで移
動するバンドがゲル精製され、再増幅され、ＳａｌＩで
切断され、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合され、配列決定
される。得られたヌクレオチド配列（ｐＦＳＥＭ）はフ
ローマンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８５巻、第８９
９８−９００２頁、１９８８年で記載されたプロトコー
ルに従いｃＤＮＡの５’及び３’末端を増幅させるため
にアンチセンス及びセンスＰＣＲプライマーをデザイン
する上で用いられる。５’及び３’クローンは各々ｐ
５：１６及びｐ３：１９と表示される。Ｃサブユニット
に関する全塩基配列及びアミノ酸配列は図９で示されて
いる。
ド領域は３組の重複ｃＤＮＡクローンから調べられる。
ラットＶＥＧＦ Ｂサブユニットからのアミノ酸配列Ｐ
ｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ及びＧ
ｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに基づ
く縮重オリゴヌクレオチドプライマーはサイキら、サイ
エンス、第２３０巻、第１３５０−１３５４頁、１９８
５年の操作に従いＶＥＧＦ Ｃ鎖のｃＤＮＡの中心領域
をＰＣＲ増幅させるために用いられる。１８０ｂｐで移
動するバンドがゲル精製され、再増幅され、ＳａｌＩで
切断され、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合され、配列決定
される。得られたヌクレオチド配列（ｐＦＳＥＭ）はフ
ローマンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８５巻、第８９
９８−９００２頁、１９８８年で記載されたプロトコー
ルに従いｃＤＮＡの５’及び３’末端を増幅させるため
にアンチセンス及びセンスＰＣＲプライマーをデザイン
する上で用いられる。５’及び３’クローンは各々ｐ
５：１６及びｐ３：１９と表示される。Ｃサブユニット
に関する全塩基配列及びアミノ酸配列は図９で示されて
いる。
【００２３】本発明の血管内皮細胞増殖因子はＣ微異種
及び／又は別にスプライスされたサブユニットと組合さ
れたＡ微異種及び／又は別にスプライスされたサブユニ
ット又はＢ微異種及び／又は別にスプライスされたサブ
ユニットからなるヘテロダイマーとして存在すると考え
られている。本発明のＶＥＧＦホモダイマーは２つのＣ
サブユニットとして存在することが更に考えられてい
る。天然形のＡ、Ｂ、Ｃサブユニットは別にスプライス
された全鎖長翻訳産物からプロセッシングしてもよい。
ヘテロダイマー又はヘテロダイマー種はＡ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ
又はＢ＋Ｃとして示されるが、その場合にＡ、Ｂ又はＣ
サブユニットは別にスプライスされた又は微異種の形の
いずれで存在していてもよい。ホモダイマー又はホモダ
イマー種はいずれかの別にスプライスされた又は微異種
の形の組合せにより形成できる。本発明はＶＥＧＦのＡ
サブユニット、Ｂサブユニット及びＣサブユニットの個
別的サブユニット形のすべてを含むとしても考えられて
いる。
及び／又は別にスプライスされたサブユニットと組合さ
れたＡ微異種及び／又は別にスプライスされたサブユニ
ット又はＢ微異種及び／又は別にスプライスされたサブ
ユニットからなるヘテロダイマーとして存在すると考え
られている。本発明のＶＥＧＦホモダイマーは２つのＣ
サブユニットとして存在することが更に考えられてい
る。天然形のＡ、Ｂ、Ｃサブユニットは別にスプライス
された全鎖長翻訳産物からプロセッシングしてもよい。
ヘテロダイマー又はヘテロダイマー種はＡ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ
又はＢ＋Ｃとして示されるが、その場合にＡ、Ｂ又はＣ
サブユニットは別にスプライスされた又は微異種の形の
いずれで存在していてもよい。ホモダイマー又はホモダ
イマー種はいずれかの別にスプライスされた又は微異種
の形の組合せにより形成できる。本発明はＶＥＧＦのＡ
サブユニット、Ｂサブユニット及びＣサブユニットの個
別的サブユニット形のすべてを含むとしても考えられて
いる。
【００２４】血管内皮細胞増殖因子に関するヌクレオチ
ド配列は遺伝コードの縮重で示されるように血管内皮増
殖因子サブユニットの各々に関する配列において適切な
アミノ酸についてコードするすべてのコドンを含むと解
釈されることが更に考えられている。ＶＥＧＦサブユニ
ットに関するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列には血
管内皮細胞増殖因子と類似した生物活性を示すタンパク
質を生じる端部切取り遺伝子又はタンパク質も含むと更
に考えられている。本発明の範囲は配列を変化させてい
るが、但し血管内皮細胞の分裂を刺激しうる能力で調べ
ても生物活性を変えないすべての自然変異及び対立遺伝
的変形体及びあらゆるランダムに形成される人工変異体
を含めて考えられる。
ド配列は遺伝コードの縮重で示されるように血管内皮増
殖因子サブユニットの各々に関する配列において適切な
アミノ酸についてコードするすべてのコドンを含むと解
釈されることが更に考えられている。ＶＥＧＦサブユニ
ットに関するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列には血
管内皮細胞増殖因子と類似した生物活性を示すタンパク
質を生じる端部切取り遺伝子又はタンパク質も含むと更
に考えられている。本発明の範囲は配列を変化させてい
るが、但し血管内皮細胞の分裂を刺激しうる能力で調べ
ても生物活性を変えないすべての自然変異及び対立遺伝
的変形体及びあらゆるランダムに形成される人工変異体
を含めて考えられる。
【００２５】血管内皮細胞増殖因子の前記ヘテロダイマ
ー、ホモダイマー及びサブユニットは化学合成操作の又
はここで記載されるＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主
発現の産物であるとして特徴付けられる。モノマーはオ
リゴマー単位に組込まれていないサブユニットとして定
義される。組換えＶＥＧＦ遺伝子（組換えＤＮＡ）の発
現はいくつかの発現ベクターのうち少なくとも１つを含
むいくつかの異なる宿主細胞により行われる。発現ベク
ターとは適切な宿主における組換えＤＮＡ配列又は遺伝
子のクローン化コピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻
訳に必要とされるＤＮＡ配列としてここでは定義され
る。このようなベクターは細菌、藍藻植物、酵母細胞、
昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞、好ましくは哺乳動物
細胞のような様々な宿主において遺伝子を発現させるた
めに使用できる。その遺伝子はいくつかのウイルス発現
系のうちいずれを用いて発現させてもよい。特に示され
たベクターは細菌−酵母、細菌−植物又は細菌−動物細
胞間でＤＮＡのシャトル化を行える。適切に組立てられ
た発現ベクターは宿主細胞における自己複製用の複製
源、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コ
ピー数、強プロモーター及び効率的な翻訳停止シグナル
を含んでいるべきである。プロモーターはＤＮＡに結合
してＲＮＡ合成を開始させるようにＲＮＡポリメラーゼ
を指示するＤＮＡ配列として定義される。強プロモータ
ーとはｍＲＮＡを高頻度で始動させるものである。発現
ベクターとしては格別限定されず、クローニングベクタ
ー、修正されたクローニングベクター、特にデザインさ
れたプラスミド又はウイルス及びコスミドがある。培養
哺乳動物細胞における哺乳動物遺伝子の発現は当業界で
周知である。サムブルックら、分子クローニング、実験
マニュアル、第２版、第３巻、コールド・スプリングス
・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９年［Samb
rook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l, ２nd Edition, Book ３, Cold Springs Harbor Labo
ratory Press（１９８９）］と分子生物学における現行
プロトコール、オースベルら編集、グリーン・パプリッ
シング・アソシエーツ・アンド・ウィリー・インターサ
イエンス、１９８７年及び補巻（Current Protocols In
Molecular Biology, Ausubel et al., Eds, Greene Pu
blishingAssociates and Wiley Interscience, １９８
７and supplement）は哺乳動物細胞内への組換えベクタ
ーの導入に関する方法と共に様々な哺乳動物発現ベクタ
ー及びベクター系について開示している。Ａ、Ｂ及びＣ
サブユニットのモノマー形に関するｃＤＮＡはラインマ
イヤー（Linemeyer）らの欧州特許出願公開第２５９,９
５３号明細書で記載された場合のような系で発現させる
ことができる。ｃＤＮＡはラインマイヤーらによるのと
同様に修正されたｐＫＫ２２３−３（ファルマシア）の
ような市販プラスミドに組込まれ、大腸菌で発現され
る。他の発現系及び宿主細胞も当業界で周知である。
ー、ホモダイマー及びサブユニットは化学合成操作の又
はここで記載されるＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主
発現の産物であるとして特徴付けられる。モノマーはオ
リゴマー単位に組込まれていないサブユニットとして定
義される。組換えＶＥＧＦ遺伝子（組換えＤＮＡ）の発
現はいくつかの発現ベクターのうち少なくとも１つを含
むいくつかの異なる宿主細胞により行われる。発現ベク
ターとは適切な宿主における組換えＤＮＡ配列又は遺伝
子のクローン化コピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻
訳に必要とされるＤＮＡ配列としてここでは定義され
る。このようなベクターは細菌、藍藻植物、酵母細胞、
昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞、好ましくは哺乳動物
細胞のような様々な宿主において遺伝子を発現させるた
めに使用できる。その遺伝子はいくつかのウイルス発現
系のうちいずれを用いて発現させてもよい。特に示され
たベクターは細菌−酵母、細菌−植物又は細菌−動物細
胞間でＤＮＡのシャトル化を行える。適切に組立てられ
た発現ベクターは宿主細胞における自己複製用の複製
源、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コ
ピー数、強プロモーター及び効率的な翻訳停止シグナル
を含んでいるべきである。プロモーターはＤＮＡに結合
してＲＮＡ合成を開始させるようにＲＮＡポリメラーゼ
を指示するＤＮＡ配列として定義される。強プロモータ
ーとはｍＲＮＡを高頻度で始動させるものである。発現
ベクターとしては格別限定されず、クローニングベクタ
ー、修正されたクローニングベクター、特にデザインさ
れたプラスミド又はウイルス及びコスミドがある。培養
哺乳動物細胞における哺乳動物遺伝子の発現は当業界で
周知である。サムブルックら、分子クローニング、実験
マニュアル、第２版、第３巻、コールド・スプリングス
・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９年［Samb
rook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l, ２nd Edition, Book ３, Cold Springs Harbor Labo
ratory Press（１９８９）］と分子生物学における現行
プロトコール、オースベルら編集、グリーン・パプリッ
シング・アソシエーツ・アンド・ウィリー・インターサ
イエンス、１９８７年及び補巻（Current Protocols In
Molecular Biology, Ausubel et al., Eds, Greene Pu
blishingAssociates and Wiley Interscience, １９８
７and supplement）は哺乳動物細胞内への組換えベクタ
ーの導入に関する方法と共に様々な哺乳動物発現ベクタ
ー及びベクター系について開示している。Ａ、Ｂ及びＣ
サブユニットのモノマー形に関するｃＤＮＡはラインマ
イヤー（Linemeyer）らの欧州特許出願公開第２５９,９
５３号明細書で記載された場合のような系で発現させる
ことができる。ｃＤＮＡはラインマイヤーらによるのと
同様に修正されたｐＫＫ２２３−３（ファルマシア）の
ような市販プラスミドに組込まれ、大腸菌で発現され
る。他の発現系及び宿主細胞も当業界で周知である。
【００２６】ホモ及びヘテロダイマーの構造と共にＡ、
Ｂ及びＣサブユニットの高Ｃｙｓ含有率及びグリコシル
化部位は、生物活性タンパク質の発現が動物細胞で行え
ることを示唆している。発現はチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞においてジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ｄｈｆｒ）についてコードする遺伝子で dhfr- ＣＨ
Ｏ細胞中に同時トランスフェクトされたクローン化ＶＥ
ＧＦ ＤＮＡにより行ってもよい（サムブルックら）。
ｄｈｆｒを発現する形質転換体はヌクレオシドを欠く培
地で選択され、濃度増加させたメソトレキセートに接触
される。こうしてｄｈｆｒ及びＶＥＧＦ遺伝子は同時増
幅されて、高レベルのＶＥＧＦを発現できる安定な細胞
系を生じる。プラスミドはＡサブユニット、Ｂサブユニ
ット又はＣサブユニットあるいはこれらサブユニットの
いずれか２つの組合せのいずれかについてコードするよ
うにデザインされる。２つのｃＤＮＡは産生されるタン
パク質がダイマーであってＶＥＧＦ生物活性を有するよ
うに作動可能に結合される。作動可能に結合されたと
は、望ましいタンパク質が作動可能に結合された遺伝
子、ｃＤＮＡセグメント又はヌクレオチドを有する発現
ベクターを含む細胞で産生されるようなヌクレオチドセ
グメント、ｃＤＮＡセグメント又は遺伝子の適切な連続
配置に関する。単一サブユニット種を含むプラスミドは
適切な細胞系を同時トランスフェクトするために用いら
れる。
Ｂ及びＣサブユニットの高Ｃｙｓ含有率及びグリコシル
化部位は、生物活性タンパク質の発現が動物細胞で行え
ることを示唆している。発現はチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞においてジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ｄｈｆｒ）についてコードする遺伝子で dhfr- ＣＨ
Ｏ細胞中に同時トランスフェクトされたクローン化ＶＥ
ＧＦ ＤＮＡにより行ってもよい（サムブルックら）。
ｄｈｆｒを発現する形質転換体はヌクレオシドを欠く培
地で選択され、濃度増加させたメソトレキセートに接触
される。こうしてｄｈｆｒ及びＶＥＧＦ遺伝子は同時増
幅されて、高レベルのＶＥＧＦを発現できる安定な細胞
系を生じる。プラスミドはＡサブユニット、Ｂサブユニ
ット又はＣサブユニットあるいはこれらサブユニットの
いずれか２つの組合せのいずれかについてコードするよ
うにデザインされる。２つのｃＤＮＡは産生されるタン
パク質がダイマーであってＶＥＧＦ生物活性を有するよ
うに作動可能に結合される。作動可能に結合されたと
は、望ましいタンパク質が作動可能に結合された遺伝
子、ｃＤＮＡセグメント又はヌクレオチドを有する発現
ベクターを含む細胞で産生されるようなヌクレオチドセ
グメント、ｃＤＮＡセグメント又は遺伝子の適切な連続
配置に関する。単一サブユニット種を含むプラスミドは
適切な細胞系を同時トランスフェクトするために用いら
れる。
【００２７】発現されたタンパク質（ホモダイマー又は
ヘテロダイマー）は標準タンパク質精製プロセスにより
単離かつ精製される。ヘテロダイマー形のＶＥＧＦを発
現できる発現ベクターはＡサブユニットについてコード
するＤＮＡ配列及び／又はＢサブユニットについてコー
ドするＤＮＡ配列及び／又はＣサブユニットについてコ
ードするＤＮＡ配列を２つ含んでいると理解される。ホ
モダイマー形のＶＥＧＦを発現できる発現ベクターは２
つのＡ、２つのＢ又は２つのＣサブユニットのいずれか
についてコードする１又は２いずれかのＤＮＡ配列を含
んでいる。
ヘテロダイマー）は標準タンパク質精製プロセスにより
単離かつ精製される。ヘテロダイマー形のＶＥＧＦを発
現できる発現ベクターはＡサブユニットについてコード
するＤＮＡ配列及び／又はＢサブユニットについてコー
ドするＤＮＡ配列及び／又はＣサブユニットについてコ
ードするＤＮＡ配列を２つ含んでいると理解される。ホ
モダイマー形のＶＥＧＦを発現できる発現ベクターは２
つのＡ、２つのＢ又は２つのＣサブユニットのいずれか
についてコードする１又は２いずれかのＤＮＡ配列を含
んでいる。
【００２８】血管内皮細胞の分裂を刺激しうる様々なＶ
ＥＧＦ種の能力はすべての微異性形及び別のスプライシ
ング形におけるこのタンパク質を薬剤として有用なもの
にする。ここで用いられるタンパク質は前記のようなす
べての微異種形を含むと考えられている。そのタンパク
質は治療の必要な患者への新規タンパク質の投与により
ヒトを含めた哺乳動物の創傷を治癒するために用いるこ
とができる。血管内皮細胞の刺激に関する新規方法は、
栄養培地において望ましい血管内皮細胞のサンプルを哺
乳動物、好ましくはヒト又はラットのＶＥＧＦにより約
１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理することからなる。血
管内皮細胞増殖がインビトロで行われる場合、そのプロ
セスではＤＭＥＭ又はその修正物のような栄養培地と約
０〜２容量％のような低濃度の子ウシ又はウシ血清の存
在を要する。抗生物質のような保存剤も含有させてよ
い；これらは当業界で周知である。
ＥＧＦ種の能力はすべての微異性形及び別のスプライシ
ング形におけるこのタンパク質を薬剤として有用なもの
にする。ここで用いられるタンパク質は前記のようなす
べての微異種形を含むと考えられている。そのタンパク
質は治療の必要な患者への新規タンパク質の投与により
ヒトを含めた哺乳動物の創傷を治癒するために用いるこ
とができる。血管内皮細胞の刺激に関する新規方法は、
栄養培地において望ましい血管内皮細胞のサンプルを哺
乳動物、好ましくはヒト又はラットのＶＥＧＦにより約
１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理することからなる。血
管内皮細胞増殖がインビトロで行われる場合、そのプロ
セスではＤＭＥＭ又はその修正物のような栄養培地と約
０〜２容量％のような低濃度の子ウシ又はウシ血清の存
在を要する。抗生物質のような保存剤も含有させてよ
い；これらは当業界で周知である。
【００２９】本発明の新規増殖因子は血管内皮細胞によ
る人工血管のカバーに有用である。患者からの血管内皮
細胞は末端血管又は毛細血管含有組織の小セグメントの
除去により得られ、望ましい細胞はＶＥＧＦと増殖に必
要ないずれか他の補助成分の存在下で培養増殖される。
合成ポリマー血管をカバーするため充分数の内皮細胞の
培養増殖後に、細胞は固定されたヘソ血管のような血管
の内表面におかれ、しかる後これが患者に移植される。
一方、管状支持体は患者への移植前にインビトロでＶＥ
ＧＦによりコートされる。移植後内皮細胞は人工表面に
移動して増殖する。フィブリン、コラーゲン、フィブロ
ネクチン又はラミニンのようなタンパク質による共有結
合又は非共有結合いずれかの人工血管の事前コーティン
グは人工表面への細胞付着性を高めるために行われる。
次いで細胞ライニング人工血管は患者に外科的に移植さ
れ、患者自身の細胞でライニングされると、免疫学的に
適合化するであろう。非トロンボゲン性内皮細胞ライニ
ングは人工血管の表面上における血餅形成の発生率を減
少させ、それにより他の箇所における血管閉塞又は塞栓
症の傾向を減少させる。
る人工血管のカバーに有用である。患者からの血管内皮
細胞は末端血管又は毛細血管含有組織の小セグメントの
除去により得られ、望ましい細胞はＶＥＧＦと増殖に必
要ないずれか他の補助成分の存在下で培養増殖される。
合成ポリマー血管をカバーするため充分数の内皮細胞の
培養増殖後に、細胞は固定されたヘソ血管のような血管
の内表面におかれ、しかる後これが患者に移植される。
一方、管状支持体は患者への移植前にインビトロでＶＥ
ＧＦによりコートされる。移植後内皮細胞は人工表面に
移動して増殖する。フィブリン、コラーゲン、フィブロ
ネクチン又はラミニンのようなタンパク質による共有結
合又は非共有結合いずれかの人工血管の事前コーティン
グは人工表面への細胞付着性を高めるために行われる。
次いで細胞ライニング人工血管は患者に外科的に移植さ
れ、患者自身の細胞でライニングされると、免疫学的に
適合化するであろう。非トロンボゲン性内皮細胞ライニ
ングは人工血管の表面上における血餅形成の発生率を減
少させ、それにより他の箇所における血管閉塞又は塞栓
症の傾向を減少させる。
【００３０】新規タンパク質は人工血管の産生にも有用
である。患者から血管内皮細胞及び平滑筋細胞が取出さ
れ、別々に培養増殖される。内皮細胞は前記のようにＶ
ＥＧＦの存在下で増殖される。平滑筋は当業界で周知の
操作により培養増殖される。生体適合性ポリマーの管状
メッシュマトリックス（タンパク質のコーティングがあ
る又はない合成ポリマーあるいは外科縫合糸のような非
免疫原性バイオポリマー物質）は外側における平滑筋細
胞及び内表面における血管内皮細胞の培養増殖を支持す
るために用いられる。内皮細胞が内表面で集密化単層を
形成して複数層の平滑筋細胞が外部をカバーしてから、
その血管が患者に移植される。
である。患者から血管内皮細胞及び平滑筋細胞が取出さ
れ、別々に培養増殖される。内皮細胞は前記のようにＶ
ＥＧＦの存在下で増殖される。平滑筋は当業界で周知の
操作により培養増殖される。生体適合性ポリマーの管状
メッシュマトリックス（タンパク質のコーティングがあ
る又はない合成ポリマーあるいは外科縫合糸のような非
免疫原性バイオポリマー物質）は外側における平滑筋細
胞及び内表面における血管内皮細胞の培養増殖を支持す
るために用いられる。内皮細胞が内表面で集密化単層を
形成して複数層の平滑筋細胞が外部をカバーしてから、
その血管が患者に移植される。
【００３１】新規ペプチドは組織修復又は増殖の誘導に
用いることもできる。純粋なＶＥＧＦは血管増殖及び／
又は修復を誘導させることで組織の増殖を誘導及び促進
するために用いられる。そのペプチドは組織修復のため
局所的に又は血管修復のため静脈内で用いることができ
る。表面創傷の新血管新生及び治癒を要する適用の場
合、処方物は約１０ｎｇ〜約１ｍｇ／cm2 ／日の割合で
直接適用される。血管修復の場合、ＶＥＧＦは約１ｎｇ
〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日の割合で静脈内投与され
る。内部血管増殖の場合、処方物は埋込まれた徐放出ポ
リマー物質から又は徐放出ポンプもしくは反復注射から
新血管新生すべき領域に直接放出される。いずれのケー
スにおける放出速度も約１０ｎｇ〜約１００μg／日／c
m3である。
用いることもできる。純粋なＶＥＧＦは血管増殖及び／
又は修復を誘導させることで組織の増殖を誘導及び促進
するために用いられる。そのペプチドは組織修復のため
局所的に又は血管修復のため静脈内で用いることができ
る。表面創傷の新血管新生及び治癒を要する適用の場
合、処方物は約１０ｎｇ〜約１ｍｇ／cm2 ／日の割合で
直接適用される。血管修復の場合、ＶＥＧＦは約１ｎｇ
〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日の割合で静脈内投与され
る。内部血管増殖の場合、処方物は埋込まれた徐放出ポ
リマー物質から又は徐放出ポンプもしくは反復注射から
新血管新生すべき領域に直接放出される。いずれのケー
スにおける放出速度も約１０ｎｇ〜約１００μg／日／c
m3である。
【００３２】非局所適用の場合、ＶＥＧＦは標準的製剤
実務に従い医薬組成物においてリン酸緩衝剤、塩水、リ
ン酸緩衝液、リンゲル液等のような薬学上許容されるキ
ャリア又は希釈剤と組合せて投与される。局所適用の場
合、様々な医薬処方物が本発明の活性化合物の投与上有
用である。このような処方物としては格別限定されず、
親水性ワセリン又はポリエチレングリコール軟膏のよう
な軟膏；キサンゴムのようなゴムを含有していてもよい
ペースト；アルコール性又は水性溶液のような溶液；
水酸化アルミニウム又はアルギン酸ナトリウムゲルのよ
うなゲル； ヒト又は動物アルブミンのようなアルブミ
ン；ヒト又は動物コラーゲンのようなコラーゲン；アル
キルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース及びア
ルキルヒドロキシアルキルセルロース、例えばメチルセ
ルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース
及びヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロー
ス；プルロニック（Pluronic（商標））Ｆ−１２７で例
示されるプルロニックポリオールのようなポリオキサマ
ー；テトロニック（tetronic）１５０８のようなテトロ
ニクス；アルギン酸ナトリウムのようなアルギネートが
ある。
実務に従い医薬組成物においてリン酸緩衝剤、塩水、リ
ン酸緩衝液、リンゲル液等のような薬学上許容されるキ
ャリア又は希釈剤と組合せて投与される。局所適用の場
合、様々な医薬処方物が本発明の活性化合物の投与上有
用である。このような処方物としては格別限定されず、
親水性ワセリン又はポリエチレングリコール軟膏のよう
な軟膏；キサンゴムのようなゴムを含有していてもよい
ペースト；アルコール性又は水性溶液のような溶液；
水酸化アルミニウム又はアルギン酸ナトリウムゲルのよ
うなゲル； ヒト又は動物アルブミンのようなアルブミ
ン；ヒト又は動物コラーゲンのようなコラーゲン；アル
キルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース及びア
ルキルヒドロキシアルキルセルロース、例えばメチルセ
ルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース
及びヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロー
ス；プルロニック（Pluronic（商標））Ｆ−１２７で例
示されるプルロニックポリオールのようなポリオキサマ
ー；テトロニック（tetronic）１５０８のようなテトロ
ニクス；アルギン酸ナトリウムのようなアルギネートが
ある。
【実施例】実施例 １ ＧＳ−９Ｌ細胞で馴致した培地の調製 ＧＳ−９Ｌ細胞をダルベッコ改良イーグル培地／１０％
新生児子ウシ血清（ＤＭＥＭ−ＮＣＳ）を含む１７５ｃ
ｍ2 の組織培養フラスコ中で集密化するまで生育させ
た。集密化した時点で培地をフラスコから傾瀉して除
き、フラスコをカルシウム及びマグネシウムを含まない
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞をトリプシ
ン／ＥＤＴＡ（ギブコ）の１倍溶液で処理して取り出し
た。細胞（１×１０8）を遠心によって沈降させＤＭＥ
Ｍ／５％ＮＣＳに浮遊させ、１０レベル（表面積６００
０ｃｍ2）のセルファクトリー（ＮＵＮＣ）に入れた。
５％ＣＯ2雰囲気中３７℃で７２時間インキュベートし
た後培地を傾瀉しセルファクトリーをＰＢＳで３回洗浄
した。細胞に２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.４、５μｇ
／mlインシュリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン及
び１．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有するハム
のＦ−１２／ＤＭＥＭ１：２混合液１５００ｍｌを加え
た。２４時間後この培地を新しいＦ−１２／ＤＭＥＭに
変え、その後は４８時間毎に集めた。この馴致培地をワ
ットマン＃１濾紙で濾過して細胞デブリを除去し、−２
０℃で冷凍貯蔵した。
新生児子ウシ血清（ＤＭＥＭ−ＮＣＳ）を含む１７５ｃ
ｍ2 の組織培養フラスコ中で集密化するまで生育させ
た。集密化した時点で培地をフラスコから傾瀉して除
き、フラスコをカルシウム及びマグネシウムを含まない
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞をトリプシ
ン／ＥＤＴＡ（ギブコ）の１倍溶液で処理して取り出し
た。細胞（１×１０8）を遠心によって沈降させＤＭＥ
Ｍ／５％ＮＣＳに浮遊させ、１０レベル（表面積６００
０ｃｍ2）のセルファクトリー（ＮＵＮＣ）に入れた。
５％ＣＯ2雰囲気中３７℃で７２時間インキュベートし
た後培地を傾瀉しセルファクトリーをＰＢＳで３回洗浄
した。細胞に２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.４、５μｇ
／mlインシュリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン及
び１．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有するハム
のＦ−１２／ＤＭＥＭ１：２混合液１５００ｍｌを加え
た。２４時間後この培地を新しいＦ−１２／ＤＭＥＭに
変え、その後は４８時間毎に集めた。この馴致培地をワ
ットマン＃１濾紙で濾過して細胞デブリを除去し、−２
０℃で冷凍貯蔵した。
【００３３】実施例 ２ ＶＥＧＦ ＡＡ及びＶＥＧＦ ＡＢのカルボキシメチル−
セファデックスクロマトグラフィー 実施例１で得たＧＳ−９Ｌ馴致培地を解凍し、１Ｍ ＨＣ
ｌでｐＨ６.０にした。１Ｎ ＨＣｌでｐＨ６.０に調整
したＰＢＳで予め平衡化したＣＭセファデックスＣ−５
０カチオン交換（ファーマシア）樹脂２ｇを馴致培地２
０ｌに加えた。この混合液を４℃で２４時間低速で攪拌
した。次いで樹脂を沈降させ、培地を吸引して除いた。
残存する樹脂スラリーを直径３．０ｃｍのカラムに充填
し、残存する培地を流出させた。非結合タンパク質を
０.１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍリン酸ナトリ
ウムｐＨ６．０でカラムから洗い落した。次いで０.６
Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍリン酸ナトリウムｐ
Ｈ６．０を用いて血管内皮成長因子活性をカラムから溶
離した。
セファデックスクロマトグラフィー 実施例１で得たＧＳ−９Ｌ馴致培地を解凍し、１Ｍ ＨＣ
ｌでｐＨ６.０にした。１Ｎ ＨＣｌでｐＨ６.０に調整
したＰＢＳで予め平衡化したＣＭセファデックスＣ−５
０カチオン交換（ファーマシア）樹脂２ｇを馴致培地２
０ｌに加えた。この混合液を４℃で２４時間低速で攪拌
した。次いで樹脂を沈降させ、培地を吸引して除いた。
残存する樹脂スラリーを直径３．０ｃｍのカラムに充填
し、残存する培地を流出させた。非結合タンパク質を
０.１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍリン酸ナトリ
ウムｐＨ６．０でカラムから洗い落した。次いで０.６
Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍリン酸ナトリウムｐ
Ｈ６．０を用いて血管内皮成長因子活性をカラムから溶
離した。
【００３４】実施例 ３ ＶＥＧＦ ＡＡ及びＶＥＧＦ ＡＢのコンカナバリンＡ
（Ｃｏｎ Ａ）レクチンアフィニティークロマトグラフ
ィー 充填済Ｃｏｎ Ａアガロース（ベクター ラボラトリー
ス）約５ｍｌを含有する直径０．９ｃｍのカラムを１ｍ
Ｍ Ｃａ++、１ｍＭ Ｍｎ++及び０.６Ｍ ＮａＣｌを含有
する０．０５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６．０で平衡化し
た。ＣＭセファデックスＣ−５０カラム、（実施例２）
から得た活性溶出液をＣｏｎ Ａアガロースに加え、非
結合タンパク質を平衡緩衝液でカラムから洗い出した。
次いでカラムを１ｍＭ Ｃａ++、１ｍＭ Ｍｎ++及び０.
１Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、
ｐＨ６．０、３カラム容量ですすいだ。続いて０．３２
Ｍα−メチルマンノシドと０．２８Ｍα−メチルグルコ
シドを加えたこの緩衝液を注いで結合タンパク質をカラ
ムから溶離した。
（Ｃｏｎ Ａ）レクチンアフィニティークロマトグラフ
ィー 充填済Ｃｏｎ Ａアガロース（ベクター ラボラトリー
ス）約５ｍｌを含有する直径０．９ｃｍのカラムを１ｍ
Ｍ Ｃａ++、１ｍＭ Ｍｎ++及び０.６Ｍ ＮａＣｌを含有
する０．０５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６．０で平衡化し
た。ＣＭセファデックスＣ−５０カラム、（実施例２）
から得た活性溶出液をＣｏｎ Ａアガロースに加え、非
結合タンパク質を平衡緩衝液でカラムから洗い出した。
次いでカラムを１ｍＭ Ｃａ++、１ｍＭ Ｍｎ++及び０.
１Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、
ｐＨ６．０、３カラム容量ですすいだ。続いて０．３２
Ｍα−メチルマンノシドと０．２８Ｍα−メチルグルコ
シドを加えたこの緩衝液を注いで結合タンパク質をカラ
ムから溶離した。
【００３５】実施例 ４ ＶＥＧＦ ＡＡ及びＶＥＧＦ ＡＢのポリアスパラギン酸
ＷＣＸ ＨＰＬＣカチオン交換クロマトグラフィー Ｃｏｎ Ａカラム（実施例３）で得た活性溶出液を、０.
０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０で予め平衡
化した２５ｃｍ×４．６ｍｍポリ（アスパラギン酸）Ｗ
ＣＸカチオン交換ＨＰＬＣカラム（ネストグループ）に
加えた。カラムをこの緩衝液中０〜０．７５Ｍ ＮａＣ
ｌの直線勾配を用いて流速０.７５ｍｌ／分で６０分か
けて溶離し、０．７５ｍｌづつの画分を集めた。約２
１.７〜２８.５ｍｌで溶離する画分に存在するＶＥＧＦ
ＡＢをプールした。
ＷＣＸ ＨＰＬＣカチオン交換クロマトグラフィー Ｃｏｎ Ａカラム（実施例３）で得た活性溶出液を、０.
０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０で予め平衡
化した２５ｃｍ×４．６ｍｍポリ（アスパラギン酸）Ｗ
ＣＸカチオン交換ＨＰＬＣカラム（ネストグループ）に
加えた。カラムをこの緩衝液中０〜０．７５Ｍ ＮａＣ
ｌの直線勾配を用いて流速０.７５ｍｌ／分で６０分か
けて溶離し、０．７５ｍｌづつの画分を集めた。約２
１.７〜２８.５ｍｌで溶離する画分に存在するＶＥＧＦ
ＡＢをプールした。
【００３６】実施例 ５ 金属キレートクロマトグラフィー ＶＥＧＦ ＡＢ を含有するポリ（アスパラギン酸）ＷＣ
Ｘカラム（実施例４）で得た活性画分をプールしてｐＨ
７.０に調整し、過剰量の塩化銅でチャージし、２Ｍ Ｎ
ａＣｌと０．５ｍＭイミダゾールを含有する０.０５Ｍ
リン酸ナトリウムｐＨ７．０（Ａ緩衝液）で平衡化した
ファーマシアキレーティングセファロース６Ｂ １×１
０ｃｍカラムにかけた。Ｂ緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌと１
００ｍＭイミダゾールを含有する０.０５Ｍリン酸ナト
リウム、ｐＨ７.０）の勾配０〜２０％Ｂで１０分間、
２０〜３５％Ｂで４５分間及び３５〜１００％Ｂで５分
間を用いて流速０．３ｍｌ／分でＶＥＧＦ ＡＢをカラ
ムから溶離した。勾配溶出量１２．６〜２２．８ｍｌで
溶離するＶＥＧＦ ＡＢ活性を含む活性画分をプールし
た。
Ｘカラム（実施例４）で得た活性画分をプールしてｐＨ
７.０に調整し、過剰量の塩化銅でチャージし、２Ｍ Ｎ
ａＣｌと０．５ｍＭイミダゾールを含有する０.０５Ｍ
リン酸ナトリウムｐＨ７．０（Ａ緩衝液）で平衡化した
ファーマシアキレーティングセファロース６Ｂ １×１
０ｃｍカラムにかけた。Ｂ緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌと１
００ｍＭイミダゾールを含有する０.０５Ｍリン酸ナト
リウム、ｐＨ７.０）の勾配０〜２０％Ｂで１０分間、
２０〜３５％Ｂで４５分間及び３５〜１００％Ｂで５分
間を用いて流速０．３ｍｌ／分でＶＥＧＦ ＡＢをカラ
ムから溶離した。勾配溶出量１２．６〜２２．８ｍｌで
溶離するＶＥＧＦ ＡＢ活性を含む活性画分をプールし
た。
【００３７】実施例 ６ 逆相クロマトグラフィー 金属キレートカラム（実施例５）で プールしたＶＥＧ
Ｆ ＡＢ活性を含む画分を、溶媒Ａ（０．１％トリフル
オロ酢酸−ＴＦＡ）で平衡化した４．６ｍｍ×５ｃｍバ
イダックＣ4 逆相ＨＰＬＣカラム（粒子サイズ５μｍ）
に充填した。溶媒Ｂ（６７％アセトニトリルを含有する
Ａ）の 勾配０〜３０％溶媒Ｂで１５分間、３０％Ｂで
更に１５分間、次いで３０〜４５％Ｂで２２．５分間最
後に４５〜１００％Ｂで５．５分間を用いてカラムを溶
離した。流速を０．７５ｍｌ／分に維持した。勾配溶出
量約３２.２〜３７.５ｍｌで溶離するＶＥＧＦ ＡＢ 活
性画分をプールした。
Ｆ ＡＢ活性を含む画分を、溶媒Ａ（０．１％トリフル
オロ酢酸−ＴＦＡ）で平衡化した４．６ｍｍ×５ｃｍバ
イダックＣ4 逆相ＨＰＬＣカラム（粒子サイズ５μｍ）
に充填した。溶媒Ｂ（６７％アセトニトリルを含有する
Ａ）の 勾配０〜３０％溶媒Ｂで１５分間、３０％Ｂで
更に１５分間、次いで３０〜４５％Ｂで２２．５分間最
後に４５〜１００％Ｂで５．５分間を用いてカラムを溶
離した。流速を０．７５ｍｌ／分に維持した。勾配溶出
量約３２.２〜３７.５ｍｌで溶離するＶＥＧＦ ＡＢ 活
性画分をプールした。
【００３８】実施例 ７ マイトジェン アッセイ ２０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地１
９９の５００μｌ中、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶ
Ｅ）を５０００細胞／ウェルの密度でゼラチン被覆４８
穴組織培養皿に接種。接種時に検定される試料を加え
た。この組織培養プレートを３７℃で１２時間インキュ
ベートし、検定培地１ｍｌ当たりトリチウム化チミジン
（ＮＥＮ、２０Ｃｉ／ミリモル）２μＣｉを加えた
（１．０μＣｉ／ウェル）。プレートを更に６０時間イ
ンキュベートし、検定培地を取り出し、プレートを２０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と０．５ｍｇ／ｍｌウシ
血清アルブミンを含有するハンクス液で洗浄した。細胞
を溶解し、標識ＤＮＡを水１００ｍｌ中炭酸ナトリウム
２ｇと水酸化ナトリウム４００ｍｇを含有する溶液２０
０μｌで可溶化した。取込まれた放射能を液体シンチレ
ーションカウンターで定量した。ＨＵＶＥ細胞に１／２
最大マイトジェン応答を誘発したＶＥＧＦ ＡＢ の濃度
は約２±１ｎｇ／ｍｌであった。これらの検定に於て正
の対照である酸性繊維芽成長因子に対する応答を促進す
るために１０〜１００μｇ／ｍｌのレベルで必要とされ
るグリコサミノグリカンヘパリンはこれらの細胞のＶＥ
ＧＦ ＡＢ によるマイトジェン刺激を促進しない。
９９の５００μｌ中、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶ
Ｅ）を５０００細胞／ウェルの密度でゼラチン被覆４８
穴組織培養皿に接種。接種時に検定される試料を加え
た。この組織培養プレートを３７℃で１２時間インキュ
ベートし、検定培地１ｍｌ当たりトリチウム化チミジン
（ＮＥＮ、２０Ｃｉ／ミリモル）２μＣｉを加えた
（１．０μＣｉ／ウェル）。プレートを更に６０時間イ
ンキュベートし、検定培地を取り出し、プレートを２０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と０．５ｍｇ／ｍｌウシ
血清アルブミンを含有するハンクス液で洗浄した。細胞
を溶解し、標識ＤＮＡを水１００ｍｌ中炭酸ナトリウム
２ｇと水酸化ナトリウム４００ｍｇを含有する溶液２０
０μｌで可溶化した。取込まれた放射能を液体シンチレ
ーションカウンターで定量した。ＨＵＶＥ細胞に１／２
最大マイトジェン応答を誘発したＶＥＧＦ ＡＢ の濃度
は約２±１ｎｇ／ｍｌであった。これらの検定に於て正
の対照である酸性繊維芽成長因子に対する応答を促進す
るために１０〜１００μｇ／ｍｌのレベルで必要とされ
るグリコサミノグリカンヘパリンはこれらの細胞のＶＥ
ＧＦ ＡＢ によるマイトジェン刺激を促進しない。
【００３９】実施例 ８ ＶＥＧＦ ＡＢの純度及びタンパク質構造確認 非還元条件下タンパク質の純度をレムリ（Ｌaemmli）の
方法ネーチャー（Ｎature）第２２７巻、６８０〜６８
５頁（１９７０年）に従い１２.５％架橋ゲル中でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより測定した。銀染色ゲルでは見掛けの
質量約５８ｋＤａを有するシングルバンドであった。Ｖ
ＥＧＦ ＡＢ は１５％架橋ゲル中還元条件下ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで見掛けの分子質量約２３ｋＤａを有する幅広い
銀染色バンドとして移動した。
方法ネーチャー（Ｎature）第２２７巻、６８０〜６８
５頁（１９７０年）に従い１２.５％架橋ゲル中でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより測定した。銀染色ゲルでは見掛けの
質量約５８ｋＤａを有するシングルバンドであった。Ｖ
ＥＧＦ ＡＢ は１５％架橋ゲル中還元条件下ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで見掛けの分子質量約２３ｋＤａを有する幅広い
銀染色バンドとして移動した。
【００４０】ＶＥＧＦ ＡＢを水性トリフルオロ酢酸（T
FA）／アセトニトリル混合液中４℃で貯蔵した。この液
組成は前述の精製プロトコールの最終段階に於て逆相Ｃ
4 ＨＰＬＣクロマトグラフィーで均一なタンパク質を溶
離するために使用したのと同じである。精製タンパク質
の一部（１〜２μｇ）を１０×７５ｍｍの酸洗浄ガラス
管で真空蒸発乾固し、アルゴン雰囲気下０．１％ＥＤＴ
Ａと２０ｍＭジチオトレイトール（カルビオケミ、ウル
トロールグレード）を含む０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ
９.５と６Ｍ塩化グアニジニウム１００μｌ中５０℃で
２時間還元した。続いて還元タンパク質を０.１％ＥＤ
ＴＡ、６Ｍ塩化グアニジニウム、９.２μＭ非標識ヨー
ド酢酸及び５０μＣｉのヨード［２−14Ｃ］酢酸（１
７．９ｍＣｉ／ミリモル、アマーシャム）を含有する
０．７ＭトリスｐＨ７．８、１００μｌを添加すること
により２０℃で１時間カルボキシメチル化した。カルボ
キシメチル化の完了後、この混合液を０．１％ＴＦＡで
予め平衡化した４．６ｍｍ×５．０ｃｍバイダックＣ4
カラムに直接のせた。この還元カルボキシメチル化タン
パク質を０．１％ＴＦＡ中０〜６７％（ｖ／ｖ）アセト
ニトリルの４５分直線勾配で流速０．７５ｍｌ／分で溶
離することにより再精製し、この溶離溶液中４℃で貯蔵
した。この還元カルボキシメチル化タンパク質は約２３
ｍｌと２５ｍｌで２本のピークとして溶離し、２１０ｎ
ｍに於ける吸光度を監視して測定した場合ほぼ等面積で
あった。
FA）／アセトニトリル混合液中４℃で貯蔵した。この液
組成は前述の精製プロトコールの最終段階に於て逆相Ｃ
4 ＨＰＬＣクロマトグラフィーで均一なタンパク質を溶
離するために使用したのと同じである。精製タンパク質
の一部（１〜２μｇ）を１０×７５ｍｍの酸洗浄ガラス
管で真空蒸発乾固し、アルゴン雰囲気下０．１％ＥＤＴ
Ａと２０ｍＭジチオトレイトール（カルビオケミ、ウル
トロールグレード）を含む０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ
９.５と６Ｍ塩化グアニジニウム１００μｌ中５０℃で
２時間還元した。続いて還元タンパク質を０.１％ＥＤ
ＴＡ、６Ｍ塩化グアニジニウム、９.２μＭ非標識ヨー
ド酢酸及び５０μＣｉのヨード［２−14Ｃ］酢酸（１
７．９ｍＣｉ／ミリモル、アマーシャム）を含有する
０．７ＭトリスｐＨ７．８、１００μｌを添加すること
により２０℃で１時間カルボキシメチル化した。カルボ
キシメチル化の完了後、この混合液を０．１％ＴＦＡで
予め平衡化した４．６ｍｍ×５．０ｃｍバイダックＣ4
カラムに直接のせた。この還元カルボキシメチル化タン
パク質を０．１％ＴＦＡ中０〜６７％（ｖ／ｖ）アセト
ニトリルの４５分直線勾配で流速０．７５ｍｌ／分で溶
離することにより再精製し、この溶離溶液中４℃で貯蔵
した。この還元カルボキシメチル化タンパク質は約２３
ｍｌと２５ｍｌで２本のピークとして溶離し、２１０ｎ
ｍに於ける吸光度を監視して測定した場合ほぼ等面積で
あった。
【００４１】還元カルボキシメチル化後、単離した２つ
のタンパク質サブユニットの試料をポリブレン被覆ガラ
ス繊維フィルターに各々加え、製造業者の指示書に従い
フェニルチオヒダントインラインアナライザーのＡＢＩ
１２０Ａに連結したＡＢＩ気相マイクロシークエンサー
でエドマン分解によりＮ−末端配列を決定した。約２５
ｍｌ（Ａサブユニット）で溶離する吸光度ピークからは
ＶＥＧＦ ＡＡ と同一のアミノ末端配列 Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ ＧｌｎＬｙｓ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ（配列番号ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１）を得た。約２３ｍｌ（Ｂサブユニッ
ト）で溶離する吸光度ピークからはＮ−末端配列Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｘａａ Ｓeｒ
Ｔｈｒ ＧｌｕＭｅｔ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐ
ｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
と それに加えほぼ同量の、最初の３残基を失った末端
切除同一配列型を得た。消失しているＸ残基はクローン
化配列のＡｓｎに相当する。この消失Ａｓｎは古典的Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ Ｎ-グリコシル化配列中にあ
ることからグリコシル化されることが推定される。Ａ鎖
とＢ鎖ペプチドの合計はほぼ同量で回収されるため、２
つのペプチドが結合してＶＥＧＦ II のＡＢ異種二量体
を形成するという説明が支持された。還元カルボキシメ
チル化Ａ及びＢサブユニット（各々６５０ｎｇ）を１０
×７５ｍｍの酸洗浄ガラス管中で各々真空蒸発乾燥させ
た。リシン残基のカルボキシル末端側で切断するＬｙｓ
Ｃ プロテアーゼ（５０ｎｇ、ベーリンガーマンハイ
ム、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．１％ＥＤＴＡ１
００μｌ）を各試験管に加えた。基質タンパク質サブユ
ニットを３７℃で８時間別々に消化させ、得られたポリ
ペプチドを０．１％ＴＦＡで平衡化した４．６ｍｍ×２
５ｃｍのバイダックＣ18カラムによる逆相ＨＰＬＣクロ
マトグラフィーで分離した。ポリペプチドを０.１％Ｔ
ＦＡ中０〜６７％アセトニトリルの２時間直線勾配を用
いて流速０．７５ｍｌ／分で２０℃に於て溶離して分画
した。個々のピークを手で集め、この溶離溶液中４℃で
貯蔵した。
のタンパク質サブユニットの試料をポリブレン被覆ガラ
ス繊維フィルターに各々加え、製造業者の指示書に従い
フェニルチオヒダントインラインアナライザーのＡＢＩ
１２０Ａに連結したＡＢＩ気相マイクロシークエンサー
でエドマン分解によりＮ−末端配列を決定した。約２５
ｍｌ（Ａサブユニット）で溶離する吸光度ピークからは
ＶＥＧＦ ＡＡ と同一のアミノ末端配列 Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ ＧｌｎＬｙｓ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ（配列番号ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１）を得た。約２３ｍｌ（Ｂサブユニッ
ト）で溶離する吸光度ピークからはＮ−末端配列Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｘａａ Ｓeｒ
Ｔｈｒ ＧｌｕＭｅｔ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐ
ｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
と それに加えほぼ同量の、最初の３残基を失った末端
切除同一配列型を得た。消失しているＸ残基はクローン
化配列のＡｓｎに相当する。この消失Ａｓｎは古典的Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ Ｎ-グリコシル化配列中にあ
ることからグリコシル化されることが推定される。Ａ鎖
とＢ鎖ペプチドの合計はほぼ同量で回収されるため、２
つのペプチドが結合してＶＥＧＦ II のＡＢ異種二量体
を形成するという説明が支持された。還元カルボキシメ
チル化Ａ及びＢサブユニット（各々６５０ｎｇ）を１０
×７５ｍｍの酸洗浄ガラス管中で各々真空蒸発乾燥させ
た。リシン残基のカルボキシル末端側で切断するＬｙｓ
Ｃ プロテアーゼ（５０ｎｇ、ベーリンガーマンハイ
ム、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．１％ＥＤＴＡ１
００μｌ）を各試験管に加えた。基質タンパク質サブユ
ニットを３７℃で８時間別々に消化させ、得られたポリ
ペプチドを０．１％ＴＦＡで平衡化した４．６ｍｍ×２
５ｃｍのバイダックＣ18カラムによる逆相ＨＰＬＣクロ
マトグラフィーで分離した。ポリペプチドを０.１％Ｔ
ＦＡ中０〜６７％アセトニトリルの２時間直線勾配を用
いて流速０．７５ｍｌ／分で２０℃に於て溶離して分画
した。個々のピークを手で集め、この溶離溶液中４℃で
貯蔵した。
【００４２】次に単離ペプチドのアミノ酸配列をフェニ
ルチオヒダントインラインアナライザー（アプライドバ
イオシステムスＩｎｔ．）のＡＢＩ１２０Ａと連結した
ＡＢＩ気相シークエネーターでエドマン分解を用いて決
定した。このペプチド配列を次の図２及び３に示す。Ｌ
ｙｓ Ｃ 断片Ｌ１２０のアミノ酸配列（図５）は異種二
量体のＶＥＧＦ ＡＢ 成熟Ａサブユニット型が１６４ア
ミノ酸型であることを証明している。Ｌｙｓ Ｃ断片Ｌ
２６のアミノ酸配列（図３）は 異種二量体のＶＥＧＦ
ＡＢ 成熟Ｂサブユニット型が１５８全長アミノ酸型に
由来した１３５アミノ酸型であることを証明している。
ルチオヒダントインラインアナライザー（アプライドバ
イオシステムスＩｎｔ．）のＡＢＩ１２０Ａと連結した
ＡＢＩ気相シークエネーターでエドマン分解を用いて決
定した。このペプチド配列を次の図２及び３に示す。Ｌ
ｙｓ Ｃ 断片Ｌ１２０のアミノ酸配列（図５）は異種二
量体のＶＥＧＦ ＡＢ 成熟Ａサブユニット型が１６４ア
ミノ酸型であることを証明している。Ｌｙｓ Ｃ断片Ｌ
２６のアミノ酸配列（図３）は 異種二量体のＶＥＧＦ
ＡＢ 成熟Ｂサブユニット型が１５８全長アミノ酸型に
由来した１３５アミノ酸型であることを証明している。
【００４３】実施例 ９ ＶＥＧＦ Ａモノマーのクローニング及びシークエンシ
ング Ｐ４２３８のＰＣＲ増幅、クローニング及びシークエン
シング ２つの縮重オリゴヌクレオチドをＬｙｓ Ｃ 断片Ｌ４２
とトリプシン断片Ｔ３８間のＶＥＧＦ Ａ サブユニット
のペプチド配列をコードしているｃＤＮＡを増幅させる
ために合成した。これらのオリゴヌクレオチドは Ｌ４２.２ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴ［ＴＣ］ＡＴＧＧＡ［ＴＣ］ＧＴ［Ｎ］ ＴＡ［ＴＣ］ＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３） Ｔ３８３’Ｂ ５’ＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡ［ＡＧ］ＴＣ［Ｎ］ＧＴ［ＡＧ］ＴＴ ［ＴＣ］ＴＴ［ＡＧ］ＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４） Ｎ＝ＡＣＧＴ である。ポリＡ+ＲＮＡをＧＳ-９Ｌ細胞からインビトロ
ジェンの高速トラックＲＮＡ単離キットと提示プロトコ
ールを用いて単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成を次の通り
行なった。１０μｌ容量中７０℃で５分間インキュベー
トした後室温に冷却することによりＧＳ−９Ｌ ＲＮＡ
１μｇを５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５）のアダプタープライマーＴＡ１７、１μｇ
にアニールした。この反応液に ３．０μｌ 水 ２．５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ
ｐＨ８．３、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
2、５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ １００ｍＭ ＤＴＴ ２．５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ ０．６μｌ １５単位ＲＮasin ２．５μｌ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １．５μｌ １５単位逆転写酵素 を加え、この反応液を４２℃で１時間インキュベート
し、次に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
ｐＨ７．５で１ｍｌまで希釈した。
ング Ｐ４２３８のＰＣＲ増幅、クローニング及びシークエン
シング ２つの縮重オリゴヌクレオチドをＬｙｓ Ｃ 断片Ｌ４２
とトリプシン断片Ｔ３８間のＶＥＧＦ Ａ サブユニット
のペプチド配列をコードしているｃＤＮＡを増幅させる
ために合成した。これらのオリゴヌクレオチドは Ｌ４２.２ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴ［ＴＣ］ＡＴＧＧＡ［ＴＣ］ＧＴ［Ｎ］ ＴＡ［ＴＣ］ＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３） Ｔ３８３’Ｂ ５’ＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡ［ＡＧ］ＴＣ［Ｎ］ＧＴ［ＡＧ］ＴＴ ［ＴＣ］ＴＴ［ＡＧ］ＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４） Ｎ＝ＡＣＧＴ である。ポリＡ+ＲＮＡをＧＳ-９Ｌ細胞からインビトロ
ジェンの高速トラックＲＮＡ単離キットと提示プロトコ
ールを用いて単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成を次の通り
行なった。１０μｌ容量中７０℃で５分間インキュベー
トした後室温に冷却することによりＧＳ−９Ｌ ＲＮＡ
１μｇを５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５）のアダプタープライマーＴＡ１７、１μｇ
にアニールした。この反応液に ３．０μｌ 水 ２．５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ
ｐＨ８．３、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
2、５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ １００ｍＭ ＤＴＴ ２．５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ ０．６μｌ １５単位ＲＮasin ２．５μｌ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １．５μｌ １５単位逆転写酵素 を加え、この反応液を４２℃で１時間インキュベート
し、次に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
ｐＨ７．５で１ｍｌまで希釈した。
【００４４】ＰＣＲ反応： 一次反応（１００μｌ） １０μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧｅ
ｎｅＡｍｐキット １６μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの各原液 ２μｌ 第１鎖 ＧＳ９Ｌ ｃＤＮＡ ２μｌ ５０ピコモル Ｌ４２．２ ２μｌ ５０ピコモル Ｔ３８３Ｂ ０.５μｌ ２．５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラー
ゼ ６７.５μｌ 水 反応条件９４℃、１’、５０℃、２’３０”７２℃、
２’の４０サイクル Ｐｒｅｐスケール二次反応 １００μｌ １０×緩衝液 １６０μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの各原液 １０μｌ ＰＣＲ一次反応液 ２０μｌ ５００ピコモルＬ４２．２ ２０μｌ ５００ピコモルＴ３８３Ｂ ５μｌ ２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ６８５μｌ 水 反応条件９４℃、１’、５５℃、２’、７２℃、２’、
３０サイクル
ｎｅＡｍｐキット １６μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの各原液 ２μｌ 第１鎖 ＧＳ９Ｌ ｃＤＮＡ ２μｌ ５０ピコモル Ｌ４２．２ ２μｌ ５０ピコモル Ｔ３８３Ｂ ０.５μｌ ２．５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラー
ゼ ６７.５μｌ 水 反応条件９４℃、１’、５０℃、２’３０”７２℃、
２’の４０サイクル Ｐｒｅｐスケール二次反応 １００μｌ １０×緩衝液 １６０μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの各原液 １０μｌ ＰＣＲ一次反応液 ２０μｌ ５００ピコモルＬ４２．２ ２０μｌ ５００ピコモルＴ３８３Ｂ ５μｌ ２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ６８５μｌ 水 反応条件９４℃、１’、５５℃、２’、７２℃、２’、
３０サイクル
【００４５】ＰＣＲ生成物をセントリコン３０スピンカ
ラムで濃縮し、１％アガロースゲルで精製し、制限エン
ドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。次にＳａｌＩ断
片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した。こ
の連結ミックスを用いてＥ．coli ＸＬ-１ブルーを形質
転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞から単
離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を決定した。ｐＷ−３のＰＣＲ増幅、クローニング及びシークエンシ
ング ｐ４２３８クローンから得た配列に基づいて２つの特定
ＰＣＲプライマーを合成した。オリゴ３０７ ５’ＴＴ
ＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＣ
３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及びオリゴ２８９ ５’ＴＴ
ＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＡＧＣ
３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７。 これらのプライマーをオ
リゴＡ１７ ５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ
３’ＳＥＱ ＩＤＮＯ：８と一緒に使用して ＶＥＧＦ
ＡサブユニットのＣＯＯＨ末端をコードしているｃＤＮ
Ａをフローマン（Frohman）等 ＰＮＡＳ第８５巻、８９
９８−９００２頁（１９８８年）に記載される３’ＲＡ
ＣＥ手法を用いて増幅させた。
ラムで濃縮し、１％アガロースゲルで精製し、制限エン
ドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。次にＳａｌＩ断
片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した。こ
の連結ミックスを用いてＥ．coli ＸＬ-１ブルーを形質
転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞から単
離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を決定した。ｐＷ−３のＰＣＲ増幅、クローニング及びシークエンシ
ング ｐ４２３８クローンから得た配列に基づいて２つの特定
ＰＣＲプライマーを合成した。オリゴ３０７ ５’ＴＴ
ＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＣ
３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及びオリゴ２８９ ５’ＴＴ
ＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＡＧＣ
３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７。 これらのプライマーをオ
リゴＡ１７ ５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ
３’ＳＥＱ ＩＤＮＯ：８と一緒に使用して ＶＥＧＦ
ＡサブユニットのＣＯＯＨ末端をコードしているｃＤＮ
Ａをフローマン（Frohman）等 ＰＮＡＳ第８５巻、８９
９８−９００２頁（１９８８年）に記載される３’ＲＡ
ＣＥ手法を用いて増幅させた。
【００４６】ＰＣＲ反応： 一次反応１００μｌ １０μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧene
Ａmp キット １８μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの各原液 0.35μｌ 第１鎖 ＧＳ−９Ｌ ｃＤＮＡ ２μｌ ５０ピコモルオリゴ２８９ 0.5μｌ ２．５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 67.15μｌ 水 反応条件９４℃、１’、５８℃、２’、７２℃、２’、
１０サイクル次いで５０ｐモルＡ１７を添加した後９４
℃、１’、５８℃、２’、７２℃、４０’１サイクル次
いで９４℃、１’、５８℃、２’７２℃、２’４０サイ
クル Ｐｒｅｐスケール二次反応： ６０μｌ １０×緩衝液 １０８μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＰＴ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの各原液 ２４μｌ ＰＣＲ一次反応液 １２μｌ ３００ピコモル オリゴ３０７ １２μｌ ３００ピコモル オリゴＡ１７ ３μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ３８１μｌ 水 反応条件９４℃、１’、５８℃、２’、７２℃、２’、
３０サイクル ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルで精製し制限エンド
ヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。次にＳａｌＩ断片
をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した。この
連結ミックスを用いてＥ.Ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを形
質転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞から
単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を決定した。
Ａmp キット １８μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの各原液 0.35μｌ 第１鎖 ＧＳ−９Ｌ ｃＤＮＡ ２μｌ ５０ピコモルオリゴ２８９ 0.5μｌ ２．５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 67.15μｌ 水 反応条件９４℃、１’、５８℃、２’、７２℃、２’、
１０サイクル次いで５０ｐモルＡ１７を添加した後９４
℃、１’、５８℃、２’、７２℃、４０’１サイクル次
いで９４℃、１’、５８℃、２’７２℃、２’４０サイ
クル Ｐｒｅｐスケール二次反応： ６０μｌ １０×緩衝液 １０８μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＰＴ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの各原液 ２４μｌ ＰＣＲ一次反応液 １２μｌ ３００ピコモル オリゴ３０７ １２μｌ ３００ピコモル オリゴＡ１７ ３μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ３８１μｌ 水 反応条件９４℃、１’、５８℃、２’、７２℃、２’、
３０サイクル ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルで精製し制限エンド
ヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。次にＳａｌＩ断片
をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した。この
連結ミックスを用いてＥ.Ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを形
質転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞から
単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を決定した。
【００４７】ｐ５−１５のＰＲＣ増幅、クローニング及
びシークエンシング ｐ４２３８クローン配列に基づいて２つの特定ＰＣＲプ
ライマーを合成した。オリゴ１１３ ５'ＴＴＴＧＴＣＧ
ＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＡＧ３’ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：９及びオリゴ７４ ５'ＴＴＴＧＴＣＧＡ
ＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣ ３' ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１０ これらの２プライマーをオリゴ１７ ５’ＧＡＣＴＣＧ
ＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と
一緒に用いて ＶＥＧＦ Ａサブユニットのアミノ末端を
コードしているｃＤＮＡを上記フローマン等によって記
載された５’ＲＡＣＥ手法を用いて増幅させた。オリゴ
１５１をＧＳ−９Ｌ ＲＮＡからのＶＥＧＦ Ａサブユニ
ットｃＤＮＡを特異的に開始させるために合成した。オ
リゴ１５１は５’ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧ
Ｃ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１である。ＲＮＡをＧＳ
−９Ｌ細胞からインビトロジェンの高速トラックＲＮＡ
単離キットを用い提示プロトコールを用いて単離した。
第１鎖ｃＤＮＡ合成を次の通り行なった。
びシークエンシング ｐ４２３８クローン配列に基づいて２つの特定ＰＣＲプ
ライマーを合成した。オリゴ１１３ ５'ＴＴＴＧＴＣＧ
ＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＡＧ３’ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：９及びオリゴ７４ ５'ＴＴＴＧＴＣＧＡ
ＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣ ３' ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１０ これらの２プライマーをオリゴ１７ ５’ＧＡＣＴＣＧ
ＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と
一緒に用いて ＶＥＧＦ Ａサブユニットのアミノ末端を
コードしているｃＤＮＡを上記フローマン等によって記
載された５’ＲＡＣＥ手法を用いて増幅させた。オリゴ
１５１をＧＳ−９Ｌ ＲＮＡからのＶＥＧＦ Ａサブユニ
ットｃＤＮＡを特異的に開始させるために合成した。オ
リゴ１５１は５’ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧ
Ｃ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１である。ＲＮＡをＧＳ
−９Ｌ細胞からインビトロジェンの高速トラックＲＮＡ
単離キットを用い提示プロトコールを用いて単離した。
第１鎖ｃＤＮＡ合成を次の通り行なった。
【００４８】６μｌ容量中７０℃で５分間インキュベー
トした後、室温に冷却することによりＧＳ ９Ｌ ＲＮＡ
１μｇをオリゴ１５１.１μｇにアニールした。この反
応液に １．５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ
ｐＨ８．３、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
2、５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ １０ｍＭ ＤＴＴ ２．５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ ０．６μｌ ２．５単位ＲＮasin ２．５μｌ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム ９．５μｌ ２０単位希釈逆転写酵素 を加えた。この反応液を４２℃で１時間インキュベート
した。余分なオリゴ１５１をセントリコン１００スピン
カラムにより除去しｃＤＮＡの５’末端をｄＡＴＰと末
端トランスフェラーゼを加えてつないだ。この末端につ
ないだｃＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ７.５で最終容量１５０μｌまで希釈し
た。
トした後、室温に冷却することによりＧＳ ９Ｌ ＲＮＡ
１μｇをオリゴ１５１.１μｇにアニールした。この反
応液に １．５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ
ｐＨ８．３、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
2、５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ １０ｍＭ ＤＴＴ ２．５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ ０．６μｌ ２．５単位ＲＮasin ２．５μｌ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム ９．５μｌ ２０単位希釈逆転写酵素 を加えた。この反応液を４２℃で１時間インキュベート
した。余分なオリゴ１５１をセントリコン１００スピン
カラムにより除去しｃＤＮＡの５’末端をｄＡＴＰと末
端トランスフェラーゼを加えてつないだ。この末端につ
ないだｃＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ７.５で最終容量１５０μｌまで希釈し
た。
【００４９】ＰＣＲ反応： 一次反応（５０μｌ） ５μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧeneＡ
mpキット ８μｌ １.２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰの各原液 ５μｌ オリゴ１５１で開始し末端につないだ第１鎖Ｇ
Ｓ−９Ｌ ｃＤＮＡ １μｌ ２５ピコモル オリゴ１１３ １μｌ ２５ピコモル オリゴＡ１７ １μｌ １０ピコモル オリゴＴＡ１７ 0.25μｌ １.２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 28.75μｌ 水 反応条件：１サイクル ９４℃ １’、５０℃ ２’、７
２℃ ４０’次に４０サイクル９４℃１’、５０℃ １’
３０”、７２℃ ２’ Ｐｒｅｐスケール二次反応： ６０μｌ １０×緩衝液 ９６μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの各原液 ６μｌ ＰＣＲ一次反応液 １２μｌ ３００ピコモル オリゴ７４ １２μｌ ３００ピコモル オリゴＡ１７ ３μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 411μｌ 水 反応条件 ９４℃ １’、５５℃ ２’、７２℃ ２’ ３
０サイクル ＰＣＲ生成物をセントリコン１００スピンカラムにより
濃縮し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させ
た。次にＳａｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合した。この連結ミックスを用いてＥ.ｃｏ
ｌｉ ＸＬ−１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮ
Ａを白い形質転換細胞から単離しジデオキシ鎖終結法に
よって配列を決定した。塩基配列を図５に示す。
mpキット ８μｌ １.２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰの各原液 ５μｌ オリゴ１５１で開始し末端につないだ第１鎖Ｇ
Ｓ−９Ｌ ｃＤＮＡ １μｌ ２５ピコモル オリゴ１１３ １μｌ ２５ピコモル オリゴＡ１７ １μｌ １０ピコモル オリゴＴＡ１７ 0.25μｌ １.２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 28.75μｌ 水 反応条件：１サイクル ９４℃ １’、５０℃ ２’、７
２℃ ４０’次に４０サイクル９４℃１’、５０℃ １’
３０”、７２℃ ２’ Ｐｒｅｐスケール二次反応： ６０μｌ １０×緩衝液 ９６μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの各原液 ６μｌ ＰＣＲ一次反応液 １２μｌ ３００ピコモル オリゴ７４ １２μｌ ３００ピコモル オリゴＡ１７ ３μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 411μｌ 水 反応条件 ９４℃ １’、５５℃ ２’、７２℃ ２’ ３
０サイクル ＰＣＲ生成物をセントリコン１００スピンカラムにより
濃縮し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させ
た。次にＳａｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合した。この連結ミックスを用いてＥ.ｃｏ
ｌｉ ＸＬ−１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮ
Ａを白い形質転換細胞から単離しジデオキシ鎖終結法に
よって配列を決定した。塩基配列を図５に示す。
【００５０】ＶＥＧＦ Ａ ｃＤＮＡの別種のクローニン
グ及びシークエンシング ｐ５−１５及びｐＷ−３クローンから得た配列に基づい
て２つの特定ＰＣＲプライマーを合成した；オリゴ５’
Ｃ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣ
ＴＧＣ ３’ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１２及びオリゴ１８１
５'ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＧＧＴＣＴＡＧ
ＴＴＣ ３’ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３。これらのプライ
マーを一緒に用いてＶＥＧＦ Ａサブユニットの別種を
コードしている多重ｃＤＮＡを増幅させた。
グ及びシークエンシング ｐ５−１５及びｐＷ−３クローンから得た配列に基づい
て２つの特定ＰＣＲプライマーを合成した；オリゴ５’
Ｃ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣ
ＴＧＣ ３’ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１２及びオリゴ１８１
５'ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＧＧＴＣＴＡＧ
ＴＴＣ ３’ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３。これらのプライ
マーを一緒に用いてＶＥＧＦ Ａサブユニットの別種を
コードしている多重ｃＤＮＡを増幅させた。
【００５１】分取用ＰＣＲ反応 ５０μｌ １０×緩衝液 ８０μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの各原液 １０μｌ 第１鎖ＧＳ−９Ｌ ｃＤＮＡ １０μｌ ３００ピコモル オリゴ５’Ｃ １０μｌ ３００ピコモル オリゴ１８１ ２.５μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 337.5μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５８℃２’、７２℃３’、４０
サイクル ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、セ
ントリコン３０スピンカラムにより濃縮し、エタノール
で沈降させ、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化さ
せＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させた。こ
の連結ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを
形質転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞か
ら単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を決定し
た。３組のクローンを確認した。クローン#１２は図１
に示されるものと同一のＶＥＧＦ Ａサブユニットの１
９０アミノ酸型をコードした。ＶＥＧＦ Ａ サブユニッ
トの１６４アミノ酸分泌型はＡｌａ27 からＡｒｇ190ま
で連続して続いているものである。クローン＃１４はＡ
ｓｎ140コドンの２番目の塩基とＡｒｇ184コドンの３番
目の塩基の間で１３５塩基対の欠落がある。従ってこの
クローンはＡｓｎ140 をＬｙｓ140に変換したＶＥＧＦ
Ａサブユニットの１４６ａａ型をコードする。ＶＥＧＦ
Ａサブユニットの１２０アミノ酸分泌型はＡｌａ27か
らＡｓｎ140まで続きＬｙｓ140 になりＣｙｓ185 まで
始まらずまたこの型はＡｒｇ190 で終わる、図４。クロ
ーン＃１６はＡｓｎ140 コドンの２番目及び３番目の塩
基の間に７２塩基対の挿入がある。従ってこのクローン
はＡｓｎ140をＬｙｓ140に変換したＶＥＧＦ Ａサブユ
ニットの２１４アミノ酸型をコードする、図６。
及びｄＴＴＰの各原液 １０μｌ 第１鎖ＧＳ−９Ｌ ｃＤＮＡ １０μｌ ３００ピコモル オリゴ５’Ｃ １０μｌ ３００ピコモル オリゴ１８１ ２.５μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 337.5μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５８℃２’、７２℃３’、４０
サイクル ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、セ
ントリコン３０スピンカラムにより濃縮し、エタノール
で沈降させ、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化さ
せＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させた。こ
の連結ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを
形質転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞か
ら単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を決定し
た。３組のクローンを確認した。クローン#１２は図１
に示されるものと同一のＶＥＧＦ Ａサブユニットの１
９０アミノ酸型をコードした。ＶＥＧＦ Ａ サブユニッ
トの１６４アミノ酸分泌型はＡｌａ27 からＡｒｇ190ま
で連続して続いているものである。クローン＃１４はＡ
ｓｎ140コドンの２番目の塩基とＡｒｇ184コドンの３番
目の塩基の間で１３５塩基対の欠落がある。従ってこの
クローンはＡｓｎ140 をＬｙｓ140に変換したＶＥＧＦ
Ａサブユニットの１４６ａａ型をコードする。ＶＥＧＦ
Ａサブユニットの１２０アミノ酸分泌型はＡｌａ27か
らＡｓｎ140まで続きＬｙｓ140 になりＣｙｓ185 まで
始まらずまたこの型はＡｒｇ190 で終わる、図４。クロ
ーン＃１６はＡｓｎ140 コドンの２番目及び３番目の塩
基の間に７２塩基対の挿入がある。従ってこのクローン
はＡｓｎ140をＬｙｓ140に変換したＶＥＧＦ Ａサブユ
ニットの２１４アミノ酸型をコードする、図６。
【００５２】実施例１０ ＶＥＧＦ Ｂサブユニットのクローニング及びシークエ
ンシング ｐＹＧのＰＣＲ増幅、クローニング及びシークエンシン
グ ２つの縮重オリゴヌクレオチドをＬｙｓ Ｃ断片Ｌ５０
のＶＥＧＦ Ｂペプチド配列をコードしているｃＤＮＡ
を増幅させるために合成した。これらのオリゴヌクレオ
チドは ＹＩ ５’ ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡ［ＴＣ］ＡＴ［ＴＣＡ］ＧＣ
［Ｎ］ＧＡ［ＴＣ］ＧＡ［ＡＧ］Ｃ ３’ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１４ ＧＣ ５'ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣ［ＡＧ］ＴＣ［ＡＧ］
ＴＴ［ＡＧ］ＣＡ［ＡＧ］ＣＡ［Ｎ］ＣＣ ３'ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１５（Ｎ＝ＡＣＧＴ）である。ＲＮＡをイ
ンビトロジェンの高速トラックＲＮＡ単離キットと提示
プロトコールを用いてＧＳ−９Ｌ細胞から単離した。第
１鎖ｃＤＮＡ合成は次の通り行なった。１０μｌ容量を
７０℃で５分間インキュベートした後室温に冷却するこ
とによってＧＳ−９ＬポリＡ＋ＲＮＡ １μｇを５'ＧＡ
ＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴ ３'ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアダプタ
ープライマーＴＡ１７、１μｇにアニールした。この混
合液に ３．０μｌ 水 ２．５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８.３、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ １００ｍＭ ＤＴＴ ２．５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ ０．６μｌ １５単位ＲＮasin ２．５μｌ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １．５μｌ １５単位逆転写酵素 を加え、この反応液を４２℃で１時間インキュベート
し、次に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ７．５で１ｍｌまで希釈した。
ンシング ｐＹＧのＰＣＲ増幅、クローニング及びシークエンシン
グ ２つの縮重オリゴヌクレオチドをＬｙｓ Ｃ断片Ｌ５０
のＶＥＧＦ Ｂペプチド配列をコードしているｃＤＮＡ
を増幅させるために合成した。これらのオリゴヌクレオ
チドは ＹＩ ５’ ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡ［ＴＣ］ＡＴ［ＴＣＡ］ＧＣ
［Ｎ］ＧＡ［ＴＣ］ＧＡ［ＡＧ］Ｃ ３’ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１４ ＧＣ ５'ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣ［ＡＧ］ＴＣ［ＡＧ］
ＴＴ［ＡＧ］ＣＡ［ＡＧ］ＣＡ［Ｎ］ＣＣ ３'ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１５（Ｎ＝ＡＣＧＴ）である。ＲＮＡをイ
ンビトロジェンの高速トラックＲＮＡ単離キットと提示
プロトコールを用いてＧＳ−９Ｌ細胞から単離した。第
１鎖ｃＤＮＡ合成は次の通り行なった。１０μｌ容量を
７０℃で５分間インキュベートした後室温に冷却するこ
とによってＧＳ−９ＬポリＡ＋ＲＮＡ １μｇを５'ＧＡ
ＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴ ３'ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアダプタ
ープライマーＴＡ１７、１μｇにアニールした。この混
合液に ３．０μｌ 水 ２．５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８.３、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ １００ｍＭ ＤＴＴ ２．５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ ０．６μｌ １５単位ＲＮasin ２．５μｌ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １．５μｌ １５単位逆転写酵素 を加え、この反応液を４２℃で１時間インキュベート
し、次に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ７．５で１ｍｌまで希釈した。
【００５３】ＰＣＲ反応 一次反応（５０μｌ） ５μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧeneＡ
mpキット ８μｌ １.２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰの各原液 １μｌ 第１鎖ＧＳ−９Ｌ ｃＤＮＡ １μｌ ５０ピコモル オリゴＹＩ １μｌ ５０ピコモル オリゴＧＣ 0.25μｌ １．２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 33.75μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５０℃２’、７２℃２’の４０
サイクル Ｐｒｅｐスケール反応： ６０μｌ １０×緩衝液 ９６μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの各原液 １２μｌ 第１鎖６５９Ｌ ｃＤＮＡ １２μｌ ５００ピコモル オリゴＹＩ １２μｌ ５００ピコモル オリゴＧＣ ３μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 405μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５０℃２’、７２℃２’、４０
サイクル ＰＣＲ生成物をセントリコン３０スピンカラムにより濃
縮し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。
次いでＳａｌＩ切断をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合させた。この連結ミックスを用いてＥ.ｃ
ｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを形質転換した。プラスミドＤ
ＮＡを白い形質転換細胞から単離しジデオキシ鎖終結法
によって配列を決定した。
mpキット ８μｌ １.２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰの各原液 １μｌ 第１鎖ＧＳ−９Ｌ ｃＤＮＡ １μｌ ５０ピコモル オリゴＹＩ １μｌ ５０ピコモル オリゴＧＣ 0.25μｌ １．２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 33.75μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５０℃２’、７２℃２’の４０
サイクル Ｐｒｅｐスケール反応： ６０μｌ １０×緩衝液 ９６μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの各原液 １２μｌ 第１鎖６５９Ｌ ｃＤＮＡ １２μｌ ５００ピコモル オリゴＹＩ １２μｌ ５００ピコモル オリゴＧＣ ３μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 405μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５０℃２’、７２℃２’、４０
サイクル ＰＣＲ生成物をセントリコン３０スピンカラムにより濃
縮し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。
次いでＳａｌＩ切断をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合させた。この連結ミックスを用いてＥ.ｃ
ｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを形質転換した。プラスミドＤ
ＮＡを白い形質転換細胞から単離しジデオキシ鎖終結法
によって配列を決定した。
【００５４】ｐ３Ｖ２のＰＣＲ増幅、クローニング及び
シークエンシング ｐＹＧクローンから得た配列に基づいて特定のＰＣＲプ
ライマーを合成した：５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＣ
ＣＣＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧＴＣ ３’ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１６。このプライマーをＡ１７５'ＧＡＣＴＣＧＡ
ＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ ３’ＳＥＱＩＤ ＮＯ：８と一緒
に用い、フローマン等、ＰＮＡＳ 第８５巻 ８９９８〜
９００２頁（１９８８年）に記載される３'ＲＡＣＥ手
法を用いてＶＥＧＦ ＢサブユニットのＣＯＯＨ末端を
コードしているｃＤＮＡを増幅させた。 分取用ＰＣＲ反応 ６μｌ １０Ｘ緩衝液、パーキンエルマーセタスＧeneＡ
mp キット １２μｌ 第１鎖６５９Ｌ ｃＤＮＡ ９６μｌ １.２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ １２μｌ ３００ピコモル オリゴＡ１７ １２μｌ ３００ピコモル オリゴＨＰ ３μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 405μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５８℃２’、７２℃２’の １サ
イクル、次いで９４℃１’、５８℃２’及び７２℃
２’、４０サイクル ＰＣＲ生成物をセントリコン３０スピンカラムによって
濃縮しエタノールで沈降させ制限エンドヌクレアーゼＳ
aｌＩで消化させた。次にＳaｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐ
ＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させた。この連結ミックスを
用いてＥ．coliＸＬ−１ブルーを形質転換した。プラス
ミドＤＮＡを白い形質転換細胞から単離しジデオキシ鎖
終結法によって配列を決定した。
シークエンシング ｐＹＧクローンから得た配列に基づいて特定のＰＣＲプ
ライマーを合成した：５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＣ
ＣＣＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧＴＣ ３’ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１６。このプライマーをＡ１７５'ＧＡＣＴＣＧＡ
ＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ ３’ＳＥＱＩＤ ＮＯ：８と一緒
に用い、フローマン等、ＰＮＡＳ 第８５巻 ８９９８〜
９００２頁（１９８８年）に記載される３'ＲＡＣＥ手
法を用いてＶＥＧＦ ＢサブユニットのＣＯＯＨ末端を
コードしているｃＤＮＡを増幅させた。 分取用ＰＣＲ反応 ６μｌ １０Ｘ緩衝液、パーキンエルマーセタスＧeneＡ
mp キット １２μｌ 第１鎖６５９Ｌ ｃＤＮＡ ９６μｌ １.２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ １２μｌ ３００ピコモル オリゴＡ１７ １２μｌ ３００ピコモル オリゴＨＰ ３μｌ １５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 405μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５８℃２’、７２℃２’の １サ
イクル、次いで９４℃１’、５８℃２’及び７２℃
２’、４０サイクル ＰＣＲ生成物をセントリコン３０スピンカラムによって
濃縮しエタノールで沈降させ制限エンドヌクレアーゼＳ
aｌＩで消化させた。次にＳaｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐ
ＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させた。この連結ミックスを
用いてＥ．coliＸＬ−１ブルーを形質転換した。プラス
ミドＤＮＡを白い形質転換細胞から単離しジデオキシ鎖
終結法によって配列を決定した。
【００５５】ｐ５Ｖ２のＰＣＲ増幅、クローニング及び
シークエンシング ｐＹＧクローンの配列に基づいて２つの特定ＰＣＲプラ
イマーを合成した：オリゴＶＬ'５’ＴＴＴＧＴＣＧＡ
ＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＧ ３’ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１７及びオリゴＶＳ’５’ＴＴＴＧＴＣＧＡ
ＣＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＡＣＡＣ ３'ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１８。これらのプライマーをオリゴＡ１７
５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣG ３’ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：８と一緒に用い、上記フローマン等によっ
て記載された５’ＲＡＣＥ手法を用いて ＶＥＧＦ Ｂサ
ブユニットのアミノ末端をコードしているｃＤＮＡを増
幅させた。オリゴ１５１をＧＳ-９Ｌ ＲＮＡからのｃＤ
ＮＡを開始させるために合成した。オリゴ１５１は５'
ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣ ３'ＳＥＱ Ｉ
ＤＮＯ：１１である。ポリＡ＋ＲＮＡをインビトロジェ
ンの高速トラックＲＮＡ単離キットを用い提示プロトコ
ールを用いてＧＳ９Ｌ細胞から単離した。第１鎖ｃＤＮ
Ａ合成を次の通り行なった。
シークエンシング ｐＹＧクローンの配列に基づいて２つの特定ＰＣＲプラ
イマーを合成した：オリゴＶＬ'５’ＴＴＴＧＴＣＧＡ
ＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＧ ３’ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１７及びオリゴＶＳ’５’ＴＴＴＧＴＣＧＡ
ＣＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＡＣＡＣ ３'ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１８。これらのプライマーをオリゴＡ１７
５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣG ３’ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：８と一緒に用い、上記フローマン等によっ
て記載された５’ＲＡＣＥ手法を用いて ＶＥＧＦ Ｂサ
ブユニットのアミノ末端をコードしているｃＤＮＡを増
幅させた。オリゴ１５１をＧＳ-９Ｌ ＲＮＡからのｃＤ
ＮＡを開始させるために合成した。オリゴ１５１は５'
ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣ ３'ＳＥＱ Ｉ
ＤＮＯ：１１である。ポリＡ＋ＲＮＡをインビトロジェ
ンの高速トラックＲＮＡ単離キットを用い提示プロトコ
ールを用いてＧＳ９Ｌ細胞から単離した。第１鎖ｃＤＮ
Ａ合成を次の通り行なった。
【００５６】６μｌ容量中７０℃で５分間インキュベー
トした後室温に冷却することによりＧＳ９Ｌ ＲＮＡ １
μｇをオリゴ１５１、１μｇにアニールした。この反応
液に １.５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８．３、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
2、５ｍＭスペルミジン） ２.５μｌ １０ｍＭ ＤＴＴ ２.５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＴＴＰ ０.６μｌ ２５単位ＲＮasin ２.５μｌ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム ９.５μｌ ２０単位希釈逆転写酵素 を加えた。この反応液を４２℃で１時間インキュベート
した。余分なオリゴ１５１をセントリコン１００スピン
カラムによって除去しｃＤＮＡの５’末端をｄＡＴＰと
末端トランスフェラーゼを加えてつないだ。この末端に
つないだｃＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７.５で最終容量１５０μｌまで希釈し
た。
トした後室温に冷却することによりＧＳ９Ｌ ＲＮＡ １
μｇをオリゴ１５１、１μｇにアニールした。この反応
液に １.５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８．３、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
2、５ｍＭスペルミジン） ２.５μｌ １０ｍＭ ＤＴＴ ２.５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＴＴＰ ０.６μｌ ２５単位ＲＮasin ２.５μｌ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム ９.５μｌ ２０単位希釈逆転写酵素 を加えた。この反応液を４２℃で１時間インキュベート
した。余分なオリゴ１５１をセントリコン１００スピン
カラムによって除去しｃＤＮＡの５’末端をｄＡＴＰと
末端トランスフェラーゼを加えてつないだ。この末端に
つないだｃＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７.５で最終容量１５０μｌまで希釈し
た。
【００５７】ＰＣＲ反応： 一次反応（５０μｌ） ５μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧeneＡ
ｍｐキット ８μｌ １．２３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰの各原液 ５μｌ オリゴ１５１で開始し、末端につないだ第１鎖
ＧＳ９Ｌ ｃＤＮＡ １μｌ ２５ピコモル オリゴＶＬ’ １μｌ ２５ピコモル オリゴＡ１７ １μｌ １０ピコモル オリゴＴＡ１７ 0.25μｌ １．２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 28.75μｌ 水 反応条件：１サイクル ９４℃１’、５８℃２’、７２℃
４０’次いで４０サイクル ９４℃１’、５８℃２’、
７２℃２’。 Ｐrepスケール二次反応 １００μｌ １０×緩衝液 １６０μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの各原液 １０μｌ ＰＣＲ一次反応 ２０μｌ ５００ピコモル オリゴＶＳ’ ２０μｌ ３００ピコモル オリゴＡ１７ ５μｌ ２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ６８５μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５８℃２’、７２℃２’、３０
サイクル ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、セ
ントリコン３０スピンカラムにより濃縮しエタノールで
沈降させ、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させ
た。ＳａｌＩ断片を４％Ｎｕ−篩アガロースゲルで精製
し次にＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させ
た。この連結ミックスを用いてＥ.coli ＸＬ−１ブルー
を形質転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞
から単離しジデオキシ鎖終結法によって配列を決定し
た。
ｍｐキット ８μｌ １．２３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰの各原液 ５μｌ オリゴ１５１で開始し、末端につないだ第１鎖
ＧＳ９Ｌ ｃＤＮＡ １μｌ ２５ピコモル オリゴＶＬ’ １μｌ ２５ピコモル オリゴＡ１７ １μｌ １０ピコモル オリゴＴＡ１７ 0.25μｌ １．２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 28.75μｌ 水 反応条件：１サイクル ９４℃１’、５８℃２’、７２℃
４０’次いで４０サイクル ９４℃１’、５８℃２’、
７２℃２’。 Ｐrepスケール二次反応 １００μｌ １０×緩衝液 １６０μｌ １．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰの各原液 １０μｌ ＰＣＲ一次反応 ２０μｌ ５００ピコモル オリゴＶＳ’ ２０μｌ ３００ピコモル オリゴＡ１７ ５μｌ ２５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ６８５μｌ 水 反応条件 ９４℃１’、５８℃２’、７２℃２’、３０
サイクル ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、セ
ントリコン３０スピンカラムにより濃縮しエタノールで
沈降させ、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させ
た。ＳａｌＩ断片を４％Ｎｕ−篩アガロースゲルで精製
し次にＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させ
た。この連結ミックスを用いてＥ.coli ＸＬ−１ブルー
を形質転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞
から単離しジデオキシ鎖終結法によって配列を決定し
た。
【００５８】ｐＣＶ２及びｐＣＶ２．１のＰＣＲ増幅、
クローニング及びシークエンシング ｐ３Ｖ２及びｐ５ＣＶ２クローンの配列に基づいて２つ
の特定のＰＣＲプライマーを合成した：オリゴ５’ＣＶ
２．１ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ［Ｎ］［Ｎ］ＧＣＡＧＧＴＣＣ
ＴＡＧＣＴＧ ３'ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１９及びオリゴ
３’ＣＶ２５’ ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ［Ｎ］［Ｎ］ＣＴＡＡＴＡＡＡＴＡ
ＧＡＧＧＧ ３’ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２０。これらのプラ
イマーを一緒に用いて ＶＧＥＦ Ｂサブユニットをコー
ドしているｃＤＮＡを増幅させた。 分取用ＰＣＲ反応： ４０μｌ １０×緩衝液 ６４μｌ １.２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ ８μｌ 第１鎖ＧＳ−９Ｌ ｃＤＮＡ ８μｌ ２００ピコモル ５’ＣＶ２．１ ８μｌ ２００ピコモル ３’ＣＶ２ ２μｌ １０単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ２７０μｌ 水 反応条件：９４℃１’、５８℃２’、７２℃２’：４０
サイクル ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、セ
ントリコン３０スピンカラムにより濃縮し、エタノール
で沈降させ制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させ
ＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させた。この
連結ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを形
質転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞から
単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を決定した。
２組のクローンを確認し１方が１５８アミノ酸配列をコ
ードし他方が１３８アミノ酸配列をコードした、図７及
び８参照。
クローニング及びシークエンシング ｐ３Ｖ２及びｐ５ＣＶ２クローンの配列に基づいて２つ
の特定のＰＣＲプライマーを合成した：オリゴ５’ＣＶ
２．１ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ［Ｎ］［Ｎ］ＧＣＡＧＧＴＣＣ
ＴＡＧＣＴＧ ３'ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１９及びオリゴ
３’ＣＶ２５’ ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ［Ｎ］［Ｎ］ＣＴＡＡＴＡＡＡＴＡ
ＧＡＧＧＧ ３’ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２０。これらのプラ
イマーを一緒に用いて ＶＧＥＦ Ｂサブユニットをコー
ドしているｃＤＮＡを増幅させた。 分取用ＰＣＲ反応： ４０μｌ １０×緩衝液 ６４μｌ １.２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ ８μｌ 第１鎖ＧＳ−９Ｌ ｃＤＮＡ ８μｌ ２００ピコモル ５’ＣＶ２．１ ８μｌ ２００ピコモル ３’ＣＶ２ ２μｌ １０単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ２７０μｌ 水 反応条件：９４℃１’、５８℃２’、７２℃２’：４０
サイクル ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、セ
ントリコン３０スピンカラムにより濃縮し、エタノール
で沈降させ制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させ
ＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させた。この
連結ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを形
質転換した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞から
単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を決定した。
２組のクローンを確認し１方が１５８アミノ酸配列をコ
ードし他方が１３８アミノ酸配列をコードした、図７及
び８参照。
【００５９】ＶＥＧＦ ＢサブユニットのｃＤＮＡクロ
ーニング ＶＥＧＦ Ｂ シグナルペプチドのアミノ末端のＤＮＡ及
びタンパク質配列はＧＳ−９ＬポリＡ＋ＲＮＡから組立
てられたｃＤＮＡライブラリーから単離したｃＤＮＡで
決定した。 第１鎖合成： ＧＳ−９ＬポリＡ＋ＲＮＡ １５．６μｌ（５μｇ）と
オリゴｄＴ−ＸｂａＩプライマー２．５μｌ（２．５μ
ｇ）を７０℃で５分間加熱した後室温に徐冷することに
よりアニールする。以下を加える。 ５．５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ ８．３（４２℃）、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１０
０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭスペルミジン） ５．５μｌ １００ｍＭ ＤＴＴ ５．５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ １．４μｌ （５５単位）ＲＮasin ５．５μｌ ４０ｍＭ ＮaＰＰi １３．５μｌ ５５単位ＡＭＶ逆転写酵素 ４２℃で６０分インキュベートする。 第２鎖合成：反応ミックスをアセンブルする ５０μｌ 第１鎖反応液 ２５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７．２、８５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１００ｍＭ（ＮＨ4）Ｓ
Ｏ4） ７.５μｌ １００ｍＭ ＤＴＴ ２５μｌ １ｍＭ ＮＡＤ ６.５μｌ （６５単位）Ｅ. coli ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ ２.５μｌ （２.５単位）Ｅ. coli ＤＮＡリガーゼ ２.５μｌ （２単位）Ｅ. coli ＲＮase Ｈ １３５μｌ 水 １４℃で２時間インキュベートした後７０℃で１０分間
インキュベートする。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ
（１０単位）を加え、３７℃で１０分間インキュベート
し、０．２Ｍ ＥＤＴＡ ２５μｌを加えフェノール／ク
ロロホルムで抽出し、次に０．５容量の７．５Ｍ酢酸ア
ンモニウムと３容量のエタノールを加えて沈降させ、沈
降物を集め、２０μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡに再浮遊させた。 ｃＤＮＡライブラリー作成 ＥｃｏＲ１リンカーを付加し、ＥｃｏＲ１とＸｂａＩで
消化させた後、ＥｃｏＲ１／ＸｂａＩ消化Ｌambda ＧＥ
Ｍ−４（プロメガバイオケミカルス）に上記ｃＤＮＡを
結合させた。ｃＤＮＡライブラリーを〜５０，０００の
独立したクローンで増幅させた。
ーニング ＶＥＧＦ Ｂ シグナルペプチドのアミノ末端のＤＮＡ及
びタンパク質配列はＧＳ−９ＬポリＡ＋ＲＮＡから組立
てられたｃＤＮＡライブラリーから単離したｃＤＮＡで
決定した。 第１鎖合成： ＧＳ−９ＬポリＡ＋ＲＮＡ １５．６μｌ（５μｇ）と
オリゴｄＴ−ＸｂａＩプライマー２．５μｌ（２．５μ
ｇ）を７０℃で５分間加熱した後室温に徐冷することに
よりアニールする。以下を加える。 ５．５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ ８．３（４２℃）、７５０ｍＭ ＫＣｌ、１０
０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭスペルミジン） ５．５μｌ １００ｍＭ ＤＴＴ ５．５μｌ １０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ １．４μｌ （５５単位）ＲＮasin ５．５μｌ ４０ｍＭ ＮaＰＰi １３．５μｌ ５５単位ＡＭＶ逆転写酵素 ４２℃で６０分インキュベートする。 第２鎖合成：反応ミックスをアセンブルする ５０μｌ 第１鎖反応液 ２５μｌ １０×緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７．２、８５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１００ｍＭ（ＮＨ4）Ｓ
Ｏ4） ７.５μｌ １００ｍＭ ＤＴＴ ２５μｌ １ｍＭ ＮＡＤ ６.５μｌ （６５単位）Ｅ. coli ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ ２.５μｌ （２.５単位）Ｅ. coli ＤＮＡリガーゼ ２.５μｌ （２単位）Ｅ. coli ＲＮase Ｈ １３５μｌ 水 １４℃で２時間インキュベートした後７０℃で１０分間
インキュベートする。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ
（１０単位）を加え、３７℃で１０分間インキュベート
し、０．２Ｍ ＥＤＴＡ ２５μｌを加えフェノール／ク
ロロホルムで抽出し、次に０．５容量の７．５Ｍ酢酸ア
ンモニウムと３容量のエタノールを加えて沈降させ、沈
降物を集め、２０μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡに再浮遊させた。 ｃＤＮＡライブラリー作成 ＥｃｏＲ１リンカーを付加し、ＥｃｏＲ１とＸｂａＩで
消化させた後、ＥｃｏＲ１／ＸｂａＩ消化Ｌambda ＧＥ
Ｍ−４（プロメガバイオケミカルス）に上記ｃＤＮＡを
結合させた。ｃＤＮＡライブラリーを〜５０，０００の
独立したクローンで増幅させた。
【００６０】ラットＶＥＧＦ Ｂ ｃＤＮＡクローンの単
離 上記ｃＤＮＡライブラリーをプローブとしてｐＣＶ２を
用いてプラークハイブリッド形成によってスクリーンし
た。ハイブリッド形成条件は次の通りである。 ５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム） ５０％ホルムアミド ５×デンハート液（１％フィコール、１％ポリビニルピ
ロリドン、１％ウシ血清アルブミン） ０．１５ｍｇ／ｍｌサーモン精液ＤＮＡ ４２℃で一夜ハイブリッド形成させる。フィルターを２
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温で５分間３回、１×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で３０分間１回洗浄し
た。正のクローンをオートラジオグラフィーで確認し
た。ファージ＃２０２からのＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼＳｐｅＩで消化させ、１．１ｋｂバンドをＸｂａ
Ｉ消化ｐＤＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させた。この連結ミ
ックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを形質転換
した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞から単離
し、ジデオキシ鎖終結法により配列を決定した。シグナ
ルペプチドのｃＤＮＡと予測されるアミノ酸配列を図７
及び図８に示す。
離 上記ｃＤＮＡライブラリーをプローブとしてｐＣＶ２を
用いてプラークハイブリッド形成によってスクリーンし
た。ハイブリッド形成条件は次の通りである。 ５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム） ５０％ホルムアミド ５×デンハート液（１％フィコール、１％ポリビニルピ
ロリドン、１％ウシ血清アルブミン） ０．１５ｍｇ／ｍｌサーモン精液ＤＮＡ ４２℃で一夜ハイブリッド形成させる。フィルターを２
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温で５分間３回、１×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で３０分間１回洗浄し
た。正のクローンをオートラジオグラフィーで確認し
た。ファージ＃２０２からのＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼＳｐｅＩで消化させ、１．１ｋｂバンドをＸｂａ
Ｉ消化ｐＤＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合させた。この連結ミ
ックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルーを形質転換
した。プラスミドＤＮＡを白い形質転換細胞から単離
し、ジデオキシ鎖終結法により配列を決定した。シグナ
ルペプチドのｃＤＮＡと予測されるアミノ酸配列を図７
及び図８に示す。
【００６１】１３８アミノ酸型の全ヌクレオチドとアミ
ノ酸配列を図７に示す。分泌タンパク質はＡｌａ24で始
まりＡｒｇ138 まで続く。１５８アミノ酸型の全ヌクレ
オチドとアミノ酸配列を図８に示す。分泌タンパク質は
Ａｌａ24 で始まりＬｅｕ１５８ まで続く。
ノ酸配列を図７に示す。分泌タンパク質はＡｌａ24で始
まりＡｒｇ138 まで続く。１５８アミノ酸型の全ヌクレ
オチドとアミノ酸配列を図８に示す。分泌タンパク質は
Ａｌａ24 で始まりＬｅｕ１５８ まで続く。
【００６２】実施例 １１ ＶＥＧＦ Ｃサブユニットのクローニング及びシークエ
ンシング ｐＦＳＥＭ’のＰＣＲ増幅、クローニング及びシークエ
ンシング ヒト髄芽細胞腫系ＴＥ−６７１、ＡＴＣＣ ＨＴＢから
のＶＥＧＦ ｃＤＮＡを増幅させるために ラットＶＥＧ
Ｆ Ｂモノマーの配列に基づいて２つの縮重オリゴヌク
レオチドを合成した（マクアリスター（ＭｃＡlliste
r）等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃancer 第２０巻 ２０６〜２１２
頁［１９７７年］）。 これらのオルゴヌクレオチドは ＦＳ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＣ
（Ｎ）ＴＣ（Ｎ）ＴＧ（ＴＣ）ＧＴ ３’ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２１ ＥＭ’５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡ
Ａ（Ｎ）ＧＴ ＣＡＴ（ＣＴ）ＴＣ ３’ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２２（Ｎ＝ＡＧＣＴ）である。 インビトロジェンの高速トラックＲＮＡ単離キットと提
示プロトコールを用いてＴＥ−６７１からポリＡ＋ＲＮ
Ａを単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成をインビトロジェン
のｃＤＮＡサイクルキットを用いて次の通り行なった。 １μｌ １μｇのＴＥ−６７１ポリＡ＋ＲＮＡ １９μｌ 水 ５μｌ １００ｍＭ ＭｅＭｇＯＨ 6.25μｌ ０．７Ｍ Ｂ−メルカプトエタノール 2.5μｌ ランダムプライマー 2.5μｌ ＲＮase インヒビター １０μｌ ５×ＲＴ緩衝液 2.5μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ 1.25μｌ 逆転写酵素１２．５単位 この反応液を４２℃で６０分間次に９５℃で３分間温置
し氷の上に置いてから更に１．２５μｌの逆転写酵素を
加え、この反応液を更に４２℃で６０分間インキュベー
トした。上記の方法を２回行ないｃＤＮＡを最終容量１
００μｌまでプールした。
ンシング ｐＦＳＥＭ’のＰＣＲ増幅、クローニング及びシークエ
ンシング ヒト髄芽細胞腫系ＴＥ−６７１、ＡＴＣＣ ＨＴＢから
のＶＥＧＦ ｃＤＮＡを増幅させるために ラットＶＥＧ
Ｆ Ｂモノマーの配列に基づいて２つの縮重オリゴヌク
レオチドを合成した（マクアリスター（ＭｃＡlliste
r）等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃancer 第２０巻 ２０６〜２１２
頁［１９７７年］）。 これらのオルゴヌクレオチドは ＦＳ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＣ
（Ｎ）ＴＣ（Ｎ）ＴＧ（ＴＣ）ＧＴ ３’ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２１ ＥＭ’５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡ
Ａ（Ｎ）ＧＴ ＣＡＴ（ＣＴ）ＴＣ ３’ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２２（Ｎ＝ＡＧＣＴ）である。 インビトロジェンの高速トラックＲＮＡ単離キットと提
示プロトコールを用いてＴＥ−６７１からポリＡ＋ＲＮ
Ａを単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成をインビトロジェン
のｃＤＮＡサイクルキットを用いて次の通り行なった。 １μｌ １μｇのＴＥ−６７１ポリＡ＋ＲＮＡ １９μｌ 水 ５μｌ １００ｍＭ ＭｅＭｇＯＨ 6.25μｌ ０．７Ｍ Ｂ−メルカプトエタノール 2.5μｌ ランダムプライマー 2.5μｌ ＲＮase インヒビター １０μｌ ５×ＲＴ緩衝液 2.5μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ 1.25μｌ 逆転写酵素１２．５単位 この反応液を４２℃で６０分間次に９５℃で３分間温置
し氷の上に置いてから更に１．２５μｌの逆転写酵素を
加え、この反応液を更に４２℃で６０分間インキュベー
トした。上記の方法を２回行ないｃＤＮＡを最終容量１
００μｌまでプールした。
【００６３】ＰＣＲ反応： 一次反応（１００μｌ） １０μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧene
Ａmp キット １６μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ １０μｌ 第１鎖ＴＥ−６７１ ｃＤＮＡ ２μｌ ５０ピコモル ＦＳプライマー ２μｌ ５０ピコモル ＥＭ’プライマー 0.5μｌ ２．５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 59.5μｌ 水 反応条件： ９０℃ １'、４５℃まで２'、４５℃で
２'、７２℃で２'、４０サイクル ゲル精製 ＰＣＲ一次反応液２０μｌを４％Ｎｕ篩アガロースゲル
で精製した。１８０塩基対バンドをゲルから切り出し、
６５℃で５分間加熱しＰＣＲ二次反応の鋳型として直接
用いた。 ＰＣＲ二次反応液２００μｌ ２０μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧene
Ａmp キット ３２μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ ５μｌ 金属ゲルスライス ４μｌ １００ピコモル ＦＳプライマー ４μｌ １００ピコモル ＥＭ’プライマー １μｌ ５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ １３４μｌ 水 反応条件：９４℃ １’、５０℃ ２’、７２℃、３５サ
イクル ＰＣＲ生成物をキアゲンチップ５カラムで精製してから
制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。次いで
ＳａｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結
合させ、この結合ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換細胞から単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列
を決定した。
Ａmp キット １６μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ １０μｌ 第１鎖ＴＥ−６７１ ｃＤＮＡ ２μｌ ５０ピコモル ＦＳプライマー ２μｌ ５０ピコモル ＥＭ’プライマー 0.5μｌ ２．５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ 59.5μｌ 水 反応条件： ９０℃ １'、４５℃まで２'、４５℃で
２'、７２℃で２'、４０サイクル ゲル精製 ＰＣＲ一次反応液２０μｌを４％Ｎｕ篩アガロースゲル
で精製した。１８０塩基対バンドをゲルから切り出し、
６５℃で５分間加熱しＰＣＲ二次反応の鋳型として直接
用いた。 ＰＣＲ二次反応液２００μｌ ２０μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧene
Ａmp キット ３２μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ ５μｌ 金属ゲルスライス ４μｌ １００ピコモル ＦＳプライマー ４μｌ １００ピコモル ＥＭ’プライマー １μｌ ５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ １３４μｌ 水 反応条件：９４℃ １’、５０℃ ２’、７２℃、３５サ
イクル ＰＣＲ生成物をキアゲンチップ５カラムで精製してから
制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。次いで
ＳａｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結
合させ、この結合ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換細胞から単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列
を決定した。
【００６４】ｐ３'、１９のＰＣＲ増幅、クローニング
及びシークエンシング ｐＦＳＥＭ’クローンから得た配列に基づいて特定のＰ
ＣＲプライマーを合成した；オリゴ ＬＨ５’ＴＴＴＧ
ＴＣＧＡＣＡ ＣＴＧ ＣＡＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＣＧ Ｇ
ＴＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３。 このプライマー
をオリゴ Ａ１７，５'ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴ
ＣＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４と一緒に用い、フロ
ーマン等ＰＮＡＳ第８５巻、８９９８〜９００２頁（１
９８８年）に記載される３'ＲＡＣＥ手法を用いてＶＥ
ＧＦ ＣサブユニットのＣＯＯＨ末端をコードしている
ｃＤＮＡを増幅させた。インビトロジェンの高速トラッ
クＲＮＡ単離キットと提示プロトコールを用いてＴＥ−
６７１細胞からポリＡ＋ＲＮＡを単離した。第１鎖ｃＤ
ＮＡ合成をインビトロジェンのｃＤＮＡサイクルとＴＡ
１７アダプタープライマーＴＡ１７ ５’ＧＡＣＴＣＧ
ＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を用いて次の通り行
なった。 ０．８μｌ １μｇのＴＥ−６７１ポリＡ＋ＲＮＡ ２０．７μｌ 水 ５μｌ １００ｍＭ ＭｅＭｇＯＨ ６．２５μｌ ０．７Ｍ Ｂ−メルカプトエタノール １．０μｌ ０．８８μｇプライマー ＴＡ１７ ２．５μｌ ＲＮase インヒビター １０μｌ ５×ＲＴ緩衝液 ２．５μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ １．２５μｌ 逆転写酵素１２．５単位 この反応液を４２℃で６０分間次に９５℃で３分間イン
キュベートし、氷上に置いてから更に１．２５μｌの逆
転写酵素を加え、この反応液を更に４２℃６０分間イン
キュベートした。 ３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ ２０μｌ １０×緩衝液パーキンエルマーセタスＧeneＡ
mpキット ３２μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ ２０μｌ ＴＡ１７で開始した第１鎖 ＴＥ−６７１ ｃ
ＤＮＡ ２μｌ ５０ピコモル ＬＨプライマー ２μｌ ５０ピコモル Ａ１７プライマー １．０μｌ ５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ １２３μｌ 水 反応条件：９４℃ １’、５８℃ ２’、７２℃ ３’、
４０サイクル ＰＣＲ生成物をキアゲンチップ５カラムで精製してから
制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。次いで
ＳａｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結
合し、この結合ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１
ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質転
換細胞から単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を
決定した。
及びシークエンシング ｐＦＳＥＭ’クローンから得た配列に基づいて特定のＰ
ＣＲプライマーを合成した；オリゴ ＬＨ５’ＴＴＴＧ
ＴＣＧＡＣＡ ＣＴＧ ＣＡＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＣＧ Ｇ
ＴＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３。 このプライマー
をオリゴ Ａ１７，５'ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴ
ＣＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４と一緒に用い、フロ
ーマン等ＰＮＡＳ第８５巻、８９９８〜９００２頁（１
９８８年）に記載される３'ＲＡＣＥ手法を用いてＶＥ
ＧＦ ＣサブユニットのＣＯＯＨ末端をコードしている
ｃＤＮＡを増幅させた。インビトロジェンの高速トラッ
クＲＮＡ単離キットと提示プロトコールを用いてＴＥ−
６７１細胞からポリＡ＋ＲＮＡを単離した。第１鎖ｃＤ
ＮＡ合成をインビトロジェンのｃＤＮＡサイクルとＴＡ
１７アダプタープライマーＴＡ１７ ５’ＧＡＣＴＣＧ
ＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を用いて次の通り行
なった。 ０．８μｌ １μｇのＴＥ−６７１ポリＡ＋ＲＮＡ ２０．７μｌ 水 ５μｌ １００ｍＭ ＭｅＭｇＯＨ ６．２５μｌ ０．７Ｍ Ｂ−メルカプトエタノール １．０μｌ ０．８８μｇプライマー ＴＡ１７ ２．５μｌ ＲＮase インヒビター １０μｌ ５×ＲＴ緩衝液 ２．５μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ １．２５μｌ 逆転写酵素１２．５単位 この反応液を４２℃で６０分間次に９５℃で３分間イン
キュベートし、氷上に置いてから更に１．２５μｌの逆
転写酵素を加え、この反応液を更に４２℃６０分間イン
キュベートした。 ３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ ２０μｌ １０×緩衝液パーキンエルマーセタスＧeneＡ
mpキット ３２μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ ２０μｌ ＴＡ１７で開始した第１鎖 ＴＥ−６７１ ｃ
ＤＮＡ ２μｌ ５０ピコモル ＬＨプライマー ２μｌ ５０ピコモル Ａ１７プライマー １．０μｌ ５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ １２３μｌ 水 反応条件：９４℃ １’、５８℃ ２’、７２℃ ３’、
４０サイクル ＰＣＲ生成物をキアゲンチップ５カラムで精製してから
制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化させた。次いで
ＳａｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結
合し、この結合ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１
ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質転
換細胞から単離し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を
決定した。
【００６５】ｐ５'、１６のＰＣＲ増幅、クローニング
及びシークエンシング ｐＦＳＥＭ’クローンから得た配列に基づいて２つの特
定ＰＣＲプライマーを合成した、オリゴＶＥ’５’ＴＴ
ＴＧＴＣＧＡＣＡ ＡＣ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＧＴＣＴＣ
ＣＡＣ Ｃ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４及びオリゴＧＣ
Ａ ＧＣＡ ＧＣＣＧＧＴ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
５。これらのプライマーをオリゴＡ１７，５’ＧＡＣＴ
ＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ ３'ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
８、及びオリゴＴＡ１７ ＴＧ’５’ＴＴＴＧＴＣＧＡ
ＣＡ ＡＴＣ ＧＣＣ ５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣ
ＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ３'Ｓ
ＥＱ ＩＤＮＯ：５と一緒に用い、フローマン等、ＰＮ
ＡＳ 第８５巻 ８９９８〜９００２頁（１９８８年）に
記載される５'ＲＡＣＥ手法を用いてＶＥＧＦ Ｃサブユ
ニットのアミノ末端をコードしているｃＤＮＡを増幅さ
せた。 インビトロジェンの高速トラックＲＮＡ単離キ
ットと提示プロトコールを用いてポリＡ＋ＲＮＡをＴＥ
−６７１細胞から単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成をイン
ビトロジェンのｃＤＮＡサイクルキットとＶＥ’プライ
マーを用いて次の通り行なった。 １．０μｌ １μｇのＴＥ−６７１ポリＡ＋ＲＮＡ 20.25μｌ 水 ５μｌ １００ｍＭ ＭｅＭｇＯＨ 6.25μｌ ０．７Ｍ Ｂ−メルカプトエタノール １．０μｌ １．０μｇプライマーＶＥ’ ２．５μｌ ＲＮase インヒビター １０μｌ ５×ＲＴ緩衝液 ２．５μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ ＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ）１０単位
及びシークエンシング ｐＦＳＥＭ’クローンから得た配列に基づいて２つの特
定ＰＣＲプライマーを合成した、オリゴＶＥ’５’ＴＴ
ＴＧＴＣＧＡＣＡ ＡＣ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＧＴＣＴＣ
ＣＡＣ Ｃ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４及びオリゴＧＣ
Ａ ＧＣＡ ＧＣＣＧＧＴ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
５。これらのプライマーをオリゴＡ１７，５’ＧＡＣＴ
ＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ ３'ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
８、及びオリゴＴＡ１７ ＴＧ’５’ＴＴＴＧＴＣＧＡ
ＣＡ ＡＴＣ ＧＣＣ ５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣ
ＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ３'Ｓ
ＥＱ ＩＤＮＯ：５と一緒に用い、フローマン等、ＰＮ
ＡＳ 第８５巻 ８９９８〜９００２頁（１９８８年）に
記載される５'ＲＡＣＥ手法を用いてＶＥＧＦ Ｃサブユ
ニットのアミノ末端をコードしているｃＤＮＡを増幅さ
せた。 インビトロジェンの高速トラックＲＮＡ単離キ
ットと提示プロトコールを用いてポリＡ＋ＲＮＡをＴＥ
−６７１細胞から単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成をイン
ビトロジェンのｃＤＮＡサイクルキットとＶＥ’プライ
マーを用いて次の通り行なった。 １．０μｌ １μｇのＴＥ−６７１ポリＡ＋ＲＮＡ 20.25μｌ 水 ５μｌ １００ｍＭ ＭｅＭｇＯＨ 6.25μｌ ０．７Ｍ Ｂ−メルカプトエタノール １．０μｌ １．０μｇプライマーＶＥ’ ２．５μｌ ＲＮase インヒビター １０μｌ ５×ＲＴ緩衝液 ２．５μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ ＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ）１０単位
【００６６】この反応液を４２℃で６０分間次に９５℃
で３分間インキュベートし、氷上に置いてから更に１．
２５μｌの逆転写酵素を加え、この反応液を更に４２℃
で６０分間インキュベートした。余分なオリゴＶＥ’を
セントリコン１００スピンカラムにより除去しｃＤＮＡ
の５’末端をｄＡＴＰと末端トランスフェラーゼを加え
ることによってつないだ。この末端につないだｃＤＮＡ
を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．５で最終容量２００μｌまで希釈した。 ５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ ５×１００μｌ １０μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧene
Ａmp キット １６μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ １０μｌ ＶＥ’で開始した第１鎖ＴＥ−６７１ｃＤＮ
Ａ ２μｌ ５０ピコモル ＴＧ’プライマー ２μｌ ５０ピコモル Ａ１７プライマー ２μｌ ２０ピコモル ＴＡ１７プライマー ０．５μｌ ２．５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ５７.５μｌ 水 反応条件：９４℃ １’、５８℃まで２、５８℃で
２’、７２℃で２’、４０サ イクル ＰＣＲ生成物をキアゲンチップ５カラムで精製した後制
限エンドヌクレアーゼＳaｌＩで消化させた。次いでＳa
ｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合さ
せ、この連結ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブ
ルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質転換
細胞から単離し、ジデオキシ鎖終結法により配列を決定
した。プラスミドｐＦＳＥＭ’ｐ３’１９及びｐ５’１
６の混合配列を図９に示す。
で３分間インキュベートし、氷上に置いてから更に１．
２５μｌの逆転写酵素を加え、この反応液を更に４２℃
で６０分間インキュベートした。余分なオリゴＶＥ’を
セントリコン１００スピンカラムにより除去しｃＤＮＡ
の５’末端をｄＡＴＰと末端トランスフェラーゼを加え
ることによってつないだ。この末端につないだｃＤＮＡ
を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．５で最終容量２００μｌまで希釈した。 ５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ ５×１００μｌ １０μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧene
Ａmp キット １６μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ １０μｌ ＶＥ’で開始した第１鎖ＴＥ−６７１ｃＤＮ
Ａ ２μｌ ５０ピコモル ＴＧ’プライマー ２μｌ ５０ピコモル Ａ１７プライマー ２μｌ ２０ピコモル ＴＡ１７プライマー ０．５μｌ ２．５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ ５７.５μｌ 水 反応条件：９４℃ １’、５８℃まで２、５８℃で
２’、７２℃で２’、４０サ イクル ＰＣＲ生成物をキアゲンチップ５カラムで精製した後制
限エンドヌクレアーゼＳaｌＩで消化させた。次いでＳa
ｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合さ
せ、この連結ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブ
ルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質転換
細胞から単離し、ジデオキシ鎖終結法により配列を決定
した。プラスミドｐＦＳＥＭ’ｐ３’１９及びｐ５’１
６の混合配列を図９に示す。
【００６７】ｐｈＶＣ１６及びｐｈＶＣ２のＰＣＲ増
幅、クローニング及びシークエンシング ｐ５’１６及びｐ３’１９クローンの配列に基づいて２
つの特定ＰＣＲプライマーを合成した、オリゴ ５’Ｇ
ＣＶＢ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ ＴＧＧ ＣＴＣＴＧＧ
ＡＣＧ ＴＣＴ ＧＡＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及
びオリゴ ３'ＶＣ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ
Ａ ＧＡＧ ＴＧＴ ＧＡＣ ＧＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２７。これらのプライマーを一緒に用いて完全ＶＥ
ＧＦ ＣサブユニットをコードしているｃＤＮＡを増幅
させた。インビトロジェンの高速トラックＲＮＡ単離キ
ットと提示プロトコールを用いてポリＡ＋ＲＮＡをＴＥ
−６７１から単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成をインビト
ロジェンのｃＤＮＡキットを用いて次の通り行なった。 ０．８μｌ １μｇのＴＥ−６７１ポリＡ＋ＲＮＡ １９．２μｌ 水 ５μｌ １００ｍＭ ＭｅＭｇＯＨ ６．２５μｌ ０．７Ｍ Ｂ−メルカプトエタノール ２．５μｌ オリゴｄＴプライマー ２．５μｌ ＲＮase インヒビター １０μｌ ５×ＲＴ緩衝液 ２．５μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ １．２５μｌ 逆転写酵素１２．５単位 この反応液を４２℃で６０分、次いで９５℃で３分間イ
ンキュベートし、氷上に置いてから更に１．２５μｌの
逆転写酵素を加え、この反応液を更に４２℃で６０分間
インキュベートした。
幅、クローニング及びシークエンシング ｐ５’１６及びｐ３’１９クローンの配列に基づいて２
つの特定ＰＣＲプライマーを合成した、オリゴ ５’Ｇ
ＣＶＢ ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ ＴＧＧ ＣＴＣＴＧＧ
ＡＣＧ ＴＣＴ ＧＡＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及
びオリゴ ３'ＶＣ５’ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ
Ａ ＧＡＧ ＴＧＴ ＧＡＣ ＧＧ ３’ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２７。これらのプライマーを一緒に用いて完全ＶＥ
ＧＦ ＣサブユニットをコードしているｃＤＮＡを増幅
させた。インビトロジェンの高速トラックＲＮＡ単離キ
ットと提示プロトコールを用いてポリＡ＋ＲＮＡをＴＥ
−６７１から単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成をインビト
ロジェンのｃＤＮＡキットを用いて次の通り行なった。 ０．８μｌ １μｇのＴＥ−６７１ポリＡ＋ＲＮＡ １９．２μｌ 水 ５μｌ １００ｍＭ ＭｅＭｇＯＨ ６．２５μｌ ０．７Ｍ Ｂ−メルカプトエタノール ２．５μｌ オリゴｄＴプライマー ２．５μｌ ＲＮase インヒビター １０μｌ ５×ＲＴ緩衝液 ２．５μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ １．２５μｌ 逆転写酵素１２．５単位 この反応液を４２℃で６０分、次いで９５℃で３分間イ
ンキュベートし、氷上に置いてから更に１．２５μｌの
逆転写酵素を加え、この反応液を更に４２℃で６０分間
インキュベートした。
【００６８】ＰＣＲ反応２００μｌ ２０μｌ １０×緩衝液、パーキンエルマーセタスＧene
Ａmp キット ３２μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ ２０μｌ オリゴｄＴで開始した第１鎖ＴＥ−６７１ｃ
ＤＮＡ ４μｌ ５０ピコモル ５’ＧＣＶＢプライマー ４μｌ ５０ピコモル ３ＶＣプライマー １μｌ ５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ １１９μｌ 水 反応条件：９４℃ １’、５０℃で２’、７２℃で
２’、４０サイクル ＰＣＲ生成物をキアゲンチップ５カラムで精製した後制
限エンドヌクレアーゼＳaｌＩで消化させた。次いでＳa
ｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合さ
せ、この連結ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブ
ルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質転換
細胞から単離し、ジデオキシ鎖終結法で配列を決定し
た。クローンｐｈＶＣ１６とｐｈＶＣ２の配列では塩基
４６３（図９）をＴをＣに変えアミノ酸１５４に続く翻
訳終止コドンを除去した。これはアミノ酸Ｌｙｓ１５４
に続く１６個のアミノ酸付加を生じる。この付加のヌク
レオチド配列と推定アミノ酸配列は CAG AGA CCC ACA GAC TGC CAC CTG TGC GGC GAT GCT GTT Gln Arg Pro Thr Asp Cys His Leu Cys Gly Asp Ala Val 155 160 165 CCC CGG AGG TAA Pro Arg Arg 170 SEQ ID NO:29 である。更にクローンｐｈＶＣ１６は３塩基対の欠落が
あり（図９、ヌクレオチド残基７３〜７５）、Ｇｎ２５
の欠落を生じる。
Ａmp キット ３２μｌ １．２５ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ ２０μｌ オリゴｄＴで開始した第１鎖ＴＥ−６７１ｃ
ＤＮＡ ４μｌ ５０ピコモル ５’ＧＣＶＢプライマー ４μｌ ５０ピコモル ３ＶＣプライマー １μｌ ５単位Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ １１９μｌ 水 反応条件：９４℃ １’、５０℃で２’、７２℃で
２’、４０サイクル ＰＣＲ生成物をキアゲンチップ５カラムで精製した後制
限エンドヌクレアーゼＳaｌＩで消化させた。次いでＳa
ｌＩ断片をＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合さ
せ、この連結ミックスを用いてＥ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブ
ルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質転換
細胞から単離し、ジデオキシ鎖終結法で配列を決定し
た。クローンｐｈＶＣ１６とｐｈＶＣ２の配列では塩基
４６３（図９）をＴをＣに変えアミノ酸１５４に続く翻
訳終止コドンを除去した。これはアミノ酸Ｌｙｓ１５４
に続く１６個のアミノ酸付加を生じる。この付加のヌク
レオチド配列と推定アミノ酸配列は CAG AGA CCC ACA GAC TGC CAC CTG TGC GGC GAT GCT GTT Gln Arg Pro Thr Asp Cys His Leu Cys Gly Asp Ala Val 155 160 165 CCC CGG AGG TAA Pro Arg Arg 170 SEQ ID NO:29 である。更にクローンｐｈＶＣ１６は３塩基対の欠落が
あり（図９、ヌクレオチド残基７３〜７５）、Ｇｎ２５
の欠落を生じる。
【００６９】配列番号：１ 配列の長さ：１４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列： Ａla Ｐro Ｔhr Ｔhr Ｇlu Ｇly Ｇlu Ｇln Ｌys Ａla Ｈis Ｇlu Ｖal Ｖal 5 10
【００７０】配列番号：２ 配列の長さ：１９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列： Ａla Ｌeu Ｓer Ａla Ｇly Ａsn Ｘaa Ｓer Ｔhr Ｇlu Ｍet Ｇlu Ｖal 5 10 Ｖal Ｐro Ｐhe Ａsn Ｇlu Ｖal 15
【００７１】配列番号：３ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACT TYATGGAYGT NTAYCA 26
【００７２】配列番号：４ 配列の長さ：３２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CAGAGAATTC GTCGACARTC NGTRTTYTTR CA 32
【００７３】配列番号：５ 配列の長さ：３５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GACTCGAGTC GACATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 35
【００７４】配列番号：６ 配列の長さ：２８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA ACACAGGACG GCTTGAAG 28
【００７５】配列番号：７ 配列の長さ：２５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧ ＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧ ＴＧＡ
ＧＣ ２５
ＧＣ ２５
【００７６】配列番号：８ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣ ＧＡＣＡＴＣＧ １７
【００７７】配列番号：９ 配列の長さ：２８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA ACACAGGACG GCTTGAAG 28
【００７８】配列番号：１０ 配列の長さ：２８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA TACTCCTGGA AGATGTCC 28
【００７９】配列番号：１１ 配列の長さ：１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CTTCATCATT GCAGCAGC 18
【００８０】配列番号：１２ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA ACCATGAACT TTCTGC 26
【００８１】配列番号：１３ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACG GTGAGAGGTC TAGTTC 26
【００８２】配列番号：１４ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA TAYATHGCNG AYGARC 26
【００８３】配列番号：１５ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACT CRTCRTTRCA RCANCC 26
【００８４】配列番号：１６ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA CACCCTAATG AAGTGTC 27
【００８５】配列番号：１７ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA ACAGCGACTC AGAAGG 26
【００８６】配列番号：１８ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA CTGAATATAT GAGACAC 27
【００８７】配列番号：１９ 配列の長さ：２５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACN NGCAGGTCCT AGCTG 25
【００８８】配列番号：２０ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACN NCTAATAAAT AGAGGG 26
【００８９】配列番号：２１ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA TTCAGTCCNT CNTGYGT 27
【００９０】配列番号：２２ 配列の長さ：２８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTTGTCGACA CTGAGAGAAN GTCATYTC 28
【００９１】配列番号：２３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５】
【００９２】配列番号：２４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６】
【００９３】配列番号：２５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化７】
【００９４】配列番号：２６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化８】
【００９５】配列番号：２７ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化９】
【００９６】配列番号：２８ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１０】
【００９７】配列番号：２９ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１１】
【００９８】配列番号：３０ 配列の長さ：５５７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１２】
【００９９】配列番号：３１ 配列の長さ：１９０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１３】
【０１００】配列番号：３２ 配列の長さ：４４５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１４】
【０１０１】配列番号：３３ 配列の長さ：１４６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１５】
【０１０２】配列番号：３４ 配列の長さ：６４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１６】
【化１７】
【０１０３】配列番号：３５ 配列の長さ：２１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１８】
【０１０４】配列番号：３６ 配列の長さ：４１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１９】
【０１０５】配列番号：３７ 配列の長さ：１３８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２０】
【０１０６】配列番号：３８ 配列の長さ：４４７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２１】
【０１０７】配列番号：３９ 配列の長さ：１５８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２２】
【０１０８】配列番号：４０ 配列の長さ：４６５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２３】
【０１０９】配列番号：４１ 配列の長さ：１５４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２４】
【図１】ＶＥＧＦ−ＡＡサブユニットＡに関するタンパ
ク質翻訳産物の完全長アミノ酸残基およびそのｃＤＮＡ
コード配列およびアミノ酸配列を決定するために用いら
れたポリペプチド開裂産物を示す図である。
ク質翻訳産物の完全長アミノ酸残基およびそのｃＤＮＡ
コード配列およびアミノ酸配列を決定するために用いら
れたポリペプチド開裂産物を示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】図２の続きである。
【図４】図３の続きである。
【図５】図４の続きである。
【図６】ＶＥＧＦ−ＡＢサブユニットＡに関するタンパ
ク質翻訳産物の完全長アミノ酸残基およびそのｃＤＮＡ
コード配列およびアミノ酸配列を決定するために用いら
れたポリペプチド開裂産物を示す図である。
ク質翻訳産物の完全長アミノ酸残基およびそのｃＤＮＡ
コード配列およびアミノ酸配列を決定するために用いら
れたポリペプチド開裂産物を示す図である。
【図７】図６の続きである。
【図８】図７の続きである。
【図９】図８の続きである。
【図１０】ＶＥＧＦ−ＡＢサブユニットＢに関するタン
パク質翻訳産物の完全長アミノ酸残基およびそのｃＤＮ
Ａコード配列およびアミノ酸配列を決定するために用い
られたポリペプチド開裂産物を示す図である。
パク質翻訳産物の完全長アミノ酸残基およびそのｃＤＮ
Ａコード配列およびアミノ酸配列を決定するために用い
られたポリペプチド開裂産物を示す図である。
【図１１】図１０の続きである。
【図１２】図１１の続きである。
【図１３】ＶＥＧＦ−Ａ１４６アミノ酸残基サブユニッ
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号２３および３３）。
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号２３および３３）。
【図１４】ＶＥＧＦ−Ａ１９０アミノ酸残基サブユニッ
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号３０および３１）。
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号３０および３１）。
【図１５】ＶＥＧＦ−Ａ２１４アミノ酸残基サブユニッ
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号３４および３５）。
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号３４および３５）。
【図１６】図１５の続きである。
【図１７】ＶＥＧＦ−Ｂ１３８アミノ酸残基サブユニッ
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号３６および３７）。
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号３６および３７）。
【図１８】ＶＥＧＦ−Ｂ−１５８アミノ酸残基サブユニ
ットに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク
質翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列
番号３８および３９）。
ットに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク
質翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列
番号３８および３９）。
【図１９】ＶＥＧＦ−Ｃ１５４アミノ酸残基サブユニッ
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号４０および４１）。
トに関する全ｃＤＮＡコード配列およびそのタンパク質
翻訳産物の全鎖長アミノ酸残基を示す図である（配列番
号４０および４１）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/10 15/70 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ケネス エー．トマス，ジュニア アメリカ合衆国，07928 ニュージャーシ ィ，チャサム ボロー，ワシントン アヴ ェニュー 245
Claims (39)
- 【請求項１】 血管内皮細胞増殖因子のＣサブユニット
をコードする、単離精製されたＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 血管内皮細胞増殖因子のＣサブユニット
をコードする、単離精製され以下の配列を有するＤＮＡ
配列。 【化１】 - 【請求項３】 ＡサブユニットをコードするＤＮＡ配列
とＣサブユニットをコードするＤＮＡ配列を含む、血管
内皮細胞増殖因子ＡＣをコードするＤＮＡ。 - 【請求項４】 ＢサブユニットをコードするＤＮＡ配列
とＣサブユニットをコードするＤＮＡ配列を含む、血管
内皮細胞増殖因子ＢＣをコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 血管内皮細胞増殖因子のＣサブユニット
をコードする、単離精製され以下の配列を有するＤＮＡ
配列。 【化２】 - 【請求項６】 １８９アミノ酸形をコードするＤＮＡ配
列、１６５アミノ酸形をコードするＤＮＡ配列および１
２１アミノ酸形をコードするＤＮＡ配列からなる群から
選択されるＡサブユニットＤＮＡ配列を含む、血管内皮
細胞増殖因子ＡＣをコードするＤＮＡ配列。ただしＡサ
ブユニットＤＮＡはＣサブユニットＤＮＡ配列に機能的
に接続している。 - 【請求項７】 １３５アミノ酸形をコードするＤＮＡ配
列および１１５アミノ酸形をコードするＤＮＡ配列から
なる群から選択されるＢサブユニットＤＮＡ配列を含
む、血管内皮細胞増殖因子ＢＣをコードするＤＮＡ配
列。ただしＢサブユニットＤＮＡはＣサブユニットＤＮ
Ａ配列に機能的に接続している。 - 【請求項８】 ＣサブユニットＤＮＡ配列を含む、ホモ
ダイマー血管内皮細胞増殖因子ＤＮＡ。 - 【請求項９】 請求項３記載のＤＮＡ配列を含有するベ
クター。 - 【請求項１０】 請求項４記載のＤＮＡ配列を含有する
ベクター。 - 【請求項１１】 請求項６記載のＤＮＡ配列を含有する
ベクター。 - 【請求項１２】 請求項７記載のＤＮＡ配列を含有する
ベクター。 - 【請求項１３】 請求項８記載のＤＮＡ配列を含有する
ベクター。 - 【請求項１４】 血管内皮細胞増殖因子をコードするＤ
ＮＡ配列を有する請求項９記載のベクターで形質転換さ
れた宿主細胞。 - 【請求項１５】 血管内皮細胞増殖因子をコードするＤ
ＮＡ配列を有する請求項１０記載のベクターで形質転換
された宿主細胞。 - 【請求項１６】 血管内皮細胞増殖因子をコードするＤ
ＮＡ配列を有する請求項１１記載のベクターで形質転換
された宿主細胞。 - 【請求項１７】 血管内皮細胞増殖因子をコードするＤ
ＮＡ配列を有する請求項１２記載のベクターで形質転換
された宿主細胞。 - 【請求項１８】 血管内皮細胞増殖因子をコードするＤ
ＮＡ配列を有する請求項１３記載のベクターで形質転換
された宿主細胞。 - 【請求項１９】 請求項１４の形質転換宿主細胞を血管
内皮細胞増殖因子の発現に適した条件下で培養し、血管
内皮細胞増殖因子を回収することを含む、血管内皮細胞
増殖因子の製造方法。 - 【請求項２０】 請求項１５の形質転換宿主細胞を血管
内皮細胞増殖因子の発現に適した条件下で培養し、血管
内皮細胞増殖因子を回収することを含む、血管内皮細胞
増殖因子の製造方法。 - 【請求項２１】 請求項１６の形質転換宿主細胞を血管
内皮細胞増殖因子の発現に適した条件下で培養し、血管
内皮細胞増殖因子を回収することを含む、血管内皮細胞
増殖因子の製造方法。 - 【請求項２２】 請求項１７の形質転換宿主細胞を血管
内皮細胞増殖因子の発現に適した条件下で培養し、血管
内皮細胞増殖因子を回収することを含む、血管内皮細胞
増殖因子の製造方法。 - 【請求項２３】 請求項１８の形質転換宿主細胞を血管
内皮細胞増殖因子の発現に適した条件下で培養し、血管
内皮細胞増殖因子を回収することを含む、血管内皮細胞
増殖因子の製造方法。 - 【請求項２４】 請求項１９の方法で製造された血管内
皮細胞増殖因子。 - 【請求項２５】 請求項２０の方法で製造された血管内
皮細胞増殖因子。 - 【請求項２６】 請求項２１の方法で製造された血管内
皮細胞増殖因子。 - 【請求項２７】 請求項２２の方法で製造された血管内
皮細胞増殖因子。 - 【請求項２８】 請求項２３の方法で製造された血管内
皮細胞増殖因子。 - 【請求項２９】 Ａサブユニットアミノ酸配列とＣサブ
ユニットアミノ酸配列を含む、血管内皮細胞増殖因子Ａ
Ｃ。 - 【請求項３０】 Ｂサブユニットアミノ酸配列とＣサブ
ユニットアミノ酸配列を含む、血管内皮細胞増殖因子Ｂ
Ｃ。 - 【請求項３１】 Ｃサブユニットアミノ酸配列とＣサブ
ユニットアミノ酸配列を含む、血管内皮細胞増殖因子Ｃ
Ｃ。 - 【請求項３２】 単離精製された、以下のアミノ酸配列
を含む血管内皮細胞増殖因子Ｃサブユニット。 【化３】 - 【請求項３３】 単離精製された、以下のアミノ酸配列
を含む血管内皮細胞増殖因子Ｃサブユニット。 【化４】 - 【請求項３４】 医薬的担体と、請求項２９記載の精製
された血管内皮細胞増殖因子の組織修復有効量を含む組
織修復用医薬組成物。 - 【請求項３５】 医薬的担体と、請求項３０記載の精製
された血管内皮細胞増殖因子の組織修復有効量を含む組
織修復用医薬組成物。 - 【請求項３６】 医薬的担体と、請求項３１記載の精製
された血管内皮細胞増殖因子の組織修復有効量を含む組
織修復用医薬組成物。 - 【請求項３７】 治療を必要とする患者に、請求項３４
記載の血管内皮細胞増殖因子の組織修復有効量を投与す
ることを特徴とする組織修復促進法。 - 【請求項３８】 治療を必要とする患者に、請求項３５
記載の血管内皮細胞増殖因子の血管内皮刺激有効量を投
与することを特徴とする血管内皮細胞の生育を刺激する
方法。 - 【請求項３９】 治療を必要とする患者に、請求項３６
記載の血管内皮細胞増殖因子の血管内皮刺激有効量を投
与することを特徴とする血管内皮細胞の生育を刺激する
方法。
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| JPH06503225A (ja) * | 1990-09-27 | 1994-04-14 | コンジグリオ ナチオナーレ デレ リチエルシエ | アンギオジェネシス制御特性を有するヒト蛋白をコードするヌクレオチド配列 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2010024235A (ja) * | 2001-05-25 | 2010-02-04 | Thomas Jefferson Univ | 多様な治療様式のための主成分としての選択的スプライスフォーム |
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