JPH06503225A

JPH06503225A - アンギオジェネシス制御特性を有するヒト蛋白をコードするヌクレオチド配列

Info

Publication number: JPH06503225A
Application number: JP3515286A
Authority: JP
Inventors: ペルシコ，マリア; マグリオーネ，ドメニコ
Original assignee: コンジグリオ　ナチオナーレ　デレ　リチエルシエ
Priority date: 1990-09-27
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 1994-04-14
Anticipated expiration: 2014-12-06
Also published as: AU8635391A; US5919899A; IT9048315A0; ATE173505T1; IT1242149B; CA2092533A1; JP2987203B2; CA2092533C; DE69130506D1; ES2127730T3; EP0550519B1; WO1992006194A1; DE69130506T2; EP0550519A1; IT9048315A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

４４、該細胞かオイカリオテック細胞である請求項４１の細胞。４５、バクテリアカルチャーを液体培地中で、６００ｎｍて光学濃度０．３５迄生育させ、ＴＥ中に再懸濁し、遠沈しそしてリンスバッファー中に再懸濁し、細胞を溶解することを含む方法であって、請求項４１ないし４３のいずれかの細胞から請求項２１ないし３１のいずれかの蛋白を生産し抽出する方法。浄書（内容に変更なし）明　細　書アンギオジエネンス制御特性を存するヒト蛋白をコードするヌクレオチド配列本発明はアンギオジエネシス制御特性を存するヒト蛋白をコードするヌクレオチド配列に関する。更には、本発明はを椎血管系の形成及び／又は再分化をインビボ制御するアンギオジエネティックファクター特性を有する新規蛋白をコードする遺伝子の単離及び分子キャラクタライゼイションに関し、又その蛋白質自体に関する。更に、本発明は、それらの配列又は部分を含むベクター、該ベクターにより形質転換されたプロ力すオティック及びオイカリオテック細胞及び該蛋白及び対応するポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体の生産への使用に関する。成長因子はポリペプチドであり、ホ乳動物細胞により合成され分泌され、プロリフェレーションだけでなくディフエレンシエーション及びターゲット細胞のモルホジェネシスに作用することは広く知られている。事実、いくつかの生長因子は、その作用を制御機構、例えばケミオタクシス、インフラマトリ−システム細胞の活性化及び組織の修復といったものによりもたらすことが知られている（Ｗｈｉｔｍａｎ、　Ｍ、及びＭｅｌｔｏｎ、　Ｄ、Ａ、、１９８９゜Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、５　、　９　３−１　１　７　）　。刺激された培養生長因子とレトロビールス形質転換細胞との類似するフェノタイプのため、共通の機構で該現象を制御することが示唆されてきた。事実、生長因子とそれ自体の特異的レセプターとのインターラクションにより別の蛋白キナーゼを含む中間体反応を通して、遺伝子活性制御蛋白を間接的に活性化する。この代謝績の多くの成分は、ビールスオンコジーンの細胞アナログと同定され、オンコジーンスが正常細胞プロセスをいかに妨害しうるかを示唆する。多くの生長因子がこれまでに同定されてきた。対応する遺伝子はクローンされ、該因子は、活性及び／又は配列ホモ０ジーに基づいてグループに分けられ、そのうちで、アンギオジエネティックファクターのファミリーがある。アンギオジエネシス、又は血管系の管の形成はエンブリオジエネシス、ウーンドヒーリング（ｗｏｕ口ｄ　ｈｅａｌｉｎｇ）及び器官再分化の間に生じる複雑なプロセスである。更に、ソリッドな腫瘍の生長のようないくつかのパソロジー、いくつかのレチノパチー及びリウマチ様関節炎はアベラントアンギオジエネシス（ａｂｅｒｒａｎｔ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導する（Ｒｉｓａｕ　Ｗ、、　１９９０、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　２．　７１−７９　）。インビボアンギオジェネシスは、多段プロセスであり、それらの２つは、管形成に発展するエントテリアル（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　）細胞のマイグレーション（ｍｉｇｒａｔ　１ｏｎ）とプロリフニレ−ジョン（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）で示される。ごく最近、多くのアンギオジエネテイックファクターが同定され、対応する遺伝子がクローンされた。それらとしては、ＰＣＴ特許出願Ｎｏ、８７０１３７２の主題である、アンギオジエニン；血小板−由来エンドテリアル生長因子Ｐ　Ｄ　 −Ｅ　ＣＧ　Ｆ　（Ｉｓｈｉｇａｗａ等、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、　３３８．　５５７）　；ヒト血管透過ファクター、Ｖ　Ｐ　Ｆ　（Ｋｅｃｋ等、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．　１３０９）、これはパスキュラー　エンドテリアル生長因子、Ｖ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　（Ｌｅｕｎｇ等、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　、　２４６．１３０６）のデノミネーションとともに、マウスでもクローンされた；フィブロブラストの生長因子、即ち、酸因子、ａ−ＦＧＦ及び塩基因子、ｂ− ＦＧＦ、トランスホーミング生長因子アルファ、ＴＧＦ−α及びベータ、ＴＧＦ −β（Ｆｏｌｋｍａｎ及びＫｌａｇｓｂｕｒｎ　、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　、　２３５．４４２）。アンギオジエネテイツクファクターは、それらの作用方法に従って２つのグループに分けられる：モーテイリティー又はマイト−シスを刺激することにより血管エンドテリアル細胞に直接に又は、エンドテリアル細胞に作用する生長因子を生産する細胞に間接的に働く場合である。インビトロ分析によって、アンギオジエネテイツクファクターかモーティリティー及びエンドテリアル細胞のブロリフェレーションに別々の効果をもたらすことかはつきりした。事実、それらのいくつかは、２つの出来事のうちちょうどひとつを刺激し、他のひとつは、両方の出来事を刺激する。ところか、他の方はインビトロで不活性であると思われ、他のひとつはエンドテリアルセルラープロリフェレーションを阻害する活性すら示す。このようなデータはアンギオジエネシスの規制は異なる成分に媒介された複雑なプロセスであること示している。それらの成分の多くは未だ同定されていない。従って、エンドテリアル細胞のマイグレーション及びディフエレンシェイションを刺激することのできる新規アンギオジエニックファクターの同定及び単離の必要があるのは明らかである。そして、チューモラル（ｔｕｍｏｒａｌ　）マーカーとして、そして炎症疾患用の診断薬分野と局所又はインターナルユース用、例えば、傷、外科手術後の組織、移植、火傷、潰瘍等の治療のような治療分野の両方で利用できる。このような因子は、インビトロでも細胞培養の生長刺激としてうまく利用できる。更に、ＤＮＡ組換技術は、このような因子を適当量、短時間で注目すべき低コストで生産することを可能としている。事実、腫瘍診断における不確実性のため、新規で特異的チュモラルマーカーを同定する必要性が増加している。更に、ハイブリッド蛋白を生産する最近の方法（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ　Ｄ、及びＰａ５ｔａｎ　１．、１９８９．　Ｊ、　Ｎａｔｌ。Ｃａｎｃｅｒ　［ｎｓｔ、　８１．１４５５−１４６３　）及び／又は毒性分子を存する抗体をコンジュゲートする方法（Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｊ、　Ｗ。等、１９８９　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４９．３５６２−３５６７　）は、チューモラルセロテラピーの分野に確実な結果を与えており、テストすべき新規ファクターの必要が徐々に高まっている。最後に、多くのアンギオジエニックファクターかチューモラル細胞から始まってクローンされてきた。一方、非−ネオプラスチックマテリアルから生じる遺伝子の治療分野でのより良い適用が明らかである。従って、本発明は、アンギオジエネシスの規制活性を存する蛋白をコードするヌクレオチド配列を提供し、この配列は非−ネオプラスチック組織から得られ；該配列を含むベクター：該ベクターにより形質転換された細胞及び新規なアンギオジェニックファクターの生物学的及び／又は免疫学的活性を有する蛋白の生産及び蛋白自体、これらは診断及び治療分野で利用される。本発明は、組換技術により、蛋白又はその部分を得る方法及び対応するポリクローナル又はモノクローナル抗体の生産用抗原としてのその使用も提供する。事実、本発明の主題であるアンギオジエニツクファクターをコードする配列を含む分子プローブは、他のアンギオジエニツクファクターのチューモラルパソロジーの場合と同様その異常型（ａｂｅｒｒａｎｔ）生産に関係したバソロジーの診断でマーカーとして利用しうる。更に、本発明の別の主題である蛋白は、炎症疾患の治療、傷の治療、外科手術後の組織の治療、移植、火傷、潰瘍等の治療に利用できる。該因子は、細胞培養の生長刺激としてインビトロでもうまく利用できる。最後に、本発明で利用するＤＮＡ組換技術により、上述の分子プローブ及び蛋白を適切な量、短時間及び注目すべき低コストで生産できる。本発明のヌクレオチド及びアミノ酸鎖は診断テスト及び治療目的用に、宿主細胞からの由来として直接及び適切な修正をした後の両方として、医薬組成物のより良い生産物を得るために利用できる。従って、本発明の目的は、アミノ酸配列表５ＥＱＩＤ　Ｎｌで示されるアミノ酸配列を有する、アンギオジエネシス制御因子の免疫的及び／又は生物的特性をもった蛋白、例えばＰＩＧＦをコードするヌクレオチド配列にある。本発明の別の例としては、ＰＩＧＥアミノ酸配列はプライマリ−の転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ２に示すヌクレオチド配列での、最も好ましくは、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｌに示すアミノ酸配列の位置１４１− １４２で、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ２に示す２１アミノ酸の挿入を生じる。本発明の目的のひとつは、ＰＩＧＦ蛋白をコードするヌクレオチド配列で、１以上のアミノ酸の欠失及び／又は置換され、好ましくは、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｌのアミノ酸ｌからアミノ酸３１までが欠失している配列にある。本発明は又ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｌをコードする配列の対立（ａｌｌｅｌｉｃ　）誘導体であるヌクレオチド配列、並びにＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｌをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を提供する。更に、本発明によれば、このヌクレオチド配列は、同じリーディングフレーム又はＰＩＧＦをコードする遺伝子を採用することによりアミノ酸配列に翻訳でき、ＰＩＣＦのアンギオジエネシス制御活性を好ましくは妨害しないそして更に好ましくは毒性活性を有する蛋白部分をコードするヌクレオチド配列に共有結合しうる。したかって、本発明の目的は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｌのように、そのコーディングパートで蛋白ＰＩＧＦをコードするヌクレオチド配列がたとえ１以上のヌクレオチドで欠失及び／又は置換がされていたとしても、５ＥＱＩＤ　Ｎｌのヌクレオチド配列にある。本発明はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｌとハイブリダイズするヌクレオチド配列又はその部分；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｌで述べた配列又はその部分の、単−又は複数のベースで、置換、欠失、挿入及びインバージョンミューチージョンにより、天然及び合成又は半合成法の両方で得られたヌクレオチド配列；および蛋白ＰＩＧＦ又はその部分により示されるものと同様な免疫的及び／又は生物的特性を存する蛋白をコードする配列を含むヌクレオチドを提供する。本発明の別の側面によれば、本発明は、組換ＤＮＡ技術により得られるか又は生物組織から単離された５ＥＱＩＤ　Ｎｌで示す配列又はその部分を存する蛋白ＰＩＧＦに関する。免疫学的に活性な該蛋白又はその部分は、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を生産する抗原として利用しうる。本発明は又本発明の主題たるヌクレオチド配列、上流に位置する転写をプロモートする配列、及び一般にセレクティブマーカーからなる、プロカリオティック及びオイカリオティックな、クローニング及び／又は発現ベクターを提供する。好ましくは、インデューシブルに転写をプロモートする配列も又存在し、エンハンサ−、ポリアゾニレ−ジョンシグナル等も同様である。更に、本発明の目的は、ＰＩＧＦ蛋白又はその部分を生産するために採用される該ベクターにより形質転換されたプロ力すオティク及びオイカリオテック細胞にある。本発明の詳細な説明するため、制限的ではなく、以下に実施例を記述する。図１は、サブの３２７ラグメントからなる、リコンビナントλＧＴ、、ファージの制限マツプを示す。図２は、サブ３２ｃＤＮＡフラグメントを用いたノーザンブロツティング実験を示す。図３は、プラスミドｐＰＩＧＦ−２の制限マツプを示す。図４は、発現ベクターｐ　Ｅ　Ｔ　３　（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＭａｄｉｓｏｎＷｌ、　ＵＳＡ　）において、蛋白ＰＩＧＦの部分をコードするフラグメントのサブクローニングの例示的スキームを示す。図５は、組換法により得られた蛋白ＰｒＧＦのポリアクリルアミドゲルエレクトロホレーシスを示す。実施例１新規アンギオジエニックファクターをコードするｃＤＮＡの単離サブ３２と名づけた最初のｃＤＮＡをヒトブラセンタからのｃＤＮＡライブラリーのクローンから、λＧＴ１１ベクター中で、従来手法に従って単離し、池の実験室でも採用した（Ｗａｔａｎｅｂ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．１２６１１−１９、ｌ　９８９）。簡単には、グアニジンチオシアナートで溶解し、セシウム不連続グラジェントで遠沈してＲＮＡを抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ、　Ｆ、　、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、。Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｖｏｌ。１、　７．１９．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌｏｂ、Ｐｒｅｓｓ）　ａ　ポリＡ＋ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロース（１ｂｉｄ、　７．２６）上クロマトグラフィーにより精製した。ｃＤＮＡ合成及びＥｃｏＲＩ制限部位でのλＧ　Ｔ　＋　＋ファージベクターのクローニング（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｔｏｌｌａ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ）を１ｂｉｄ、　８．５４−８．７９のプロトコールに従って実施した。図１に地図を示すクローンを同定した。これは、前述の８．４６に記述されたフィルター上へのハイブリダイゼーション法に従って５ＸＳ５Ｃ６５°Ｃて、グルコース−６−ホスフニートデヒドロゲナーゼ酵素（Ｇ６ＰＤ）（Ｐｅｒｓｉｃｏ、　Ｍ、等、１９８６　、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　１４　。２５１１）のｃ　ＤＮＡをコードする配列と１１イブリダイーズできる２６００ヌクレオチド配列を含むためである。２４０ヌクレオチドのフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断後この組換ファージから単離し、このフラグメントをサブ３２と名付けた。前述の１０．６−１０．８に記述の「ニックトランスレーション」法により、３２ｐでラベル後、該フラグメントを次に用いた。ａ）前述の７．３７記述の「ノーザンプロット」法により、異なる組織又はセルラインから抽出したＲＮＡを分析。図２に示した結果は、サブ３２フラグメントはブラセンタ（ライン２）　、ＨＥＰＧ２ヘパトーマ細胞、ＡＴＣＣＮ、ＨＢ８０６５　（ライン３）、ＪＥＧヒトコリオカルシノア細胞、ＡＴＣＣＮ、ＨＴＢ３６　（ライン４）および低濃度て、Ｈｅ１ａｓ３細胞ＡＴＣＣＮ、ＣＣＬ２．２　（ライン５）で特異的ｍＲＮＡを検知し、ＨＬ６０細胞、ＡＴＣＣＮ、ＣＣＬ２４０　（ラインｌ）では検知されないことを示す。ｂ）　λＧＴＩＯベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　ＪｏｌｌａＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ　）のＥｃｏＲ１部位で、ヒトブラセンタからのｃＤＮＡライブラリーで述へた方法に従って、ヒトコリオカルシノーマＪＥＧ、ＡＴＣＣＮ、ＨＴＢ３６からｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること。２つのクローンを単離し、ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵＣＩ　８ベクター中にサブクローニングして（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ　）　、配列を前述の１３．６−１３．１０のＳａｎｇｅｒ法により決定した。この配列は部分的に互いにオーバーラツプしたフラグメントを示したが、対応するｍＲＮＡをコードする全体の配列を含んでいなかった。従って、単離したフラグメントを同様の技法を用いて第２のスクリーニングを行なった。用いたライブラリーはヒトブラセンタからのｃＤＮＡライブラリーで、そこから最初のサブ３２フラグメントが生じた。その後２つのクローンを単離し、それらのＤＮＡをＥｃｏＲＴて切断し、得られたインサートをＩ）ＧＥＭ　１ベクターにサブクローニングしくＰｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｍａｄｉｓｏｎ　Ｗ　１　、　Ｕ　Ｓ　Ａ）　、それらの配列をＳａｎｇｅｒ法により決定した。ＥｃｏＲＴて切断後得られたこれらの２つのＤＮＡフラグメントをＴ４−リガーゼで再切断し、同じｐＧＥＭ　１ベクターのＥｃｏＲＩ部位でクローニングして、グラセンタ中に、シングルのプラスミドとして存在し、ｐＰＩＧＦ−２（ＡＴＣＣＤｅｐ　Ｎｏ、４０８９２）と呼ばれ、そのマツプを図３に示すｍＲＮＡに対応する全コード配列を得た。得られたフラグメントが全コード配列をカバーしていることを確認するために、その配列をＦｉｘベクターのヒトフィブロブラストＷＩ３８　（Ｎｏ、９４４２０１Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ　）からのゲノムライブラリーとの同じフラグメントをハイブリダイゼーションした後得られたゲノムフラグメントの配列と比較した。ｃＤＮＡ配列をＳａｎｇｅｒ法　法（前述１３．３−１３．１０）に従って同定し次のことが判明した。ａ）翻訳制御シグナルを示す、ステム−ループ第２構造を形成できる配列を含む、３２１ヌクレオチドの５′末端非翻訳領域；ｂ）分泌蛋白のシグナルペプチドを示す、ＮＨ２末端で疎水性３２アミノ酸配列を含む、１４９アミノ酸の蛋白をコードするオーブンリーディングフレームを存する４４７ヌクレオチド配列；Ｃ）ポリアゾニレ−ジョン部位を含む８７７ヌクレオチドの３′末端非翻訳領域。ｃＤＮＡ配列から推論されたアミノ酸配列を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　）Ｄａｔａ　Ｂａｎｋに挿入し、同一の配列の蛋白は無いこと、１２０アミノ酸領域に限り５０％ホモロジーを、血管透過性因子ＶＰＦ（Ｋｅｃｋ等、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ、　２４６．１３０９）、強力なアンギオジエニックファクターに対して示した。したがって、新規蛋白ＰＩＧＦはそれ自体アンギオジェネシスー制御活性を有することを示唆している。実施例２ＪＥＧ−３細胞ｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡライブラリーをＰＩＧＦプローブてスクリーニングした。６つの組換えファージを単離した。そのうち２つの配列は、５１０塩基対長、＋７０アミノ酸蛋白をもたらす。この配列はプラセンタから単離されたｃＤＮＡと、６３塩基対、＋４１−１４２の位置に蛋白中に２１アミノ酸挿入をもたらす以外は同一であった。興味深いことには、新規配列は２１以上に１０基本アミノ酸（Ａｒｇ及びＬｙｓ）を含む実施例３ＰＩＧＦ遺伝子のゲノムマツピング及びクローニング蛋白ＰＩＧＦをコードする遺伝子は、別々のヒト染色体（示さず）をそれぞれ含むむ、別々のハイブリッドセルラインからＤＮＡを採用することにより、「サザンプロット」分析により、染色体１４上にマツプされていた。ＰＩＧＦ遺伝子の構造及びヌクレオチド配列部分はヒトゲノムライブラリーから決定した。この遺伝子は６つのエクソンとスプライシングにより１４９アミノ酸蛋白をコードするトランスクリプトをもたらす５つの介在配列に分けられる。コリオカルシツマ細胞（ＪＥＧ−３）において、−次トランスクリプトは交互に５番目のイントロンでスプライスされて１７０アミノ酸をコードするトランスクリプトをもたらす（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ２参照）。５番目のイントロンのＳＥＱ　ＴＤ　Ｎ２の１７４から８２８までの配列を含むもうひとつの別のスプライシングは、より高分子量のＰＩＧＦ蛋白を生じる。事実、２つの蛋白が、抗Ｐ　ＩＧＦ抗体を用いた。ＪＥＧ−３コンデイシヨンメデイウムからイムツブレシピテートされる。実施例４サブクローニングストラテジーの図式を図４に示す。ここで、本質的にＴ７フアージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、同じファージのターミネーター：複製のオリジン（ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性（ａｍｐ）を含むＰＥＴ３を用いた（Ｎｏｖａｇｅｎ　Ｍａｄｉｓｏｎ　Ｗｉ；　ＵＳＡ　）。サブクローンされるｃＤＮＡインサートをＰＣＲアンブリフイケーション（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、前述１４．６）により得た。最初の３１アミノ酸を欠失した蛋白をコードするｃＤＮＡをもたらした。鋳型として、ヌクレオチドｌからヌクレオチド９４０迄のＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントを採用した。ＲＮＡポリメラーゼのプライマーとして、以下のオリゴヌクレオチドを採用し、ｒＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３８１　ＡＪオリゴシンセサイザーにより合成した。オリゴヌクレオチドＡ　ヌクレオチド７６８からヌクレオチド７８７迄のコーディング　ストランドに相補的、ＧＧＡＴＣＣ配列、ＢａｍＨＩ認識部位を、ヌクレオチドア７５から７７６の間に挿入し、以下の配列を有する。！’−ｆｃｅ：ＴＣＣＡＱＧＧＱ哀＝ピ３２；７０３０７丁に−３−オリゴヌクレオチドＢ　ヌクレオチド４０４からヌクレオチド４２１まての非コードストランドに相補的、ＣＡＴＡＴＧ配列、Ｎｄｅ　Ｉ認識部位を次の配列を有するヌクレオチド４１４と４１５の間に挿入した。ＰＣＲから得られたヌクレオチド鎖をＮｄｅ　Ｉ及びＢａｍＨＩで切断し、標準プロトコールにより、同じＮｄｅｌ及びＢａｍＨ１部位でプロ力すオテックｐＥ７３発現ベクターでライゲートした。生成物をＣａ　Ｃ２２法でコンピテントにしたＥ、Ｃｏ１１ＨＢＩＯＩ株を形質転換するのに用いた。組換プラスミドを同定しＥ、Ｃｏ１１　ＪＭ１０９株（ＤＥ３、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ　Ｗ　ｌ　１Ｕ　Ｓ　Ａ　）を形質転換するのに用いた。実施例５バクテリアからのＰＩＧＦ蛋白の合成及び単離ひとつのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンブリシリン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ，、ＵＳＡ　）及び４　ｇ／Ｉ！のグルコースを含むＬＥツブスに接種し、３７°Ｃで生育して６゜Ｏｎｍでの光学濃度０．Ｄ　０．３５にした。Ｉ　ＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ　）を添加し最終濃度１ｍＭとし、培養を３７°Ｃで更に３時間インキュベートした。培養を遠沈し、ｌｏｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０（ＴＥ）を含むバッファーのｌ／１０の初期濃度中で再懸濁した。更に遠沈後、沈殿をＴＥ、１％ＳＤＳ、０．１ＭＮａＣ１を含むリンスバッファー中にｌ／６０の初期濃に分け、３サイクルの凍結及び解凍によるりシスを行ない、中強度ソニケーションを行なった。得られた電気泳動パターンの例を図５に示す。ここでライン１．２．３及び４はｌ　ＰＴＧインダクション後それぞれ、０、ｌ、２及び３時間のライゼートからの蛋白の電気泳動パターンを示す。コントロールとして、ライン５は、インサートを欠き、Ｉ　ＰＴＧで３時間インデユースしたベクターでのみ形質転換した同じ株を示す。電気泳動は、Ｌａｅｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、２２７．６８０−６８５．１９７０に従って、Ｂｒａｄｌｅｙ等、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　。１８２．１５７−１５９　（１９８９）に従って、スティンした１５％ポリアクリルアミドゲル中で実施した。実施例６抗ＰＩＧＦ抗体の生産及びＰＩＧＦのイムノブレシビテーション７０μｇの蛋白ＰＴＧＦをＧａｓｓｍａｎｎ等、１９９０、Ｆａｓｅｂ　Ｊ、４．２５２８−２５３２に記述されたように、２匹のキッチンの免疫用に用いた。形成された抗体を抽出しＧａｓｓｍａｎｎ等（上述）に記述されたようにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）て沈殿によりヨーク（ｙｏｌｋ）から精製した。イムノブレシビテーションを１２０−２５０μｌのセルラーライゼート又はｃｏｓ −１セルコンデイシヨニングメデイウムを１０又は１５μｍのラビット又はチッキン抗体で、２時間室温で又は１６時間４°Ｃでインキュベートして実行した。チッキン抗体とのイムノ反応を更に１５μｌのラヒット抗チッキンＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ　Ｎ、　Ｃ６７７８）で、１時間室温で処理した。イムノコンプレックスを蛋白−セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）で選択し、１．２μｌのＰＢＳで２度、０．０１％　Ｎｏｎ１ｄｅｔ−Ｐ２Ｏ及び４００μＭのＮａＣ１で洗滌した。イムツブレシピテートをその後再懸濁し、標準手法によるデネイチュリング及び還元条件下ポリアクリルアミドゲル上で分析した。もし、ＣＯＳ細胞が以前にプラスミドｐＳＶＬ−Ｐ　ＩＧＦにトランスフェクトされていたならば、２５ｋＤａ分子量の蛋白が、ライゼート及び培地の両方からイムツブレシピテートされる。

【配列表】

配列番号：１（ＳＥＱ　ｒｐ　Ｎ、ｌ）配列の型：コード領域に対応する蛋白を有するヌクレオチド配列の長さ：ｌ６４５塩基対鎖の数　−木組トポロジー二直鎖状分子の型：ｃＤＮＡからｍＲＮＡハイポセティカル配列：なしアンチセンス、なし起源：ｃＤＮＡブラセンタルシタブラリーオルガニズム：ヒトイミディエートな実験源＋　ｐ　Ｐ　Ｉ　ＧＦ　−２（ＡＴＣＣＮ、４０８９２）特徴：ｌから３２１ｂｐまで　５′末端非翻訳領域３２２から７６８ｂｐまて　コード領域７６９から１６４５ｂｐまで　３′末端非翻訳領域配列：１０３０　１０４０　１Ｇ５０　１０６０　１０７（ｌ　Ｌｏａ。１−ＣＡ（（：ＴＧＣ−ＣＣＴＣＣＴＧＡＱズｔＣん献χτａｃｃｃＣＣｃａｃａｃｃＣＣＣＩ’ＧＧＡＧＧτａ℃こＡｌｌ！ズにＣ口１０９０　１１００　ＬｌｉＯＬＬＺＯＬｉ２ＯＬＬ４０ｃｃ−んｈＱＧ　ＣｃＴＧｃ１ムＣＸτｃｃｃｃ　Ｃ−ムごυ。ｃｃＭＪｃｃｃｒｒｃＣＴＴＴＣＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧτＡＧＧＧＡＴ（ａα℃ＡτフσｒｃｃフスχＣｃｃｃｃｃ１２１０　１２２０　１２３０　１２４０　ＬＺ５０　１２６０ＡＣＧＧ（ｍｅゴ乙！ＩＪ＆ＣＡ（ＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＬＺ７０　１２８０　１２９０　Ｌｌｏｏ　１３１０　１ｊ２０ｅ’ＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＡ　Ｇ１１ｘτ＝ｔａ１αｔＧ−ＴＴＴＧＣＣＡ（１３３０１ｊ＆０　１３５０　１４６０　１４７０　１３！１０τＣ σ口℃τｃａｃａｏば℃に■πＣＣＣ−乙にぶ＝〒−に口しτ＝℃＝ＡＣ−号Ｇぬ＝す＝Ｃ１！９０　ＬｌｔＯＯ１４１０１ＡＺ０　１４３０　１＆４０ττフｃｃｃｃｃｃｃａｃｃτｃ：ＣＡｃｃ、、ｃｃｃｒｃｃｃｅｃｃａｃτＡムＧＡＧ人ＣＡＣ人てλＣＡＧＡＧτｃｃｃＣｃｃｃ＝１４５０　１Ａ６０　１４７ＯＬ＆ａＣＬ＋！、９（ｌ　Ｌ５００ＧＧ（ＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣ３Ａ τ−Ｃυ１ＣＡＧＣ−シーＣ乙（τｅ＾τＧＭχＪＣλα詰ＧＬ５ＬＯＬｉ２ＯＬ５３Ｑ　１５ｏｏ　１５５０　Ｌ５６０α：ｃａｃｃ、ｗｃｒｃ’ｒｃｃｃ’ ｒｃｃｃａｃｃｒｃ　＆　＝乙とｒｃｃｃ乙ｕＧαＸ＝１５７ＯＬ５ｇＯＬ５９（ｌ　Ｌ６００　Ｌ６ＬＯ１６２０σＩ’ＧＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＡＡＯコ℃τ ＣＣＩＣＡＴＣＴＣＡＣｒＣＣＣＡＡＧロシ！ＴＴＣＴＣＴＴＣＡ１６］０　１６４０ＡτλＡＡＧＴ人τて０丁配列番号：２（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ、２）配列の型・リーディングフレームの対応するアミノ酸配列を存するヌクレオチド配列の長さ・８２８ｂｐ鎖の数ニー木組トポロジー・直鎖状分子の型、ゲノムＤＮＡハイボセティカル配列：なしアンチセンス　なし起源：ゲノムライブラリーオルガニズム・ヒトイミーディエードな実験源：ｐｌｑｆｉｓＳ特徴。１から８２８ｂｐ　ｐｌＧＦ遺伝子の５′末端の５番目のインターピーニング配列１１０から１７２ｂｐ　プライマリ−トランスクリプトの交互スプライシングによるコード領域１７５から８２９ｂｐ　プライマリ−トランスクリプトの別の交互ライジングによるコード領域配列Ｃ０Ｎ５ＴＲＬＩＣＴＩＱＮ　ＯＦ　ｐＥＴ−ρＬＧＦ手続補正書（睦）平成５年６月３０日。

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の配列：【配列があります】を有し、アンギオジェネシス制御活性を有する蛋白をコードする配列を含むヌクレオチド配列。
２．該コードされた蛋白が交互スプライシングプロセスから由来することを特徴とする請求項１のヌクレオチド配列。
３．該蛋白が位置１４１−１４２に挿入された次の２１アミノ酸配列：【配列があります】を含む請求項２のヌクレオチド配列。
４．該蛋白が１以上のアミノ酸を欠失するがそのアンギオジェニック制御活性を保持する請求項１ないし３のいずれかのヌクレオチド配列。
５．該蛋白がアミノ酸１からアミノ酸３１まで欠失している請求項４のヌクレオチド配列。
６．１以上のアミノ酸が該蛋白中で置換されているが、該蛋白はそのアンギオジェニック制御活性を保持している請求項１から３のいずれからヌクレオチド配列。
７．請求項１ないし６のいずれかの配列のアレリックデリバティブであるヌクレオチド配列。
８．請求項１ないし７のいずれかの配列に相補的なヌクレオチド配列。
９．同じリーディングフレームで翻訳されるヌクレオチド配列が５′又は３′位置に共有結合的にリンクする請求項１ないし８のいずれかのヌクレオチド配列。
１０．該リンクしたヌクレオチド配列が、該蛋白のアンギオジェネシスの制御活性を妨害しないアミノ酸配列をコードする請求項９のヌクレオチド配列。
１１．該リンクしたヌクレオチド配列がトキシックな活性を有する蛋白をコードする請求項９又は１０のヌクレオチド配列。
１２．配列：【配列があります】ここで、ヌクレオチド１からヌクレオチド３２１までの５′末端領域が非翻訳であり、ヌクレオチド３２２からヌクレオチド７６８迄の領域がアンギオジェネシス制御活性を有する蛋白をコードし、３′末端領域が非翻訳であるを含むヌクレオチド配列。
１３．配列：【配列があります】の少くとも１部を含む請求項１２のヌクレオチド配列。
１４．アンギオジェネシスの制御活性を有する蛋白をコードし、１以上のヌクレオチドを欠く請求項１２又は１３のヌクレオチド配列。
１５．ヌクレオチド３２２からヌクレオチド４１４までが欠失している請求項１４のヌクレオチド配列。
１６．１以上のヌクレオチドが置換され、アンギオジェネシスの制御活性を有する蛋白をコードする請求項１２又は１３のヌクレオチド配列。
１７．該非翻訳５′末端が翻訳の規制領域を含む請求項１２又は１３のヌクレオチド配列。
１８．該制御領域がステムーループ二次構造を形成する請求項１７のヌクレオチド配列。
１９．請求項１２又は１３のヌクレオチド配列にアレリックなヌクレオチド配列。
２０．請求項１２から１９までのいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
２１．アンギオジェネシスの制御活性を有する請求項１のアミノ酸配列を含む蛋白。
２２．該蛋白が一次トランスクリプトの交互スプライシング由来の配列を含む請求項２１の蛋白。
２３．該配列が請求項２１の配列の位置１４１−１４２に挿入され、請求項１３の配列の少くとも一部分によりコードされた配列を含む請求項２２の蛋白。
２４．該配列が請求項３の２１のアミノ酸配列である請求項２３の蛋白。
２５．該蛋白が１以上のアミノ酸を欠けるが、そのアンギオジェニック制御活性を保持する請求項２１ないし２４のいずれかの蛋白。
２６．該蛋白がアミノ酸１からアミノ酸３１迄を欠失している請求項２５の蛋白。
２７．１以上のアミノ酸が該蛋白中で置換されているが、該蛋白はそのアンギオジェニック制御活性を保持している請求項２１から２４までのいずれかの蛋白。
２８．請求項１ないし３のいずれかのヌクレオチド配列のアレリックなデリバティブであるヌクレオチド配列によりコードされた蛋白。
２９．アミノ酸鎖が末端ＣＯＯＨ又はＮＨ２基で共有結合的にリンクしている請求項２１から２８のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白。
３０．該アミノ酸鎖が蛋白それ自体のアンギオジェネシスの制御活性を妨害しない請求項２９の蛋白。
３１．該アミノ酸鎖がトキシックな細胞活性を示す請求項２９又は３０の蛋白。
３２．ａ）バクテリアルプラスミドのレプリケーションオリジン、ｂ）セレクティブマーカー、ｃ）プロモーター及び該プロモーターの制御下、ｄ）請求項１から２０迄のいずれかのヌクレオチド配列を含むベクター。
３３．該セレクティブマーカーが抗生物質耐性をコードする遺伝子である請求項３２のベクター。
３４．該プロモーターが、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターである請求項３２又は３３のいずれかのベクター。
３５．該ベクターがプラスミドｐ　Ｇｅｍ　１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ，ＵＳＡ）を含む請求項３２から３４迄のいずれかのベクター。
３６．該ベクターがプラスミドｐＥＴ３（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ　ＵＳＡ）を含む請求項３２ないし３４のいずれかのベクター。
３７．転写を制御する１以上の配列を含む請求項３２ないし３６のいずれかのベクター。
３８．該配列がトランスクリプションエンハンサーを含む請求項３７のベクター。
３９．該配列がインデューシブルプロモーターを含む請求項３７のベクター。
４０．ポリアデニレーション部位を含む請求項３２ないし４０のいずれかのベクター。
４１．請求項３２ないし４０のいずれかのベクターにより形質転換された細胞。
４２．該細胞がバクテリア細胞である請求項４１の細胞。
４３．該バクテリアがＥ．Ｃｏｌｉである請求項４２の細胞。
４４．該細胞がオイカリオテック細胞である請求項４１の細胞。
４５．バクテリアカルチャーを液体培地中で、６００ｎｍで光学濃度０．３５迄生育させ、ＴＥ中に再懸濁し、遠沈しそしてリシスバッファー中に再懸濁し、細胞を溶解することを含む方法であって、請求項４１ないし４３のいずれかの細胞から請求項２１ないし３１のいずれかの蛋白を生産し抽出する方法。