ES2305541T3 - Scd40l, papp-a y factor de crecimiento placentario (pigf) como combinaciones de marcadores bioquimicos en enfermedades cardiovasculares. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el análisis de muestras en relación con enfermedades cardiovasculares agudas, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: (a) poner a disposición una muestra biológica que va examinarse de un sujeto; (b) determinar la concentración del marcador PlGF en la muestra, (c) dado el caso, determinar la concentración de al menos otro marcador seleccionado de ligando CD40 soluble (sCD40L), PAPP-A, troponina T (TnT), MPO, NT-proBNP, VEGF, BNP y otros marcadores inflamatorios, y (d) comparar el/los resultado/s obtenido/s para la muestra que va a examinarse con valores de referencia y/o los valores de muestras de referencia.

Description

sCD40L, PAPP-A y factor de crecimiento placentario (PlGF) como combinaciones de marcadores bioquímicos en enfermedades cardiovasculares.

La invención se refiere a nuevos marcadores de inflamación vascular y combinaciones de los mismos como herramientas para el diagnóstico y su pronóstico en pacientes con enfermedades cardiovasculares. Los marcadores sirven además como herramientas que facilitan la elección de principios activos para el tratamiento de tales enfermedades y finalmente como punto de partida para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Además, la invención se refiere a la creación de un perfil de riesgo individual de procesos negativos que están relacionados con la progresión de arteriosclerosis.

Antecedentes de la invención

Una formación de trombo en la arteria coronaria es el acontecimiento desencadenante de una enfermedad cardíaca coronaria inestable. La función central de la activación plaquetaria se promueve incluso adicionalmente en pacientes con una enfermedad cardíaca coronaria inestable mediante metabolitos de tromboxano y prostaglandina que son liberados por las plaquetas. Por esto, la activación plaquetaria es un objetivo terapéutico general. Hasta ahora, las terapias de este tipo han comprendido el uso de aspirina, tienopiridinas y un inhibidor directo de la glucoproteína IIb/IIIa. No obstante, hasta la fecha no ha podido identificarse un marcador bioquímico fidedigno de la activación plaquetaria. Los resultados con P-selectina, que hasta ahora son los marcadores más prometedores para una activación plaquetaria, son hasta la fecha cuestionables.

Los individuos que padecen una enfermedad cardiovascular pueden clasificarse en individuos que no muestran síntomas y aquellos que muestran dolor torácico. El último grupo mencionado puede clasificarse en individuos que presentan una angina de pecho estable (APE) y aquellos con síndromes coronarios agudos (SCA). Los pacientes con SCA pueden presentar una angina de pecho inestable (API) o estos pacientes ya padecieron un infarto de miocardio (IM). El IM puede ser un IM con ST elevado o un IM sin ST elevado. La aparición de un IM puede ir acompañado de una disfunción ventricular izquierda (DVI). Por último lugar, los pacientes con DVI pasan una insuficiencia cardíaca congestiva (ICC) con un índice de mortalidad de aproximadamente el 15% o no muestran síntomas.

Los pacientes que son hospitalizados con dolores torácicos son examinados de una elevación o depresión de ST. Si este es el caso, el individuo tiene una probabilidad de casi el 100% de quedarse en el hospital. Sin embargo, debido a que no todos los individuos con un IM muestran anomalías en ST, se determina el nivel de troponina (TnT), que en el caso de valores inusualmente altos indica una alta probabilidad de que se ha producido un IM.

Los recientes avances en la investigación básica han establecido una función fundamental de la inflamación en la mediación de todas las fases de arteriosclerosis, desde su inicio pasando por la progresión y, por último lugar, las complicaciones trombóticas de las lesiones arterioscleróticas [Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation and atherosclerosis. Circulation 2002;105(9): 1135-43. Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease. N Engl J Med 1999;340 (2):115-26. Davies MJ, Thomas AC. Plaque fissuring-the cause of acute myocardial infarction, sudden ischaemic death, and crescendo angina. Br Heart J 1985;53(4):363-73. Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation 1995;91(11):2844-50]. Los resultados obtenidos de la relación entre inflamación y arteriosclerosis forman la base teórica para el uso de marcadores de inflamación circulantes como potenciales instrumentos predictivos en pacientes con síndromes coronarios agudos. De hecho, niveles elevados de marcadores de inflamación, como por ejemplo proteína C reactiva de alta sensibilidad (hsCRP), suero amiloide A e interleucina 6 (IL-6), no sólo van acompañados generalmente de síndromes coronarios agudos [Berk BC, Weintraub WS, Alexander RW. Elevation of C-reactive protein in "active" coronary artery disease. Am J Cordial 1990;65(3):168-72., Biasucci LM, Vitelli A, Liuzzo G y col. Elevated levels of interleukin-6 in unstable angina. Circulation 1996;94(5):874-7], sino que - lo que es más importante - también pueden predecir una explicación sobre el desenlace clínico de pacientes con síndromes coronarios agudos [Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR y col. The prognostic value of C-reactive protein and serum amyloid a protein in severe unstable angina. N Engl J Med 1994;331(7):417-24., Biasucci LM, Liuzzo G, Grillo RL y col. Elevated levels of C-reactive protein at discharge in patients with unstable angina predict recurrent instability. Circulation 1999;99(7):855-60., Toss H, Lindahl B, Siegbahn A, Wallentin L. Prognostic influence of increased fibrinogen and C-reactive protein levels in unstable coronary artery disease. FRISC Study Group. Fragmin during Instability in Coronary Artery Disease. Circulation 1997; 96(12):4204-10]. Aunque la "clásica" proteína de fase aguda hsCRP se contempla como el biomarcador más prometedor para fines clínicos, existe una heterogeneidad sustancial en cuanto a la prevalencia de niveles elevados de hsCRP en pacientes con síndromes coronarios agudos [Biasucci LM, Liuzzo G, Colizzi C, Rizzello V. Clinical use of C-reactive protein for the prognostic stratification of patients with ischemic heart disease. Ital Heart J 2001;2(3):164-71].

Así, más del 30% de los pacientes con angina de pecho inestable más grave no muestran niveles elevados de hsCRP [Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR y col. The prognostic value of C-reactive protein and serum amyloid a protein in severe unstable angina. N Engl J Med 1994;331(7):417-24., Heeschen C, Hamm CW, Bruemmer J, Simeons ML. Predictive value of C-reactive protein and troponin T in patients with unstable angina: a comparative analysis. CAPTURE Investigators. Chimeric c7E3 AntiPlatelet Therapy in Unstable angina refractory to standard treatment trial. J Am Coll Cardiol 2000;35(6):1535-42]. Además, diferencias individuales en la amplitud de la respuesta a determinados estímulos inflamatorios pueden influir posiblemente en los niveles de reactivos de la fase aguda "aguas abajo", como hsCRP [Pepys MB, Hirschfield GM. C-reactive protein and its role in the pathogenesis of myocardial infarction. Ital Heart J 2001, 2(11):804-6., Liuzzo G, Biasucci LM, Rebuzzi AG y col. Plasma protein acute-phase response in unstable angina is not induced by ischemic injury. Circulation 1996;94(10):2373-80]. Por tanto, todavía existe el requisito importante de identificar estímulos proximales para inflamación vascular que puedan usarse como marcadores de suero predictivos de riesgos en pacientes con arteriosclerosis coronaria.

Entretanto se multiplican las indicaciones de que el sistema CD40-CD40L desempeña una función importante en la patofisiología de pacientes con una enfermedad cardíaca coronaria inestable. Además de en la forma asociada a células, el CD40L también aparece en una forma soluble biológica completamente activa, concretamente sCD40L. El sCD40L es desprendido por linfocitos estimulados y se libera activamente en la estimulación plaquetaria. El sCD40L actúa de forma proinflamatoria en células endoteliales y promueve la coagulación incitando a los monocitos y células endoteliales a la expresión de factores tisulares. Además, el sCD40L contiene una secuencia KGD, un motivo de unión conocido que es específico para la integrina \alphaIIb\beta3 de plaquetas predominante. El CD40L es realmente un ligando de \alphaIIb\beta3, un agonista plaquetario, y es necesario para la estabilidad de trombos arteriales. En el suero de pacientes con síndromes coronarios agudos puede detectarse una elevación del sCD40L. Se informó (Schonbeck U, Varo N, Libby P, Buring J, Ridker PM. Circulation 2001; 104: 2266-8) que mujeres aparentemente sanas que presentaban elevadas concentraciones de sCD40L en plasma tenían al mismo tiempo un riesgo elevado de acontecimientos cardiovasculares.

Nuevos hallazgos muestran que una rotura de placas y la posterior formación de un trombo en pacientes con síndromes coronarios agudos puede llevar a una activación de la exposición de CD40L en plaquetas circulantes (Lee Y, Lee WH, Lee SC, Ahn KJ, Choi YH, Park SW, Seo JD, Park JE. Cardiology. 1999; 92: 11-6). También se detectaron elevadas concentraciones de sCD40L en pacientes con angina de pecho, siendo las concentraciones especialmente altas en pacientes con angina de pecho inestable (Aukrust P, Muller F, Ueland T, Berget T, Aaser E, Brunsvig A, Solum NO, Forfang K, Froland SS, Gullestad L. Circulation 1999; 100: 614-20). Estos hallazgos sugieren que una interacción CD40L-CD40 desempeña una función importante en la patogénesis de procesos ateroscleróticos y el desarrollo de síndromes coronarios.

El establecimiento del diagnóstico correcto, unido a un tratamiento adecuado de pacientes con síndromes coronarios agudos, que no van acompañados de una elevación del segmento ST, puede ser muy laborioso. La exclusión de infartos de miocardio agudos según los estándares actuales no es satisfactoria. En los últimos años ha tenido lugar una concentración en la estratificación del riesgo y el control del tratamiento con el fin de identificar pacientes en los que existe el riesgo de desarrollar acontecimientos cardiológicos potencialmente mortales y que se aprovechan sobre todo de las estrategias terapéuticas y de intervención mejoradas (Hamm CW, Bertrand M, Braunwald E. Lancet 2001; 358:1533-8). El ECG sólo tiene en relación a esto una relevancia pronóstica limitada ya que las anomalías representativas son escasas y su detección es menos sensible y específica (Kaul P, Fu Y, Chang WC y col., J Am Coll Cardiol 2001; 38:64-71 y Savonitto S, Ardissino D, Granger CB y col. JAMA 1999; 281:707-13). Por lo tanto, los marcadores de una necrosis de células miocárdicas, sobre todo troponinas cardíacas, se han convertido en valiosas herramientas en la evaluación de pacientes con síndromes coronarios agudos (Hamm CW, Braunwald E. Circulation 2000; 102:118-22). No obstante, las troponinas no participan activamente en la patofisiología de síndromes coronarios agudos, sino que más bien representan un tipo de marcador sustituto para la frágil formación de trombos (Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B, Venge P, Wallentin L. J Am Coll Cardio. 2001; 38:979-86, Heeschen C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML. Circulation 1999; 100:1509-14; Benamer H, Steg PG, Benessiano J y col. Am Heart J 1999; 137:815-20). El ECG sólo tiene en relación a esto una relevancia pronóstica limitada ya que las anomalías representativas son escasas y su detección es menos sensible y específica (Kaul P, Fu Y, Chang WC y col., J Am Coll Cardiol 2001; 38:64-71 y Savonitto S, Ardissino D, Granger CB y col. JAMA 1999; 281:707-13).

Los marcadores de una activación plaquetaria que determinan la actividad de la enfermedad posiblemente antes de que aparezca una necrosis miocárdica podrían representar informaciones adicionales importantes para la estratificación diagnóstica y terapéutica en pacientes con síndromes coronarios agudos. Cada vez más hay pruebas de que el ligando CD40 (CD40L, renombrado hace poco CD154) también desempeña una función importante en el desarrollo de la enfermedad y la desestabilización de placas (Mach F, Schonbeck U, Sukhova GK, Atkinson E, Libby P. Nature 1998; 394:200-3 y Lutgens E, Gorelik L, Daemen MJ y col. Nat Med 1999; 5:1313-6). El sistema CD40-CD40L está distribuido en una pluralidad de leucocitos y células no leucocitarias, incluidas células endoteliales y células de músculo liso (Schonbeck U, Libby P. Cell Mol Life Sci 2001; 58:4-43), así como plaquetas activadas (Henn V, Slupsky JR, Grafe M y col. Nature 1998; 391: 591-4). Adicionalmente a la forma de 39 kDa asociada a células, el CD40L también aparece en una forma soluble biológica completamente activa, concretamente sCD40L (Graf D, Muller S, Korthauer U, van Kooten C, Weise C, Kroczek RA. Eur J Immunol 1995; 25:1749-54). El sCD40L es desprendido por linfocitos estimulados y se libera activamente en la estimulación plaquetaria (Lee Y, Lee WH, Lee SC y col. Cardiology 1999; 92:11-6 y Henn V, Steinbach S, Buchner K, Presek P, Kroczek RA. Blood 2001; 98:1047-54). El sCD40L actúa de forma proinflamatoria en células endoteliales y promueve la coagulación induciendo la expresión de factores tisulares por monocitos (Mach F, Schonbeck U, Bennefoy JY, Pober JS, Libby P. Circulation 1997; 96:396-9) y células endoteliales (Urbich C, Mallat Z, Tedgui A, Clauss M, Zeiher AM, Dimmeler S. J Clin Invest 2001; 108:1451-8). Además, el sCD40L contiene una secuencia KGD (Graf D, Muller S, Korthauer U, van Kooten C, Weise C, Kroczek RA. Eur J Immunol 1995; 25:1749-54), un motivo de unión conocido que es específico para la integrina \alphaIIb\beta3 de plaquetas predominante (Scarborough RM, Naughton MA, Teng W y col. J Biol Chem 1993; 268:1066-73). Pudo mostrarse que el CD40L representa realmente un ligando de \alphaIIb\beta3, un agonista plaquetario, y es necesario para la estabilidad de trombos arteriales (Andre P, Prasad KS, Denis CV y col. Nat Med 2002; 8:247-52).

Estos hallazgos prueban obligatoriamente que el sCD40L desempeña una función importante en la patofisiología de síndromes coronarios agudos. De manera interesante, una elevación del sCD40L puede detectarse en suero de pacientes con síndromes coronarios agudos (Aukrust P, Muller F, Ueland T y col. Circulation 1999; 100:614-20). Se informó que mujeres aparentemente sanas que presentaban elevadas concentraciones de sCD40L en plasma tenían un riesgo elevado de acontecimientos cardiovasculares. (Schonbeck U, Varo N, Libby P, Buring J, Ridker PM. Circulation 2001; 104: 2266-8).

Los marcadores de inflamación que determinan la actividad de la enfermedad posiblemente antes de que aparezca una necrosis miocárdica podrían representar informaciones adicionales importantes para la estratificación diagnóstica y terapéutica en pacientes con síndromes coronarios agudos. La inhibición terapéutica específica de citocinas, que son esenciales para la estabilidad de placas, puede ser una nueva estrategia de tratamiento para pacientes con enfermedad cardíaca coronaria inestable y estable.

El factor de crecimiento placentario (PlGF), un miembro de la familia de los factores de crecimiento endoteliales vasculares (familia VEGF) de los factores de crecimiento, mostró recientemente que éste está regulado por incremento en lesiones arterioscleróticas tempranas y avanzadas.

El documento US 6.225.088 describe PlGF en relación con enfermedades proliferativas, mientras que en el documento WO 92/06194 PlGF se describe como factor angiogenético.

De Falco y col. (De Falco S, Gigante B, Persico MG. "Structure and function of placental growth factor" Trends Cardiovasc Med 2002 Aug;12(6):241-6) describen la relación de la angiogénesis y arteriogénesis afectadas durante estados patológicos, como por ejemplo isquemia y formación de tumores en ratones. En este sentido, el PlGF se describe como un factor esencial para la angiogénesis en condiciones patológicas. PlGF se propone como una diana alternativa para una terapia angiogenética.

Luttun y col. (Luttun A, Tjwa M, Moons L, Wu Y, Angelillo-Scherrer A, Liao F, Nagy JA, Hooper A, Priller J, De Klerck B, Compernolle V, Daci E, Bohlen P, Dewerchin M, Herbert JM, Fava R, Matthys P, Carmeliet G, Collen D, Dvorak HF, Hicklin DJ, Carmeliet P. Revascularization of ischemic tissues by PlGF treatment, and inhibition of tumour angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by anti-Flt1 Nat Med 2002 Aug;8(8):831-40) describen procedimientos terapéuticos de PlGF y Flt-1 en el marco de la angiogénesis. Además se describe que la inhibición de PlGF reduce el crecimiento y la vulnerabilidad de placas arterioscleróticas.

Oura y col. (Oura H, Bertoncini J, Velasco P, Brown LF, Carmeliet P, Detmar M. A critical role of placental growth factor in the induction of inflammation and edema formation. Blood 2003 Jan 15;101(2):560-7) describen la función del PlGF en inflamación cutánea y angiogénesis. Además, se describen los efectos de niveles elevados y reducidos de PlGF y su comparación con el estado de la inflamación.

La citocina proinflamatoria CD40L se libera de plaquetas activadas. La forma soluble de CD40L, concretamente sCD40L, está presente incrementada en pacientes con síndromes coronarios agudos. Por lo tanto, el valor pronóstico de sCD40L como un marcador para la activación plaquetaria también se examinó en cuanto al efecto terapéutico de una inhibición del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa.

La proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A) es una metaloproteinasa de matriz de unión a cinc de alto peso molecular que pertenece a la superfamilia de las metzincinas de las metaloproteinasas y originariamente se identificó en el plasma de mujeres embarazadas. Se ampliamente para la detección de trisomía fetal en el primer trimestre de gestación. Recientemente también se encontró en relación a la PAPP-A que se expresa respectivamente en placas erosionadas y aflojadas, pero sólo se expresa mínimanente en placas estables, y de esto se supuso una reaparición con síntomas en pacientes con SCA. Sin embargo, no se ha determinado exactamente la función exacta del nivel de PAPP-A en plasma circulante para la predicción de desenlaces duros, como muerte o infarto de miocardio en pacientes con SCA. Adicionalmente, es completamente desconocido si el nivel de PAPP-A en plasma pone a disposición informaciones pronósticas adicionales en comparación con los biomarcadores recientemente establecidos en pacientes con SCA. Por tanto, los inventores compararon la significancia pronóstica de niveles de PAPP-A en plasma con marcadores de inflamación sistemática, de la activación plaquetaria, isquemia y necrosis del miocardio en pacientes con SCA.

En el estado de la técnica se encuentran muchos marcadores moleculares distintos que pueden ser adecuados para el diagnóstico de una enfermedad cardiovascular. Ejemplos de tales marcadores son, entre otros:

Proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A); proteína C reactiva (CRP); hsCRP; factor de crecimiento placentario (PlGF); interleucina 18 (IL-18/IL-18b); péptido natriurético cerebral (BNP); propéptido natriurético cerebral NT (NT-proNP); sCD40L, cTnI/T, IL-10, ICAM-1, VCAN-1, E-selectina, P-selectina, IL-6, VEGF, suero amiloide A (SAA), CKMB, MPO, LpPLAz, GP-BB, IL1RA, TAF1, fibrina soluble, anti-oxLDL, MCP-1, factor tisular (TF), MMP-9, Ang-2, Tffi-2, IL-P, bFGF, PCM y VEGF-A.

Algunos de los marcadores anteriormente mencionados son marcadores conocidos y caracterizados para el examen de enfermedades coronarias; sin embargo, hasta ahora todavía no se han examinado otros correspondientemente.

Casi todos los marcadores indicados poseen un valor diagnóstico en cuanto a determinados episodios cardiovasculares. Por ejemplo, TnT es de valor especial para el diagnóstico y la predicción de IM (véase anteriormente). Los marcadores inflamatorios como CRP son valiosos para el diagnóstico y la predicción de una inflamación que puede llevar a una rotura de placas e IM.

Muchos de los marcadores anteriormente mencionados poseen un valor diagnóstico para enfermedades cardiovasculares. El uso de una combinación de marcadores sólo se describió de forma muy reservada.

Lund y col. en Circulation. 2003,108:1924-1926 describen la combinación de PAPP-A con TnI (troponina I); Peng y col. en Clinica Chimica Acta 319 (2002) 19-26 describen la combinación de sCD40L con sICAM-1 y sVCAM-1. Lenderink y col. en European Heart Journal (2003) 24, 77-85 describen la combinación de TnT con CRP. Heeschen y col. en Journal of the American College of Cardiology; vol. 35, nº 6, 2000 mencionan la combinación de TnT con CRP.

Heeschen y col. en Circulation. 2003; 107:2109-2114 describen la combinación de TnT, CRP y IL-10. Blankenberg y col. en Circulation. 2002; 106:24-30 describen la combinación de CRP y IL-6. Autiero y col. en Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1:1356-1370 describen la combinación de PlGF y VEGF.

El documento WO 01/0156593 da a conocer el uso del factor de crecimiento placentario (PlGF) para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares agudas.

Sin embargo, hasta ahora ni se ha examinado el potencial del análisis mejorado mediante la combinación ni se concluyó el desarrollo de pruebas con marcadores superiores selectivos. Por tanto, de los documentos anteriormente mencionados no se deduce por sí mismos que marcadores son apropiados para un diagnóstico eficaz.

Por tanto, en cuanto a lo anteriormente mencionado, un objetivo de la presente invención es poner a disposición un procedimiento con el que pueda estimarse el riesgo de un acontecimiento adverso cardiovascular debido a trombosis coronaria con ayuda de un perfil de riesgo individual. Además, es objetivo de la presente invención un procedimiento para evaluar la probabilidad de desarrollar un tratamiento con un principio activo que sea ventajoso para la inhibición del factor de crecimiento placentario (PlGF). Con la ayuda de este procedimiento se debe permitir mejor que antes que el médico práctico pueda seleccionar medidas adecuadas para influir positivamente en los pacientes y/o prevenir un acontecimiento adverso o al menos reducirlo en su gravedad en los pacientes afectados.

El objetivo de la presente invención es desarrollar un procedimiento con el que pueda estimarse el riesgo de un acontecimiento adverso cardiovascular debido a trombosis coronaria con ayuda de un perfil de riesgo individual. Esto debe tener lugar mediante la medición de la concentración de un marcador de la activación plaquetaria. El objetivo de la presente invención es además desarrollar un procedimiento para evaluar la probabilidad de desarrollar un tratamiento con un principio activo que sea ventajoso para la inhibición de la activación plaquetaria. Con ayuda de este procedimiento se debe permitir mejor que antes que el médico práctico pueda seleccionar medidas adecuadas para influir positivamente en los pacientes y/o prevenir un acontecimiento adverso o al menos reducirlo en su gravedad en los pacientes afectados.

Otro objetivo de la presente invención es encontrar combinaciones generales de marcadores diagnósticos para acontecimientos cardiovasculares que faciliten un diagnóstico preciso de qué acontecimiento cardiovascular ya ha padecido el paciente y de qué enfermará posiblemente en el futuro. Especialmente es un objetivo encontrar una combinación de marcadores que puedan realizarse favorablemente en paralelo. Idealmente, estas mediciones se facilitarían conjuntamente con mediciones de TnT de pacientes con dolores torácicos.

El objetivo de la presente invención se consigue mediante un procedimiento para el análisis de muestras en relación con enfermedades cardiovasculares agudas. El procedimiento según la invención comprende las etapas de: (a) poner a disposición una muestra biológica que va examinarse de un sujeto, (b) determinar la concentración del marcador PlGF en la muestra, (c) dado el caso, determinar la concentración de al menos otro marcador seleccionado de ligando CD40 soluble (sCD40L), PAPP-A, troponina T (TnT), MPO, NT-proBNP, VEGF, BNP y otros marcadores inflamatorios, y (d) comparar el/los resultado/s obtenido/s para la muestra que va a examinarse con valores de referencia y/o los valores de muestras de referencia.

Los marcadores usados para el análisis en el marco de la presente invención son en su mayor parte marcadores muy conocidos y caracterizados del estado de la técnica que, sin embargo, hasta ahora todavía no se habían caracterizado suficientemente para el uso para el diagnóstico de una enfermedad cardiovascular aguda.

Así, la proteína C reactiva (CRP) y hsCRP se caracterizan como marcadores de inflamación sistémica, troponina cTnI/T como marcador para necrosis; la proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A) como marcador para la activación de macrófagos; IL-10 (interleucina 10) como marcador para el equilibrio inflamatorio, sCD40L como marcador para la activación tromboinflamatoria, MPO (mieloperoxidasa) como marcador para estrés oxidativo, el factor de crecimiento placentario (PlGF) como marcador para inflamación vascular y los marcadores péptido natriurético cerebral (BNP) y propéptido natriurético cerebral NT (NT-proNP) como marcadores de activación neurohumoral y de isquemia.

Otros marcadores similares y que también pueden usarse son interleucina 18 (IL-18/IL-18b), ICAM-1,VCAN-1, E-selectina, P-selectina, IL-6, VEGF, suero amiloide A (SAA), CKMB, LpPLAz, GP-BB, IL-1RA, TAF-1, fibrina soluble, anti-oxLDL, MCP-1, factor tisular (TF), MMP-9, Ang-2, Tffi-2, bFGF, PCM y VEGF-A.

El documento WO 03/040692 (y Circulation 2001; 104:2266-2268) describe que el sCD40L puede usarse ventajosamente en combinación con un marcador inflamatorio, especialmente CRP. Sin embargo, esta combinación se usa exclusivamente para el diagnóstico de enfermedades cardíacas no agudas, el documento WO 03/040692 rechaza una estratificación debido a resultados dudosos.

Se prefiere un procedimiento según la invención en el que la muestra que va a examinarse y/o la muestra de referencia proceden de un mamífero, especialmente de ser humano. También se prefiere un procedimiento según la invención en el que la muestra que va a examinarse y/o la muestra de referencia se seleccionan del grupo compuesto por sangre periférica o fracciones de la misma y suspensiones de cultivo celular o fracciones de las mismas. Se prefiere además que la muestra que va a examinarse y/o muestra de referencia sea suero sanguíneo o plasma sanguíneo. Se prefiere especialmente sangre completa periférica como muestra que va a examinarse y/o muestra de
referencia.

Según otro aspecto del procedimiento según la invención, la muestra que va a examinarse y/o la muestra de referencia pueden tratarse previamente añadiéndole a la sangre periférica, por ejemplo, un anticoagulante, especialmente heparina.

Según la invención, pudo encontrarse de manera sorprendente que, además de los análisis individuales del marcador PlGF para el diagnóstico o el seguimiento de acontecimientos cardíacos agudos, también son posibles combinaciones de tales marcadores que facilitan un análisis considerablemente mejorado. En este sentido han demostrado ser especialmente preferidas las combinaciones de marcadores que afectan a distintos aspectos del acontecimiento cardíaco adverso, pero que pueden analizarse al mismo tiempo (es decir, simultáneamente o en una serie de mediciones más o menos separadas en el tiempo). En un aspecto de esta invención, estos otros marcadores se seleccionan de marcadores inflamatorios tales como, por ejemplo, de CRP, (hs)CRP y IL-10.

Según otro aspecto del procedimiento según la invención, los marcadores analizados y combinaciones de éstos se seleccionan de PlGF; PlGF + TnT; sCD40L + PlGF; PAPP-A + PlGF; sCD40L + PlGF + TnT; PAPP-A + PlGF + TnT; sCD40L + PAPP-A + PlGF; y sCD40L + PAPP-A + PlGF + TnT. Entonces, la otra combinación se prefiere con al menos otro de los marcadores MPO, NT-proBNP, BNP, CRP, (hs)CRP y IL-10.

El procedimiento usado según la invención para determinar la concentración de los marcadores analizados puede seleccionarse de todos los procedimientos adecuados conocidos para el experto para la detección de proteínas en muestras biológicas. En el marco de la presente invención, el procedimiento específico no es importante ya que el procedimiento es suficientemente sensible para quedar por debajo del límite de detección necesario para una determinación exacta de las concentraciones de marcadores. Los procedimientos adecuados se basan normalmente en la unión de una marca al marcador que va a detectarse y la posterior detección de esta marca. En este sentido, la unión puede ser covalente o no covalente y/o realizarse directamente o indirectamente. Procedimientos de medición adecuados según la presente invención incluyen, por ejemplo, la electroquimioluminiscencia. También pueden usarse turbidimetría, nefelometría y turbidimetría o nefelometría reforzada con látex.

Debido a su alta sensibilidad y al hecho de que estos procedimientos también pueden adecuarse a entornos de alto rendimiento, según la invención se prefieren procedimientos en los que la determinación de la concentración se realiza mediante un procedimiento inmunológico mediante moléculas que se unen a los marcadores. Ejemplos de tales procedimientos son ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos enzimáticos tipo sándwich o inmunoensayos en fase sólida. Por tanto, se prefiere que las moléculas que se unen a los marcadores se seleccionen del grupo compuesto por anticuerpos anti-marcadores o partes de los mismos y receptores de marcadores o partes de los mismos.

Estas moléculas pueden seleccionarse de una gran pluralidad de moléculas específicas para los marcadores. Se prefiere que las moléculas que se unen a los marcadores se seleccionen del grupo compuesto por anticuerpos, que se dirigen específicamente contra el marcador o contra partes del mismo, o partes o fragmentos del mismo y un receptor de marcadores o partes del mismo o una integrina, por ejemplo, la integrina \alphaIIb\beta3 de plaquetas, o partes de la misma. Se prefiere especialmente un procedimiento según la invención en el que los anticuerpos, partes o fragmentos de los mismos comprendan anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos Fab, anticuerpos scFv y diacuerpos.

Según otro aspecto del procedimiento de la presente invención, los componentes del procedimiento pueden presentarse unidos a una fase sólida, por tanto, las moléculas que se unen a un marcador pueden presentarse en disolución o inmovilizadas en matrices. Como matrices pueden usarse una pluralidad de materiales conocidos para el experto, como por ejemplo matrices de resina y/o matrices de columna habituales. Se prefiere especialmente además un procedimiento según la invención en el que las moléculas que se unen a un marcador estén acopladas a una o varias moléculas de detección del grupo compuesto por tioisocianato de fluoresceína, ficoeritrina, enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano picante) y perla magnética.

Según otro aspecto del procedimiento según la invención, las moléculas que se unen a los marcadores pueden detectarse con un anticuerpo al que están acopladas una o varias moléculas de detección. Por tanto, se trata de una detección indirecta de la unión de la molécula. Tales detecciones de dos etapas son muy conocidas para el experto, por ejemplo, de las técnicas de detección de anti-anticuerpos.

Según otro aspecto del procedimiento según la presente invención, para el análisis de la muestra pueden usarse procedimientos inmunocitológicos. En este sentido son adecuados todos los procedimientos que permiten una determinación específica mediante la interacción marcador/molécula. Se prefieren procedimientos que se seleccionan del grupo compuesto por inmunoensayo enzimático tipo sándwich, ELISA e inmunoensayos en fase sólida.

Los resultados determinados para la muestra que va a examinarse se comparan normalmente con una muestra de referencia. Qué muestra puede servir como muestra de referencia depende especialmente del tipo de la muestra examinada y de la historia clínica del individuo del que procede la muestra que va a examinarse. Se prefiere un procedimiento según la invención en el que la muestra de referencia proceda de uno o el valor medio de varios mamíferos en el/los que se excluyó una enfermedad cardiovascular. Pero esto no debe ser obligatoriamente así, por ejemplo, si debe determinarse la progresión de una enfermedad también puede usarse una muestra "antigua" del mismo paciente como muestra de referencia. Para el experto es obvio qué muestras son adecuadas como muestra de referencia para el procedimiento según la invención.

Según otro aspecto del procedimiento según la presente invención, las enfermedades cardiovasculares agudas que deben diagnosticarse y/o pronosticarse y/o supervisar su terapia pueden seleccionarse del grupo compuesto por angina de pecho inestable, infarto de miocardio, síndrome cardíaco agudo, enfermedad de las arterias coronarias e insuficiencia cardíaca. Sin embargo, no debe excluirse que el procedimiento según la invención todavía pueda ser adecuado y usarse para otros estados de enfermedad cardiológica aguda.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un kit diagnóstico en el que el kit comprende agentes para la realización del procedimiento según la invención, otros componentes y/o coadyuvantes. Tales agentes son un anticuerpo para la detección del marcador y agentes para la posterior cuantificación de los marcadores. El kit puede contener además otros componentes y/o enzimas para la realización del procedimiento de la presente invención, por ejemplo, instrucciones de uso para la interpretación de los resultados de la prueba en cuanto al perfil de riesgo del paciente y medidas preventivas y propuestas de terapia correspondientes.

Se prefiere realizar el procedimiento según la invención con ayuda de un kit diagnóstico que comprende anticuerpos indicadores de ratón policlonales marcados con oro, anticuerpos de detección policlonales biotinilados y un dispositivo de prueba que comprende una tela no tejida de fibra de vidrio.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del procedimiento según la invención para el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades cardiovasculares agudas y/o para supervisar su terapia. Esto se realiza mediante la determinación cuantitativa y crítica de marcadores. Debido al perfil de riesgo que puede crearse a raíz de esto, entonces el médico práctico puede llevar a cabo medidas preventivas adecuadas para influir positivamente en los pacientes y prevenir el acontecimiento adverso o al menos reducirlo en su gravedad en los pacientes afectados. Una terapia tal puede comprender según la invención, por ejemplo, la administración de estatinas o inhibidores del receptor de la glucoproteína IIb/III, especialmente abciximab. Sin embargo, el experto conoce otras posibles terapias que pueden hacer terapia con enfermedades cardiovasculares que pueden realizarse según esquemas habituales.

En otra forma de realización de la invención se administra conjuntamente un agente antiinflamatorio. Este agente puede seleccionarse de agentes antiinflamatorios no esteroideos o esteroideos que pueden incluir, por ejemplo: alclofenac; alclometasona; dipropionato; acetónido de algestona; alfa-amilasa; amcinafal; amcinafida; amfenac sódico; clorhidrato de amiprilosa; anakinra; anirolac; anitrazafeno; apazona; balsalazida disódica; bendazac; benoxaprofeno; clorhidrato de bencidamina; bromelaína; broperamol; budesónida; carprofeno; cicloprofeno; cintazona; cliprofeno; propionato de clobetasol; butirato de clobetasona; clopirac; propionato de cloticasona; acetato de cormetasona; cortodoxona; deflazacort; desonida; desoximetasona; dipropionato de dexametasona; diclofenac potásico; diclofenac sódico; diacetato de diflorasona; diflunudona sódica; diflunisal; difluprednato; diftalona; dimetilsulfóxido; drocinónida; endrisona; enlimomab; enolicam sódico; epirizol; etodolac; etofenamato; felbinac; fenamol; fenbufeno; fenclofenac; fenclorac; fendosal; fenpipalona; fentiazac; flazalona; fluazacort; ácido flufenámico; flumizol; acetato de runisolida; plunixina; flunixina meglumina; fluocortina butilo; acetato de fluorometolona; flucuazona; flurbiprofeno; fluretofeno; propionato de fluticasona; puraprofeno; furobufeno; halcinónida; propionato de halobetasol; acetato de halopredona; ibufenac; ibuprofeno; ibuprofeno aluminio; ibuprofeno piconol; ilonidap; indometacina; indometacina sódica; indoprofeno; indoxol; mitrazol; acetato de isoflupredona; isoxepac; isoxicam; cetoprofeno; clorhidrato de lofemizol; lomoxicam; etabonato de loteprednol; meclofenamato sódico; ácido meclofenámico; dibutirato de meclorisona; ácido mefenámico; mesalamina; meseclazona; suleptanato de metilprednisolona; momiflumato; nabumetona; naproxeno; naproxeno sódico; naproxol; nimazona; olsalazina sódica; orgoteína; orpanoxina; oxaprozina; oxifenbutazona; clorhidrato de paranilina; pentosano polisulfato sódico; fenbutazona glicerato sódico; pirfenidona; piroxicam; cinamato de piroxicam; piroxicam olamina; pirprofeno; prednazato; prifelona; ácido prodolínico; procuazona; proxazol; citrato de proxazol; rimexolona; romazarit; salcolex; salnacedina; salsalato; salicilato; cloruro de sanguinario; seclazona; sermetacina; sudoxicam; sulindac; suprofeno; talmetacina; talniflumato; talosalato; tebufelona; tenidap; tenidap sódico; tenoxicam; tesicam; tesimida; tetridamina; tiopinac; pivalato de tixocortol; tolmetina; tolmetina sódica; triclonida; triflumidato; zidometacina; glucocorticoides; zomepirac sódico.

En el contexto de la presente invención "diagnóstico" se refiere a la comprobación de si un individuo ha padecido un determinado acontecimiento cardiovascular. En el contexto de la presente invención "pronóstico" se refiere a la predicción de la probabilidad (en %) de que un individuo padezca un determinado acontecimiento cardiovascular. En el contexto de la presente invención "estratificación de la terapia" se refiere a la determinación del tratamiento terapéutico adecuado para el acontecimiento cardiovascular que aparecerá o ha aparecido. En el contexto de la presente invención "supervisión de la terapia" se refiere al control y, dado el caso, al ajuste del tratamiento terapéutico de un individuo. En el contexto de la presente invención "tratamiento terapéutico" incluye cualquier tratamiento que posiblemente el estado patofisiológico de un individuo e incluye, por ejemplo, la administración de fármacos, así como tratamiento quirúrgico (por ejemplo, dilatación con globo).

Los valores iniciales de la concentración de sCD40L ponen a disposición informaciones del valor pronóstico en pacientes con síndromes coronarios agudos independientemente de la aparición de una necrosis miocárdica. Además, mediante sCD40L puede identificarse el grupo de alto riesgo de pacientes que pueden sacar el mayor provecho de un tratamiento antiplaquetario con abciximab.

El presente estudio proporciona indicaciones directas de que el sCD40L es un marcador bioquímico significativo de una activación plaquetaria. Una elevación de la concentración de CD40L identifica de forma fidedigna un determinado subgrupo de pacientes con síndromes coronarios agudos que tienen un riesgo extremo de sufrir un acontecimiento cardíaco y que sacan el mayor provecho de un tratamiento con el antagonista del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa abciximab. Correspondientemente, el CD40L no sólo contribuye considerablemente a la patofisiología de síndromes coronarios agudos, sino que pone a disposición un marcador clínico fidedigno y significativo con cuya ayuda pueden identificarse pacientes con un formación de lesiones de alto riesgo y/o trombosis coronaria (Andre P, Prasad KS, Denis CV y col., Nat Med 2002; 8:247-52; Andre P., Nannizzi-Alaimo L, Prasad SK, Phillips DR.; Circulation 2002; 106:896-9).

En el 40,5% de los pacientes de CAPTURE, las concentraciones de sCD40L en la circulación estaban por encima de la concentración umbral calculada de 5,0 \mug/l. Estos pacientes con elevadas concentraciones de sCD40L tenían un riesgo cardíaco extremo de sufrir un infarto de miocardio mortal o no mortal. Este aumento del riesgo cardíaco en pacientes con altas concentraciones de sCD40L, que recibieron un placebo, era obviamente notable durante las primeras 72 horas (figura 5a). No obstante, la frecuencia de los acontecimientos durante los seis meses totales siempre siguió desarrollándose por separado (figura 5b). El sCD40L demostró ser un marcador pronóstico significativo que es independientemente de la detección de una necrosis miocárdica e independientemente de los marcadores de inflamación CRP y TNF-\alpha, así como de la molécula de adhesión ICAM-1. En un modelo de regresión de multivarianza, TnT, CRP y sCD40L proporcionaron informaciones pronósticas fidedignas (tabla 2). Con ayuda de la concentración de sCD40L se identificaron pacientes sin indicios de una necrosis miocárdica que presentaban un elevado riesgo cardíaco. Con el uso de concentraciones umbral fijadas para TnT y CRP, así como de una clasificación de los pacientes por medio del número de marcadores cardíacos que eran elevados, se constató que una estimación simultánea de estos tres marcadores bioquímicos patobiológicamente diferentes en el momento en el que el paciente se presenta facilitó una predicción significativa del riesgo del paciente de sufrir acontecimientos cardíacos adversos durante los seis meses siguientes.

Las troponinas representan marcadores de una necrosis miocárdica, sin embargo no participan activamente en la patofisiología de síndromes coronarios agudos. Más bien son marcadores sustitutos para la frágil formación de trombos (Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B, Venge P, Wallentin L; J Am Coll Cardiol 2001; 38:979-86; Heeschen C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML; Circulation 1999; 100:1509-14; Benamer H, Steg PG, Benessiano J y col.; Am Heart J 1999; 137:815-20). En estudios post mortem en pacientes con síndromes coronarios agudos se identificó una erosión o rotura de las pequeñas cubiertas fibrosas de las placas ateroscleróticas en las que se basa la patofisiología (Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B, Venge P, Wallentin L; J Am Coll Cardiol 2001; 38:979-86; Heeschen C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML; Circulation 1999; 100:1509-14). Una exposición de constituyentes de las placas, colágeno y otros componentes de la pared vascular lleva a un aumento del tono vascular y de la activación plaquetaria (Farb A, Burke AP, Tang AL y col.; Circulation 1996; 93:1354-63; Davies MJ, Thomas AC; Br Heart J 1985; 53:363-73; Davies MJ; N. Engl J Med 1997; 336:1312-4). La tromboembolia de una arteria coronaria con perfusión microvascular elevada y necrosis es un constituyente esencial de síndromes coronarios agudos (Heeschen C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML; Circulation 1999; 100:1509-14; Benamer H, Steg PG, Benessiano J y col.; Am Heart J 1999; 137: 815-20). Correspondientemente, los marcadores sensibles sirven para la detección de una lesión más pequeña del miocardio, especialmente troponinas, como marcadores sustitutos de una tromboembolia arterial que se atribuye a un proceso trombótico activo en la lesión desencadenante.

A diferencia de esto, el sCD40L podría participar de múltiples formas directamente en la patofisiología de síndromes coronarios agudos. Las últimas indicaciones sugieren que el CD40L contribuye esencialmente a la progresión de una aterosclerosis y correspondientemente a una desestabilización de placas ateroscleróticas (Mach F, Schonbeck U, Sukhova GK, Atkinson E, Libby P; Nature 1998; 394:200-3; Lutgens E, Gorelik L, Daemen MJ y col.; Nat Med 1999; 5:1313-6). Se propuso que las interacciones CD40/CD40L promueven complicaciones por ateromas mediante inducción de la expresión de citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, metaloproteinasas de matriz y procoagulantes en distintos tipos de células asociados a ateromas (Schonbeck U, Libby P.; Cell Mol Life Sci 2001; 58:4-43; Henn V, Slupsky JR, Grafe M y col.; Nature 1998; 391:591-4; Henn V, Steinbach S, Buchner K, Presek P, Kroczek RA; Blood 2001; 98:1047-54; Mach F, Schonbeck U, Bonnefoy JY, Pober JS, Libby P.; Circulation 1997; 96:396-9; Miller DL; Yaron R, Yellin MJ; J Leukoc Biol 1998; 63-373-9; Kotowicz K, Dixon GL, Klein NJ, Peters MJ, Callard RE; Immunology 2000; 100:441-8). Recientes estudios han mostrado que, además de los leucocitos y las células no leucocitarias, incluidos granulocitos, fagocitos mononucleares, células endoteliales y células de la musculatura lisa (Schonbeck U, Libby P; Cell Mol Life Sci 2001; 58:4-43), las plaquetas activadas producen y liberan grandes cantidades de sCD40L (Henn V, Steinbach S, Buchner K, Presek P, Kroczek RA; Blood 2001; 98:1047-54). Otro estudio muestra que una circulación extracorpórea provoca una subida de la concentración de sCD40L en plasma que se corresponde con una bajada del contenido de CD40L en plaquetas, lo que sugiere que el sCD40L procede ante todo de las plaquetas y podría contribuir a las complicaciones trombóticas que están asociadas con una circulación de este tipo (Nannizzi-Alaimo L, Rubenstein MH, Alves VL, Leong GY, Phillips DR, Gold HK; Circulation 2002, 105:2849-2854). También se constató que el sCD40L se correlaciona positivamente con P-selectiva soluble en plasma y concentraciones de 11-deshidrotromboxano B_{2} en orina (Cipollone F, Mezzetti A, Porreca E y col.; Circulation 2002; 106:399-402). Además, los exámenes experimentales mostraron que el CD40L es necesario para una estabilización de trombos arteriales (Andre P, Prasad KS, Denis CV y col.; Nat Med 2002; 8:247-52). El presente estudio proporciona ahora una indicación directa de que el CD40L es realmente un marcador de la activación plaquetaria. La activación plaquetaria determinada mediante citometría de flujo en pacientes con síndromes coronarios agudos se correlacionó significativamente con las concentraciones de sCD40L en suero (figura 7). De manera interesante, el sCD40L demostró ser un factor predictivo independiente de una activación plaquetaria con gran significancia. Los resultados del presente estudio establecen concentraciones de sCD40L como marcador pronóstico sumamente informativo en pacientes con síndromes coronarios agudos que están en peligro de sufrir una trombosis. Estos hallazgos están apoyados por el hecho de que una inhibición del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa por abciximab suprimió el elevado riesgo en pacientes con síndromes coronarios agudos y las elevadas concentraciones de sCD40L. Mientras que la troponina indica positivamente la tendencia de un trombo a provocar una embolia y a conducir a necrosis miocárdica, elevadas concentraciones de sCD40L en pacientes con síndromes coronarios agudos reflejan la actividad trombótica de la lesión desencadenante para reclutar y activar plaquetas.

En un análisis anterior de un subgrupo de pacientes del estudio CAPTURE se mostró que un tratamiento adicional con el antagonista del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa abciximab reduce el elevado riesgo de pacientes positivos para troponina al grado de pacientes negativos para troponina (Hamm CW, Heeschen C, Goldmann B y col.; N Engl J Med 1999; 340:1623-9). Estos pacientes representan aproximadamente 1/3 de los pacientes con síndromes coronarios agudos (Hamm CW, Braunwald E; Circulation 2000; 102:118-22; Antman EM, Tanasijevic MJ, Thompson B y col.; N Engl J Med 1996; 335:1342-9; Ohman EM, Armstrong PW, Christenson RH y col.; N Engl J Med 1996; 335:1333-41; Hamm CW, Ravkilde J, Gerhardt W y col.; N Engl J Med 1992; 327:146-S0; Hamm CW, Goldmann BU, Heeschen C, Kreymann G, Berger J, Meinertz T; N Engl J Med 1997; 337:1648-53). De otros estudios resultaron posteriormente hallazgos similares relativos a troponina T y troponina I (Newby LK, Ohman EM, Christenson RH y col.; Circulation 2001; 103:2891-6; Januzzi JL, Chae CU, Sabatine MS, Jang IK; J Thromb Thrombolysis 2001; 11:211-5; Heeschen C, Hamm CW, Goldmann B, Deu A, Langenbrink L, White HD; Lancet 1999; 354:1757-62) y a continuación se incluyeron las troponinas en las nuevas pautas como parte de la estratificación del riesgo en pacientes con síndromes coronarios agudos (Hamm CW, Bertrand M, Braundwald E; Lancet 2001; 358:1533-8; Braunwald E, Maseri A, Armstrong PW y col.; Eur Heart J 1998; 19:D22-30). En el presente estudio se muestra que un efecto pronunciadamente positivo de este tipo de una terapia antiplaquetaria también es notorio en pacientes con elevadas concentraciones de sCD40L. El presente análisis sugiere que los pacientes con síndrome coronario agudo, que presentan elevadas concentraciones de sCD40L, se estabilizan eficazmente mediante el antagonista del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa abciximab (figura 5a, b). En una concentración umbral calculada de 5,0 \mug/l se observó un cambio brusco del cociente de riesgos de 0,87 para el segundo quintil y 1,12 para el tercer quintil hasta valores significativamente más bajos de 0,36 para el cuarto quintil y 0,38 para el quinto quintil (figura 4). De manera interesante, las concentraciones de TnT y sCD40L proporcionaron valores predictivos independientes en cuanto a tanto el riesgo de acontecimientos isquémicos como al efecto positivo de una inhibición del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa por abciximab. Los pacientes sin indicios de lesión del miocardio (falta la elevación de troponina), pero que presentaron concentraciones elevadas de sCD40L, sacaron provecho considerable del tratamiento con el inhibidor de la glucoproteína IIb/IIIa abciximab. Por lo tanto, los pacientes con alto riesgo de trombosis de las arterias coronarias, probada o mediante una elevación de la concentración de sCD40L o de una elevación de la concentración de TnT, que finalmente sumaron el 54% de todos los pacientes que participaron en el estudio CAPTURE, sacaron una ventaja considerable del tratamiento con abciximab con un cociente de riesgos de 0,38 [0,21 - 0,72]; p < 0,001).

En resumen puede decirse que el presente estudio documenta la función representativa e independiente de sCD40L como un marcador de la activación plaquetaria para la estratificación diagnóstica y terapéutica del riesgo. El elevado riesgo cardíaco de pacientes con altas concentraciones de sCD40L que recibieron una terapia habitual con heparina y aspirina se suprimió mediante el antagonista del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa abciximab. El uso combinado de troponinas y sCD40L, que representan los dos constituyentes esenciales de la patofisiología en pacientes con síndromes coronarios agudos, proporciona ideas importantes de la actividad de la enfermedad, el riesgo cardiológico y la eficacia de un tratamiento mediante inhibición de la glucoproteína IIb/IIIa mediante abciximab, que es superior al uso de un único marcador. El uso de sCD40L como único marcador o en combinación con otros marcadores sin un uso de PlGF no es objeto de la presente invención.

Los resultados del presente estudio establecen el nivel de PlGF en suero como un nuevo determinante pronóstico independiente eficaz del desenlace clínico en pacientes con síndromes coronarios agudos. Debe mencionarse especialmente que en pacientes con bajos niveles de hsCRP en suero, elevados niveles de PlGF en suero identifican un subgrupo de pacientes que padecen un riesgo cardíaco significativamente elevado (cociente de riesgos instantáneos adaptado 3,58 [IC del 95% 1,48 - 7,72]; p = 0,001).

El valor predictivo del nivel de PlGF en suero es independiente de la evidencia de necrosis del miocardio como se determina por el nivel de troponina en suero. Por último lugar, elevados niveles de PlGF en suero no sólo identifican a aquellos pacientes con dolores torácicos agudos que desarrollan síndromes coronarios agudos, sino también a aquellos pacientes que padecen un elevado riesgo de inestabilidad recurrente después del alta médica de un síndrome coronario agudo inicial. Por tanto, la medición del nivel de PlGF en suero no sólo puede ser una herramienta clínica fiable y eficaz para la identificación de pacientes con formación de lesiones de alto riesgo, sino también de inflamación vascular persistente de la circulación coronaria.

La función de PlGF como marcador de inflamación primario de inestabilidad de lesiones arterioscleróticas puede aclararse bien por sus buenos efectos proinflamatorios documentados en modelos animales de arteriosclerosis o artritis [Luttun A, Tjwa M, Moons L y col. Revascularization of ischemic tissues by PlGF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by anti-FIt1. Nat Med 2002;8(8):831-40]. Aunque PlGF pertenece a la familia de VEGF, parece que su función etiopatogenética está más bien relacionada con la inflamación que con la angiogénesis [Luttun A, Tjwa M, Moons L y col. Revascularization of ischemic tissues by PlGF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by anti-Flt1. Nat Med 2002;8(8):831-40]. De hecho, mientras que la elevación VEGF por hipoxia y la elevación del nivel de VEGF en suero se contemplan como una adaptación temprana del miocardio al flujo sanguíneo decreciente [Lee SH, Wolf PL, Escudero R, Deutsch R, Jamieson SW, Thistlethwaite PA. Early expression of angiogenesis factors in acute myocardial ischemia and infarction. N Engl J Med 2000;342(9):626-33], PlGF no se influye o regula por disminución por hipoxia [Khaliq A, Dunk C, Jiang J y col. Hypoxia down-regulates placenta growth factor, whereas fetal growth restriction up-regulates placenta growth factor expression: molecular evidence for "placental hyperoxia" in intrauterme growth restriction. Lab Invest 1999;79(2): 151-70, Cao Y, Linden P, Shima D, Browne F, Folkman J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. J Clin Invest 1996;98(11):2507-11]. De acuerdo con estos datos, los resultados de este estudio no dieron ninguna correlación entre el nivel de PlGF en suero y el nivel de troponina T en suero como un marcador de necrosis del miocardio, mientras que el nivel de VEGF en suero se correlacionó positivamente con el nivel de troponina T en suero. De acuerdo con esto, el PlGF no se correlacionó con el nivel de VEGF en suero.

Por tanto, parece que el nivel de PlGF en suero no está influido por la necrosis del miocardio. A diferencia, los niveles de VEGF en suero están acoplados con una elevación de troponina T, influencia del flujo de TIMI e indicios clínicos de isquemia del miocardio [Heeschen C, Dimmeler S, Hamm CW, Boersma E, Zeiher AM, Simoons ML. Prognostic significance of angiogenic growth factor serum levels in patients with acute coronary syndromes. Circulation 2003;107:524-530]. El nivel de PlGF en suero como lesiones de miocardio insensibles en comparación con lesiones de miocardio más pequeñas podría ser específicamente importante en pacientes con síndromes coronarios agudos, de los que aproximadamente un tercio son positivos para troponina en la hospitalización [Hamm CW, Braunwald E. A classification of unstable angina revisited. Circulation 2000;102(1): 118-22].

Similarmente, una lesión de miocardio también podría comprometer el valor del nivel de hsCRP en suero para así poder predecir el desenlace en pacientes con síndromes coronarios agudos. Como un marcador de la fase aguda corriente adelante inespecífico clásico, los niveles de hsCRP en suero son elevados en pacientes con lesión de miocardio, como se mide mediante la elevación de troponina T. Está bien establecido que elevados niveles de hsCRP en suero se encuentran antes de la aparición de un marcador de necrosis del miocardio en casi todos los pacientes en los que antes de un infarto aparece una angina de pecho inestable [Liuzzo G, Baisucci LM, Gallimore JR y col. Enhanced inflammatory response in patients with preinfarction unstable angina. J Am Coll Cardiol 1999;34(6): 1696-703]. Por tanto, la especificidad del elevado nivel de hsCRP en suero, que confirma una inflamación vascular reforzada, está muy limitada en presencia de lesión de miocardio.

Por tanto, niveles elevados de hsCRP en suero en pacientes positivos para troponina solamente pueden representar un elevado riesgo secundario a la lesión de miocardio como un marcador sustituto para tromboembolia que más bien procede de un proceso trombótico activo dentro de la lesión responsable que de una inflamación vascular persistente.

Realmente, cuando la troponina T y el VEGF se incluyen respectivamente como marcadores de necrosis e isquemia del miocardio en un análisis multifactorial, los elevados niveles de hsCRP en suero ya no son predictivos de un elevado riesgo en pacientes con síndromes coronarios agudos.

Todavía más importante, la prevalencia informada de elevado nivel de hsCRP en suero varía considerablemente en síndromes coronarios agudos (más del 30% de los pacientes con angina de pecho inestable grave y más del 50% de los pacientes con un infarto de miocardio agudo no muestran nivel elevado de hsCRP en suero). Los niveles elevados de hsCRP en suero faltan en más del 30% de los pacientes con angina de pecho inestable grave y en más del 50% de aquellos con un infarto de miocardio agudo que no siguió después de una angina de pecho inestable [Liuzzo G, Baisucci LM, Gallimore JR y col. Enhanced inflammatory response in patients with preinfarction unstable angina. J Am Coll Cardiol 1999;34(6): 1696-703], lo que hace suponer una importante heterogeneicidad de la función de los desencadenantes inflamatorios del síndrome clínico de inestabilidad coronaria [Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation and atherosclerosis. Circulation 2002;105(9): 1135-43]. Sin embargo, también está bien establecido que los individuos pueden variar en su respuesta sistémica a un determinado estímulo inflamatorio [Liuzzo G, Buffon A, Biasucci LM y col. Enhanced inflammatory response to coronary angioplasty in patients with severe unstable angina. Circulation 1998;98(22):2370-6., Liuzzo G, Angiolillo DJ, Buffon A y col. Enhanced response of blood monocytes to in vitro lipopolysaccharide-challenge in patients with recurrent unstable angina. Circulation 2001;103(18):2236-41.
Biasucci LM, Vitelli A, Liuzzo G y col. Elevated levels of interleukin-6 in unstable angina. Circulation 1996;94(5):874-7]. El aumento en hsCRP o IL-6, que se observó en respuesta al traumatismo vascular inducido por la dilatación con globo o incluso mediante cateterismo cardíaco sin complicaciones, correlaciona linealmente con niveles de hsCRP o interleucina 6 en suero iniciales [Liuzzo G, Buffon A, Biasucci LM y col. Enhanced inflammatory response to coronary angioplasty in patients with severe unstable angina. Circulation 1998;98(22):2370-6]. Adicionalmente, la producción de IL-6 por monocitos que se aíslan de pacientes con angina de pecho inestable es significativamente elevada en pacientes con nivel elevado de hsCRP en suero en comparación con pacientes con nivel normal de hsCRP en suero [Liuzzo G, Angiolillo DJ, Buffon A y col. Enhanced response of blood monocytes to in vitro lipopolysaccharide-challenge in patients with recurrent unstable angina. Circulation 2001;103(18):2236-41]. Estas diferencias individuales en la amplitud de la respuesta a un determinado estímulo inflamatorio pueden tener un origen genético [Westendorp RG, Langermans JA, Huizinga TW, Verweij CL, Sturk A. Genetic influence on cytokine production in meningococcal disease. Lancet 1997;349(9069):1912-3]. Desgraciadamente, tales respuestas heterogéneas limitan la utilidad de los reactivos de la fase aguda corriente adelante, como por ejemplo hsCRP, como marcadores inflamatorios para la estimación del riesgo. A diferencia de esto, parece que PlGF es un estímulo proximal directo para procesos inflamatorios dentro de la pared vascular [Luttun A, Tjwa M, Moons L y col. Revascularization of ischemic tissues by PlGF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by anti-FIt1. Nat Med 2002;8(8):831-40]. Realmente, niveles elevados de PlGF en suero eran extremadamente informativos específicamente en pacientes con síndromes coronarios agudos, pero no niveles no elevados de hsCRP en suero. En esta cohorte de paciente, niveles elevados de PlGF en suero identificaron un subgrupo de pacientes con riesgo cardíaco claramente elevado que era similar a los pacientes de elevado riesgo definidos por los altos niveles de troponina en suero. Por tanto, niveles elevados de PlGF en suero pueden representar de hecho un indicador inflamatorio primario de inestabilidad coronaria.

Además, debido a que los efectos proinflamatorios de PlGF pueden inhibirse específicamente mediante el bloqueo de su receptor Flt-1, estos resultados también pueden poner a disposición una solución para una nueva diana terapéutica antiinflamatoria en pacientes con enfermedad de las arterias coronarias [Luttun A, Tjwa M, Canneliet P. Placental Growth Factor (PlGF) and Its Receptor Flt-1 (VEGFR-1): Novel Therapeutic Targets for Angiogenic Disorders. Ann N Y Acad Sci 2002;979:80-93]. Los efectos proinflamatorios de PlGF pueden inhibirse específicamente mediante el bloqueo de su receptor Flt-1 y ponen a disposición una nueva opción terapéutica antiinflamatoria en pacientes con enfermedad de las arterias coronarias.

Los resultados del presente estudio muestran que niveles elevados en sangre de la metaloproteinasa PAPP-A están relacionados con desenlace negativo en pacientes con SCA. De acuerdo con un primer examen realizado hace poco, el valor predictivo de niveles de PAPP-A en plasma era el más claro en pacientes sin una elevación de troponina. Por tanto, un nivel elevado de PAPP-A en plasma no sólo es un marcador de la inestabilidad de placas que promueve el desarrollo de SCA, sino todavía más importante, indica un mal pronóstico antes de la aparición de un acontecimiento isquémico agudo que es provocado por la inestabilidad de placas. Adicionalmente, niveles elevados de PAPP-A pusieron a disposición más información pronóstica incluso en pacientes con niveles elevados de hsCRP en plasma, lo que hace suponer que al menos en algunos pacientes los niveles elevados de hsCRP no están relacionados con inflamación vascular. El resultado de que el valor predictivo de PAPP-A se limitaba a pacientes con bajos niveles de citocina antiinflamatoria interleucina 10 apoya adicionalmente el concepto de que el equilibro entre citocinas pro y antiinflamatorias es para el desenlace para los pacientes con SCA. Mediante análisis de regresión multifactorial se identificaron varios marcadores bioquímicos, incluidos troponina T, ligando CD40 soluble, interleucina 10 y PAPP-A, como marcadores predictivos independientes para el desenlace para los pacientes durante los seis meses posteriores de seguimiento.

Las troponinas cardíacas son marcadores sensibles y específicos de necrosis del miocardio, secundarias a las complicaciones trombóticas durante un síndrome coronario agudo, y son sumamente predictivas del transcurso clínico temprano después del estallido de SCA. Sin embargo, la estratificación del riesgo representa un reto en pacientes negativos para troponina con síndrome coronario agudo.

Sin embargo, aproximadamente dos tercios de los pacientes con SCA sin elevaciones del segmento ST presentan valores de troponina normales y más de la mitad de los pacientes presentan resultados electrocardiográficos no concluyentes. Durante las primeras semanas después del estallido de un síndrome coronario agudo, el riesgo de muerte o infarto de miocardio no fatal en pacientes negativos para troponina es aproximadamente del 5 al 8%. Por tanto, queda la aparición a corto plazo de acontecimientos cardiovasculares esenciales relativamente sustanciales en pacientes sin indicaciones de necrosis del miocardio que provoca la necesidad de otro proceso diagnóstico. Un continua supervisión del segmento ST, pruebas de esfuerzo y procedimientos de obtención de imágenes de perfusión pueden ser de disponibilidad limitada para la estratificación inmediata del riesgo de pacientes de los que se sospecha que presentan un síndrome coronario agudo. El presente estudio muestra que los niveles de PAPP-A indican un subgrupo de pacientes sin elevación de troponina que durante el transcurso temporal temprano después del estallido de los síntomas presentan un riesgo esencialmente alto de acontecimientos cardíacos (72 horas, RP 3,17; 30 días: RP 3,33). A diferencia de esto, los pacientes sin las modificaciones del segmento ST, que eran negativos tanto para TnT como PAPP-A, estaban sujetos a un riesgo muy bajo (tasa de incidencia del 0,9%). Por tanto, la determinación de PAPP-A en pacientes con SCA es una herramienta eficaz para la estratificación del riesgo a corto plazo de pacientes sin niveles elevados de troponina.

La progresión y la posterior desestabilización de las placas arterioscleróticas incluyen modificaciones importantes en la estructura de la pared de las arterias. La aparición de un estado de inflamación local en pacientes con SCA está muy establecida como se detecta por marcadores inflamatorios, como por ejemplo CRP. Las metaloproteinasas también son indicadores potenciales de inflamación arterial y pueden contribuir mediante la degradación de matrices extracelulares a la fragilidad de las placas arterioscleróticas ricas en lípidos y, eventualmente, a su rotura. Como se describió anteriormente para varias otras metaloproteinasas (MMP-1, MMP-3, MMP-12 o MMP-13), de PAPP-A sólo se ha encontrado recientemente que se expresó en placas erosionadas y sueltas, mientras que no puedo detectarse la expresión de PAPP-A en placas estables. Otros estudios también han mostrado que los pacientes con placas carotídeas hiperecoicas o isoecoicas muestran niveles de PAPP-A significativamente más altos que aquellos con lesiones carotídeas tempranas hipoecoicas. La función exacta de PAPP-A en la patofisiología de SCA está dudosa. De PAPP-A se mostró que es un activador específico del factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I), un potente mediador de arteriosclerosis. Como metaloproteinasa de matriz PAPP-A podría participar en el procesado de la matriz extracelular de placas y consecuentemente influir la cubierta fibrosa. Esto lleva a una morfología de placas que es sensible a la erosión, rotura y posterior trombosis. El presente estudio muestra que una única medición de PAPP-A que se obtiene 8,7 horas después de la aparición de los síntomas pone a disposición un valor significativamente predictivo de la aparición de muerte e infarto de miocardio no fatal durante el posterior seguimiento de 6 meses. Estos datos hacen suponer que PAPP-A desempeña una función patofisiológica representativa en la desestabilización de placas arterioscleróticas durante SCA. La producción de PAPP-A por células activadas durante las lesiones arterioscleróticas y su liberación en la matriz extracelular parecen ser inherentes al proceso inflamatorio local que aparece dentro de la pared de las arterias como se indica mediante la significativa correlación positiva que se observó entre los niveles de CRP y PAPP-A. De hecho, los niveles de PAPP-A eran sumamente predictivos en pacientes con niveles elevados de CRP, mientras que en pacientes con bajos niveles de CRP PAPP-A no sirvió como una variable independiente significativa del desenlace del paciente (figura 26a). Aunque los niveles de CRP están relacionados con la elevación de troponina, parece que los niveles de PAPP-A son menos sensibles a lesión de miocardio más pequeña, lo que puede ser especialmente importante en pacientes con SCA, de los que aproximadamente un tercio son positivos para troponina en el momento de llegar al hospital. Adicionalmente, los niveles de PAPP-A ni interfirieron con la significancia predictiva de sCD40L, un marcador de la activación plaquetaria en pacientes con SCA, ni éstos lo influyeron. Mediante análisis multifactorial, PAPP-A, sCD40L y TnT resultaron todos variables independientes del desenlace adverso (tabla 2). Una combinación de PAPP-A y sCD40L era especialmente clara en pacientes que eran negativos para TnT, lo que hace suponer que ambos marcadores reflejan rutas de señalización distintas que eventualmente a un medio proinflamatorio y procoagulante en la circulación coronaria. De manera auxiliar para una función complementaria en vez de una competitiva para predecir un desenlace adverso en pacientes con SCA, los resultados de los inventores son que la inhibición agresiva de la agregación plaquetaria mediante abciximab era especialmente útil en pacientes con niveles elevados de
sCD40L.

En el resumen, los resultados de la presente invención muestran que niveles elevados en plasma de PAPP-A como marcador de la inflamación vascular están relacionados con un riesgo elevado de acontecimientos cardíacos posteriores. El valor predictivo de los niveles de PAPP-A en plasma era independiente de niveles elevados de troponina que representan el riesgo actual secundario a complicaciones trombóticas que llevan a lesión de miocardio durante un síndrome coronario agudo. Por tanto, un nivel elevado de PAPP-A en plasma no sólo es un marcador de la inestabilidad de placas en lo que se refiere a la progresión a un infarto de miocardio, sino que también indica un mal pronóstico incluso después de la aparición de un episodio isquémico agudo que es provocado por inestabilidad de
placas.

En resumen puede decirse que el presente estudio documenta la función representativa e independiente de PlGF como un marcador para la estratificación diagnóstica y terapéutica del riesgo. El elevado riesgo cardíaco de pacientes con altas concentraciones de PlGF que recibieron una terapia habitual con heparina y aspirina se suprimió mediante el antagonista del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa abciximab. El uso combinado de troponinas y PlGF, que representan los dos constituyentes esenciales de la patofisiología en pacientes con síndromes coronarios agudos, proporciona ideas importantes de la actividad de la enfermedad, el riesgo cardiológico y la eficacia de un tratamiento mediante inhibición de la glucoproteína IIb/IIIa mediante abciximab, que es superior al uso de un único marcador.

En resumen, el nivel de PlGF en suero representa un biomarcador eficaz y fiable de la inflamación vascular y el desenlace negativo en pacientes con síndromes coronarios agudos. Una medición de los niveles de PlGF en suero amplia significativamente la información predictiva y pronóstica obtenida de marcadores inflamatorios habituales en síndromes coronarios agudos. El uso de PAPP-A como único marcador o en combinación con otros marcadores sin un uso de PlGF no es objeto de la presente invención.

A continuación, la invención se explicará ahora más detalladamente mediante ejemplos en relación a las figuras adjuntas, pero sin limitarla a éstas. En las figuras se muestra:

La figura 1 la relación entre la concentración en suero de sCD40L y la frecuencia de un acontecimiento cardíaco después de 24 horas, 72 horas, 30 días y 6 meses en el grupo de pacientes que había recibido un placebo (n = 544). Los pacientes se clasificaron en 5 quintiles. El intervalo de concentraciones de sCD40L era del siguiente modo:
0,003 - 1,9 \mug/l (quintil 1), 1,9 - 3,5 \mug/l (quintil 2), 3,5 - 5,0 \mug/l (quintil 3), 5,0 - 6,3 \mug/l (quintil 4) y > 6,3 \mug/l (quintil 5). p < 0,001 después de 72 horas, 30 días y 6 meses.

La figura 2 una representación según Kaplan-Meier de la incidencia acumulada de infarto de miocardio con desenlace mortal o no mortal después de 72 horas (a) y 6 meses (b) según los valores iniciales de la concentración de sCD40L (valor umbral diagnóstico 5,0 \mug/l) en el grupo de placebo (n = 544).

La figura 3 los cocientes de riesgos adaptados (incluido el intervalo de confianza del 95%) en el tratamiento con abciximab según los quintiles de sCD40L. Un tratamiento satisfactorio se define como la reducción de infartos de miocardio mortales o no mortales en el transcurso de 6 meses. Un cociente de riesgos < 1,0 indica el tratamiento satisfactorio con abciximab en comparación con el tratamiento con placebo.

La figura 4 una representación de Kaplan-Meier de la mortalidad e infarto de miocardio no mortal 72 horas (a) y 6 meses (b) según la concentración de sCD40L en pacientes que habían recibido o un placebo o abciximab.

La figura 5 la activación plaquetaria en función de la actividad de la enfermedad. La actividad plaquetaria determinada mediante agregados monocito-plaqueta era significativamente elevada en pacientes con enfermedad cardíaca coronaria estable. En pacientes con síndromes coronarios agudos se observó un aumento significativo adicional de la activación plaquetaria.

La figura 6, que las concentraciones de sCD40L en suero se correlacionan estrechamente con la amplitud de la activación plaquetaria en pacientes con y sin síndromes coronarios agudos. Las líneas representadas discontinuas clasifican los pacientes en terciles según la activación plaquetaria (< 15%, 15% - 30%, > 30%) o concentraciones de sCD40L en suero (< 2,5 g/l; 2,5 - 4,5 \mug/l; > 4,5 \mug/l).

La figura 7 la relación entre PlGF y hsCRP como un reactivo de la fase aguda corriente adelante (n = 1088).

La figura 8 respectivamente los niveles de PlGF y hsCRP en suero según el estado de troponina T inicial (n = 1088).

La figura 9 la relación entre la concentración en suero de PlGF y la frecuencia de un acontecimiento cardíaco después de 24 horas, 72 horas, 30 días y 6 meses en el grupo de pacientes que había recibido un placebo (n = 547). El intervalo de concentraciones de PlGF era del siguiente modo: menor de igual a 13,3 ng/l (1º quintil), 13,4 a 19,2 ng/l (2º quintil), 19,3 a 27,3 ng/l (3º quintil), 27,4 a 40,0 ng/l (4º quintil) y mayor de 40,0 ng/l (5º quintil). Las diferencias en las tasas de un suceso entre los cuartiles eran significativas a 30 días (p 0,001) y 6 meses (p < 0,001) después del examen.

La figura 10 análisis de las curvas de eficacia diagnóstica para el valor predictivo de los niveles de PlGF en suero para la aparición de mortalidad o infarto de miocardio no mortal en el examen de seguimiento de 6 meses.

La figura 11 una representación según Kaplan-Meier de la incidencia acumulada de infarto de miocardio con desenlace mortal o no mortal después de 72 horas (a) y 6 meses (b) según los valores iniciales del nivel de PlGF en suero (valor umbral diagnóstico 27,0 ng/l; n = 547).

La figura 12 el valor predictivo de PlGF para la incidencia de infarto de miocardio con desenlace mortal o no mortal según niveles de hsCRP en suero (a) y niveles de troponina T en suero (b). Los valores umbral diagnósticos eran 27,0 ng/l para PlGF, 0,1 ug/l para troponina T y 10 mg/l para hsCRP; n = 547).

La figura 13 el valor predictivo de niveles de PlGF en suero en el alta para el resultado del paciente en el examen de seguimiento de 6 meses. Los pacientes con niveles elevados de PlGF en suero estaban sujetos a un mayor riesgo cardíaco, con una tasa de incidencia del 7,4%, en comparación con el 2,2% para pacientes con niveles de PlGF en suero inferiores a 27,0 ng/l (p = 0,005).

La figura 14: niveles respectivos de PAPP-A y hsCRP según el estado de troponina T inicial. Los círculos indican valores atípicos.

La figura 15: niveles respectivos de ligando CD40 soluble y hsCRP según el estado de PAPP-A inicial. Los círculos indican valores atípicos.

La figura 16: relación entre los niveles de PAPP-A en plasma y la tasa de acontecimientos cardíacos a 24 h, 72 h, 30 días y 6 meses según el grupo de placebo con PAPP-A (n = 547). El intervalo de PAPP-A era del siguiente modo: (PAPP-A_1) < 4,5 mUI/l (n=111); (PAPP-A_2) 4,5 - 7,5 mUI/l (n = 108); (PAPP-A_3) 7,6 - 12,6 mUI/l (n = 109); (PAPP-A 4) 12,7 - 24,0 mUI/l (n = 110) y (PAPP-A_5) > 24,0 mUI/l. Las diferencias en las tasas de incidencia eran significativas a 72 horas (p = 0,019), 30 días (p = 0,008) y 6 meses (p = 0,004).

La figura 17: análisis de las curvas de eficacia diagnóstica para el valor predictivo de los niveles de PAPP-A en plasma para la aparición de muerte e infarto de miocardio no fatal en el seguimiento de 6 meses.

La figura 18: curvas de la tasa de acontecimientos de Kaplan-Meier que muestran la aparición acumulada de muerte e infarto de miocardio no fatal a 72 horas (a) y 6 meses (b) según los niveles de PAPP-A en plasma iniciales. Valor umbral diagnóstico 12,6 mUI/l; n = 547.

La figura 19: el valor predictivo de PAPP-A para la aparición de muerte e infarto de miocardio no fatal se limitó a pacientes con niveles elevados de hsCRP (a) y pacientes con bajos niveles de la citocina antiinflamatoria IL-10 (b). Valores umbral diagnósticos 12,6 mUI/l para PAPP-A, 10 mg/l para hsCRP y 3,5 ng/l para IL-10; n = 547.

La figura 20: el valor predictivo de PAPP-A para la aparición de muerte e infarto de miocardio no fatal era especialmente informativo en pacientes sin elevación de troponina T (a). En pacientes que eran tanto negativos para TnT como para sCD40L, PAPP-A identificó un subgrupo que padeció un elevado riesgo cardiovascular en el seguimiento de 6
meses (b). Valores umbral diagnósticos 12,6 mUI/l para PAPP-A, 0,1 \mug/l para TnT y 5,0 \mug/l para sCD40L; n = 547.

Ejemplos I. sCD40L

El uso de sCD40L como único marcador o en combinación con otros marcadores sin un uso de PlGF no es objeto de la presente invención.

1. Pacientes

El estudio CAPTURE registró 1.265 pacientes con angina de pecho inestable resistente al tratamiento (61% de hombres, edad 61 [48 - 72, intervalo de confianza del 95%]) entre mayo de 1993 y diciembre de 1995. Todos los pacientes de CAPTURE se lamentaban de dolores torácicos recurrentes en reposo asociados con cambios del ECG durante un tratamiento con heparina intravenosa y trinitrato de glicerina durante 14 horas de media. La población total de pacientes se sometió a una angiografía coronaria antes de que se documentara la aparición de una clara enfermedad de las arterias coronarias con lesiones desencadenantes \geq 17% que eran adecuadas para una angioplastia. A los pacientes se les asignó aleatoriamente un tratamiento mediante abciximab o placebo. El tratamiento empezó en el plazo de 2 horas después de la asignación. En todos los pacientes se previeron intervenciones coronarias en el plazo de 18 a 24 horas después del inicio del tratamiento (CAPTURE. Lancet 1997; 349:1429-35). 8,7 (3,6 - 11,3) horas de media después del inicio de los síntomas se obtuvieron muestras de sangre (n = 1096) (nivel inicial).

Los criterios de valoración primarios del estudio fueron mortalidad, infarto de miocardio o la necesidad de intervención inmediata (angioplastia, operaciones de derivación de la arteria coronaria) debido a una inestabilidad durante 30 días o 6 meses. En pacientes que sufrieron un infarto de miocardio durante la hospitalización, uno tal se les diagnosticó cuando sus valores de la actividad enzimática de creatina-cinasa en al menos dos muestras eran más del triple del límite superior del intervalo normal o cuando su ECG presentó nuevas ondas Q claras en más de dos intervalos sucesivos. Esta estricta definición se eligió para excluir cualquier pequeña subida insignificante de la creatina-cinasa después de ACTP. En pacientes con un infarto de miocardio después del alta médica, uno tal se definió cuando sus valores de la actividad enzimática de creatina-cinasa eran más del doble del límite superior del intervalo normal o cuando su ECG presentó nuevas ondas Q claras en dos o más intervalos sucesivos. El criterio de valoración secundario fue la reestenosis coronaria sintomática de la lesión tratada con un diámetro de estenosis \geq 70% y la necesidad de repetir la revascularización durante los 6 meses siguientes.

2. Validación de pacientes con dolor torácico agudo

Un grupo separado de 626 pacientes con dolor torácico (161 mujeres y 465 hombres, edad media 61 [38 - 82] años) que llegaron a urgencias en una sucesión continua con dolor torácico agudo que duró menos de 12 horas (5,1 [2,1 - 10,4] horas de media). No se consideraron pacientes con una elevación de ST característica basada en el ECG o un infarto de miocardio agudo documentado durante las 2 semanas precedentes. Las muestras de sangre se obtuvieron en el momento del ingreso (antes de empezar el tratamiento) y 4 horas más tarde; se conservaron en hielo, en el plazo de 20 minutos después de la toma de la muestra se centrifugaron y se almacenaron a -80ºC para el posterior análisis. Se había mostrado que este tratamiento llevó a resultados reproducibles en la medición de concentraciones de sCD40L (Nannizzi-Alaimo L, Rubenstein MH, Alves VL, Leong GY, Phillips DR, Gold HK. Circulation 2002; 105: 2849-54). Los pacientes se observaron hasta que se les dio el alta médica del hospital y 30 días después para registrar infartos de miocardio mortales y no mortales. La presencia de una enfermedad de las arterias coronarias se detectó mediante uno de los siguientes criterios: indicios del ECG de una isquemia del miocardio (nuevos cambios en el segmento ST o inversión de las ondas T), una enfermedad cardíaca coronaria en la anamnesis (infarto de miocardio o revascularización coronaria, una prueba de esfuerzo positivo o estrechamiento del diámetro de una arteria coronaria principal en al menos el 50% en un angiograma anterior). Los pacientes sin enfermedad cardíaca coronaria habían mostrado un angiograma coronario normal. La activación plaquetaria se determinó mediante citometría de flujo en un subgrupo de pacientes que incluyó 131 pacientes con síndromes coronarios agudos, 20 pacientes con enfermedad cardíaca coronaria estable y 10 pacientes con enfermedad cardíaca coronaria excluida.

3. Análisis bioquímico

Las muestras de plasma anticoaguladas con heparina sódica se almacenaron centralmente a -80ºC. La determinación de los marcadores cardíacos se realizó con desconocimiento de la historia clínica de los pacientes y del tratamiento mandado en el laboratorio de investigación de la Universidad de Francfort. Los niveles en plasma de sCD40L (límite de detección 0,005 \mug/l), P-selectina soluble (0,5 \mug/l), factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha, sumamente sensible; 0,12 ng/l) y molécula de adhesión intracelular 1 soluble (Intracellular Adhesion Molecule-1, ICAM-1; 0,35 \mug/l) se midieron mediante ELISA (R&D Systems, Wiesbaden). Para la cuantificación de troponina T (TnT) se usó un inmunoensayo enzimático de una sola etapa basado en la tecnología de electroquimioluminiscencia (Elecsys 2010, Roche Diagnostics; límite de detección 0,01 \mug/l). La proteína C reactiva (CRP) se midió con ayuda del nefelómetro Behring BN II (Behring Diagnostics; límite de detección 0,2 \mug/l).

5. Determinación cuantitativa de sCD40L

La concentración de sCD40L se determinó usando la técnica de inmunoensayo enzimático tipo sándwich (R&D Systems, Wiesbaden). Una placa de microtitulación se recubrió con un anticuerpo policlonal que estaba dirigido específicamente contra sCD40L. Los patrones y las muestras se pipetearon en los pocillos y el sCD40L presente se unió mediante el anticuerpo inmovilizado. Después de eliminarse mediante lavado el material no unido, un anticuerpo policlonal acoplado a enzima que estaba dirigido específicamente contra sCD40L se añadió a los pocillos. Después de una etapa de lavado para eliminar mediante lavado el anticuerpo-enzima-reactivo no unido, una disolución de sustrato se añadió a los pocillos y el color se reveló en relación con la cantidad de sCD40L que se unió en la primera etapa. Se detuvo el revelado de color y se midió la intensidad del color.

6. Prueba rápida para la detección de CD40L

Se desarrolló una prueba rápida basada en la tecnología de cromatografía-fase sólida con una mezcla de anticuerpos indicadores policlonales marcados con oro de ratón y anticuerpos de captura policlonales biotinilados. El sistema de prueba contuvo al menos 0,3 \mug de cada anticuerpo. Se añadieron 200 \mul de sangre completa heparinizada o plasma centrifugado al dispositivo de prueba. Después de la separación de los componentes sanguíneos celulares de la fracción plasmática mediante una tela no tejida de fibra vidrio, el plasma que migró a través de la tela no tejida se recogió en un tampón y se añadió al anticuerpo adsorbido. Los anticuerpos y las moléculas de sCD40L de las muestras formaron complejos tipo sándwich que migraron hacia la zona de señalización y se acumularon en la ventana de lectura mediante interacción con biotina-estreptavidina. Los resultados positivos (sCD40L \geq 4,7 \mug/ml) se indicaron mediante una línea de color que se reveló en el plazo de 15 minutos. Los anticuerpos indicadores que no se unieron siguieron migrando y se unieron a una línea de control compuesta por fase sólida-anticuerpos anti-IgG de ratón (\geq 0,2 \mug). La aparición de esta línea de control hacia abajo de la línea de señalización confirmó la función de prueba sin fallos, incluido el flujo libre del plasma.

7. Activación plaquetaria in vivo

Las muestras de plasma anticoaguladas con citrato sódico se trataron inmediatamente 10 minutos con paraformaldehído al 1,1% en PBS 4,6 veces diluido en agua destilada para la lisis de los eritrocitos y las células fijadas se lavaron en PBS. Para determinar la P-selectina en plaquetas, el sedimento resuspendido se incubó 60 minutos con anticuerpo monoclonal específico para glucoproteína IIb conjugado con ficoeritrina (PE) (CD41; Dako Carpenteria, California) y anticuerpo monoclonal específico para P-selectina conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BD Pharmingen, San Diego, California). Las plaquetas se caracterizaron mediante su dispersión de la luz hacia delante y lateralmente característica y la unión del anticuerpo específico para glucoproteína IIb conjugado con PE. La activación plaquetaria se expresa en % de las plaquetas positivas para P-selectina. Para identificar agregados monocito-plaqueta circulantes, las células se tiñeron con anticuerpo monoclonal específico para glucoproteína IIIa conjugado con FITC (CD61; Dako) y anticuerpo monoclonal conjugado con PE contra CD14 (BD Pharmingen). Los monocitos se identificaron mediante su dispersión de la luz hacia delante y lateralmente característica y la unión del anticuerpo específico para CD14 conjugado con PE. Los agregados monocito-plaqueta se definieron como monocitos en los que pudo detectarse glucoproteína IIIa y se indican en porcentaje del número total de monocitos (Michelson AD, Barnard MR, Krueger LA, Valeri CR, Furman IM, Circulation 2001; 104:1533-7). Cada tinción se incubó en presencia de concentraciones saturadas de un anticuerpo de rata no conjugado monoclonal contra receptores Fc (anti-CD16/32, BD Pharmingen) para reducir la unión inespecífica y los anticuerpos de idéntico isotipo sirvieron como control (IgG_{1}-PE y IgG_{2a}-FITC; BD Pharmingen). En total se analizaron 50.000 señales con ayuda de FACS-Calibur (Becton/Dickinson, Heidelberg) y del software CellQuest (BD Pharmingen).

8. Métodos estadísticos

Después de una valoración ciega de los marcadores bioquímicos y de la activación plaquetaria, los resultados de las pruebas se compararon con el banco de datos. Para poder distinguir pacientes con distintos grados de un riesgo cardiológico se eligió un análisis de datos exploratorio. Los pacientes de CAPTURE se clasificaron según la concentración de sCD40L de los quintiles. Para cada uno de los cuatros momentos de tiempo (24 horas, 72 horas, 30 días y 6 meses) se realizó una análisis de regresión logística y los pacientes en el primer quintil (sCD40L < 2,0 \mug/l) sirvieron de referencia. El análisis de las curvas de eficacia diagnóstica (ROC) respecto al intervalo dinámico de la prueba de sCD40L se usó para identificar la concentración umbral de sCD40L, que proporcionó el mayor valor predictivo para la estratificación del riesgo de pacientes con síndromes coronarios agudos. La repercusión de una elevación de los marcadores bioquímicos en el destino del paciente se evaluó usando un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox que evaluó los valores iniciales de los factores pronósticos (por ejemplo, hallazgos del ECG, factores de riesgo cardíacos, edad y sexo) y el tratamiento elegido al azar (Harrell FE, Jr., Lee KL, Pollock BG. J Natl Cancer Inst 1988; 80:1198-202). Todos los resultados para las variables continuas se expresan como mediana con el intervalo de confianza del 95%. Los mismos grupos intermedios se analizaron mediante la prueba de la t (bilateral) o ANOVA en experimentos con más de dos subgrupos. Las pruebas de intervalos a posteriori y las comparaciones múltiples por pares se realizaron con la prueba de la t (bilateral) con el ajuste de Bonferroni. La comparación de las variables categóricas se realizó con la prueba de \chi^{2} de Pearson. Todos los análisis se realizaron con SPSS 11.0 (SPSS, Inc.). Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Ejemplo 1a Relación entre riesgo cardíaco y concentración de sCD40L

Las características del desenlace de la población seleccionada para este estudio (n = 1088, 86% de los pacientes de CAPTURE) no se diferenciaron de la población total del estudio en cuanto a edad, sexo, perfil de riesgo cardiovascular y tratamiento concomitante antes y después de la elección al azar. La reducción de acontecimientos cardíacos en el grupo de abciximab de la población era comparable con la población total de CAPTURE (antes de ACTP: 2,2% en placebo frente a 0,9% en abciximab, p = 0,094; después de ACTP: 7,9% frente a 3,5%, p = 0,002; después de 30 días: 9,0% frente al 4,2%, p = 0,002) (CAPTURE. Lancet 1997; 349:1429-35).

El sCD40L era detectable en las muestras de suero iniciales de los 1088 pacientes con un valor medio de 4,5 \mug/l (intervalo 0,003 - 20,4). La concentración de sCD40L no se correlacionó con las concentraciones medidas de TnT (r = 0,14) y CRP (r = 0,11). Los pacientes del grupo de placebo (n = 544) se clasificaron en quintiles según sus concentraciones de sCD40L medidas: (sCD40L 1) < 1,93 \mug/l (n = 100), (sCD40L 2) 1,93 - 3,50 \mug/l (n = 102), (sCD40L 3) 3,50 - 5,00 \mug/l (n = 121), (sCD40L 4) 5,00 - 6,30 \mug/l (n = 115) o (sCD40L 5) > 6,30 \mug/l (n = 106). Durante las primeras 24 horas, los criterios de valoración combinados mortalidad e infarto de miocardio no mortal sólo eran ligeramente elevados en el quinto quintil de sCD40L en comparación con el primer quintil (p = 0,13) (figura 1). En momentos de tiempo posteriores (72 horas, 30 días, 6 meses), estos acontecimientos aparecieron significativamente más frecuentes tanto en el cuarto como en el quinto quintil (p = 0,003, p = 0,0004 o
p = 0,001).

Basándose en los hallazgos anteriormente descritos, las muestras de pacientes se dividieron según la concentración umbral calculada. 221 pacientes (40,6%) presentaron concentraciones de sCD40L de 5,0 \mug/l o por encima y 323 pacientes presentaron valores < 5,0 \mug/l. Como muestra la tabla 1, no apareció ninguna diferencia significativa en las características del desenlace de ambos grupos. En pacientes con bajas concentraciones de sCD40L, los criterios de valoración combinados infarto de miocardio mortal y no mortal eran significativamente distintos de los de los pacientes con elevadas concentraciones de sCD40L tanto 24 horas antes del procedimiento (4,1% frente al 0,9%; p = 0,016) como 72 horas después (incluidas intervenciones coronarias en todos los pacientes) (13,1% frente al 4,3%; frente al 4,3%; p < 0,001) (figura 2a). Durante el periodo de seguimiento de 6 meses, las curvas que indican la frecuencia de un acontecimiento siguieron divergiendo en pacientes con altas o bajas concentraciones de sCD40L (figura 2b). Hubo diferencias significativas tanto después de 30 días (14,5% frente al 5,3%; p < 0,001) como después de 6 meses (18,6% frente al 7,1%; p < 0,001). Debido a la mortalidad relativamente baja del grupo CAPTURE, el criterio de valoración mortalidad después de 6 meses no se diferenció significativamente entre los dos grupos (2,3% frente al 1,5%; p = 0,72). El valor predictivo de sCD40L era independiente de una necrosis miocárdica. En los pacientes negativos para TnT, mediante la concentración de sCD40L se identificó un grupo de pacientes con elevado riesgo cardíaco (13,6%) que no se diferenció significativamente del riesgo cardíaco de pacientes positivos para TnT (14,0%; p = 1,00). El análisis de las curvas de eficacia diagnóstica confirmó una concentración umbral de 5,0 \mug/l para el valor predictivo maximizado de sCD40L. Las intervenciones cardiológicas no urgentes repetidas durante los 6 primeros meses no fueron significativamente diferentes en pacientes con altas concentraciones de sCD40 de las de en pacientes con bajas concentraciones de sCD40L (6,2% frente al 4,5%; p = 0,45).

De 626 pacientes sin elevación de ST que se presentaron en urgencias con dolor torácico agudo, 308 pacientes padecieron síndrome coronario agudo (117 pacientes habían sufrido un infarto de miocardio agudo basado en una elevación de troponina \geq 0,1 \mug/l). En los otros pacientes se presentaron los siguientes diagnósticos: n = 91 angina de pecho estable, n = 10 embolia pulmonar, n = 11 insuficiencia cardíaca congestiva, n = 7 miocarditis y n = 199 ninguna indicación de una enfermedad cardíaca. Las concentraciones de sCD40L eran significativamente mayores en pacientes con síndromes coronarios agudos (4,53 [3,19 - 5,87] \mug/l) en comparación con pacientes con angina de pecho estable (2,41 [1,99 - 3,52] \mug/l; p < 0,001) o pacientes sin síntomas de una enfermedad cardíaca (1,57 [0,88 - 1,76] \mug/l; p < 0,001). El valor promedio del límite de referencia superior (límite de referencia superior, LRS) de 97,5 en pacientes sin indicios de dolores cardíacos ascendió a 4,7 \mug/l y el valor promedio del LRS de 99 fue de 6,2 \mug/ml. Similarmente como en los resultados que se obtuvieron en el estudio CAPTURE, las concentraciones de sCD40L en suero no se correlacionaron con marcadores de necrosis (troponina T), marcadores de inflamación (CRP, TNF-\alpha) y moléculas de adhesión (ICAM-1). En pacientes con síndromes coronarios agudos, el 43,5% presentaron concentraciones de sCD40L en suero superiores al valor promedio del LRS de 97,5 y el 21,8% concentraciones de sCD40L en suero superiores al valor promedio del LRS de 99. Con uso de una concentración umbral fijada para sCD40L de 5,0 \mug/l, los pacientes con elevadas concentraciones de sCD40L en suero se identificaron como población de alto riesgo (cociente de riesgos fijado 3,00 [1,35 - 6,71]; p = 0,009). Dentro de la población total heterogénea de pacientes con dolor torácico, la concentración umbral fijada de 5,0 \mug/l también era fidedigna para identificar pacientes que presentaron un riesgo extremo de acontecimientos cardiológicos durante los 30 días siguientes (cociente de riesgos fijado 6,65 [3,18 a 13,89]; p < 0,001). El área bajo la curva ROC ascendió a 0,75 [0,67 - 0,83] y se consiguió un valor predictivo maximizado a una concentración umbral de
4,8 \mug/l.

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Ejemplo 2a Hallazgos angiográficos y concentración de sCD40L

Los angiogramas coronarios iniciales en pacientes con elevadas concentraciones de sCD40L mostraron características más complejas de las lesiones. En el 40,6% de los pacientes con altas concentraciones de sCD40L se documentaron lesiones del tipo B2+ o C, mientras que sólo el 27,5% de los pacientes con bajas concentraciones de sCD40L presentaron características de lesiones más complejas (p = 0,004).

El valor inicial para el flujo de TIMI era normal en el 59,6% de los pacientes con altas concentraciones de sCD40L y en el 58,9% de los pacientes con bajas concentraciones de sCD40L (p = 0,049). Se documentó un flujo de TIMI = 1 para el 7,8% de los pacientes con altas concentraciones de sCD40L en comparación con el 5,7% de los pacientes con bajas concentraciones de sCD40L (p = 0,67).

En el momento del ingreso era visible un trombo en el 11,1% de los pacientes con altas concentraciones de sCD40L en comparación con el 4,8% de los pacientes con bajas concentraciones de sCD40L (p = 0,009). Todos los pacientes con formación de trombo visible presentaron concentraciones de sCD40L > 2,5 \mug/l.

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Ejemplo 3a Efecto de abciximab en la concentración de sCD40L

Un análisis de regresión logística indicó una relación significativa entre la eficacia de un tratamiento con abciximab y las concentraciones de sCD40L (p < 0,001). Los pacientes se clasificaron como anteriormente en quintiles. Para los dos primeros quintiles no se observó ninguna diferencia relativa a un riesgo cardíaco en un tratamiento con placebo o abciximab (figura 3). Para los dos quintiles superiores se documentó una reducción significativa e igualmente pronunciada de acontecimientos cardíacos. El hallazgo de un cambio de la diferencia de 0,35 entre el segundo y tercer quintil sugirió una concentración umbral favorable en este intervalo de concentraciones de sCD40L. Por consiguiente, las curvas que representan la frecuencia de un acontecimiento cardíaco bajo la forma de un infarto de miocardio mortal o no mortal se produjeron usando una concentración umbral de 5,0 \mug/l. Los acontecimientos antes de este procedimiento eran raros (0,9%) en pacientes con bajas concentraciones de sCD40L que recibieron placebo, mientras que en el 3,4% de los pacientes aparecieron acontecimientos en relación con una intervención coronaria (figura 4a). En pacientes con bajas concentraciones de sCD40L no se observó ninguna diferencia entre pacientes que recibieron abciximab y aquellos que recibieron placebo (24 horas: 1,2% frente al 0,9%; 72 horas: 3,8% frente al 4,3%). Sólo se registraron algunos acontecimientos adicionales en los 6 meses posteriores. La frecuencia total ascendió al 7,1% (figura 4b).

A diferencia de esto, la frecuencia de ataques era significativamente mayor en pacientes con altas concentraciones de sCD40L que habían recibido placebo, tanto antes de ACTP (4,1%) como en ACTP (9,0%), así como en el tiempo posterior después del alta médica, lo que llevó a una frecuencia total del 18,6% después de seis meses. Los acontecimientos que aparecieron antes y en ACTP se redujeron eficazmente mediante tratamiento con abciximab al 0,5% antes ACTP (cociente de riesgos 0,12 [0,01 - 0,92]; p = 0,013) y al 2,9% para acontecimientos relacionados con ACTP (cociente de riesgos 0,19 [0,08 - 0,49]; p< 0,001). Esta mejora se detuvo durante seis meses después del acontecimiento, lo que llevó a una frecuencia acumulada de acontecimientos del 7,8% frente al 18,6% en el grupo de placebo (cociente de riesgos 0,37 [0,20 - 0,68]; p = 0,001). Este valor es comparable con el que se observó en pacientes con bajas concentraciones de sCD40L (7,1%). Además, el efecto de la inhibición de la glucoproteína IIb/IIIa sin la aparición de una necrosis miocárdica era obvio. En pacientes negativos para TnT se identificó mediante la concentración de sCD40L un subgrupo de pacientes que mostraron una reducción significativa de acontecimientos cardíacos cuando recibieron abciximab (2,8% frente al 10,2%; placebo frente a abciximab; p = 0,022).

La disolución de un trombo durante el tratamiento mandado antes de la intervención coronaria era especialmente sorprendente en pacientes con altas concentraciones de sCD40L cuando fueron tratados con abciximab, con una reducción relativa del 63% (placebo: -21%; p < 0,01). Era rara una formación de trombo en pacientes con bajas concentraciones de sCD40L y no se consiguió una disolución significativa ni en el grupo de placebo (p = 0,75) ni el grupo de abciximab (p = 0,82).

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Ejemplo 4a sCD40L como marcador de una activación plaquetaria in vivo

Para verificar la hipótesis de que el sCD40L representa realmente un marcador para la activación plaquetaria se examinó prospectivamente la relación de la activación plaquetaria y las concentraciones de sCD40L en suero en un subgrupo de pacientes con dolor torácico agudo (n = 151). La amplitud de la activación plaquetaria era significativamente elevada en pacientes con síndromes coronarios agudos en comparación tanto con pacientes con enfermedad cardíaca coronaria estable como con pacientes sin enfermedad cardíaca coronaria (figura 5). Se obtuvo una estricta correlación entre la activación plaquetaria, determinada mediante agregados monocito-plaqueta (%), y la concentración de sCD40L (r = 0,75; p < 0,0001) (figura 6). Se obtuvieron resultados similares para P-selectina (p < 0,001). Los pacientes se clasificaron en terciles según sus concentraciones de sCD40L medidas: (sCD40L 1) < 2,5 \mug/l (n = 55), (sCD40L 2) 2,5 - 4,5 \mug/l (n = 50) o (sCD40L 3) > 4,5 \mug/l (n = 56). En pacientes del primer tercil de sCD40L, la proporción porcentual de agregados monocito-plaqueta ascendió al 11,3% [9,6 - 12,9]. En el segundo y tercer tercil de sCD40L, la activación plaquetaria era significativamente mayor (22,3 [19,8 - 24,8]% o 34,1 [30,0 - 38,3]%; p < 0,001). Es especialmente interesante que en todos los pacientes (con excepción de un paciente) las concentraciones de sCD40L en suero presentaron > 4,5 \mug/l, al menos el 15% de los monocitos estaban agregados con plaquetas, lo que indica una clara activación plaquetaria en estos pacientes. A diferencia de esto, las concentraciones en suero de P-selectina soluble mostraron una relación claramente menos pronunciada con la activación plaquetaria (r = 0,41 para agregados plaqueta-monocito o r = 0,36 para P-selectina). En un análisis de regresión multivarianza se mostró que una enfermedad diabética (p = 0,015), una hipercolesterolemia (p = 0,006) y la concentración de sCD40L (p < 0,0001), pero no la concentración de P-selectina soluble, estaba asociada significativamente con la activación plaquetaria (agregados monocito-plaqueta > 30%).

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TABLA 1 Características iniciales de sCD40L en el grupo de placebo

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1

TABLA 2 Infarto de miocardio mortal y no mortal en el plazo de los 6 primeros meses (análisis de regresión de multivarianza)

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3

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II. PlGF

PlGF se identificó originalmente en la placenta y estimula el crecimiento de músculo liso, recluta macrófagos en lesiones arterioscleróticas, regula por incremento la producción de TNF-\alpha y MCP-1 mediante macrófagos y estimula la angiogénesis patológica. Mucho más importante, de la inhibición de los efectos de PlGF mediante el bloqueo de su receptor tirosina-cinasa Flt-1 se mostró experimentalmente que esto suprime tanto el crecimiento de placas arterioscleróticas como la vulnerabilidad mediante la inhibición de la infiltración celular inflamatoria. Estos datos hacen suponer que PlGF sirve quizás como un indicador inflamatorio primario de la inestabilidad de placas arterioscleróticas.

Por tanto, la significancia pronóstica de PlGF en pacientes con síndromes coronarios agudos se uso con el uso de los datos de pacientes con síndromes coronarios agudos que fueron admitidos en el estudio CAPTURE (c7E3 "Anti Platelet Therapy in Unstable Refractory angina") y luego la significancia diagnóstica y pronóstica se validó provisionalmente en una gran población de pacientes que fueron hospitalizados con dolores en el pecho. Los niveles de PlGF en suero se midieron en 1088 pacientes con síndromes coronarios agudos del estudio CAPTURE. Además, la significancia diagnóstica y pronóstica de los niveles de PlGF en suero se validó provisionalmente en un grupo heterogéneo de 619 pacientes con dolores agudos en el pecho. La incidencia de infarto de miocardio con desenlace mortal o no mortal se anotó durante el periodo de seguimiento.

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1. Pacientes

Constitución del conjunto de pacientes con síndromes coronarios agudos. El estudio CAPTURE registró 1265 pacientes con síndromes coronarios agudos (61% de hombres, de edades de 61 \pm 10 años). Todos los pacientes de CAPTURE se lamentaban de dolores torácicos recurrentes en reposo asociados con cambios del ECG durante un tratamiento con heparina intravenosa y trinitrato de glicerina. La población total de pacientes se sometió antes de la aleatorización a una angiografía coronaria que indicó significativamente la aparición de una clara enfermedad de las arterias coronarias con lesiones desencadenantes de > 70% que eran adecuadas para una angioplastia. Se administró heparina desde antes de la aleatorización hasta al menos 1 h después del procedimiento de ACTP. En todos los pacientes se previeron intervenciones coronarias en el plazo de 18 a 24 horas después del inicio del tratamiento. A los pacientes se les asignó aleatoriamente un tratamiento mediante abciximab o placebo. Los criterios de valoración primarios del estudio fueron mortalidad e infarto de miocardio no fatal durante el periodo del examen de seguimiento de 6 meses. Las muestras de suero se extrajeron 8,7 [IC del 75% 3,6 - 11,3] horas después del inicio de los síntomas.

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2. Validación de pacientes con dolor torácico agudo

Como conjunto se creó un grupo separado de 626 pacientes con dolor torácico (161 mujeres y 465 hombres, edad media 61 [38 - 82] años) que llegaron a urgencias en una sucesión continua con dolor torácico agudo que duró menos de 12 horas (5,1 [2,1 - 10,4] horas de media). No se consideraron pacientes con una elevación de ST característica basada en el ECG o un infarto de miocardio agudo documentado durante las 2 semanas precedentes. Las muestras de suero se obtuvieron en el momento del ingreso (antes de empezar el tratamiento) y 4 horas más tarde, se conservaron en hielo, en el plazo de 20 minutos después de la toma de la muestra se centrifugaron y se almacenaron a -80ºC para el posterior análisis. Los pacientes se observaron hasta que se les dio el alta médica del hospital y 30 días después para registrar infartos de miocardio mortales y no mortales. La presencia de una enfermedad de las arterias coronarias se detectó mediante uno de los siguientes criterios: indicios del ECG de una isquemia del miocardio (nuevos cambios en el segmento ST o inversión de las ondas T), una enfermedad cardíaca coronaria en la anamnesis (infarto de miocardio o revascularización coronaria, una prueba de esfuerzo positivo o estrechamiento del diámetro de una arteria coronaria principal en al menos el 50% en un angiograma anterior). Los pacientes sin enfermedad cardíaca coronaria habían mostrado un angiograma coronario normal.

Los criterios de valoración primarios del estudio fueron mortalidad, infarto de miocardio o la necesidad de intervención inmediata (angioplastia, operaciones de derivación de la arteria coronaria) debido a una inestabilidad durante 30 días o 6 meses. En pacientes que sufrieron un infarto de miocardio durante la hospitalización, uno tal se les diagnosticó cuando sus valores de la actividad enzimática de creatina-cinasa en al menos dos muestras eran más del triple del límite superior del intervalo normal o cuando su ECG presentó nuevas ondas Q claras en más de dos intervalos sucesivos. Esta estricta definición se eligió para excluir cualquier pequeña subida insignificante de la creatina-cinasa después de ACTP. En pacientes con un infarto de miocardio después del alta médica, uno tal se definió cuando sus valores de la actividad enzimática de creatina-cinasa eran más del doble del límite superior del intervalo normal o cuando su ECG presentó nuevas ondas Q claras en dos o más intervalos sucesivos. El criterio de valoración secundario fue la reestenosis coronaria sintomática de la lesión tratada con un diámetro de estenosis \geq 70% y la necesidad de repetir la revascularización durante los 6 meses siguientes.

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3. Análisis bioquímico

Las muestras de suero se almacenaron centralmente a -80ºC. La determinación de los marcadores cardíacos se realizó con desconocimiento de la historia clínica de los pacientes y del tratamiento mandado en el laboratorio de investigación de la Universidad de Francfort. Los niveles en suero de PlGF y VEGF se midieron mediante ELISA (R&D Systems, Wiesbaden). Para la cuantificación de troponina T cardíaca (TnT) se usó un inmunoensayo enzimático de una sola etapa basado en la tecnología de electroquimioluminiscencia (Elecsys 2010, Roche Diagnostics). La proteína C reactiva de alta sensibilidad (hsCRP) se midió con ayuda del nefelómetro Behring BN II (Behring Diagnostics). Se usó un valor umbral diagnóstico de 10,0 mg/l [9, 18].

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4. Determinación cuantitativa de PlGF

La concentración de PlGF se determinó usando la técnica de inmunoensayo enzimático tipo sándwich (R&D Systems, Wiesbaden). Una placa de microtitulación se recubrió con un anticuerpo policlonal que estaba dirigido específicamente contra PlGF. Los patrones y las muestras se pipetearon en los pocillos y el PlGF presente se unió mediante el anticuerpo inmovilizado. Después de eliminarse mediante lavado el material no unido, un anticuerpo policlonal acoplado a enzima que estaba dirigido específicamente contra PlGF se añadió a los pocillos. Después de una etapa de lavado para eliminar mediante lavado el anticuerpo-enzima-reactivo no unido, una disolución de sustrato se añadió a los pocillos y el color se reveló en relación con la cantidad de PlGF que se unió en la primera etapa. Se detuvo el revelado de color y se midió la intensidad del color.

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5. Métodos estadísticos

Después de una valoración ciega de los marcadores bioquímicos, los resultados de las pruebas se compararon con el banco de datos Para poder distinguir pacientes con distintos grados de un riesgo cardiológico se eligió un análisis de datos exploratorio. Se usó el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox para estimar el riesgo relativo de sucesos cardiovasculares y los pacientes se clasificaron según la concentración de PlGF de los quintiles. El análisis a posteriori de los quintiles se realizó usando el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox con los quintiles de PlGF como variable categórica y los pacientes en el primer quintil sirvieron de referencia. Se usó el análisis de las curvas de eficacia diagnóstica (ROC) respecto al intervalo dinámico de la prueba de PlGF para identificar la concentración umbral de PlGF que proporcionó el mayor valor predictivo para la estratificación del riesgo de pacientes con síndromes coronarios agudos. El efecto de las características iniciales (en las que era necesario p = 0,10 para introducir una variable en el modelo) y otros marcadores bioquímicos en cada relación observada entre los niveles de PlGF y sucesos cardiovasculares se realizó usando el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox escalonado. Todos los resultados de las variables continuas se expresan como media \pm desviación estándar. La comparación entre los grupos se analizó mediante una prueba de la t (bilateral). La comparación de las variables categóricas se generó mediante la prueba de \chi^{2} de Pearson. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los análisis se realizaron con SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago).

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Ejemplo 1b Relación entre riesgo cardíaco y concentración de PlGF

Las características del desenlace de la población seleccionada para este estudio (n = 1088, 86% de los pacientes de CAPTURE) no se diferenciaron de la población total del estudio en cuanto a edad, sexo, perfil de riesgo cardiovascular y tratamiento concomitante antes y después de la elección al azar. La reducción de acontecimientos cardíacos en el grupo de abciximab de la población era comparable con la población total de CAPTURE tanto antes de ACTP (2,2% en placebo frente al 0,9% en abciximab; p = 0,07) como después de ACTP (7,9% frente al 3,5%; p = 0,001) y a 30 días (9,0% frente al 4,2%; p = 0,001).

El PlGF era detectable en las muestras de suero iniciales del 95,6% de los pacientes del estudio con un valor medio de 23,0 ng/l (intervalo 7,0 - 181,2). El nivel de PlGF en suero no se correlacionó con las concentraciones medidas de troponina T (r = 0,14) y niveles de VEGF (r = 0,07), pero mostró una correlación significativa con niveles de hsCRP en suero (r = 0,48) (figura 7). El nivel de PlGF en suero no se diferenció entre pacientes positivos para troponina T y negativos para troponina T, mientras que los niveles de hsCRP en suero en pacientes positivos para troponina T eran significativamente mayores (figura 8). Los pacientes del grupo de placebo (n=547) se clasificaron en quintiles según sus niveles de PlGF en suero medidos: respectivamente (PlGF 1) < 13,3 ng/l (n = 109), (PlGF 2) 13,4 - 19,2 ng/l
(n = 110), (PlGF 3) 19,3 - 27,3 ng/l (n = 110), (PlGF 4) 27,3 - 40,0 ng/l (n = 109) y (PlGF 5) > 40,0 ng/l (n = 109). Durante las primeras 24 horas, los criterios de valoración combinados mortalidad e infarto de miocardio no mortal no eran diferentes entre los quintiles de PlGF (p = 0,11) (figura 9). En momentos de tiempo posteriores (72 horas, 30 días, 6 meses), las tasas de sucesos mostraron diferencias significativas entre los quintiles de PlGF. En el examen de seguimiento de 72 horas, las tasas de sucesos en el cuarto y quinto quintil eran significativamente mayores cuando se comparaban con el primer quintil (respectivamente p = 0,038 y p = 0,011). Durante el posterior examen de seguimiento de 6 meses, las tasas de sucesos siguieron divergiendo, lo que llevó a diferencias significativas para el cuarto y quinto quintil en el examen de seguimiento de 30 días (respectivamente p = 0,005 y p = 0,017) y de 6 meses (respectivamente p = 0,002 y p = 0,001).

El análisis de las curvas de eficacia diagnóstica confirmó un valor umbral de 27,0 ng/l para el valor predictivo maximizado de PlGF (figura 10). Basándose en este valor umbral, 223 pacientes (40,8%) presentaron niveles de PlGF en suero superiores o iguales a 27,0 ng/l y 324 pacientes inferiores a 27,0 ng/l. Como muestra la tabla 3, aparecieron pequeñas diferencias en las características del desenlace de los dos grupos. Los pacientes con niveles elevados de PlGF en suero fueron más frecuentemente diabéticos y presentaron hipertensión y tenían niveles de hsCRP en suero significativamente más altos (tabla 3). En pacientes con alto nivel de PlGF en suero, los criterios de valoración combinados infarto de miocardio mortal y no mortal eran significativamente distintos de pacientes con bajo nivel de PlGF en suero. Después de 72 horas (incluidas intervenciones coronarias en todos los pacientes), el 12,1% de los pacientes con alto nivel de PlGF en suero tenían un acontecimiento negativo en comparación con el 4,9% para pacientes con bajo nivel de PlGF en suero (p = 0,002) (figura 11a). Durante el periodo de seguimiento de 6 meses, las curvas que indican la frecuencia de un acontecimiento siguieron divergiendo entre pacientes con altos o bajos niveles de PlGF en suero (figura 11b). Hubo diferencias significativas tanto después de 30 días (15,8% frente al 3,6%; p = 0,001) como después de 6 meses (20,3% frente al 4,9%; p < 0,001). A pesar de la mortalidad relativamente baja del grupo CAPTURE, el criterio de valoración mortalidad después de 6 meses se diferenció significativamente entre los dos grupos (4,0% frente al 0,9%; p = 0,021). En un análisis multifactorial que las características iniciales y los marcadores bioquímicos (troponina T, VEGF, hsCRP), el PlGF permaneció como una variable independiente eficaz de elevado riesgo cardíaco tanto en el examen de seguimiento de 30 días (cociente de riesgos instantáneos ajustado 3,34 [IC del 95% 1,79 - 6,24]; p < 0,001) como en el examen de seguimiento de 6 meses (cociente de riesgos instantáneos ajustado 3,58 [IC del 95% 1,48 - 7,72]; p < 0,001) (tabla 4). La división de los pacientes en cuatro grupos basándose en sus niveles de PlGF y hsCRP resultó que PlGF identificó un subgrupo de pacientes con bajos niveles de hsCRP en suero que padecieron un riesgo cardíaco significativamente elevado. Los pacientes con bajo nivel de hsCRP en suero, pero niveles de PlGF en suero superiores a 27,0 ng/l, presentaron un riesgo significativamente mayor que los pacientes que presentaron bajos niveles tanto para hsCRP como para PlGF (23,6% frente al 3,9%; p = 0,001) (figura 12a).

Además, el valor predictivo de PlGF era independiente de necrosis del miocardio. Altos niveles de PlGF en suero indicaron un elevado riesgo cardíaco tanto en pacientes positivos para troponina T (15,4% frente al 4,1%; P=0,005) como en pacientes negativos para troponina T (26,1% frente al 10,1%; p = 0,001) (figura 12b).

Ejemplo 2b Efecto de abciximab en cuanto al nivel de PlGF en suero

Un análisis de regresión logística indicó una relación límite significativa entre la eficacia de un tratamiento con abciximab y las concentraciones de PlGF (p = 0,043). Los pacientes con niveles elevados de PlGF en suero que recibieron abciximab tenían un riesgo significativamente más bajo en el examen de seguimiento de 30 días (cociente de riesgos instantáneos ajustado 0,38 [0,19 - 0,74]; p = 0,005). Esta diferencia significativa se mantuvo en el examen de seguimiento de 6 meses (0,57 [0,34 - 0,96]; p = 0,037). A diferencia de esto, los pacientes con bajos niveles de PlGF en suero no recibieron ninguna ventaja significativamente terapéutica de un tratamiento con abciximab (examen de seguimiento de 30 días: cociente de riesgos instantáneos ajustado 0,59 [0,27 - 1,33]; p = 0,23).

Ejemplo 3b Niveles de PlGF en suero en el alta médica son predictivos para el desenlace a largo plazo

Se obtuvo una segunda muestra de sangre que se sacó antes del alta médica (7,2 \pm 4,5 días después de la aleatorización) para los 489 pacientes de los 547 pacientes con placebo (89,4%). Los niveles de PlGF en suero disminuyeron de una media de 27,12 \pm 19,56 ng/l en el nivel inicial a 23,4 \pm 26,2 ng/l en el alta médica (p = 0,012). Para pacientes con un nivel de PlGF en suero superior a 27,0 ng/l en el alta médica, la aparición de mortalidad e infarto de miocardio no fatal era significativamente mayor cuando se comparaba con pacientes con bajo nivel de PlGF en suero, tanto en el examen de seguimiento de 30 días (4,6% frente al 0,8%; p = 0,019) como en el de 6 meses (7,4% frente al 2,2%; p = 0,005) (figura 13).

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Ejemplo 4b Validación del valor umbral de PlGF en pacientes con dolores torácicos agudos

De los 626 pacientes con dolores torácicos agudos, 308 pacientes padecieron un síndrome coronario agudo (117 pacientes tuvieron un infarto de miocardio sin elevación de ST). A los otros pacientes se les asignaron los siguientes diagnósticos: n = 91 angina de pecho estable, n = 10 embolia pulmonar, n = 11 insuficiencia cardíaca congestiva,
n = 7 miocarditis y n = 199 ninguna indicación de enfermedad cardíaca. Los niveles de PlGF en suero eran significativamente elevados en pacientes con síndromes coronarios agudos (media 28,3 [IC del 95% 21,3 - 2,2] ng/l) cuando se compararon respectivamente con pacientes con angina de pecho estable (media 16,2 [IC del 95% 13,8 - 18,6 ng/l; p = 0,001) y pacientes sin indicios de enfermedad cardíaca (media 9,6 [IC del 95% 10,4 - 12,9 ng/l; p = 0,001). Los niveles de PlGF en suero en pacientes con infarto de miocardio sin elevación de ST no se diferenciaron significativamente de niveles de PlGF en suero en pacientes con angina de pecho inestable (30,5 [IC del 95% 26,9 - 34,1] frente a 28,3 [IC del 95% 21,3 - 32,2] ng/l; p = 0,42). El límite de referencia superior del 97,5 por ciento en pacientes sin indicación de enfermedad cardíaca era de 24,9 ng/l y el límite de referencia superior del 99 por ciento era de 27,3 ng/l. El nivel de PlGF en suero no se correlacionó con marcadores de la necrosis (troponina T [r = 0,07]), pero se correlacionó significativamente con marcadores de inflamación (proteína C reactiva [r = 0,43]).

En pacientes con síndromes coronarios agudos, el 44,8% de los pacientes presentaron niveles de PlGF en suero superiores al límite de referencia superior del 99 por ciento. Con el uso del valor umbral para PlGF de 27,0 ng/l, los pacientes con nivel elevado de PlGF en suero estaban sujetos a un riesgo significativamente mayor de muerte e infarto de miocardio (cociente de riesgos instantáneos ajustado 2,97 [IC del 95% 1,74 a 9,06; p = 0,014). Dentro de la población total heterogénea de pacientes con dolores torácicos, el valor umbral de 27,0 ng/l también identificó pacientes probados que estaban expuestos al mayor riesgo de muerte e infarto de miocardio (cociente de riesgos instantáneos ajustado 4,95 [IC del 95% 2,50 a 9,79; P 0,001).

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Resumen de los ejemplos 1b a 4b

En pacientes con SCA, PlGF no se correlacionó con VEGF, troponina T y modificaciones del segmento ST, pero mostró una correlación significativa con hsCRP (p = 0,001). Los pacientes con nivel elevado de PlGF en suero (> 27,0 ng/l; 40,8%) experimentaron un riesgo cardíaco considerablemente elevado (muerte e infarto de miocardio no fatal) tanto en 30 días (cociente de riesgos instantáneos ajustado 3,34 [IC del 95% 1,79 - 6,24]; p = 0,001) como en 6 meses (cociente de riesgos instantáneos ajustado 3,58 [IC del 95% 1,48 - 7,72]; p = 0,001) después de SCA. Los niveles de PlGF en suero eran específicamente informativos en pacientes con bajos niveles de hsCRP. La validación provisional en pacientes con dolores torácicos agudos dio como resultado que niveles de PlGF en suero > 27 ng/l identificaron de forma fidedigna aquellos pacientes que estaban expuestos al mayor riesgo de muerte e infarto de miocardio (cociente de riesgos instantáneos ajustado 4,95 [IC del 95% 2,50 a 9,79; p = 0,001). El elevado riesgo en pacientes con alto nivel de PlGF en suero se redujo mediante el tratamiento con el inhibidor del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa abciximab (cociente de riesgos instantáneos ajustado 0,38 [0,19 - 0,74]; p = 0,005).

TABLA 3 Características iniciales según el estado de PlGF para el grupo de placebo del experimento CAPTURE (n = 547)

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TABLA 4 Modelo de regresión multifactorial de riesgos instantáneos proporcionales de Cox para infarto de miocardio mortal y no mortal en el plazo de los 6 primeros meses del examen de seguimiento deducido del grupo de placebo del estudio CAPTURE

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III. PAPP-A y combinaciones

El uso de PAPP-A como único marcador o en combinación con otros marcadores sin un uso de PlGF no es objeto de la presente invención.

La significancia pronóstica de PAPP-A en pacientes con síndromes coronarios agudos se empleó usando los datos de pacientes con síndromes coronarios agudos que fueron admitidos en el estudio CAPTURE (c7E3 "Anti Platelet Therapy in Unstable Refractory angina") y luego la significancia diagnóstica y pronóstica se validó provisionalmente en una gran población de pacientes que fueron hospitalizados con dolores en el pecho. Los niveles de PAPP-A en suero se midieron en pacientes con síndromes coronarios agudos del estudio CAPTURE. La incidencia de infarto de miocardio con desenlace mortal o no mortal se anotó durante el periodo de seguimiento.

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1. Pacientes

Constitución del conjunto de pacientes con síndromes coronarios agudos. El estudio CAPTURE registró 1265 pacientes con síndromes coronarios agudos (61% de hombres, edad 61 \pm 10 años). Todos los pacientes de CAPTURE se lamentaban de dolores torácicos recurrentes en reposo asociados con cambios del ECG durante un tratamiento con heparina intravenosa y trinitrato de glicerina. La población total de pacientes se sometió antes de la aleatorización a una angiografía coronaria que mostró significativamente la aparición de una clara enfermedad de las arterias coronarias con lesiones desencadenantes de > 70% que eran adecuadas para una angioplastia. Se administró heparina desde antes de la aleatorización hasta al menos 1 h después del procedimiento de ACTP. En todos los pacientes se previeron intervenciones coronarias en el plazo de 18 a 24 horas después del inicio del tratamiento. A los pacientes se les asignó aleatoriamente un tratamiento mediante abciximab o placebo. Los criterios de valoración primarios del estudio fueron mortalidad e infarto de miocardio no fatal durante el periodo del examen de seguimiento de 6 meses. El infarto de miocardio durante la hospitalización, incluido el procedimiento de angioplastia, se definió mediante los valores de la actividad enzimática de CC de más del triple del límite superior del intervalo normal en al menos dos muestras y/o nuevas ondas Q significativas en dos o más derivaciones continuas. El infarto de miocardio después del alta médica se definió como valores de la actividad enzimática de CC de más del doble del límite superior del intervalo normal en al menos dos muestras y/o nuevas ondas Q significativas en dos o más derivaciones continuas. Debido a que otros marcadores, como por ejemplo troponina T (TnT) y ligando CD40 soluble (sCD40L), mostraron que éstos interferían con el efecto del tratamiento del antagonista del receptor de la glucoproteína IIb/IIIa, el presente análisis se limitó a pacientes con placebo con muestras de sangre disponibles (n=547; 86% de los pacientes con placebo). Las muestras de sangre se tomaron 8,7 \pm 4,9 horas después del inicio de los síntomas.

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2. Análisis bioquímico

Las muestras de suero se almacenaron centralmente a -80ºC. La determinación de los marcadores cardíacos se realizó con desconocimiento de la historia clínica de los pacientes y del tratamiento mandado en el laboratorio de investigación de la Universidad de Francfort. Los niveles en suero de PlGF y VEGF se midieron mediante ELISA (R&D Systems, Wiesbaden). Para la cuantificación de troponina T cardíaca (TnT) se usó un inmunoensayo enzimático de una sola etapa basado en la tecnología de electroquimioluminiscencia (Elecsys 2010, Roche Diagnostics). La proteína C reactiva de alta sensibilidad (hsCRP) se midió con ayuda del nefelómetro Behring BN II (Behring Diagnostics). Se usó un valor umbral diagnóstico de 10,0 ng/l. La interleucina 10 de alta sensibilidad (IL-10), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sCD40L se midieron mediante ELISA (ambos R&D Systems, Wiesbaden, GE). Se usaron los siguientes valores umbral diagnósticos anteriormente establecidos: 5,0 ug/l para sCD40L, 300 ng/l para VEGF, 3,5 ng/l para IL-10. PAPP-A cardíaca se determinó usando un inmunoensayo enzimático de una sola etapa basado en la tecnología de electroquimioluminiscencia (Elecsys 2010, Roche Diagnostics, Mannheim, GE). La imprecisión total para PAPP-A usando controles internos durante las 8 semanas de duración fue del 8,5%.

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3. Métodos estadísticos

Los pacientes se clasificaron según las concentraciones de PAPP-A en plasma de los quintiles. Para cada momento de tiempo (24 h, 72 h, 30 días y 6 meses) se uso el modelo de regresión logística para determinar el riesgo relativo de muerte e infarto de miocardio. El efecto de las características iniciales y de otros marcadores biológicos en cada relación observada entre los niveles de PAPP-A y sucesos cardiovasculares se realizó usando el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox escalonado. Todos los resultados de las variables continuas se expresan como media \pm desviación estándar. La comparación entre los grupos se analizó mediante una prueba de la t (bilateral). La comparación de las variables categóricas se generó mediante la prueba de \chi^{2} de Pearson. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los análisis se realizaron con SPSS 11.5 (SPSS Inc., Chicago).

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Resumen de los resultados

Los niveles de PAPP-A en plasma iniciales mostraron un nivel medio de 14,8 \pm 13,8 mUI/l (intervalo 0,2 a 105,4). Cuando los niveles de PAPP-A en plasma estaban unidos a marcadores de riesgo habituales, las concentraciones de PAPP-A no se correlacionaron con los niveles de TnT (coeficiente de correlación de rangos de Spearman r = 0,11; P = 0,16) y eran similares en pacientes con altos niveles de TnT en plasma y en pacientes con bajos niveles de TnT en plasma (figura 14). Similarmente, los niveles de VEGF (r = 0,08; P = 0,07) y IL-10 en plasma (r = -0,04; P = 35) no mostraron ninguna asociación con los niveles de PAPP-A en plasma. A diferencia de esto, los niveles de hsCRP en plasma eran significativamente mayores en pacientes con nivel elevado de TnT en plasma. El análisis de la correlación bifactorial dio como resultado una correlación significativa entre PAPP-A y hsCRP, así como entre PAPP-A y sCD40L, aunque los coeficientes de correlación con r = 0,21 para hsCRP (P = 0,001) y r = 0,18 para sCD40L
(P = 0,001) eran bajos. Sin embargo, cuando el análisis se limitó a pacientes sin necrosis del miocardio (sin elevación de troponina), la correlación entre hsCRP y PAPP-A fue mucho más clara, con un valor de r de 0,68 (P = 0,001). Consecuentemente, los pacientes con niveles elevados de PAPP-A presentaron respectivamente niveles de hsCRP y sCD40L significativamente mayores (figura 15).

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Interacción entre los niveles de PAPP-A en plasma y riesgo cardíaco

Los pacientes se estratificaron en quintiles según sus niveles de PAPP-A medidos: respectivamente (PAPP-A 1) < 4,5 mUI/l (n = 111), (PAPP-A-2) 4,5 - 7,5 mUI/l (n = 108), (PAPP-A-3) 7,6 - 12,6 mUI/l (n = 109), (PAPP-A_4) 12,7 - 24,0 mUI/l (n = 110) y (PAPP-A_5) > 24,0 mUI/I (n = 1 09). Para el periodo inicial de 24 horas, los criterios de valoración combinados mortalidad e infarto de miocardio no fatal no se diferenciaron entre los quintiles (P = 0,69) (figura 16). Para el seguimiento de 72 horas, incluidos sucesos perioperatorios, las diferencias en los acontecimientos cardíacos entre los quintiles alcanzaron niveles de significancia estadística (P = 0,019). Durante el seguimiento de 30 días y de 6 meses, las curvas de tasas de acontecimientos siguieron desviándose entre sí, lo que llevó a diferencias sumamente significativas entre los quintiles tanto en el seguimiento de 30 días (P = 0,008) como en el de 6 meses (P = 0,004). Para los datos de seguimiento de 6 meses, el análisis a posteriori de los quintiles de PAPP-A usando un modelo de regresión logística dio como resultado que sólo los dos quintiles superiores de PAPP-A (4º quintil: P = 0,034; 5º quintil: P = 0,002) se diferenciaban significativamente del primer quintil de PAPP-A, que sirvió de referencia. De acuerdo con estos resultados, el análisis de las curvas de eficacia diagnóstica verificó un valor umbral de 12,6 mUI/l de PAPP-A para el valor predictivo maximizado (figura 17).

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Estratificación según el estado de PAPP-A

Basándose en los resultados anteriormente mencionados, la población del estudio se dicotomizó según el valor umbral calculado de 12,6 mUI/l, lo que llevó a 219 pacientes con niveles elevados de PAPP-A (40,0%). Además de niveles más altos de respectivamente hsCRP y sCD40L en pacientes con niveles elevados de PAPP-A en plasma, las características iniciales en pacientes con niveles elevados de PAPP-A en plasma no eran significativamente distintas de pacientes con bajos niveles de PAPP-A en plasma (tabla 5). Las razones de probabilidades para muerte e infarto de miocardio (ajustadas a diferencias en las características iniciales) eran 1,15 (IC del 95% 0,36 - 3,67; P = 1,00) a 24 h, 2,96 (IC del 95% 1,55 - 5,64; P = 0,002) a 72 h (figura 18a), 2,84 (IC del 95% 1,55 - 5,22; P = 0,001) a 30 días y 2,64 (IC del 95% 1,55 - 4,50; P 0,001) a 6 meses (figura 18b). Las tasas de acontecimientos acumuladas en seis meses en pacientes con bajos niveles de PAPP-A eran del 7,9% frente al 17,4% para pacientes con altos niveles de PAPP-A. Esta diferencia en las tasas de acontecimientos no fue solamente provocada por una mayor tasa de infarto de miocardio no fatal, sino por una mayor mortalidad en pacientes con nivel reducido de PAPP-A en plasma (3,2% frente al 1,2%;
P = 0,098). Correspondientemente, los procedimientos de revascularización urgentes, incluidos intervención coronaria percutánea e injerto de derivación de arteria coronaria, eran significativamente mayores en pacientes con nivel elevado de PAPP-A en plasma (13,6% frente al 7,9%; P = 0,012). Los procedimientos de revascularización no urgentes durante los 6 meses de seguimiento mostraron una mayor aparición en pacientes con altos niveles de PAPP-A en plasma en comparación con pacientes con bajos niveles de PAPP-A en plasma (34,4% frente al 19,7%; P = 0,005).

Consideraciones de marcadores múltiples

Los inventores midieron al mismo tiempo marcadores de necrosis del miocardio (TnT), isquemia (VEGF), inflamación (hsCRP, PAPP-A), actividad antiinflamatoria (IL-10) y activación plaquetaria (sCD40L). Notablemente, el valor predictivo de PAPP-A en pacientes con niveles elevados de hsCRP (figura 19a) estaba limitado. Cuando el nivel de hsCRP en plasma era elevado (superior a 10 mg/l), los pacientes mostraron con un nivel de PAPP-A en plasma superior al valor umbral calculado de 12,6 mUI/l un elevado riesgo cardíaco de muerte e infarto de miocardio no fatal (razón de probabilidades ajustadas 2,61 [1,25 - 5,62]; P = 0,007) (figura 19a). A diferencia de esto, para pacientes con valores de hsCRP inferiores a 10 mg/l, PAPP-A no sirvió como una variable independiente significativa para el riesgo cardiovascular (P = 0,073). Además, el valor predictivo de PAPP-A se relacionó estrechamente con el nivel en plasma de la citocina antiinflamatoria IL-10 (figura 19b). Cuando los niveles de IL-10 en plasma eran superiores al valor umbral calculado de 3,5 ng/l, los pacientes con niveles elevados de PAPP-A en plasma (superior a 12,6 mUI/l) estaban protegidos de un elevado riesgo cardíaco (razón de probabilidades ajustadas 1,40 [0,60 - 3,23]; P < 0,001) (figura 19b). Sin embargo, para pacientes con bajo nivel de IL-10 en plasma, los valores de PAPP-A superiores a 12,6 mUI/l identificaron un subgrupo de pacientes que padeció un riesgo cardiovascular especialmente alto (razón de probabilidades ajustadas 3,52 [1,71 - 7,23]; P 0,001). En conjunto, estos datos muestran que el valor predictivo de los niveles de PAPP-A en plasma se modulan de manera importante por el equilibrio entre los niveles de citocinas pro y antiinflamatorias en plasma. Lo más importante, el valor predictivo de PAPP-A también era evidente en pacientes sin indicaciones de necrosis del miocardio. Los pacientes negativos para TnT (valor umbral 0,1 ug/l) con niveles elevados de PAPP-A tenía un riesgo significativamente mayor en comparación con pacientes negativos para TnT con bajos niveles de PAPP-A (razón de probabilidades ajustadas 2,72 [1,25 - 5,89]; P = 0,009) (figura 20a). A diferencia de esto, los pacientes positivos para TnT padecieron un elevado riesgo cardiovascular que es independiente de los niveles de PAPP-A en plasma. El valor predictivo de PAPP-A también se observó para un valor umbral reducido de 0,01 ug/l para TnT (razón de probabilidades ajustadas 3,97 [1,24 - 12,68]; P = 0,016). En pacientes que eran negativos tanto para TnT como para sCD40L, PAPP identificó un subgrupo que padeció un elevado riesgo cardiovascular durante los 6 meses de seguimiento (figura 20b). Para deducir adicionalmente una significancia pronóstica potencialmente independiente de los marcadores bioquímicos individuales se realizó un análisis de regresión multifactorial logística escalonado que incluyó los marcadores bioquímicos TnT, VEGF, hsCRP, PAPP-A, IL-10 y sCD40L, así como características iniciales, que dieron como resultado un valor predictivo significativo en un modelo monofactorial. Para los criterios de valoración muerte e infarto de miocardio no fatal en el seguimiento de 30 días y de 6 meses, ninguno de los factores de riesgo establecidos era una variable independiente después de que los marcadores bioquímicos dicotomizados TnT, hsCRP y sCD40L se introdujeran en el modelo (tabla 6). Por tanto, el análisis multifactorial escalonado se limitó a marcadores bioquímicos. TnT (P = 0,008) y PAPP-A (P = 0,007) permanecieron como variables independiente significativas del desenlace del paciente, mientras que hsCRP perdió la significancia después de que PAPP-A se introdujera en el modelo (P = 0,003 sin PAPP-A; P = 0,16 después de introducir PAPP-A) (tabla 7; etapa I). PAPP-A quedó como una variable independiente significativa del desenlace del paciente después de la inclusión de la citocina antiinflamatoria IL-10 (tabla 7; etapa II; P = 0,006) y después de la inclusión de sCD40L como un marcador de la activación plaquetaria (tabla 7; etapa III; P = 0,015). Después de la inclusión de VEGF como marcador de isquemia del miocardio, TnT perdió su valor predictivo para el desenlace en 6 meses (tabla 7; etapa IV; P = 0,24 después de la inclusión de VEGF frente a
P = 0,16 antes de la inclusión de VEGF), mientras que PAPP-A quedó como una variable independiente significativa (P = 0,014).

La determinación simultánea de biomarcadores con distintos perfiles patofisiológicos mejora espectacularmente la estratificación del riesgo en pacientes con SCA. Debido a que los niveles de PAPP-A, PlGF y sCD40L son relativamente estables y no son necesarias condiciones de muestras específicas para PAPP-A, PlGF y sCD40L, estos marcadores parecen adecuados para el uso clínico rutinario. Aunque permanecen las limitaciones inherentes para marcadores que no son específicos para las arterias coronarias y/o el miocardio, PAPP-A, PlGF y sCD40L pueden representar una herramienta importante para la estratificación diagnóstica y terapéutica de pacientes con SCA sin indicaciones de necrosis del miocardio.

TABLA 5 Características iniciales según el estado de PAPP-A

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TABLA 6 Modelo de regresión multifactorial de riesgos instantáneos proporcionales de Cox para infarto de miocardio mortal y no mortal en el plazo de los 6 primeros meses del examen de seguimiento

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TABLA 7 Examen de marcadores múltiples - modelo de regresión multifactorial/logística escalonado para infarto de miocardio mortal y no mortal en el plazo de los 6 primeros meses del examen de seguimiento

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Claims (25)

1. Procedimiento para el análisis de muestras en relación con enfermedades cardiovasculares agudas, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:

(a) poner a disposición una muestra biológica que va examinarse de un sujeto;

(b) determinar la concentración del marcador PlGF en la muestra,

(c) dado el caso, determinar la concentración de al menos otro marcador seleccionado de ligando CD40 soluble (sCD40L), PAPP-A, troponina T (TnT), MPO, NT-proBNP, VEGF, BNP y otros marcadores inflamatorios, y

(d) comparar el/los resultado/s obtenido/s para la muestra que va a examinarse con valores de referencia y/o los valores de muestras de referencia.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra que va a examinarse y/o la muestra de referencia procede de un ser humano.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra que va a examinarse se selecciona del grupo compuesto por sangre periférica o fracciones de la misma y suspensiones de cultivo celular o fracciones de las mismas.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la muestra que va a examinarse es plasma sanguíneo o suero sanguíneo.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que a la sangre periférica se le añade un anticoagulante, especialmente heparina.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los otros marcadores inflamatorios se seleccionan de CRP/(hs)CRP y IL-10.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los marcadores analizados y las combinaciones de estos se seleccionan de PlGF; PlGF + TnT; sCD40L + PlGF; PAPP-A + PlGF; sCD40L + PlGF + TnT; PAPP-A + PlGF + TnT; sCD40L + PAPP-A + PlGF; y sCD40L + PAPP-A + PlGF + TnT.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, que comprende además el análisis de al menos uno de los marcadores MPO, NT-proBNP, BNP, CRP/(hs)CRP y IL-10.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la determinación de la concentración se realiza mediante un procedimiento inmunológico mediante moléculas que se unen a los marcadores.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las moléculas que se unen a los marcadores se seleccionan del grupo compuesto por anticuerpos anti-marcadores o partes de los mismos y receptores de marcadores o partes de los mismos.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que los anticuerpos, partes o fragmentos de los mismos comprenden anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos Fab, fragmentos scFv y diacuerpos.

12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que los marcadores y/o las moléculas que se unen a los marcadores se presentan en disolución o inmovilizados en matrices.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12, en el que las moléculas que se unen a los marcadores están acopladas a uno o varios grupos de detección del grupo compuesto por tioisocianato de fluoresceína, ficoeritrina, una enzima y perla magnética.

14 Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 13, en el que las moléculas que se unen a los marcadores se detectan con un anticuerpo al que están unidas una o varias moléculas de detección.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 14, en el que los procedimientos inmunológicos se seleccionan del grupo compuesto por inmunoensayo enzimático tipo sándwich, ELISA e inmunoensayos en fase sólida.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, en el que las enfermedades cardiovasculares se seleccionan del grupo compuesto por angina de pecho inestable, infarto de miocardio, síndrome cardíaco agudo, enfermedad de las arterias coronarias e insuficiencia cardíaca.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el valor umbral para los resultados obtenidos de la muestra que va a examinarse es de 27,0 ng/l de PlGF en suero o plasma.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el valor umbral para los resultados obtenidos de la muestra que va a examinarse es de 10,0 \mug/l de CRP/(hs)CRP en suero o plasma.

19. Uso de un kit diagnóstico que comprende al menos un anticuerpo para detectar PlGF en una muestra de un paciente y agentes para la posterior cuantificación de PlGF, dado el caso junto con otros componentes y/o coadyuvantes, para el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades cardiovasculares agudas y/o para la supervisión de su terapia.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que el kit comprende anticuerpos indicadores de ratón policlonales marcados con oro, anticuerpos de detección policlonales biotinilados y un dispositivo de prueba que comprende una tela no tejida de fibra de vidrio.

21. Uso del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 18 para el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades cardiovasculares agudas y/o para la supervisión de su terapia.

22. Uso del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 18 para la identificación de un subgrupo de pacientes con bajos niveles de CRP/(hs)CRP en suero o plasma que padecen un riesgo cardíaco significativamente elevado.

23. Uso según la reivindicación 21, en el que la terapia comprende la administración de estatinas y/o inhibidores del receptor de la glucoproteína IIb/III.

24. Uso según la reivindicación 21, en el que la terapia comprende la administración de un agente antiinflamatorio y un tratamiento quirúrgico, especialmente una dilatación con globo.

25. Uso del procedimiento según la reivindicación 18 para diferenciar entre grupos de riesgo con un nivel de CRP/(hs)CRP en suero de \leq 10,0 \mug/l en suero o plasma.

26. Uso del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 18 para diferenciar entre pacientes que reaccionan o no reaccionan a una terapia con abciximab.