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Die Erfindung betrifft einen Marker
für die
Aktivierung von Blutplättchen
als Werkzeug zur Diagnose von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen,
deren Prognosse und als ein Werkzeug, das die Auswahl von Wirkstoffen
zur Behandlung solcher Erkrankungen erleichtert.
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Eine Thrombusbildung im Koronargefäß ist das
auslösende
Ereignis einer instabilen koronaren Herzerkrankung. Die zentrale
Rolle der Plättchenaktivierung
wird bei Patienten mit einer instabilen koronaren Herzerkrankung
zusätzlich
noch durch Thromboxan- und Prostaglandin-Metaboliten, die von den Plättchen freigesetzt
werden, gefördert.
Deshalb ist die Plättchenaktivierung
ein allgemeines therapeutisches Ziel. Bisher haben derartige Therapien
die Verwendung von Aspirin, Tienopyridinen und einem direkten Glycoprotein
IIb/IIIa-Inhibitor umfaßt.
Allerdings konnte ein zuverlässiger
biochemischer Marker der Plättchenaktivierung
bis heute nicht identifiziert werden. Ergebnisse mit P-Selektin,
dem bisher aussichtsreichsten Marker für eine Plättchenaktivierung, sind bis
heute kontrovers.
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Inzwischen mehren sich Hinweise darauf,
daß das
CD40-CD40L-System eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von
Patienten mit einer instabilen koronaren Herzerkrankung spielt.
Außer
in der zellassoziierten Form tritt CD40L auch in einer löslichen,
biologisch vollständig
aktiven Form, nämlich
sCD40L, auf. sCD40L wird von stimulierten Lymphozyten abgestoßen und
auf Plättchenstimulation
hin aktiv freigesetzt. sCD40L wirkt pro-imflammatorisch auf Endothelzellen
und fördert
die Koagulation, indem Monozyten und Endothelzellen zur Expression
von Gewebefaktoren veranlaßt
werden. Darüber
hinaus enthält
sCD40L eine KGD-Sequenz, ein bekanntes Bindungsmotiv, das für das vorherrschende
Plättchen-Integrin αIIbβ3 spezifisch ist.
CD40L ist tatsächlich
ein αIIβ3-Ligand,
ein Plättchenagonist,
und notwendig für
die Stabilität
von arteriellen Thromben. In Serum von Patienten mit akuten Koronarsyndromen
ist eine Erhöhung
von sCD40L nachweisbar. Es wurde berichtet (Schonbeck U, Varo N,
Libby P, Buring J, Ridker PM. Circulation 2001; 104: 2266–8), daß scheinbar
gesunde Frauen, die erhöhte
Plasmakonzentrationen an sCD40L aufwiesen, zugleich ein erhöhtes Risiko
für kardiovaskuläre Ereignisse
trugen.
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Neuere Befunde zeigen, daß eine Ruptur
von Plaques und die anschließende
Bildung eines Thrombus bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen
zu einer Aktivierung der Exposition von CD40L in zirkulierenden Plättchen führen kann
(Lee Y, Lee WH, Lee SC, Ahn KJ, Choi YH, Park SW, Seo JD, Park JE.
Cardiology. 1999; 92: 11–6).
Auch wurden erhöhte
Konzentrationen an sCD40L bei Patienten mit Angina nachgewiesen,
wobei die Konzentrationen bei Patienten mit instabiler Angina besonders
hoch waren (Aukrust P, Muller F, Ueland T, Berget T, Aaser E, Brunsvig
A, Solum NO, Forfang K, Froland SS, Gullestad L. Cirulation 1999;
10: 614–20). Diese
Befunde legen nahe, daß eine
CD40L-CD40-Interaktion eine wichtige Rolle bei der Pathogenese atherosklerotischer
Prozesse und der Entwicklung koronarer Syndrome spielt.
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Die Etablierung der korrekten Diagnose,
verbunden mit einer geeigneten Behandlung von Patienten mit akuten
koronaren Syndromen, die nicht mit einer Hebung der ST-Strecke einhergehen,
kann sehr mühsam sein.
Der Ausschluß von
akuten Myokardinfarkten nach heutigen Standards ist nicht zufriedenstellend.
In den letzten Jahren hat eine Konzentration auf die Risikostratifizierung
und Steuerung der Behandlung stattgefunden mit dem Ziel, Patienten
zu identifizieren, bei denen das Risiko besteht, lebensbedrohliche
kardiologische Ereignisse zu entwickeln, und die vor allem von verbesserten
therapeutischen und intervenierenden Strategien profitieren (Hamm
CW, Bertrand M, Braunwald E. Lancet 2001; 358: 1533–8). Das
EKG hat in dieser Hinsicht nur begrenzte prognostische Relevanz,
da bedeutende Abnormitäten
selten sind und ihr Nachweis wenig empfindlich und spezifisch ist
(Kaul P, Fu Y, Chang WC, et al., J Am Coll Cardiol 2001; 38: 64–71 und
Savonitto S, Ardissino D, Granger CB, et al. JAMA 1999; 281: 707–13). Deshalb
haben sich Marker einer Nekrose von Myokardzellen, vor allem kardiale
Troponine, zu wertvollen Werkzeugen bei der Evaluierung von Patienten
mit akuten koronaren Syndromen entwickelt (Hamm CW, Braunwald E.
Circulation 2000; 102: 118–22).
Troponine sind allerdings nicht aktiv an der Pathophysiologie akuter
koronarer Syndrome beteiligt, sondern stellen eher eine Art Surrogat-Marker
für die
fragile Thromusbildung dar (Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B,
Venge P, Wallentin L. J Am Coll Cardio. 2001; 38: 979–86, Heeschen
C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML. Circulation 1999; 100:
1509–14;
Benamer H, Steg PG, Benessiano J, et al. Am Heart J 1999; 137: 815–20).
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Marker einer Plättchenaktivierung, welche die
Aktivität
der Erkrankung bestimmen, möglichst
bevor eine Myokardnekrose auftritt, könnten wichtige zusätzliche
Informationen für
die diagnostische und therapeutische Stratifizierung bei Patienten
mit akuten Koronarsyndromen darstellen. In zunehmendem Maße gibt
es Beweise dafür,
daß auch
der CD40-Ligand (CD40L, kürzlich
umbenannt in CD 154) eine wichtige Rolle bei der Krankheitsentwicklung
und der Plaque-Destabilisierung spielt (Mach F, Schonbeck U, Sukhova
GK, Atkinson E, Libby P. Nature 1998; 394: 200–3 und Lutgens E, Gorelik L,
Daemen MJ, et al. Nat Med 1999; 5: 1313–6). Das CD40-CD40L-System
ist bei einer Vielzahl von Leukozyten und nicht-leukozytischen Zellen, einschließlich Endothelzellen
und glatte Muskelzellen (Schonbeck U, Libby P. Cell Mol Life Sci
2001; 58: 4–43),
sowie aktivierten Plättchen,
verbreitet (Henn V, Slupsky JR, Grafe M, et al. Nature 1998; 391:
591–4).
Zusätzlich
zu der zellassoziierten 39-kDa
Form tritt CD40L auch in einer löslichen,
biologisch vollständig
aktiven Form, nämlich sCD40L,
auf (Graf D, Muller S, Korthauer U, van Kooten C, Weise C, Kroczek
RA. Eur J Immunol 1995; 25: 1749–54). sCD40L wird von stimulierten
Lymphozyten abgestoßen
und auf Plättchenaktivierung
hin aktiv freigesetzt (Lee Y, Lee WH, Lee SC, et al. Cardiology
1999; 92: 11–6
und Heran V, Steinbach S, Buchner K, Presek P, Kroczek RA. Blood
2001; 98: 1047–54).
sCD40L wirkt pro-inflammatorisch auf Endothelzellen und fördert die
Koagulation, indem es die Expression von Gewebefaktoren durch Monozyten
(Mach F, Schonbeck U, Bennefoy JY, Pober JS, Libby P. Circulation
1997; 96: 396–9)
und Endothelzellen (Urbich C, Mallat Z, Tedgui A, Clauss M, Zeiher
AM, Dimmeler S. J Clin Invest 2001; 108: 1451–8) induziert. Darüber hinaus
enthält sCD40L
eine KGD-Sequenz (Graf D, Muller S, Korthauer U, van Kooten C, Weise
C, Kroczek RA. Eur J Immunol 1995; 25: 1749–54), ein bekanntes Bindungsmotiv,
das für
das vorherrschende Plättchen-Integrin αIIbβ3 spezifisch
ist (Scarborough RM, Naughton MA, Teng W, et al. J Biol Chem 1993;
268: 1066–73).
Es konnte gezeigt werden, daß CD40L
tatsächlich
einen αIIbβ3-Liganden,
einen Plättchenagonisten,
darstellt und für
die Stabilität
arterieller Thromben notwendig ist (Andre P, Prasad KS, Denis CV,
et al. Nat Med 2002; 8: 247–52).
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Diese Befunde beweisen zwingend,
daß sCD40L
eine wichtige Rolle bei der Pathophysiologie akuter Koronarsyndrome
spielt. Interessanterweise ist eine Erhöhung von sCD40L im Serum von
Patienten mit akuten Koronarsyndromen nachweisbar (Aukrust P, Muller
F, Ueland T, et al. Circulation 1999; 100: 614–20). Es wurde berichtet, daß scheinbar
gesunde Frauen, die erhöhte
Plasmakonzentrationen an sCD40L aufwiesen, ein erhöhtes Risiko
für kardiovaskuläre Ereignisse
trugen (Schonbeck U, Varo N, Libby P, Buring J, Ridker PM. Circulation
2001; 104: 2266–8).
Ziel der vorliegenden Erfindung ist, den Vorhersagewert von sCD40L-Konzentrationen
im Hinblick auf kardiale Ereignisse und die Heilwirkungen des Glycoprotein
IIb/IIIa-Inhibitors Abciximab. bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen
zu untersuchen, wobei die Datenbank der CAPTURE-Studie (c7E3 Anti-Platelet
Therapy in Unstable Refractory Angina) verwendet wurde (CAPTURE.
Lancet 1997; 349: 1429–35).
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Ein zuverlässiger biochemischer Marker
der Plättchenaktiverung
wurde bis heute nicht identifiziert. Im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung wurde sCD40L als ein Marker der Plättchenaktivierung identifiziert
und es zeigte sich, daß die
sCD40L-Plasmakonzentration wichtige und unabhängige Informationen für die diagnostische
und therapeutische Risikostratifizierung bei Patienten mit instabilen
koronaren Herzerkrankungen liefert. Ein erhöhtes Risiko von Herzpatienten
mit hohen sCD40L-Konzentrationen, die standardmäßig therapiert wurden, wurde
durch die zusätzliche
Behandlung mit einem Glycoprotein IIb/IIIa-Inhibitor aufgehoben.
Die Messung von sCD40L bei Patienten mit instabiler koronarer Herzerkrankung
liefert wichtige Einblicke in die Aktivität der Erkrankung, das kardiale
Risiko und die Wirkung einer Behandlung mittels Glycoprotein IIb/IIIa-Hemmung
durch Abciximab.
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Das pro-inflammatorische Zytokin
CD40L wird aus aktivierten Plättchen
freigesetzt. Die lösliche
Form von CD40L, nämlich
sCD40L, ist in Patienten mit akuten koronaren Syndromen vermehrt
vorhanden. Deshalb wurde der prognostische Wert von sCD40L als ein
Marker für
die Plättchenaktivierung
auch im Hinblick auf die therapeutische Wirkung einer Hemmung des
Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptors untersucht.
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Base Line-Werte der sCD40L-Konzentration
machen Informationen von prognostischem Wert bei Patienten mit akuten
koronaren Syndromen unabhängig
vom Auftreten einer Myokardnekrose verfügbar. Darüber hinaus läßt sich
mittels sCD40L die Hochrisikogruppe von Patienten, welche den größten Nutzen
aus einer Anti-Plättchen-Behandlung
mit Abciximab ziehen können,
identifizieren.
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Die vorliegende Studie liefert direkte
Hinweise darauf, daß sCD40L
ein aussagekräftiger
biochemischer Marker einer Plättchen-Aktivierung
ist. Eine Erhöhung
der Konzentration an CD40L identifiziert zuverlässig eine bestimmte Untergruppe
von Patienten mit akuten Koronarsyndromen, die ein hochgradiges
Risiko dafür
tragen, ein kardiales Ereignis zu erleiden, und die den größten Nutzen
von einer Behandlung mit dem Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten Abciximab
haben. Dementsprechend trägt
CD40L nicht nur erheblich zu der Pathophysiologie akuter Koronarsyndrome
bei, sondern stellt einen zuverlässigen
und aussagekräftigen
klinischen Marker zur Verfügung,
mit dessen Hilfe Patienten mit einer hoch risikoreichen Läsionsbildung und/oder
koronaren Thrombose identifiziert werden kann (Andre P, Prasad KS,
Denis CV, et al., Nat Med 2002; 8: 247–52; Andre P., Nannizzi-Alaimo
L, Prasad SK, Phillips DR.; Circulation 2002; 106: 896–9).
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Bei 40,5% der CAPTURE-Patienten lagen
die sCD40L-Konzentrationen in der Zirkulation oberhalb der berechneten
Schwellenkonzentration von 5,0 μg/l.
Diese Patienten mit erhöhten
sCD40L-Konzentrationen trugen ein hochgradiges kardiales Risiko,
eine tödlichen
oder nicht-tödlichen
Myokardinfarkt zu erleiden. Dieses gesteigerte kardiale Risiko bei
Patienten mit hohen sCD40L-Konzentrationen, die ein Placebo erhielten,
war in besonderem Maße
während
der ersten 72 Stunden offensichtlich (5a).
Allerdings entwickelte sich die Häufigkeit der Ereignisse während der
gesamten sechs Monate immer weiter auseinander (5b). sCD40L erwies sich als ein aussagekräftiger prognostischer
Marker, der unabhängig
vom Nachweis einer Myokardnekrose und unabhängig von den Entzündungsmarkern
CRP und TNF-α ebenso
wie von dem Adhäsionsmolekül ICAM-1
ist. In einem Multivarianz-Regressionsmodell
lieferten TnT, CRP und sCD40L zuverlässige prognostische Informationen
(Tabelle 2). Mit Hilfe der sCD40L-Konzentration wurden Patienten
ohne Anzeichen einer Myokardnekrose identifiziert, die ein erhöhtes kardiales
Risiko aufwiesen. Unter Verwendung festgesetzter Schwellenkonzentrationen
für TnT
und CRP sowie einer Einteilung der Patienten anhand der Anzahl kardialer Markern,
die erhöht
waren, wurde festgestellt, daß eine
simultane Abschätzung
dieser drei pathobiologisch unterschiedlichen biochemischen Markern
zum Zeitpunkt, zu dem der Patient vorstellig wird, eine aussagekräftige Vorhersage
des Risikos des Patienten, nachteilige kardiale Ereignisse während der
nachfolgenden sechs Monate zu erleiden, ermöglichte.
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Troponine stellen Marker einer Myokardnekrose
dar, sind jedoch nicht aktiv in die Pathophysiologie akuter Koronarsyndrome
involviert. Sie sind eher Surrogat-Marker für die fragile Thrombus-Bildung
(Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B, Venge P, Wallentin L; J Am
Coll Cardiol 2001; 38: 979–86;
Heeschen C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML; Circulation 1999;
100: 1509–14;
Benamer H, Steg PG, Benessiano J, et al.; Am Heart J 1999; 137:
815–20).
Bei post mortem-Studien an Patienten mit akuten Koronarsyndromen
wurde eine Erosion oder Ruptur der fibrösen Käppchen der atherosklerotischen
Plaques, die der Pathophysiologie zugrunde liegen, identifiziert
(Lindahl B, Diderholm E, Lagerqvist B, Venge P, Wallentin L; J Am
Coll Cardiol 2001; 38: 979–86;
Heeschen C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML; Circulation 1999;
100: 1509–14). Eine
Exposition von Bestandteilen der Plaques, Kollagen und anderen Komponenten
der Gefäßwand führt zu einer
Zunahme des Gefäßtonus und
der Plättchen-Aktivierung
(Farb A, Burke AP, Tang AL, et al.; Circulation 1996; 93: 1354–63; Davies
MJ, Thomas AC; Br Heart J 1985; 53: 363–73; Davies MJ; N. Engl J Med
1997; 336: 1312–4).
Die Thromboembolie einer Koronararterie mit gesteigerter mikrovaskulärer Perfusion
und Nekrose ist ein wesentlicher Bestandteil von akuten Koronarsyndromen
(Heeschen C, van Den Brand MJ, Hamm CW, Simoons ML; Circulation
1999; 100: 1509–14;
Benamer H, Steg PG, Benessiano J, et al.; Am Heart J 1999; 137:
815–20).
Dementsprechend dienen empfindliche Marker für den Nachweis einer kleineren
Verletzung des Myokards, insbesondere Troponine, als Surrogat-Marker
einer arteriellen Thromboembolie, die auf einen aktiven thrombotischen
Prozeß in
der auslösenden
Läsion
zurückzuführen ist.
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Im Gegensatz dazu könnte sCD40L
in mehrfacher Weise direkt in die Pathophysiologie akuter Koronarsyndrome
involviert sein. Jüngste
Hinweise legen nahe, daß CD40L
wesentlich zur Progression einer Atherosklerose und dementsprechend
zu einer Destabilisierung von atherosklerotischen Plaques beiträgt (Mach
F, Schonbeck U, Sukhova GK, Atkinson E, Libby P; Nature 1998; 394:
200–3;
Lutgens E, Gorelik L, Daemen MJ, et al.; Nat Med 1999; 5: 1313–6). Es
wurde vorgeschlagen, daß CD40/CD40L-Interaktionen
Komplikationen durch Atherome fördern,
indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Wachstumsfaktoren,
Matrix-Metalloproteinasen und Prokoagulantien in verschiedenen Atherom-assoziierten
Zelltypen induziert (Schonbeck U, Libby P.; Cell Mol Life Sci 2001;
58: 4–43;
Henn V, Slupsky JR, Grafe M, et al.; Nature 1998; 391: 591–4; Henn
V, Steinbach S, Buchner K, Presek P, Kroczek RA; Blood 2001; 98:
1047–54;
Mach F, Schonbeck U, Bonnefoy JY, Pober JS, Libby P.; Circulation
1997; 96: 396–9;
Miller DL; Yaron R, Yellin MJ; J Leukoc Biol 1998; 63-373-9; Kotowicz
K, Dixon GL, Klein NJ, Peters MJ, Callard RE; Immunology 2000; 100:
441–8). Neuere
Studien haben gezeigt, daß neben
Leukozyten und nicht-leukozytischen Zellen einschließlich Granulozyten,
mononukleäre
Phagozyten, Endothelzellen und Zellen der glatten Muskulatur (Schonbeck
U, Libby P; Cell Mol Life Sci 2001; 58: 4–43) aktivierte Plättchen große Mengen
an sCD40L produzieren und freisetzen (Henn V, Steinbach S, Buchner
K, Presek P, Kroczek RA; Blood 2001; 98: 1047–54). Eine andere Studie zeigt, daß ein Kardiopul monar-Bypass
einen Anstieg der Konzentration von sCD40L im Plasma verursacht,
der mit einer Abnahme des CD40L-Gehalts in Plättchen korrespondiert, was
nahe legt, daß sCD40L
primär
aus den Plättchen
stammt und zu den thrombotischen Komplikationen, die mit einem derartigen
Bypass verbunden sind, beitragen könnte (Nannizzi-Alaimo L, Rubenstein
MH, Alves VL, Leong GY, Phillips DR, Gold HK; Circulation 2002,
105: 2849–2854).
Auch wurde festgestellt, daß sCD40L
positiv mit löslichem
P-Selektin im Plasma und 11-Dehydro-Thromboxan B2-Konzentrationen
im Urin korreliert (Cipollone F, Mezzetti A, Porreca E, et al.; Circulation
2002; 106: 399–402).
Darüber
hinaus zeigten experimentelle Untersuchungen, daß CD40L für eine Stabilisierung arterieller
Thromben erforderlich ist (Andre P, Prasad KS, Denis CV et al.;
Nat Med 2002; 8: 247–52).
Die vorliegende Studie liefert jetzt direkten Hinweis darauf, daß CD40L
tatsächlich
ein Marker der Plättchen-Aktivierung
ist. Die Plättchen-Aktivierung, bestimmt
durch Durchflußzytometrie
bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen, korrelierte signifikant
mit den Serumkonzentrationen an sCD40L (7.
Interessanterweise erwies sich sCD40L als unabhängiger Vorhersagefaktor einer
Plättchen-Aktivierung
mit größter Aussagekraft.
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie etablieren sCD40L-Konzentrationen als
hoch informativen prognostischen Marker bei Patienten mit akuten
Koronarsyndromen, die gefährdet
sind, eine Thrombose zu erleiden. Diese Befunde werden durch die
Tatsache unterstützt,
daß eine
Hemmung des Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptors durch Abciximab das
erhöhte
Risiko bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen und erhöhten sCD40L-Konzentrationen
aufhob. Während
Troponin die Neigung eines Thrombus, eine Embolie hervorzurufen
und zu Myokardnekrose zu führen,
positiv anzeigt, spiegeln erhöhte
Konzentrationen an sCD40L bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen
die thrombotische Aktivität
der auslösenden
Läsion,
Plättchen
zu rekrutieren und aktivieren, wider.
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In einer früheren Analyse einer Untergruppe
von Patienten der CAPTURE-Studie wurde gezeigt, daß eine zusätzliche
Behandlung mit dem Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten Abciximab
das erhöhte
Risiko Troponin-positiver Patienten auf das Maß von Troponin-negativen Patienten
reduziert (Hamm CW, Heeschen C, Goldmann B, et al.; N Engl J Med
1999; 340: 1623–9).
Diese Patienten stellen ungefähr
1/3 der Patienten mit akuten Koronarsyndromen dar (Hamm CW, Braunwald
E; Circulation 2000; 102: 118–22;
Antman EM, Tanasijevic MJ, Thompson B, et al; N Engl J Med 1996;
335: 1342–9;
Ohman EM, Armstrong PW, Christenson RH, et al.; N Engl J Med 1996;
335: 1333–41;
Hamm CW, Ravkilde J, Gerhardt W, et al.; N Engl J Med 1992; 327:
146–50;
Hamm CW, Goldmann BU, Heeschen C, Kreymann G, Berger J, Meinertz
T; N Engl J Med 1997; 337: 1648–53). Ähnliche
Befunden hin sichtlich Troponin T und Troponin I ergaben sich später aus
anderen Studien (Newby LK, Ohman EM, Christenson RH, et al.; Circulation
2001; 103: 2891–6;
Januzzi JL, Chae CU, Sabatine MS, Jang IK; J Thromb Thrombolysis
2001; 11: 211–5;
Heeschen C, Hamm CW, Goldmann B, Deu A, Langenbrink L, White HD;
Lancet 1999; 354: 1757–62),
und anschließend
wurden Troponine in die neuen Richtlinien aufgenommen als Teil der
Risikostratifizierung bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen (Hamm
CW, Bertrand M, Braundwald E; Lancet 2001; 358: 1533–8; Braunwald
E, Maseri A, Armstrong PW, et al.; Eur Heart J 1998; 19: D22–30). In
der vorliegenden Studie wird gezeigt, daß ein derartiger ausgeprägt positiver
Effekt einer Anti-Plättchen-Therapie
auch bei Patienten mit erhöhten
sCD40L-Konzentrationen
offenkundig ist. Die vorliegenden Analyse legt nahe, daß Patienten
mit akutem Koronarsyndromen, die erhöhte Konzentrationen an sCD40L
aufweisen, wirksam durch den Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten
Abciximab stabilisiert werden (5a, b). Bei einer berechneten Schwellenkonzentration
von 5,0 μg/l
wurde eine abrupte Änderung
des Risikoquotienten von 0,87 für
das zweite Quintil und 1,12 für
das dritte Quintil hin zu signifikant niedrigeren Werten von 0,36
für das
vierte Quintil und 0,38 für
das fünfte
Quintil beobachtet (4). Interessanterweise
lieferten die Konzentrationen an TnT und sCD40L unabhängige Vorhersagewerte
im Hinblick sowohl auf das Risiko ischämischer Ereignisse als auch
auf die positive Wirkung einer Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptor-Hemmung
durch Abciximab. Patienten ohne Anzeichen einer Myokardverletzung
(Troponin-Erhöhung
fehlt), die jedoch gesteigerte Konzentrationen an sCD40L aufwiesen,
zogen erheblichen Nutzen aus der Behandlung mit dem Glycoprotein
IIb/IIIa-Inhibitor Abciximab. Folglich zogen Patienten mit hohem
Risiko zu einer Thrombose der Koronargefäße, belegt entweder durch eine
Erhöhung
der sCD40L-Konzentration oder einer Erhöhung der TnT-Konzentration,
die schließlich
54% der insgesamt in die CAPTURE-Studie involvierten Patienten ausmachten,
einen deutlichen Vorteil aus der Behandlung mit Abciximab mit einem
Risikoquotienten von 0,38 [0,21–0,72];
p < 0,001).
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Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die vorliegende
Studie die bedeutende und unabhängige
Rolle von sCD40L als einen Marker der Plättchenaktivierung für die diagnostische
und therapeutische Risikostratifizierung dokumentiert. Das erhöhte kardiale
Risiko von Patienten mit hohen sCD40L-Konzentrationen, die eine
Standardtherapie mit Heparin und Aspirin erhielten, wurde durch
den Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptorantagonisten Abciximab aufgehoben.
Die kombinierte Verwendung von Troponinen und sCD40L, welche beide
wesentliche Bestandteile der Pathophysiologie bei Patienten mit
akuten Koronarsyndromen darstellen, liefert wichtige Einblicke in
die Aktivität
der Erkrankung, dem kardiologischen Risiko und der Wirksamkeit einer
Behandlung mittels Glycoprotein IIb/IIIa-Hemmung durch Abciximab,
welche der Verwendung eines einzelnen Markers überlegen ist.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem das Risiko, ein kardiovaskulär nachteiliges
Ereignis, bedingt durch Koronarthrombos mit Hilfe eines individuellen
Risikoprofils abgeschätzt
werden kann. Dies soll durch die Messung der Konzentration eines
Markers der Plättchenaktivierung erfolgen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist weiterhin, ein Verfahren
zur Evaluation der Wahrscheinlichkeit, daß eine Behandlung mit einem
Wirkstoff zur Hemmung der Plättchenaktivierung
von Vorteil ist, zu entwickeln. Mit Hilfe dieses Verfahren soll
der behandelnden Arzt besser als bisher in die Lage versetzt werden, geeignete
Maßnahmen
auswählen
zu können,
um den Patienten positiv zu beeinflusssen, ein nachteiliges Ereignis
zu verhindern oder zumindest in seiner Schwere für den betroffenen Patienten
zu vermindern.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird durch ein Verfahren zur Analyse von Proben in Zusammenhang
mit kardiovaskulären
Erkrankungen gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren
umfaßt
die Schritte aus: (a) Gewinnung einer zu untersuchenden Probe; (b)
Inkubation der Probe mit einem oder mehreren Molekülen, die
spezifisch an sCD40L binden; (c) Nachweisen und/oder quantifizieren
von löslichem
CD40-Ligand (sCD40L) in der Probe unter Verwendung immunologischer
Methoden; und (d) Vergleich des für die zu untersuchende Probe
erhaltenen Ergebnisses mit einem Referenzwert und/oder dem Ergebnis
einer Referenzprobe.
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Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren,
wobei die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe aus
einem Säugetier,
insbesondere aus dem Menschen, stammen. Weiter bevorzugt ist ein
erfindungsgemäßes Verfahren,
wobei die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus peripherem Blut oder Fraktionen davon
und Zellkultur-Suspensionen oder Fraktionen davon. Bevorzugt ist
weiterhin, daß die
untersuchende Probe und/oder Referenzprobe Blutserum oder Blutplasma
ist. Besonders bevorzugt ist peripheres Vollblut als zu untersuchende
Probe und/oder Referenzprobe.
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Gemäß einem weiteren Aspekt des
erfindungsgemäßen Verfahrens
kann die zu untersuchende Probe und/oder die Referenzprobe vorbehandelt
sein, wobei dem peripheren Blut z.B. ein Gerinnungshemmer, insbesondere
Heparin, zugesetzt wird.
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Ein wesentlicher Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahren
ist die Inkubation der Probe mit einem oder mehreren Molekülen, die
spezifisch an sCD40L oder einen Teil davon, z.B. die KGD-Sequenz,
binden. Diese Moleküle
können
aus einer sehr großen
Vielzahl von für
sCD40L spezifischen Molekülen
ausgewählt sein.
Bevorzugt ist, daß die
an sCD40L bindenden Moleküle
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, die spezifisch gegen
sCD40L oder gegen Teile davon gerichtet sind, oder Teilen oder Fragmenten davon
und einem sCD40L-Rezeptor oder Teilen davon oder einem Integrin,
z.B. dem Plättchen-Integrin αIIbβ3, oder Teilen
davon. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Antikörper, Teile
oder Fragmente davon polyklonale Antikörpern, monoklonale Antikörpern, Fab-Fragmente,
scFv-Antikörper
und Diabodies umfassen.
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Gemäß eines weiteren Aspekts des
Verfahrens der vorliegenden Erfindung können Komponenten des Verfahrens
an eine feste Phase gebunden vorliegen, somit können die an einen Marker bindenden
Moleküle in
Lösung
oder Matrix-immobilisiert vorliegen. Als Matrices können eine
Vielzahl von dem Fachmann bekannten Materialien verwendet werden,
wie zum Beispiel Harz-Matrices und/oder herkömmliche Säulenmatrices. Besonders bevorzugt
ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren,
bei dem die an einen Marker bindenden Moleküle an eines oder mehrere Detektionsmoleküle aus der
Gruppe bestehend aus Fluoresceinthioisocyanat, Phycoerythrin, Enzymen
(zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase) und magnetisches Bead gekoppelt
sind.
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Gemäß einem weiteren Aspekt des
erfindungsgemäßen Verfahrens
können
die an sCD40L bindenden Moleküle
mit einem Antikörper,
an den eine oder mehrere Detektionsmoleküle gekoppelt sind, nachgewiesen werden.
Es handelt sich somit um einen indirekten Nachweis der Bindung des
Moleküls.
Solche zweistufigen Nachweise sind dem Fachmann zum Beispiel aus
der anti-Antikörper-Nachweistechnik
bestens bekannt.
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Gemäß einem weiteren Aspekt des
Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung können
zur Analyse der Probe immunzytologischen Verfahren angewandt werden.
Dabei sind alle Verfahren geeignet, die eine spezifische Bestimmung
anhand der sCD40L/Molekül-Interaktion
erlauben. Bevorzugt sind Verfahren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend
aus Sandwich-Enzym-Immuntest, ELISA und Festphasen-Immuntests.
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Die für die zu untersuchende Probe
ermittelten Ergebnisse werden üblicherweise
mit einer Referenzprobe verglichen. Welche Probe als Refernzprobe
dienen kann, wird insbesondere von der Art der untersuchten Probe
und der Krankengeschichte des Individuums, aus dem die zu untersuchende
Probe stammt, abhängen.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren,
bei dem die Referenzprobe aus einem oder dem Mittelwert mehrerer
Säugetiere
stammt, in dem/in denen eine kardiovaskuläre Erkrankung ausgeschlossen
wurde. Dies muß aber
nicht zwangsläufig
so sein, wenn z.B. das Fortschreiten einer Erkrankung bestimmt werden
soll, kann auch eine „alte" Probe desselben
Patienten als Referenzprobe verwendet werden. Dem Fachmann ist offensichtlich,
welche Proben als Referenzprobe für das erfindungsgemäße Verfahren
geeignet sind.
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Gemäß einem weiteren bevorzugten
Verfahren beträgt
der Referenzwert und/oder das Ergebnis einer Referenzprobe ≤ 5,0 μg/l. Besonders
bevorzugt beträgt
der Referenzwert und/oder das Ergebnis einer Referenzprobe ≤ 4,7 μg/l.
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Gemäß einem weiteren Aspekt des
Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung können
die zu diagnostizierenden und/oder prognostizierenden und/oder deren
Therapie zu überwachenden
kardiovaskulären Erkrankungen
ausgewählt
sein aus der Gruppe bestehend aus stabiler und instabiler Angina,
Myokardinfarkt, aktuem Herzsyndrom, koronarer Arterienerkrankung
und Herzinsuffizienz. Es soll jedoch nicht ausgeschlossen weren,
daß sich
das erfindungsgemäße Verfahren
noch für
weitere kardiologische Erkrankungszustände eignet und anwenden läßt.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft einen diagnostischen Kit, wobei der Kit Mittel zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
unter Umständen
zusammen mit weiteren Komponenten und/oder Hilfsstoffen umfaßt. Solche
Mittel sind bevorzugterweise mindestens ein Antikörper zum
Nachweis von sCD40L und Mittel zur anschließenden Quantifizierung von
sCD40L. Der Kit kann außerdem
andere Komponenten und/oder Enzyme zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden
Erfindung, z.B. Gebrauchsanweisungen zur Interpretation der Ergebnisse
des Tests im Hinblick auf das Risikoprofil des Patienten und entsprechende
Gegenmaßnahmen
und Therapievorschläge
enthalten.
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Bevorzugt ist, das erfindungsgemäßes Verfahren
mit Hilfe eines einen diagnostischer Kits durchzuführen, der
goldmarkierte polyklonale Maus-Indikatorantikörper, biotinylierte poly klonale
Nachweisantikörper
und eine Testvorrichtung, umfassend ein Fiberglas-Vlies, umfaßt.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft somit die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Diagnose und/oder Prognose kardiovaskulärer Erkrankungen und/oder zur Überwachung
von deren Therapie. Dies geschieht durch die quantitative und kritische
Bestimmung von sCD40L. Aufgrund des daraufhin erstellbaren Risiokoprofils
können
dann geeignete Gegenmaßnahmen
durch den behandelnden Arzt durchgeführt werden, um den Patienten
positiv zu beeinflussen und das nachteilige Ereignis zu verhindern oder
zumindest in seiner Schwere für
den betroffenen Patienten zu vermindern. Eine solche Therapie kann erfindungsgemäß die Verabreichung
von Inhibitoren des Glycoprotein IIb/III-Rezeptors insbesondere
Absiximab umfassen. Dem Fachmann sind jedoch weitere mögliche Therapien
bekannt, um kardiovaskuläre
Erkrankungen zu therapieren, die nach herkömmlichen Schemata erfolgen
können.
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Die Erfindung soll nun im folgenden
anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren
näher erläutert werden,
ohne jedoch dadurch begrenzt zu werden. In den Figuren zeigt:
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1 den
Zusammenhang zwischen der Serumkonzentration an sCD40L und der Häufigkeit
eines kardialen Ereignisses nach 24 Stunden, 72 Stunden, 30 Tagen
und 6 Monaten in der Patientengruppe, die ein Placebo erhalten hatte
(n = 544). Die Patienten wurden in 5 Quintile eingeteilt. Der Bereich
der sCD40L-Konzentrationen war wie folgt: 0,003–1,9 μg/l (Quintil 1), 1,9–3,5 μg/l (Quintil
2), 3,5–5,0 μg/l (Quintil
3), 5,0–6,3 μg/l (Quintil
4) und > 6,3 μg/l (Quintil
5). p < 0,001 nach
72 Stunden, 30 Tagen und 6 Monaten.
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2 eine
Darstellung nach Kaplan-Meier der kumulativen Inzidenz von Myokardinfarkt
mit tödlichem oder
nicht-tödlichem
Ausgang nach 72 Stunden (a) und 6 Monaten (b) gemäß den Base
Line-Werten der sCD40L-Konzentration (diagnostischer Schwellenwert
5,0 μg/l)
in der Placebo-Gruppe (n = 544).
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3 den
angepaßten
Risikoquotienten (einschließlich
95% Vertrauensintervall) bei der Behandlung mit Abciximab gemäß den sCD40L-Quintilen.
Eine erfolgreiche Behandlung wird definiert als Reduktion von tödlichen
oder nicht-tödlichen
Myokardinfarkten im Verlauf von 6 Monaten. Ein Risikoquotient < 1,0 gibt die erfolgreiche
Behandlung mit Abciximab im Vergleich zur Placebo-Behandlung an.
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4 eine
Kalpan-Meier-Darstellung von Mortalität und nicht-tödlichem
Myokardinfarkt 72 Stunden (a) und 6 Monate (b) gemäß der sCD40L-Konzentration
bei Patienten, die entweder ein Placebo oder Abciximab erhalten
hatten.
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5 die
Plättchenaktivierung
in Abhängigkeit
von der Aktivität
der Erkrankung. Die Plättchenaktivität, bestimmt
durch Monozyt-Plättchen-Aggregate,
war bei Patienten mit stabiler coronarer Herzerkrankung signifikant
erhöht.
Eine weiterere signifikante Zunahme der Plättchenaktivierung wurde in
Patienten mit akuten Koronarsyndromen beobachtet.
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6,
daß die
sCD40L-Serumkonzentrationen eng mit dem Ausmaß der Plättchenaktiverung bei Patienten
mit und ohne akute Koronarsyndrome korrelieren. Die unterbrochen
dargestellten Linien teilen die Patienten in Tertile gemäß der Plättchenaktivierung
(< 15%, 15%–30%, > 30%) bzw. sCD40L-Serumkonzentrationen
(< 2,5 g/l; 2,5–4,5 μg/l; > 4,5 μg/l) ein.
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Beispiele
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Material und Methoden
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1. Patienten
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Die CAPTURE-Studie registriert 1,265
Patienten mit refraktärer
instabiler Angina (61% männlich,
im Alter von 61 [48–72,
95% Vertrauensintervall]) zwischen Mai 1993 und Dezember 1995. Alle
CAPTURE-Patienten klagten über
wiederkehrende Brustschmerzen im Ruhezustand, assoziiert mit EKG-Änderungen
während
einer Behandlung mit intravenösem
Heparin und Glycerintrinitrat im Mittel für 14 Stunden. Die gesamte Patientenpopulation
wurde einer Koronarangiographie unterzogen, bevor das Auftreten
einer deutlichen koronaren Arterienerkrankung mit auslösenden Läsionen ≥ 17%, die
für eine
Angioplastie geeignet waren, dokumentiert wurden. Die Patienten
wurden einer Behandlung durch Abciximab oder Placebo zufallsverteilt
zugeordnet. Die Behandlung wurde innerhalb von 2 Stunden nach der
Zuordnung begonnen. Bei allen Patienten waren innerhalb von 18 bis
24 Stunden nach Beginn der Behandlung koronare Interventionen vorgesehen (CAPTURE.
Lancet 1997; 349: 1429–35).
Es wurden im Mittel 8,7 (3,6–11,3)
Stunden nach Einsetzen der Symptome Blutproben (n = 1096) gewonnen
(Base Line).
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Primäre Endpunkte der Studie waren
Mortalität,
Myokardinfarkt oder die Notwendigkeit zu sofortiger Intervention
(Angioplastie, Bypass-Operationen der Koronararterie) aufgrund einer
Instabilität
während
30 Tagen oder 6 Monaten. Bei Patienten, die während des Krankenhausaufenthalts
einen Herzinfarkt erlitten hatten, wurde ein solcher diagnostiziert,
wenn ihre Werte der Kreatinkinase-Enzymaktivität in mindestens zwei Proben mehr
als dreimal so hoch waren wie die obere Grenze des Normalbereichs
oder wenn ihr EKG neue deutliche Q-Zacken in mehr als zwei aufeinanderfolgenden
Intervallen aufwiesen. Diese strikte Definition wurde gewählt, um
jeden unbedeutend geringen Anstieg der Kreatinkinase nach PTCA auszuschließen. Bei
Patienten mit einem Myokardinfarkt nach der Entlassung wurde ein
solcher definiert, wenn ihre Werte der Kreatinkinase-Enzymaktivität mehr als
doppelt so hoch waren, wie die obere Grenze des Normalbereichs oder
wenn ihr EKG neue deutliche Q-Zacken in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden
Intervallen aufwies. Der sekundäre
Endpunkt war die symptomatische koronare Restenose der behandelten
Läsion
mit einem Stenosedurchmesser ≥ 70%
und die Notwendigkeit zu wiederholter Revaskularisierung während der
nachfolgenden 6 Monate.
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2. Validierung von Patienten
mit akutem Brustschmerz
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Eine separate Gruppe von 626 Patienten
mit Brustschmerz (161 Frauen und 465 Männer, mittleres Alter 61 [38–82] Jahre),
die in fortlaufender Reihe mit akutem Brustschmerz, der weniger
als 12 Stunden (im Mittel 5,1 [2,1–10,4] Stunden) andauerte,
in die Notaufnahme kamen. Nicht berücksichtigt wurden Patienten
mit einer charakteristischen ST-Hebung im Basis-EKG bzw. einem dokumentierten
akuten Myokardinfarkten während
der vorangegangenen 2 Wochen. Blutproben wurden zum Zeitpunkt der
Aufnahme (vor Beginn der Behandlung) und 4 Stunden später gewonnen,
auf Eis gehalten, innerhalb von 20 Minuten nach Probennahme zentrifugiert
und zur späteren
Analyse bei –80°C gelagert.
Es hatte sich gezeigt, daß diese
Behandlung zu reproduzierbaren Ergebnissen bei der Messung der sCD40L-Konzentrationen führte (Nannizzi-Alaimo
L, Rubenstein MH, Alves VL, Leong GY, Phillips DR, Gold HK. Circulation
2002; 105: 2849–54).
Die Patienten wurden bis zu ihrer Entlassung aus dem Krankenhaus
und 30 Tage danach beobachtet, um tödliche und nicht-tödliche Myokardinfarkte
zu verzeichnen. Das Vorhandensein einer koronaren Arterienerkrankung
wurde durch eines der folgenden Kriterien nachgewiesen: EKG-Anzeichen
auf eine Myokard- Ischämie (neue Änderungen
in der ST-Strecke oder Inversion der T-Zacke), eine koronare Herzerkrankung
in der Anamnese (Myocardinfarkt oder koronare Revaskularisierung,
ein positiver Belastungstest oder Einengung des Durchmessers einer
Hauptkoronararterie um mindestens 50% in einem früheren Angiogramm).
Patienten ohne koronare Herzerkrankung hatten ein normales Koronar-Angiogramm
aufzuweisen. An einer Untergruppe von Patienten, die 131 Patienten
mit akuten Koronarsyndromen, 20 Patienten mit stabiler koronarer
Herzerkrankung und 10 Patienten mit ausgeschlossener koronarer Herzerkrankung
einschloß,
wurde die Plättchenaktivierung
mittels Durchflußzytometrie
bestimmt.
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3. Biochemische Analyse
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Plasmaproben, antikoaguliert mit
Natriumheparin, wurden zentral bei –80°C gelagert. Die Bestimmung der
kardialen Marker wurde in Unkenntnis der Krankengeschichte der Patienten
und der angeordneten Behandlung im Forschungslabor der Universität Frankfurt
durchgeführt.
Die Plasmaspiegel von sCD40L (Nachweisgrenze 0,005 μg/l), lösliches
P-Selektin (0,5 μg/l),
Tumornekrosefaktor-α (TNF-α, hochempfindlich;
0,12 ng/l) und lösliches
intrazelluläres
Adhäsionsmolekül-1 (Intracellular
Adhesion Molecule-1, ICAM-1; 0,35 μg/l) wurden mittels ELISA (R&D Systems, Wiesbaden)
gemessen. Zur Quantifizierung von Troponin T (TnT) wurde ein Ein-Schritt-Enzym-Immuntest
auf der Grundlage der Elektrochemilumineszenz-Technologie (Elecsys 2010,
Roche Diagnostics; Nachweisgrenze 0,01 μg/l) verwendet. C-reaktives
Protein (CRP) wurde mit Hilfe des Behring BN II Nephelometers (Behring
Diagnostics; Nachweisgrenze 0,2 μg/l)
gemessen.
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5. Quantitative Bestimmung
von sCD40L
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Die sCD40L-Konzentration wurde unter
Verwendung der Sandwich-Enzym-Immuntest-Technik (R&D Systems, Wiesbaden) bestimmt. Eine
Mikrotiterplatte wurde mit einem polyklonalen Antikörper, der
spezifisch gegen sCD40L gerichtet war, beschichtet. Standards und
Proben wurden in die Wells pipettiert und vorhandenes sCD40L wurde
durch den immobilisierten Antikörper
gebunden. Nachdem nicht-gebundenes Material weggewaschen worden
war, wurde ein Enzym-gekoppelter polyklonaler Antikörper, der
spezifisch gegen sCD40L gerichtet war, zu den Wells gegeben. Nach
einem Waschschritt, um nicht gebundenes Antikörper-Enzym-Reagenz wegzuwaschen,
wurde eine Substrat-Lösung
zu den Wells gegeben, und die Farbe entwickelte sich im Verhältnis zur
Menge an sCD40L, die im ersten Schritt gebunden wurde. Die Farbentwicklung
wurde abgestoppt und die Farbintensität wurde gemessen.
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6. Schnelltest für den Nachweis
von CD40L
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Ein Schnelltest auf der Basis der
Chromatographie-Festphase-Technologie mit einem Cocktail aus goldmarkierten
polyklonalen Indikator-Antikörpern
aus der Maus und biotinylierten polyklonalen Capture-Antikörpern wurde
entwickelt. Das Testsystem enthielt mindestens 0,3 μg jedes Antikörpers. 200 μl heparinisiertes Vollblut
oder zentrifugiertes Plasma wurde der Testvorrichtung zugesetzt.
Nach Trennung der zellulären
Blutkomponenten von der Plasmafraktion über ein Fiberglas-Vlies wurde
das Plasma, das durch das Vlies hindurchwanderte, in einem Puffer
aufgenommen und zu dem adsorbierten Antikörper gegeben. Die Antikörper und
die sCD40L-Moleküle
der Proben bildeten Sandwich-Komplexe, die zu der Signalzone wanderten
und in dem Lesefenster mittels Interaktion mit Biotin-Streptavidin
akkumulierten. Positive Ergebnisse (sCD40L ≥ 4,7 μg/l wurden durch eine farbige
Linie angezeigt, die sich innerhalb von 15 Minuten entwickelte.
Die Indikator-Antikörper,
die nicht gebunden wurden, wanderten weiter und wurden an einer
Kontrollinie, bestehend aus Festphase-Anti-Maus-IgG-Antikörpern (≥ 0,2 μg) gebunden. Das Auftreten dieser
Kontrollinie abwärts
von der Signallinie bestätigte
die fehlerfreie Testfunktion einschließlich des ungehinderten Durchflusses
des Plasma.
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7. In vivo-Plättchenaktivierung
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Blutproben, antikoaguliert mit Natriumcitrat,
wurden sofort 10 Minuten mit 1,1% Paraformaldehyd in PBS, 4,6-fach
verdünnt
in destilliertem Wasser zur Lyse der Erythrozyten, behandelt und
die fixierten Zellen in PBS gewaschen. Um P-Selektin bei Plättchen zu
bestimmen, wurde das resuspendierte Pellet 60 Minuten mit Phycoerythrin
(PE)-konjugiertem Glycoprotein IIb- spezifischem monoklonalem Antikörper (CD41;
Dako Carpenteria, Kalifornien) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugiertem
P-Selektin-spezifischem monoklonalem Antikörper (BD Pharmingen, San Diego,
Kalifornien) inkubiert. Die Plättchen
wurden durch ihre charakteristische Vorwärts- und Seitwärts-Lichtstreuung
und die Bindung des PE-konjugierten
Glycoprotein IIb-spezifischen Antikörpers charakterisiert. Die
Plättchenaktivierung
wird in % der P-Selektin-positiven Plättchen ausgedrückt. Um
zirkulierende Monozyt-Plättchen-Aggregate
zu identifizieren, wurden die Zellen mit FITC-konjugiertem Glycoprotein
IIIa-spezifischem monoklonalem Antikörper (CD61; Dako) und PE-konjugiertem
monoklonalem Antikörper
gegen CD 14 (BD Pharmingen) gefärbt.
Die Monozyten wurden durch ihre charakteristischen Vorwärts- und
Seitwärts-Lichtstreuungseigenschaften
und die Bindung von PE-konjugiertem CD14-spezifischem Antikörper identifiziert.
Monozyt-Plättchen- Aggregate wurden
definiert als Monozyten, bei denen sich Glycoprotein IIIa nachweisen
ließ,
und werden in Prozent der Monozyten-Gesamtzahl angegeben (Michelson
AD, Barnard MR, Krueger LA, Valeri CR, Furman MI, Circulation 2001;
104: 1533–7).
Jede Färbung
wurde in Gegenwart gesättigter
Konzentrationen eines monoklonalen unkonjugierten Ratte-Antikörpers gegen Fc-Rezeptoren
(anti-CD16/32, BD Pharmingen ) inkubiert um die unspezifische Bindung
zu reduzieren und Isotyp-identische Antikörper dienten als Kontrolle
(IgG1-PE und IgG2a-FITC;
BD Pharmingen). Insgesamt wurden 50.000 Signale mit Hilfe von FACS-Calibur (Becton/Dickinson,
Heidelberg) und der CellQuest-Software (BD Pharmingen) analysiert.
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8. Statistische Verfahrens
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Nach einer blinden Beurteilung der
biochemischen Marker und der Plättchenaktivierung
wurden die Testergebnisse mit der Datenbank abgeglichen. Um Patienten
mit verschiedenen Graden eines kardiologischen Risikos unterscheiden
zu können,
wurde eine orientierende Datenanalyse gewählt. CAPTURE-Patienten wurden
nach der sCD40L-Konzentration der Quintile eingeteilt. Für jeden
der vier Zeitpunkte (24 Stunden, 72 Stunden, 30 Tage und 6 Monate)
wurde eine logistische Regressionsanalyse durchgeführt, und
Patienten in dem ersten Quintil (sCD40L < 2,0 μg/l) dienten als Referenz. Receiver
Operating Characteristics (ROC) Curve Analysis über den dynamischen Bereich
des sCD40L-Tests wurde verwendet, um die Schwellenkonzentration
für sCD40L
zu identifizieren, die den höchsten
Vorhersagewert für
die Risikostratifikation von Patienten mit akuten Koronarsyndromen
lieferte. Die Auswirkung einer Erhöhung der biochemischen Marker
auf das Schicksal des Patienten wurde unter Verwendung eines Cox
Proportional-Hazards Regression Model, welches die Base Line-Werte
der prognostischen Faktoren (z.B. EKG-Befunde, kardiale Risikofaktoren,
Alter und Geschlecht) und die zufällig ausgewählte Behandlung evaluiert (Harrell
FE, Jr., Lee KL, Pollock BG. J Natl Cancer Inst 1988; 80: 1198–202). Alle
Ergebnisse für
kontinuierliche Variablen werden als Mediane mit 95% Vertrauensintervall
ausgedrückt.
Gleiche Zwischengruppen wurden durch den T-Test (zweiseitig) oder
ANOVA bei Experimenten mit mehr als zwei Untergruppen analysiert.
Post hoc-Bereichstests und paarweise multiple Vergleiche wurden
mit dem T-Test (zweiseitig) mit Bonferroni-Abgleich durchgeführt. Der
Vergleich von kategorischen Variablen wurde mit dem Pearson-chi2-Test durchgeführt. Alle Analysen wurden mit
SPSS 11,0 (SPSS, Inc.) durchgeführt.
Werte von p < 0,05
wurden als statistisch signifikant beurteilt.
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Beispiel 1: Zusammenhang
zwischen kardialem Risiko und sCD40L-Konzentration
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Die Ausgangscharakteristika der für diese
Studie ausgewählten
Population (n = 1088, 86% der CAPTURE-Patienten) unterschied sich
nicht von der Gesamtpopulation der Studie im Hinblick auf Alter,
Geschlecht, kardiovaskuläres
Risikoprofil und begleitende Behandlung vor und nach der zufälligen Auswahl.
Die Reduktion kardialer Ereignisse in der Abciximab-Gruppe der Population
war mit der gesamten CAPTURE-Population vergleichbar (vor PTCA:
2,2% Placebo vs. 0,9% Abciximab, p = 0,094; nach PTCA: 7,9% vs.
3,5%, p = 0,002 ; nach 30 Tagen: 9,0% vs. 4,2%, p = 0,002) (CAPTURE.
Lancet 1997; 349: 1429–35).
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sCD40L war in den Base Line-Serumproben
aller 1088 Patienten mit einem Mittelwert von 4,5 μg/l (Bereich
0,003–20,4)
nachweisbar. Die sCD40L-Konzentration korrelierte nicht mit den
gemessenen Konzentrationen an TnT (r = 0,14) und CRP (r = 0,11).
Die Patienten der Placebo-Gruppe (n = 544) wurden nach ihren gemessenen
sCD40L-Konzentrationen in Quintile eingeteilt: (sCD40L 1) < 1,93 μg/l (n =
100), (sCD40L 2) 1,93–3,50 μg/l (n =
102), (sCD40L 3) 3,50–5,00 μg/l (n =
121), (sCD40L 4) 5,00–6,30 μg/l (n =
115) bzw. (sCD40L 5) > 6,30 μg/l (n =
106). Während
der ersten 24 Stunden waren die kombinierten Endpunkte Mortalität und nicht-tödlicher
Myokardinfarkt nur in dem fünften
sCD40L-Quintil im Vergleich zu dem ersten Quintil leicht erhöht (p =
0,13) (1). Zu späteren Zeitpunkten
(72 Stunden, 30 Tage, 6 Monate) traten diese Ereignisse signifikant
häufiger
sowohl in dem vierten als auch dem fünften Quintil (p = 0,003, p
= 0,0004 bzw. p = 0,001) auf.
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Auf der Grundlage der oben beschriebenen
Befunde wurden die Patientenproben nach der berechneten Schwellenkonzentration
aufgeteilt. 221 Patienten (40,6%) wiesen sCD40L-Konzentrationen von 5,0 μg/l oder
darüber
auf, und 323 Patienten wiesen Werte < 5,0 μg/l auf. Wie Tabelle 1 zeigt,
traten keine signifikanten Unterschiede in den Ausgangscharakteristika
der beiden Gruppen auf. Bei Patienten mit niedrigen sCD40L-Konzentrationen
waren die kombinierten Endpunkte tödlicher und nicht-tödlicher
Myokardinfarkt signifikant von denen von Patienten mit erhöhten sCD40L-Konzentrationen
sowohl 24 Stunden vor dem Verfahren (4,1 % vs. 0,9%; p = 0,016)
als auch 72 Stunden danach (einschließlich koronarer Interventionen
bei allen Patienten) (13,1% vs. 4,3%; vs. 4,3%; p < 0,001) verschieden
( 2a). Während der
sechsmonatigen Folgezeit divergierten die Kurven, welche die Häufigkeit
eines Ereignisses anzeigen, bei Patienten mit hohen bzw. niedrigen
sCD40L-Konzentrationen weiter (2b).
Signifikante Unterschiede gab es sowohl nach 30 Tagen (14,5% vs.
5,3%; p < 0,001)
als auch nach 6 Monaten (18,6% vs. 7,1 %; p < 0,001). Aufgrund der relativ niedri gen
Mortalität
der CAPTURE-Gruppe unterschied sich die Endpunktmortalität nach 6
Monaten nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen (2,3% vs.
1,5%; p = 0,72). Der Vorhersagewert von sCD40L war von einer Myokardnekrose
unabhängig.
Bei TnT-negativen Patienten wurde mittels der sCD40L-Konzentration
eine Gruppe von Patienten mit erhöhtem kardialen Risiko (13,6%)
identifiziert, das sich nicht signifikant vom kardialen Risiko TnT-positiver Patienten
(14,0%; p = 1,00) unterschied. Receiver Operating Characteristics
Curve Analysis bestätigte
eine Schwellenkonzentration von 5,0 μg/l für den maximierten Vorhersagewert
von sCD40L. Wiederholte, nicht dringende kardiologische Interventionen
während
der ersten 6 Monate waren bei Patienten mit hohen sCD40-Konzentrationen
nicht signifikant verschieden von denen bei Patienten mit niedrigen
sCD40L-Konzentrationen (6,2% vs. 4,5%; p = 0,45).
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Von 626 Patienten ohne ST-Hebung,
die mit akutem Brustschmerz in der Notaufnahme vorstellig wurden,
litten 308 Patienten an akutem Koronarsyndrom (117 Patienten hatten
einen akuten Myokardinfarkt, gestützt auf einer Troponin-Erhöhung ≥ 0,1 μg/l, erlitten).
Bei den anderen Patienten wurden folgende Diagnosen gestellt: n
= 91 stabile Angina, n = 10 Lungenembolie, n = 11 kongestive Herzininsuffizienz,
n = 7 Myokarditis und n = 199 kein Hinweis auf eine Herzerkrankung.
sCD40L-Konzentrationen waren bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen
signifikant höher
(4,53 [3,19–5,87] μg/l) im Vergleich
zu Patienten mit stabiler Angina (2,41 [1,99–3,52] μg/l; p < 0,001) bzw. Patienten ohne Anzeichen
einer Herzerkrankung (1,57 [0,88–1,76] μg/l; p < 0,001). Der Durchschnittswert der
oberen Referenzgrenze (Upper Reference Limit, URL) von 97,5 bei
Patienten ohne Anzeichen kardialer Beschwerden betrug 4,7 μg/l und der
URL-Durchschnittswert von 99 lag bei 6,2 μg/ml. Ähnlich wie bei den Ergebnissen,
die in der CAPTURE-Studie erhalten wurden waren, korrelierten die sCD40L-Serumkonzentrationen
nicht mit Nekrosemarkern (Troponin T), Entzündungsmarkern (CRP, TNF-α) und Adhäsionsmolekülen (ICAM-1).
Bei Patienten mit akuten Koronarsyndromen wiesen 43,5% sCD40L-Serumkonzentrationen
oberhalb des 97,5 URL-Durchschnittswerts
und 21,8% sCD40L-Serumkonzentrationen oberhalb des 99 URL-Durchschnittswerts
auf. Unter Verwendung einer festgesetzten Schwellenkonzentration für sCD40L
von 5,0 μg/l
wurden Patienten mit erhöhten
sCD40L-Serumkonzentrationen als Hochrisiko-Population identifiziert
(festgesetzter Risikoquotient 3,00 [1,35–6,71]; p = 0,009). Innerhalb
der gesamten heterogenen Population von Patienten mit Brustschmerz,
war die festgesetzte Schwellenkonzentration von 5,0 μg/l ebenfalls
zuverlässig,
um Patienten zu identifizieren, die ein hochgradiges Risiko für kardiologische
Ereignisse während
der nach fol genden 30 Tage aufwiesen (festgesetzter Risikoquotient
6,65 [3,18 bis 13,89]; p < 0,001). Die
Fläche
unter der ROC-Kurve betrug 0,75 [0,67–0,83] und ein maximierter
Vorhersagewert wurde bei einer Schwellenkonzentration von 4,8 μg/l erreicht.
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Beispiel 2: Angiographische
Befunde und sCD40L-Konzentration
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Die Base Line-Koronarangiogramme
bei Patienten mit erhöhten
sCD40L-Konzentrationen zeigten komplexere Charakteristika der Läsionen.
Bei 40,6% der Patienten mit hohen sCD40L-Konzentrationen wurden
Läsionen
vom Typ B2+ oder C dokumentiert, während nur 27,5% der Patienten
mit niedrigen sCD40L-Konzentrationen komplexere Läsionscharakteristika
aufwiesen (p = 0,004).
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Der Base Line-Wert für den TIMI-Durchfluß war bei
59,6% der Patienten mit hohen sCD40L-Konzentrationen und bei 58,9%
der Patienten mit niedrigen sCD40L-Konzentrationen normal (p = 0,049).
Ein TIMI-Durchfluß ⎕ 1
wurde für
7,8% der Patienten mit hohen sCD40L-Konzentrationen im Vergleich
zu 5,7%, Patienten mit niedrigen sCD40L-Konzentrationen dokumentiert (p = 0,67).
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Ein Thrombus war zum Zeitpunkt der
Aufnahme bei 11,1 % der Patienten mit hohen sCD40L-Konzentrationen im
Vergleich zu 4,8% Patienten mit niedrigen sCD40L-Konzentrationen
sichtbar (p = 0,009). Alle Patienten mit sichtbarer Thrombusbildung
wiesen sCD40L-Konzentrationen > 2,5 μg/l auf.
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Beispiel 3: Wirkung von
Abciximab auf die sCD40L-Konzentration
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Eine logistische Regressionsanalyse
wies auf einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit
einer Behandlung mit Abciximab und der sCD40L-Konzentrationen hin
(p < 0,001). Die
Patienten wurden wie oben angegeben in Quintile eingeteilt. Für die ersten
zwei Quintile wurden keine Unterschiede hinsichtlich eines kardialen
Risikos bei einer Behandlung mit Placebo oder Abciximab beobachtet
(3). Eine signifikante
und gleichermaßen
ausgeprägte
Reduktion kardialer Ereignisse wurde für die oberen beiden Quintile
dokumentiert. Der Befund einer Änderung
der Ungleichheit auf 0,35 zwischen den zweiten und dritten Quintilen
legt eine günstige
Schwellenkonzentration in diesem Bereich der sCD40L-Konzentrationen nahe.
Demgemäß wurden
die Kurven, welche die Häufigkeit
eines kardialen Ereignisses in Gestalt eines tödlichen oder nicht-tödlichen
Myokardinfarkts darstellen, unter Verwendung einer Schwellenkonzentration
von 5,0 μg/l
erzeugt. Ereignisse vor diesem Ver fahren waren bei Patienten mit
niedrigen sCD40L-Konzentrationen, die Placebo erhielten, selten
(0,9%), während
bei 3,4% der Patienten Ereignisse im Zusammenhang mit einer coronaren
Intervention auftraten (4a).
Bei Patienten mit niedrigen sCD40L-Konzentrationen wurde kein Unterschied
zwischen Patienten, die Abciximab und denen, die Placebo erhielten,
beobachtet (24 Stunden: 1,2% vs. 0,9%; 72 Stunden: 3,8% vs. 4,3%).
Nur wenige zusätzliche
Ereignisse wurden in den anschließenden 6 Monaten registriert.
Die Gesamthäufigkeit
betrug 7,1 % führte
(4b).
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Im Gegensatz dazu war die Häufigkeit
von Anfällen
signifikant höher
bei Patienten mit hohen sCD40L-Konzentrationen, die Placebo erhalten
hatten, sowohl vor PTCA (4,1 %) als auch unter PTCA (9,0%), ebenso
wie in der nachfolgenden Zeit nach der Entlassung, was zu einer
Gesamthäufigkeit
von 18,6% nach sechs Monaten führte.
Ereignisse, die vor und unter PTCA auftraten, wurden durch Behandlung
mit Abciximab wirksam auf 0,5% vor PTCA (Risikoquotient 0,12 [0,01–0,92];
p = 0,013) und 2,9% für
PTCA-bezogene Ereignisse (Risikoquotient 0,19 [0,08–0,49];
p < 0,001) reduziert.
Diese Verbesserung blieb über
sechs Monate nach dem Ereignis bestehen, was zu einer kumulativen
Häufigkeit
der Ereignisse von 7,8% vs. 18,6% in der Placebo-Gruppe führte (Risikoquotient
0,37 [0,20–0,68];
p = 0,001). Dieser Wert ist vergleichbar mit dem, der bei Patienten
mit niedrigen sCD40L-Konzentrationen (7,1 %) beobachtet wurde. Weiterhin
war die Wirkung der Glycoprotein IIb/IIIa-Hemmung ohne das Auftreten
einer Myokardnekrose offensichtlich. Bei TnT-negativen Patienten
wurde mittels der sCD40L-Konzentration eine Untergruppe von Patienten
identifiziert, die eine signifikante Reduktion kardialer Ereignisse
zeigten, wenn sie Abciximab (2,8% vs. 10,2%; Placebo vs. Abciximab; p
= 0,022) erhielten.
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Die Auflösung eines Thrombus während der
angeordneten Behandlung vor Koronarintervention war bei Patienten
mit hohen sCD40L-Konzentrationen besonders auffällig, wenn sie mit Abciximab
behandelt wurden, mit einer relativen Reduktion von 63% (Placebo: –21%; p < 0,01). Eine Thrombusbildung
bei Patienten mit niedrigen sCD40L-Konzentrationen war selten und
eine signifikante Auflösung
wurde weder in der Placebogruppe (p = 0,75) noch in der Abciximab-Gruppe
(p = 0,82) erreicht.
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Beispiel 4: sCD40L als
Marker einer Plättchen-Aktivierung
in vivo
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Um die Hypothese zu verifizieren,
daß sCD40L
tatsächlich
einen Marker für
die Plättchen-Aktivierung darstellt,
wurde das Verhältnis
der Plättchen-Aktivierung
und der sCD40L- Serumkonzentrationen
in einer Untergruppe von Patienten mit akutem Brustschmerz (n =
151) prospektiv untersucht. Das Ausmaß der Plättchen-Aktivierung war bei
Patienten mit aktuten Coronarsyndromen im Vergleich sowohl zu Patienten
mit stabiler koronarer Herzerkrankung als auch zu Patienten ohne
koronare Herzerkrankung signifikant erhöht (5). Es wurde eine strenge Korrelation
zwischen der Plättchen-Aktivierung,
bestimmt mittels Monozyt-Plättchen-Agregate
(%), und der sCD40L-Konzentration beobachtet (r = 0,75; p < 0,0001) (6). Ähnliche Ergebnisse wurden für P-Selektin
(p < 0,001) erhalten.
Die Patienten wurden nach ihren gemessenen sCD40L-Konzentrationen
in Tertile eingeteilt: (sCD40L 1) < 2,5 μg/l (n =
55), (sCD40L 2) 2,5–4,5 μg/l (n =
50), bzw. (sCD40L 3) > 4,5 μg/l (n =
56). Bei Patienten des ersten sCD40L-Tertils betrug der prozentuale
Anteil von Monozyt-Plättchen-Aggregaten
11,3% [9,6–12,9].
In dem zweiten und dritten sCD40L-Tertil war die Plättchen-Aktivierung
signifikant höher
(22,3 [19,8–24,8]
% bzw. 34,1 [30,0–38,3]
%; p < 0,001).
Besonders interessant ist, daß bei
allen Patienten (mit Ausnahme eines Patienten) die sCD40L-Serumkonzentrationen > 4,5 μg/l aufwiesen,
mindestens 15% der Monozyten mit Plättchen aggregiert waren, was
auf eine deutliche Plättchen-Aktivierung
bei diesen Patienten hinweist. Im Gegensatz dazu zeigten die Serumkonzentrationen
an löslichem
P-Selektin einen deutlich weniger ausgeprägten Zusammenhang mit der Plättchen-Aktivierung
(r = 0,41 für
Plättchen-Monozyt-Aggregate
bzw. r = 0,36 die P-Selektin). In einer Multivarianz-Regressionsanalyse
zeigte sich, daß eine
Diabetes-Erkrankung (p = 0,015), eine Hypercholesterinämie (p =
0,006) und die sCD40L-Konzentration (p < 0,0001), nicht jedoch die Konzentration
an löslichem
P-Selektin signifikant mit der Plättchen-Aktivierung assoziiert
war (Monozyt-Plättchen-Aggregate > 30%).
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Tabelle
1: Base Line-Charakteristika von sCD40L in der Placebo-Gruppe
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Tabelle
2: Tödlicher
und nicht-tödlicher
Myocardinfarkt innerhalb der ersten 6 Monate (Multivarianz-Regressionsanalyse)
