DE60112949T2

DE60112949T2 - Verfahren zum nachweis eines lipoprotein-akutphaseprotein-komplexes

Info

Publication number: DE60112949T2
Application number: DE60112949T
Authority: DE
Inventors: J. Timothy FISCHER; Colin Downey; Mike Nesheim; A. John SAMIS; Liliana Tejidor; Hock Cheng TOH; B. John WALKER
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux Inc
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2021-06-09
Also published as: EP1309857A2; AU2001266795B2; US20070155018A1; ATE302947T1; WO2001096864A3; JP2004503254A; AU6679501A; JP5051960B2; WO2001096864A2; CA2412317A1; MXPA02012176A; EP1309857B1; DE60112949D1; CA2412317C; BR0111987A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Blutgerinnsel sind der Endpunkt einer komplexen Kettenreaktion, wobei Proteine eine Enzymkaskade bilden, die als ein biologisches Verstärkersystem agiert. Dieses System versetzt relativ wenige Moleküle aus Initiatorprodukten in die Lage, eine sequentielle Aktivierung einer Reihe inaktiver Proteine zu induzieren, bekannt als Faktoren, die in der Herstellung des Fibringerinnsels gipfelt. Mathematische Modelle der Kinetik des Weges der Kaskade wurden schon vorher vorgeschlagen.
Thrombose- und Hämostasetests sind der in vitro Test der Fähigkeit von Blut, in vivo Gerinnsel zu bilden und Gerinnsel aufzulösen. Gerinnungs- (Hämostase-) Untersuchungen begannen als manuelles Verfahren, wobei die Gerinnselbildung in einer Teströhre bzw. einem Reagenzglas entweder durch Schütteln der Röhre oder Entfernen von Fibrinfasern durch eine Drahtschlinge beobachtet wurde. Das Ziel war es zu bestimmen, ob die Blutprobe eines Patienten nach Zugabe bestimmter Materialien gerinnt. Es wurde später festgestellt, daß der Zeitraum von der Initialisierung der Reaktion bis zum Punkt der Gerinnselbildung in vitro im Verhältnis zu angeborenen Funktionsstörungen, erworbenen Funktionsstörungen und therapeutischer Überwachung steht. Um die inhärente Schwankung, die mit den subjektiven Endpunktbestimmungen der manuellen Verfahren verbunden ist, zu beheben, wurden Instrumente entwickelt, um die Gerinnungszeit zu messen, basierend auf (1) elektromechanischen Eigenschaften, (2) Gerinnselelastizität, (3) Lichtstreuung, (4) Fibrinadhäsion und (5) Impedanz. Bei dem Lichtstreuungsverfahren werden Daten gesammelt, die die Transmission von Licht durch die Probe als Funktion der Zeit darstellen (ein optisches zeitabhängiges Meßprofil).
Zwei Bestimmungen, die PT und die aPTT, werden weit verbreitet verwendet, um nach Abweichungen im Gerinnungssystem zu suchen, obwohl mehrere andere Screeninguntersuchungen verwendet werden können, z. B. Protein C, Fibrinogen, Protein S und/oder Thrombinzeit. Wenn die Screeninguntersuchungen ein unnormales Ergebnis zeigen, werden ein oder mehrere zusätzliche Tests benötigt, um die genaue Quelle der Abweichung zu bestimmen. Die PT- und aPTT-Bestimmungen beruhten in erster Linie auf der Messung der Zeit, die für die Gerinnungszeit benötigt wird, obwohl einige Variationen des PT auch die Amplitude der Änderung des optischen Signals zur Abschätzung der Fibrinogenkunzentration verwenden.
Die Blutgerinnung wird durch die Verabreichung von Arzneistoffen beeinflußt, zusätzlich zu der riesigen Anzahl innerer Faktoren und Proteine, die normalerweise die Blutgerinnung beeinflussen. Z. B. ist Heparin ein weitverbreiteter therapeutischer Arzneistnff, der verwendet wird, um Thrombosen in Folge von Operationen oder unter anderen Bedingungen zu verhindern, oder es wird verwendet, um bestehende Thrombosen zu behandeln. Die Verabreichung von Heparin wird üblicherweise mit der aPTT-Bestimmung überwacht, die eine verlängerte Gerinnungszeit in Gegenwart von Heparin angibt. Gerinnungszeiten bei PT-Bestimmungen werden zu einem viel geringeren Grad beeinflußt. Da eine Reihe anderer Plasmaabnormalitäten auch verlängerte aPTT-Ergebnisse hervorrufen können, kann die Möglichkeit, zwischen diesen Effektoren aus den Screeninguntersuchungsergebnissen zu unterscheiden, klinisch signifikant sein.
Die vorliegende Erfindung wurde konzipiert und entwickelt für die Vorhersage hämostatischer Dysfunktion in einer Probe basierend auf einem oder mehreren zeitabhängigen Meßprofilen, wie z. B. optische, zeitabhängige Meßprofile. Zusätzlich ist die vorliegende Erfindung dahin gerichtet, die Gegenwart von disseminierter intravasaler Gerinnung in einem Patienten basierend auf einem zeitabhängigen Profil, wie z. B. einem optischen Transmissionsprofil, aus einer Bestimmung einer Blut- oder Plasmaprobe eines Patienten vorherzusagen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln eines Niederschlags in einer Testprobe in Abwesenheit von Gerinnungsbildung. Das Verfahren schließt das Bereitstellen einer Testprobe und Zugabe eines Reagenzes dazu ein, wobei das Reagenz alleine oder in Kombination mit zusätzlichen Reagenzien die Bildung eines Niederschlags hervorruft. Das Reagenz umfaßt bevorzugt ein zweiwertiges Metallkation und schließt wahlweise eine gerinnungshemmende Substanz ein. Die Ermittlung des Niederschlags kann qualitativ oder quantitativ sein, und der Niederschlag kann z. B. durch eine Blutgerinnungsuntersuchung, eine Latexagglutination- oder Gold-Sol-Untersuchung, ein Immunoassay wie z. B. eine ELISA oder andere geeignete Verfahren ermittelt werden, die die Erkennung und/oder Quantifizierung des Niederschlages erlauben. Die Bildung des Niederschlages kann als Endpunktwert oder kinetisch bestimmt werden. Diese Niederschlagsbestimmung erlaubt die Vorhersage hämostatischer Fehlfunktion in Patienten. Die vorliegende Erfindung ist zur Vorhersage einer hämostatischer Fehlfunktion nützlich, die zu Blutungen oder Thrombose oder besonders zu disseminierter intravasaler Gerinnung (DIC) führen kann.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das folgendes umfasst: Zugabe eines Reagenzes zu einer Testprobe mit mindestens einem Bestandteil einer Blutprobe aus einem Patienten, Messung der Bildung eines Niederschlags aufgrund der Reaktion der Testprobe und des Reagenzes im Verlauf der Zeit, um so ein zeitabhängiges Meßprofil abzuleiten, wobei das Reagenz in der Lage ist, einen Niederschlag in der Testprobe zu bilden ohne wesentliche Fibrinpolymerisation hervorzurufen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient hämostatische Fehlfunktion besitzt oder nicht, mit den Schritten: Nehmen einer Blutprobe eines Patienten, Beschaffen von Plasma aus der Blutprobe, Zugeben eines Reagenzes, das in der Lage ist, die Bildung eines Niederschlags bei Patienten mit hämostatischer Fehlfunktion hervorzurufen, ohne irgendwelche wesentliche Fibrinpolymerisation hervorzurufen, Aufnehmen einer oder mehrerer Messungen eines Parameters der Probe, wobei Änderungen in dem Probenparameter zu einer Korrelation zur Niederschlagsbildung, wenn sie vorliegt, in der Lage sind, und Bestimmen, daß ein Patient eine hämostatische Fehlfunktion besitzt, wenn Niederschlagsbildung ermittelt wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens eines Komplexes aus Proteinen in einer Patientenprobe, die mindestens eines von einem 300 kDa Protein, Serumamyloid A und C-reaktivem Protein umfassen, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Nehmen einer Testprobe von einem Patienten, Zugeben eines Alkohols, eines Gerinnungshemmers und eines Metallkations, wobei ein Niederschlag gebildet wird, der einen Komplex aus Proteinen einschließlich mindestens eines von einem 300 kDa Protein, Serumamyloid A und C-reaktiven Protein umfaßt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren mit den Schritten: Zugabe eines Gerinnungsreagenz zu einem Aliquot einer Testprobe eines Patienten, Überwachung der Bildung von Fibrin im Verlauf der Zeit in der Testprobe durch Messen eines Parameters der Testprobe, der sich im Verlauf der Zeit aufgrund der Zugabe des Gerinnungsreagenz ändert, Bestimmung der Änderungsrate, wenn es eine gibt, des Parameters in einem Zeitraum vor der Bildung von Fibrinpolymerisation in der Testprobe. wenn die bestimmte Änderungsrate jenseits eines vorherbestimmten Schwellwertes ist, dann mit einem zweiten Aliquot der Testprobe des Patienten, Zugabe eines Reagenzes, das die Bildung eines Niederschlags in Abwesenheit von Fibrinpolymerisation hervorruft, dazu, Messung der Bildung des Niederschlags im Verlauf der Zeit, und Bestimmung der Möglichkeit oder Wahrscheinlichkeit hämostatischer Fehlfunktion basierend auf der Messung des Niederschlags.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Überwachung einer Entzündung bei einem Patienten, mit den Schritten: Zugabe eines Reagenzes zu einer Testprobe eines Patienten, wobei das Reagenz in der Lage ist, Niederschlagsbildung in einigen Testproben von Patienten hervorzurufen, ohne Fibrinpolymerisation hervorzurufen, Messung eines Parameters der Testprobe im Verlauf der Zeit, der für die Niederschlagsbildung indikativ ist, Bestimmung der Steigung des sich ändernden Parameters, Wiederholen der obigen Schritte zu einem späteren Zeitpunkt, wobei ein Anstieg oder Abfall der Steigung zu einem späteren Zeitpunkt für das Fortschreiten bzw. den Rückgang der Entzündung indikativ ist.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zum Diagnostizieren und Behandeln von Patienten mit hämostatischer Fehlfunktion, das folgendes umfasst: Zugeben eines Reagenzes zu einer Testprobe, das Niederschlagsbildung ohne Fibrinpolymerisation hervorruft, Aufnehmen von Messungen eines Parameters der Testprobe im Verlauf der Zeit, der sich aufgrund der Bildung des Niederschlags ändert, Bestimmung der Änderungsrate des Parameters, Erkennen, daß ein Patient eine hämostatische Fehlfunktion besitzt, wenn die Änderungsrate außerhalb einer vorherbestimmten Grenze ist; Eingreifen mit Behandlung gegen die hämostatische Fehlfunktion, wenn die Änderungsrate außerhalb der vorherbestimmten Grenzen liegt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren mit den Schritten: Zugabe eines Reagenzes zu einer Probe eines Patienten, das in der Lage ist, eine Niederschlagsbildung in der Probe hervorzurufen, Überwachung eines sich ändernden Parameters der Probe im Verlauf der Zeit, wobei der Parameter indikativ für die Niederschlagsbildung ist, Bestimmung der Änderungsrate des Parameters oder ob der Parameter eine vorherbestimmte Grenze zu einer vorherbestimmten Zeit überschreitet, Wiederholen der obigen Schritte mindestens einmal, jedesmal mit einem unterschiedlichen Plasma/Reagenzverhältnis, Bestimmung des Maximums, Durchschnitts und/oder der Standartabweichung für die Messungen; und Bestimmung hämostatischer Fehlfunktion basierend auf der Maximums-, dem Durchschnitts- und/oder den Standartabweichungsbestimmungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein Immunoassay mit den Schritten: Bereitstellen eines Liganden, der in der Lage ist, an C-reaktives Protein oder das 300 kDa Protein in Bahn 5 aus 21 zu binden, Zugeben des Liganden zu einer Testprobe eines Patienten und Erlauben des Bindens des Liganden an das C-reaktive Protein oder das 300 kDa Protein in der Testprobe, Bestimmen des Vorliegens und/oder der Menge des C-reaktiven Proteins oder des 300 kDa Proteins in der Probe, und Diagnostizieren einer hämostatischer Fehlfunktion in dem Patienten aufgrund der Erkennung und/oder Menge des C-reaktiven Proteins oder des 300 kDa Proteins, das erkannt wurde.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines neuen Arzneistoffs an einem menschlichen oder tierischen Versuchsobjekt mit einer Entzündung und/oder hämostatischen Fehlfunktion, das folgendes umfasst: Zugabe eines Reagenzes zu einer Testprobe eines Patienten, wobei das Reagenz in der Lage ist, Niederschlagsbildung in einigen Testproben des Versuchsobjekts hervorzurufen, ohne Fibrinpolymerisation hervorzurufen, Messung eines Parameters der Testprobe im Verlauf der Zeit, der für die Niederschlagsbildung indikativ ist, Bestimmung der Steigung der Änderung des Parameters und/oder des Wertes des Parameters zu einer vorherbestimmten Zeit, Verabreichung eines Arzneistoffs an das tierische oder menschliche Versuchsobjekt, Wiederholung der obigen Schritte zu einem späteren Zeitpunkt, wobei eine Zunahme oder eine Abnahme in der Steigung oder dem Wert zu einem späteren Zeitpunkt indikativ für die Wirksamkeit des Arzneistoffs ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A und 1B stellen Transmissionswellenformen bei der aPTT-Bestimmung dar, wobei (A) ein normales Erscheinungsbild und (B) ein biphasisches Erscheinungsbild zeigt. Die Gerinnungszeit ist durch einen Pfeil angezeigt.
2 stellt die Transmissionsniveaus nach 25 Sekunden im Verhältnis zur Diagnose bei 54 Patienten mit biphasischen Wellenformabnormalitäten dar. Die horizontale gepunktete Linie gibt das normale Transmissionsniveau an.
3 stellt serielle Transmissionsniveaus (A) und Wellenformen am Tag 1 (B), Tag 4 (C), und Tag 6 (D) eines Patienten dar, der DIC infolge von Sepsis entwickelte und sich erholte.
4 stellt serielle Transmissionsniveaus (A) und Wellenformen am Tag 2 (B), Tag 5 (C) und Tag 10 (D) eines Patienten dar, der DIC infolge eines Traumas entwickelte und starb.
5 stellt ROC-Graphiken für die Vorhersage von DIC-Transmission nach 25 Sekunden (TR25), die aPTT-Gerinnungszeit und die Steigung_1 (die Steigung bis zum Einsetzen der Gerinnungsbildung) dar.
6 zeigt ein Histogramm für DIC-, normale und abnormale/nicht-DIC-Populationen für TR25.
7 zeigt ein Histogramm für DIC-, normale und abnormale/nicht-DIC-Populationen für Steigung_1.
8 zeigt Gruppenverteilungen für Steigung_11.
9 zeigt partielle Unterpopulationen der Daten, die in 8 gezeigt sind.
10 zeigt Gruppenverteilungen für TR25.
11 zeigt partielle Unterpopulationen der Daten, die in 10 gezeigt sind.
12 ist ein optisches Transmissionsprofil für eine aPT7-Bestimmung unter Verwendung von Platelin^TM.
13 ist ein optisches Transmissionsprofil für die PT-Bestimmung unter Verwendung von Recombiplast^TM.
14 ist ein optisches Transmissionsprofil für die PT-Bestimmung unter Verwendung von Thromborel S^TM.
15 ist eine Standardkurve für ELISA von CRP.
16 ist ein Graph, der den Zeitverlauf der Trübheit in einer Probe nach Zugabe von Ca²⁺ und PPACK zeigt, verglichen mit Proben von normalen und Patientenplasmen, die in den unterschiedlichen Verhältnissen, die auf der rechten Seite gezeigt sind, gemischt wurden. HBS/1 mM Citrat war das Verdünnungsmittel.
17 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der maximalen Trübungsänderung und der Menge an Patientenplasma in der Probe zeigt.
18 zeigt die Ergebnisse der Anionentauscherchromatographie von Material, das nach der Fraktionierung von Patientenplasma gewonnen wurde. Interessante Peaks sind angezeigt.
19 zeigt nicht-reduziertes (A) und reduziertes (B) SDS-PAGE unterschiedlicher Fraktionen von Patientenplasma.
20 zeigt Immunoblots des CRP in normalem (A und B) und DIC-Plasma (C). Bei (A) und (B) sind die Bahnen mit der Patientennummer beschriftet; (C) ist mit der ng-Menge des beladenen CRPs beschriftet.
21 zeigt die Trübungsänderung nach Zugabe von zweiwertigem Calcium zu Materialien, die durch Q-Sepharose-Chromatographie in Abwesenheit von Plasma (mit Ausnahme der oberen Kurve) gewonnen wurden.
22 zeigt die Reaktion auf ansteigende Calciumkonzentrationen in optischen Transmissionsprofilen. Die Profile sind für zwei normale Patienten (A, B) und zwei Patienten mit DIC (C, D) dargestellt.
23 zeigt optische Transmissionsprofile für Calciumchlorid allein (B) oder in Verbindung mit aPTT-Reagenz (A). Die Nummern geben Patientenidentifikationsnummern an.
24 ist eine Kalibrierungskurve mit Heparin;
25 zeigt CRP-Niveaus in 56 ITU-Patienten aufgetragen gegen die Transmission nach 18 Sekunden.
26 zeigt weitere Proben mit CRP und die Abnahme der Transmission nach 18 Sekunden (10000-TR 18).
27 stellt ein Rekonstitutionsexperiment dar, das die Wirkung auf die Trübung der Kombination VLDL und CRP (Peak 3) im Vergleich zu VLDL allein zeigt. Die Anfangskonzentration von VLDL bei diesem Experiment betrug 0,326 mg/ml.
28 stellt ein Rekonstitutionsexperiment dar, das die Wirkung auf die Trübung einer Kombination von IDL und CRP (Peak 3) im Vergleich zu ILD allein zeigt. Die Anfangskonzentration von IDL bei diesem Experiment betrug 0,06797 mg/ml.
29 stellt ein Rekonstitutionsexperiment dar, das die Wirkung auf die Trübung einer Kombination von LDL und CRP im Vergleich zu LDL allein und CRP allein (Peak 3) zeigt. Die Anfangskonzentration von LDL bei diesem Experiment betrug 0,354 mg/ml.
30 stellt ein Rekonstitutionsexperiment dar, das die Wirkung auf die Trübung einer Kombination von HDL und CRP (Peak 3) im Vergleich zu HDL allein zeigt. Die Anfangskonzentration von HDL bei diesem Experiment betrug 1,564 mg/ml.
31 ist eine ROC-Graphik der Sensitivität gegenüber der Spezifität.
32 ist ein Immunoblot für apo(B)-100. Bahn 1 ist aus normalem menschlichem Plasma isoliertes Protein, die Bahnen 2 bis 5 sind Proteinproben, die aus DIC-Patientenplasma isoliert wurden und Bahnen 6–9 sind Calciumniederschläge aus Proteinproben derselben DIC-Patienten aus Bahnen 2–5. Der monoklonale apo(B)-100 Antikörper wurde mit einer 1/5000 Verdünnung verwendet. Die Proteine wurden mit ECL-Reagenzien sichtbar gemacht.
33 ist ein SDS-PAGE-Gel von Calciuimniederschlägen aus 4 DIC-Patienten, das unter reduzierenden (Bahnen 1–4) oder nicht-reduzierenden (Bahnen 5–8) Bedingungen elektrophoretisiert wurden. Ungefähr 5 μg Protein wurden von Patient Nr. 1 (Bahnen 1 und 5), Patient Nr. 2 (Bahnen 2 und 6), Patient Nr. 3 (Bahnen 3 und 7) und Patient Nr. 4 (Bahnen 4 und 8) geladen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Blau eingefärbt, abgefärbt und getrocknet.
34 ist eine Darstellung der Peaks 1 und 3, die aus einer Q-Sepharose-Säule aus gewaschenem Calciumniederschlag gewonnen wurde.
35 ist eine Graphik, die die Trübungsänderungen, die mit der Zugabe eines Überschusses CRP und Ca⁺⁺ zu isolierten Lipoproteinen aus normalem Plasma einhergeht, darstellt.
36 ist eine Graphik, die die Quantifizierung der Wechselwirkung zwischen CRP und VLDL darstellt. Rekombinantes CRP und normales VLDL wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen im Puffer gemischt und dann wurden maximale Trübungsänderungen nach Zugabe von Ca²⁺ aufgenommen. Die VLDL Konzentrationen (gemessen als Cholesterin) betrugen: 0,030 mM (Quadrate), 0,065 mM (Dreiecke), 0,10 mM (Rauten) und 0,15 mM (Kreise). Die Linien sind Regressionskurven.
37 ist eine Graphik, die die Quantifizierung der Wechselwirkung zwischen CRP und VLDL darstellt. Rekombinantes CRP und normales VLDL wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen in Lipoprotein-defizientem Plasma vermischt und dann wurden die maximalen Trübungsänderungen nach Zugabe von Ca²⁺ aufgenommen. Die VLDL Konzentration (gemessen als Cholesterin) betrugen: 0,030 mM (Quadrate), 0,065 mM (Dreiecke), 0,10 mM (Rauten) und 0,15 mM (Kreise). Die Linien sind Regressionskurven.
38 ist eine Graphik, die die Calciumkonzentrationsabhängigkeit der Bildung des VLDL/CRP-Komplexes darstellt. Die Komplexbildung ist bei 5,0 mM Calcium zur Hälfte maximal.
39 ist eine Graphik, die die Trübungsänderungen, die mit veränderten Konzentrationen von VLDL in Gegenwart eines Überschusses CRP im Puffer und im Lipoprotein-defizienten Plasma einhergeht, darstellt.
40 ist eine Graphik, die die Hemmung der Bildung des VLDL/CRP-Komplexes durch EACA darstellt. Der IC₅₀-Wert für die Hemmung durch EACA beträgt 2,1 mM.
41 ist eine Graphik, die die Trübungsänderung gegenüber unterschiedlichen CRP-Konzentration darstellt.
42 ist eine Graphik, die den Zusammenhang zwischen dem Niveau von CRP im Komplex mit VLDL und die Trübungsänderung nach Recalcifizierung der Plasmaproben des Patienten darstellt. Die Gesamtkonzentration an CRP und VLDL (Cholesterin) wurde in 15 Patientenplasmen gemessen. Das Niveau an komplexiertem CRP wurde berechnet unter Verwendung der Parameter für die im normalen Lipoprotein-defizienten Plasma gemessene Komplexbildung, ergänzt durch normales VLDL und rekombinantes CRP. Die Änderung des Absorptionsvermögens bei 405 nm (Trübung) wurde 20 Minuten nach der Zugabe von CaCl₂ und des Thrombininhibitors PPACK zu den Proben gemessen.
43 ist eine Graphik, die den Zusammenhang zwischen den VLDL-Niveaus und den Trübungsänderungen nach Recalcifizierung des Patientenplasmas gegenüber veränderten VLDL Konzentrationen darstellt.
44 ist eine Graphik, die MDA-Wellenformen für normale, biphasische und biphasische/Thrombininhibitorproben darstellt.
45 ist ein nicht-reduzierendes SDS-PAGE-Gel von isoliertem Niederschlag vor und nach Aniontauscherchromatographie. Die Bahnen 1–3 wurden mit dem Ausgangsmaterial, Peak 1 bzw. Peak 3 beladen.
46 sind nicht-reduzierende SDS-PAGE-Gele, die dem Immunoblotting unterworfen und mit entweder anti-APO(B)- (A), anti-CRP- (B) oder anti-SAA- (C) Antikörper untersucht wurden. Die Blots zeigen die Analyse von isoliertem Niederschlag vor und nach Anionentauscherchromatographie. Die Bahnen 1–3 wurden mit Ausgangsmaterial, Peak 1 bzw. Peak 3 beladen.
47 ist eine Graphik, die die Trübungsänderungen darstellt, die mit einer Mischung für Peaks 1 und 3, isoliert aus Anionentauscherchromatographie, einhergehen.
48 ist eine Graphik, die den Zeitverlauf der Trübungsänderungen nach der Zugabe von Ca⁺⁺ zu Mischungen aus normalem Plasma und dem Plasma eines Patienten mit biphasischer Wellenform zeigt. Die Werte rechts sind Volumina von Patientenplasma in einer Gesamtmenge von 50 μl.
49 ist eine Graphik, die eine Standardkurvenuntersuchung der Änderung der Trübung darstellt, die mit unterschiedlichen Mengen von zugegebenem Patientenplasma einhergeht. 1 ml Patientenplasma entspricht 1 Einheit an Aktivität.
50 ist eine Graphik, die die Wirkung von EACA auf Ca⁺⁺-abhängige Trübungsänderungen darstellt, die mit VLDL und CRP einhergehen.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Mit der vorliegenden Erfindung kann nicht nur eine besondere Abnormalität (hämostatische Fehlfunktion) festgestellt werden, sondern zusätzlich das Fortschreiten der Krankheit bei einem einzelnen Patienten überwacht werden. Insbesondere kann eine Systemstörung und/oder Sterblichkeit vorhergesagt werden. Hämostatische Fehlfunktion, wie sie hierin verwendet wird, ist ein Zustand, der durch die Bildung eines Niederschlags (vor oder in Abwesenheit von Gerinnungsbildung, in Abhängig des verwendeten Reagenzes) nachgewiesen wird.
Die Prognose der disseminierten intravasalen Gerinnung (DIC – eine Art der hämostatischen Fehlfunktion) wurde durch das Fehlen eines frühen, nützlichen und schnell verfügbaren diagnostischen Markers behindert. Es wurde festgestellt, daß die Erfindung nicht nur als früher diagnostischer und einzelner Überwachungsmarker von DIC nützlich ist, sondern zusätzlich die quantifizierbaren und standardisierbaren Änderungen eine prognostische Anwendung im Klinikmanagement erlauben.
Disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) ist eine zweite Reaktion auf eine vorher bestehende Symptomatik, wobei die hämostatische Reaktion im Gegensatz zu den konzentrierten Vorkommnissen normaler Blutgerinnung gestört und verbreitet wird. Trotz Verbesserungen sowohl in der Intensivpflegeführung von Patienten als auch in unserem grundlegenden Wissen des hämostatischen Mechanismus von DIC, ist das Überleben dieser Patientengruppe immer noch sehr entmutigend. Grundlegend für die Handhabung dieser Komplikation ist die Anwendung einer aggressiven Therapie, die darauf gerichtet ist, die primäre Symptomatik als die Quelle des auslösenden Stimulus zu verhindern oder gänzlich auszurotten. Praktisch gesprochen bleibt jedoch das Problem einer frühen Erkennung von DIC, um schnelles und angemessenes Eingreifen zu ermöglichen. Obwohl das technologische Arsenal, das dem klinischen Forscher zur Verfügung steht, sich sehr stark ausgeweitet hat, schließt die Geschwindigkeit von akuter DIC die meisten der spezifischeren Untersuchungen aus und das Vertrauen wird immer noch in herkömmliche Screeninguntersuchungen wie z. B. die Prothrombinzeit (PT), die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und die Blutplättchenzahl gelegt. Diesen Untersuchungen fehlt die Spezifität als eine einzelne Grundlage und sie sind bei DIC nur nützlich, wenn sie zu weiteren Bestimmungen des Fibrinogen und der Fibrinspaltprodukte/D-Dimere führen. Änderungen bei diesen Parametern treten oft nicht alle zur selben Zeit auf und daher sind oft fortlaufende Untersuchungen nötig, die unweigerlich zu einer Verzögerung der Diagnose und klinisch nützlichem Eingreifen führen.
Die normale, sigmoidale Erscheinungsform einer aPTT-Transmissionswellenform (TW) ändert sich zu einer „zweiphasigen" (biphasischen) Erscheinungsform bei DIC-Patienten. Dies stellt einen Verlust des Plateaus einer normalen aPTT-TW dar, mit Ausbildung einer Steigung mit anfänglich geringem Gradienten, gefolgt von einer viel steileren Steigung (1a und b). Zusätzlich kann dieses zweiphasige Muster sogar dann beobachtet werden, wenn das aPTT-Blutgerinnungszeitergebnis normal ist.
Frisch genommene Blutproben, die eine PT oder eine aPTT erforderten, wurden vorausschauend über eine zweiwöchige Arbeitsphase analysiert. Diese lagen in 0,105 M Trinatriumcitrat in dem Verhältnis von einem Teil Anticoagulanz zu 9 Teilen Vollblut vor und das blutplättchenarme Plasma wurde auf dem MDA (Multichannel Discrete Analyzer) 180, einem automatisierten Analysator zum Durchführen klinischer Laborgerinnungsuntersuchungen unter Verwendung eines optischen Nachweissystems (Organon Teknika Corporation, Durham, NC, USA) analysiert. Zusätzlich zum Ableiten der Gerinnungszeiten für sowohl PT (normal 11, 2–15 s) unter Verwendung von MDA Simplastin LS^TM als auch aPTT (normal 23–35 s) unter Verwendung von MDA Platelin LS^TM mit 0,025 M Calciumchlorid (Organon Teknika Corporation, USA), wurde eine Analyse der TW für die aPTT bei jeder Gelegenheit bei einer Wellenlänge von 580 nm durchgeführt. Um das visuelle Profil zu quantifizieren wurde die Lichttransmissionsmenge nach 25 Sekunden aufgenommen. Eine normale Wellenform besitzt eine Lichttransmission von 100%, die am Meßgerät und in 1a ohne den Dezimalpunkt als 10000 dargestellt wird. Daher wird eine biphasische Änderung eine verminderte Lichttransmission von weniger als 10000 besitzen. Wie aus 1b ersichtlich ist, korrelieren abnehmende Niveaus an Lichttransmission vor der Gerinnungsbildung direkt mit zunehmender Steigung der biphasischen Steigung. Die Aufnahme der Lichttransmission nach 25 Sekunden erlaubt auch eine Standardisierung zwischen Patienten und innerhalb desselben Patienten im Verlauf der Zeit. Wenn das minimale Niveau der Lichttransmission für jede Probe statt dessen verwendet würde, würde dies durch Veränderungen der Gerinnungszeit des aPTT beeinflußt und wäre daher für Vergleiche nicht ideal.
Um sicherzustellen, daß keine Fälle von DIC übersehen werden, wurden die folgenden Kriterien befolgt. Wenn (a) eine abnormale, biphasische TW festgestellt wurde oder (b) eine spezielle DIC-Untersuchung angefordert wurde oder (c) wenn eine Verlängerung entweder der PT oder der aPTT in Abwesenheit offensichtlicher Antikoagulantientherapie vorlag, wurde eine vollständige DIC-Untersuchung durchgeführt. Dies schließt zusätzlich die Thrombinzeit (TT) (normalerweise 10,5–15,5 Sekunden), Fibrinogen (Fgn) (normal 1,5–3,8 g/l) und eine Abschätzung von D-Dimer-Niveaus (normalerweise < 0,5 mg/l) auf dem Nyocard D-Dimer (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegen) ein. Blutplättchenzahlen (Plt) (normalerweise 150–440 10⁹/1), die mit einer EDTA Probe zur selben Zeit durchgeführt wurden, wurden aufgenommen. Zusätzlich wurden klinische Details bei jedem Patient mit einer biphasischen TW oder Gerinnungssabnormalitäten, die mit DIC vereinbar sind, aufgeklärt.
Die Diagnose von DIC wurde im Zusammenhang von sowohl Labor- als auch klinischen Befunden von mindestens 2 Abnormalitäten in den Screeninguntersuchungen (erhöhte PT, erhöhte aPTT, reduziertes Fgn, erhöhte TT oder reduzierte Plt) zusätzlich zu dem Befund eines erhöhten D-Dimerniveaus (> 0,5 mg/l) in Verbindung mit einem primären Zustand, der in der Pathogenese von DIC erkannt wurde, streng festgelegt. Hintereinanderfolgende Screeninguntersuchungen lagen auch für diese Patienten vor, um den Fortlauf und die Bestätigung der Diagnose von DIC aufzuzeichnen, wie auch direkte klinische Beurteilung und Handhabung. Für eine statistische Analyse wurden die Werte der Sensitivität, der Selektivität, der positiven und negativen Vorhersage der aPTT-TW für die Diagnose von DIC berechnet, wobei eine zwei-mal-zwei Tabelle angewandt wurde. 95% Konfidenzintervalle wurden durch genaue binominale Verfahren berechnet.
Insgesamt wurden 1470 Proben analysiert. Diese stammten von 747 Patienten. 174 Proben (11,9%) aus 54 Patienten hatten die biphasische Wellenformänderung. Für 22 dieser 54 Patienten standen mehr als 3 sequentielle Proben zur Analyse zur Verfügung. In 41 Patienten wurde DIC diagnostiziert, wobei 30 von ihnen eine Transfusionsunterstützung mit frischem, gefrorenem Plasma, Cryoprecipitat oder Blutplättchen benötigten. Die zugrundeliegenden klinischen Funktionsstörungen sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1

* schließt Hypoxie, Acidose, Lithiumüberdosis und Transplantatabstoßung ein 40 von 41 Patienten mit DIC besaßen die biphasische TW. Das eine falsch-negative Ergebnis (DIC ohne eine biphasische TW) trat bei einem Patienten mit Präeklampsie (PET) auf, wobei die einzige verfügbare Probe zur Analyse eine verlängerte PT von 21,0 s, aPTT von 44,0 s und erhöhte D-Dimere von 1,5 mg/l zeigte. 5 weitere Patienten wurden in dieser Studie mit PET identifiziert und keiner hatte entweder DIC oder eine biphasische TW. Von den 14 Patienten mit einer biphasischen TW, die die Kriterien von DIC nicht erfüllten, besaßen alle einige Anzeichen für eine Koagulopathie mit Anomalien in einer oder zwei der Screeninguntersuchungen. Diese abnormalen Ergebnisse erfüllten die oben definierten Kriterien für DIC nicht. 4 dieser 14 Patienten besaßen chronische Lebererkrankungen mit verlängerter PT und leichte Thrombocytopenie. Weitere 2 Patienten besaßen Vorhofflimmern mit lediglich isolierter Erhöhung der D-Dimerniveaus. Die verbleibenden 8 Patienten waren auf der Intensivstation mit multipler Organfehlfunktion, die von einem Trauma oder einer vermuteten Infektion herrühren, jedoch ohne die klassischen Laborwertänderungen des DIC. Die Profile dieser Patienten wurden in der Intensivstation als übereinstimmend mit der „systemischen inflammatorischen Reaktion" (SIRS; systemic inflammatory response syndrome) beschrieben. Basierend auf diesen Zahlen besitzt die biphasische TW eine Sensitivität von 97,6% für die Diagnose von DIC mit einer Spezifität von 98%. Die Verwendung einer optischen Transmissionswellenform wurde bei der Erkennung der biphasischen Wellenform als hilfreich empfunden.

TABELLE 2
Sensitivität 97,6% (Cl 85,6–99,99%), Spezifität 98,0% (Cl 96,6–98,9%), positiver Vorhersagewert 74,0% (Cl 60,1–84,6%), negativer Vorhersagewert 99,9% (Cl 99,1–99,99%)
Der positive Vorhersagewert des Testes betrug 74%, der mit ansteigender Steigung der biphasischen Steigung und sinkenden Niveaus an Lichttransmission (Tabelle 2 und 2) anstieg. In den ersten zwei Tagen der Studie gab es 12 Patienten, die eine Anomalie bei den Gerinnungstests zuzüglich zu einer Erhöhung des D-Dimerniveaus besaßen. Dies waren Patienten, die sich klinisch von DIC erholten, das in der Woche vor der Studie auftrat. Dies führte zu dem Eindruck, daß TW-Änderungen enger mit klinischen Ereignissen zusammenhängen könnten, als die Standardmarker von DIC.
TABELLE 3

PT = Prothrombinzeit, aPTT = aktivierte, partielle Thromboplastinzeit,
TT = Thrombinzeit, Fgn = Fibrinogen, PTT = Plättchenzahl,
TW = Transmissionswellenform
* zeigt abnorme Änderungen, B = biphasisch, N = normal

Die Verfügbarkeit von mehr als 3 aufeinanderfolgenden Proben bei 22 Patienten erlaubt eine weitere Beurteilung. Tabelle 3 stellt solch ein Beispiel mit nacheinander folgenden Untersuchungsergebnissen eines Patienten mit E. coli Sepsis dar.
Dem Auftreten einer biphasischen TW gingen Änderungen bei den Standarduntersuchungen für die Diagnose von DIC voraus. Erst später am Tag wurden die PT, aPTT, PLT und D-Dimerniveaus abnormal und erfüllten die diagnostischen Kriterien für DIC. Die Behandlung mit intravenösen Antibiotika führte zu klinischen Verbesserungen am Tag 2 mit Normalisierung ihrer TW vor den Standardparametern des DIC. D-Dimere bzw. Plt waren 24 bzw. 48 Stunden später immer noch abnormal.
Dieser Zusammenhang zwischen klinischen Ereignissen und TW-Änderungen wurden bei allen DIC Patienten, bei denen Proben vorhanden waren, um den Verlauf der klinischen Ereignisse aufzuzeichnen, sichtbar. Als die TW-Änderungen durch Aufnehmen des Transmissionsniveaus nach 25 Sekunden quantifizierbar und standardisierbar waren, stellte diese Analyse eine Handhabe bei der Beurteilung der prognostischen Anwendbarkeit bereit. 3 stellt die Ergebnisse eines Patienten dar, der sich ursprünglich mit Peritonitis infolge eines Darmdurchbruchs zeigte. Dies wurde weiter verkomplizieit durch eine gramnegative, postoperative Sepsis mit anfänglicher Verschlechterung des DIC gefolgt von allmählicher Erholung nach entsprechender Therapie. Als die DIC anfänglich fortschritt, lag eine ansteigende Steigung in der biphasischen Steigung des TW und ein Abfall in den Lichttransmissionsniveaus vor. Eine Umkehrung dessen kündigte eine klinische Erholung an. 4 stellt die Ergebnisse eines Patienten dar, der schwere innere und äußere Verletzungen infolge eines Jetski-Unfalls erlitt. Obwohl er anfänglich mit Blutproduktunterstützung stabilisiert wurde, verschlechterte sich sein Zustand mit fortlaufendem Blutverlust und der Entwicklung fulminanter DIC. Die biphasische Steigung wurde ansteigend steil mit Abfällen bei dem Transmissionsniveau als sich die Folgen seiner Verletzungen als fatal herausstellten.
Da DIC aus einer Vielzahl von primären Fehlfunktionen herrühren kann, können die klinischen und laboratorischen Erscheinungsformen außerordentlich variabel nicht nur von Patient zu Patient, sondern auch bei demselben Patient im Verlauf der Zeit sein. Daher besteht ein Bedarf an Systemen, die nicht nur in ihrer Diagnose robust, sondern auch einfach und schnell durchzuführen sind. Obwohl gezeigt wurde, daß die biphasische TW anscheinend empfindlich auf hämostatische Fehlfunktion (z. B. DIC) ist und bei anderen ausgewählten Patienten mit Koagulationsanomalien oder beeinflußt durch entweder (i) präanalytische Variablen, (ii) unterschiedliche siliziumdioxidbasierte aPTT-Reagenzien, (iii) die Verwendung von Thrombin als Indikator der Gerinnungsreaktion oder (iv) Behandlung in der Form von Heparin oder Plasmaexpandern nicht beobachtet wurde, konnte die Robustheit dieser Untersuchung auf DIC nur durch eine vorausblickende Studie angegangen werden. Diese Studie hat gezeigt, daß die biphasische TW diagnostische Genauigkeit bei DIC mit einer Gesamtsensitivität von 97,6% und einer Spezifität von 98% bereitstellt. Im Gegensatz dazu hat keiner der Standardparameter auf einer einzelnen Basis (d. h. PT, aPTT, TT, Fgn, Plt, D-Dimere) oder selbst in Kombination den Grad der Sensitivität oder Spezifität erreicht. Die sofortige Verfügbarkeit von TW-Daten aus dem MDA-180 würde auch die Kriterien der Einfachheit und Schnelligkeit anders als die Messungen von Thrombin-Antithrombinkomplexen oder anderen Markern, die von der ELISA-Technologie abhängen, erfüllen. Zusätzlich sind die Vorteile der TW-Analyse, daß: (a) die biphasische TW-Änderungen die einzige, nützlichste Korrelation innerhalb einer isolierten Probe zu DIC zu sein scheint, und daher muß das Vertrauen nicht länger auf hintereinanderfolgende Abschätzungen einer Reihe von Untersuchungen beruhen, und (b) das Auftreten oder die Auflösung der biphasischen TW den Anderungen bei den herkömmlichen Standardparametern, die bei DIC überwacht werden mit starken, klaren Korrelationen zu klinischen Ereignissen und dem Ausgang vorausgehen kann.
Obwohl die biphasische TW auch bei Patienten beobachtet wurde, die kein DIC per se hatten, wie sie durch die obigen Kriterien definiert wurde, wurden die klinischen Zustände mit hämostatischer Fehlfunktion assoziiert – und zwar aktivierte Gerinnung vor dem Beginn der Plättchenbildung, die zu einer biphasischen Wellenform führte (z. B. bei chronischer Lebererkrankung oder bei den sehr kranken Patienten auf der Intensivstation, die multiple Organfehlfunktion besaßen). Es scheint, daß die biphasische TW für nicht offensichtliche oder kompensierte DIC empfindlich ist, und daß ein Transmissionsniveau von weniger als 90% (2) oder sequentielle Abfälle in diesem Niveau (4) eine Dekompensation hin zu einer offenkundigeren Erscheinungsform und möglicherweise fulminanten Form von DIC wiederspiegelt. Diese Erklärungsrichtung wird durch die Beobachtungen eines lediglich schwachen biphasischen TW (Transmissionsniveau von ungefähr 95%) bei 2 Patienten mit Vorhofflimmern gestützt; ein Zustand, der mit schwacher Gerinnungsaktivierung und angehobenen D-Dimerniveaus verbunden ist. Da keine Folgeproben von diesen zwei Patienten erhältlich waren, deren klinische Details anderweitig nicht nennenswert waren, können ihre biphasischen TW sehr wohl vorübergehend gewesen sein. Trotzdem zeigen diese Fälle, daß je niedriger das Niveau an Lichttransmission ist, desto wahrscheinlicher wird die biphasische TW für hämostatische Fehlfunktion, insbesondere DIC, vorhersagend.
Die Beobachtung einer normalen TW bei einem Patienten mit PET und DIC benötigt weitere Untersuchungen, da die Studie nicht selektiv darauf zielte, bestimme Patientengruppen zu untersuchen, und lediglich insgesamt 6 Patienten mit PET umfasste; die verbleibenden 5 davon hatten kein DIC. Eine Erklärung. die durch andere Befunde dieser Studie gestützt würde, ist, daß die Patienten sich von PET und DIC zum Zeitpunkt der Probennahme erholt haben könnten. Es könnte schon eine Normalisierung bei der biphasischen TW vor den anderen Parametern, die nach wie vor abnormal und indikativ für DIC waren, gegeben haben. Eine andere Erklärung ist, daß der gestörte hämostatische Prozeß bei PET lokalisierter ist und sich von DIC unterscheidet, das aus anderen Gegebenheiten hervorgeht. Solche Patienten reagieren dramatisch auf die Geburt des Fötus, was eine anatomische Lokalisierung des pathologischen Prozesses auf die Plazenta vermuten läßt, trotz Standardlaborgerinnungstests, die einen systemischen Beweis des Zustandes implizieren.
Beispiel:
Obwohl die Analyse der Transmission zu einem Zeitpunkt von 25 Sekunden hilfreich bei der Vorhersage von DIC ist, wurde eine zweite Ausführungsform der Erfindung gefunden, die die Sensitivität und die Spezifität stark verbessert. Es wurde festgestellt, daß bei Betrachten der Transmission zu einem bestimmten Zeitpunkt zum Feststellen eines Artefakts oder zu anderweitigem Abfall der Transmission an diesem Punkt führen kann, obwohl die Wellenform keine biphasische Wellenform ist. Zum Beispiel würde ein temporärer Abfall der Transmission nach 25 Sekunden bedeuten, daß solch eine Patientenprobe als biphasisch ausgewiesen wird, obwohl die Wellenform normal oder zumindest nicht biphasisch war. Auch wenn eine Patientenprobe eine besonders kurze Gerinnungszeit besitzt, dann, wenn die Gerinnungsbildung z. B. vor 25 Sekunden beginnt (oder welche Zeit auch immer vorausgewählt wurde), dann könnten die Wellenform als biphasisch ausgewiesen werden, obwohl der wahre Grund für eine verminderte Transmission nach 25 Sekunden aufgrund von bereits begonnener/aufgetretener Gerinnungsbildung vorliegt.
Daher wurde festgestellt, daß es eher wünschenswert ist, die Steigung der Wellenform vor dem Beginn der Gerinnungsbildung zu berechnen, als die Analyse der Transmission zu einem bestimmten Zeitpunkt. Diese Berechnung kann die Bestimmung der Gerinnungszeit gefolgt von der Bestimmung der Steigung der Wellenform vor der Gerinnungszeit einschließen. In einer zusätzlichen Ausführungsform wird die Steigung (nicht die Transmission) vor der Gerinnungszeit oder vor einem vorhergewählten Zeitraum bestimmt, je nachdem, welche weniger ist. Wie aus 11 ersichtlich ist, ist die Spezifität und die Sensitivität schlecht, wenn die Transmission zur Bestimmung von z. B. DIC verwendet wird. Wie jedoch aus 9 ersichtlich ist, werden die Spezifität und die Sensitivität stark verbessert, und sind besser als Standarduntersuchungen, die zur Diagnose von hämostatischer Fehlfunktion, wie z. B. DIC verwendet werden, wenn die Steigung vor dem Beginn der Gerinnungsbildung verwendet wird.
Zusätzliche Untersuchungen wurden mit drei Gruppen von Patienten durchgeführt. Die erste Gruppe bestand aus 91 aPTT-Untersuchungen, die mit Proben aus 51 unterschiedlichen Patienten mit bestätigter DIC durchgeführt wurden. Die zweite Gruppe von Daten bestand aus 110 aPTT-Untersuchungen, die mit Proben aus 81 unterschiedlichen Patienten, die nachgewiesenermaßen normal waren, durchgeführt wurden. Die dritte Gruppe von Daten schloß 37 aPTT-Untersuchungen ein, die mit 22 abnormalen, nicht DIC-Proben durchgeführt wurden. 5 stellt ROC-Graphiken für die Vorhersage von DIC für drei unterschiedliche Parameter, die aus den aPTT-Untersuchungen abgeleitet wurden, unter Verwendung der beschriebenen kombinierten Datensätze dar: (1) Transmission nach 25 Sekunden (TR25), (2) aPTT Gerinnungszeit, und (3) Steigung 1 (die Steigung bis zum Beginn der Gerinnungsbildung). Steigung 1 zeigte die beste Vorhersagekraft, gefolgt von TR25. Es wurde auch gezeigt, daß die Transmission nach 18 Sekunden vorhersagenden Wert besitzt, insbesondere wenn die aPTT Gerinnungszeit weniger als 25 Sekunden beträgt. Die „cutoffs", die mit der höchsten Effizienz für die drei Parameter verbunden sind, sind in Tabelle 4 aufgeführt:
Tabelle 4
Es sollte erwähnt werden, daß diese Grenzwerte sich mit der Aufnahme der dritten Gruppe verschoben haben und sich in Abhängigkeit des Probenbestandes wahrscheinlich wieder verändern würden. Die 6 und 7 zeigen die Histogramme für den DIC-, den normalen und den abnormalen/nicht DIC-Bestand für TR25 bzw. Steigung 1. Tabellen 5 und 6 zeigen die Daten der Histogramme in den 6 bzw. 7:
TABELLE 5
TABELLE 6
Die 8 und 10 zeigen die Gruppenverteilungen für Steigung 1 bzw. TR25; und die 9 und 11 zeigen die Gruppenverteilungen für Steigung 1 bzw. TR25. Die 9 und 11 zeigen partielle Untergruppen der Daten, die in den 8 und 10 gezeigt sind.
Wenn die Vorhersage der hämostatischen Fehlfunktion auf einem automatisierten oder halbautomatisierten Meßgerät durchgeführt wird, kann die erkannte biphasische Wellenform markiert werden. Auf diese Art und Weise kann der Benutzer der Maschine oder eine Einzelperson, die die Untersuchungsergebnisse interpretiert (z. B. ein Doktor oder anderer praktischer Arzt), über die Gegenwart der biphasischen Wellenform und die Möglichkeit/Wahrscheinlichkeit einer hämostatischen Fehlfunktion wie z. B. DIC alarmiert werden. Die Markierung kann an einem Monitor angezeigt werden oder ausgedruckt werden. Eine Steigung von weniger als ungefähr –0,0003 oder weniger als ungefähr –0,0005 ist der bevorzugte Grenzwert zum Anzeigen einer biphasischen Wellenform. Eine ansteigende Steigung der Steigung vor der Gerinnungsbildung korreliert mit dem Fortschreiten der Krankheit.
Die obigen Beispiele zeigen, daß die Wellenformanalyse der aPTT-Untersuchung charakteristische, biphasische Muster bei Patienten mit hämostatischer Fehlfunktion identifizieren kann. In der Mehrzahl der Fälle konnte diese Fehlfunktion als DIC ausgezeichnet werden. Dieses diagnostische Wellenformprofil wurde bei allen untersuchten aPTT-Reagenzien gefunden, die entweder auf Siliziumdioxid oder Ellagsäure basierten. Es wurde auch überraschenderweise festgestellt, daß eine biphasische Wellenform auch bei PT-Untersuchungen mit speziellen Reagenzien festgestellt werden kann, und daß die biphasische Wellenform ebenfalls indikativ für die hämostatische Fehlfunktion, hauptsächlich DIC, ist.
Unter Verwendung von Proben, die die biphasische aPTT-Wellenform zeigen, wurde das PT-Wellenformprofil unter Verwendung von PT-Reagenzien (Thromboplastin), und zwar Recombiplast^TM (Ortho), Thromborel^TM (Dade-Behring) und Innovin^TM (Dade-Behring), abgeleitet. Sowohl Recombiplast^TM als auch Thromborel^TM waren besonders gut beim Anzeigen biphasischer Reaktionen. Innovin^TM lag in seiner Sensitivität dazwischen. Unter Verwendung des Transmissionsniveaus der PT-Reaktion nach 10 Sekunden als quantitativem Index zeigten Recombiplast^TM und Thromborel^TM objektiv geringere Niveaus an Lichttransmission als Innovin^TM. Thromborel^TM kann bei der anfänglichen Lichttransmission einen leichten Anstieg vor einem anschließenden Abfall zeigen. Dies kann zum Teil mit der relativen Undurchlässigkeit von Thromborel^TM zusammenhängen.
Es wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, die aPTT-Profile unter Verwendung von Platelin^TM und PT-Wellenformprofilen unter Verwendung von Recombiplast^TM verglichen. Fortlaufende Proben aus einer Intensivstation wurden über einen Zeitraum von vier Wochen untersucht. Visuell und nach objektiver Auswertung (unter Vergleich von TL18 für aPTT und TL10 für PT) war das aPTT-Profil sensitiver gegenüber Änderungen der hämostatischen Fehlfunktion und klinischem Verlauf als das PT-Profil. Diese relative Empfindlichkeit kann im aPTT-Profil von 12 (Platelin) im Vergleich mit den PT-Profilen der 13 (Recombiplast) und 14 (Thromborel S) erkannt werden. Ausnahmslos erkennt die aPTT-Wellenform bei kleineren Änderungen der Lichttransmission Abnormalitäten leichter als die PT-Wellenform. Nichtsdestotrotz waren in schweren Fällen von hämostatischer Fehlfunktion beide biphasischen Profile übereinstimmend.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die zeitabhängige Messung, wie z. B. ein optisches Transmissionsprofil, im wesentlichen oder vollständig in Abwesenheit der Gerinnungsbildung durchgeführt werden. In dieser Ausführungsform wird ein Reagenz zugegeben, das die Bildung eines Niederschlags hervorruft, jedoch in einer Umgebung, in der kein Fibrin polymerisiert wird. Das Reagenz kann irgendein geeignetes Reagenz sein, das die Bildung eines Niederschlags in einer Probe eines Patienten mit hämostatischer Fehlfunktion, wie z. B. DIC, auslöst. Zum Beispiel können zweiwertige Kationen, bevorzugt Übergangsmetalle, und bevorzugter Calcium-, Magnesium-, Mangan-, Eisen- oder Bariumionen zu einer Testprobe zugegeben werden. Diese Ionen rufen die Aktivierung einer atypischen Wellenform hervor, die als Indikator für hämostatische Fehlfunktion dienen kann. Es ist auch möglich, diese Untersuchung in Abwesenheit eines Gerinnungsmittels (aPTT, PT oder ähnliches) durchzuführen. Als Teil des Reagenzes, das das Aktivierungsmittel der atypischen Wellenform umfaßt, oder separat in einem anderen Reagenz, kann auch ein Gerinnungshemmer bereitgestellt werden. Der Gerinnungshemmer kann irgendein geeigneter Gerinnungshemmer wie z. B. Hirudin, PPACK, Heparin, Antithrombin, l2581, etc., sein. Die Bildung der atypischen Wellenform kann auf einem automatisierten Meßgerät, das in der Lage ist, solch eine Wellenform zu erkennen, wie z. B. eines, das Trübungsänderungen überwacht (z. B. durch Überwachen von Änderungen der optischen Transmission), überwacht und/oder aufgezeichnet werden.
44 ist eine Darstellung von zwei Wellenformen: die Wellenform (Dreiecke) ist ein Testlauf mit einer Probe unter Verwendung eines aPTT-Gerinnungsmittels, und das zu einer atypischen (biphasischen) Wellenform führt, wohingegen die Wellenform (Quadrate) ein Testlauf mit einer Probe ist, bei der ein Gerinnungshemmer verwendet wird (zusammen mit einem Reagenz, wie z. B. einem zweiwertigen Metallkation, das die Bildung eines Niederschlags in der Probe hervorruft). Die Wellenform (Quadrate) ist beispielhaft für eine Wellenform, die bei Patienten mit hämostatischer Fehlfunktion auftreten kann, wobei kein Gerinnungsmittel verwendet wurde und/oder ein Gerinnungshemmer vor Aufnahme des zeitabhängigen Meßprofils zugegeben wurde. Allgemein gesprochen, je größer die Steigung der Wellenform (je größer der Abfall der Transmission im gleichen Zeitintervall) aufgrund der Niederschlagsbildung, desto größer die Schwere der hämostatischen Fehlfunktion des Patienten. 15 ist eine Standardkurve für ELISA von CRP (CRP isoliert aus einem Patienten, der als Standard verwendet wurde).
Der Niederschlag, der in der vorliegenden Erfindung gebildet wurde, wurde mittels Chromatographie und Reinigung isoliert und charakterisiert. Gelfiltration wurde wie folgt durchgeführt: eine Säule (Hiprep Sephacryl S-300 High resolution – z. B. Auflösung von 10 bis 1500 kDa) wurde verwendet. Das Volumen betrug 320 ml (d = 26 mm, l = 600 mm), und die Flußrate betrug 1,35 ml/min.
16 ist ein Diagramm, das den Zeitverlauf der Trübung in einer Probe nach Zugabe eines Niederschlag induzierenden Mittels (in diesem Fall zweiwertiges Calcium) und eines Thrombininhibitors (in diesem Fall PPACK) zu Mischungen von Patienten- und normalen Plasmen zeigt. 17 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der maximalen Trübungsänderung und der Menge von Patientenplasma in einer Probe zeigt. 0,05 Einheiten beinhalten 100% Patientenplasma.
Die Schritte, die bei der Reinigung der Bestandteile, die in der Trübungsänderung in einem Patientenplasma beteiligt sind, verwendet wurden, sind die folgenden: PPACK (10 μM) wurde zu Patientenplasma zugegeben. Calciumchlorid wurde zu 50 μM zugegeben, gefolgt von 8 Minuten Inkubation, gefolgt von der Zugabe von Ethanol zu 5%. Die Probe wurden dann bei 10500 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Niederschlag wurde dann in HBS/1mM Citrat/10 μM PPACK aufgelöst, gefolgt von Fraktionierung durch 35–70% (NH₄)₂SO₄. Schließlich wurde eine Ionentauscherchromatographie unter Verwendung eines 5 ml Bett, 0,02–0,5 M NaCl Gradienten und 50 ml/Seite, um die Fraktionen in 2 ml aufzusammeln, durchgeführt. 18 zeigt die Ergebnisse der Anionentauscherchromatographie (Q-Sepharose) von Material, das nach der Fraktionierung des Patientenplasmas mit 35–70% Ammoniumsulfat erhalten wurde.
Die 19A und 19B zeigen die nichtreduzierte bzw. reduzierte SDS-PAGE von unterschiedlichen Fraktionen, die nach Fraktionierung des Patientenplasmas erhalten wurden. Die Beladungsorientierung (von links nach rechts): 5–15% Gradient/Neville Gel (ungefähr 10 μg Protein pro well beladen). In Bahn 1 sind Molekulargewichtstandards (94, 67, 45, 30, 20 und 14 kDa von oben nach unten). In Bahn 2 ist der 35%-ige (NH₄)₂SO₄ Niederschlag, wobei in Bahn 3 der 70%-ige (NH₄)₂SO₄ Überstand ist. Bahn 4 ist Q-Sepharose Ausgangsmaterial. In den 19A und 19B sind (aus 18) auch die Peaks 1, 2a, 2b und 3 in jeweils den Bahnen 5, 6, 7 und 8 gezeigt. Bahn 9 ist Niederschlag l, wobei in Bahn 10 wiederum Molekulargewichtsstandards sind. Die Ergebnisse der NH₂-Terminus-Sequenzierung zeigte, daß Peak 3, das 22 kDa Protein in den Bahnen 8 und 9 C-reaktives Protein (CRP) ist, und dass das 10 kDa Protein in Bahn 9 das Humanserum Amyloid A (SAA) ist. Peak 1 in Bahn 5 ist ein >300 kDa Protein, das, wie aus 21 ersichtlich ist, Teil des Komplexes des Proteins (zusammen mit CRP) in dem Niederschlag ist, der aufgrund der Zugabe eines zweiwertigen Metallkations zu der Plasmaprobe gebildet wurde.
Immunoblots von CRP wurden im normalen (NHP) und DIC-Plasma durchgeführt. Blot A (siehe 20): (verwendete 0,2 μl Plasmen für reduzierendes SDS-PAGE/CRP Immunoblotting). Beladungsorientierung (von links nach rechts): NHP; Pt 5; 3; 1; 2; 4; und 8. Für Blot B: Beladungsorientierung (von links nach rechts): NHP; Pt 9; 10; 11; 7; 6; 12. Für Blot C: (CRP, gereinigt aus DIC Patientenplasma) – Beladungsorientierung (von links nach rechts; ng CRP beladen): 3,91; 7,81; 15,625; 31,25; 62,5; 125; 250. Die Blots wurden mit 2% (w/v) BSA in PBS blockiert, pH 7,4 und dann sequentiell mit Hasen anti-human CRP-IgG (Sigma, Cat# C3527, Verdünnung 1:5000 in PBS/0,01 % Tween 20) beladen und dann mit dem Test erkennenden Antikörper, der mit HRP verbunden ist (Verdünnung 1:25000 in PBS/0,01 % Tween 20) behandelt.
21 zeigt die Trübungsänderungen nach der Zugabe von zweiwertigem Calcium zu Materialien, die durch Q-Sepharosechromatographie in Abwesenheit von Plasma erhalten wurden. Kein einziger Peak ergab eine positive Reaktion, jedoch eine Mischung aus Peak 1 und Peak 3 Materialien ergab eine positive Reaktion, die die Beteiligung von CRP, einem 300 kDa Protein, und einem oder mehreren anderen Proteinen in dem Niederschlag zeigt (Peak 3 und Plasma war die Kontrolle). Tabelle 7 ist eine Tabelle, die CRP-Mengen in μg/ml (bestimmt durch ELISA) zeigt. Delta A405nm ist die maximale Trübungsänderung, die beobachtet wird, wenn Patientenplasmen in Gegenwart des Thrombininhibitors PPACK recalcifiziert wurden. Tabelle 7 zeigt daher, daß Patienten mit erhöhter Absorption unterschiedliche erhöhte Niveaus an CRP besitzen, wodurch einmal mehr gezeigt wird, daß mehr als ein Protein an der Bildung des Niederschlages beteiligt ist.
TABELLE 7
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird das Verhältnis Reagenz zu Plasma zwischen mehreren Tests, die ein Reagenz verwenden, das die Niederschlagsbildung induziert, variiert. Diese Variation ermöglicht die Verstärkung der Erkennung der Niederschlagsbildung durch Optimierung des Verhältnisses Reagenz zu Plasma (z. B. Variieren der Plasma- oder Reagenzkonzentrationen). Alternativ kann die Steigung aufgrund der Niederschlagsbildung über mehrere Tests ermittelt werden. Wie aus 22 ersichtlich ist, wird die Reaktion auf steigende Calciumkonzentrationen in optischen Transmissionswellenformprofilen gezeigt. Die Felder A und B zeigen zwei normale Patienten, bei denen Calciumkonzentrationen variiert wurden (es wurden keine Gerinnungsmittel verwendet), wohingegen die Felder C und D zwei Patienten mit hämostatischer Fehlfunktion (DIC in diesen beiden Fällen) zeigen, bei denen die Metallkationenkonzentration (Calcium) variiert wurde (das Calcium allein ist nicht zu irgendeiner wesentlichen Fibrinpolymerisation in der Lage).
Obwohl die Niederschlagsbildung bei Patienten mit hämostatischer Dysfunktion erkannt werden kann, wenn ein Gerinnungsmittel verwendet wird, ist es vorteilhaft, daß das verwendete Reagenz in der Lage ist, den Niederschlag ohne Fibrinpolymerisation zu bilden. Wie aus 23 ersichtlich ist, ist die Steigung ausdrucksstärker und leichter zu erkennen, wenn ein Reagenz wie z. B. Calciumchlorid alleine (Feld A) im Vergleich dazu, wenn es zusammen mit einem Gerinnungsmittel wie z. B. einem aPTT-Reagenz (Feld B) verwendet wird. Wie aus 24 ersichtlich ist, ergeben alle Parameter einschließlich Steigung_1 gute Ergebnisse, wenn ein Gerinnungshemmer zugegeben wurde (in diesem Fall Heparin), und Steigung_1 zeigte die beste Sensitivität. Aufgrund dessen ist ein Reagenz, das zur Niederschlagsbildung in Abwesenheit von Fibrinpolymerisation und/oder eines Gerinnungshemmers in der Lage ist, bevorzugt.
Wie aus 25 ersichtlich wird, wurden CRP-Niveaus aus 56 Intensivpatienten gegen die Transmission nach 18 Sekunden aufgetragen. Die gepunktete Linie ist der Grenzwert für eine abnormale Transmission nach 18 Sekunden. 26 zeigt mehr Proben mit CRP und einem Abfall der Transmission nach 18 Sekunden (10000 – TR18). Diese Figuren zeigen, daß Patienten mit abnormalem Transmissionsniveau aufgrund von Niederschlagsbildung alle erhöhte Niveaus an CRP besitzen. Jedoch nicht alle Patienten mit erhöhten Niveaus an CRP besitzen abnormale Transmissionsniveaus, wodurch angezeigt wird, daß mehr als CRP an dem Niederschlag beteiligt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Bildung des Niederschlages, der einen Komplex aus Proteinen einschließlich CRP umfaßt, durch die Verwendung eines Latexagglutinationstests erkannt und/oder quantifiziert. Bei diesem Verfahren werden Antikörper entweder gegen das 300 kDa Protein oder CRP gezüchtet. Ob monoklonale oder polyklonale Antikörper verwendet wurden, wurden diese an ein geeignetes Latex gebunden und mit einer Testprobe eines Patienten oder bevorzugt mit dem Niederschlag selbst umgesetzt, der vom Rest des Patientenplasmas getrennt wurde, in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren. Die Menge an Agglutination des Latex ist proportional zur Menge des CRP-Komplexes in der Probe.
Alternativ können Immunoassays, wie z. B. ELISAs, gemäß bekannten Verfahren (Sandwich, Kompetition oder andere ELISA) durchgeführt werden, bei denen das Vorhandensein und/oder die Menge des Proteinkomplexes bestimmt wird. Z. B. bindet ein Antikörper, der an eine feste Phase gebunden ist, an CRP im CRP-Proteinkomplex. Dann wird ein zweiter markierter Antikörper zugegeben, der auch an das CRP in dem CRP-Proteinkomplex bindet, wodurch der Komplex aus Proteinen detektiert wird. Alternativ kann der zweite markierte Antikörper für das 300 kDa Protein in dem Komplex spezifisch sein. Oder in einer unterschiedlichen Untersuchung kann der Antikörper, der an die feste Phase gebunden ist, an das 300 kDa Protein in dem Komplex binden, wobei der zweite (markierte) Antikörper entweder an das 300 kDa Protein oder an CRP bindet. Solche Immunoassays könnten in ähnlicher Weise dahingehend verändert werden, daß sie spezifisch für SAA sind. Die obigen Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt und in Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow, Ed and Lane, David, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, dargelegt, dessen Gegenstand hierin durch Verweis aufgenommen wird.
Nach weiteren Untersuchungen hat sich herausgestellt, daß das „300 kDa" Protein in der Tat die Apo(B)-100 Verbindung von VLDL (Lipoprotein mit sehr geringer Dichte, very low density lipoprotein) mit einem Molekulargewicht von 500 bis 550 kDa ist. Es können ebenfalls weitere Lipoproteinkomplexe in dem Niederschlag vorliegen, einschließlich CRP-LDL (CRP komplexiert mit Lipoprotein niedriger Dichte), CRP-IDL (CRP komplexiert mit Lipoprotein mittlerer Dichte), CRP-Chycomicrone, CRP-HDL (CRP komplexiert mit Lipoprotein hoher Dichte) und SAA-VLDL (Serumamyloid A komplexiert mit VLDL).
Um die Bestandteile der Komplexe zu charakterisieren, wurde der Niederschlag in Citrat dispergiert und Anionentauscherchromatographie unterworfen (siehe 34). Das Verfahren ergab zwei größere Peaks (hierin im weiteren als „Peak 1" und „Peak 3" bezeichnet), wobei der erste davon sehr trübe war. Die Trübung war für das Auge offensichtlich und wurde durch Absorptionsmessungen bei 320 nm quantifiziert. Die Fraktionen wurden auf die Aktivität (Trübungsbildung im normalen Plasma nach Recalcifizierung) hin untersucht. Nur Peak 3 zeigte eine Trübung, wenn er zu normalem Plasma zugegeben wurde.
Um das ausgefällte Material weiter zu charakterisieren, wurden Lipid- und Proteinanalysen durchgeführt. Zusätzlich wurden Fraktionen, die nach der Anionentauscherchromatographie erhalten wurden, SDS-PAGE, Immunoblotting und Aminosäuresequenzanalyse unterworfen. Es wurde gezeigt, daß die isolierten Materialien Proteine, Phospholipide, Cholesterin und Triglyceride in Verhältnissen umfassen, die typisch für Lipoproteine mit sehr geringer Dichte (VLDL und IDL) sind. Siehe Tabelle 8. Fraktionierung durch Anionenaustausch und SDS-PAGE hat gezeigt, daß der Niederschlag Proteinbanden enthält, die mit Coomassie blau verfärbt werden können, mit offensichtlichen Molekularmassen von 500 kDa, 22 kDa und 10 kDa. Das 22 kDa Protein ergab eine Aminoterminus-Sequenz QTDMS_KAFV (SEQ ID NO: 1), die das Protein als C-reaktives Protein identifizierte. Das 10 kDa Protein ergab zwei Reste bei jedem Zyklus im Sequenator. Sie waren in Übereinstimmung mit dem Serumamyloid A, beginnend mit den Aminosäuren 18 und 19. Die 500 kDa Spezies ergab keine Sequenz, vermutlich aufgrund seiner kleiner molaren Menge. Das hohe Molekulargewicht dieser Bande war jedoch übereinstimmend mit Apo-Lipoprotein B, dem Hauptproteinbestandteil von VLDL.
TABELLE 8

PL = Phospholipid, UC = unverestertes Cholesterin,
CE = Cholesterylester, TG = Triacylglycerin

Nach der Fraktionierung wurde die Bande mit hohem Molekulargewicht und SAA in Peak 1 erhalten, und CRP wurde im Peak 3 erhalten (siehe 34). Die Peaks 2a und 2b konnten in 18 beobachtet werden, nicht jedoch in 34, da in der Untersuchung, die für 18 vorgenommen wurde, die Menge an Protein und Lipoprotein in der Probe die Kapazität der Säule überstieg. Wenn die Säule nicht überladen ist, wie in der Untersuchung für 34, treten die Peaks 2a und 2b nicht auf. Der Niederschlag und die Materialien in den Peaks 1 und 3 wurden durch Immunoblotting auf Apo(B)-100, CRP und SAA hin untersucht. Die Ergebnisse stimmten mit der identifizierung des 500 kDa Materials als Apo(B)-100, dein 22 kDa Material als CRP und dem 10 kDa Material als SAA überein.
Das Ausgangsmaterial, die Materialien in Peaks 1 und 3 und eine Mischung davon wurden in Abwesenheit von Plasma recalcifiziert, um zu bestimmen, welcher Bestandteil oder welche Bestandteile für die Bildung eines Niederschlags notwendig sind. Die Ergebnisse zeigten, daß das Ausgangsmaterial, nicht jedoch die isolierten Bestandteile aus den Peaks 1 und 3, einen Niederschlag bilden, wenn sie recalcifiziert werden. Die Mischung der Peaks 1 und 3 jedoch bildete einen Niederschlag. Daher kann geschlossen werden, daß mindestens VLDL und CRP benötigt werden, um den Niederschlag zu bilden. Der Vorgang wurde mit mindestens 10 unterschiedlichen positiven Plasmen wiederholt, und die Ergebnisse waren jeweils dieselben. Gelegentlich jedoch wurde SAA nicht in den isolierten Peaks gewonnen. Nichtsdestoweniger bildeten sich Niederschläge mit VLDL und CRP in Abwesenheit von SAA. Es wird daher geschlossen, daß SAA in dem Komplex/Niederschlag eingeschlossen sein kann, jedoch für dessen Bildung nicht notwendig ist.
Es wurden Rekonstruktionsexperimente durchgeführt, um die Fähigkeit der oben genannten Komplexe zu überprüfen, daß sie sich bilden. Wie aus 27 ersichtlich ist, zeigen VLDL und P3 (Peak 3 = CRP, siehe 18) bei unterschiedlichen Konzentrationen (100/20 μl: VLDL/CRP und 50/20 μl VLDL/CRP) einen Anstieg der Absorption aufgrund von Trübung, verglichen mit VLDL alleine. Ähnlich ist aus den 28 und 29 ersichtlich, daß IDL und CRP, wie auch LDL und CRP (und zu einem geringeren Ausmaß HDL und CRP, wie aus 30 ersichtlich ist) auch einen Anstieg der Trübung erzeugen, wenn sie miteinander kombiniert werden. Und wie des weiteren aus Tabelle 9 ersichtlich ist, besitzen die unterschiedlichen Lipoproteine unterschiedliche Calcium abhängige Trübungsaktivität in Gegenwart von gereinigter CRP.
TABELLE 9
Interessanterweise wurde herausgefunden, daß die Trübung, die hervorgerufen wird, wenn ein zweiwertiges Metallkation, wie z. B. Calcium, zu Patientenplasmen zugegeben wird, die eine charakteristische Steigung (sogar in Abwesenheit von Gerinnungsbildung) aufgrund des oben genannten Komplexes zeigen, nicht mit dem Niveau an CRP in dem Patientenplasma korreliert. Daher betrifft die vorliegende Erfindung nicht das Bestimmen von CRP-Niveaus an sich, sondern vielmehr das Bestimmen von CRP, das mit Lipoprotein (VLDL im besonderen) komplexiert ist. Bei der vorliegenden Erfindung wird angenommen, daß die Bildung des Komplexes ex vivo (nach der Zugabe eines zweiwertigen Metallkations zu citrathaltigem Plasma) dem Vorhandensein des Komplexes in vivo entspricht, der möglicherweise ein Indikator für das Unvermögen dieses Patienten ist, den gebildeten Komplex (die gebildeten Komplexe) abzubauen. Der Abbau von VLDL und IDL aus dein Plasma durch die Leber ist auf ihre Oberfläche apo E gerichtet. Daher, wenn es einen fehlerhaften Abbau des (der) Komplexe(s) aus dem Plasma gibt, kann dies an einem mutierten, fragmentierten oder anderweitig defekten apo E liegen, oder an oxidiertem, mutierten oder fragmentiertem Lipoprotein (z. B. beta-VLDL, einem oxidierten LDL, einem abnormalen LDL genannt Lp(a), oder an anderweitig abnormalen Versionen von VLDL, LDL oder IDL). IDL, LDL, Lp(a) und VLDL besitzen alle Apo(B)-100, das, wenn es abnormal ist, eine Rolle bei dem unsachgemäßen Abbau des (der) Komplexes) aus dem Plasma spielen kann. Natürlich könnte auch eine mutierte, fragmentierte oder anderweitig abnormale Form von CRP eine Rolle bei unsachgemäßem Abbau des Komplexes aus dem Plasma spielen, das zu der charakteristischen Steigung bei der Plättchenwellenform führt. Wie aus Tabelle 10 ersichtlich ist, korreliert die Änderung der Absorption aufgrund der Komplexbildung nicht mit der Menge an CRP in der Patientenprobe. Das Niveau an CRP ist im allgemeinen bei der Komplexbildung nicht limitierend. In der Tat wurde festgestellt, daß Patienten erhöhte Niveaus an CRP besitzen können, und dennoch zeigen ihre Plasmen nicht die oben genannte Wellenformsteigung. Die Zugabe von zusätzlichem VLDL veranlassen diese Proben jedoch, eine Trübungsänderung durchzumachen (in der Gegenwart bestimmter zweiwertiger Metallkationen, wie z. B. Calcium, natürlich).
TABELLE 10
Es wurde auch festgestellt, daß die Bestimmung der Niederschlagsbildung mit dem klinischen Ausgang korreliert, insbesondere dem Tod des Patienten. Von 529 Zugängen zu einer Intensivstation waren 178 Sterbefälle (34 % Grundlinienwahrscheinlichkeit des Todes). Der positive Vorhersagewert des Todes stieg auf 50%, wenn die Patienten Transmissionswerte nach 18 Sekunden von 96%, oder eine Steigung von –0,00075 oder weniger besaßen. Diese Vorhersagekraft stieg auf 77%, wenn die Transmissionswerte nach 18 Sekunden weniger als 65% (Steigung von –0,00432 oder weniger) betrugen. Unter Verwendung der „receiver operator characteristic" Analyse war das optimale Niveau, das die Vorhersage maximierte, ohne die Sensitivität zu gefährden, ein Grenzwert der Transmission bei 18 Sekunden von 90% (oder Steigungsgrenzwert von –0,00132 oder weniger). Der Vorhersagewert für den Tod bei diesem Grenzwert wurde zu 75% bestimmt. Zusätzliche Daten sind in Tabelle 11 gezeigt, wobei für Patientenpopulationen von 10 oder mehr der positive Vorhersagewert im allgemeinen steigt, während der negative Steigungswert oder die Transmission abfällt. Daher ist das Vorhandensein der Steigung oder der verminderten Transmission ein Vorhersagewert für den zukünftigen klinischen Ausgang (z. B. Wahrscheinlichkeit eines Todesfalles), sondern zusätzlich ist je größer die Bildung des Niederschlages (je größer der Abfall der Transmission oder der Anstieg der Steigung) ist, desto größer ist die Vorhersage des bevorstehenden Todes. 31 zeigt eine ROC-Graphik von Sensitivität gegenüber Spezifität.
TABELLE 11
Die Daten lassen vermuten, daß 25% der Zugänge zu Intensivstationen einen Transmissionswert nach 18 Sekunden von 90% oder weniger (Steigung von –0,00132 oder weniger) während ihres klinischen Verlaufs besitzen. Daher kann die Bestimmung der Komplexbildung ein nützliches Werkzeug sein, vorherzusagen, welche Patienten wahrscheinlich sterben werden (und welche in dieser Gruppe wahrscheinlicher sterben als andere), basierend darauf, daß sie einen steileren Abfall in der Steigung oder Transmission besitzen, und ein energisches Eingreifen mit den Hoffnungen erlauben, den (wahrscheinlichen) bevorstehenden Tod zu verhindern. Die Überwachung der Steigung ist auch eine Art der Überwachung der Wirkung des Eingreifens.
Daher wird in einer Ausführungsform der Erfindung die Wahrscheinlichkeit einer Systemstörung oder Sterblichkeit eines Patienten (z. B. in einer Intensivstation) durch Zugeben eines oder mehrerer Reagenzien zu einer Testprobe eines Patienten bestimmt, das mindestens einen Bestandteil einer Blutprobe umfaßt, um die Bildung eines Niederschlages, der ein Akute-Phase-Protein und ein Lipoprotein umfaßt, hervorzurufen. Dann wird die Bildung des Niederschlages gemessen, gefolgt durch die Korrelation der Entstehung der Niederschlagsbildung zu der Wahrscheinlichkeit einer Systemstörung oder Sterblichkeit des Patienten. Das Verfahren kann mehrfach durchgeführt werden (z. B. täglich, wöchentlich, etc.), um die Wirksamkeit der Therapie eines Patienten zu überwachen. Der Vorhersagewert dieses Verfahrens allein oder in Verbindung mit anderen medizinischen Indikatoren ist deutlich besser als der Vorhersagewert ohne diese Untersuchung. Das Verfahren schließt auch das Messen der Bildung des Niederschlages im Verlauf der Zeit ein, wie z. B. mit einem automatisierten Meßgerät unter Verwendung der optischen Transmission und/oder Absorption. Und die Menge an Niederschlag, die im Verlauf der Zeit bestimmt wurde (oder als letzter Endpunkt), kann mit der Wahrscheinlichkeit der Sterblichkeit korreliert werden (je größer die Niederschlagsbildung ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit einer Systemstörung oder Sterblichkeit, und umgekehrt). Die Niederschlagsbildung in dieser Ausführungsform kann sogar in Abwesenheit von Fibrinpolymerisation erfolgen.
32 ist ein Westernblot und 33 ist ein SDS-PAGE-Gel von Calciumniederschlägen, die aus DIC-Patienten isoliert wurden. 32 ist ein Westernblot eines transferierten 2,5–5%-igen SDS-PAGE Gels das mit einem monoklonalen Antikörper auf apoB (vorliegend auf VLDL, IDL und LDL) untersucht wurde. In Bahn 1 in 32 ist normales menschliches Plasma, in Bahnen 2–5 ist Plasma von DIC Patienten, wohingegen in Bahnen 6–9 Calciumniederschläge aus Plasmen von DIC Patienten sind, das aus Patienten isoliert wurde, die in den jeweiligen Bahnen 2–5 untersucht wurden. 33 ist ein 5–15% SDS-PAGE aus Calciumniederschlägen von vier DIC-Patienten, die unter reduzierenden (Bahnen 1–4) und nicht-reduzierenden (Bahnen 5–8) Bedingungen der Elektrophorese unterworfen wurden. Ungefähr 5 Mikrogramm Protein wurde von Patient #1 (Bahnen 1, 5); Patient #2 (Bahnen 2, 6); Patient #3 (Bahnen 3, 7) und Patient #4 (Bahnen 4, 8) beladen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in Coomassie Blau eingefärbt, abgefärbt und getrocknet. CRP und SAA wurden durch Immunoblotting identifiziert, und apoB wurde durch N-Terminus-Sequenzierung und Immunoblotting identifiziert.
Es wurde auch festgestellt, daß die Komplexbildung durch Phnsphorylcholin, oder Phosphorylcholin mit unterschiedlichen Fettsäurenseitenketten (z. B. Phosphotidylcholin) oder Träger, die Phosphorylcholin, Phosphorylethanolamin oder Phosphylethanolamin mit unterschiedlichen Fettsäureseitenketten (z. B. Phosphotidylethanolamin) oder Trägern, die Phosphorylethanolamin oder EACA und ähnliches enthalten, verhindert werden kann. Es ist bekannt, daß CRP direkt an PC bindet, und daß PC mit Lipoproteinen um die Bindung an CRP konkurriert. Es wurde festgestellt, daß Phosphotidylcholin ein hauptsächlicher Phospholipidbestandteil in dem Komplex ist. PE, apo(A) und Sphingomyelin stellten sich als geringfügigere Bestandteile heraus. Es wurde auch festgestellt, daß apo(B) direkt an CRP binden kann, es ist jedoch unwahrscheinlich, daß dies in vivo auftritt (und daher ist es unwahrscheinlich, daß dies zur Komplexbildung beiträgt), da apo(B) nicht im Plasma in einer „freien" Form, nicht an ein Lipoprotein gebunden, auftritt.
Daher wird in noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, das die Zugabe eines oder mehrerer Reagenzien (die Gerinnung hervorrufen können oder auch nicht) zu einer Testprobe eines Patienten einschließt, um die Bildung eines Niederschlags hervorzurufen, der ein Akute-Phase-Protein, das an ein Lipoprotein gebunden ist, umfaßt. Dann wird die Bindung des Akute-Phase-Proteins an das Lipoprotein gemessen (entweder im Verlauf der Zeit oder als Endpunkt). Ein hemmendes Reagenz wird vor oder nach dein (den) Komplex induzierenden Reagenz (Reagenzien) zugegeben, wobei das hemmende Reagenz zumindest zum Teil die Bindung des Akute-Phase-Proteins an das Lipoprotein hemmt. Das Ausmaß der Hemmung wird dann bestimmt (z. B. basierend auf der Menge des gebildeten oder nicht gebildeten Komplexes). Das hemmende Reagenz kann nachdem das gesamte oder im wesentlichen gesamte Lipoprotein an das Akute-Phase-Protein gebunden wurde, oder das hemmende Reagenz kann sogar vor der Zugabe des Komplex induzierenden Reagenz (der Reagenzien) zugegeben werden (z. B. zweiwertiges Metallkation wie z. B. Calcium). Die Arten der komplexhemmenden Substanzen können z. B. die oben genannten sein, oder ein apo-Lipoprotein, das an CRP bindet, wie z. B. apoB oder apoE, oder EDTA, Natriumcitrat, oder Antikörper für Epitope, die bei der Komplexbildung involviert sind. Das komplexhemmende Reagenz sollte bevorzugt z. B. die Bindung von CRP an ein Chylomicron oder Chylomicronrest, oder LDL, VLDL oder IDL hemmen. Das Verfahren kann durchgeführt werden, indem das komplexauslösende Reagenz und/oder das komplexhemmende Reagenz in mehr als einer Konzentration zugegeben wird. Diese Ausführungsform kann verwendet werden, um die Menge an Komplex zu quantifizieren und/oder die Spezifität des Komplexes zu bestimmen. Aufgrund der Korrelation des schlechten klinischen Ausgangs und der Komplexbildung kann das komplexhemmende Reagenz in einer Ausführungsform als Therapeutikum verwendet werden, um die Menge an Komplex in vivo zu vermindern.
Obwohl die hauptsächliche Erfindung die Erkennung des Komplexes ist und dadurch die Vorhersage der Sterblichkeit betrifft, betrifft die Erfindung auch die Bestimmung des gesamten Lipoproteins (der Lipoproteine), die an CRP binden (und daher die Bestimmung einer Gesamtmenge bestimmter Lipoproteine in der Probe). Insbesondere wird ein Akut-Phasen-Protein (wie z. B. CRP) zu mindestens einer Testprobe zusammen mit Niederschlagsinduzierenden, wie z. B. einem zweiwertigen, Metallkation oder einem Reagenz, um den pH-Wert auf mindestens unter 7 zu senken, gegeben. Das exogene Akut-Phasen-Protein stellt sicher, daß im wesentlichen das gesamte Lipoprotein VLDL, wie auch ein Großteil des LDL in der Testprobe den Komplex/Niederschlag bilden werden. Da die Komplexbildung zwischen CRP und VLDL und IDL im Vergleich zu zwischen CRP und LDL und HDL in dieser Ausführungsform viel größer ist (siehe 42), kann der Komplex, der durch Zugabe von exogenem CRP gebildet wird. auf gesamt VLDL und/oder VLDL + IDL Niveaus korreliert werden. Bei Zugabe von zusätzlichem CRP kann das CRP isoliertes oder gereinigtes CRP oder rekombinantes CRP sein.
Es sollte verstanden werden, daß die vorliegende Erfindung für die Erkennung der Komplexbildung in Abwesenheit der Zugabe von exogenen Lipiden zu der Testprobe, oder in Abwesenheit der Zugabe exogener Lipide an den Patienten (z. B. intravenöse Verabreichung von Lipiden wie z. B. Intralipid) nützlich ist. Vielmehr ist die vorliegende Erfindung wünschenswert für die Erkennung der patienteneigenen Lipoproteine wie z. B. VLDL, komplexiert mit dem (den) patienteneigenen Akut-Phasen-Proteinen) wie z. B. CRP. Durch Messung dieses „natürlichen" Lipoprotein-Akut-Phasen-Protein-Komplexes (lieber als künstlich die Komplexbildung aufgrund der Zugabe von exogenen Lipiden zu bewirken), kann der Test eine hilfreiche Vorhersage des klinischen Ausgangs darstellen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Steigung des Gerinnungsprofils und/oder die Gesamtänderung der Trübung (z. B. gemessen durch optische Transmission oder Absorption) verwendet werden, um den Zustand des Patienten zu diagnostizieren. Insbesondere werden ein oder mehrere Reagenzien zu einer Testprobe aus einem Patienten zugegeben. Die Testprobe sollte mindestens einen Bestandteil des Blutes aus dem Patienten einschließen (z. B. kann Plasma oder Serum verwendet werden). Die Reagenzien sind in der Lage, die Bildung des Komplexes in vitro zu bewirken, wobei der Komplex mindestens ein Akut-Phasen-Protein und mindestens ein Lipoprotein umfaßt, während im wesentlichen keine Fibrinpolymerisation hervorgerufen wird. Die Bildung des Komplexes wird im Verlauf der Zeit gemessen, um so ein zeitabhängiges Meßprofil abzuleiten. Dann wird die Steigung und/oder die Gesamtänderung der Trübung („Delta") verwendet, um den Zustand des Patienten zu diagnostizieren (z. B. die Wahrscheinlichkeit der Sterblichkeit des Patienten vorherzusagen).
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließt ein Verfahren zum Testen von Therapeutika (oder „Testverbindung") oder Behandlungsmitteln das Bereitstellen eines menschlichen oder tierischen Subjekts ein, dessen Blut einer Komplexbildung ausgesetzt ist und Verabreichung eines Therapeutikums an das menschliche oder tierische Subjekt, dessen Blut Anzeichen der Komplexbildung zeigt. Dann wird ein Theraueutikum entweder dem Subjekt verabreicht oder zu einer Testprobe in vivo zugegeben, gefolgt von der Bestimmung, ob die Komplexbildung verstärkt, abgeschwächt oder vollständig verhindert wird. Wenn das Therapeutikum dem Patienten verabreicht wird, ist es bevorzugt, daß es im Verlauf der Zeit verabreicht wird, und daß die Komplexbildung (oder das Fehlen davon) ebenfalls im Verlauf der Zeit überwacht wird.
Zum Zweck des vorangegangen beziehen sich die Begriffe „Testverbindung" und „Therapeutikum" auf eine organische Verbindung, Arzneistoff oder pharmazeutisch aktives Mittel, insbesondere eines, das getestet wird, um die Wirksamkeit in einer klinischen Studie an einem menschlichen oder tierischen (bevorzugt Säugetier wie z. B. Hund, Katze oder Ratte) Subjekt zu bestätigen (eher als ein zugelassenes therapeutisches Mittel, das verwendet wird, um eine Krankheit in einem speziellen Subjekt zu behandeln). Das Therapeutikum kann im allgemeinen ein antibiotisches Mittel, ein entzündungshemmendes Mittel, ein gerinnungshemmendes Mittel, ein gerinnungsförderndes Mittel, etc. sein. Zusätzlich zu klinischen Untersuchungen oder zur Verwendung bei der Arzneistoffuntersuchung kann das Verfahren auch in Verbindung mit einem zugelassenen therapeutischen Mittel wie z. B. den oben beschriebenen, verwendet werden, um die Wirksamkeit des therapeutischen Mittels bei einem bestimmten Patienten zu überwachen. Daher wird eine Gelegenheit bereitgestellt, wenn das besondere Therapeutikum frühzeitig als nicht wirksam für einen speziellen Patienten erkannt wird, den Patienten auf ein anderes Therapeutikum zu setzen, das sich als effektiver für diesen Patienten erweisen kann.
Tabelle 12 zeigt CRP, VLDL, Steigung 1 und die Trübungsänderungen bei 15 Patienten.
Tabelle 12

VLDL-Niveaus wurden auf 3 Arten gemessen: 1) Gesamtcholesterin, 2) ELISA für Apo(B), und 3) Gesamtprotein durch die Bradford-Untersuchung.

37–50 zeigen weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung.

Claims

Verfahren zur Vorhersage einer gestiegenen Wahrscheinlichkeit einer Systemstörung oder der Sterblichkeit eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (a) Entnehmen einer Blutprobe von einem Patienten; (b) Beschaffen eines Plasmas oder Serums aus der Blutprobe; (c) Zugeben eines Reagens, das in der Lage ist, die Bildung eines Proteinkomplexes zu induzieren, der mindestens ein Lipoprotein und mindestens ein Akute-Phase-Protein umfasst; (d) Durchführen einer oder mehrerer Messungen eines Parameters des Plasmas oder Serums und Korrelieren des gemessenen Parameters zur Komplexbildung, wenn vorhanden; und (e) Korrelieren der Bildung des Komplexes zu einer gestiegenen Wahrscheinlichkeit einer Systemstörung oder der Sterblichkeit des Patienten.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei eine Vielzahl von Messungen nach der Zugabe des einen Reagens oder der mehreren Reagenzien durchgeführt werden, um ein zeitabhängiges Messprofil abzuleiten.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei ein einzelnes Reagens vor der Durchführung der Messungen verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Messungen Messungen der optischen Transmission oder Absorption durch die Probe sind, wobei die Transmission durch Fibrinpolymerisation nicht beeinflusst wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Reagens ein Metallion, bevorzugt ein zweiwertiges Metallion, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Metallion eines oder mehrere aus Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen oder Barium oder einem Übergangsmetall umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei ein gerinnungshemmendes Mittel als Teil des einen Reagens oder der mehreren Reagenzien bereitgestellt wird, oder als Teil eines zusätzlichen Reagens zu der Testprobe zugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das gerinnungshemmende Mittel eines oder mehrere aus Hirudin, Heparin, PPACK, I2581 oder Antithrombin umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die eine oder die mehreren Messungen durch Gerinnungsbildung aufgrund des Fehlens von Fibrinpolymerisation unbeeinflusst sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die eine oder die mehreren Messungen eine Vielzahl von Messungen darstellen, wobei eine Änderungsrate der Vielzahl der Messungen oder durch eine Gesamtänderung bestimmt wird, und eine hämostatische Fehlfunktion, basierend auf der bestimmten Gesamtänderung und/oder Änderungsrate, bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das mindestens eine Lipoprotein VLDL, IDL und/oder LDL und das mindestens eine Akute-Phase-Protein SAA und/oder CRP umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei eine Mehrheit des Komplexes an VLDL gebundenes CRP umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Reagens in der Lage ist, Niederschlagsbildung vollständig in der Abwesenheit von Fibrinpolymerisation auszulösen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das eine Reagenz oder die mehreren Reagenzien in der Lage sind, die Bildung eines Niederschlags zu induzieren, umfassend ein Akut-Phasen-Protein und ein Lipoprotein.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei es zusätzlich umfasst: (i) Messen eines Niederschlags, der das Akut-Phasen-Protein und das Lipoprotein umfasst; (ii) Zugeben eines hemmenden Mittels vor oder nach der Zugabe des einen niederschlagsauslösenden Reagens oder der mehreren niederschlagsauslösenden Reagenzien, das zumindest zum Teil die Bildung des Niederschlags hemmt; und (iii) Bestimmen des Ausmaßes der Hemmung des hemmenden Mittels.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das niederschlagshemmende Mittel zugegeben wird, nachdem sich das gesamte oder im Wesentlichen das gesamte Lipoprotein mit Akut-Phasen-Protein verbunden hat, um so den Niederschlag zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das niederschlagshemmende Mittel vor der Zugabe des niederschlagsauslösenden Reagens zugegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das niederschlagsauslösende Mittel ein zweiwertiges Metallkation ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das niederschlagshemmende Mittel eines oder mehrere von einem Apolipoproteins, das in der Lage ist, an CRP zu binden, einem Phosphorylcholin, EDTA, Natriumcitrat oder einem Antikörper, der in der Lage ist, an eine Lipoprotein-Akut-Phasen-Protein Bindungsstelle zu binden, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das niederschlagshemmende Mittel in der Lage ist, die Assoziation von CRP mit Chylomikronen oder Resten davon, LDL, VLDL und/oder IDL zu hemmen.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Bestimmung des Ausmaßes der Hemmung über die Zeit durchgeführt wird, um so ein zeitabhängiges Messprofil abzuleiten.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die zeitabhängige Messung eine Messung der optischen Transmission oder Absorption über die Zeit ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es zusätzlich das Messen der Bildung des Proteinkomplexes und das Korrelieren der Bildung des Komplexes zu einer Konzentration des einen Lipoproteins oder der mehreren Lipoproteine umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei das Reagens ein zweiwertiges Metallkation und ein Akut-Phasen-Protein umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Akut-Phasen-Protein CRP ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das eine oder die mehreren Lipoproteine Chylomikrone, VLDL und/oder IDL umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die Bildung des Komplexes und die Bildung eines zusätzlichen Komplexes zeitabhängig so bestimmt werden, dass ein erstes bzw. zweites zeitabhängiges Messprofil bereitgestellt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei der gemessene zusätzliche Komplex und der gemessene ursprüngliche Komplex zusammen zu einer Gesamtmenge an Akute-Phase-Protein in der Testprobe korreliert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das Akut-Phasen-Protein ein C-reaktives Protein ist.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei die Wahrscheinlichkeit einer Systemstörung und/oder Sterblichkeit umso höher ist, je größer der anfängliche Komplex gemessen wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Vorhersage der gestiegenen Wahrscheinlichkeit einer Systemstörung oder Sterblichkeit genauer ist als ohne das Durchführen eines Verfahrens zum Vorhersagen einer gestiegenen Wahrscheinlichkeit einer Systemstörung oder Sterblichkeit eines Patienten, das die Schritte (a) bis (e) umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Schritte (a) bis (e) mindestens einmal mehr zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden, um den Rückschritt oder Fortschritt des Zustands des Patienten zu bestimmen.
Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Therapeutikums, dadurch gekennzeichnet, dass es Folgendes umfasst: (a) Entnehmen einer Testprobe aus einem Testsubjekt, das auf Komplexbildung überprüft werden soll; (b) Zugeben eines Reagens zu der Testprobe, das die Bildung eines Komplexes aus Akute-Phase-Protein und Lipoprotein, die in der Testprobe vorliegen, in Gegenwart und Abwesenheit eines therapeutischen Mittels hervorruft; (c) wahlweise Wiederholen der Schritte (a) und (b); und (d) Bestimmen, ob die Menge an gebildetem Komplex sich geändert hat.