JP4733326B2 - 患者サンプル中の止血機能障害の存在を予測する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の背景
本出願は、１９９９年２月４日に提出された米国特許出願第０９／２４４，３４０号の一部継続出願である。この出願の主題事項は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本特許出願はさらにまた、Ｆｉｓｃｈｅｒらへ付与された米国特許第５，６４６，０４６号に関連する。この出願の主題事項も参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
血餅は、タンパク質が生物学的増幅系として機能する酵素カスケードを形成する複合連鎖反応の最終生成物である。この系は、かなり少数の分子の開始生成物が因子として知られている一連の不活性タンパク質の連続的活性化を誘発することを可能にし、最後にフィブリンクロットを産生させる。このカスケード経路の動態の数学的モデルについては以前に提案されている。
【０００３】
血栓症および止血試験は、インビボで血液が血餅を形成するおよび血餅を壊す能力についてのインビトロ試験である。凝固（止血）アッセイは、試験管を傾ける、またはワイヤーループによってフィブリン線維を除去することのどちらかによって試験管内で血餅形成を観察する手動的な方法として始まった。その目的は、一定の物質を添加した後に、患者の血液サンプルが凝固するかどうかを決定することであった。後に、インビトロでの反応開始から血餅形成時点までの時間が先天性疾患、後天性疾患および治療的モニタリングに関連していることが確定された。手動的な方法における主観的な終点決定と結び付いている固有の変動性を排除するために、（１）電気機械的特性、（２）血餅の弾性、（３）光分散、（４）フィブリン接着、および（５）インピーダンスに基づいて凝固時間を測定する計測機器が開発されてきた。光分散法については、試料を通過する光の透過を時間の関数として表わすデータ（光学的時間依存性測定プロフィール）が収集される。
【０００４】
２種のアッセイ、ＰＴおよびＡＰＴＴは、凝固系における異常をスクリーニングするために広汎に使用されているが、例えばプロテインＣ、フィブリノーゲン、プロテインＳおよび／またはトロンビン時間のような他の数種のスクリーニングアッセイを使用することもできる。スクリーニングアッセイが異常な試験成績を示した場合は、正確な異常の源を分離するために１種もしくは数種の追加の試験が必要になる。ＰＴおよびＡＰＴＴアッセイは、主として凝固のために必要な時間の測定値を基にしているが、ＰＴの数種の変形はさらにフィブリノーゲン濃度を推定する際に光信号における変化の振幅を使用する。
【０００５】
血液凝固は、通常は血餅形成に影響を及ぼす極めて多数の内部要因およびタンパク質に加えて、薬物の投与によって影響を受ける。例えば、ヘパリンは術後または他の条件下での血栓症を防止するために使用される、または存在する血栓症を治療するために使用される、一般に用いられる治療薬である。ヘパリンの投与は典型的には、ヘパリンの存在下では凝固時間の延長を生じさせるＡＰＴＴアッセイを使用して監視される。ＰＴアッセイでの凝固時間はそれよりは少ない程度に影響を受ける。他の多数の血漿異常もまた遷延性ＡＰＴＴ試験成績を誘発する可能性があるので、スクリーニングアッセイ成績からこれらのエフェクター類を弁別する能力は臨床的に重要である可能性がある。
【０００６】
そこで本発明は、例えば光学的時間依存性測定プロフィールのような１種以上の時間依存性測定プロフィールに基づいてサンプル中の止血機能障害を予測するために考案かつ開発された。さらに、本発明は患者の血液もしくは血漿サンプルに対して実施されたアッセイから、例えば光透過プロフィールのような時間依存性プロフィールに基づいて患者における播種性血管内凝固症候群の存在を予測することに関する。
【０００７】
発明の概要
本発明は、血餅形成の不存在下で試験サンプル中の沈殿物を検出する方法に関する。本方法には、試験サンプルを準備するステップと、それに試薬を添加するステップが含まれるが、その試薬は単独でも、または追加の試薬と組み合わせても沈殿物の形成を誘発する。その試薬は、好ましくは金属二価陽イオンを備えるが、さらに任意選択的に凝固阻害物質を含む。沈殿物の検出は、定性的または定量的であってよく、さらに沈殿物は、例えば凝固アッセイ、ラテックス凝集もしくは金ゾルアッセイ、ＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイ、または沈殿物の検出および／または定量を可能にする他の適切な方法によって検出することができる。沈殿物の形成は、終点値として、または動態的に検出することができる。この沈殿物検出は、患者における止血機能障害を予測することを可能にする。本発明は、出血もしくは血栓症、または特に播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）をもたらす可能性のある止血機能障害を予測するために有用である。
【０００８】
より詳細には、本発明は患者からの血液サンプルの少なくとも１種の構成要素を有する試験サンプルに試薬を添加するステップと、時間依存的な測定プロフィールを引き出せるように経時的に試験サンプルおよび試薬の反応を原因とする沈殿物の形成を測定するステップとを含む方法に関し、その試薬は実質的なフィブリン重合を誘発することなく試験サンプル中で沈殿物を形成することができる。本発明は、患者から血液サンプルを入手するステップと、前記血液サンプルから血漿を入手するステップと、実質的なフィブリン重合を誘発することなく止血機能障害を有する患者において沈殿物の形成を誘発することのできる試薬を添加するステップと、サンプルのパラメーターにおける変化が存在する場合に沈殿物形成と相関させることのできるサンプルのパラメーターの１回以上の測定値を入手するステップと、沈殿物形成が検出された場合に患者が止血機能障害を有すると決定するステップとを含む、患者が止血機能障害を有するかどうか決定するための方法にも関する。
【０００９】
本発明はさらにまた、患者から試験サンプルを入手するステップと、アルコール、凝固阻害剤および金属陽イオンを添加するステップとを含み、３００ｋＤタンパク質、血清アミロイドＡおよびＣ反応性タンパク質のうちの少なくとも１種を含有するタンパク質複合体を備える沈殿物が形成されることを特徴とする、患者のサンプル中で３００ｋＤタンパク質、血清アミロイドＡおよびＣ反応性タンパク質のうちの少なくとも１種を含むタンパク質複合体の存在を測定するための方法に関する。
【００１０】
本発明はさらにまた、患者からの試験サンプルのアリコートに凝固試薬を添加するステップと、凝固試薬の添加を原因として経時的に変化する試験サンプルのパラメーターを測定することによって前記試験サンプル中のフィブリン形成を経時的に監視するステップと、前記試験サンプル中のフィブリン形成に先行する期間中にもしあれば前記パラメーターの変化率を測定するステップと、測定された変化率が所定閾値を超えている場合は患者の試験サンプルの第２アリコートを用いてそれにフィブリン重合の不存在下で沈殿物の形成を誘発する試薬を添加するステップと、沈殿物の形成を経時的に測定すること、および沈殿物の測定値に基づいて止血機能障害の可能性または確率を決定するステップとを含む方法に関する。
【００１１】
本発明は、フィブリン重合を誘発することなく一部の患者の試験サンプルにおいて沈殿物形成を誘発することができる試薬を患者の試験サンプルに添加するステップと、前記沈殿物形成の指標である試験サンプルのパラメーターを経時的に測定するステップと、変化するパラメーターの傾斜を決定するステップと、後の日付もしくは時間に上記ステップを繰り返すステップとを含み、後の日付もしくは時間における傾斜の増加または減少が各々炎症状態の進行または後退の指標であることを特徴とする、患者における炎症状態を監視する方法に関する。
【００１２】
本発明は、フィブリン重合を誘発することなく沈殿物形成を誘発する試薬を試験サンプルに添加するステップと、沈殿物の形成を原因として変化する試験サンプルのパラメーターの測定値を経時的に入手するステップと、前記パラメーターの変化率を測定するステップと、前記変化率が所定限度を超えた場合に患者が止血機能障害を有すると決定するステップと、前記変化率が所定限度を超えている場合には前記止血機能障害のための治療を用いて介入するステップとを含む、止血機能障害を有する患者を診断および治療するための方法に関する。
【００１３】
本発明はさらにまた、患者のサンプルに前記サンプル中で沈殿物の形成を誘発することのできる試薬を添加するステップと、前記パラメーターが前記沈殿物形成の指標である前記サンプルの変化するパラメーターを経時的に監視するステップと、前記パラメーターの変化率または前記パラメーターが所定時間に所定限度を超えるかどうかを測定するステップと、各時点に相違する血漿／試薬比で前記ステップを少なくとも１回繰り返すステップと、測定に対する最高値、平均値および／または標準偏差を測定するステップと；最高値、平均値および／または標準偏差測定値に基づいて止血機能障害を確定するステップとを含む方法に関する。
【００１４】
本発明はさらにまた、図２１のレーン５におけるＣ反応性タンパク質もしくは３００ｋＤタンパク質に結合することのできるリガンドを用意するステップと、前記リガンドを患者からの試験サンプルに添加して、前記試験サンプル中でのＣ反応性タンパク質もしくは前記３００ｋＤタンパク質に前記リガンドを結合させるステップと、前記サンプル中のＣ反応性タンパク質もしくは前記３００ｋＤタンパク質の存在および／または量を検出するステップと、および検出されたＣ反応性タンパク質もしくは前記３００ｋＤタンパク質の存在および／または量を原因として患者における止血機能障害を診断するステップとを含むイムノアッセイに関する。
【００１５】
本発明はさらにまた、フィブリン重合を誘発することなく一部の被験者試験サンプル中で沈殿物形成を誘発することのできる試薬を患者の試験サンプルに添加するステップと、前記沈殿物形成の指標である前記試験サンプルのパラメーターを経時的に測定するステップと、所定時点に前記変化するパラメーターの傾斜および／または前記パラメーターの数値を測定するステップと、前記動物もしくはヒト対象に薬物を投与するステップと、後の日付もしくは時間に上記のステップを繰り返すステップとを含み、前記後の日付もしくは時間における前記傾斜もしくは数値の増加または減少は前記薬物の有効性の指標であることを特徴とする、炎症状態および／または止血機能障害を有するヒトまたは動物対象に及ぼす新規薬物の有効性を試験するための方法に関する。
【００１６】
好ましい実施形態の説明
本発明においては、特定の異常（止血機能障害）を検出できるだけではなく、さらにその疾患の進行を単一の患者において監視することができる。本明細書で使用されるように、止血障害は、血餅形成に先行する（または使用した試薬によっては、血餅形成の不存在下での）沈殿物の形成によって明白になる状態である。
【００１７】
播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ−止血機能障害の１つのタイプ）の予後は、早期の有用かつ迅速に入手できるマーカーがないことによって妨害されてきた。本発明は、ＤＩＣの早期診断マーカーおよび単一モニタリングマーカーとして有用であることが判明してきただけではなく、さらに定量可能かつ標準化可能な変化が臨床管理における予後診断適用にも効果がある。
【００１８】
播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）は、先在病理に対する二次反応であり、それによって止血反応が正常な止血の集束性事象とは反対に混乱して播種性となる。患者の集中治療管理およびＤＩＣにおける止血機序に関する我々の基本的知識の両方における向上にもかかわらず、この患者群における生存率は今もなお極めて思わしくない。この合併症の管理にとっての基本は、刺激を開始する起源としての一次病理を未然に防ぐまたは撲滅することを目的とする攻撃的療法の実行である。しかし、実際的観点では、迅速かつ適切な介入を容易にするためにＤＩＣを早期に識別することが依然として問題となっている。臨床研究者が利用できる技術的装備は桁外れに拡大してきたが、急性ＤＩＣの進行速度は大多数のより特異的試験を不可能にし、例えばプロトロンビン（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）および血小板数のような伝統的スクリーニング検査が今なお当てにされている。これらの試験は個人ベースでは特異性が欠如しており、それらがその後のフィブリノーゲンおよびフィブリン破壊生成物／Ｄ−ニ量体の測定に進む場合にのみＤＩＣにおいて有用である。しかし、これらのパラメーターにおける変化は、全部が同時には発生しない可能性があり、従って必然的に診断および臨床的に有用な介入における遅延をもたらす連続検査がしばしば必要となる。
【００１９】
ＤＩＣ患者においては、ＡＰＴＴ透過度波形（ＴＷ）が正常なＳ字形様相から「二相性」様相へ変化する。これは正常なＡＰＴＴ−ＴＷのプラトー消失を表わしており、初期の勾配の小さな傾斜の発生の後にはるかに急勾配の傾斜が続く（図１ａおよびｂ）。さらに、この二相性パターンは、ＡＰＴＴ凝固時間検査成績が正常である場合でさえ所見できる。
【００２０】
ＰＴまたはＡＰＴＴを必要とした、新たに採取した血液サンプルを２週間の研究期間に渡ってプロスペクティブに分析した。これらは全血９部に対して凝固剤１部の比率で０．１０５Ｍクエン酸三ナトリウム中に入れ、光学検出システム（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、ダーラム、ノースカロライナ州、米国）を使用して臨床検査凝固アッセイを実施するための自動分析装置であるＭＤＡ（多チャンネル分離分析装置）１８０上で少血小板血漿を分析した。さらに、ＭＤＡシンプラスチンＬＳを使用するＰＴ（正常値１１．２−１５ｓ）および０．０２５Ｍ塩化カルシウムとともにＭＤＡプラテリンＬＳ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、米国）を使用するＡＰＴＴ（正常値２３−３５ｓ）の両方についての凝固時間を引き出すために、ＡＰＴＴについてのＴＷの分析を５８０ｎｍの波長で各機会に実施した。視覚的プロフィールを定量するために、２５秒間での光透過の量を記録した。正常な波形は分析装置および図１ａ上で小数点なしで１００００と表示される１００％の光透過度を有している。従って、二相性変化は１００００未満の低下した光透過度を有するであろう。図１ｂにおいて明らかであるように、血餅形成に先行する低下した光透過度レベルは二相性傾斜の急勾配の増加と直接に相関している。２５秒間で光透過度を記録することは、さらにまた患者間および同一患者内の経時的標準化を可能にする。その代わりに各サンプルについての光透過度の最小レベルを使用しなければならない場合は、これはＡＰＴＴの凝固時間における変動によって影響を受け、そのために比較にとっては理想的ではなくなるであろう。
【００２１】
ＤＩＣの症例が見逃されないことを保証するために、下記の基準に従った。（ａ）異常な二相性ＴＷに遭遇したら、または（ｂ）特異的ＤＩＣスクリーニングが要請されたら、または（ｃ）明白な抗凝固療法が実施されていない場合にＰＴまたはＡＰＴＴのどちらかの延長が存在する場合には、完全ＤＩＣスクリーニング検査を実施した。これにはさらにトロンビン時間（ＴＴ）（正常値１０．５−１５．５秒間）、フィブリノーゲン（Ｆｇｎ）（正常値１．５−３．８ｇ／ｌ）およびＮｙｏｃａｒｄ Ｄ−二量体（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ、オスロ、ノルウェー）についての二量体濃度の推定（正常値＜０．５ｍｇ／ｌ）が含まれるであろう。同時にＥＤＴＡサンプルについて実施した血小板数（Ｐｌｔ）（正常値１５０−４００ １０⁹／ｌ）も記録した。さらに、ＤＩＣに一致する二相性ＴＷまたは凝固異常を有する患者については臨床的詳細を完全に解明した。
【００２２】
ＤＩＣは、スクリーニング検査（ＰＴ増加、ＡＰＴＴ増加、Ｆｇｎ減少、ＴＴ増加またはＰｌｔ減少）における少なくとも２種の異常の検査室所見および臨床的所見に加えてＤＩＣの病因において認識された一次状態と関連しているＤ−二量体レベル（＞０．５ｍｇ／ｌ）上昇の所見を加えた両方の状況がある場合に厳密に診断が下された。直接の臨床的評価および管理と同様に、それらの患者についてはＤＩＣの診断の経過および確証を図に記すために連続スクリーニング検査結果もまた入手できた。統計的解析のために、ＤＩＣの診断のためのＡＰＴＴ−ＴＷの感受性、特異性、陽性および陰性予測についての数値を２×２分割表を使用して計算した。９５％信頼区間（ＣＩ）は精密２項法によって計算した。
【００２３】
総計１，４７０例のサンプルを分析した。これらは患者７４７例からのサンプルであった。患者５４例からの１７４例のサンプル（１１．９％）が二相性波形変化を有していた。これらの患者５４例中２２例からは解析のために連続３例以上のサンプルを入手できた。ＤＩＣは、新鮮冷凍血漿、寒冷沈殿物または血小板を使用する輸血サポートを必要とする患者３０例を含む４１例で診断された。基礎臨床疾患は表１に示されている。
【００２４】
表１がここに入る。
【００２５】
ＤＩＣを有する患者４１例中４０例が二相性ＴＷを有していた。１例の疑陰性成績（二相性ＴＷを伴わないＤＩＣ）は子癇前症（ＰＥＴ）を有する患者において発生したが、この場合には解析のために入手できた単一サンプルは２１．０ｓの延長ＰＴ、４４．０ｓのＡＰＴＴおよび１．５ｍｇ／ｌのＤ−二量体増加を示した。他の患者５例は本試験においてＰＥＴを有すると同定されたが、いずれもＤＩＣまたは二相性ＴＷのどちらも有していなかった。二相性ＴＷを有していたがＤＩＣの基準を満たさなかった患者１４例では、全例が１回または２回のスクリーニング検査において異常を伴う凝固障害の何らかの証拠を有していた。これらの異常結果は上記で定義したようなＤＩＣの基準には達しなかった。これらの患者１４例中４例は、延長ＰＴおよび軽度の血小板減少症を伴う慢性肝疾患を有していた。さらに患者２例はＤ−二量体レベルの孤立性増加単独を伴う心房細動を有していた。残りの患者８例は、外傷または擬似感染症から発生した多臓器機能障害のためにＩＣＵで治療されていたが、ＤＩＣの伝統的検査室成績変化は有していなかった。これらの患者プロフィールは、ＩＣＵで「全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）」と一致していると説明された。これらの数値に基づくと、二相性ＴＷは９８％の特異性でＤＩＣの診断のために９７．６％の感受性を有している。光透過度波形の使用は二相性波形を検出する際に有用であることが明らかになった。
【００２６】
ここに表２が入る。
【００２７】
本試験の陽性予測値は７４％であったが、これは二相性傾斜の急勾配の増加および光透過度レベルの減少に伴って増加した（表２および図２）。本試験の最初の２日間には、凝固試験における異常プラスＤ−二量体レベルの上昇を有する患者１２例がいた。これらは、本試験１週間前に発生したＤＩＣから臨床的に回復しつつある患者であった。これは、ＴＷ変化がＤＩＣの標準マーカーよりも臨床事象により密接に相関する可能性があるとの印象をもたらした。
【００２８】
ここに表３が入る。
【００２９】
患者２２例における連続３例以上のサンプルを入手できることによって、より詳細な評価が可能になった。表３はＥ．ｃｏｌｉ敗血症を有する患者からの連続試験成績を備えた１例を例示している。
【００３０】
ＤＩＣの診断のための標準試験における変化には二相性ＴＷの様相が先行した。ＰＴ、ＡＰＴＴ、ＰｌｔおよびＤ−二量体レベルが異常になってＤＩＣの診断基準を満たしたのは当日遅くになってであった。静脈内抗生物質投与による治療は、ＤＩＣの標準パラメーターに先立つ彼女のＴＷの正常化とともに第２日までに臨床的改善をもたらした。Ｄ−二量体およびＰｌｔは各々２４時間後および４８時間後にもまだ異常であった。
【００３１】
臨床事象とＴＷ変化との相関は、臨床事象の経過を図に記すためにサンプルを入手できた全ＤＩＣ患者において所見された。ＴＷ変化は２５秒間での透過度レベルの記録を通して定量可能かつ標準化可能であったので、この解析は予想適用性を評価する際の手がかりを提供した。図３は、腸穿孔後の腹膜炎を最初に示していた患者の結果を示している。これはさらに術後のグラム陰性菌敗血症によって複雑になってＤＩＣの初期の悪化を伴ったが、適切な療法を実施した後には漸進的回復が続いた。当初はＤＩＣが進行したので、ＴＷの二相性傾斜における急勾配の増加および光透過度レベルの低下が生じた。これの逆転が臨床的回復の前触れとなった。図４は、ジェットスキーの事故後に身体の内部および外部の重篤な傷害を受けた患者の結果を示している。血液製剤サポートによって初期は安定化したが、持続的な失血および劇症ＤＩＣの発生を伴って彼の状態は悪化した。二相性傾斜は、彼の生涯の結果が致死性であることが判明するにつれて透過度レベルにおける低下を伴ってますます急勾配になった。
【００３２】
ＤＩＣは様々な原発疾患から発生する可能性があるので、臨床的および臨床検査的発現は患者毎にだけではなく、同一患者においても経時的に極度に変動する可能性がある。このため、それらの診断において確固としているだけではなく単純かつ迅速に実施できるシステムに対する必要がある。二相性ＴＷは止血機能障害（例、ＤＩＣ）に対して感受性であると思われることが証明されており、凝固異常を有する他の選択患者群では所見されておらず、または（ｉ）分析前変量、（ｉｉ）様々なシリカを基剤とするＡＰＴＴ試薬類、（ｉｉｉ）凝固反応の開始剤としてのトロンビンの使用または（ｉｖ）ヘパリンもしくは血漿増量剤の形での治療のいずれかによって影響を受けたので、ＤＩＣに対するこのアッセイの堅牢性はプロスペクティブ試験を通してのみ対応することができよう。本試験は、二相性ＴＷがＤＩＣにおいて９７．６％の総合感受性および９８％の特異性を備える診断用精度を提供することを証明した。これとは対照的に、個別ベース（即ち、ＰＴ、ＡＰＴＴ、ＴＴ、Ｆｇｎ、Ｐｌｔ、Ｄ−ニ量体）での標準パラメーターはいずれも、または組み合わせた場合でさえこの程度の感受性または特異性に到達しなかった。ＭＤＡ−１８０からのＴＷデータの入手し易さもまたトロンビン−アンチトロンビン複合体の測定値またはＥＬＩＳＡテクノロジーに依存する他のマーカーとは相違して単純性および迅速性の基準を満たすであろう。さらに、ＴＷ分析の長所は次の点にある。（ａ）二相性ＴＷ変化はＤＩＣに対する孤立サンプル中で単一の最も有用な相関物であると思われるので、従って一連の試験の連続推定値をもはや当てにする必要がない、および（ｂ）二相性ＴＷの様相または分解能は臨床事象および転帰との強力かつ明確な相関を伴ってＤＩＣにおいて監視される標準の伝統的パラメーターにおける変化に先行する可能性がある。
【００３３】
二相性ＴＷは上記の基準によって定義されたようなＤＩＣ自体を有していない患者においても所見されたが、臨床状態は止血機能障害−つまり二相性波形を生じさせる血餅形成の開始に先立つ凝固活性化と関連していた（例えば慢性肝疾患または多臓器機能障害を有する集中治療室の極めて重症患者において）。二相性ＴＷは非顕在性または代償性ＤＩＣに対して感受性である、および９０％未満の透過度レベル（図２）またはそのレベルにおける連続的低下（図４）がＤＩＣのより顕性の発現および潜在的劇症形に向かう代償不全を反映していると思われる。この行の説明は、軽度の凝固活性化およびＤ−二量体レベル上昇と関連している状態である心房細動を有する患者２例における軽度の二相性ＴＷ（約９５％の透過度レベル）だけの観察によって支持されている。臨床的詳細はその他の点では目立たなかったこれらの患者２例についてはフォローアップ試験サンプルを入手できなかったので、彼らの二相性ＴＷは明確に一過性であったかも知れない。それでもなお、これらの症例は光透過度のレベルが低いほど、二相性ＴＷが止血機能障害、特にＤＩＣの前兆となる可能性が高いことを例示している。
【００３４】
ＰＥＴおよびＤＩＣを有する患者における正常ＴＷの観察は、この試験が選択的に特定患者群を検査することを目的としておらず、ＰＥＴの患者を総計６例しか含んでいなかったので、より詳細な調査を必要とする。それらの内残り５例はＤＩＣを有していなかった。本試験における他の観察所見によって支持されるであろう１つの説明は、この患者がサンプル採取時点にＰＥＴおよびＤＩＣから回復しつつあった可能性があることである。まだ異常でＤＩＣの指標であった他のパラメーターに先立って二相性ＴＷにおける正常化が既に存在した可能性がある。もう１つの説明は、ＰＥＴにおける乱れた止血プロセスがより限局性であり他の状態から発生するＤＩＣとは相違することである。そのような患者は胎児の出産に劇的に反応するが、これはこの状態の全身性証拠を意味する標準検査室凝固試験にもかかわらず胎盤への病理的プロセスの解剖学的局在を示唆する。
【００３５】
例
２５秒間の時点での透過度の分析はＤＩＣを予測することに有用ではあるが、本発明の第２実施形態は感受性および特異性を大きく向上させることが発見されてきた。特定時点での透過度を注目することはたとえ波形が二相性波形ではない場合でさえ、その時点での透過度におけるアーチファクトまたはその他の低下を検出を生じさせる可能性がある。例えば、２５秒間での透過度における一時的下落は、たとえ波形が正常である場合でさえ、または少なくとも二相性ではない場合でさえ、そのような患者サンプルが二相性であるとフラグされることを引き起こすであろう。同様に、患者のサンプルが特に短い凝固時間を有した場合、その後血餅形成が例えば２５秒間（または前選択されたいずれかの時間）より前に始った場合、２５秒間後の透過度低下に対する実質の理由が血餅形成が既に始っている／発生しているということであったとしても、波形は二相性であるとフラグされるであろう。
【００３６】
この理由から、特定時点での透過度の解析よりむしろ、血餅形成の開始に先立って波形の傾斜を計算することが望ましい。この計算は、凝固時間の測定を含むことができ、凝固時間の測定に先立つ波形の傾斜の測定に続く。追加の実施形態では、傾斜（透過度ではない）は凝固時間前に、または前選択された時間のどちらか短い時間の前に測定される。図１１から明らかであるように、例えばＤＩＣを決定するために透過度を使用した場合は、特異性および感受性が不良である。しかし、図９において明らかであるように、血餅形成の開始前の傾斜を使用した場合には、特異性および感受性が大きく改善され、例えばＤＩＣのような止血機能障害の診断において使用される標準試験より良好である。
【００３７】
追加の試験を３セットの患者について実施した。第１セットは５１例の相違する確定ＤＩＣ患者からのサンプルについて実施された９１回のＡＰＴＴアッセイから構成された。第２セットのデータは、８１例の相違する確定健常患者からのサンプルについて実施された１１０回のＡＰＴＴアッセイから構成された。第３セットのデータには２２例の異常であるが非ＤＩＣサンプルについて実施された３７回のＡＰＴＴアッセイが含まれた。図５は、下記に説明する結合データセットを使用してＡＰＴＴアッセイから引き出された３種のパラメーターに関するＤＩＣの予測についてのＲＯＣプロットを示している。（１）２５秒間での透過度（ＴＲ２５）、（２）ＡＰＴＴ凝固時間、および（３）傾斜１（血餅形成の開始までの傾斜）。傾斜１は最高の予測力を示し、それに続くのがＴＲ２５であった。１８秒間での透過度は、特にＡＰＴＴ凝固時間が２５秒間未満である場合に予測値を有することも証明されている。３種のパラメーターについての最高効率と関連している「カットオフ」値は表４に列挙されている。
【００３８】
【表１】

【００３９】
これらのカットオフ値は第３セットの添加に伴って変化し、さらにサンプル集団に依存して再び変化する可能性があることを言及しておかなければならない。図６および７は、ＤＩＣ、ＴＲ２５および傾斜１についての正常および異常／非ＤＩＣ集団についてのヒストグラムを示している。表５および６は、図６および７におけるヒストグラムについてのデータを各々示している。
【００４０】
【表２】

【００４１】
【表３】

【００４２】
図８および１０は傾斜１およびＴＲ２５各々についての群分布を示している。そして図９および１１は傾斜１およびＴＲ２５各々についての群分布を示している。図９および１１は、図８および１０に示されたデータの部分小集団を示している。
【００４３】
止血機能障害の予測を全自動または半自動分析装置上で実施する場合は、検出された二相性波形を使用してフラグすることができる。この方法では、機械のオペレーター、または検査成績を解釈する人間（例、医師または他の医療従事者）は二相性波形の存在および例えばＤＩＣのような止血機能の可能性／確率について注意を喚起することができる。フラグはモニター上に表示するかプリントアウトすることができる。約−０．０００３未満または約−０．０００５未満の傾斜は二相性波形を示すために好ましいカットオフ値である。血餅形成に先行する傾斜における急勾配の増加は疾患進行と相関している。
【００４４】
上記の例は、ＡＰＴＴアッセイ上の波形分析によって止血機能障害を有する患者における特徴的な二相性パターンを識別できることを示している。症例の大多数においては、この機能障害はＤＩＣと標識することができよう。この診断的波形プロフィールは、シリカまたはエラグ酸のどちらかを基剤とする試験した全ＡＰＴＴ試薬において所見された。さらにまた驚くべきことに、二相性波形はさらに特定試薬を用いたＰＴアッセイ上でも所見できること、そして二相性波形は同様に主としてＤＩＣのような止血機能障害の指標であることも発見された。
【００４５】
二相性ＡＰＴＴ波形を生じさせるサンプルを使用すると、ＰＴ波形プロフィールはＰＴ試薬類（トロンボプラスチン）、つまりリコンビプラスト^TM（Ｒｅｃｏｍｂｉｐｌａｓｔ）（Ｏｒｔｈｏ社製）、トロンボレル^TM（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ）（Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ社製）およびイノビン^TM（Ｉｎｎｏｖｉｎ）（Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ社製）を使用して引き出された。リコンビプラストおよびトロンボレルはどちらも二相性反応を示すのに特に優れていた。イノビンはその感受性において中間であった。定量指数としてＰＴ反応に１０秒間での透過度レベルを使用すると、リコンビプラストおよびトロンボレルは客観的にイノビンより低い光透過度レベルを示した。トロンボレルはその後に低下する前に初期の光透過度における僅かな増加を示すことができる。これは、一部にはトロンボレルの相対不透明性に関連している。
【００４６】
さらにプラテリン^TM（Ｐｌａｔｅｌｉｎ）を使用したＡＰＴＴプロフィールおよびリコンビプラスト^TMを使用したＰＴ波形プロフィールを比較する試験を実施した。集中治療室から４週間に渡って収集した連続サンプルを評価した。視覚的に、および客観的スコア（ＡＰＴＴについてのＴＬ１８およびＰＴについてのＴＬ１０を比較する）に基づくと、ＡＰＴＴプロフィールはＰＴプロフィールに比較して止血機能障害および臨床的進行の変化に対してより高感受性であった。この相対感受性は図１３（リコンビプラスト）および図１４（トロンボレルＳ）のＰＴプロフィールに比較して、図１２（プラテリン）のＡＰＴＴプロフィールにおいて所見できる。常に、光透過度における変化が小さいほど、ＡＰＴＴ波形はＰＴ波形より容易に異常を検出した。それでもなお止血機能障害の程度が重度である場合には、両方の二相性プロフィールが一致していた。
【００４７】
本発明のまた別の実施形態では、例えば光透過度プロフィールのような時間依存性測定を実質的または完全に血餅形成の不存在下で実施できる。この実施形態では、沈殿物の形成を誘発する試薬を、しかしフィブリンが重合されない環境において添加する。この試薬は例えばＤＩＣのような止血機能障害を有する患者からのサンプル中において沈殿物の形成を誘発するであろう何らかの適切な試薬であってよい。例として、好ましくは遷移元素、およびより好ましくはカルシウム、マグネシウム、マンガン、鉄もしくはバリウムイオンの二価陽イオンを試験サンプルに添加することができる。これらのイオンは止血機能障害の指標として機能できる非定型波形の活性化を誘発する。さらにまたこのアッセイを凝固試薬（ＡＰＴＴ、ＰＴまたはその他）の不存在下で実施することも可能である。非定型波形の活性化剤を備える試薬の一部として、または個別に他の試薬中に、凝固阻害剤を用意することもできる。凝固阻害剤は、例えばヒルジン、ＰＰＡＣＫ、ヘパリン、アンチトロンビン、Ｉ２５８１等のような何らかの適切な凝固阻害剤であってよい。非定型波形の形成は、濁度における変化を監視するもの（例、光透過度における変化を監視することによって）のような、例えば波形を検出することのできる全自動分析装置上で監視および／または記録することができる。
【００４８】
図１５は２種の波形の例である。波形（ｘ）はＡＰＴＴ凝固試薬を使用して結果として非定型（二相性）波形が生じたサンプルについて実施した試験であるが、他方波形（ｙ）は（例えば金属二価陽イオンのような、サンプル中で沈殿物の形成を誘発する試薬と一緒に）凝固阻害剤を使用してサンプルについて実施した試験である。波形（ｙ）は、時間依存性測定プロフィールを引き出す前に凝固試薬を使用していない、および／または凝固阻害剤を添加していない場合に止血機能障害を有する患者において生じる可能性がある波形の例である。一般的に言って、沈殿物形成に起因する波形の傾斜が大きいほど（同一時間内における透過度の低下が大きいほど）、患者の止血機能障害の重症度が大きい。図１６はＣＲＰのＥＬＩＳＡについての標準曲線である（ＣＲＰは標準として使用された患者から分離した）。
【００４９】
本発明で形成された沈殿物は、クロマトグラフィーおよび精製によって分離かつ特性付けた。次の通りにゲル濾過を実施した。カラム（Ｈｉｐｒｅｐ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００高解像度−例えば、１０〜１，５００ｋＤａの解像度）を使用した。装填量は３２０ｍｌ（ｄ＝２６ｍｍ、ｌ＝６００ｍｍ）であり、流量は１．３５ｍｌ／ｍｉｎであった。図１７は分離された沈殿物を示している。
【００５０】
図１８は、沈殿物誘発剤（この場合には二価カルシウム）およびトロンビン阻害剤（この場合にはＰＰＡＣＫ）を患者血漿および正常血漿の混合液に添加した後のサンプル中の濁度の時間経過を示したグラフである。図１９は、１つのサンプル中の最高濁度変化と患者血漿の量との相関関係を示したグラフである。０．０５単位は１００％患者血漿を意味する（図１８からのデータ）。
【００５１】
患者の血漿中の濁度変化に含まれるコンポーネントの精製で使用したステップは次の通りであった。ＰＰＡＣＫ（１０μＭ）を患者の血漿に添加した。塩化カルシウムを５０ｍＭへ添加し、その後８分間インキュベーションし、さらに５％へＥｔＯＨを添加した。サンプルをその後４℃で１５分間に渡り１０，５００×ｇで遠心分離した。その後ペレットをＨＢＳ／１ｍＭクエン酸塩／１０μＭ ＰＰＡＣＫ中で溶解させ、その後３５−７０％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄分別を実施した。最後に、２ｍｌフラクションを収集するために５ｍｌ床、０．０２−０．５Ｍ ＮａＣｌ勾配および５０ｍｌ／側を使用してセファロースクロマトグラフィーを実施した。図２０は患者の血漿の３５−７０％硫酸アンモニウム分別後に回収した物質の陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース）の結果を示している。
【００５２】
図２１ａおよび２１ｂは患者の血漿の分別後に入手した種々のフラクションの非還元および還元各々のＳＤＳ ＰＡＧＥを示している。装填方向（左から右へ）：５−１５％勾配／ネビル・ゲル（Ｎｅｖｉｌｌｅ Ｇｅｌ．）（１ウエル当たり約１０μｇのタンパク質が装填された）。レーン１は分子量標準（上から下へ９４、６７、４５、３０、２０および１４ｋＤａ）である。レーン２は３５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ペレットであるが、レーン３は７０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄上清である。レーン４はＱ−セファロース開始物質である。さらに図２１ａおよびｂでは、レーン５、６、７および８に各々ピーク１、２ａ、２ｂおよび３が示されている（図２０から）。レーン９はペレット１であるが、他方レーン１０は再び分子量標準である。ＮＨ₄ターミナルシークエンシングの結果は、ピーク３、レーン８および９における２２ｋＤタンパク質がＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）であり、さらにレーン９における１０ｋＤタンパク質がヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）であることを証明した。レーン５におけるピーク１は、図２３から明らかであるように、血漿サンプルへの金属二価陽イオンの添加を原因として形成された沈殿物中のタンパク質の複合体（ＣＲＰと一緒に）の一部である３００ｋＤタンパク質である。
【００５３】
ＣＲＰの免疫ブロット法を正常およびＤＩＣ血漿において実施した。ブロット１（図２２参照）：（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＲＰ免疫ブロット法を低下させるために０．２μｌ血漿を使用した）。装填方向（左から右）：ＮＨＰ；Ｐｔ ５；３；１；２；４；および８。ブロット２に対して：装填方向（左から右）：ＮＨＰ；Ｐｔ ９；１０；１１；７；６；１２。ブロット３に対して：（ＤＩＣ患者血漿から精製されたＣＲＰ）−装填方向（左から右；装填されたｎｇ ＣＲＰ）：３．９１；７．８１；１５．６２５；３１．２５；６２．５；１２５；２５０。これらのブロットはＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を用いてブロックし、その後ウサギ抗ヒトＣＲＰ−ＩｐＧ（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｃ３５２７、ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０中での希釈率１：５０００）を用いて連続的にプローブし、さらにＨＲＰに共役した同一抗体を用いて処置した（ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０中での希釈率１：２５０００）。
【００５４】
図２３は血漿の不存在下でＱ−セファロースクロマトグラフィーによって入手した物質に二価カルシウムを添加した後の濁度変化を示している。単一のピークは陽性反応を生じさせなかったが、ピーク１およびピーク３の物質の混合物は沈殿物中にＣＲＰ、３００ｋＤタンパク質、および１種以上の他のタンパク質の包含を示す陽性反応を生じた（ピーク３＋血漿は対照であった）。図２４は、ＥＬＩＳＡによって測定したＣＲＰ（μｇ／ｍｌ）を示した表である。デルタＡ４０５ｎｍは、トロンビン阻害剤ＰＰＡＣＫの存在下で患者の血漿を再石灰化したときに観察された最高濁度変化である。このため図２４は、沈殿物形成に１種以上のタンパク質が含まれていることを示して、吸光度が上昇した患者は様々に上昇したレベルのＣＲＰを有していることを示している。
【００５５】
本発明のある実施形態では、試薬対血漿比は沈殿物形成を誘発する試薬を使用する複数の試験間で相違する。この変動によって、試薬対血漿比を最適化する（例えば、血漿また葉試薬の濃度を変化させる）ことによって沈殿物形成の検出を拡大することができる。あるいはまた、沈殿物形成を原因とする傾斜を複数の試験間で平均することができる。図２５から明らかであるように、カルシウム濃度の上昇に対する反応は光透過波形プロフィールに示されている。左のパネルはカルシウム濃度を変更させた場合の２例の健常患者を示しているが（凝固剤は使用されていない）、他方右のパネルは金属陽イオン（カルシウム）濃度が変化した（カルシウム単独では実質的なフィブリン重合を誘発できない）場合の止血機能障害（この２例ではＤＩＣ）を有する患者２例を示している。
【００５６】
凝固剤を使用した場合には止血機能障害を有する患者において沈殿物形成を検出することができるが、使用する試薬がフィブリン重合を伴わずに沈殿物を形成することができれば有益である。図２６から明らかであるように、たとえば塩化カルシウムのような試薬を使用した場合（右パネル）には、たとえばＡＰＴＴ試薬（左パネル）のような凝固試薬を使用した場合に比較して、傾斜はより顕著かつより容易に検出可能である。図２７から明らかであるように、凝固阻害剤（この場合にはヘパリン）を添加した場合に、傾斜＿１を含む全パラメーターが良好な結果を生じさせ、さらに傾斜＿１は最高感受性を示した。上記の理由から、フィブリン重合および／または凝固阻害剤の不存在下で沈殿物形成が可能な試薬が好ましい。
【００５７】
図２８から明らかであるように、５６例のＩＴＵ患者からのＣＲＰレベルを１８秒間での透過度に対してプロットした。点線は１８秒間での以上透過度に対するカットオフ値である。図２９は、ＣＲＰを有するより多くのサンプルおよび１８秒間での透過度における低下を示している（１００００−ＴＲ１８）。これらの図は、沈殿物形成を原因とする異常な透過度レベルを有する患者の全例がＣＲＰのレベル上昇を有することを示している。しかし、ＣＲＰのレベル上昇を有する患者全例が異常な透過度レベルを有しているわけではなく、これは沈殿物中にＣＲＰ以外のものが含まれていることを示している。
【００５８】
本発明のまた別の実施形態では、ＣＲＰを含むタンパク質の複合体を備える沈殿物の形成がラテックス凝集アッセイの使用によって検出および／または定量される。この方法では、３００ｋＤタンパク質またはＣＲＰに対する抗体が立てられる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体のどちらを使用しても、よく知られている方法に従って、それらは適切なラテックスと結合して患者の試験サンプルまたは好ましくは患者の血漿の残りから分離されている沈殿物自体と反応する。ラテックスの凝集量はサンプル中のＣＲＰ複合体の量と比例している。
【００５９】
あるいはまた、タンパク質の複合体の存在および／または量が測定されるよく知られている方法（サンドイッチ法、競合法または他のＥＬＩＳＡ）に従って、例えばＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイ法を実施できる。例えば、固相に結合した抗体はＣＲＰタンパク質複合対中のＣＲＰに結合する。その後同様にＣＲＰタンパク質複合体中のＣＲＰに結合する、従ってタンパク質の複合体を検出する第２標識抗体を添加する。あるいはまた、第２標識抗体が複合体中の３００ｋＤタンパク質に対して特異的であってもよい。または、相違するアッセイにおいて、固相に結合した抗体は３００ｋＤタンパク質またはＣＲＰのどちらかに結合する第２（標識）抗体とともに複合体内で３００ｋＤタンパク質に結合することができる。そのようなイムノアッセイ法は同様に、ＳＡＡに対して特異的であるのに適するであろうが、その場合には結合かつ標識された抗体類がＳＡＡに結合する、または１種の抗体がＳＡＡに結合し、他方の抗体がＣＲＰまたは３００ｋＤタンパク質のどちらかに結合する。上記の方法は当業者にはよく知られており、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（抗体、検査室マニュアル），Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｄ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄａｖｉｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８，に略述されている。この文献の主題事項は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００６０】
ここに記載かつ例示した本発明は発明の好ましい例であると見なすべきであること、そして本発明の方法における様々な変化は本発明の精神またはクレームの範囲から逸脱することなく実施できる可能性があることを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１ａおよび１ｂ】 ＡＰＴＴアッセイ上の透過度波形を示しており、図１ａは通常の様相を示し、図１ｂは二相性様相を示している。
【図２】 二相性波形異常を有する患者５４例における診断に関連する２５秒間での透過度レベルを示している。水平の点線は正常透過度レベルを示している。
【図３】 敗血症後にＤＩＣを発生して回復した患者の連続透過度レベル（上方パネル）および波形（下方パネル）を示している。
【図４】 外傷後にＤＩＣを発生して死亡した患者の連続透過度レベル（上方パネル）および波形（下方パネル）を示している。
【図５】 ２５秒間でのＤＩＣ透過度（ＴＲ２５）、ＡＰＴＴ凝固時間および傾斜＿１（血餅形成の開始までの傾斜）の予測のためのＲＯＣプロットを示している。
【図６および７】 ＴＲ２５および傾斜＿１についてのＤＩＣ、正常および異常／非−ＤＩＣ集団のヒストグラムを示している。
【図８および１０】 傾斜＿１およびＴＲ２５各々についての群分布を示している。
【図９および１１】 図８および１０に示されているデータの部分母集団を示している。
【図１２】 ＡＰＴＴアッセイについての光透過度プロフィールである。
【図１３および１４】 ＰＴアッセイについての光透過度プロフィールである。
【図１５】 ２種の波形を示した図であるが、（ｘ）はＡＰＴＴ凝固試薬が使用されて二相性波形が生じたサンプルについて実施した試験であり、（ｙ）は凝固阻害剤を使用して実施した試験である。
【図１６】 ＣＲＰのＥＬＩＳＡについての標準曲線である。
【図１７】 ゲル濾過後に分離された沈殿物を示している。
【図１８】 沈殿物を誘発する試薬を添加した後のサンプル中の濁度の時間経過を示したグラフである。
【図１９】 最高濁度変化とサンプル中の患者の血漿量との関係を示したグラフである。
【図２０】 患者の血漿の分画化後の物質回収に対する陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図２１ａおよび２１】 患者の血漿の様々な分画の非還元および還元ＳＤＳページを示している。
【図２２】 正常およびＤＩＣ血漿中のＣＲＰの免疫ブロット法を示している。
【図２３】 材料への二価カルシウムの添加後に血漿の不存在下でＱセファロースクロマトグラフィーで入手された濁度変化を示している（一番上の曲線を除く）。
【図２４】 ＥＬＩＳＡによって測定されたＣＲＰを示している。
【図２５】 光透過度プロフィールにおけるカルシウム濃度上昇に対する反応を示している。
【図２６】 凝固剤を使用しない場合のより顕著な傾斜を示している。
【図２７】 ヘパリンを用いた検量線である。
【図２８】 １８秒間での透過度に対してプロットされた５６例のＩＴＵ患者におけるＣＲＰレベルを示している。
【図２９】 ＣＲＰを有するより多数のサンプルおよび１８秒間での透過度における低下を示している（１０，０００−ＴＲ１８）。

Claims (11)

1. 患者が止血機能障害を有するかどうかを決定するための方法であって、
   ａ）患者から血液サンプルを入手するステップと、
   ｂ）前記血液サンプルから血漿を入手するステップと、
   ｃ）フィブリン重合を引き起こすことがない試薬であって、止血機能障害を有する患者において沈殿物の形成を引き起こすことができる試薬を添加するステップと、
   ｄ）サンプルのパラメーターの１以上の測定値を入手するステップであって、サンプルパラメーターにおける変化を沈殿物形成が存在する場合にそれに相関させることができるステップと、
   ｅ）患者が止血機能障害を有するかどうかをステップｄ）の上記測定値に基づいて決定するステップと
   を含む方法。
2. 前記試薬の添加後に、複数の測定が実施される請求項１に記載の方法。
3. 前記測定が実施される前に、単一の試薬が使用される請求項１に記載の方法。
4. 前記測定が、前記サンプルを通しての光透過度または吸光度の測定である請求項１に記載の方法。
5. 前記試薬が金属イオンを含む請求項４に記載の方法。
6. 前記金属イオンが、カルシウム、マグネシウム、マンガン、鉄またはバリウムの１種以上を含む請求項５に記載の方法。
7. 凝固阻害剤が、前記試薬の一部としてまたは前記試験サンプルへ添加される追加の試薬の一部として提供される請求項１に記載の方法。
8. 前記凝固阻害剤が、ヒルジン、ヘパリン、ＰＰＡＣＫ、Ｉ２５８１、またはアンチトロンビンの１種以上を含む請求項７に記載の方法。
9. 前記１以上の測定が、フィブリン重合の欠如による血餅形成によって影響を受けない請求項１に記載の方法。
10. １以上の測定が複数の測定であり、さらに前記複数の測定の変化率が決定され、止血機能障害が測定された変化率に基づいて決定される請求項１に記載の方法。
11. 前記止血機能障害が播種性血管内凝固症候群である、請求項１に記載の方法。

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