CN116097099A - 用于评定无症状脑梗死和认知衰退的esm-1 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于评定主体是否经历过主体的一次或多次无症状梗死的方法，所述方法包括：a)确定来自所述主体的样品中的生物标志物ESM‑1的量，b)将在步骤a)中确定的所述量与参考进行比较，以及c)评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死。本发明进一步涉及一种用于预测无症状梗死和/或认知衰退的方法，以及用于评定和监测主体的无症状小面积和大面积非皮质和皮质梗死程度的方法。本发明进一步涵盖相应的用途。

Description

用于评定无症状脑梗死和认知衰退的ESM-1
本发明涉及一种用于评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死的方法，所述方法包括：a)确定来自该主体的样品中的ESM-1的量，b)将在步骤c)中确定的该量与参考进行比较，以及评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死。
本发明还涵盖用于预测无症状梗死和/或认知衰退以及提高主体的无症状脑梗死和/或认知衰退的临床风险评分的预测准确性的方法。
通过将ESM-1的量与CHA2D2-VASc评分结合，提高了无症状脑梗死和/或认知衰退的临床风险评分的预测准确性。此外，本发明涉及用于评定主体的无症状大面积非皮质和皮质梗死和/或白质病变的程度的方法。
背景技术
卒中作为高收入国家中损失失能调整的寿命年数的原因和作为全球范围内的死亡原因而排在缺血性心脏病之后的第二位。为了降低脑卒中风险，抗凝疗法似乎为最合适的疗法。
心房颤动(AF)为脑卒中的重要危险因素(Hart等人，Ann Intern Med 2007；146(12)：857-67；Go AS等人，JAMA 2001；285(18)：2370-5)。心房颤动的特征是不规则的心脏跳动并且通常以短暂的异常跳动开始，该短暂的异常跳动会随着时间的推移增加并且可能成为永久性病症。估计美国270万-610万人罹患心房颤动，并且全球约有3300万人罹患心房颤动(Chugh S.S.等人，Circulation 2014；129：837-47)。由于心房颤动是卒中和全身性栓塞的重要风险因素，因此非常需要早期诊断心房颤动和早期预测卒中风险(Hart等人，AnnIntern Med 2007；146(12)：857-67；Go AS等人JAMA 2001；285(18)：2370-5)。
诸如心房颤动的心律失常的诊断通常涉及对心律失常原因的确定及对心律失常的分类。根据美国心脏病学会(ACC)、美国心脏协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)的心房颤动分类的指南主要基于简单性和临床相关性。第一类别称为“首次检测到AF”。此类别中的人最初被诊断患有AF，并且可能已经具有或可能尚未具有先前未检测到的发作。如果首次检测到的发作在不到一周的时间内自行停止，但随后又发生了另一次发作，则类别变为“阵发性AF”。尽管此类别中的患者的发作可持续长达7天，但在大多数阵发性AF病例中，发作将在不到24小时内停止。如果发作持续超过一周，则将其分类为“持续性AF”。如果这种发作无法停止，即，无法通过电复律或药物复律停止，并且持续一年以上，则分类变为“永久性AF”。
最近的证据表明，AF患者还面临认知功能障碍/衰退和痴呆的风险增加(Conen等人，J Am Coll Cardiol 2019；73：989-99)。AF患者较高的卒中风险解释了AF与痴呆之间的部分关联。然而，在无卒中临床病史的AF患者中，痴呆的风险也在增加。临床上无法识别的脑梗死(即无症状脑梗死)或其他脑损伤(诸如白质病变)可以解释这种关联。
无症状大面积皮质和非皮质梗死(LNCCI)与认知功能障碍相关联，类似于明显卒中，并且在认知表现上对应于大约10岁的年龄差异。因此，预防无症状脑梗死似乎具有重大公共卫生利益。需要及时识别这些病变，使得可以启动适当的治疗措施。然而，从实际和经济角度来看，对所有AF患者进行脑磁共振成像(MRI)是不可行的。因此，需要预测工具来识别处于高无症状脑病变风险的AF患者。
磁共振成像上的无症状大面积皮质和非皮质梗死(LNCCI)与多种不良结果诸如认知障碍和抑郁等关联。例如，据报道，白质变化与速度和精细运动协调方面的运动功能下降有关，并且与许多疾病有关，包括血管性痴呆、路易体痴呆和精神障碍。
非常需要允许评定卒中、无症状脑梗死和/或认知衰退的生物标志物。
ESM-1(也称为endocan)是由20kDa成熟多肽和30kDa O-连接的聚糖链构成的蛋白聚糖(Bechard D等人，J Biol Chem 2001；276(51)：48341-48349)。聚糖链的羧酸盐和硫酸盐在生理pH值下均带负电荷，因此为包含带正电荷氨基酸的信号分子(诸如生长因子和细胞因子)提供结合位点(Roudnicky F等人，Cancer Res.2013；73(3)：1097-106)。癌症进展中涉及的血管生成介导物VEGF-A、VEGF-C、FGF-2、PI3K和细胞因子以及炎症过程(败血症)高度诱导ESM-1的生物表达和从内皮细胞的释放(Kali A等人；Indian J Pharmacol.201446(6)：579-583)。ESM-1与促血管生成生长因子(诸如FGF-2和HGF)结合并上调其表达，从而介导增加的内皮细胞迁移和增殖。缺乏聚糖链的Endocan变体未能诱导HGF活化，从而突出了聚糖的作用(Delehedde M等人；Int J Cell Biol.2013：705027)。ESM-1与LFA-1整联蛋白(CD11a/CD18)结合到血淋巴细胞、单核细胞、Jurkat细胞的细胞表面，伴随循环淋巴细胞募集到炎症部位和LFA-1依赖性白细胞粘附和活化。
已经发现，可溶性ESM-1是不同类型癌症中内皮功能障碍的风险标志物。此外，还评定了该标志物与不同心血管病症或疾病有关。例如，已结合高血压(Balta S等人；Angiology.2014；65(9)：773-7)、冠状动脉疾病以及心肌梗死(Kose M等人；Angiology.2015，66(8)：727-31)测量了ESM-1。此外，在糖尿病患者中测量了该标志物(Arman Y等人，Angiology.2016 Mar；67(3)：239-44)。在慢性肾病不同阶段中的测量结果得出的结论是，该标志物可能也有助于预测慢性肾病中的心血管事件和死亡率(Yilmaz MI等人，Kidney Int.2014；86(6)：1213-20)。
Mosevoll等人(Springerplus.2014 Sep 30；3：571)分析了疑似深静脉血栓形成患者的endocan和E选择素。血栓形成患者、健康对照和未证实血栓形成的患者(即具有其他症状原因(包括各种炎症和非炎症病症)的患者)之间的血浆endocan和E选择素水平没有差异。然而，内皮生物标志物、C-反应蛋白和D-二聚体的结合使用可用于识别患有不同频率的静脉血栓形成的患者亚群。大面积肺栓塞患者的endocan水平升高主要是由于栓塞而不是由于原始的血栓形成和/或受肺动脉高压/右心衰竭影响的循环。作者得出结论：“大面积肺栓塞患者的endocan水平升高主要是由于栓塞而不是由于原始的血栓形成和/或受肺动脉高压/右心衰竭影响的循环”(Mosevoll等人，SpringerPlus 2014，3：571)。
此外，endocan释放到血液中也被认为是内皮功能障碍、血管通透性改变和败血症严重程度的生物标志物(Chelazzi C等人；Crit Care.2015；19(1)：26)。除了炎症过程，已经证明endocan还在血管生成过程中表达(Matano F等人；J Neurooncol.2014 May；117(3)：485-91)。
Menon等人的会议摘要描述了ESM-1敲除在小鼠模型中的影响。作者在进行敲除的心脏中观察到心房扩张和nppa、nppb和myh7表达上调。作者得出结论：ESM-1破坏会导致心功能不全(Abstract 19140：Targeted Disruption of Endothelial Specific Molecule(ESM-1)Results in Atrioventricular Valve Malformations Leading to CardiacDysfunction.Prashanthi Menon，Katherine Spokes，David Beeler，Lauren Janes和William Aird Circulation.2012；126：A19140第126卷，第21期补编；2012年11月20日/美国心脏协会2012科学会议和复苏科学研讨会的摘要)
Xiong等人测量了高血压患者的Endocan水平。该标志物被描述为在高血压患者中增加(与非高血压患者对照)。在高血压组中，患有冠状动脉疾病CAD的患者的标志物水平高于未患CAD的患者(Xiong C.等人，Elevated Human Endothelial Cell-SpecificMolecule-1 Level and Its Association With Coronary Artery Disease in PatientsWith Hypertension.J Investig Med.2015 Oct；63(7)：867-70)
Qiu等人测量了患有急性STEMI心肌梗死的2型糖尿病患者的ESM-1(Qiu CR.等人，Angiology.2017 Jan；68(1)：74-78)。作者描述了患有STEMI(ST段抬高型心肌梗死)的2型糖尿病组与未患血管疾病的2型糖尿病组之间的血清ESM-1水平的差异。内皮功能障碍的确定预测心血管风险，如心肌梗死。
Cimen等人研究了阻塞性冠状动脉疾病(CAD)、微血管心绞痛(MVA)与血浆内endocan水平之间的关系(Cimen T.等人，Angiology.2016；67(9)：846-853)。未分析患有例如心房颤动的患者。与CAD对照相比，患有微血管心绞痛(MVA)的CAD患者表现出ESM-1增加。作者提出，该标志物可能作为明显的心血管疾病之前内皮功能障碍的指标。
Madhivathanan等人分析了endocan在心脏手术患者中与作为心脏手术(搭桥以及复杂手术)并发症的急性肺损伤有关的动力学。作者得出结论：在高血压和严重冠状动脉疾病患者中，基线endocan浓度升高。与接受使用体外循环的心脏手术的患者相比，接受非体外循环手术的患者在围手术期内的endocan浓度更低。(Madhivathanan PR.等人，Cytokine.2016 Jul；83：8-12)。
WO1999/045028描述了两种用于检测ESM-1的特异性单克隆抗体
WO2002/039123描述了一种用于检测ESM-1蛋白的试剂盒，以及ESM-1用于检测人体内皮血管壁的体外退化的用途，以用于对用免疫抑制剂化合物治疗的患者的ESM-1蛋白进行体外量化以及用于对患有癌症的患者的ESM-1进行体外量化。
WO2012/098219将ESM-1描述为用于预测败血症患者的呼吸衰竭、肾功能衰竭和血小板减少症风险的标志物。
WO2014/135488将ESM-1描述为识别妊娠相关综合征(例如，先兆子痫和IUGR)的标志物。
WO2018/024905将ESM-1描述为用于评定心房颤动和心力衰竭以及用于预测卒中的标志物。
然而，到目前为止，尚未描述过改变的循环ESM-1水平用于评定卒中、用于评定无症状梗死或用于评定主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死(SNCI和LNCCI)或白质病变的程度。
有利地，在本发明基础的研究中已经发现，ESM-1是用于评定卒中和无症状梗死以及用于预测无症状梗死和/或认知衰退的生物标志物。ESM-1的确定进一步允许提高无症状脑梗死的临床风险评分的预测准确性。
此外，研究表明，生物标志物ESM-1与患者的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死(SNCI和LNCCI)的存在以及白质病变(WML)的存在呈正相关。
由于SNCI、LNCCI和WML程度可能由临床无症状卒中引起(Conen等人，2019，WangY，Liu G，Hong D，Chen F，Ji X，Cao G.White matter injury in ischemic stroke.ProgNeurobiol.2016；141：45-60)，生物标志物ESM-1可用于评定SNCI、LNCCI和WML程度，以及用于评定主体过去是否经历过一次或多次无症状卒中，即临床无症状卒中。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种用于评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，
b)将在步骤a)中确定的所述量与参考进行比较，以及
c)评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死。
在第二方面，本发明涉及一种用于预测主体的无症状梗死和/或认知衰退的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，
b)将在步骤a)中确定的所述量与参考进行比较，以及
c)预测主体的无症状梗死和/或认知衰退。
在第三方面，本发明涉及一种用于提高主体的无症状脑梗死和/或认知衰退的临床风险评分的预测准确性的方法，其包括以下步骤
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)将ESM-1的量的值与无症状脑梗死的临床风险评分结合，从而提高无症状脑梗死的临床风险评分的预测准确性。
在第四方面，本发明涉及一种用于评定主体的无症状小面积和大面积非皮质和皮质梗死程度的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)基于在步骤a)中确定的量来评定主体的无症状大面积非皮质或皮质梗死程度。
在第五方面，本发明涉及一种用于评定主体的白质病变程度的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)基于在步骤a)中确定的量来评定主体的白质病变程度。
在第六方面，本发明涉及一种用于监测主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死和/或白质病变程度和/或认知功能的方法，其包括
a)确定来自主体的第一样品中的ESM-1的量，
b)确定已在第一样品之后获得的来自主体的第二样品中的ESM-1的量，
c)将第一样品中的ESM-1的量与第二样品中的ESM-1的量进行比较，以及
d)基于步骤c)的结果来监测主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死程度和/或认知功能和/或认知功能。
在第七方面，本发明涉及一种用于预测主体的卒中和/或无症状梗死和/或认知衰退的计算机实现方法的方法，所述方法包括
a)在处理单元处接收来自主体的样品中的ESM-1的量的值，
b)用处理单元处理在步骤(a)中接收到的值，其中所述处理包括从存储器中检索ESM-1的量的一个或多个阈值并将在步骤(a)中接收到的值与该一个或多个阈值进行比较，以及
c)经由输出装置提供对无症状梗死和/或认知衰退的预测，其中所述预测基于步骤(b)的结果。
在第八方面，本发明涉及ESM-1或与ESM-1结合的药剂用于以下的体外用途：
a)预测主体的无症状梗死和/或认知衰退，
b)评定主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死和/或白质病变的程度，或提高主体的临床卒中风险评分的预测准确性。
附图说明
图1：SWISS AF研究的EDTA血浆样品中的循环ESM-1的测量，Fazekas评分＜2(否)与Fazekas评分≥2(是)：WML的检测/无症状卒中风险的预测：评定循环ESM-1水平。
具体实施方式
在下文详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些方法、方案和试剂可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外指明，本文所用的所有科学技术术语具有本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
在本说明书全文中引用了若干文档。无论在上文还是在下文中，本文所引用的每篇文档(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明等)的全部内容均以引用方式并入本文。如果此类并入的参考文献的定义或教导内容与本说明书中引用的定义或教导内容之间发生冲突，则以本说明书的文本为准。
下面将描述本发明的要素。这些要素与具体实施例一起列出，但是，应该理解，它们可通过任何方式和任何数量组合以形成其他实施例。本文所述的各种实例和优选实施例不应解释为将本发明限制为仅明确描述的实施例。本说明书应理解为支持并包含将明确描述的实施例与任意数量的所公开和/或优选的要素相组合的实施例。此外，除非上下文中另有说明，否则本申请中所描述的所有要素的任意排列和组合均应视为由本申请的说明书公开。
本发明的方法优选地是离体或体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，进一步的步骤可能涉及样品预处理或评估通过该方法获得的结果。该方法可以手动执行或由自动化辅助。优选地，步骤(a)、(b)和/或(c)可全部或部分地由自动化辅助，例如通过合适的机器人和感觉设备进行步骤(a)中的确定，或步骤(b)中由计算机实现的比较和/或基于所述比较的预测。
定义
词语“包括(comprise)”以及变体诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。
如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物。
水平、浓度、量和其他数值数据在本文中均可以以“范围”格式表示或呈现。应当理解，此类范围格式仅出于方便和简洁而使用，因此应灵活地解释为不仅包括明确列举为范围限值的数值，而且包括该范围所涵盖的所有单独的数值或子范围，就如同明确列举出每个数值和子范围一样。作为说明，数值范围“150mg至600mg”应解释为不仅包括明确列举的值150mg至600mg，而且包括所指示范围内的个体值和子范围。因此，该数值范围中包括个体值诸如150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、...580mg、590mg、600mg和子范围诸如从150到200、从150到250、从250到300、从350到600等。该相同原则适用于列举仅一个数值的范围。此外，无论所述范围或特征的广度如何，均适用此类解释。
当与数值结合使用时，术语“约”意指涵盖具有比所示数值小5％的下限以及具有比所示数值大5％的上限的范围内的数值。
如本领域技术人员将理解的，如本文所述的评定，诸如卒中和/或无症状梗死的评定、无症状大面积非皮质或小面积非皮质或皮质梗死程度的评定、白质病变的评定、无症状梗死和/或认知衰退的预测、无症状脑梗死的临床风险评分的预测准确性的提高、无症状大面积非皮质或皮质梗死程度和/或认知功能的监测，通常不是旨在对100％的主体是正确的。
在一个实施例中，能够以适当且正确的方式对主体的统计上显著部分进行预测。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，测定置信区间、p值测定、学生t检验、Mann-Whitney检验等)在无需进一步努力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
术语“心房颤动”在本领域中是众所周知的。如本文所用，该术语优选地指以心房不协调激活和随之导致心房机械功能恶化为特征的室上性快速心律失常。特别地，该术语指以快速且不规则的跳动为特征的不正常的心律。它涉及心脏的两个上腔室。在正常的心律中，窦房结产生的脉冲通过心脏传播，并引起心肌收缩和血液泵送。在心房颤动时，窦房结的规则电脉冲被无组织、快速的电脉冲所取代，该无组织、快速的电脉冲导致不规则的心跳。心房颤动的症状是心悸、晕厥、呼吸急促或胸痛。然而，大多数发作都没有症状。在心电图上，心房颤动的特征为通过在振幅、形状和定时上变化的快速振荡或纤维波代替一致的P波，该振荡或纤维波与房室传导完整时的不规则、频繁的快速心室反应有关。
美国心脏病学会(ACC)、美国心脏病协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)提出了以下分类体系(参见Fuster(2006)Circulation 114(7)：e257-354，本文件的全部内容通过引用合并于此，参见例如文件中的图3)：首次检测到AF、阵发性AF、持续性AF和永久性AF。
所有患有AF的人最初都属于被称为首次检测到AF的类别。然而，该主体可能有或可能没有先前未被检测到的发作。如果AF已持续超过一年，则主体罹患永久性AF。特别地，不会发生转换回窦性心律的(或仅在医疗干预下转换回窦性心律)。如果AF持续超过7天，则主体患有持续性AF。该主体可能需要药物或电干预来终止心房颤动。因此，持续性AF在发作时发生，但心律失常通常不会自发(即在没有医学发明的情况下)转换回窦性心律。阵发性心房颤动优选地是指持续不超过7天并且自发(即在没有医疗干预的情况下)终止的心房颤动的间歇性发作。在大多数阵发性AF的病例中，发作持续小于24小时。因此，虽然阵发性心房颤动为自发终止，但是持续性心房颤动并不是自发结束的，并且需要电复律或药物复律来进行终止，或需要其他程序，诸如消融程序(Fuster(2006)Circulation 114(7)：e257-354)。术语“阵发性心房颤动”被定义为这样的AF发作，该AF发作在小于48小时内，更优选在小于24小时内，并且最优选在小于12小时内自发终止。持续性和阵发性AF都可能复发。
如上所述，优选罹患阵发性、持续性或永久性心房颤动的待测主体。
进一步地，预期心房颤动先前已在主体中诊断出。因此，心房颤动应为被诊断出的，即被检测到的心房颤动。
进一步地，设想根据本发明的方法和用途进行待测试的主体可以没有已知的脑卒中和/或TIA(短暂性脑缺血发作)病史。
在一个实施例中，主体没有已知的脑卒中病史。在另一实施例中，主体没有已知的脑卒中和TIA病史。因此，待测试的主体不应患有临床公认的脑卒中和/或TIA。
如本文所用，术语“评定无症状梗死”适用于患有无症状卒中或发生无症状梗死卒中的主体。根据本发明，患有无症状卒中的主体有发展成临床卒中的风险。如本文所用，术语“评定无症状梗死”适用于主体以诊断无症状梗死、确定疾病严重程度、指导治疗(旨在强化/减少治疗)、预测疾病结果(风险预测，例如卒中)、主体的治疗监测(例如，抗凝药物对ESM-1水平的影响)和治疗分层(选择治疗方案；例如来自SWISS AF的长期治疗和选择)。
如本文所用，术语“预测风险”优选地是指据此评定主体将患无症状梗死和/或认知衰退的概率。典型地，预测主体是有患无症状梗死和/或认知衰退的风险(因此风险升高)还是没有患无症状梗死和/或认知衰退的风险(因此风险降低)。因此，本发明的方法允许区分有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体和没有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体。进一步地，设想本发明的方法允许区分降低的、平均的或升高的风险的主体。
如上所述，应预测在一定时间窗口内患无症状梗死和/或认知衰退的风险(和概率)。
在本发明的实施例中，在已获得待测样品之后确定对无症状梗死和/或认知衰退的预测。
在本发明的另一实施例中，预测窗口优选地是至少1个月、至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年、至少15年或至少20年的间隔或任何间歇时间范围。
在一个优选实施例中，预测窗口为1个月至5年的时段。因此，可以预测在1个月至5年内患无症状梗死和/或认知衰退的风险。在一个优选实施例中，预测窗口为1个月至2年的时段。优选地，预测窗口为约一年的时段。最优选地，预测窗口可以为约两年的时段。因此，可以预测主体在2年内患无症状梗死和/或认知衰退的风险。
优选地，从本发明的方法的完成起计算所述预测窗口。更优选地，从获得待测样品的时间点计算所述预测窗口。
在一个优选实施例中，“预测无症状梗死和/或认知衰退的风险”的表述是指要通过根据本发明的方法分析的主体被分配到有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体组中，或被分配到没有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体组中。因此，可以预测主体是否有患无症状梗死和/或认知衰退的风险。如本文所用，“有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体”优选地具有升高的患无症状梗死和/或认知衰退的风险(优选地在预测窗口内)。优选地，与主体同期群中的平均风险相比，所述风险是升高的。
如本文所用，“没有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体”优选地具有降低的患无症状梗死和/或认知衰退的风险(优选地在预测窗口内)。优选地，与主体同期群中的平均风险相比，所述风险是降低的。优选地在约三年的预测窗口内，有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体优选地具有至少20％或更优选地至少30％的患无症状梗死和/或认知衰退的风险。优选地在两年的预测窗口内，没有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体优选地具有低于12％，更优选地低于10％的患所述不良事件的风险。
术语“卒中”在本领域是众所周知的。该术语优选地是指缺血性脑卒中，特别是指脑缺血性脑卒中。通过本发明的方法预测的脑卒中应为由于流向大脑或其部分的血流量减少所致，该血流量减少导致脑细胞供氧不足。特别地，由于脑细胞死亡，脑卒中会导致不可逆转的组织损伤。脑卒中的症状在本领域是众所周知的。缺血性脑卒中可能为由动脉粥样硬化血栓形成或大脑主动脉栓塞、由凝血障碍或非肿瘤性血管疾病、或由导致总血流量减少的心脏缺血引起的。缺血性脑卒中优选地选自由动脉粥样硬化性血栓性脑卒中、心脏栓塞性脑卒中和腔除性脑卒中组成的组。术语“卒中”优选地不包括出血性卒中。
主体是否罹患脑卒中，特别是缺血性脑卒中，可以通过众所周知的方法来测定。此外，脑卒中的症状在本领域中是众所周知的。例如，脑卒中症状包括面部、手臂或腿部突然麻木或无力，特别是在身体的一侧，突然意识混乱，说话或理解困难，一只或两只眼睛突然看不到，以及突然行走困难，头晕，失去平衡或协调。
术语“无症状梗死”，即“无症状脑梗死”，在本领域中是已知的并且例如在Conen等人中进行了描述(Conen等人，J Am Coll Cardiol 2019；73：989-99)其全部公开内容通过引用并入本文。无症状梗死是无卒中或短暂性脑缺血发作临床病史的患者的临床无症状梗死。因此，待测试的主体应没有已知的脑卒中和/或TIA(短暂性脑缺血发作)病史。
在一个优选实施例中，预测无症状梗死的风险。优选地，该术语是指无症状脑梗死或无症状性脑梗死(Krisai等人)。
无症状梗死是没有任何与卒中相关联的外在症状的卒中，并且患者通常不知晓他们患有卒中。尽管没有引发可识别的症状，但无症状卒中仍然会对大脑造成损害，并使患者未来发生短暂性脑缺血发作和严重卒中的风险增加。无症状梗死与通常未被察觉的身体和认知功能的细微缺陷相关联。无症状卒中通常会影响与各种思维过程、情绪调节和认知功能相关联的大脑区域，并且是认知衰退或血管性认知障碍的主要原因，还可能导致膀胱失控。无症状梗死通常导致经由使用神经影像学(诸如MRI)检测到的病变。
术语“无症状脑梗死”被进一步定义为无卒中或TIA病史的患者的脑MRI上的脑梗死(LNCCI和/或SNCI)(Conen等人，2019)。
术语“LNCCI”被定义为大面积非皮质或皮质梗死，而术语“SNCI”被定义为小面积非皮质梗死。
在一个优选实施例中，评定“患有大面积非皮质或皮质梗死(LNCCI)的主体”。术语“无症状大面积非皮质或皮质梗死(LNCCI)”被定义为在轴向分区上FLAIR＞20mm直径且不累及皮质的高信号病变。FLAIR＝液体衰减反转恢复。这些病变与位于白质、内囊或外囊、脑深部核、丘脑或脑干的穿支小动脉区域的缺血性梗死一致(Conen等人，2019)。
磁共振成像上的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死(SNCI和LNCCI)与多种不良结果诸如认知障碍和抑郁等关联。例如，据报道，白质变化与速度和精细运动协调方面的运动功能下降有关，并且与许多疾病有关，包括血管性痴呆、路易体痴呆和精神障碍。
术语“白质病变”在本领域是众所周知的。白质是指主要由有髓轴突组成的中枢神经系统(CNS)区域。白质病变(也称为“白质疾病”)通常在老年人的脑MRI上检测为白质高信号(WMH)或“白质疏松症”。据描述，WMH的存在和程度是小脑血管疾病的放射影像学标志物，也是脑卒中、认知障碍和功能障碍终生风险的重要预测因子(Chutenet A，Rost NS.Whitematter disease as a biomarker for long-term cerebrovascular disease anddementia.Curr Treat Options Cardiovasc Med.2014；16(3)：292.doi：10.1007/s11936-013-0292-z)。ESM-1的确定允许评定WML程度，即WML的负担。因此，生物标志物允许对主体中的WML进行量化，即它是功能性脑组织体积损失的标志物。
白质病变程度可通过Fazekas评分来表示(Fazekas、JB Chawluk、A Alavi、HIHurtig和RA Zimmerman American Journal of Roentgenology 1987 149：2，351-356)。Fazekas评分范围为0到3。0表示无WML，1表示轻度WML，2表示中度WML，3表示重度WML。
如本文所用，术语“认知衰退”被定义为记忆力、注意力和认知功能的退化。作为术语“认知衰退”的替代，可以使用术语“认知功能障碍”、术语“认知障碍”或术语“痴呆”。
该术语优选地是指可以表征为认知和智力功能的丧失，通常是进行性的，但没有由各种病症但最通常是与结构性脑病相关联的疾病引起的感知或意识损害。认知测试可以使用蒙特利尔认知评定(MoCA)来进行，如Conen等人所述，2019。术语“认知功能”涉及用评分评定认知功能，如Conen等人所述，2019。蒙特利尔认知评定(MoCA)评定视觉空间功能和执行功能、对证命名、记忆、注意力、语言和抽象。患者最多可获得30分，评分越高表示认知功能越好。如果患者接受过12年或更少的正规教育，则总测试评分增加一分。
最常见的痴呆类型是阿尔茨海默病，占病例的50％至70％。其他常见类型包括血管性痴呆(25％)、路易体痴呆和额颞叶痴呆。术语“痴呆”包括但不限于艾滋病性痴呆、阿尔茨海默病、早老性痴呆、老年性痴呆、紧张性痴呆、路易体痴呆(弥漫性路易体病)、多发性脑梗死性痴呆(血管性痴呆)、麻痹性痴呆、创伤后痴呆、早发性痴呆、血管性痴呆。
在一个实施例中，术语痴呆是指血管性痴呆、阿尔茨海默病、路易体痴呆和/或额颞叶痴呆。因此，预测患有血管性痴呆、阿尔茨海默病、路易体痴呆和/或额颞叶痴呆的风险。
在一个实施例中，预测患有“阿尔茨海默病”的风险。术语“阿尔茨海默病”在本领域是众所周知的。阿尔茨海默病是一种慢性神经退行性疾病，通常开始缓慢并随着时间的推移逐渐恶化。随着疾病的进展，症状可包括语言问题、定向障碍、情绪波动、失去动力、无法自我照顾和行为问题。
在一个实施例中，预测患有“血管性痴呆”的风险。术语“血管性痴呆”优选地是指由脑内血管损伤或疾病引起的记忆和其他认知功能的进行性丧失。因此，该术语应指由脑部血液循环问题引起的痴呆症状。它可能发生在无症状脑梗死之后或卒中随时间推移而累积之后。
本发明的方法也可用于筛选更大的主体群体。因此，设想对至少100名主体、特别是至少1000名主体，例如进行关于无症状梗死的风险的评定。因此，在来自至少100名、或特别是来自至少1000名主体的样品中确定生物标志物ESM-1的量。此外，设想评定至少10,000名主体。
术语“抗凝疗法”优选地为旨在降低所述主体的抗凝风险的治疗。施用至少一种抗凝剂应旨在减少或预防血液凝固和相关的脑卒中。在一个优选实施例中，至少一种抗凝剂选自由以下项组成的组：肝素、香豆素衍生物(即维生素K拮抗剂)(特别是华法林或双香豆素)、口服抗凝剂(特别是达比加群(dabigatran)、利伐沙班(rivaroxaban)或阿哌沙班(apixaban))、组织因子途径抑制剂(TFPI)、抗凝血酶III、因子IXa抑制剂、因子Xa抑制剂、因子Va和因子VIIIa的抑制剂以及凝血酶抑制剂(抗IIa型)。
在特别优选的实施例中，该抗凝剂为维生素K拮抗剂(诸如华法林或双香豆素)。维生素K拮抗剂(诸如华法林或双香豆素)价格较低，但是因为治疗不方便，繁琐，而且往往不可靠，并且治疗时间在治疗范围内波动，所以需要更好的患者依从性。NOAC(新的口服抗凝剂)包括直接因子Xa抑制剂(阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班(darexaban)、依度沙班(edoxaban))、直接凝血酶抑制剂(达比加群)和PAR-1拮抗剂(沃拉帕沙(vorapaxar)、阿托帕沙(atopaxar))。
如果测试主体正在接受抗凝疗法，并且如果已确定主体没有患无症状梗死的风险(通过本发明的方法)，则可以减少抗凝疗法的剂量。因此，可以建议减少剂量。减少剂量，可能会降低副作用(诸如出血)的风险。
术语“临床卒中风险评分”在本领域中是众所周知的。例如，在Kirchhof P.等人(European Heart Journal 2016；37：2893-2962)中描述了所述评分。在一个实施例中，评分是CHA2DS2-VASc评分。在另一实施例中，评分是CHADS2评分。(Gage BF.等人，JAMA，285(22)(2001)，第2864-2870页)和ABC评分，即ABC(年龄、生物标志物、临床病史)脑卒中风险评分(Hijazi Z.等人，Lancet 2016；387(10035)：2302-2311)。本段中的所有出版物的全部公开内容均以引用方式并入本文。
因此，在一个实施例中，临床卒中风险评分是CHA2DS2-VASc评分。在本发明的替代实施例中，临床卒中风险评分是CHADS2评分。
如本文所用，术语“建议”是指建立可以应用于主体的治疗的提议。然而，应该理解的是该术语并不包括应用实际疗法。建议的疗法取决于例如通过本发明的方法预测的结果。
如本文所用，术语“监测”优选地涉及评定如本文别处提及的疾病进展。此外，可监测治疗对患者的功效。
根据本发明的方法和用途，待测“主体”优选地为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，该主体是人主体。术语“主体”和“患者”在本文中可互换使用。
在特定实施例中，主体为人类患者。在实施例中，患者不限年龄。在实施例中，患者为50岁或更高年龄，具体地为60岁或更高年龄，且具体地为65岁或更高年龄。进一步地，设想待测试患者为70岁或更高年龄。
在本发明方法和用途的一个优选实施例中，主体为65岁或更高年龄。在另一优选实施例中，主体为70岁或更高年龄。在另一实施例中，主体为75岁或更高。
术语“样品”是指体液样品、分离细胞样品或来自组织或器官样品。体液样品可通过众所周知的技术获得并且包括血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、痰、腹水、唾液、泪液、脑脊液或任何其他身体分泌物或其衍生物的样品。组织或器官样品可以通过例如活检从任何组织或器官获得。分离细胞可以通过诸如离心或细胞分选等分离技术从体液或组织或器官中获得。例如，可以从表达或产生生物标志物的那些细胞、组织或器官中获得细胞、组织或器官样品。例如，样品可以是心肌组织样品。进一步地，样品可以是神经组织样品或肠道组织样品。在一些实施例中，样品是骨髓样品。样品可以是冷冻样品、新鲜样品、固定(例如，福尔马林固定)样品、离心和/或包埋(例如，石蜡包埋)样品等。在评定样品中一种或多种标志物的量之前，细胞样品当然可以经受各种众所周知的收集后制备和贮存技术(例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、贮存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)处理。
因此，样品可以是组织样品。在一个优选实施例中，组织样品是心脏组织样品(诸如心肌组织样品)。特别地，样品是来自右心耳的组织样品。在另一优选实施例中，样品是神经组织样品(诸如脑组织样品或脊髓样品。
在另一优选实施例中，样品为血液(即全血)、血清或血浆样品。例如，样品可以是静脉血、血清或血浆样品。可替代地，样品可以是毛细血管血样品(例如从手指获得)。在一些实施例中，样品为外周血样品。血清是在使血液凝固后所获得的全血的液体级分。为了获得血清，通过离心去除血凝块并收集上清液。血浆是血液中无细胞的流体部分。为了获得血浆样品，将全血收集在抗凝处理过的试管(例如柠檬酸盐处理过的试管或EDTA处理过的试管)中。通过离心将细胞从样品中去除，并获得上清液(即血浆样品)。
进一步地，样品可以包含干细胞(诸如来自骨髓或外周血的干细胞、淋巴细胞、心肌细胞、神经元细胞或肠道细胞。
在一些实施例中，样品为脑脊液样品。
生物标志物的检测：
本文提及的生物标志物可以使用本领域中一般已知的方法来检测。检测方法通常包括量化样品中生物标志物的量的方法(定量方法)。本领域技术人员通常已知以下方法中的何种适合于生物标志物的定性和/或定量检测。可以使用商购可得的Western和免疫测定，如ELISA、RIA、基于荧光和发光的免疫测定和邻近延伸测定法来方便地测定样品中的例如蛋白质。检测生物标志物的其他合适方法包括测量肽或多肽特有的物理或化学性质，诸如其精确的分子质量或NMR谱。所述方法包括，例如生物传感器、耦合到免疫测定的光学装置、生物芯片、分析装置(诸如质谱仪、NMR分析仪或色谱装置)。进一步地，方法包括基于微板ELISA的方法、全自动或机器人免疫测定(例如在ElecsysTM分析仪上可用)、CBA(例如在Roche-HitachiTM分析仪上可用的酶钴结合测定)和乳胶凝集测定(例如在Roche-HitachiTM分析仪上可用)。
对于本文所述的生物标志物蛋白的检测，可以使用这种检定形式的各种免疫测定技术，参见例如美国专利号4016043、4424279和4018653。这些技术包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定，以及传统的竞争性结合测定。这些测定还包括标记抗体与靶标生物标志物的直接结合。
采用电化学发光标签的方法是众所周知的。此类方法利用特殊金属复合物的借助于氧化实现激发态的能力，所述特殊金属复合物从该激发态衰变为基态，从而发出电化学发光。关于综述请参见Richter，M.M.，Chem.Rev.2004；104：3003-3036。
在一个实施例中，用于测量生物标志物的量的检测抗体(或其抗原结合片段)被钌化或铱化。因此，抗体(或其抗原结合片段)应包含钌标签。在一个实施例中，所述钌标签是联吡啶钌(II)复合物。或抗体(或其抗原结合片段)应包含铱标签。在一个实施例中，所述铱标签是如WO 2012/107419中所公开的复合物。
在用于确定ESM-1的夹心测定的一个实施例中，该测定包括特异性结合ESM-1的生物素化的第一单克隆抗体(作为捕获抗体)；以及特异性结合ESM-1的第二单克隆抗体(作为检测抗体)的钌化F(ab′)2片段。两种抗体与样品中的ESM-1形成夹心免疫测定复合物。
测量多肽的量可以优选地包括以下步骤：(a)将多肽与特异性地结合所述多肽的药剂接触，(b)(任选地)移除未结合的药剂，(c)测量结合的结合剂的量，即在步骤(a)中形成的药剂的复合物。根据一个优选实施例，所述接触、移除和测量步骤可由分析器单元执行。根据一些实施例，所述步骤可由所述系统的单个分析器单元或由彼此可操作通信的多于一个分析器单元来执行。例如，根据一个特定实施例，本文所公开的所述系统可包括用于执行所述接触和移除步骤的第一分析器单元；以及第二分析器单元，所述第二分析器单元通过传输单元(例如，机械臂)可操作地连接到所述第一分析器单元，所述第二分析器单元执行所述测量步骤。
特异性地结合生物标志物的试剂(在此也称为“结合试剂”)可以共价或非共价地耦合到标签，从而允许检测和测量结合的试剂。可通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及将标签直接(共价或非共价)耦合到结合试剂。间接标记涉及二级结合试剂与第一结合试剂的结合(共价或非共价)。该二级结合试剂应特异性地与第一结合试剂结合。所述二级结合试剂可以与适当的标签耦合，并且/或者是三级结合试剂的与二级结合试剂结合的靶标(受体)。合适的二级和更高阶的结合试剂可包括抗体、二抗和众所周知的链霉亲和素-生物素体系(Vector Laboratories，Inc.)。结合试剂或底物也可以用本领域已知的一个或多个标签“标记”。此类标签可以是更高阶的结合试剂的靶标。合适的标签包括生物素、洋地黄毒苷、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，该标签优选地位于N-末端和/或C-末端。合适的标签是可通过合适的检测方法检测到的任何标签。典型的标签包括金颗粒、乳胶珠粒、吖啶酯(acridan ester)、鲁米诺、钌复合物、铱复合物、酶活性标签、放射性标签、磁性标签(“例如磁珠”，包括顺磁标签和超顺磁标签)和荧光标签。酶活性标签包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶，以及它们的衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3，3′-5，5′-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，可作为现成储备溶液从Roche Diagnostics购得)、CDP-StarTM(AmershamBio-sciences)、ECFTM(Amersham Biosciences)。合适的酶-底物组合可产生有色反应产物、荧光或化学发光，所述有色反应产物、荧光或化学发光可根据本领域已知的方法(例如使用感光胶片或合适的摄像系统)来测定。对于酶反应的测量，上述给定的标准类似地适用。典型的荧光标记包括荧光蛋白(诸如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。进一步的荧光标签可从Molecular Probes(Oregon)购得。同样，还考虑使用量子点作为荧光标签。放射性标签可以通过任何已知且适当的方法检测，所述方法为例如感光胶片或磷光成像仪。
多肽的量也可以优选地如下测定：(a)将包含如本文其他部分所述的多肽的结合试剂的固体支持物与包含所述肽或多肽的样本接触，以及(b)测量与支持物结合的肽或多肽的量。制造支持物的材料在本领域中是众所周知的，并且尤其包括商用柱材料、聚苯乙烯珠粒、乳胶珠粒、磁性珠粒、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝化纤维带、膜、片材、耐久细胞(duracytes)、反应盘的孔和壁、塑料管等。
在又另一方面中，在测量形成的复合物的量之前，从结合剂与至少一种标志物之间形成的复合物中移除样品。因此，在一个方面中，该结合试剂可固定在固体支持物上。在又另一方面中，通过应用洗涤溶液，可以从固体支持物上形成的复合物中移除样品。
“夹心测定”是最有用和最常用的测定之一，包括夹心测定技术的许多变型。简单地说，在典型的测定中，未标记的(捕获)结合试剂被固定或可以固定在固体底物上，并且使待测样品与捕获结合试剂接触。在适当的孵育期后，在一段时间足以允许形成结合试剂-生物标志物复合物，然后添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的第二(检测)结合试剂，以及孵育允许足以形成结合试剂-生物标志物-标记的结合试剂的另一复合物的时间。可将任何未反应的材料洗去，并且通过观察由与检测结合试剂结合的报告分子产生的信号来测定生物标志物的存在。结果可以通过简单观察可见信号来定性，或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品进行比较来量化。
典型夹心测定的孵育步骤可以根据需要和在适当时进行变化。此类变化包括例如同时孵育，其中将两种或更多种结合试剂和生物标志物共孵育。例如，将待分析的样品和标记的结合试剂同时添加到固定的捕获结合试剂中。也可以首先孵育待分析的样品和标记的结合试剂，然后添加结合到固相或能够结合到固相的抗体。
特定结合试剂与生物标志物之间形成的复合物应与样品中存在的生物标志物的量成比例。应理解的是，将要应用的结合试剂的特异性和/或敏感性限定了样品中包含的能够被特异性地结合的至少一种标志物的比例程度。也可在本文别处找到关于可以如何进行测量的进一步细节。形成的复合物的量应转化为生物标志物的量，从而反映样品中真实存在的量。
术语“结合剂”、“特异性结合剂”、“分析物特异性结合剂”、“检测剂”、“与生物标志物结合的药剂”和“与生物标志物特异性地结合的药剂”在本文中可互换使用。优选地，它涉及这样的试剂，所述试剂包含特异性地结合对应的生物标志物的结合部分。“结合试剂”、“检测剂”、“试剂”的实例是核酸探针、核酸引物、DNA分子、RNA分子、适体、抗体、抗体片段、肽、肽核酸(PNA)或化合物。优选的试剂是特异性地结合待测定生物标志物的抗体。本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性(即其抗原结合片段)即可。优选地，该抗体是多克隆抗体(或其抗原结合片段)。优选地，该抗体是单克隆抗体(或其抗原结合片段)。此外，如本文别处所述，设想使用在ESM-1多肽的不同位置处结合的两种单克隆抗体(在夹心免疫测定中)。因此，将至少一种抗体用于确定ESM-1的量。
药剂或检测剂应特异性地结合生物标志物ESM-1。术语“特异性结合”或“特异性地 结合”是指其中结合对分子在它们没有与其他分子显著结合的条件下表现为彼此结合的结合反应。当提及蛋白质或肽作为生物标志物时，术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地指结合试剂以至少107M-1的亲和力(“结合常数”Ka)与对应的生物标志物结合的结合反应。术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地是指对其靶分子具有至少108M-1或甚至更优选至少109M-1的亲和力。术语“特异的”或“特异性地”用于表示样品中存在的其他分子不显著地与特异于该靶分子的结合试剂结合。
如本文所用，术语“量”涵盖本文提及的生物标志物(诸如ESM-1)的绝对量、所述生物标志物的相对量或浓度，以及与其相关或可从其导出的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接测量从所述肽获得的所有具体物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，所包含的是通过在本说明书别处指定的间接测量获得的所有值或参数，例如，响应于肽或从特异性地结合的配体获得的强度信号而从生物读出系统测定的反应量。应理解的是，与上述量或参数相关的值也可以通过所有标准数学运算获得。
如本文所用，术语“比较”是指将来自主体的样品中生物标志物(ESM-1)的量与本说明书别处指定的生物标志物的参考量进行比较。应理解的是，如本文所用的比较通常指对应的参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量进行比较，而将浓度与参考浓度进行比较，或将从样品中的生物标志物获得的强度信号与从参考样品获得的相同类型的强度信号进行比较。可手动或计算机辅助进行比较。因此，可以由计算装置进行比较。例如，可以将来自主体的样品中生物标志物的测定或检测量的值与参考量相互比较，并且可以由执行比较算法的计算机程序自动执行所述比较。执行所述评估的计算机程序将以适当的输出格式提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可以进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的预测。
根据本发明，生物标志物ESM-1的量应与参考(即与一个参考量(或与多个参考量))进行比较。因此，参考优选为参考量。术语“参考量”或“参考”被技术人员很好地理解。
应当理解，参考量应允许预测无症状梗死和/或认知衰退，提高主体的无症状脑梗死的临床风险评分的预测准确性，评定无症状大面积非皮质或皮质梗死程度，评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死，监测无症状大面积非皮质或皮质梗死的程度和/或认知功能，以及诊断主体的心房颤动，如本文别处所述。
例如，结合用于预测无症状梗死和/或认知衰退的风险的方法，参考量优选地是指这样的量，该量允许将主体分配到(i)有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体组，或(ii)有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体组。例如，结合用于诊断无症状梗死的方法，参考量优选地指这样的量，该量允许将主体分配到(i)患有无症状梗死的主体组，或(ii)未患无症状梗死的主体组。可从要与测试样品一起(即同时或随后)分析的参考样品测定适当的参考量。
原则上，可以基于给定生物标志物的平均值或均值，通过施加标准统计方法来计算如上文所指定的主体同期群的参考量。特别地，测试(诸如旨在诊断发生事件或未发生事件的方法)的准确性通过其接收器操作特性(ROC)而被最好地描述(特别地参见Zweig MH.等人，Clin.Chem.1993；39：561-577)。ROC曲线图是在观察到的整个数据范围内连续改变决策阈值所产生的所有敏感性对比特异性对的曲线。诊断方法的临床性能取决于其准确性，即其能够正确地将主体分配到某一预后或诊断中。ROC曲线通过将适用于区分的整个阈值范围的敏感性对比1-特异性绘制成曲线而显示了两种分布之间的重叠。y轴上是敏感性，即真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性测试结果数和假阴性测试结果数之积的比率。其仅从受影响的子组计算。x轴上是假阳性分数，即1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性结果数和假阳性结果数之积的比率。这是一个特异性指数，并且完全由未受影响的子组计算得出。由于真阳性分数和假阳性分数是完全分开计算的，所以通过使用来自两个不同子组的测试结果，ROC曲线与同期群中事件的患病率无关。ROC曲线上的每一点代表与特定决策阈值对应的敏感性/1-特异性对。有完全区别(两种结果分布没有重叠)的测试具有穿过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数为1.0或100％(完全敏感性)，并且假阳性分数为0(完全特异性)。无区别(两个组的结果分布相同)的测试的理论曲线是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极端之间。如果ROC曲线完全落到低于45°对角线，则可以通过将“阳性”的标准从“大于”逆转为“小于”或反之亦然来轻松纠正。定性地，曲线越接近左上角，则测试的总体准确性就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线导出阈值，从而允许分别在适当的敏感性和特异性平衡下对给定事件进行诊断。
因此，优选地，通过建立如上所述的所述同期群的ROC并由此导出阈值量，可以生成用于本发明方法的参考，即允许相应评定的阈值，诸如预测无症状梗死和/或认知衰退、预测无症状梗死和/或认知衰退、提高主体的无症状脑梗死的临床风险评分的预测准确性、评定无症状大面积非皮质或皮质梗死的程度、评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死、监测无症状大面积非皮质或皮质梗死的程度和/或认知功能。
根据评定所需的敏感性和特异性，ROC曲线允许得出合适的阈值。应当理解，最佳敏感性是排除针对有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体(即排除)所需的，而最佳特异性是针对预测有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体(即确定)设想的。
本文的术语“参考量”是指预定值。所述预定值应允许本文提及的评定，诸如预测无症状梗死和/或认知衰退、提高主体的无症状脑梗死的临床风险评分的预测准确性、评定无症状大面积非皮质或皮质梗死程度、评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死、监测主体的无症状大面积非皮质或皮质梗死程度和/或认知功能。
在用于预测无症状梗死和/或认知衰退的风险的方法中，例如，参考，即参考量应允许区分有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体和没有患无症状梗死和/或认知衰退的风险的主体。
生物标志物内皮细胞特异性分子1(缩写为ESM-1)是本领域众所周知的。生物标记物通常也被称为endocan。ESM-1是分泌蛋白，其主要在人肺和肾组织的内皮细胞中表达。公共领域数据表明，甲状腺、肺和肾中也表达，但在心脏组织中也表达，参见例如蛋白Atlas数据库中ESM-1的条目(Uhlén M.等人，Science 2015；347(6220)：1260419)。该基因的表达受细胞因子调节。ESM-1是由20kDa成熟多肽和30kDa O-连接的聚糖链构成的蛋白聚糖(Bechard D等人，J Biol Chem 2001；276(51)：48341-48349)。
在本发明的一个优选实施例中，在来自主体的样品中测定人ESM-1多肽的量。人ESM-1多肽的序列是本领域众所周知的(例如参见Lassale P.等人，J.Biol.Chem.1996；271：20458-20464并且可以例如通过Uniprot数据库进行评定，参见条目Q9NQ30(ESM1_HUMAN)。通过选择性剪接产生ESM-1的两种同工型，即同工型1(具有Uniprot标识符Q9NQ30-1)和同工型2(具有Uniprot标识符Q9NQ30-2)。同工型1的长度为184个氨基酸。在同工型2中，缺少同工型1的氨基酸101至150。氨基酸1至19形成信号肽(可能会被裂解)。
在一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1、即具有如UniProt登录号Q9NQ30-1所示的序列的同工型1的量。
在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型2、即具有如UniProt登录号Q9NQ30-2所示的序列的同工型2的量。
在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1和同工型2、即总ESM-1的量。
例如，可以用针对ESM-1多肽的氨基酸85至184的单克隆抗体(诸如小鼠抗体)和/或用山羊多克隆抗体测定ESM-1的量。
在本发明的方法和用途的一个优选实施例中，生物标志物ESM-1为ESM-1多肽。因此，确定ESM-1多肽的量。
在本发明的方法和用途的一个优选实施例中，生物标志物ESM-1是ESM-1mRNA。因此，确定ESM-1mRNA的量(可以直接或间接进行)。
术语“确定”如本文提及的生物标志物(诸如ESM-1)的量是指生物标志物的量化，例如使用本文别处描述的适当检测方法来确定样品中生物标志物的水平。术语“测量”和“测定”在本文中可互换使用。
在一个实施例中，生物标志物的量是通过以下方式来测定的：使样品与特异性地结合生物标志物的试剂接触，由此在该试剂与所述生物标志物之间形成复合物，检测所形成的复合物的量，并由此测量所述生物标志物的量。
在实施例中，使用抗体，特别是使用单克隆抗体确定ESM-1的水平。在实施例中，确定患者的样品中ESM-1的水平的步骤a)包括进行免疫测定。在实施例中，免疫测定法以直接或间接形式执行。在实施例中，此类免疫测定法选自由以下组成的组：酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光检测的免疫测定法。
在特定实施例中，确定患者的样品中ESM-1的水平的步骤a)包括以下步骤
i)将患者的样品与一种或多种与ESM-1特异性结合的抗体一起孵育，从而在抗体和ESM-1之间产生复合物，以及
ii)量化步骤i)中形成的复合物，从而量化患者的样品中ESM-1的水平。
在特定实施例中，在步骤i)中，将样品与两种特异性结合ESM-1的抗体一起孵育。如对本领域技术人员显而易见的那样，可按任意需要的顺序使样品接触第一和第二抗体，即首先接触第一抗体，然后接触第二抗体；或者首先接触第二抗体，然后接触第一抗体；或同时接触第一和第二抗体。在充分的时间和条件下接触，以形成第一抗ESM-1抗体/ESM-1/第二抗ESM-1抗体复合物。如本领域技术人员所容易理解的是，这仅仅是用于设定形成以下复合物的适合或充分的时间和条件的常规实验，即形成特异性抗ESM-1抗体和ESM-1抗原/分析物的复合物(＝抗ESM-1复合物)，或形成二级复合物或夹心复合物，其包括ESM-1的第一抗体、ESM-1(分析物)和第二抗ESM-1抗体(＝抗ESM-1抗体/ESM-1/第二抗ESM-1抗体复合物)。
可采用任何适当的方式对抗ESM-1抗体/ESM-1复合物进行检测。第一抗ESM-1抗体/ESM-1/第二抗ESM-1抗体复合物的检测可以通过任何合适的方式进行。本领域的技术人员充分熟悉所述方式/方法。
在某些实施例中，将形成包含针对ESM-1的第一抗体、ESM-1(分析物)和针对ESM-1的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记。
在一个实施例中，将形成包含针对GDF-15的第一抗体、ESM-1(分析物)和针对ESM-1的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记并且其中第一抗ESM-1抗体能够结合固相或与固相结合。
在实施例中，第二抗体被直接或间接地可检测地标记。在特定实施例中，第二抗体用发光染料，特别是化学发光染料或电化学发光染料可检测地标记。
在特定实施例中，样品中的抗原、生物素化的单克隆ESM-1特异性抗体和用钌复合物标记的单克隆ESM-1特异性抗体形成夹心复合物。在添加链霉亲和素包被的微粒之后，复合物经由生物素和链霉亲和素的相互作用与固相结合。
本发明的具体实施方式
根据本发明的方法包括基本上由上述步骤组成的方法或包括其他步骤的方法。此外，本发明的方法优选地是离体方法，更优选地是体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可涉及测定其他标志物和/或样品预处理或评估通过该方法获得的结果。该方法可以手动执行或由自动化辅助。优选地，步骤(a)、(b)和/或(c)可全部或部分地由自动化辅助，例如通过合适的机器人和感觉设备进行步骤(a)中的测定或步骤(b)中由计算机实现的计算。
在本发明方法和用途的一个优选实施例中，待测主体患有心房颤动。心房颤动可以为阵发性、持续性或永久性心房颤动。因此，该主体可能患有阵发性、持续性或永久性心房颤动。特别地，设想主体罹患阵发性、持续性或永久性心房颤动。在持续性心房颤动患者中观察到了最好的性能。
因此，在本发明的一个实施例中，该主体罹患阵发性心房颤动。在本发明的另一实施例中，该主体罹患持续性心房颤动。在本发明的另一实施例中，该主体患有永久性心房颤动。
在第一方面，本发明涉及一种用于评定主体的卒中的方法，其包括以下步骤
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)将ESM-1的量与参考量进行比较，从而评定卒中。
在一个优选实施例中，大于参考的ESM-1的量指示患有卒中的主体，其中低于参考的ESM-1的量指示未患卒中的主体。
在一个优选实施例中，大于参考的ESM-1的量指示患有卒中的主体，其中低于参考的ESM-1的量指示未患卒中的主体。
在另一个优选实施例中，主体可能患有心房颤动。
在一个优选实施例中，主体为人。此外，主体的样品优选地为血液、血清、血浆或组织样品。
在第二方面，本发明涉及一种用于评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，
b)将在步骤a)中确定的量与参考进行比较，以及
c)评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死。
在一个优选实施例中，大于参考的ESM-1的量指示患有一次或多次无症状梗死的主体，其中低于参考的ESM-1的量指示未患一次或多次无症状梗死的主体。
在另一个优选实施例中，主体可能患有心房颤动。
在一个优选实施例中，主体为人。此外，主体的样品优选地为血液、血清、血浆或组织样品。
在第三方面，本发明涉及一种用于预测主体的无症状梗死和/或认知衰退的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，
b)将在步骤a)中确定的量与参考进行比较，以及
c)预测主体的无症状梗死和/或认知衰退。
在一个优选实施例中，预测无症状梗死的风险。优选地，该术语是指无症状脑梗死或无症状性脑梗死(Krisai等人)。
在另一个优选实施例中，ESM-1的量的值与CHA2D2-VASc评分结合，从而提高无症状脑梗死的临床风险评分的预测准确性。
在一个优选实施例中，预测认知衰退。可替代地，可以预测主体是否有认知衰退/痴呆的风险。可以通过认知测试来评定认知功能衰退和痴呆的风险。
优选地，大于参考的ESM-1的量预示主体的无症状梗死和/或认知衰退，其中低于参考的ESM-1的量不预示主体的无症状梗死和/或认知衰退。
在一个优选实施例中，ESM-1的量的值与CHA2D2-VASc评分结合，从而提高无症状脑梗死和/或认知衰退的临床风险评分的预测准确性。
此外，预测在1个月至5年内，诸如在1年内或在2年内，主体患主体的无症状梗死和/或认知衰退的风险。
在另一个优选实施例中，主体可能患有心房颤动。
此外，主体的样品优选地为血液、血清、血浆或组织样品。在一个优选实施例中，主体为人。
在第四方面，本发明涉及一种用于提高主体的无症状梗死和/或认知衰退的临床 卒中风险评分的预测准确性的方法，其包括以下步骤
a)确定来自主体的样品中的生物标志物ESM-1的量，以及
b)将生物标志物ESM-1的量的值与临床卒中风险评分结合，从而提高所述无症状梗死和/或认知衰退的临床卒中风险评分的预测准确性。
在本发明的基础研究中，进一步证明，ESM-1的确定允许提高主体的无症状梗死和/或认知衰退的临床卒中风险评分的预测准确性。因此，与单独的ESM-1的确定或单独的临床卒中风险评分的确定相比，无症状梗死和/或认知衰退的临床卒中风险评分和ESM-1的量的结合确定可以更可靠地预测临床卒中。此外，ESC指南推荐的风险评分不够敏感，并且遗漏抗凝治疗的患者。本发明检测出抗凝疗法的患者的概率以比ESC指南推荐的当前卒中风险评分更高。
因此，用于预测无症状梗死和/或认知衰退的风险的方法可进一步包括将ESM-1的量与临床卒中风险评分结合。基于ESM-1的量与临床风险评分的结合，预测测试主体的无症状梗死的风险。
或者，该方法可包括获得或提供临床脑卒中风险评分的值。优选地，该值是数字。在一个实施例中，临床脑卒中风险评分是通过医师可用的基于临床的工具中的一种生成的。优选地，值是通过测定主体的临床脑卒中风险评分的值而提供的。更优选地，主体的值是从主体的患者记录数据库和病史获得的。因此，评分的值也可以使用该主体的历史数据或公布的数据来测定。
根据本发明，ESM-1的量可以与无症状梗死和/或认知衰退的临床卒中风险评分结合。这意味着优选地，将ESM-1的量的值与临床卒中风险评分结合。因此，将这些值有效结合以预测主体患无症状梗死和/或认知衰退的风险。通过结合该值，可以计算单个值，该单个值本身可用于预测。
临床脑卒中风险评分在本领域中是众所周知的。例如，在Kirchhof P.等人(European Heart Journal 2016；37：2893-2962)中描述了所述评分。在一个实施例中，评分是CHA2DS2-VASc评分。在另一实施例中，评分是CHADS2评分。(Gage BF.等人，JAMA，285(22)(2001)，第2864-2870页)和ABC评分，即ABC(年龄、生物标志物、临床病史)脑卒中风险评分(Hijazi Z.等人，Lancet 2016；387(10035)：2302-2311)。本段中的所有出版物的全部公开内容均以引用方式并入本文。
因此，在一个实施例中，临床卒中风险评分是CHA2DS2-VASc评分。在本发明的替代实施例中，临床卒中风险评分是CHADS2评分。
在一个优选实施例中，ESM-1的量的值与CHA2D2-VASc评分结合，从而提高无症状脑梗死和/或认知衰退的临床风险评分的预测准确性。
在另一个优选实施例中，用于预测主体的无症状梗死和/或认知衰退的风险的上述方法进一步包括建议抗凝疗法的步骤，或如果已确定主体有患卒中的风险则建议强化抗凝疗法的步骤(如本文别处所述)。
该方法可包括进一步的步骤：c)基于步骤b)的结果提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。
上文结合预测无症状梗死和/或认知衰退的风险的方法给出的定义和解释优选地也适用于上述方法。例如，设想主体是具有已知无症状梗死和/或认知衰退的临床卒中风险评分的主体。可替代地，该方法可包括获得或提供无症状梗死和/或认知衰退的临床卒中风险评分的值。
此外，预测在1个月至5年内，诸如在1年内或在2年内，主体患主体的无症状梗死和/或认知衰退的风险。
在一个实施例中，主体可能患有心房颤动。此外，主体的样品优选地为血液、血清、血浆或组织样品。在一个优选实施例中，主体为人。
在本发明的第五方面，该方法涉及评定主体的无症状小面积和大面积非皮质和皮 质梗死程度，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)基于在步骤a)中确定的量来评定主体的无症状大面积非皮质或皮质
梗死程度。
上文给出的定义优选地比照适用于以下方法，以评定白质病变程度。
有趣的是，在本发明基础的研究中表明，生物标志物ESM-1可用于估计作为心房颤动患者认知衰退和认知功能障碍的原因的脑血管损伤的风险、存在和/或严重程度。具体地，研究表明，ESM-1与患者的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死(LNCCI或SNCI)和白质病变(WML)的存在相关。术语“LNCCI”被定义为大面积非皮质或皮质梗死，而术语“SNCI”被定义为小面积非皮质梗死。
在一个优选实施例中，评定“患有无症状大面积非皮质或皮质梗死(LNCCI)的主体”。
在上述方法的实施例中，主体可能患有心房颤动。此外，主体的样品优选地为血液、血清、血浆或组织样品。在一个优选实施例中，主体为人。
在本发明的第六方面，该方法涉及评定主体的白质病变程度，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)基于在步骤a)中确定的量来评定主体的白质病变程度。
ESM-1的量越高，LNCCI或SNCI或WML程度越高(反之亦然)。因此，ESM-1可用作评定主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死和/或白质病变程度和/或认知功能的标志物。
上文给出的定义优选地比照适用于以下方法。
白质病变或无症状大面积非皮质或皮质梗死程度可能由临床无症状梗死引起。因此，生物标志物ESM-1可进一步用于评定主体过去(即在获得样品之前)是否经历过一次或多次无症状梗死。
在一个优选实施例中，待测主体患有心房颤动。此外，预测在1个月至5年内，诸如在1年内或在2年内，主体患主体的无症状梗死和/或认知衰退的风险。
在本发明的第七方面，该方法涉及监测主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死和/或白质病变程度和/或认知功能，其包括
a)确定来自主体的第一样品中的ESM-1的量，
b)确定已在第一样品之后获得的来自主体的第二样品中的ESM-1的量，
c)将第一样品中的ESM-1的量与第二样品中的ESM-1的量进行比较，以及
d)基于步骤c)的结果来监测主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死程度和/或认知功能和/或认知功能。
在本发明的一个实施例中，该方法进一步包括以下步骤
a)建议抗凝疗法，
b)建议强化抗凝疗法，
c)强化风险因素管理，以及
d)在专科诊所进行护理。
本发明的方法可以辅助个性化医疗。在一个优选实施例中，用于预测主体的无症状梗死的风险的方法进一步包括i)建议抗凝疗法的步骤，或ii)如果已确定主体有患无症状梗死的风险则建议强化抗凝疗法的步骤。在另一优选实施例中，用于预测主体的无症状梗死的风险的方法进一步包括i)开始抗凝疗法的步骤，或ii)如果已确定主体有患无症状梗死的风险(通过本发明的方法)则强化抗凝疗法的步骤。
特别地，以下规定适用：
如果待测主体未接受抗凝疗法，则如果已确定主体有患无症状梗死的风险，就建议开始抗凝疗法。因此，应开始抗凝疗法。
如果待测主体已接受抗凝疗法，则如果已确定主体有患无症状梗死的风险，就建议强化抗凝疗法。因此，应加强抗凝疗法。
在一个优选实施例中，通过增加抗凝剂的剂量(即，当前施用的凝结剂的剂量)来加强抗凝疗法。
在一个特别优选实施例中，通过用更有效的抗凝剂替换当前施用的抗凝剂来强化抗凝疗法。因此，建议更换抗凝剂。
据描述，与维生素K拮抗剂华法林相比，使用口服抗凝剂阿哌沙班实现了高风险患者中的更好预防，如Hijazi等人，The Lancet 2016 387，2302-2311，(图4)所示。
因此，设想待测主体是使用维生素K拮抗剂(诸如华法林或双香豆素)疗法的主体。如果已确定主体有患无症状梗死的风险(通过本发明的方法)，则建议用口服抗凝剂(特别是达比加群、利伐沙班或阿哌沙班)替代维生素K拮抗剂。因此，用维生素K拮抗剂的治疗中止，开始用口服抗凝剂进行治疗。
术语“主体”和“样品”已在上文中定义。这些定义相应地适用。例如，设想主体未患有心房颤动。进一步地，样品可以是例如血液、血清或血浆样品或组织样品。
以下优选地用作诊断算法：
大于参考的ESM-1的量指示经历过一次或多次无症状梗死的主体，且/或低于参考的ESM-1的量指示未经历过无症状梗死的主体。
上文给出的定义优选地比照适用于以下：
在本发明的研究中进行的研究表明，可以基于ESM-1的量的变化来监测主体。例如，可监测无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死程度以及白质病变程度，即小面积和大面积非皮质梗死或皮质梗死程度是否增加。由于无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死和白质病变程度的增加可能与认知功能的降低有关，生物标志物ESM-1的确定也将允许监测主体的认知功能。
因此，本发明进一步涉及一种用于监测主体的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的第一样品中的生物标志物ESM-1的量，
b)确定已在第一样品之后获得的来自主体的第二样品中的生物标志物ESM-1的量，
c)将第一样品中的生物标志物ESM-1的量与第二样品中的生物标志物ESM-1的量进行比较，以及
d)基于步骤c)的结果监测主体。
本发明还进一步涉及生物标志物ESM-1或与生物标志物ESM-1结合的药剂的体外用途，用于监测主体。在一些实施例中，生物标志物ESM-1或药剂用于来自主体的第一样品和第二样品中。
待监测的主体可以是结合用于预测无症状梗死和/或认知衰退的风险的方法定义的主体。例如，主体可以患有心房颤动。
优选地，监测主体的白质病变和/或无症状小面积和/或大面积非皮质或皮质梗死程度和/或认知功能。然而，还设想监测心肌心房、脑梗死、脑微量出血、心律失常进展、合并症(高血压或糖尿病)进展和/或抑郁症状进展的形态变化。可替代地，可以监测功能性脑组织的量。
监测应基于第一样品中的生物标志物ESM-1的量与第二样品中的生物标志物ESM-1的量的比较。“第二样品”被理解为为了反映与第一样品中的ESM-1的量相比，生物标志物ESM-1的量的变化而获得的样品。因此，应在第一样品之后获得第二样品。优选地，在第一样品之后不要太早获得第二样品(以便观察足够显著的变化以允许监测)。在一个实施例中，第二样品是在第一样品之后至少一个月获得的。在另一实施例中，第二样品是在第一样品之后一个月获得的。在另一实施例中，第二样品是在第一样品之后至少一年或两年获得的。进一步地，设想第二样品是在第一样品之后不超过15年、不超过10年、或者特别地不超过5年获得的。因此，第二样品可以在例如第一样品之后至少一个月，但不超过五年之后获得。
进一步地，设想主体在第一样品和第二样品之间表现出无症状梗死。术语“无症状梗死”已在上文中定义。
优选地，与第一样品相比，第二样品中的生物标志物ESM-1的增加的量，特别地显著增加的量，指示主体的无症状梗死LNCCI程度的增加和/或主体的认知功能的衰退。因此，在第一样品和第二样品之间，LNCCI程度增加且/或认知功能衰退。生物标志物ESM-1的显著增加的量应理解为大于一组对照主体的平均减少量的增加。在一些实施例中，生物标志物ESM-1的量的增加至少0.5％(例如每年)(诸如增加至少1％(例如每年))指示无症状梗死LNCCI程度的增加和/或认知功能的衰退。
上文给出的定义优选地比照适用于以下：
本发明进一步涉及一种用于诊断患有认知衰退的主体的认知衰退严重程度的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的生物标志物ESM-1的量，
b)将在步骤a)中确定的所述量与参考进行比较，以及
c)优选地，基于步骤c)的结果，诊断主体的认知衰退严重程度。
术语“主体”和“样品”已在上文中定义。这些定义相应地适用。例如，设想在获得样品时主体处于窦性心律。
脑血管损伤的诊断，诸如白质病变、无症状大面积非皮质或皮质梗死和/或临床无症状梗死(包括病变的大小、位置和类型)，现在使用通常耗时且昂贵的磁共振成像(MRI)进行。然而，ESM-1的确定将允许对脑MRI进行快速且具有成本效益的预选。
本发明的方法可以进一步包括对已被确定为有无症状梗死和/或认知衰退的风险、已被确定为有高度无症状小面积和/或大面积非皮质或皮质梗死和/或白质病变程度、已被确定为过去经历过一次或多次无症状梗死和/或已被诊断为患有AF的患者进行脑磁共振成像(MRI)，特别是用于评定脑血管损伤的MRI的步骤。
在本发明的第八方面，该方法涉及生物标志物ESM-1或与生物标志物ESM-1结合的药剂的体外用途，用于预测主体的无症状梗死和/或认知衰退。
本发明进一步涉及生物标志物ESM-1或与生物标志物ESM-1结合的药剂的体外用途，用于评定主体的无症状小面积和/或大面积非皮质或皮质梗死程度。
本发明进一步涉及生物标志物ESM-1或与生物标志物ESM-1结合的药剂的体外用途，用于评定主体的白质病变程度。
本发明进一步涉及生物标志物ESM-1或与生物标志物ESM-1结合的药剂的体外用途，用于评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死。
本发明进一步涉及生物标志物ESM-1或与生物标志物ESM-1结合的药剂的体外用途，用于提高主体的临床卒中风险评分的预测准确性。
优选地，上述用途是体外用途。因此，它们优选在从主体获得的样品中进行。此外，该检测剂优选为抗体，诸如单克隆抗体(或其抗原结合片段)，该抗体与生物标志物ESM-1特异性结合。
本发明方法也可以作为计算机实现的方法来实施。
在本发明的第九方面，该方法涉及一种用于预测主体的卒中和/或无症状梗死和/或认知衰退的计算机实现方法，所述方法包括
a)在处理单元处接收来自主体的样品中的生物标志物ESM-1的量的值，
b)用处理单元处理在步骤(a)中接收到的值，其中所述处理包括从存储器中检索生物标志物ESM-1的量的一个或多个阈值并将在步骤(a)中接收到的值与该一个或多个阈值进行比较，以及
c)经由输出装置提供对无症状梗死和/或认知衰退的预测，其中所述预测基于步骤(b)的结果。
本发明进一步涉及一种用于评定主体的无症状大面积非皮质或皮质梗死程度的计算机实现方法，所述方法包括，
a)在处理单元处接收来自主体的样品中的生物标志物ESM-1的量的值，
b)用处理单元处理在步骤(a)中接收到的值，其中所述处理包括从存储器中检索生物标志物ESM-1的量的一个或多个阈值并将在步骤(a)中接收到的值与该一个或多个阈值进行比较，以及
e)经由输出装置提供评定主体白质病变程度，其中所述评定基于步骤(b)的结果。
本发明进一步涉及一种用于评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死的计算机实现方法，所述方法包括
a)在处理单元处接收来自主体的样品中的生物标志物ESM-1的量的值，
b)用处理单元处理在步骤(a)中接收到的值，其中所述处理包括从存储器中检索生物标志物ESM-1的量的一个或多个阈值并将在步骤(a)中接收到的值与该一个或多个阈值进行比较，以及
c)经由输出装置提供评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死，其中所述评定基于步骤(b)的结果。
在本发明方法的一个实施例中，关于预测、评定或诊断的信息(根据本发明的计算机实现的方法的最后一步)经由显示器提供，其经配置用于呈现预测、评定或诊断。例如，可以提供主体是否有无症状梗死和/或认知衰退的风险的信息。进一步地，可以显示对合适治疗措施的建议。
在本发明方法的一个实施例中，该方法可以包括以下进一步的步骤：将本发明方法的关于评定的信息转移到主体的电子医疗记录。
可替代地，在本发明方法的最后一步中进行的评定可以通过打印机打印。打印输出应包含关于患者是否有风险的信息和/或合适的治疗措施的建议。
本发明进一步涉及包括计算机可执行指令的计算机程序，当该程序在计算机或计算机网络上执行时，这些计算机可执行指令用于执行根据本发明方法的步骤。通常，计算机程序具体地可以包含用于执行如本文所公开的方法的步骤的计算机可执行指令。具体地，计算机程序可以存储在计算机可读数据载体上。
本发明进一步涉及具有存储在机器可读载体上的程序代码工具的计算机程序产品，以便当该程序在计算机或计算机网络上执行时，执行根据本发明的计算机实现方法，诸如用于预测卒中和/或认知衰退的计算机实现方法，诸如在计算机程序的背景中讨论的上述步骤中的一个或多个步骤。如本文所用，计算机程序产品是指作为可交易产品的程序。该产品通常能够以任意格式(诸如以纸质格式)存在，或在计算机可读数据载体上存在。具体地讲，计算机程序产品可以分布在数据网络上。
本发明进一步涉及包括至少一个处理单元的计算机或计算机网络，其中该处理单元适于执行根据本发明的计算机实现方法的所有步骤。
然而，本发明还设想了：
-计算机或计算机网络，该计算机或计算机网络包括至少一个处理单元，其中所述处理单元适于执行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，
-计算机可加载数据结构，该计算机可加载数据结构适于当在计算机上执行该数据结构时，执行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，
-计算机脚本，其中该计算机程序适于当在计算机上执行该程序时，执行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，
-计算机程序，其包括程序工具，这些程序工具用于当在计算机上或在计算机网络上执行该计算机程序时，执行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，
-计算机程序，其包括根据前述实施例的程序工具，其中这些程序工具存储在计算机可读的存储介质上，
-存储介质，其中数据结构存储在该存储介质上并且其中该数据结构适于在被加载到计算机或计算机网络的主存储装置和/或工作存储装置之后，执行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，
-计算机程序产品，该计算机程序产品具有程序代码工具，其中这些程序代码工具可以存储或被存储在存储介质上，以用于在计算机上或在计算机网络上执行这些程序代码工具的情况下，执行根据本说明书中所述的实施例之一的方法，
-数据流信号，该数据流信号通常是加密的，包括如上文所指定的从个体获得的葡萄糖数据测量值，以及
-数据流信号，该数据流信号通常是加密的，其包括在通过本发明的方法获得的指导的评定中提供辅助的信息。
在另一些实施例中，本发明涉及以下方面：
在下文中，总结了本发明的实施例。上文给出的定义优选地适用于以下实施例。
1.一种用于评定主体的卒中的方法，其包括以下步骤
a)确定来自所述主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)将所述ESM-1的量与参考量进行比较，从而评定卒中。
2.一种用于评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，
b)将在步骤a)中确定的量与参考进行比较，以及
c)评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中大于所述参考的ESM-1的量指示患有卒中和/或无症状梗死的主体，且/或其中低于所述参考的ESM-1的量指示未患卒中和/或无症状梗死的主体。
4.一种用于预测主体的无症状梗死和/或认知衰退的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，
b)将在步骤a)中确定的量与参考进行比较，以及
c)预测主体的无症状梗死和/或认知衰退。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中将所述ESM-1的量的值与CHA2D2-VASc评分结合，从而提高无症状脑梗死和/或认知衰退的临床风险评分的所述预测准确性。
6.一种用于提高主体的无症状梗死和/或认知衰退的临床风险评分的预测准确性的方法，其包括以下步骤
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)将ESM-1的量的值与无症状脑梗死的临床风险评分结合，从而提高无症状脑梗死的临床风险评分的预测准确性。
7.根据权利要求6所述的方法，其中预测在1个月至5年内，诸如在1年内或在2年内，所述主体患主体的无症状梗死和/或认知衰退的风险。
8.一种用于评定主体的无症状小面积和大面积非皮质和皮质梗死程度的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)基于在步骤a)中确定的所述量来评定主体的无症状大面积非皮质或皮质梗死程度。
9.一种用于评定主体的白质病变程度的方法，所述方法包括
a)确定来自主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)基于在步骤a)中确定的量来评定主体的白质病变程度。
10.根据实施例1或9中任一项所述的方法，其中所述主体患有心房颤动。
11.根据实施例1或10中任一项所述的方法，其中所述心房颤动是阵发性或持续性心房颤动。
12.根据实施例1或11中任一项所述的方法，其中所述主体为人，且/或其中所述样品优选地为血液、血清或血浆，或其中所述样品为组织样品。
13.根据实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述生物标志物ESM-1为ESM-1多肽。
14.根据实施例1至13中任一项所述的方法，其中所述主体为65岁或更高。
15.根据实施例1至14中任一项所述的方法，其中所述主体有脑卒中和/或TIA(短暂性脑缺血发作)病史。
16.根据实施例1至15所述的方法，其中所述主体在获得所述样品时处于窦性心律。
17.一种用于监测主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死和/或白质病变程度和/或认知功能的方法，其包括
a)确定来自主体的第一样品中的ESM-1的量，
b)确定已在第一样品之后获得的来自主体的第二样品中的ESM-1的量，
c)将第一样品中的ESM-1的量与第二样品中的ESM-1的量进行比较，以及
d)基于步骤c)的结果来监测主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死程度和/或认知功能和/或认知功能。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤
e)建议抗凝疗法，
f)建议强化抗凝疗法，
g)强化风险因素管理，以及
h)在专科诊所进行护理。
19.一种用于预测主体的卒中和/或无症状梗死和/或认知衰退的计算机实现方法，所述方法包括
a)在处理单元处接收来自所述主体的样品中的ESM-1的量的值，
b)用所述处理单元处理在步骤(a)中接收到的所述值，其中所述处理包括从存储器中检索所述ESM-1的量的一个或多个阈值并将在步骤(a)中接收到的所述值与所述一个或多个阈值进行比较，以及
a)经由输出装置提供对无症状梗死和/或认知衰退的预测，其中所述预测基于步骤(b)的结果。
20.根据权利要求19中任一项所述的计算机实现方法，其中所述方法包括添加另外的CHA2D2-VASc评分的值以在步骤a)中在处理单元处接收。
21.ESM-1或与ESM-1结合的药剂用于以下的体外用途：
a)预测主体的无症状梗死和/或认知衰退，
b)评定主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死和/或白质病变程度，或
c)提高主体的临床卒中风险评分的预测准确性。
22.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，或根据权利要求14所述的体外用途，其中
I.ESM-1为ESM-1多肽，
II.所述主体为人，
III.所述主体为65岁或更高年龄，且/或
IV.所述主体没有已知的卒中和/或TIA(短暂性脑缺血发作)病史。
23.生物标志物ESM-1或与所述生物标志物ESM-1结合的药剂的体外用途，用于评定主体是否经历过一次或多次无症状卒中。
24.生物标志物ESM-1或与所述生物标志物ESM-1结合的药剂的体外用途，用于提高主体的临床卒中风险评分的预测准确性。
本说明书中引用的所有参考文献的全部公开内容和在本说明书中特别提及的公开内容均以引用方式并入本文。
实例
实例1：基于循环ESM-1水平预测无症状脑梗死(LNCCI和SNCI)
ESM-1在评定无症状脑梗死中提供了一种用于以下各项的方法
1.基于血清/血浆中循环ESM-1水平来预测心房颤动患者的无症状脑梗死的风险(SWISSAF研究，表1+2)
2.基于血清/血浆中循环ESM-1水平(例如CHA2DS2-VASc、CHADS2评分)来提高无症状脑梗死的临床卒中风险评分的临床预测准确性(SWISS AF研究，表3)
在SWISS AF研究中评定ESM-1预测无症状梗死发生风险的能力(Conen D.，ForumMed Suisse 2012；12：860-862；Conen等人Swiss Med Wkly.2017；147)。SWISS AF群组的患者中位年龄为74岁，既往临床脑卒中或TIA发生率为20％，血管疾病发生率为34％，糖尿病史为17％。
为了检测ESM-1(内皮细胞特异性分子1)，为cobas
Figure BPA0000334591220000411
ECLIA平台(高通量
Figure BPA0000334591220000412
免疫测定；Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)开发了一种夹心免疫测定。
在完整的SWISS AF研究中使用这种商业前ESM-1测定测量了ESM-1。
因为来自关于病例对照群组的单纯成比例危险模型的估计将存在偏差(由于病例与对照的变化比例)，所以使用了加权成比例危险模型。权重基于为病例对照群组选择的每个患者的逆概率。为了获得基于二分基线ESM-1测量(＜＝中位数对＞中位数)的两组中绝对生存率的估计，创建了Kaplan-Meier曲线的加权形式。
结果
表1：脑损伤患者的ESM-1循环水平显著改变(SWISS AF研究)。脑损伤包括LNCCI和SNCI。值是平均值(标准差)、中值(四分位距)或n(％)。
Figure BPA0000334591220000413
Figure BPA0000334591220000421
bMRI显示LNCCI或SNCI的患者年龄较大(75.0对68.1岁，p＜0.0001)，永久性AF的发生率更高(28.4％对17.8％，p＝0.0002)，收缩压水平较高(136.7对131.3mmHg，p＜0.0001)以及CHA2DS2-VASc评分更高(3.2对2.1分，p＜0.0001)，但口服抗凝率无差异(90.3对88.5％，p＝0.32)。如表1所示，脑损伤患者的ESM-1水平显著升高。
如表1所示，可以基于血清/血浆中的循环ESM-1水平来评定心房颤动患者的无症状脑梗死的风险。
表2：显著的多变量调整风险比(HR)(95％置信区间(CI)与无症状梗死相关的ESM-1
Figure BPA0000334591220000422
模型1针对年龄和性别进行了调整。
模型2还针对收缩压、既往大出血、动脉高压、糖尿病、冠状动脉疾病、外周血管疾病、BMI、吸烟状况、口服抗凝剂和抗血小板药物的使用进行了额外调整。
将生物标志物和体积进行对数化。
如表2所示，在对年龄和性别(模型1)或年龄、性别、收缩压、既往大出血、动脉高压、糖尿病、冠状动脉疾病、外周血管疾病、BMI、吸烟状况、口服抗凝剂和抗血小板药物的使用进行多变量调整后，ESM-1与LNCCI显著相关。
因此，可以根据血清/血浆中的循环ESM-1水平评定心房颤动患者发生无症状脑梗死的风险。
表3：ESM-1显著改善与大面积非皮质梗死相关的CHAD2DS2-VASc评分。
除了CHADS2-VA2SC评分之外，预测变量是对数化的生物标志物，结果变量是存在/不存在大面积非皮质和皮质梗死。
Figure BPA0000334591220000431
当我们将单个生物标志物添加到CHA2DS2-VASc评分时，AUC(95％CI)提高了ESM-1(0.638(0.594；0.682)p＝0.02)，如表3所示。
ESM-1与CHA2DS2-VASC评分的临床参数相结合，可以很好地预测临床无症状脑梗死，并且优于CHA2DS2-VASc评分。早期临床鉴定有认知能力下降风险的患者可以允许采取更好的诊断和预防措施。
这些数据表明，ESM-1可以用于评定无症状梗死的风险、分类疾病、评定疾病严重程度、指导治疗(旨在强化/减少治疗)、预测疾病结果(风险预测，例如卒中)、治疗监测(例如抗凝药物对ESM-1水平的影响)、治疗分层(选择治疗方案；例如来自SWISS AF的长期治疗和选择)。
实例2：基于循环ESM-1水平来预测白质病变(WML)
SWISS-AF数据中的数据示出了ESM-1与患者的白质病变(WML)的存在相关。
白质病变程度可通过Fazekas评分来表示(Fazekas、JB Chawluk、A Alavi、HIHurtig和RA Zimmerman American Journal of Roentgenology 1987 149：2，351-356)。Fazekas评分范围为0到3。0表示无WML，1表示轻度WML，2表示中度WML，3表示重度WML。为了比较ESM-1与WML患者的关联，将患者分为两组，Fazekas评分＜2(否)与Fazekas评分≥2(是)。图1显示，中度或重度WML患者与轻度或无WML患者相比，ESM-1增加。
WML程度可由临床无症状卒中引起(Wang Y，Liu G，Hong D，Chen F，Ji X，CaoG.White matter injury in ischemic stroke.Prog Neurobiol.2016；141：45-60.doi：10.1016/j.pneurobio.2016.04.005)。这进一步证明了ESM-1在预测临床卒中的风险方面的有用性。
循环ESM-1区分Fazekas评分＜2(否)与Fazekas评分≥2(是)的患者的能力由0.60的AUC表示。痴呆患者脑中的白质变化。高龄和WML评分的变化已被描述为与阿尔茨海默病患者痴呆的严重程度有关(Kao等人，2019年)。
年龄也是临床脑卒中的重要预测因子。因此，循环中ESM-1水平显著增加的数据不仅表明中度或重度WML，而且表明与年龄相关的脑部疾病，例如血管性痴呆，这是合理的。

Claims (16)

1.一种用于评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死的方法，所述方法包括
a)确定来自所述主体的样品中的ESM-1的量，
b)将在步骤a)中确定的所述量与参考进行比较，以及
c)评定主体是否经历过一次或多次无症状梗死。
2.根据权利要求1所述的方法，其中大于所述参考的ESM-1的量指示患有一次或多次无症状梗死的主体，其中低于所述参考的ESM-1的量指示未患一次或多次无症状梗死的主体。
3.一种用于预测主体的无症状梗死和/或认知衰退的方法，所述方法包括
a)确定来自所述主体的样品中的ESM-1的量，
b)将在步骤a)中确定的所述量与参考进行比较，以及
c)预测主体的无症状梗死和/或认知衰退。
4.一种用于提高主体的无症状梗死和/或认知衰退的临床风险评分的预测准确性的方法，其包括以下步骤
a)确定来自所述主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)将所述ESM-1的量的值与无症状脑梗死的临床风险评分结合，从而提高所述无症状脑梗死的临床风险评分的所述预测准确性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述ESM-1的量的值与CHA2D2-VASc评分结合，从而提高无症状脑梗死和/或认知衰退的临床风险评分的所述预测准确性。
6.根据权利要求3至5所述的方法，其中预测在1个月至5年内，诸如在1年内或在2年内，所述主体患主体的无症状梗死和/或认知衰退的风险。
7.一种用于评定主体的无症状小面积和大面积非皮质和皮质梗死程度的方法，所述方法包括
a)确定来自所述主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)基于在步骤a)中确定的所述量来评定主体的无症状大面积非皮质或皮质梗死程度。
8.一种用于评定主体的白质病变程度的方法，所述方法包括
a)确定来自所述主体的样品中的ESM-1的量，以及
b)基于在步骤a)中确定的所述量来评定主体的所述白质病变程度。
9.一种用于监测主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死和/或白质病变程度和/或认知功能的方法，其包括
a)确定来自所述主体的第一样品中的ESM-1的量，
b)确定已在所述第一样品之后获得的来自所述主体的第二样品中的ESM-1的量，
c)将所述第一样品中的所述ESM-1的量与所述第二样品中的所述ESM-1的量进行比较，以及
d)基于步骤c)的结果来监测所述主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死程度和/或所述认知功能和/或所述认知功能。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤
a)建议抗凝疗法，
b)建议强化抗凝疗法，
c)强化风险因素管理，以及
d)在专科诊所进行护理。
11.根据权利要求1或10中任一项所述的方法，其中所述主体患有心房颤动。
12.根据权利要求1或11中任一项所述的方法，其中所述主体为人，且/或其中所述样品优选地为血液、血清或血浆，或其中所述样品为组织样品。
13.一种用于预测主体的无症状梗死和/或认知衰退的计算机实现方法，所述方法包括
a)在处理单元处接收来自所述主体的样品中的ESM-1的量的值，
b)用所述处理单元处理在步骤(a)中接收到的所述值，其中所述处理包括从存储器中检索所述ESM-1的量的一个或多个阈值并将在步骤(a)中接收到的所述值与所述一个或多个阈值进行比较，以及
c)经由输出装置提供对无症状梗死和/或认知衰退的预测，其中所述预测基于步骤(b)的结果。
14.根据权利要求13中任一项所述的计算机实现方法，其中所述方法包括添加另外的CHA2D2-VASc评分的值以在步骤a)中在处理单元处接收。
15.ESM-1或与ESM-1结合的药剂用于以下的体外用途：
a)预测主体的无症状梗死和/或认知衰退，
b)评定主体的无症状小面积和大面积非皮质或皮质梗死和/或白质病变程度，或
c)提高主体的临床卒中风险评分的预测准确性。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，或根据权利要求15所述的体外用途，其中
I.ESM-1为ESM-1多肽，
II.所述主体为人，
III.所述主体为65岁或更高年龄，且/或
IV.所述主体没有已知的卒中和/或TIA(短暂性脑缺血发作)病史。
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