CN109328303B - 用于预测心房纤颤的复发的循环血管生成素-2 (Ang-2) - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于测定来自主体的样品中生物标志物血管生成素‑2(Ang‑2)的量和任选至少一种另外的生物标志物的量来预测主体中的心房纤颤复发的风险的方法。本发明还考虑基于测定来自主体的样品中生物标志物血管生成素‑2(Ang‑2)的量和任选至少一种另外的生物标志物的量来诊断怀疑患有心房纤颤的主体中的心房纤颤的方法。进一步设想的是适于实施本发明的方法的装置。

Description

用于预测心房纤颤的复发的循环血管生成素-2 (Ang-2)
本发明涉及基于测定来自主体的样品中生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和任选至少一种另外的生物标志物的量来预测主体中的心房纤颤复发的风险的方法。本发明还考虑基于测定来自主体的样品中生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和任选至少一种另外的生物标志物的量来诊断怀疑患有心房纤颤的主体中的心房纤颤的方法。还设想的是适于实施本发明的方法的装置。
心房纤颤(AF)是最常见类型的心律失常，并且是老年人群中最普遍的病况之一。心房纤颤的特征在于心脏跳动不规律，并且经常始于短暂时段的异常搏动，所述异常搏动可随时间增加，并可能成为永久性病况。据估计，美国270-610万人患有心房纤颤，且全球约3300万人患有心房纤颤(Chugh SS.等人, Circulation 2014;129:837-47)。与处于窦性心律的患者相比，具有AF的患者具有较高中风率，且处于较高的发展充血性心力衰竭的风险中。
血管生成素是参与血管生成的糖蛋白。因为它们也在健康组织中表达，所以它们应该稳定现有血管并调节内皮细胞和周围血管平滑肌细胞之间的相互作用(Wong AL,等人Circ Res. 1997; 81:567-74)。已知四种血管生成素，血管生成素-1(Ang-1)至血管生成素-4(Ang-4)。人血管生成素-2(Ang-2)例如描述于Maisonpierre PC等人 (Science 277(1997) 55-60和Cheung, A. H.,等人, Genomics 48 (1998) 389-91)并且是血管生成素家族的四个成员之一。Ang-2被发现为Ties(在血管内皮中选择性表达的酪氨酸激酶家族)的配体(Yancopoulos, G. D., 等人, Nature 407 (2000) 242-48)。
尽管Ang-1是内皮细胞特异性Tie2受体酪氨酸激酶的激动剂并具有促血管生成特性，但发现Ang-2破坏血管形成并通过Tie-2受体具有拮抗信号传导作用(Maisonpierre PC等人, Science 1997;277:55-60)。
已知血管生成素-2(Ang-2)损害内皮完整性并且已经显示在心力衰竭中升高(参见例如Poss等人 Angiopoietin-2 and outcome in patients with acutedecompensated heart failure. Clin Res Cardiol. May 2015;104(5):380-387, 或Lukasz等人 Angiopoietin-2 in adults with congenital heart disease and heartfailure. PLoS One. 2013;8(6):e66861)。
已发现Ang-2在具有慢性(永久性)心房纤颤的患者中升高(Freestone等人,Angiogenic factors in Atrial Fibrillation: a possible role in thrombogenesis
Figure 285946DEST_PATH_IMAGE002
Ann Med 2005; 37: 365–72或Choudhury等人, Relationship of Soluble CD40 Ligandto Vascular Endothelial Growth Factor, Angiopoietins, and Tissue Factor inAtrial Fibrillation, CHEST 2007; 132:1913–1919)，而这两项研究中未发现Ang-1受心房纤颤的影响。在临床上很难理解从阵发性和持续性至永久性心房纤颤进展的进展速率和风险因素(Kerr CR等人, Am Heart J. 2005;149:489-496)。
Latini (J Intern Med. 2011 Feb;269(2):160-71)公开了一种基于在具有AF病史的患者中检测NTproANP、hsTnT或NTproBNP来预测心房纤颤复发的方法。
Masson (Cardiovasc Drugs Ther 2015; 29:551)公开了心脏生物标志物相比于GISSI AF生物标志物子研究的样品中各种分析的血管活性或炎性生物标志物用于预测复发性心房纤颤的有益用途。结论是，与显示当AF正在进行时相同变量的预期改变相比，通过超声心动图和循环生物标志物的测定来预测处于窦性心律的患者中AF复发的风险是完全不同的并且挑战性高得多的任务。
Masson (Heart 2010; 96: 1909-1914)公开了基于炎性标志物诸如IL-6的测定预测心房纤颤的复发。炎性标志物会增加，但却是AF首次复发的弱预测因子。
WO2014/072500公开了用于诊断主体中最近的阵发性心房纤颤的手段和方法，其包括测定来自主体的样品中至少一种选自例如心肌肌钙蛋白、BNP型肽和IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和白介素-6(IL-6)的标志物的量。
到目前为止，仅观察到血管生成素-2与永久性心房纤颤有关。然而，与显示当AF正在进行时相同变量的预期改变相比，通过超声心动图和/或循环生物标志物的测定来预测目前处于窦性心律的患者中AF复发的风险是完全不同的并且挑战性高得多的任务(Masson等人 Cardiovasc Drugs Ther (2015) 29:551)。血管生成素-2尚未用于预测已经具有心房纤颤和大多数阵发性AF的患者中心房纤颤的复发。然而，预测心房纤颤的复发、适当选择预防性药物和预测疗法成功是重要的临床上未满足的需求。有利地，在作为本发明基础的研究中已经显示单独或与至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)和IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物组合的血管生成素-2允许可靠地预测心房纤颤的复发(参见实施例)。由于本发明的发现，可以根据风险鉴定和治疗患者。
因此，本发明涉及预测主体中的心房纤颤复发的风险的方法，其包括测定来自主体的样品中的生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量。
在本发明的方法的一个优选实施方案中，所述方法还包括将测定的一种生物标志物(多种生物标志物)的量与一种参考量(或多种参考量)进行比较的步骤。
因此，本发明具体涉及预测主体中的心房纤颤复发的风险的方法，所述方法包括以下步骤
(a) 测定来自主体的样品中的生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量，和
(b) 将如步骤(a)中所测定的一种生物标志物(多种生物标志物)的量与一种参考量(或多种参考量)进行比较。
优选地，心房纤颤的复发的预测基于比较步骤(b)的结果。因此，本发明的方法可以包括基于步骤(b)的结果预测主体中心房纤颤复发的风险的另外步骤(c)。
如根据本发明所提及的方法包括基本上由前述步骤组成的方法或包括另外步骤的方法。此外，本发明的方法优选地是离体(ex vivo)或体外方法。而且，它还可以包括除了上文明确提及的那些以外的步骤。例如，其他步骤可以涉及测定另外的标志物和/或样品预处理或评估由所述方法获得的结果。本发明的方法也可用于主体的监测、证实和子分类。所述方法可以手动或由自动化辅助实施。优选地，步骤(a)、(b)和/或(c)可以全部或部分由自动化辅助，例如，通过用于步骤(a)中测定的合适的机器人和传感设备或者步骤(b)中的计算机执行的计算。
术语“心房纤颤”是本领域众所周知的。如本文所用，该术语优选是指室上性心动过速，其特征在于不协调的心房激动，随后心房机械功能的恶化。具体而言，该术语是指特征在于快速和不规则搏动的异常心律。其涉及心脏的两个上腔室。在正常的心律中，由窦房结产生的脉冲通过心脏传播并引起心肌收缩和血液泵送。在心房纤颤中，窦房结的常规电脉冲被紊乱的快速电脉冲所替代，其导致不规则的心跳。心房纤颤的症状是心悸、昏厥、呼吸短促或胸痛。但是，大多数发作没有症状。在心电图上，心房纤颤的特征在于一致性的P波被在振幅、形状和时机上不同的快速振荡或颤动波所替代，当房室传导完好时，所述快速振荡或颤动波与不规则的、频繁快速的心室反应相关。
American College of Cardiology (ACC)、American Heart Association (AHA)和European Society of Cardiology (ESC)提出以下分类系统(参见Fuster (2006)Circulation 114 (7): e257–354 其因此以其整体通过引用并入，参见例如文件中的图3)：首先检测到的AF、阵发性AF、持续性AF和永久性AF。
所有具有AF的患者最初在被称为首次检测到的AF的类别中。然而，所述主体可能具有或可能没有先前未检测到的发作。如果AF已经持续超过一年，则主体患有永久性AF。具体而言，不会发生转变回窦性心律(或仅在用医疗干预的情况下)。如果AF持续超过7天，则主体患有持续性AF。主体可能需要药理学或电子干预来终止心房纤颤。因此，持续性AF在发作中发生，但心律失常通常不会自发地(即在没有医学干预的情况下)转变回窦性心律。阵发性心房纤颤优选地是指心房纤颤的间歇性发作，其持续不超过7天并且自发地(即在没有医学干预的情况下)终止。在阵发性AF的大多数情况下，发作持续少于24小时。因此，虽然阵发性心房纤颤自发地终止，但持续性心房纤颤不会自发地终止，且需要电复律或药物复律用于终止，或需要其他程序，诸如消融术(Fuster (2006) Circulation 114 (7): e257–354)。
在本发明的一个优选实施方案中，术语“阵发性心房纤颤”被定义为AF的发作，其在少于48小时内、更优选在少于24小时内、且最优选在少于12小时内自发地终止。持续性和阵发性AF两者均可以是复发的。
根据该方法，应当预测心房纤颤的复发的风险。因此，应当理解，待测试的主体是在进行本发明的方法之前患有心房纤颤的主体。因此，主体先前应当已经历心房纤颤的发作。因此，所述主体优选患有心房纤颤，特别是患有持续性或阵发性心房纤颤。优选地，患有心房纤颤的主体在获得测试样品之前的6个月内，更优选地一个月内、甚至更优选地14天内且最优选地七天内具有一次或多次心房纤颤的发作。然而，所述主体优选地在获得待测试的样品时没有心房纤维的发作。因此，所述主体在此时优选地具有正常的窦性心律。优选地，所述主体在从主体获得测试样品之前48小时内未经历心房纤颤的发作。因此，设想心房纤颤的最后发作在获得测试样品之前至少48小时终止(在有或没有医学干预的情况下)。
优选地，待根据本发明的方法测试的主体不患有永久性心房纤颤。
在优选实施方案中，应当检测心房纤颤的先前发作中的至少一些。因此，设想待测试的主体具有已知的心房纤颤史。
在一个优选实施方案中，所述主体具有阵发性心房纤颤。优选地，所述具有阵发性心房纤颤的主体在获得待测试的样品之前的6个月内，更优选地一个月内、甚至更优选地14天内且最优选地七天内具有一次或多次心房纤颤的发作。所述一次或多次心房纤颤的发作，优选地自发终止，即在没有医学干预的情况下。优选地，最后一次发作在获得待测试的样品之前至少48小时自发终止。
在另一个优选实施方案中，所述主体具有持续性心房纤颤。优选地，心房纤颤的先前发作中的一次或多次没有自发终止。因此，设想主体已经进行了复律，即成功的复律。具体而言，设想主体在已经获得待测试的样品之前14天内(例如，在已经获得样品之前7天内)已经进行了复律。应当进行所述复律以终止最后诊断的心房纤颤的发作。复律是一种医疗程序，通过所述医疗程序将心律失常转变为正常节律。这可以通过电复律或用抗心律失常剂的复律来实现。优选地，所述复律已经在获得测试样品之前至少48小时进行。
根据本发明，考虑当获得样品时主体没有经历心房纤颤的发作。因此，当获得样品时，主体应当具有正常窦性心律。
如本文提及的“主体”优选为哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴)，兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。优选地，所述主体是人主体。
根据本发明的方法，应当预测心房纤颤复发的风险，并因此预测主体患有复发性心房纤颤的风险。优选地，在实施本发明的方法之后约三个月内、约六个月内或约一年内(或者更精确地说在已经获得样品之后)AF复发的风险。在一个优选实施方案中，预测在约一年内心房纤颤复发的风险。
优选地，如本文所用的术语“约”涵盖相对于具体值、量、浓度、水平等的+和 - 20%的范围，例如，“约100”的值的指示意指涵盖100+/−20%的数值范围的值，即80至120的值范围。优选地，该术语涵盖相对于具体值、量、浓度、水平等的+和-10%的范围，并且，更优选地，相对于具体值、量、浓度、水平等的+和-5%的范围。最优选地，术语“约”是指确切的值、量、浓度、水平等。
优选地，如本文所用的术语“预测风险”是指评价主体将患有心房纤颤的复发的概率。通常，预测主体是否处于心房纤颤复发的风险中(并且因此风险升高)或者不处于心房纤颤复发的风险中(并且因此风险降低)。因此，本发明的方法允许区分处于心房纤颤的风险中的主体和不处于心房纤颤的风险中的主体。优选地，术语“预测风险”还涵盖帮助预测风险，诸如帮助医师预测风险。
如上所述，应当预测在特定时间窗口内心房纤颤复发的风险/概率。在本发明的一个优选实施方案中，所述预测窗口是约三个月、约六个月或约一年的间隔。优选地，从完成本发明的方法起计算所述预测窗口。更优选地，从已经获得待测试的样品的时间点计算所述预测窗口。如本领域技术人员将理解，风险的预测通常不意在对100%的主体是正确的。然而，该术语可以要求可以以适当和正确的方式预测统计学显著部分的主体。一部分是否是统计学显著的可以通过本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具例如置信区间的确定、p-值确定、Student氏t-检验、Mann-Whitney检验等来确定而无需费力。详述可见Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。优选的置信区间是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。优选地，p-值是0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
在一个优选实施方案中，表述“预测心房纤颤复发的风险”意味着将待通过本发明的方法分析的主体分配至处于心房纤颤复发的风险中的主体组中，或者分配至不处于心房纤颤复发的风险中的主体组中。因此，预测主体处于心房纤颤复发的风险中或不处于心房纤颤复发的风险中。如本文所用，“处于心房纤颤复发的风险中的主体”，优选具有升高的心房纤颤复发的风险(优选在预测窗口内)。优选地，与主体的组群中的平均风险相比，所述风险升高。如本文所用，“不处于心房纤颤复发的风险中的主体”，优选具有降低的心房纤颤复发的风险(优选在预测窗口内)。优选地，与主体的组群中的平均风险相比，所述风险降低。处于心房纤颤复发的风险中的主体优选具有至少20％或更优选至少30％的复发风险，优选地，在约一年的预测窗口内。最优选地，对于生物标志物的基线浓度的1 SD的增量，主体具有> 1.1的危险比，优选地，在约一年的预测窗口内。不处于心房纤颤复发的风险中的主体优选具有低于12％、更优选低于10%的AF复发的风险，优选地在一年的预测窗口内。在一个替代实施方案中，对于生物标志物的基线浓度的1 SD的增量，所述主体具有≤1的危险比，优选地，在约一年的预测窗口内。
术语“样品”是指体液的样品、分离的细胞的样品或来自组织或器官的样品。体液的样品可以通过众所周知的技术获得，且包括血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、痰液、腹水或任何其他身体分泌液或其衍生物的样品。组织或器官样品可以通过例如活检获得自任何组织或器官。分离的细胞可以通过分离技术诸如离心或细胞分选获得自体液或组织或器官。例如，细胞、组织或器官样品可以获得自表达或产生生物标志物的那些细胞、组织或器官。所述样品可以是冷冻的，新鲜的，固定的(例如福尔马林固定的)，离心的，和/或包埋的(例如石蜡包埋的)等。在评价样品中的生物标志物的量之前，当然可以对所述细胞样品实施各种众所周知的收集后制备和储存技术(例如，核酸和/或蛋白提取、固定、储存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述样品是血液(即全血)、血清或血浆样品。血清是允许血液凝固后获得的全血的液体级分。为了获得血清，通过离心除去凝块并收集上清液。血浆是血液的无细胞流体部分。为了获得血浆样品，将全血收集在抗凝剂处理的管中(例如柠檬酸盐处理的管或EDTA处理的管)。通过离心从样品中除去细胞，并且得到上清液(即血浆样品)。
生物标志物血管生成素-2(缩写为“Ang-2”，通常也称为ANGPT2)是本领域众所周知的。其为Ang-1 ()和TIE2两者的天然存在的拮抗剂(参见例如Maisonpierre等人,Science 277 (1997) 55-60)。在ANG-1不存在的情况下，该蛋白可以诱导TEK/TIE2的酪氨酸磷酸化。在血管生成诱导物(诸如VEGF)不存在的情况下，ANG2介导的细胞-基质接触的松弛可以诱导内皮细胞凋亡与随后的血管退化。与VEGF一致，其可以促进内皮细胞迁移和增殖，因此充当容许性血管生成信号。人血管生成素的序列是本领域众所周知的。Uniprot列出血管生成素-2的三种同工型：同工型1(Uniprot标识符：O15123-1)、同工型2(标识符：O15123-2)和同工型3 (O15123-3)。在一个优选实施方案中，测定血管生成素-2的总量。总量优选为复合和游离血管生成素-2的量的总和。
在本发明的方法的一个优选实施方案中，所述方法进一步包括测定来自主体的样品中(具体而言在所述样品中)的至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量。
前一段提及的另外的生物标志物是本领域众所周知的。
生物标志物血管生成素1 (Ang-1)是由ANGPT1基因编码的血管生成素。人Ang-1的序列是本领域众所周知的，并且例如可以经由UniProt(数据库条目Q15389)进行评价。
脑钠肽型肽(本文也称为“BNP型肽”)优选地选自前proBNP、proBNP、NT-proBNP和BNP。前肽原(pre-pro peptide)(在前proBNP的情况下为134个氨基酸)包含短信号肽，其被酶促切割以释放前肽(在proBNP的情况下为108个氨基酸)。前肽进一步切割为N末端前肽(NT-前肽，在NT-proBNP的情况下为76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况下为32个氨基酸)。优选地，根据本发明的BNP型肽是BNP，或具体是NT-proBNP。BNP是活性激素，并且具有比其各自的无活性对应物NT-proBNP更短的半衰期。
IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)是已知由内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞分泌的30-kDa的模块糖蛋白(Ono, Y., 等人, Biochem Biophys ResComm 202 (1994) 1490-1496)。优选地，术语“IGFBP-7”是指人IGFBP-7。该蛋白的序列在本领域中是众所周知的，并且例如，可经由Uni-Prot (Q16270, IBP7_HUMAN)或经由GenBank(NP_001240764.1)访问。生物标志物IGFBP-7的详细定义例如在WO 2008/089994中提供，其以其整体通过引用并入本文。存在两种IGFBP-7同工型，同工型1和2，其通过可变剪接产生。在本发明的一个实施方案中，测量两种同工型的总量(对于序列，参见UniProt数据库条目(Q 16270-1和Q 16270-2)。
生物标志物“CK-MB”(肌肉-脑型肌酸激酶，也称为“肌酸激酶-MB”或“CPK-MB”)是本领域众所周知的。其为肌酸激酶(CK)的三种同工酶之一，所述肌酸激酶(CK)为由各种组织和细胞类型表达的酶(EC 2.7.3.2)。该酶催化肌酸的转化，并使用三磷酸腺苷来生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷。肌酸激酶包含两个亚基，其可以是脑型(B)或肌肉型(M)亚基。同工酶CK-MB包含脑型和肌肉型亚基。CK-MB的主要来源是心肌。然而，其也发现于骨骼肌中。
术语“心肌肌钙蛋白”是指在心脏的细胞和优选心内膜下细胞中表达的所有肌钙蛋白同工型。这些同工型在本领域中得到充分表征，如描述于例如Anderson 1995,Circulation Research, vol. 76, no. 4: 681-686和Ferrieres 1998, ClinicalChemistry, 44: 487-493。优选地，心肌肌钙蛋白是指肌钙蛋白T或肌钙蛋白I，且更优选地，是指肌钙蛋白T。该术语不涵盖肌钙蛋白C。人肌钙蛋白T和人肌钙蛋白I的氨基酸序列公开于Anderson, Circ Res. 1995 Apr;76(4):681-6和Ferrieres 1998, ClinicalChemistry, 44: 487-493。
本发明还考虑测定与至少一种额外生物标志物组合的Ang-2的量。在一个实施方案中，额外生物标志物是Ang-1。在另一个实施方案中，所述至少一种额外生物标志物是心脏生物标志物，诸如BNP型肽和/或心肌肌钙蛋白。心脏生物标志物的额外测定允许增加本发明的预测或诊断的特异性。此外，Ang-1的额外测定有助于增加灵敏度。通过形成相对作用和表达的生物标志物的比率(例如，Ang-1/Ang-2)来增加灵敏度。
可以根据本发明的方法和用途测定的生物标志物的优选组合如下：
• Ang-2和BNP型肽，具体是NT-proBNP，
• Ang-2和心肌肌钙蛋白，具体是cTnT-hs(肌钙蛋白T高灵敏性)，
• Ang-2和Ang-1，或
• Ang-2，心肌肌钙蛋白诸如cTnT，BNP型肽，具体是NT-proBNP。
进一步优选的组合是Ang-2、Ang-1和BNP型肽诸如NT-proBNP。因此，测定前述量。此外，设想计算Ang-2的量与Ang-1的量的比率，并将计算的比率与参考比率进行比较。将BNP型肽的量与参考量进行比较。
在本发明的方法的一个优选实施方案中，待测定的另外的生物标志物是Ang-1。因此，设想生物标志物血管生成素-2 (Ang-2)的量和生物标志物血管生成素-1 (Ang-1)的量的组合测定。在进一步步骤中，将测定的Ang-2和Ang-1的量与参考量进行比较。或者，设想计算血管生成素-2的量与血管生成素-1的量的比率。在随后的步骤中，将所述比率与参考比率进行比较。
因此，本发明还涉及预测主体中的心房纤颤复发的风险的方法，所述方法包括以下步骤
(a) 测定来自主体的样品中生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和生物标志物血管生成素-1(Ang-1)的量，和
(b) 计算血管生成素-2的量和血管生成素-1的量的比率，和
(c) 将计算的比率与参考比率进行比较。
心房纤颤的复发的预测应当基于比较步骤(c)的结果。因此，所述方法可以包括基于步骤(c)的结果预测主体中心房纤颤的复发的风险的另外步骤(d)。
如本文提及的术语“计算比率”涉及通过除以所述量或通过进行任何其他相当的数学计算(其将Ang-2的量对Ang-1的量建立关系)来计算Ang-2的量和Ang-1的量的比率。在一个优选实施方案中，将Ang-2的量除以Ang-1的量以计算比率(因此，计算Ang-2的量与Ang-1的量的比率)。在另一个优选实施方案中，将Ang-1的量除以Ang-2的量以计算比率(因此，计算Ang-1的量与Ang-2的量的比率)。
术语“测定”如本文所提及的生物标志物的量是指，采用本文别处所述的适当的检测方法，定量生物标志物，例如测量样品中的生物标志物的水平。术语“测量”和“测定”在本文中可互换使用。
在一个实施方案中，所述生物标志物的量通过以下测量：使样品与特异性结合生物标志物的试剂接触，由此形成试剂和所述生物标志物之间的复合物，检测形成的复合物的量，且由此测量所述生物标志物的量。
如本文所提及的生物标志物可以使用本领域中通常已知的方法检测。检测的方法通常涵盖定量样品中的生物标志物的量的方法(定量方法)。技术人员通常已知以下方法中的何种适合于定性和/或定量检测生物标志物。可以方便地使用商业可得的Westerns和免疫测定，如ELISA、RIA、基于荧光和基于发光的免疫测定法，测定样品的例如蛋白。检测生物标志物的进一步合适的方法包括测量对于肽或多肽特异性的物理或化学特性，诸如其精确分子量或NMR谱。所述方法包括例如生物传感器、与免疫测定偶联的光学装置、生物芯片、分析装置诸如质谱仪、NMR分析仪或层析装置。此外，方法包括基于微板ELISA的方法、完全自动化或机器人免疫测定(例如可在ElecsysTM分析仪上获得)、CBA (酶促钴结合测定，例如可在Roche-HitachiTM分析仪上获得)、和乳胶凝集测定(例如可在Roche-HitachiTM分析仪上获得)。
为了检测如本文提及的生物标志物蛋白，广泛范围的使用这样的测定形式的免疫测定技术是可用的，参见，例如，美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定法，以及传统的竞争结合测定法。这些测定法也包括标记的抗体与目标生物标志物的直接结合。
夹心测定法在最有用的免疫测定法之中。
采用电化学发光标记物的方法是众所周知的。这样的方法利用特定金属络合物的能力，即通过氧化的方式实现激发态，从所述激发态它们衰减至基态，发射电化学发光。关于综述，参见Richter, M.M., Chem. Rev. 104 (2004) 3003-3036。
在一个实施方案中，待用于测量生物标志物的量的检测抗体(或其抗原结合片段)被钌化或铱化。因此，抗体(或其抗原结合片段)应当包含钌标记物。在一个实施方案中，所述钌标记物是联吡啶-钌(II)络合物。或者抗体(或其抗原结合片段)应当包含铱标记物。在一个实施方案中，所述铱标记物是WO2012/107419中公开的络合物。
测量多肽(诸如Ang-2)的量可以优选包括步骤(a)使所述多肽与特异性结合所述多肽的试剂接触，(b)(任选地)除去未结合的试剂，(c)测量结合的结合剂(即，步骤(a)中形成的试剂的复合物)的量。根据一个优选的实施方案，所述接触、除去和测量的步骤可以由分析器单元实施。根据一些实施方案，所述步骤可以由所述系统的单个分析器单元或彼此可操作通信的多于一个分析器单元实施。例如，根据一个具体的实施方案，本文中公开的所述系统可以包括用于实施所述接触和除去步骤的第一分析器单元和通过运输单元(例如机械臂)可操作地连接至所述第一分析器单元的第二分析器单元，所述第二分析器单元实施所述测量步骤。
特异性结合生物标志物的试剂(本文也称为“结合剂”)可以共价或非共价偶联至标记物，从而允许检测和测量结合的试剂。标记可以通过直接或间接方法完成。直接标记涉及标记与结合剂直接(共价或非共价)偶联。间接标记涉及二级结合剂与第一结合剂的结合(共价或非共价地)。二级结合剂应特异性结合第一结合剂。所述二级结合剂可以与合适标记偶联和/或是结合二级结合剂的三级结合剂的目标(受体)。合适的二级和更高级别结合剂可以包括抗体、二级抗体和众所周知的链霉抗生物素蛋白-生物素系统(VectorLaboratories, Inc.)。结合剂或底物还可以用如本领域已知的一种或多种标签“标签化”。这样的标签随后可以是更高级别结合剂的目标。合适标签包括生物素、地高辛配基(digoxygenin)、His-标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc-标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，标签优选在N末端和/或C末端。合适标记物是可通过合适检测方法检测的任何标记物。典型标记物包括金颗粒、乳胶珠、吖啶(acridan)酯、鲁米诺、钌络合物、铱络合物、酶促活性标记物、放射性标记物、磁性标记物(“例如磁珠”包括顺磁和超顺磁标记物)、和荧光标记物。酶促活性标记物包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶及其衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP (4-氯化硝基四氮唑蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐，可作为现成储存溶液从Roche Diagnostics获得)、CDP-Star™(Amersham Bio-sciences)、ECF™ (Amersham Biosciences)。合适的酶-底物组合可以导致有色反应产物、荧光或化学发光，其可以根据本领域已知的方法(例如使用感光胶片或合适的照相机系统)进行测量。关于测量酶促反应，类似地应用上文给出的标准。一般的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、Texas Red、荧光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。进一步的荧光标记物例如可从Molecular Probes (Oregon)获得。还考虑使用量子点作为荧光标记物。放射性标记物可以通过已知和合适的任何方法进行检测，例如感光胶片或磷光体显像仪。
多肽的量还可以优选如下测量：(a)使包含如本文别处所述的多肽的结合剂的固体支持物与包含肽和多肽的样品接触，和(b)测量结合到支持物的肽或多肽的量。用于制造支持物的材料是本领域众所周知的，并且尤其包括商购可得的柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝酸纤维素条、膜、片、duracytes、反应托盘的孔和壁、塑料管等。
在又一个方面，在测量结合剂和至少一种标志物之间形成的复合物的量之前，从所形成的复合物去除样品。因此，在一个方面，所述结合剂可以固定化在固体支持物上。在又一个方面，可通过施用洗涤溶液将样品从固体支持物上的形成的复合物去除。
“夹心测定”是最有用和常用的测定之一，包括夹心测定技术的许多变化。简而言之，在典型的测定中，未标记的(捕获)结合剂被固定或可被固定在固相基材上，并使待测试的样品与捕获结合剂接触。在适当的孵育期、持续足以允许形成结合剂-生物标志物复合物的一段时间后，然后添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的第二(检测)结合剂并孵育，允许时间足以形成结合剂-生物标志物-标记的结合剂的另一复合物。可洗掉任何未反应的物质，并且通过观察由与检测结合剂结合的报道分子产生的信号来确定生物标志物的存在。结果可为通过简单观察可见信号而定性的，或可为通过与含有已知量的生物标志物的对照样品比较而定量的。
典型的夹心测定的孵育步骤可以根据需要和适当地变化。此类变化包括例如同时孵育，其中共孵育两种或更多种结合剂和生物标志物。例如，将待分析样品和标记的结合剂二者同时加入固定的捕获结合剂。首先孵育待分析样品和标记的结合剂、然后加入结合固相或能够结合固相的抗体也是可能的。
在特定结合剂和生物标志物之间形成的复合物与样品中存在的生物标志物的量应成比例。应当理解，待应用的结合剂的特异性和/或灵敏度定义样品中包含的能够被特异性结合的至少一种标志物的比例程度。在本文中别处还发现关于可以如何实施测量的更详细的描述。所形成的复合物的量将被转化为生物标志物的量，其反映样品中实际存在的量。
术语“结合剂”、“特异性结合剂”、“分析物特异性结合剂”、“检测剂”和“特异性结合生物标志物的试剂”在本文中可互换使用。优选地，其涉及包含特异性结合相应生物标志物的结合部分的试剂。“结合剂”或“试剂”的实例是核酸探针、核酸引物、DNA分子、RNA分子、适配子、抗体、抗体片段、肽、肽核酸(PNA)或化合物。优选的试剂是特异性结合待测量的生物标志物的抗体。本文中的术语“抗体”以最广泛意义使用，且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性(即其抗原结合片段)。优选地，所述抗体是多克隆抗体。更优选地，所述抗体是单克隆抗体。
术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指结合反应，其中结合对分子在它们不显著结合其他分子的条件下表现出与彼此的结合。当将蛋白或肽称为生物标志物时，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指结合反应，其中结合剂以至少10-7 M的亲和力结合相应的生物标志物。术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选是指对于其目标分子的至少10-8 M或甚至更优选至少10-9 M的亲和力。术语“特异性”或“特异性地”用于表示样品中存在的其他分子没有显著结合对于目标分子特异性的结合剂。
如本文所用的术语“量”涵盖如本文提及的生物标志物的绝对量，所述生物标志物的相对量或浓度，以及与其相关或可以从其衍生的任何值或参数。此类值或参数包括通过直接测量，来自从所述肽获得的全部特定物理或化学特性的强度信号值，例如在质谱或NMR谱中的强度值。此外，涵盖了由本说明书中别处说明的间接测量获得的全部值或参数，例如，从生物学读出系统测量的对肽应答的应答量或从特异性结合的配体获得的信号强度。应理解的是与上文提及的量或参数相关的值还可以通过所有标准数学操作获得。
如本文所用的术语“比较”是指将来自主体的样品中的生物标志物的量与本说明书中别处说明的生物标志物的参考量进行比较。应当理解的是如本文所用的比较通常是指相应参数或值的比较，例如绝对值是与绝对参考量比较，而浓度与参考浓度进行比较或从样品中的生物标志物获得的强度信号是与从参考样品获得的相同类型的强度信号比较。所述比较可以人工地或辅助以计算机执行。因此，比较可以通过计算装置进行实施。主体样品中的生物标志物的测量或检测量的值和参考量可以例如彼此比较且所述比较可以通过执行用于比较的算法的计算机程序自动实施。实施所述评价的计算机程序将以合适的输出形式提供期望的评估。对于计算机辅助的比较，被测量的量的值可以与对应于合适参考的值比较，所述参考通过计算机程序储存于数据库中。计算机程序可以进一步评价比较结果，即以合适的输出形式自动提供期望的评估。对于计算机辅助的比较，被测量的量的值可以与对应于合适参考的值比较，所述参考通过计算机程序储存于数据库中。计算机程序可以进一步评价比较结果，即以合适的输出形式自动提供期望的评估。
根据本发明，测定的一种生物标志物(多种生物标志物)的量应当与一种参考(或多种参考)进行比较。一种参考(多种参考)优选为一种参考量(多种参考量)。如本文所用的术语“参考量”优选是指这样的量，其允许将主体分配至(i)处于心房纤颤复发的风险中的主体组或(ii)不处于心房纤颤复发的风险中的主体组。合适的参考量可以从待分析的参考样品连同测试样品一起(即同时或依次地)测定。
原则上，对于如上文说明的主体组群，可以通过应用标准统计学方法基于给定的生物标志物的平均值(average or mean values)计算参考量。具体而言，测试(诸如旨在诊断事件的方法)的准确性与否，最好通过其接受者操作特征(ROC)进行描述(特别参见Zweig1993, Clin. Chem. 39:561-577)。ROC图是由持续改变对于观察的数据的整体范围的判定阈值而产生的全部灵敏度相对于特异性配对的图。诊断方法的临床执行取决于其准确性，即，其正确分配主体至某一预后或诊断的能力。ROC图通过将对适用于进行区分的阈值的完整范围的灵敏度相对于1-特异性进行作图，指出了两个分布之间的重叠。在y轴为灵敏度，或真阳性分数，其定义为真阳性测试结果数与真阳性测试结果数和假阴性测试结果数的乘积(product)的比率。其单独从受影响的亚组计算。在x轴为假阳性分数，或1-特异性，其定义为假阳性测试结果数与真阴性结果数和假阳性结果数的乘积的比率。其是特异性的指标且完全从未受影响的亚组计算。因为真阳性和假阳性分数完全分别地通过使用来自两个不同亚组的测试结果计算，所以ROC图独立于组群中事件的普遍率。ROC图中的每个点代表对应于特定决定阈值的灵敏度/1-特异性对。具有完美区分的检测(在两个分配结果中没有重叠)具有通过左上角的ROC图，其中真阳性分数为1.0，或100% (完美的灵敏度)，和假阳性分数为0 (完美的特异性)。不具有区分的测试的理论图(两个组的结果分布相同)是从左下角至右上角的45°对角线。大多数图落入这两种极端之间。如果ROC图完全落于45°对角线以下，其可以通过将“阳性”标准从“大于”逆转为“小于”而容易地补救，或反之亦然。定性上而言，图越接近左上角，测试的总体准确性越高。取决于期望的置信区间，阈值可以来源于ROC曲线，其允许分别使用灵敏度和特异性的合适的平衡诊断给定事件。因此，待用于本发明的上文提及的方法的参考、即允许区分处于心房纤颤的复发风险中的主体或不处于心房纤颤的复发风险中的那些的阈值且可以优选地通过如上文所述对所述群组建立ROC且从中衍生阈值量而生成。取决于对诊断方法的期望的灵敏度和特异性，ROC图允许衍生合适的阈值。应当理解，对于排除处于心房纤颤复发的风险中的主体(即排除)，期望最佳灵敏度，而对于待评价为处于心房纤颤复发的风险中的主体(即纳入)，则考虑最佳特异性。在一个实施方案中，本发明的方法允许预测主体处于心房纤颤复发的风险中。优选地，如果Ang-2的量(任选地，至少一种另外的生物标志物的量)高于参考量，则主体处于风险中。在一个替代实施方案中，本发明的方法允许预测主体不处于心房纤颤复发的风险中。优选地，如果Ang-2的量(任选地，至少一种另外的生物标志物的量)低于参考量，则主体不处于风险中。
在一个优选实施方案中，本文的术语“参考量”是指预定值。所述预定值应当允许区分处于心房纤颤复发的风险中的主体和不处于心房纤颤复发的风险中的主体。
优选地，测试主体的样品中Ang-2的量高于参考量表明主体处于心房纤颤复发的风险中。还优选地，样品中Ang-2的量低于参考量表明主体不处于心房纤颤复发的风险中。
测试主体的样品中Ang-2的量在参考量处(即与参考量基本上相同或相等)也优选地表明主体处于心房纤颤复发的风险中。
在一个优选实施方案中，参考量来源于已知处于心房纤颤复发的风险中的主体或主体组。在另一个优选实施方案中，参考量来源于已知不处于心房纤颤复发的风险中的主体或主体组。
如果i)参考量来源于已知不处于心房纤颤复发的风险中的主体或主体组，则主体的样品中生物标志物Ang-2的量与参考量相比减少，表明主体不处于心房纤颤复发的风险中。
如果ii)参考量来源于已知处于心房纤颤复发的风险中的主体或主体组，则主体的样品中生物标记物Ang-2的量与参考量相同或与参考量相比增加，表明主体处于心房纤颤复发的风险中。
如果测定多于一种生物标志物的量(诸如Ang-2的量和BNP型肽的量)，则设想将各个量与各个参考量进行比较(例如，Ang-2的量与Ang-2的参考量进行比较以及BNP型肽的量与BNP型肽的参考量进行比较)。
取决于待测试的主体是否患有阵发性或持续性心房纤颤，可以应用不同的参考量或比率来预测心房纤颤的复发。如技术人员将理解，用于患有持续性心房纤颤的测试主体中的预测的参考量或参考比率将高于用于患有阵发性心房纤颤的测试主体中的预测的参考量或参考比率。
优选地，测试主体的样品中生物标志物的量高于(或等于)参考量表明主体处于心房纤颤复发的风险中。还优选地，样品中生物标志物的量低于参考量表明主体不处于心房纤颤复发的风险中。这优选地适用于生物标志物血管生成素-2(Ang-2)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白。因此，如果测定例如Ang-2和BNP型肽的量，则与参考量相比增加(或等于或高于参考量)的两种生物标志物的量表明主体处于心房纤颤复发的风险中，而与参考量相比减少的两种生物标志物的量表明主体不处于心房纤颤复发的风险中。
与上文提及的生物标志物相比，与参考量相比减少的Ang-1的量表明主体处于心房纤颤复发的风险中，而与参考量相比Ang-1的基本上相同的量或增加的量表明主体不处于心房纤颤复发的风险中。因此，增加的Ang-2的量(与Ang-2的参考量相比)与减少的Ang-1的量(与Ang-1的参考量相比)的组合表明主体处于心房纤颤复发的风险中，而减少的Ang-2的量(与Ang-2的参考量相比)与Ang-1的基本上相同的量或增加的量(与Ang-1的参考量相比)的组合表明主体不处于心房纤颤复发的风险中。
如上所述，本发明还可以涵盖计算Ang-2的量和Ang-1的量(即Ang-2的量和Ang-1的量)的比率。应当将所述比率与参考比率进行比较。优选地，参考比率应当允许区分处于AF复发的风险中的主体和不处于AF复发的风险中的主体。
在一个实施方案中， 计算Ang-2与Ang-1的比率。因此，参考比率应当是Ang-2与Ang-1的参考比率。优选地，Ang-2与Ang-1的比率高于参考比率表明主体处于AF复发的风险中。还优选地，Ang-2与Ang-1的比率低于参考比率表明主体不处于AF复发的风险中。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括基于预测的结果推荐和/或起始合适的疗法的步骤。优选地，如果预测主体处于AF复发的风险中，则推荐或起始合适的疗法。合适的疗法可以是旨在降低心房纤颤复发的风险的任何疗法。优选地，所述疗法选自施用至少一种抗凝剂、节律控制和消融术。所述疗法是本领域众所周知的并且例如综述于Fuster V等人 Circulation 2011;123:e269-e367，其在此以其整体通过引用并入。
在一个实施方案中，所述疗法是施用至少一种抗凝剂。至少一种抗凝剂的施用应当旨在减少或防止血液凝结和相关中风。在一个实施方案中，至少一种抗凝剂选自肝素，香豆素衍生物，诸如华法林或双香豆素，组织因子途径抑制剂(TFPI)，抗凝血酶III，因子IXa抑制剂，因子Xa抑制剂，因子Va和VIIIa的抑制剂和凝血酶抑制剂。
上文给出的定义加上必要的变更适用于本发明的以下实施方案。
本发明进一步涉及用于诊断主体中的心房纤颤的方法，所述方法包括测定来自主体的样品中的生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量。
上面已经定义了术语“样品”、“主体”、“比较”、“量”等。所述定义相应地适用。
在本发明的前述方法的一个优选实施方案中，所述方法进一步包括将测定的一种生物标志物(多种生物标志物)的量与一种参考量(或多种参考量)进行比较的步骤。
因此，本发明具体涉及用于诊断主体中的心房纤颤的方法，所述方法包括以下步骤
(a) 测定来自主体的样品中的生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量，和
(b) 将如步骤(a)中所测定的一种生物标志物(多种生物标志物)的量与一种参考量(或多种参考量)进行比较。
优选地，心房纤颤的诊断基于比较步骤(b)的结果。因此，本发明的方法可以包括基于步骤(b)的结果诊断主体中的心房纤颤的另外步骤(c)。
待根据前述方法测试的主体应当是怀疑患有心房纤颤的主体。优选地，所述主体大于70岁。优选地，怀疑患有AF的主体在实施用于诊断AF的方法前应当已显示AF的症状。所述症状通常是短暂的并且可能在几秒钟内出现并且可能同样快速地消失。心房纤颤的症状包括头晕、昏厥、呼吸短促，且特别是心悸。如本文别处所述，考虑主体当获得样品时没有经历心房纤颤的发作。因此，当获得样品时，主体应当具有正常窦性心律。因此，主体应当处于窦性心律。
优选地，如本文所用的术语“诊断”意指评价如根据本发明的方法所提及的主体是否患有心房纤颤(AF)。在一个实施方案中，诊断出主体患有AF。在一个替代实施方案中，诊断出主体不患有AF。
在本发明的方法的一个实施方案中，待诊断的心房纤颤是阵发性心房纤颤。如果待诊断的心房纤颤是阵发性心房纤颤，则设想待测试的主体不患有持续性AF。此外，设想待测试的主体不患有永久性AF。具体而言，应当知道主体不患有持续性和永久性AF。
在本发明的方法的另一个实施方案中，待诊断的心房纤颤是持续性心房纤颤。
如本领域技术人员将理解，本文所述的诊断通常并非意在对于待诊断的所有(即100%)主体是正确的。然而，该术语要求统计学显著部分的主体可被正确地诊断(例如，在组群研究中的组群)。因此，主体是否患有AF的实际诊断可以包括另外的步骤，诸如诊断的证实。因此，在本发明的上下文中的诊断将帮助医师评价主体是否患有心房纤颤。因此，在本发明的上下文中的术语“诊断”优选地涵盖帮助医师评价主体是否患有心房纤颤。
一部分是否是统计学显著的可以通过本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具，例如置信区间的确定、p-值确定、Student氏t-检验、Mann-Whitney检验等来确定而无需费力。详述可见Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John Wiley &Sons, New York 1983。优选的置信区间是至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。优选地，p-值是0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。更优选地，可以通过本发明的方法适当地诊断群体的主体中的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
根据前述方法，测定的一种生物标志物(多种生物标志物)应当与一种参考(或多种参考)进行比较。一种参考(多种参考)优选为一种参考量(多种参考量)。如关于前述方法使用的术语“参考量”优选是指这样的量，其允许将主体分配到(i)患有心房纤颤的主体组、或(ii)未患有心房纤颤的组中。可连同(即同时或随后)测试样品从待分析参考样品确定合适的参考量。
可以如上所述确定参考量。因此，优选地，通过建立ROC曲线，可以生成待用于本发明的前述方法的参考，即有助于区分患有心房纤颤的主体或未患有AF的那些的阈值。根据诊断方法的期望的灵敏度和特异性，ROC图允许推导出合适的阈值。应当理解，对于排除处于心房纤颤复发的风险中的主体(即排除)，期望最佳灵敏度，而对于待评价为患有心房纤颤的主体(即纳入)，考虑最佳特异性。在一个实施方案中，本发明的方法允许诊断为未患有心房纤颤。优选地，如果Ang-2的量(任选地，至少一种另外的生物标志物的量)高于参考量，则主体患有AF。在一个替代实施方案中，本发明的方法允许诊断主体未患有心房纤颤。优选地，如果Ang-2的量(任选地，至少一种另外的生物标志物的量)低于参考量，则主体未患有AF。
在一个优选实施方案中，本文中的术语“参考量”是指预定值。所述预定值应允许区分患有心房纤颤的主体和未患有心房纤颤的主体。
优选地，测试主体的样品中的Ang-2(和任选地如上所述的另外的生物标志物，特别是BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白)的量等于或高于参考量表明主体患有AF。还优选地，样品中的Ang-2(和任选地如上所述的另外标志物，特别是BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白)的量低于参考量表明主体未患有心房纤颤。
如果至少一种另外的生物标志物是Ang-1，则应用以下诊断算法。在患有AF的主体中，该标志物减少。因此，如果Ang-2的量高于该标志物(即Ang-2)的参考量且如果Ang-1的量低于该标志物的参考量，则主体优选患有AF。因此，如果Ang-2的量等于或低于该标志物(即Ang-2)的参考量且如果Ang-1的量等于或高于该标志物(即Ang-1)的参考量，则主体优选未患有AF。
上文结合用于预测AF复发的风险的方法公开了优选的标志物组合。
在前述方法的一个优选实施方案中，待测定的另外的生物标志物是Ang-1。因此，设想生物标志物血管生成素-2 (Ang-2)的量和生物标志物血管生成素-1 (Ang-1)的量的组合测定。在进一步步骤中，将测定的Ang-2和Ang-1的量与参考量进行比较。或者，设想计算血管生成素-2的量与血管生成素-1的量的比率。在随后的步骤中，将所述比率与参考比率进行比较。基于该比较步骤，诊断主体是否患有AF。优选地，Ang-2与Ang-1的比率高于参考比率表明主体患有AF。还优选地，Ang-2与Ang-1的比率低于参考比率表明主体未患有AF。
本发明还涉及用于监测旨在降低心房纤颤复发的风险的疗法的方法，所述方法包括：
(a) 测定来自主体的第一样品中的生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量，
(b) 测定来自主体的第二样品中如步骤(a)中所测定的一种生物标志物(多种生物标志物)的量，和
(c) 将如第一样品中测定的一种生物标志物(多种生物标志物)的量与所述第二样品中的所述一种生物标志物(多种生物标志物)的量进行比较。
以上结合预测AF复发的风险的方法已经定义术语“样品”、“主体”、“比较”、“量”等。所述定义相应地适用。
如本文所用的术语“监测”优选地涉及评价如本文提及的疗法的效果。因此，前述方法可以包括基于步骤c)中实施的比较步骤的结果监测疗法的进一步步骤。如本领域技术人员将理解，风险的预测通常不意在对100%的主体是正确的。然而，该术语要求可以以适当和正确的方式预测统计学显著部分的主体。因此，实际监测可以包括另外的步骤，诸如证实。一部分是否是统计学显著的可以通过本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具，例如置信区间的确定、p-值确定、Student氏t-检验、Mann-Whitney检验等来确定而无需费力。详述可见Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, NewYork 1983。优选的置信区间是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。优选地，p-值是0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
如上面所提及的方法包括基本上由前述步骤组成的方法或包括另外步骤的方法。此外，本发明的方法优选是离体(ex vivo)或体外方法。而且，它还可以包括除了上文明确提及的那些以外的步骤。例如，其他步骤可以涉及测定另外的标志物或样品预处理或评估由所述方法获得的结果。
优选地，通过实施本发明的方法，可以评价主体是否对所述疗法响应。如果主体的病况在获得第一和第二样品之间改善，则主体对疗法响应。优选地，如果病况在获得第一和第二样品之间恶化，则主体未对疗法响应。
优选地，在起始所述疗法前获得第一样品。更优选地，样品在起始所述疗法前一周内、特别是两周内获得。
由于本发明的前述方法包括评价由如本文所提及的疗法引起的生物标志物的量的变化，因此也可以在起始所述疗法之后(但在获得第二样品之前)获得第一样品。
因此，应当在第一样品之后获得第二样品。应当理解，第二样品应当在起始所述疗法之后获得。
此外，特别考虑在获得第一样品后的合理时间段之后获得第二样品。应当理解，本文提及的生物标志物的量不会立即改变(例如在1分钟或1小时内)。因此，在该上下文中的“合理的”是指在获得第一和第二样品之间的间隔，所述间隔允许生物标志物进行调整。因此，优选地，在所述第一样品之后至少一个月，在所述第一样品之后至少三个月，或特别是至少六个月，获得第二样品。
以下内容优选地适用于生物标志物血管生成素-2(Ang-2)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白)。
优选地，第二样品中生物标志物的量与第一样品中生物标志物的量相比增加，且更优选地，显著增加，且最优选地，统计学显著增加，表明主体对疗法未响应。此外，第二样品中生物标志物的量与第一样品中生物标志物的量相比未改变优选表明主体对疗法未响应。还优选地，第二样品中生物标志物的量与第一样品中生物标志物的量相比降低，更优选地，显著降低，最优选地，统计学显著降低，表明主体对疗法响应。
以下内容优选适用于生物标志物血管生成素-1 (Ang-1)：
优选地，第二样品中生物标志物Ang-1的量与第一样品中生物标志物的量相比未改变(相等)或增加表明主体对疗法响应。还优选地，第二样品中生物标志物的量与第一样品中生物标志物的量相比降低，更优选地，显著降低，最优选地，统计学显著降低，表明主体对疗法未响应。
因此，如果测定Ang-1和Ang-2，例如，第二样品中生物标志物Ang-2的量与第一样品中生物标志物的量相比未改变或增加以及第二样品中Ang-1的量与第一样品中生物标志物的量相比降低，表明主体对疗法未响应(且反之亦然)。
如果疗法降低主体心房纤颤复发的风险，则主体被认为对疗法响应。如果疗法未降低主体心房纤颤复发的风险，则主体被认为对疗法未响应。
术语“显著的”和“统计学显著的”是本领域技术人员已知的。因此，本领域技术人员可以使用各种众所周知的统计学评估工具不必再费周折地确定增加或降低是否是显著的或统计学显著的。例如，显著的增加或降低是增加或降低至少10％，特别是至少20％。
优选的生物标志物组合在本文别处公开。
在前述方法的一个优选实施方案中，在第一和第二样品中待测定的另外的生物标志物是Ang-1。因此，在第一和第二样品中设想生物标志物血管生成素-2 (Ang-2)的量和生物标志物血管生成素-1 (Ang-1)的量的组合测定。在一个优选实施方案中，设想i)计算第一样品中血管生成素-2的量与第一样品中血管生成素-1的量的比率(由此计算第一比率)，和ii)计算第二样品中血管生成素-2的量与第二样品中血管生成素-1的量的比率(由此计算第二比率)。在随后的步骤中，将所述第一比率(即第一样品中的比率)与第二比率(即第二样品中的比率)进行比较。基于该比较步骤，监测疗法。优选地，与第一样品中Ang-2的量与Ang-1的量的比率相比，第二样品中Ang-2的量与Ang-1的量的比率增加，特别是显著增加，表明主体对疗法响应。还优选地，与第一样品中Ang-2的量与Ang-1的量的比率相比，第二样品中Ang-2的量与Ang-1的量的比率降低，特别是显著降低，表明主体对疗法未响应。
上文关于预测AF的复发和诊断AF给出的定义优选适用于本发明的以下实施方案。
本发明进一步涉及用于将主体中的心房纤颤分级的方法，所述方法包括测定来自主体的样品中的生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量。
在本发明的前述方法的一个优选实施方案中，所述方法进一步包括将测定的一种生物标志物(多种生物标志物)的量与一种参考量(或多种参考量)进行比较的步骤。
因此，本发明具体涉及用于将主体中的心房纤颤分级的方法，所述方法包括以下步骤
(a) 测定来自主体的样品中的生物标志物血管生成素-2(Ang-2)的量和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量，和
(b) 将如步骤(a)中所测定的一种生物标志物(多种生物标志物)的量与一种参考量(或多种参考量)进行比较。
优选地，心房纤颤的分级基于比较步骤(b)的结果。因此，本发明的方法可以包括基于步骤(b)的结果将主体中的心房纤颤分级的另外步骤(c)。
待根据前述方法测试的主体优选患有心房纤颤。具体而言，主体优选地已被诊断为患有心房纤颤(在实施本发明的前述方法之前)。因此，前述方法应当允许主体的进一步分类。
优选地，待通过用于将AF分级的方法测试的主体未患有永久性AF。
在一个实施方案中，当获得样品时，待测试的主体未经历心房纤颤的发作。因此，当获得样品时，主体应当具有正常窦性心律(且因此处于窦性心律)。
在另一个实施方案中，当获得样品时，主体经历心房纤颤的发作。在该实施方案中，主体未处于窦性心律。
优选地，如本文所用的术语“将心房纤颤分级”意指评价主体中心房纤颤的严重程度。具体而言，该术语意指评价如根据该方法所提及的主体是否患有轻度形式的心房纤颤或严重形式的心房纤颤。因此，通过实施请求保护的方法，可以区分轻度形式的AF和严重形式的AF。轻度形式的AF优选为阵发性AF。严重形式的AF优选为持续性AF。
如本领域技术人员将理解，本文所述的分级通常并非意在对于待分级的所有(即100%)主体是正确的。因此，实际分级可以包括另外的步骤，诸如证实分级。因此，在本发明的上下文中的术语“分级”优选地涵盖帮助医师评价主体是否患有轻度或严重形式的心房纤颤。
根据前述方法，测定的一种生物标志物(多种生物标志物)应当与一种参考(或多种参考)进行比较。一种参考(或多种参考)优选为一种参考量(多种参考量)。如与前述方法结合使用的术语“参考量”优选是指这样的量，其允许将主体分配至(i)患有轻度形式心房纤颤的主体组或(ii)患有严重形式的AF的主体组。应当理解，待在前述方法中应用的参考可以不同于待在用于诊断AF或用于预测AF的复发的方法中应用的参考量。技术人员考虑这一点。
可以如上所述确定参考量。因此，优选地，通过建立ROC曲线，可以生成待用于本发明的前述方法的参考，即有助于区分患有轻度形式的心房纤颤的主体或患有严重形式的AF的那些的阈值。
在一个优选实施方案中，本文的术语“参考量”是指预定值。所述预定值应当允许区分患有轻度形式的心房纤颤的主体和患有严重形式心房纤颤的主体。
在本发明的研究中已经显示，与患有轻度形式的AF(阵发性AF，参见图2)的主体中的Ang-2的量相比，患有严重形式的AF (持续性AF)的主体中Ang-2的量增加。因此，诊断算法如下：
优选地，测试主体的样品中的Ang-2(和任选地如上所述的另外的生物标志物，特别是BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白)的量等于或高于参考量表明主体患有严重形式的AF。还优选地，样品中的Ang-2(和任选地如上所述的另外的标志物，特别是BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白)的量低于参考量表明主体患有轻度形式的AF。
如果除了Ang-2以外测定的至少一种另外的生物标志物是Ang-1，则应用以下诊断算法。在患有严重形式的AF的主体中，Ang-1减少(与具有轻度形式的AF的主体相比，参见例如图2)。因此，如果Ang-2的量高于该标志物(即Ang-2)的参考量且如果Ang-1的量低于该标志物的参考量，则主体优选患有严重形式的AF。因此，如果Ang-2的量等于或低于该标志物(即Ang-2)的参考量且如果Ang-1的量等于或高于该标志物(Ang-1)的参考量，则主体优选患有轻度形式的AF。
上文结合用于预测AF复发的风险的方法公开了优选的标志物组合。
在前述方法的一个优选实施方案中，待测定的另外的生物标志物是Ang-1。因此，设想生物标志物血管生成素-2 (Ang-2)的量和生物标志物血管生成素-1 (Ang-1)的量的组合测定。在进一步步骤中，将测定的Ang-2和Ang-1的量与参考量进行比较。或者，设想计算血管生成素-2的量与血管生成素-1的量的比率。在随后的步骤中，将所述比率与参考比率进行比较。基于该比较步骤，将AF分级。具体而言，区分主体是否患有轻度形式AF或严重形式的AF。优选地，Ang-2与Ang-1的比率高于参考比率表明主体患有严重形式AF。还优选地，Ang-2与Ang-1的比率低于参考比率表明主体患有轻度形式的AF。
进一步，本发明涉及i)生物标志物血管生成素-2(Ang-2)和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物，和/或ii)特异性结合血管生成素-2(Ang-2)的试剂和任选地至少一种特异性结合选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的生物标志物的另外的试剂在来自主体的样品中用于预测心房纤颤复发的风险的用途。
进一步，本发明涉及i)生物标志物血管生成素-2(Ang-2)和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物，和/或ii)特异性结合血管生成素-2(Ang-2)的试剂和任选地至少一种特异性结合选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的生物标志物的另外的试剂在来自主体的样品中用于诊断心房纤颤的用途。
进一步，本发明涉及i)生物标志物血管生成素-2(Ang-2)和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物，和/或ii)特异性结合血管生成素-2(Ang-2)的试剂和任选地至少一种特异性结合选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的生物标志物的另外的试剂在来自主体的第一和第二样品中用于监测旨在降低心房纤颤复发的风险的疗法的用途。
最后，本发明涉及i)生物标志物血管生成素-2(Ang-2)和任选地至少一种选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物，和/或ii)特异性结合血管生成素-2(Ang-2)的试剂和任选地至少一种特异性结合选自血管生成素-1(Ang-1)、BNP型肽、CK-MB(肌肉-脑型肌酸激酶)、IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)和心肌肌钙蛋白的生物标志物的另外的试剂在来自主体的样品中用于将心房纤颤分级的用途。
结合本发明的方法给出的定义和解释也适用于本发明的用途(例如，参见如本文别处所提供的术语“样品”、“主体”、“试剂”等的定义)。
本说明书中引用的所有参考文献在此通过引用它们的全部公开内容和本文说明书中具体提及的公开内容而并入。
附图显示：
图1显示：针对外周动脉疾病、单独AF、吸烟、心率、在有/无复律的前6个月内的≥2次AF发作调整的GISSI-AF中首次AF复发的Cox多变量模型。作为对于生物标志物的基线浓度的1 SD的增量的危险比(HR)显示的数据。
图2显示：用28个患有AF的患者样品相比于28个未患有AF的患者中的比率Ang-2(上调)/Ang-1(下调)诊断AF。
实施例
本发明将仅通过以下实施例说明。然而，所述实施例不应以限制本发明范围的方式解释。
实施例1：GISSI-AF试验：
GISSI-AF试验是一项双盲、随机化、安慰剂对照、多中心试验，其已登记1442名处于窦性心律的患者，所述患者具有心房纤颤（大多数为阵发性心房纤颤）的已知病史，在过去6个月内通过有症状的ECG-记录的心房纤颤的至少两次或更多次记录，或在随机化前14天和48小时之间成功的电复律或药物复律，以及跟踪他们12个月(Masson等人 2015Cardiovasc Drugs Ther 29:551)。该试验的基本原理、设计和结果已经在更早前(参考：Disertori M, 等人, J Cardiovasc Med. 2006;7:29–38; 参考Staszewsky L等人,Cardiovasc Drugs Ther 2015;29:551-561)和Clinical Trials.gov下(具有标识符NCT00376272)详细公开。
所有患者年龄> 40岁，并且在登记前已进行针对心房纤颤和任何潜在心血管疾病的稳定治疗至少1个月。允许继续服用先前针对心血管合并症开处方的ACE抑制剂、β-受体阻滞剂和胺碘酮。将患者随机化以接受缬沙坦或安慰剂。
主要试验的主要终点是评价血管紧张素II 1型受体阻滞剂缬沙坦对(a)心房纤颤的首次复发时间和(b)在1年观察期内具有多于一次心房纤颤发作的患者比例的影响。
生物标志物子研究(N = 382)包括203名主体和179名在12个月随访期期间没有复发性心房纤颤的对照(Masson S等人, Heart. 2010;96:1909–14; Latini R等人, JIntern Med. 2011;269:160-71)。以随机方式并在随访6和12个月后抽取血液样品。
实施例2：生物标志物测量
用来自Roche Diagnostics (Mannheim, Germany)的商业化Elecsys®试剂测量生物标志物CK-MB、NT-proBNP、肌钙蛋白T和维生素D的血浆浓度。用来自Roche Diagnostics(Mannheim, Germany)的原型Elecsys®试剂测量生物标志物IGFBP7和Ang-2。
使用生物素化的MAB<Ang2>Bi和钌化的MAB<Ang2>F(ab`)2-Ru的Ang-2-测定：
使用Elecsys® cobas分析仪e601开发了用于特异性测量具体为人血清或血浆样品中的Ang2的电化学发光免疫测定(ECLIA)。Elecsys Ang2免疫测定是一种电化学发光免疫测定(ECLIA)，其经由夹心原理起作用。该测定中包括两种抗体，即生物素化的单克隆抗体MAB<Ang2> (MAB<Ang2>Bi；捕获抗体)和钌化的单克隆抗Ang2抗体MAB<Ang2>的F(ab`)2-片段(MAB<Ang2>F(ab`)2-Ru；检测抗体)，其在样品中与Ang2形成夹心免疫测定复合物。然后将复合物与固相链霉抗生物素蛋白包被的微粒结合。这些被磁性捕获至电极表面上，在向电极施加电压后导致化学发光发射，其通过光电倍增管测量。结果经由仪器特定的校准曲线确定，所述校准曲线通过在测量范围内具有不同浓度的Ang2的6种校准物的系列确定。应用测定方案2测量样品，其中移液体积为20μl样品、75μl试剂1 (R1)、75μl试剂2 (R2)和30μl磁珠。R1在磷酸盐反应缓冲液中含有1.75 µg/ml MAB<Ang2>Bi，并且试剂2 (R2)在相同反应缓冲液中含有1 µg/ml MAB<Ang2>F(ab`)2-Ru。
表1. 测试特征
生物标志物 测定/制造商 单位 LOD 测定内CV (%)
IGFBP7 ECLIA/RDG ng/mL 0.01 2
血管生成素-2 ECLIA/RDG ng/mL 0.042 <6
CK-MB ECLIA/RDG ng/mL 0.3 <4
维生素D ECLIA/RDG ng/mL 3 <7.5
血管生成素-1 ng/ml 0.061 8.8
先前公开了生物标志物子研究的首次结果(Masson S等人, Heart. 2010;96:1909–14; Latini R等人, J Intern Med. 2011;269:160-71)，其中发现心脏生物标志物NT-proBNP或cTnT-hs在AF发作期间升高并且与首次AF复发独立相关。其他标志物心脏标志物(MR-proANP)、血管活性肽(MR-proADM、CT-proET1、和肽素)和炎性生物标志物CRP-hs)不能预测心房纤颤的复发(Latini R等人, J Intern Med. 2011;269:160-71)。
表2显示了对于GISSI AF研究的6个月随访的IGFBP-7、Ang-2、CK-MB和Vit B的结果，其提供了所述血液生物标志物在具有复发性AFib的患者中是否升高的信息。患者在基线时处于窦性心律(SR)。
表2. 根据6个月随访的心节律的生物标志物(中值，[Q1-Q3])
生物标志物 SR (n=284-294) AF (n=39-41) p
IGFBP7 (ng/mL) 167 [153-186] 186 [163-227] 0.4
血管生成素-2 (ng/mL) 2.4 [2.0-3.0] 3.3 [2.4-4.5] 0.09
CK-MB (ng/mL) 2.4 [1.8-3.4] 3.0 [2.2-3.9] 0.89
维生素D (ng/mL) 14.6 [8.3-22.7] 15.9 [6.9-24.4] 0.21
表3显示12个月随访的IGFBP-7、Ang-2、CK-MB和Vit B的结果。
表3. 根据12个月随访的心节律的生物标志物(中值，[Q1-Q3])
生物标志物 SR (n=273-282) AF (n=55-57) p
IGFBP7 (ng/mL) 172 [156-196] 178 [159-214] 0.1
血管生成素-2 (ng/mL) 2.4 [1.9 – 3.1] 3.7 [2.8 – 4.9] <.0001
CK-MB (ng/mL) 2.5 [1.8 – 3.5] 2.7 [1.9 – 3.6] 0.33
维生素D (ng/mL) 7.2 [5.1.11.6] 7.9 [5.3-14.2] 0.22
因此，所述标志物是心房纤颤复发的风险的可靠预测因子。
实施例3：用比率Ang-2:Ang-1诊断AF
在n=56名血液采样的患者的血浆样品中已测定NTproBNP、Ang-2和Ang-1水平，并且由于CABG或瓣膜手术，在开胸手术前测定生物标志物。在同时进行心内膜-心外膜高密度激活作图(Endo-Epicardial High Density Activation Mapping)的手术期间，生成不同类型的AF、阵发性AF和持续性AF或SR(对照)的证据。将具有AF、阵发性AF或持续性AF的患者和对照在性别、年龄和合并症方面进行匹配。
根据由电激活导致的纤颤波的不同传导模式，心外膜高密度作图是区分窦性心律、阵发性和持续性AF的亚组的不同手段(参见Eckstein等人, Transmural ConductionIs the Predominant Mechanism of Breakthrough During Atrial FibrillationEvidence From Simultaneous Endo-Epicardial High-Density Activation Mapping.Circ Arrhythm Electrophysiol. (2013) 6, pp. 334-341; van Marion等人,Diagnosis and Therapy of Atrial Fibrillation: the Past, the Present and theFuture Diagnosis and Therapy of Atrial Fibrillation: the Past, the Presentand the Future JAFIB: Journal of Atrial Fibrillation;Aug/Sep2015, Vol. 8Issue 2, p5)。
心外膜高密度作图例如允许诊断阵发性心房纤颤，甚至在没有心房纤颤发作的情况下。因此，其允许在未患有AF的主体、患有阵发性AF的主体和患有持续性AF的主体之间进行可靠的区分。
在采血时
• 患有阵发性AF(任选处于窦性心律)的患者；n=13名患者
• 持续性AF患者不处于窦性心律；n=15名患者
• 对照患者处于窦性心律；n=28名患者。
数据评估显示Ang-2水平高于参考值且Ang-1水平低于参考值的患者被怀疑具有心房纤颤并且可能受益于抗凝。观察到的Ang-2用于检测阵发性AF的AUC为0.54，且Ang-2用于检测持续性AF的AUC为0.78。观察到的Ang-1用于检测阵发性AF的AUC为0.60，且Ang-1用于检测持续性AF的AUC为0.63。因此，在本文分析的患者中，生物标志物Ang-1允许阵发性AF的改进诊断。
如图2b中所示，从处于窦性心律的患者到阵发性AF患者到持续性AF患者，可以检测到循环Ang-2水平的进行性增加。相反且如图2a中所示，从处于窦性心律的患者到阵发性AF患者到持续性AF患者，可以检测到循环Ang-1水平的进行性下降。因此，在本文分析的患者中，比率Ang-2(上调)/Ang-1(下调)允许独立于其他生物标志物的AF的改进诊断。
表4. 比率Ang-2 :Ang-1
生物标志物 AFAUC 在60 %灵敏度时的特异性 在60 %特异性时的灵敏度 p-值
Ang-1 0.629 57.1% 0.607 0.100
Ang-2 0.654 50.0% 0.571 0.048
比率Ang-2:Ang-1 0.680 67.9% 0.679 0.020
阵发性AF AUC 在60 %灵敏度时的特异性 在60 %特异性时的灵敏度 p-值
Ang-1 0.596 57.1% 61.5% 0.338
Ang-2 0.536 32.1% 46.2% 0.730
比率Ang-2:Ang-1 0.459 32.1% 30.8% 0.688
持续性AF AUC 在60 %灵敏度时的特异性 在60 %特异性时的灵敏度 p-值
Ang-1 0.657 53.6% 60.0% 0.095
Ang-2 0.757 60.7% 66.7% 0.005
比率Ang-2:Ang-1 0.800 78.6% 86.7% 0.001
表4概述实施例3中描述的56名患者中单独的生物标志物Ang-1和Ang-2以及比率Ang-2/Ang-1的性能。
如表4中所示，观察到的比率Ang-2/Ang-1的AUC为0.680，其中具有心房纤颤的所有主体(n=28)的检测在60％特异性时的灵敏度为67.9％，且p-值为0.02。各自观察到的Ang-1的AUC为0.629，其中28名主体相比于28名对照中心房纤颤检测在60％特异性时的灵敏度为60.7％，且p-值为0.1。
各自观察到的Ang-2的AUC为0.654，其中28名主体相比于28名对照中心房纤颤检测在60％特异性时的灵敏度为57.1%，且p-值为0.048。因此，总之，观察到Ang-1和/或Ang-2两者均适合于检测阵发性和/或持续性AF。在本文分析的群组中，所提出的比率Ang-2 :Ang-1的算法在检测阵发性和/或持续性AF中显示相比于Ang-1或Ang-2的最佳性能。对于比率Ang-2 :Ang-1、Ang-1和Ang-2，观察到的在60％特异性时检测阵发性和/或持续性AF的灵敏度分别为67.9 %、60.7%和57.1%。
观察到的比率Ang-2 :Ang-1用于检测阵发性AF的AUC为0.459，其中在60％特异性时的灵敏度为30.8%。在具有阵发性心房纤颤的主体中检测Ang-1，其中在60％特异性时的灵敏度为61.5 %，且AUC为0.596。在本文分析的阵发性AF患者中检测Ang-2，其中在60％特异性时的灵敏度为46%，且AUC为0.536。
因此，总之，在分析的患者群组中，Ang-1在检测阵发性AF中显示相比于单独的Ang-2的有益性能。对于Ang-1、Ang-2和比率Ang-2:Ang-1，观察到的在60％特异性时检测阵发性AF的灵敏度分别为61.5 %、46.2%和30.8%。
对于本文分析的患者，观察到的比率Ang-2 :Ang-1用于检测持续性AF的AUC为0.80 (在60％特异性时的灵敏度为86.7%，p-值为0.001)。在具有持续性心房纤颤的主体中检测Ang-1，其中灵敏度和特异性为60 %且AUC为0.657。对于Ang-2，发现持续性AF患者的AUC为0.757，且在60％特异性时的灵敏度为66.7 %。
总之，观察到两种生物标志物Ang-1或Ang-2均适用于检测持续性AF患者。与单独使用两种生物标志物中的任一种Ang-1或Ang-2相比，使用比率Ang-2 :Ang-1，可以实现检测持续性AF的改进性能。对于比率Ang-2:Ang-1、Ang-2和Ang-1，观察到的在60％特异性时检测持续性AF的灵敏度分别为86.7 %、66.7%和60.0%。
在本文分析的患者中，观察到的NTproBNP用于检测阵发性AF的AUC为0.64，且观察到的NTproBNP用于检测持续性AF的AUC为0.9。
得出结论，比率Ang-2(上调)/Ang-1(下调)显示与单独的Ang-2相比的有益性能，且因此可以单独和/或与NTproBNP组合帮助检测心房纤颤的发作。具有Ang-2水平高于参考值及Ang-1水平低于参考值的组合的患者怀疑具有心房纤颤并且可能受益于抗凝。
因此，可以单独用比率Ang-2/Ang-1或将其与NT-proBNP组合来实现处于风险中的患者的心房纤颤的诊断。

Claims (21)

1.特异性结合生物标志物血管生成素-2的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于通过如下方法预测主体中的心房纤颤复发的风险，所述方法包括测定来自所述主体的血液、血清或血浆样品中的生物标志物血管生成素-2的量。
2.特异性结合生物标志物血管生成素-2的试剂和至少一种特异性结合选自血管生成素-1、BNP型肽、肌肉-脑型肌酸激酶、胰岛素样生长因子结合蛋白7和心肌肌钙蛋白的生物标志物的另外的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于通过如下方法预测主体中的心房纤颤复发的风险，所述方法包括测定来自所述主体的血液、血清或血浆样品中的生物标志物Ang-2的量和测定来自所述主体的血液、血清或血浆样品中的至少一种选自血管生成素-1、BNP型肽、肌肉-脑型肌酸激酶、胰岛素样生长因子结合蛋白7和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量。
3.权利要求1或2的用途，其中所述主体是人。
4.权利要求1或2的用途，其中测定BNP型肽和血管生成素-2的量。
5.权利要求1或2的用途，其中所述方法进一步包括将测定的一种或多种生物标志物的量与一种或多种参考量进行比较的步骤。
6.权利要求5的用途，其中一种生物标志物的量或多种生物标志物的量高于一种或多种参考量表明主体处于心房纤颤复发的风险中和/或其中一种生物标志物的量或多种生物标志物的量低于一种或多种参考量表明主体未处于心房纤颤复发的风险中。
7.权利要求1或2的用途，其中测定血管生成素-2和血管生成素-1的量。
8.权利要求7的用途，其中计算血管生成素-2的量和血管生成素-1的量的比率，且其中将所述计算的比率与参考比率进行比较。
9.特异性结合生物标志物血管生成素-2的试剂和特异性结合生物标志物血管生成素-1的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于通过如下方法诊断主体中的心房纤颤，所述方法包括测定来自主体的血液、血清或血浆样品中的生物标志物血管生成素-2的量和血管生成素-1的量，其中计算血管生成素-2的量和血管生成素-1的量的比率，且其中将所述计算的比率与参考比率进行比较。
10.权利要求9的用途，其中所述比率是血管生成素-2的量与血管生成素-1的量的比率。
11.权利要求10的用途，其中血管生成素-2的量与血管生成素-1的量的比率高于参考比率表明主体患有心房纤颤。
12.特异性结合生物标志物血管生成素-2的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于通过如下方法监测旨在降低心房纤颤复发的风险的疗法，所述方法包括：
(a) 测定来自主体的第一血液、血清或血浆样品中的生物标志物血管生成素-2的量，
(b) 测定来自主体的第二血液、血清或血浆样品中如步骤(a)中所测定的生物标志物的量，和
(c) 将如第一血液、血清或血浆样品中测定的生物标志物的量与所述第二血液、血清或血浆样品中的所述生物标志物的量进行比较。
13.特异性结合生物标志物血管生成素-2的试剂和至少一种特异性结合选自血管生成素-1、BNP型肽、肌肉-脑型肌酸激酶、胰岛素样生长因子结合蛋白7和心肌肌钙蛋白的生物标志物的另外的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于通过如下方法监测旨在降低心房纤颤复发的风险的疗法，所述方法包括：
(a) 测定来自主体的第一血液、血清或血浆样品中的生物标志物血管生成素-2的量和至少一种选自血管生成素-1、BNP型肽、肌肉-脑型肌酸激酶、胰岛素样生长因子结合蛋白7和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物的量，
(b) 测定来自主体的第二血液、血清或血浆样品中如步骤(a)中所测定的生物标志物的量，和
(c) 将如第一血液、血清或血浆样品中测定的生物标志物的量与所述第二血液、血清或血浆样品中的所述生物标志物的量进行比较。
14.权利要求12或13的用途，其中所述疗法是施用至少一种抗凝剂。
15.权利要求13的用途，其中至少一种另外的生物标志物选自BNP型肽、肌肉-脑型肌酸激酶、胰岛素样生长因子结合蛋白7和心肌肌钙蛋白。
16.权利要求15的用途，其中所述第二血液、血清或血浆样品中的一种或多种生物标志物的量与所述第一血液、血清或血浆样品中的一种或多种生物标志物的量相比增加表明主体对疗法未响应，或其中所述第二血液、血清或血浆样品中的一种或多种生物标志物的量与所述第一血液、血清或血浆样品中的一种或多种生物标志物的量相比减少表明主体对疗法响应。
17.权利要求13的用途，其中至少一种另外的生物标志物是血管生成素-1。
18.作为生物标志物的血管生成素-2在制备药物中的用途，所述药物用于预测心房纤颤复发的风险。
19.作为生物标志物的血管生成素-2和至少一种选自血管生成素-1、BNP型肽、肌肉-脑型肌酸激酶、胰岛素样生长因子结合蛋白7和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物在制备药物中的用途，所述药物用于预测心房纤颤复发的风险。
20.作为生物标志物的血管生成素-2在制备药物中的用途，所述药物用于监测旨在降低心房纤颤复发的风险的疗法。
21.作为生物标志物的血管生成素-2和至少一种选自血管生成素-1、BNP型肽、肌肉-脑型肌酸激酶、胰岛素样生长因子结合蛋白7和心肌肌钙蛋白的另外的生物标志物在制备药物中的用途，所述药物用于监测旨在降低心房纤颤复发的风险的疗法。
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