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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Bereiche Hepatologie und Leberfibrose.
Insbesondere betrifft sie eine Prüfergruppe von serologischen
Markern, die zur Diagnose von Leberfibrose benutzt werden können, insbesondere
zur Diagnose von Leberfibrose aufgrund einer chronischen HCV-Infektion.
Diese Marker können zur
Beobachtung der therapeutischen Behandlung von Leberfibrose benutzt
werden.
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Allgemeiner Stand der Technik
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Die
Fibrose-Leberkrankheit steht an achter Stelle von Haupttodesursachen
weltweit, wobei sie im Jahr für
1,3 Millionen Todesfälle
verantwortlich ist (Murray und Lopez, 1997, Lancet 349, 1269–1276).
Die Zellmechanismen von Fibrose sind komplex. Als Reaktion auf eine
Leberverletzung, verursacht durch zum Beispiel eine chronische Hepatitis
C Virus Infektion (HCV-Infektion), eine Hepatitis B Virus Infektion
(HBV-Infektion), Alkohol- oder Fettleber, arzneimittelbedingte Leberkrankheit
oder primäre
biliäre
Zirrhose, werden normalerweise untätige hepatische Sternzellen
zu wuchernden Myofibroblasten aktiviert. Diese Zellen produzieren
extrazelluläre
Matrixproteine und setzen Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen
frei, die Metalloproteinasen binden und deaktivieren, welche für den Narbenabbau
verantwortlich sind. Infolgedessen können sich Fibrose und Narbe
durch zunehmende Produktion von Gewebe und Proteinen wie etwa Kollagen
und abnehmenden Abbau dieser Verbindungen ansammeln, so daß die Funktion
der Leber beeinträchtigt
wird (McHutchinson 2004, CME Newsletter Tx Reporter Gastroenterology,
2–4).
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Während hepatische
Fibrose ein reversibler Vorgang ist, der in der Ansammlung von extrazellulärer Matrix
resultiert, ist Leberzirrhose ein irreversibler Vorgang, der durch
dicke Matrixbänder
gekennzeichnet ist, die das Parenchym vollständig umgeben, um Knötchen zu
bilden.
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Bleibt
sie unbehandelt, kann die Leberfibrose zur Zirrhose, möglicherweise
Krebs, führen.
Aus diesen Gründen
ist die rechtzeitige und genaue Diagnose von Leberfibrose zur wirksamen
medizinischen Behandlung entscheidend.
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Gegenwärtig wird
die Leberbiopsie immer noch als sogenannter Goldstandard bei der
Beurteilung von Fibrose und Entzündung
angesehen. Die Leberbiopsie wird empfohlen zum Grading und Staging
der Krankheit, zur Bestätigung
der Diagnose und zur Erstellung einer Grundlinie, hinsichtlich welcher
die Besserung oder der Krankheitsverlauf dokumentiert werden können, zur
Hilfe bei der Bestimmung der Prognose und dem Bedarf an Therapie
(McHutchinson, siehe oben; zum Überblick
siehe Gebo et al. 2002 Hepatology 36, 161–172).
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Es
gibt viele histologische Grading-Systeme, die zur Semiquantifizierung
des Grades an hepatischer Fibrose und Entzündung bei Patienten mit chronischer
Hepatitis C benutzt worden sind. Eines der am meisten benutzten
Grading-Systeme ist das METAVIR-System (Bedossa et al., 1994, Hepatology,
20, 15–20).
METAVIR klassifiziert hepatische Fibrose in 5 Stadien zwischen F0
und F4. F0 bedeutet keine Fibrose, F1 entspricht milder Fibrose
(portale Fibrose ohne Septen). Die mäßige bis schwere Fibrose läßt sich
als F2 bis F4 klassifizieren (F2: wenig Septen, F3: viele Septen
ohne Zirrhose), wobei Stadium F4 dem letzten Stadium von Zirrhose
entspricht. Fibrose wird als klinisch bedeutend mit Beginn bei F ≥ 2 angesehen.
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Es
bestehen jedoch mehrere Nachteile bei der Anwendung der Leberbiopsie
zur Diagnose und zum Staging von Fibrose. Leberfibrose unterliegt
Stichprobenfehlern, so daß der
kleine Teil an Stichproben die wahre Situation in der gesamten Leber
gegebenenfalls nicht widerspiegelt. Somit ist sie kein genauer Marker
des dynamischen Verlaufs konstanten Abbaus. Weitere Pathologen sind
oft in ihren Angaben histologischer Proben nicht in Übereinstimmung,
in denen Intra- und Inter-Beurteiler-Variationen in 10 bis 20% von
Biopsien auftreten (Cadranel et al. 2000, Hepatology 32, 477–481).
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Die
Leberbiopsie ist ein invasiver und schmerzhafter Vorgang für den Patienten.
Sie ist ebenfalls mit der Gefahr von Blutung und anderen Komplikationen
nach der Probeentnahme verbunden. Des weiteren, und teilweise aufgrund
der erwarteten Komplikationen mit anschließender Krankenhauseinweisung
des Patienten, ist dies ein teurer Vorgang.
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Hepatische
Fibrose ist die Hauptkomplikation der chronischen HCV-Infektion,
die zur Entwicklung von Zirrhose und dekompensierter Leberkrankheit
führt.
Gezielte Nachforschungen, welche die Entwicklung und den Verlauf
von Fibrose untersuchen, sind daher zur wirksamen Verwaltung dieser
Patienten unerläßlich. Die Evaluierung
der progressiven Fibrose wird am besten mittels nicht invasiver
Tests durchgeführt,
die unter Zwischenstadien von Fibrose unterscheiden können. Es
sind bisher mehrere einzelne Marker und Marker-Prüfergruppenalgorithmen
veröffentlicht
worden, jedoch liegt derzeit kein leistungsfähiger einzelner Biomarker oder keine
Biomarkerauswertung vor, die eine verläßliche Vorhersage der Fibrose
ermöglicht
(Diagnosegenauigkeit > 80%).
Die weiteren Untersuchungen der Entwicklung nicht invasiver dynamischer
Messungen von hepatischer Fibrose werden von der National Institutes
of Health Consensus Development Conference 2002 stark unterstützt. Insbesondere
die Studien über
Alternativen zur Leberbiopsie sollten genug Einzelheiten über die Biopsieverfahren
bereitstellen (Durchschnittsgröße der Biopsieproben;
histologisch gut gekennzeichnete qualifizierende Prüfergruppe),
um die Leser von der Eignung des Bezugsnormals zu überzeugen.
Die Leberbiopsie ist stark von optimierten Leistungskriterien abhängig und
kann zur falschen Klassifizierung histologischer Sta dien aufgrund
der Inter-Beurteiler-Variationen und zu kleiner Probengrößen (< 10 mm) führen.
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Es
sind umfangreiche Nachforschungen nach biochemischen oder serologischen
Markern betrieben worden, welche die Fibroseverläufe bei Leberkrankheiten widerspiegeln
und die als Ersatz für
die Leberbiopsie dienen können.
In den letzten Jahren wurden ein paar nicht invasive oder minimal
invasive biochemische und serologische Marker untersucht, um die
Diagnose von Leberkrankheiten zu unterstützen. Es wurden insbesondere
Kombinationen von Markern benutzt, um Patienten nach ihrem Fibrosestadium
oder -grad zu kategorisieren.
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US-Patentschrift 6,631,330 offenbart
die Benutzung einer Kombination aus mindestens 4 biochemischen Markern,
die aus der Gruppe, bestehend aus α-2-Makroglobulin, Aspartat-Aminotransferase, γ-Glutamyltranspeptidase, γ-Globulin,
totales Bilirubin, Albumin, α-1-Globulin, α-2-Globulin,
Haptoglobin, β-Globulin, apoA1,
IL-10, TGF-β1,
apoA2 und ApoB ausgewählt
sind. Die erhaltenen Werte von 4 dieser Marker werden mathematisch
kombiniert, um das Vorhandensein von Leberfibrose zu bestimmen.
Mit dieser Marker-Prüfergruppe
kann eine Diagnosegenauigkeit von etwa 80 Prozent erreicht werden.
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Die
internationale Patentanmeldung
WO
2003/073822 beschreibt ein Verfahren zur Diagnose des Vorhandenseins
oder des Schweregrades von Leberfibrose bei einem Patienten. Dieses
Verfahren benutzt die Kombination von mindestens drei Markern, die α-2-Makroglobulin,
Hyaluronsäure
und Gewebeinhibitor von Metalloproteinase 1 (TIMP-1) sind. Mit diesem
Verfahren kann eine Diagnosegenauigkeit von etwa 80 Prozent (McHutchinson,
2004, siehe oben) erreicht werden.
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Es
besteht ein Bedarf an der Entwicklung eines nicht invasiven oder
minimal invasiven Verfahrens zum Errei chen einer höheren Diagnosegenauigkeit
bei der Bestimmung von Leberfibrose und an der Klassifizierung von
und Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Fibrose-Stadien auf
verläßlichere
Weise als bisher auf dem Stand der Technik bekannt ist, so daß die Beobachtung
der klinischen Entwicklung von Fibrose während der therapeutischen Behandlung
möglich
ist. Außerdem
sollte ein derartiges Verfahren zum laufenden Testen auf automatischen
Analysatoren geeignet sein.
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Beschreibung der Erfindung
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Das
Problem wird mittels eines Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung
gelöst.
Dieses Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins und/oder der Bestimmung
des Schweregrades einer Leberkrankheit in einer Probe aus einem
Patienten umfaßt
die folgenden Schritte:
- a) Messen des TIMP-1
(Gewebeinhibitor von Metalloproteinase I) in dieser Probe
- b) Messen von Ferritin in dieser Probe
- c) Messen eines zusätzlichen
Parameters ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus A2M (alpha-2-Makroglobulin) und PI (Prothrombin-Index)
in dieser Probe
- d) Diagnostizieren des Vorhandenseins und/oder des Schweregrads
einer Leberkrankheit auf Basis des Vorhandenseins oder der gemessenen
Konzentrationen an TIMP-1, Ferritin und dem gemäß Schritt c) gemessenen Parameter.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
eine verläßliche Unterscheidung
zwischen F0/F1 Fibrose und F2/F3/F4 Stadien. Des weiteren kann die
therapeutischen Überwachung
als Kontrolle der medizinischen Behandlung der Leberkrankheit mittels
des Verfahrens der Erfindung durchgeführt werden.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung korreliert stark mit den gut
gekennzeichneten Metavir-Stadien von hepatischer Fibrose. Ein besonderer
Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu
Verfahren des Stands der Technik besteht in seiner Benutzung einer
qualifizierenden Prüfergruppe,
um falsche Klassifizierungen der pathologischen Beobachtung und
statistischer Modelle zu minimieren.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt ein nicht invasives Verfahren,
das stark mit dem Schweregrad von Fibrose, wie mittels mehrerer
Verfahren bestimmt, korreliert: Leberbiopsie und weitere Verfahren,
wie etwa die Bestimmung des Fibrosebereiches.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung basiert auf einer statistisch
relevanten Gruppe von Proben aus Patienten mit gut gekennzeichneter
Leberfibrose, welche den gesamten Bereich von Metavir-Stadien abdecken,
und von Proben aus Testpersonen ohne hepatische Fibrose aufgrund
histologischer Funde (Metavir-Auswertung: 0). Die anfänglichen
Auswahlkriterien von Proben ist die Metavir-Auswertung. Diese Referenz wird
in einer Doppelevaluierung und auf optimierte Weise bestätigt, indem
Proben mit einer Größe von mehr als
15 mm benutzt wurden.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine verläßliche Vorhersage
von Fibrose mit einer Diagnosegenauigkeit (DG) von mindestens 82%,
vorzugsweise mindestens 84%. Da selbst das Bezugsnormal kein Goldstandard
von hepatischer Fibrose hinsichtlich optionaler falscher Klassifizierung
von Fibrose-Stadien ist und ferner zu Schmerzen und Gesundheitsrisiken
für den
Patienten führt,
stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Alternative
zur Biopsie dar.
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Das
Verfahren ermöglicht
die Untersuchung der Entwicklung und des Verlaufs von Fibrose, wobei
eine wirksame Verwaltung von Patienten mit chronischer HCV bereitgestellt
wird. Die Beobachtung der Krankheit bei Patienten mit chronischer
HCV kann in einem kurzen Zeitfenster im Vergleich zur Biopsie durchgeführt werden.
Das Verfahren ermöglicht
das Beobachten des Erfolges von Antifibrose-Therapie.
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Das
Verfahren ermöglicht
ebenfalls die Untersuchung der Entwicklung und des Verlaufs von
Fibrose bei Testpersonen mit chronischer hepatischer Verletzung.
Dies ist ein relativ häufiges
Leiden mit minimalen Symptomen aber mit längerfristigen Risiken bedeutender
Morbidität
und Mortalität,
die pathologisch durch anhaltende hepatische Nekrose und Entzündung der
Leber, oft begleitet von Fibrose, definiert wird. HCV ist die häufigste
Form von chronischer hepatischer Verletzung. Das Verfahren kann
auf weitere Formen von chronischer hepatischer Verletzung angewandt
werden: Alkoholische Steatohepatitis (ASH), alkoholische Fettlebererkrankung
(AFLD), nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) oder nichtalkoholische
Fettlebererkrankung (NAFLD). Die Verfahren der Erfindung können benutzt
werden, um den Schweregrad von NASH und NAFLD zu beobachten. Sie
können
benutzt werden, um Leberfibrose bei einer Einzelperson mit Virushepatitis
wie etwa Hepatitis A, B, C oder D Virus oder humanes Immunschwächevirus
(HIV), chronischer persistierender oder chronischer aktiver Hepatitis,
Autoimmunleberkrankheit wie etwa Autoimmunhepatitis und arzneimittelbedingte
Leberkrankheit; primäre
biliäre
Zirrhose, primär
sklerosierende Cholangitis, biliäre
Artresie, Leberkrankheit aufgrund medizinischer Behandlung oder
kongenitaler Leberkrankheit zu diagnostizieren. Diese Erfindung kann
zur Beobachtung der Behandlung mit einem Arzneimittel mit dem Risiko
von Leberkrankheit benutzt werden. Die Verfahren können zur
Diagnose des Vorhandenseins oder des Schweregrades von Fibrose und
zur Beobachtung von Fibrose benutzt werden, wobei Fibrose mit mehreren
Fibrosekrankheiten in Verbindung gebracht worden ist, die nicht
auf die Leber beschränkt
sind: Lungenfibrose, Nierenfibrose, Prostatafibrose und Brustfibrose
und weitere Fibrosen in einer anderen Krankheit.
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Kombinationen
von Parametern sind TIMP-1, Ferritin und A2M (auch SNIFF 3a genannt,
wobei SNIFF die französische
Abkürzung
für score
non-invasif de fibrose du foie, auf deutsch nicht invasive Auswertung
von Leberfibrose ist) mit einer Diagnosegenauigkeit von 82,6%; TIMP-1,
Ferritin und PI (SNIFF 3) mit einer Diagnosegenauigkeit von 84%;
und TIMP-1, Ferritin, PI, PLT, Harnstoff, Alter mit einer Diagnosegenauigkeit
von 84,7%. Diese bevorzugten Kombinationen sind auch in Tabelle
3 ersichtlich.
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Im
Sinne der vorliegenden Erfindung sind die bestimmten Begriffe und
Ausdrücke
wie folgt zu verstehen: Diagnosegenauigkeit (DG) ist die Genauigkeit
des Tests selbst. Dies bedeutet der Prozentsatz aller Tests, die
echt positiv oder echt negativ sind. Je höher die Diagnosegenauigkeit
desto verläßlicher
die Ergebnisse des Tests. Die DG wird als die Summe von echten Positiven
und echten Negativen, geteilt durch die Gesamtzahl an Probenergebnissen
berechnet und ist durch die Prävalenz
von Fibrose in dem analysierten Bestand betroffen.
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Der
Anhaltewert ist die arithmetisch berechnete Konzentration eines
einzigen Biomarkers oder einer Kombination aus mehreren Biomarkern
zur Unterscheidung zwischen gesundem und krankem Stadium. Im Verständnis der
Erfindung bedeutet Anhaltewert eine Auswertung von 0,5. Wenn der
Wert größer oder
gleich 0,5 (≥ 0,5)
ist, bedeutet das, daß das
Metavir-Stadium F2 erreicht worden ist zur Unterscheidung zwischen
keiner oder milder Fibrose (Metavir-Stadien F0 oder F1) und klinisch
bedeutender Fibrose-CSF (Metavir-Stadien F2, F3, F4).
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Der
positive prädiktive
Wert (PPW) ist der Prozentsatz von positiven Tests, die echt positiv
sind.
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Der
negativ prädiktive
Wert (NPW) ist der Prozentsatz von negativen Tests, die echt negativ
sind.
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Auswertung
bedeutet eine arithmetische Kombination aus mehreren Biomarkern,
die mit Fibrose in Verbindung stehen. Insbesondere weist die hierin
benutzte Auswertung einen Bereich zwischen 0 (minimale Fibrose)
und 1 (CSF: klinisch bedeutende Fibrose) auf.
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AUROC
bedeutet der Bereich unter der Gütefunktion
eines Tests (OC-Kurve). Bei diesen Kurven ist die Empfindlichkeit über den
Kehrwert der Spezifität
aufgetragen. Ein Bereich unter der ROC-Kurve von 1,00 würde ein
Ideal von 100 Prozent Empfindlichkeit und 100 Prozent Spezifität angeben.
Je größer die
Neigung am Anfang der Kurve desto besser das Verhältnis zwischen
Empfindlichkeit und Spezifität
eines Tests.
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Die
Empfindlichkeit ist die Wahrscheinlichkeit eines positiven Testergebnisses
bei einem Patienten mit einer Krankheit oder einem Risikofaktor
oder einem anderen Gesundheitszustand.
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Die
Spezifität
ist die Wahrscheinlichkeit eines negativen Ergebnisses bei einem
Patienten, der die Krankheit nicht hat.
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TIMP-1
(Gewebeinhibitor von Metallproteinase I) ist ein 184-Aminosäure-Sialoglycoprotein
mit einem Molekulargewicht von 28,5 kDa (siehe z. B. Murphy et al.,
Biochem. J. 1981, 195, 167–170),
das Metalloproteinasen wie interstitielle Collagenase MMP-1 oder
Stromelysin oder Gelatinase B inhibiert. Im Verständnis der vorliegenden
Erfindung umspannt der Begriff TIMP-1 ein Protein mit bedeutender
struktureller Homologie gegenüber
humaner TIMP-1 inhibierender proteolytischen Aktivität von Metalloproteinasen.
Das Vorhandensein von humaner TIMP-1 kann unter Benutzung von Antikörpern nachgewiesen
werden, die spezifisch Epitope von TIMP-1 nachweisen. TIMP-1 kann
ebenfalls durch den Nachweis von damit verbundenen Nukleinsäuren wie etwa
der entsprechenden mRNA bestimmt werden.
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Ferritin
ist ein Makromolekül
mit einem Molekulargewicht von mindestens 440 kD, je nach Eisengehalt, und
besteht aus einer Proteinschale (Apoferritin) aus 24 Untereinheiten
und einem Eisenkern, der durchschnittlich annähernd 2500 Fe3+ Ionen
enthält
(in Leber- und Milzferritin). Ferritin neigt dazu, Oligomere zu
formen. Mindestens 20 Isoferritine können mit Hilfe von isoelektrischer
Fokussierung unterschieden werden. Diese Mikroheterogenität rührt von
den Unterschieden zwischen den Inhalten der säurehaltigen H und schwach basischen
L Untereinheiten. Die basischen Isoferritine sind für die längerfristige
Eisenlagerungsfunktion verantwortlich und können hauptsächlich in der Leber, der Milz
und im Knochenmark gefunden werden.
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Die
Bestimmung von Ferritin ist ein geeignetes Verfahren zur Ermittlung
des Eisenmetabolismuszustands. Die Bestimmung von Ferritin zu Beginn
der Therapie stellt eine darstellende Maßnahme der Reserven im Körper bereit.
Vom klinischen Standpunkt her gesehen hat sich ein Grenzwert von
etwa 20 ng/ml als nützlich beim
Nachweis von prälatentem
Eisenmangel erwiesen. Dieser Wert liefert eine verläßliche Angabe
des Verbrauchs der Eisenreserven, die zur Hämoglobinsynthese mobilisiert
werden können.
Latenter Eisenmangel wird als ein Rückgang unter die 12 ng/ml Grenze
definiert. Zur Manifestation einer Eisenüberlastung im Körper wird
ein Grenzwert von mehr als 400 ng/ml als nützlich angesehen.
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Zum
Nachweis von Ferritin kann ein klassischer Immunoassay (Sandwich-Methode)
benutzt werden, wobei zwei für
Ferritin spezifische Antikörper
benutzt werden, um im Assay einen Sandwich-Komplex zu bilden. Einer
der Antikörper
bindet zu einer festen Phase und der andere Antikörper trägt ein Label,
dessen Signal als Nachweismittel für das Vorhandensein von Ferritin
benutzt wird.
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Der
PI (Prothrombin-Index) ist nützlich,
um Interferenzen im Koagulationssystem nachzuweisen und kann durch
die Zugabe von Thromboplastin zur Plasmaprobe und die Messung des
Zeitpunktes der Koagulation in Sekunden (sogenannte Quicktime) bestimmt
werden. Dieser Wert wird mit einem internationalen normalisierten
Verhältnis
korreliert, das einen Korrekturfaktor enthält, der die Empfindlichkeit
des benutzten Thromboplastins berücksichtigt.
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A2M
(α-2-Makroglobulin)
ist ein konserviertes Protein, das in Plasma reichlich vorhanden
ist, das als Protease bindendes Protein dient, um die aktive Protease
von Gewebeflüssigkeiten
zu reinigen. A2M deaktiviert die katalytische Aktivität einer
Protease nicht, wirkt jedoch durch physikalisches Festhalten der
Target-Protease
durch das Einwickeln der Protease. Eine durch A2M festgehaltene
Protease wird somit sterisch daran gehindert, ihre Substratproteine
zu spalten. Im Sinne der Erfindung kann A2M mittels eines Immunoassays
unter Benutzung spezifischer Antikörper gemäß Testformaten, die einem Fachmann
bekannt sind, nachzuweisen. A2M kann ebenfalls durch den Nachweis
damit verbundener Nukleinsäuren
wie etwa die entsprechende mRNA bestimmt werden.
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Es
werden auch zusätzliche
biochemische oder klinische Parameter beschrieben. Zusätzliche
biochemische Parameter können
beliebige Parameter sein, die direkt oder indirekt mit dem Metabolismus
oder der Struktur der Leber verbunden sind, zum Beispiel Harnstoff,
GGT (gamma-Glutamyltransferase), Hyaluronat, AST (Aspartat-Aminotransferase),
MMP-2 (Matrix-Metalloproteinase-2), ALT (Alanin-Aminotransferase),
PIIINP (N-terminal Propeptid des Typ III Procollagens), Bilirubin,
Haptoglobin, ApoA1, PLT (Anzahl Plättchen). Es können ebenfalls
Hepcidin oder Adiponectin bestimmt werden.
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Hepcidin
ist ein hepatisches Protein, das ursprünglich als zirkulierendes antimikrobielles
Peptid identifiziert wurde. Es ist ein Hauptmitwirkender bei der Übertragung
von Körper-Eisenvorräten zu absorptionsfähigen Darmzellen.
Adiponectin wird von den Adipocyten abgesondert und in relativ hohen
systemischen Konzentrationen zirkuliert, um die metabolische Funktion
zu beeinflussen. Verminderte Serum-Adiponectingehalte geben ein
erhöhtes
Risiko von Krankheit an, zum Beispiel den Schweregrad von nichtalkohlischer
Fettlebererkrankung (NAFLD) oder nichtalkoholischer Steatohepatitis
(NASH).
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Es
werden ebenfalls zusätzliche
klinische Parameter offenbart, wie etwa Alter, Geschlecht, Gewicht, Ernährungsverhalten
des Patienten.
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Harnstoff,
GGT (gamma-Glutamyltransferase), Hyaluronat, AST (Aspartat-Aminotransferase)
und ALT (Alanin-Aminotransferase), MMP-2, PIIINP Bilirubin, Haptoglobin,
ApoA1, Hepcidin und Adiponectin werden mittels im Handel erhältlicher
Test-Kits durch immunologische oder fotometrische Verfahren, die
einem Fachmann bekannt sind, bestimmt. Bei Bedarf können auch
Hybridisierungstechniken zum Nachweis von Nukleinsäuren für einen
Analyten oder Parameter (wie etwa die entsprechende mRNA) zur Bestimmung
eines Parameters benutzt werden.
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PLT
(Anzahl Blutplättchen)
ist die Anzahl an Blutplättchen
und wird durch das Zählen
der Plättchen unter
Benutzung eines im Handel erhältlichen
Zählers
bestimmt.
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Die
Erfindung macht von der Bestimmung mehrerer Parameter Gebrauch.
Daher wird der Nachweis von diesen biochemischen und serologischen
Parametern der Erfindung, der in Testformaten, die eine feste Phase
benutzen, durchgeführt
werden kann, vorzugsweise auf miniaturisierten auf Arrays basierenden
Testsystemen durchgeführt,
wie in
US 2003/0017616 oder
WO 99/67643 beschrieben.
Diese Testsysteme weisen mehrere räumlich definierte Testbereiche
auf, wovon jeweils jeder zum Nachweis eines einzigen spezifischen Analyts
oder Parameters benutzt werden kann. Mehrere Analyten können somit
in einem einzigen Testlauf nachgewiesen werden.
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Der
Begriff definierte Testbereiche auf einer festen Phase bedeutet,
daß die
Testbereiche definierte Regionen der soliden Phase umfassen, die
vorzugsweise räumlich
von anderen Testbereichen durch inerte Regionen getrennt sind. Die
definierten Testbereiche weisen vorzugsweise einen Durchmesser von
10 μm bis 1
cm und besonders bevorzugt 10 μm
bis 5 mm auf. Miniaturisierte Testbereiche mit einem Durchmesser
von 10 μm
bis 2 mm sind am meisten bevorzugt. Feste Phasen mit mehreren Testbereichen,
die auch als Array-Systeme bezeichnet werden, werden bevorzugt.
Derartige Array-Systeme sind zum Beispiel in Ekins und Chu (Clin.
Chem. 37, 1995, 1955–1967)
und in den
US-Patentschriften
Nr. 5,432,099 ,
5,516,635 und
5,126,276 beschrieben. Wie
vorher erwähnt,
besteht ein Vorteil von Array-System darin, daß mehrere Analyt- und Kontrollbestimmungen
gleichzeitig auf einer Probe durchgeführt werden können. Die
Benutzung von Kontrollbereichen zum Nachweis unspezifischer bindender
und/oder störender
Proben kann die Verläßlichkeit
der Ergebnisse bedeutend verbessern, insbesondere bei miniaturisierten
Array-Testsystemen.
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In
der vorliegenden Erfindung könnte
der Nachweis von TIMP-1, Ferritin und ferner A2M oder PI zum Beispiel
gleichzeitig unter Benutzung eines derartigen Array basierenden
Testsystems durchgeführt
werden.
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Nach
der Erfindung ist die feste Phase ein beliebiger herkömmlicher
Träger
für Nachweisverfahren, vorzugsweise
ein nicht poröser
Träger,
z. B. ein Träger
mit einer Kunststoff-, Glas-, Metall- oder Metalloxidoberfläche. Poröse Träger, wie
etwa Teststreifen, sind ebenfalls geeignet. Räumlich getrennte Regionen (Testbereiche)
befinden sich auf diesem Träger.
Immobilisierte feste Phase-Rezeptoren werden auf diese Testbereiche
aufgetragen. Die feste Phase-Rezeptoren werden mittels bekannter
Verfahren immobilisiert, z. B. durch direktes adsorptives Binden,
kovalentes Koppeln oder durch Koppeln über mit hoher Affinität bindende
Paare, z. B. Streptavidin (oder Avidin)/Biotin, Antigen/Antikörper oder
Zucker/Lecithin. Das Vorhandensein oder/und die Menge an Analyt
in einer Probe kann durch spezifisches Binden von Komponenten aus
dem Nachweismedium bestimmt werden, z. B. aus dem zu bestimmenden
Analyten oder aus einem Analyten, der analog zum feste Phase-Rezeptor
ist.
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Der
Nachweis des Analyten und – bei
Bedarf – der
Nachweis des Vorhandenseins störender
Reaktionen wird im Verfahren nach der Erfindung auf bekannte Weise
unter Benutzung geeigneter Markergruppen, z. B. fluoreszierender
Markergruppen, erreicht. Als Alternative dazu ist es mit geeigneten
festen Phasen möglich, ebenfalls
die Wechselbeziehung von Komponenten des Nachweismediums mit den
Test- und optional Kontrollbereichen nachzuweisen, indem die Schichtdicke
des jeweiligen Bereichs z. B. durch Plasmonresonanz-Spektroskopie
bestimmt wird.
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Bei
Array-Systemen, bei denen mehrere Analyten aus einer Probe gleichzeitig
nachgewiesen wurden, wird vorzugsweise eine universelle Markergruppe
benutzt, die ein gleichzeitiges Nachweisen mehrerer unterschiedlicher
Analyten in unterschiedlichen Testbereichen ermöglicht. Ein Beispiel derartiger
universeller Markergruppen sind Markergruppen, die einen Rezeptoren
tra gen, der spezifisch mit einem komplementären Rezeptor auf einem Testreagens,
z. B. ein löslicher
Rezeptor für
einen zu bestimmenden Rezeptoren oder für ein Analytanalogon (wie etwa
Antikörper/Antigen
oder Streptavidin/Biotin usw.) Wechselwirken kann.
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Der
Begriff Probe bedeutet ein biologisches Probestück, das mindestens einen der
Marker nach der Erfindung enthält
oder vorgeblich enthält.
Zum Beispiel können
Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Gelenkwasser oder Lebergewebe
als Probe benutzt werden. Fluidproben können vor der Analyse bei Bedarf
verdünnt werden.
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Um
ein Ergebnis zu erhalten, das bei der Diagnose der Krankheit behilflich
ist, werden mathematische Algorithmen benutzt, die einem Fachmann
bekannt sind.
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Die
erhaltenen Daten werden kombiniert und mittels statistischer Verfahren
wie etwa logistische binäre Regression
evaluiert, was zu Auswertungen führt.
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1 zeigt
Ausgangsdaten, wie an 120 Patienten, die an einer Infektion mit
HCV leiden, gemessen.
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Vergleichsbeispiel
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Es
wurden im Handel erhältliche
Test-Kits benutzt und alle Tests wurden nach den Herstelleranweisungen,
wie unten angegeben, durchgeführt. Tabelle 1
| Biomarker | Verfahren | Lieferant |
| AST,
ALT | Klinische
Blutchemie | Roche
Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland |
| GGT | Klinische
Blutchemie | Roche
Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland |
| Bilirubin | Klinische
Blutchemie | Roche
Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland |
| Harnstoff | Klinische
Blutchemie | Roche
Diagnostics GmbH Mannheim, Deutschland |
| A2M | Nephelometrie | Dade
Behring Marburg GmbH |
| Apo
A1 | Nephelometrie | Dade
Behring Marburg GmbH |
| Plättchen | Anzahl
Plättchen | Bayer
Diagnostics |
| PI | Koagulationszeit | Diagnostica
Stago |
| Hyaluronat | Elisa | Corgenix
Inc. |
| PIIINP | RIA | Cis
Bio International |
| YKL-40 | Elisa | Quidel
Corporation |
| TIMP1 | Elisa | Amersham
Pharmacia |
| MMP2 | Elisa | Amersham
Pharmacia |
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1 zeigt
Ausgangsdaten, wie an Proben von 120 Patienten, die an einer Infektion
mit HCV leiden, gemessen. Um die Daten zu erhalten, wurden die oben
aufgeführten
Test-Kits benutzt.
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In
Tabelle 2 werden die Diagnosegenauigkeit und die AUROC-Werte aufgeführt. Es
ist ersichtlich, daß jeder
einzelne Marker eine DG unter 80% aufweist. Tabelle 2
| Biomarker | Diagnose-Genauigkeit | Korrelation | AUROC |
| % | p | r | p | c | p |
| A2M | 76,7 | < 10–4 | 0,523 | < 10–4 | 0,800 | < 10–4 |
| TIMP
1 | 72,3 | < 10–4 | 0,663 | < 10–4 | 0,813 | < 10–4 |
| Ferritin | 71,7 | < 10–4 | 0,433 | < 10–4 | 0,771 | < 10–4 |
| HA | 71,7 | 0,002 | 0,561 | < 10–4 | 0,762 | < 10–4 |
| Plättchen | 70,8 | < 10–4 | –0,523 | < 10–4 | 0,259 | < 10–4 |
| AST | 69,2 | < 10–4 | 0,444 | < 10–4 | 0,782 | < 10–4 |
| Prothrombin-Index | 69,2 | < 10–4 | –0,444 | < 10–4 | 0,265 | < 10–4 |
| GGT | 67,5 | 0,002 | 0,229 | 0,012 | 0,721 | < 10–4 |
| MMP
2 | 67,2 | < 10–4 | 0,451 | < 10–4 | 0,711 | < 10–4 |
| ALT | 66,7 | 0,002 | 0,311 | 0,001 | 0,696 | < 10–4 |
| YKL
40 | 65,3 | 0,001 | 0,480 | < 10–4 | 0,661 | 0,002 |
| Alter | 62,5 | 0,001 | 0,345 | < 10–4 | 0,706 | < 10–4 |
| P3P | 62,5 | 0,02 | 0,337 | < 10–4 | 0,626 | 0,019 |
| Bilirubin | 61,7 | 0,02 | 0,107 | 0,247 | 0,628 | 0,017 |
| Haptoglobin | 61,7 | 0,01 | –0,285 | 0,002 | 0,356 | 0,007 |
| ApoA1 | 60,0 | 0,03 | –0,229 | 0,012 | 0,361 | 0,009 |
| Geschlecht | 53,3 | 0,37 | - | - | - | - |
| Harnstoff | 51,7 | 0,28 | –0,058 | 0,527 | 0,470 | 0,572 |
-
Tabelle
3 zeigt einen Vergleich zwischen DG/AUROC mittels Verfahren des
Stands der Technik. Es hat sich gezeigt, daß die Verfahren der vorliegenden
Erfindung eine bessere Diagnosegenauigkeit von klinisch bedeutender
Fibrose mittels binärer
logistischer Regression aufweisen im Vergleich mit den Verfahren
aus
US 6,631,330 und
WO 2003/073822 . Tabelle 3
| Verfahren | Gewählte Marker | n
Var | n
Pk | R2 | DG | AUROC |
| | PLT,
PI, Harnstoff, Fer, Alter, TIMP | 6 | 118 | 0,689 | 84,7 | |
| | TIMP,
Fer, PI | 3 | 119 | 0,629 | 84,0 | 0,904 |
| | TIMP,
Fer, A2M | 3 | 118 | | 82,6 | 0,886 |
| WO 2003/073822 | TIMP,
HA, A2M | 3 | 118 | | 80,7 | 0,898 |
| US 6,631,330 (Fibrotest) | A2M,
Alter, Hapto, Apo, Bili, GGT, Geschlecht | 7 | 120 | 0,518 | 80,8 | 0,857 |
| US 6,631,330 | A2M, | 4 | 120 | 0,487 | 77,5 | 0,859 |
| | Alter,
Apo, GGT | | | | | |
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SCHLÜSSEL ZU DEN FIGUREN
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- EN: 1/1
- DE: 1/1
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- DE: Seite 1
- EN: Sample No.
- DE: Probe Nr.
- EN: Biopsy Sample (mm)
- DE: Biopsie-Probe (mm)
- EN: Metavir Stage
- DE: Metavir-Stadium
- EN: Age (years)
- DE: Alter (Jahre)
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- DE: Geschlecht (1:M; 2:W)
- EN: Platelets (Giga/l)
- DE: Plättchen
(Giga/l)
- EN: Urea (mmol/l)
- DE: Harnstoff (mmol/l)
- EN: Hyaluronate
- DE: Hyaluronat
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