DE69921668T2 - Nachweis und bestimmung von stufen der coronaren arterienerkrankung - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der koronaren Arterienerkrankung. Genauer gesagt, bezieht sie sich darauf, mit einem klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit zu detektieren, ob ein menschlicher Patient aus der allgemeinen Population eine koronare Arterienerkrankung ("CAD", coronary artery disease) hat und falls ja, mit einem klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit zu bestimmen, welches Stadium der CAD der Patient hat.
  • Stand der Technik
  • D. Steinberg, "Lewis A. Conner Memorial Lecture, Oxidative Modification Of LDL And Atherogenesis", Circulation 1997, 95: 1062–1071, bemerkt, dass Todesfälle aufgrund von koronarer Herzerkrankung weiterhin die Anzahl an Todesfällen aufgrund jeglicher anderen einzelnen Ursache in den Vereinigten Staaten übertreffen. Kolata, "A New Generation Of Tests To Determine Heart Trouble", New York Times News Service (26. November 1995) berichtet, dass die Hälfte der 600.000 Amerikaner, die jedes Jahr Herzattaken haben, zuvor keine Symptome haben und bis zu 30 % der Herzerkrankungspatienten keine offensichtlichen Risikofaktoren, wie hohen Blutdruck, hohe Cholesterinspiegel, Diabetes oder eine Familiengeschichte von Herzerkrankungen aufweisen.
  • Die Fähigkeit, ganau zu bestimmen, ob ein Patient eine koronare Arterienerkrankung aufweist und falls ja, welches Stadium der Patient hat, ist ein langjähriges (aber bislang unerreichtes) Ziel der medizinischen Wissenschaft gewesen. Es sind viele Versuche unternommen worden, monoklonale Antikörper bereitzustellen, die in Menschen oder anderen Tieren verschiedene niedrigdichte Lipoproteinsubstanzen ("LDL") und/oder Substanzen erkennen, die mit Arteriosklerose und/oder Thrombose assoziiert sein können. Auch hat es Versuche gegeben, Verfahren zum Bestimmen möglicher Marker für Arteriosklerose und eine Koronarverletzung bereitzustellen. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,024,829, 5,026,537, 5,120,834, 5,196,324, 5,223,410, 5,362,649, 5,380,667, 5,396,886, 5,453,359, 5,487,892, 5,597,726, 5,658,729, 5,690,103 und 5,756,067, EP-Offenlegungsschrift 0 484 863 A1; PCT/EP 97/03287 (unveröffentlichte Anmeldung); PCT/EP 97103493 (unveröffentlichte Anmeldung); PCT-Veröffentlichung WO 94/23302; Adams et al., "Cardiac Troponin I. A Marker With High Specificity For Cardiac Injury", Circulation 1993; 88(1): 101–106; American Biogenetic Sciences Inc., 1995, Annual Report, 24 Seiten (1995), American Biogenetic Sciences, Focus on Diagnostic Tests: A Technology Analysis, Updated Full Report, Paisley und Habermas, Inc. (3. Juni 1996); Antman et al., "Cardiac-Specific Troponin I Levels To Predict The Risk Of Mortality In Patients With Acute Coronary Syndromes", N. Eng. J. Med. 1996; 335(18): 1342–1349; AtheroGenics, Inc. Web Site (WWW.ATHEROGENICS.COM); Hamm et al., "Emergency Room Triage Of Patents With Acute Chest Pain By Means Of Rapid Testing For Cardiac Troponin T Or Troponin I", N. Eng. J. Med. 1997; 337(23): 1648–1653; Hammer et al., "Generation, Characterization, And Histochemical Application Of Monoclonal Antibodies Selectively Recognizing Oxidatively Modified ApoB-Containing Serum Lipoproteins", Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1995; 15(5): 704–713; Hoff et al., "Lesion-Derived Low Density Lipoprotein And Oxidized Low Density Lipoprotein Share A Lability For Aggregation, Leading To Enhanced Macrophage Degradation", Arterioscler. Thromb. 1991; 11(5): 1209–1222; Hoffmeister et al., "Alterations Of Coagulation And Fibrinolytic And Kallikrein-Kinin Systems In The Acute And Post-Acute Phases In Patients With Unstable Angina Pectoris", Circulation 1995; 91(10): 2520–2527; Holvoet, Collen et al., "Stimulation With A Monoclonal Antibody (mAb4E4) Of Scavenger Receptor-Mediated Uptake Of Chemically Modified Low Density Lipoproteins By THP-1-Derived Macrophages Enhances Foam Cell Generation", J.Clin. Invest. 1994; 93: 89–98; Holvoet und Collen, "β-VLDL Hypercholesterolemia Is Associated With Higher Levels Of Oxidized Lipoproteins And A More Rapid Progression Of Coronary Atherosclerosis In Rabbits", Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. November 1997; 17(11): 2376–2382; Holvoet und Collen, "Oxidized Lipoproteins In Atherosclerosis And Thrombosis", FASEB J. 1994; 8: 1279–1284; Holvoet and Collen, "Malondialdehyde-Modified Low Density Lipoproteins In Patients With Atherosclerotic Disease", J. Clin. Invest. 1995; 95: 2611–2619; Holvoet, Collen et al., "Correlation Between Oxidized Low Density Lipoproteins And Von Willebrand Factor In Chronic Renal Failure", Thromb. Haemost. 1996; 76(5): 663–669; Holvoet, Collen et al., "Correlation Between Oxidized Low Density Lipoproteins And Coronary Artery Disease In Heart Translant Patents", Zusammenfassung veröffentlicht im "Final Programme" des 66sten Kongresses der European Atherosclerosis Society, Florenz (Italien), 13.–14. Juli 1996; Abstract Book, Seite 47; Holvoet, Collen et al., "Oxidized Low Density Lipoproteins In Patients With Transplant-Associated Coronary Artery Disease", Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., Januar 1998; 18(1): 100–107; Holvoet, Collen et al., Presentation der 70sten wissenschaftlichen Sitzung der "American Heart Association", Orlando, Florida, 9.–12. November and veröffentlicht als Zusammenfassung in Circulation 1997; 96(Suppl. I): I417 (Zusammenfassung 2328); Itabe et al., "A Monoclonal Antibody Against Oxidized Lipoprotein Recognizes Foam Cells In Atherosclerotic Lesions: Complex Formation Of Oxidized Phosphatidylcholines And Polypeptides", J. Biol. Chem. 1994; 269(21): 15274–15279; Itabe et al., "Sensitive Detection Of Oxidatively Modified Low Density Lipoprotein Using A Monoclonal Antibody", J. Lipid Res. 1996; 37: 45–53; Kolata, "A New Generation Of Tests To Determine Heart Trouble", New York Times New Service (26. November 1995); Kotani et al., "Distribution Of Immunoreactive Malondialdehyde-Modified Low-Density Lipoprotein In Human Serum", Biochimica et Biophysica Acta 1994; 1215: 121–125; Menschikowski et al., "Secretory Group II Phospholipase A2 In Human Atherosclerotic Plaques", Atherosclerosis 1995; 118: 173-181; Muldoon et al., "C-Reactive Protein And Serum Amyloid A Protein In Unstable Angina", N. Engl. J. Med. 1995; 332(6); 398–400; Ohman et al., "Cardiac Troponin T Levels For Risk Stratification In Acute Myocardial Ischemia", N. Eng. J. Med. 1996 335(18): 1333–1341; Palinski et al., "Antisera And Monoclonal Antibodies Specific For Epitopes Generated During Oxidative Modification Of Low Density Lipoprotein", Arteriosclerosis 1990; 10(3): 325–335; Ravalli et al., "Immunohistochemical Demonstration Of 15-Lipoxygenase In Transplant Coronary Artery Disease", Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1995; 15(3): 340–348; Reade et al., "Expression Of Apolipoprotein B Epitopes In Low Density Lipoproteins Of Hemodialyzed Patients"; Kidney Int. 1993; 44: 1360–1365; Reverter et al., "Platelet Activation During Hemodialysis Measured Through Exposure Of P-Selectin: Analysis By Flow Cytometric And Ultrastructural Techniques", J. Lab. Clin. Med. 1994; 124(1): 79–85; Salonen et al., "Autoantibody Against Oxidised LDL And Progression Of Carotid Atherosclerosis"; Lancet 1992; 339(8798): 883–887; Uchida et al.; "Protein-Bound Acrolein: Potential Markers For Oxidative Stress", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95:4882–4887; und Van de Werf, "Cardiac Troponins In Acute Coronary Syndromes", N. Eng. J. Med. 1996; 335(18): 1388–1389.
  • Adams et al., "Cardiac Troponin I. A Marker With High Specificity For Cardiac Injury", Circulation 1993; 88(1): 101–106 zeigen auf, dass kardiales Troponin I hochspezifisch für eine myokardiale Verletzung ist und dass seine Verwendung die Unterscheidung erleichtern sollte, ob Erhöhungen von MBCK aufgrund einer myokardialen oder einer Skelettmuskelverletzung gegeben sind.
  • Holvoet et al., "Oxidized Low Density Lipoproteins In Patients With Transplant-Associated Coronary Artery Disease", Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. Januar 1998; 18(1): 100–107 berichten, dass ein den monoklonalen Antikörper mAb-4E6 verwendender ELISA verwendet wurde, um die Spiegel von OxLDL im Plasma von Kontrollpatienten, Transplantationspatienten (Herztransplantationen) bei Dilationskardiomyopathie und Transplantationspatienten (Herztransplantate) bei koronarer Arterienerkrankung zu quantifizieren.
  • Die PCT-Offenlegungsschrift WO 94/23302 betrifft die Immunodetektion (z.B.ELISA) von oxidativ-modifizierten niedrigdichtem Lipoprotein, dagegen gerichteten Antikörpern (vorzugsweise monoklonalen Antikörpern) oder einen Immunkomplex derselben in biologischem Fluid und merkt an, dass monoklonale Antikörper nützlich für die Detektion von oxidativ-modifizierten niedrigdichten Lipoproteinen im menschlichen Plasma sind.
  • Holvoet et al., "Malondialdehyde-Modified Low Density Lipoproteins In Patients With Atherosclerotic Disease", J. Clin. Invest. 1995; 95: 2611–2619, diskutieren den monoklonalen Antikörper mAb-1H11, der gegen MdA-modifiziertes LDL gezüchtet wurde und verwendet wurde, um ein quer-reagierendes Material in humanem atheromatösem Gewebe und im Plasma zu detektieren.
  • Jedoch gibt es, wie in der Literatur angemerkt, kein derzeitig verfügbares Verfahren, um mit einem klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen einer koronaren Arterienerkrankung in einem Patienten zu bestimmen, und falls die Erkrankung vorliegt, mit einem klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit zwischen den nicht-akuten (d.h. chronischen) und akuten Stadien dieser akuten Krankheit zu unterscheiden, wobei die nicht-akuten Stadien stabile Angina pectoris und vorgeblich asymptomatische koronare Arterienerkrankung sind und die akuten Stadien instabile Angina pectoris und akuter myokardialer Infarkt sind.
  • Beispielsweise merkt US-Patent Nr. 5,380,667 (erteilt am 10. Januar 1995) an, dass die meisten Individuen mit einer Herzerkrankung bis zu ihrer ersten Herzattacke weitgehend asymptomatisch sind, dass die soweit im Stand der Technik identifizierten Hauptrisikofaktoren keine perfekten Prädikatoren sind (insbesondere zur Vorhersage des Risikos von koronarer Arterienerkrankung in einem einzelnen Individuum) und dass 30 bis 40 % der Population immer noch unter Verwendung der bekannten Hauptrisikofaktoren fehldiagnostiziert werden (Spalte 1, Zeilen 31–39).
  • Hlatky MA, "Evaluation Of Chest Pain In The Emergency Department", N. Eng. J. Med., Dezember 1997, 337(23): 1687–1689 berichtet, dass, nachdem Patienten in der Notfallabteilung mit einem deutlichen akuten myokardialen Infarkt identifiziert worden sind, die verbleibenden Patienten schwieriger herauszufinden sind; dass auf myokardiale Ischämie hinweisende Symptome in Ruhe, die mehr als 15 Minuten andauern, ein relativ hohes Kurzzeitrisiko anzeigen, möglicherweise aufgrund ihrer Assoziierung mit zerrissenen koronaren Plaques; dass weitere für Patienten verwendete Tests solche beinhalten, die einen Defekt in der myokardialen Perfusion, Abnormalitäten bei der linken Ventrikularwandbewegung oder subtile Evidenz einer myokardialen Nekrose durch empfindliche Analysen intrazellulärer Proteine (z.B. CK-MB-Isoenzym, Myoglobin, Troponin T und Troponin I) identifizieren; dass selbst ein hochsensitiver Marker für myokardiale Nekrose bei einem Patienten mit akuter myokardialer Ischämie nicht notwendigerweise positiv ist und dass Patienten, die sich zum ersten Mal mit Brustschmerz vorstellen, normalerweise weitere Tests brauchen, um die Wahrscheinlichkeit einer vorliegenden Koronarerkrankung festzustellen und eine geeignete Therapie einzuleiten.
  • Das US-Patent Nr. 5,756,067 (erteilt am 26. Mai 1998) merkt an, dass derzeit erhältliche Tests zum Messen des Risikos der Entwicklung von Arteriosklerose das Messen des Plasmagehalts an Cholesterin, Triglyceriden und Lipoproteinen beinhalten, dass aber klar ist, dass diese Tests nicht schlüssig sind, weil ungefähr die Hälfte der Herzerkrankungen aufgrund von Arteriosklerose bei Patienten mit Plasmatriglyceriden und Cholesterin innerhalb des normalen Bereichs der Population auftreten und weil bei Patienten mit normalen Lipidspiegeln eine angiographische Evidenz von Arteriosklerose gefunden worden ist.
  • N. Sasavage, "Predicting Coronary Artery Disease, New Markers Could Identify Patents At Risk", Clin. Lab. News, März 1998, S. 6–7, schlägt vor, dass die Oxidation von niedrigdichten Lipoproteinen sie atherogener machen können, und dass das Detektieren oxidierter LDL-Arten einige technische Schwierigkeiten bereitet und zeigt auf, dass die koronare Arterienerkrankung eine multifaktorielle Erkrankung zu sein scheint. Er führt auch aus, dass diejenigen, die in diesem Gebiet arbeiten, darin übereinstimmen, dass die Entwicklung einer neuen Generation von biochemischen Markern den Klinikern gestatten wird, das Patientenrisiko besser einzuschätzen und mit Behandlungen einzugreifen, um schlechte Ergebnisse zu vermeiden.
  • Damit besteht ein signifikanter Bedarf an einem Verfahren, das mit einem klinisch hinreichenden Ausmaß an diagnostischer Genauigkeit eine koronare Arterienerkrankung detektieren und zwischen ihren Stadien unterscheiden kann.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Es ist nunmehr eine diesen Bedarf befriedigende und Vorteile und Nutzen aufweisende Erfindung, die dem Fachmann ersichtlich sein werden, entwickelt worden. Generell stellt diese Erfindung ein Verfahren mit einem klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit zum Detektieren des Vorliegens von und zum Unterscheiden zwischen den nicht-akuten und akuten Stadien der koronaren Arterienerkrankung für einen menschlichen Patienten aus der allgemeinen Population bereit, wobei das nicht-akute Stadium der koronaren Arterienerkrankung die asymptomatische koronare Arterienerkrankung und stabile Angina pectoris ist und die akuten Stadien der koronaren Arterienerkrankung instabile Angina pectoris und akuter myokardialer Infarkt sind, wobei das Verfahren das Durchführen von Schritt (b) und das Durchführen von zumindest einem der Schritte (a) und (c) umfasst:
    • (a) Testen einer Probe aus einem Patienten auf eine klinisch signifikante Anwesenheit eines ersten Markers, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen einer koronaren Arterienerkrankung anzeigt, wobei der erste Marker OxLDL umfasst, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100-Einheit umfasst;
    • (b) Testen einer Probe aus dem Patienten auf eine klinisch signifikante Anwesenheit eines zweiten Markers, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten Stadiums von koronarer Arterienerkrankung anzeigt, wobei der zweite Marker MDA-modifiziertes LDL umfasst, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100-Einheit enthält; und
    • (c) Testen einer Probe aus dem Patienten auf eine klinisch signifikante Anwesenheit eines dritten Markers, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten myokardialen Infarkts anzeigt, wobei der dritte Marker ein Herzprotein umfasst;
    • (d) wobei die Diagnose, die auf den Ergebnissen von Schritt (b) und zumindest einem der Schritte (a) und (c) basiert, ist:
    • (i) die Abwesenheit einer koronaren Arterienerkrankung, falls keiner der ersten, zweiten und dritten Marker über seinen jeweiligen vorgegebenen Pegel vorhanden ist;
    • (ii) nicht-akute koronare Arterienerkrankung, falls der erste Marker, nicht aber der zweite oder dritte Marker, oberhalb seines jeweiligen vorgegebenen Pegels vorhanden ist;
    • (iii) instabile Angina pectoris, falls jeder der ersten und zweiten Marker, nicht aber der dritte Marker, über seinem jeweiligen vorgegebenen Pegel vorhanden ist;
    • (iv) akuter myokardialer Infarkt atherosklerotischen Ursprungs, falls jeder der ersten zweiten und dritten Marker über seinem jeweiligen vorgegebenen Pegel vorhanden ist, und
    • (v) akuter myokardialer Infakt nicht-atherosklerotischen Ursprungs, falls weder der erste noch der zweite Marker, aber der dritte Marker über seinem jeweiligen vorgegebenen Pegel vorhanden ist.
  • Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung werden die Schritte (a) und (b), aber nicht (c) verwendet, bei anderen Ausführungsformen Schritt (b) und (c), aber nicht (a) verwendet und in noch anderen Ausführungen werden alle drei Schritte (a), (b) und (c) verwendet.
  • Bei einigen Ausführungsformen ist der erste Marker ein erstes atherogenes Protein, das vorzugsweise OxLDL umfasst, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält. Bei einigen Ausführungen ist der zweite Marker ein zweites atherogenes Protein, das vorzugsweise MDA-modifiziertes LDL umfasst, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält. Bei einigen Ausführungsformen ist der dritte Marker ein Herzprotein und ist vorzugsweise ein Troponin (z.B. Troponin I) oder CK-MB.
  • Wünschenswerterweise verwendet jeder der Schritte (a) und (b) eine immunologischen Analyse (Assay), die vorzugsweise eine Sandwich-Analyse ist, obwohl eine kompetitive Analyse verwendet werden kann. Vorzugsweise verändert jede immunologische Analyse einen oder mehrere monoklonale Antikörper mit hohen Affinitäten für ihre entsprechenden Marker, z.B. einer Affinität von zumindest etwa 1 × 1010 M–1. ("M" zeigt die Molarität oder gmol/l an; "M–1" zeigt die reziproke Molarität oder 1/mol an.) Die verwendeten monoklonalen Antikörper können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus mAb-4E6, mAb-1H11 und mAb-8A2 besteht.
  • Falls der Marker von Schritt (a) OxLDL ist, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält, ist der in Schritt (a) verwendete Test vorzugsweise zum Detektieren dieser Substanz in unverdünntem menschlichen Plasma in einer Konzentration von 0,02 Milligramm/Deziliter (0,02 mg/dl) in der Lage. Falls der Marker von Schritt (b) ein MDA-modifiziertes LDL ist, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält, ist der in Schritt (b) verwendete Test vorzugsweise zum Detektieren dieser Substanz in unverdünntem humanen Plasma in einer Konzentration von 0,02 Milligramm/Deziliter (0,02 mg/dl) in der Lage.
  • In einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren mit einem klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit zum Detektieren des Vorliegens von und zum Unterscheiden zwischen den nicht-akuten und den akuten Stadien einer koronaren Arterienerkrankung für einen menschlichen Patienten aus der allgemeinen Population bereit, wobei das nicht-akute Stadium der koronaren Gefäßerkrankung entweder eine asymptomatische koronare Arterienerkrankung oder stabile Angina pectoris ist und die akuten Stadien der koronaren Arterienerkrankung instabile Angina pectoris und akuter Myokardialinfarkt sind, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) Testen einer Probe aus einem Patienten unter Verwendung einer immunologischen Analyse auf eine klinisch signifikante Anwesenheit von OxLDL, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält, wobei seine Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel dazu in der Lage ist, mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen einer koronaren Arterienerkrankung anzuzeigen, wobei die Analyse zumindest einen monoklonalen Antikörper mit einer hohen Affinität für das OxLDL einsetzt;
    • (b) Testen einer Proben aus dem Patienten unter Verwendung einer immunologischen Analyse auf eine klinisch signifikante Anwesenheit von MDA-modifiziertem LDL, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält, wobei seine Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel in der Lage ist, mit einem sehr großen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten Stadiums von koronarer Arterienerkrankung anzuzeigen, wobei die Analyse zumindest einen monoklonalen Antikörper einsetzt, der eine hohe Affinität für MDA-modifizierte LDL aufweist; und
    • (c) optional Testen einer Probe aus dem Patienten auf eine klinisch signifikante Anwesenheit eines dritten Markers, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten myokardialen Infarkts anzeigen kann.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung eine Verfahren mit einem klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit zum Detektieren des Vorliegens von und zum Unterscheiden zwischen den nicht-akuten Stadien einer koronaren Arterienerkrankung für einen menschlichen Patienten aus der allgemeinen Population bereit, wobei das nicht-akute Stadium der koronaren Arterienerkrankung entweder asymptomatische koronare Arterienerkrankung oder stabile Angina pectoris ist, und die akuten Stadien der koronaren Arterienerkrankung instabile Angina pectoris und akuter myokardialer Infarkt sind, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) Testen einer Probe aus einem Patienten unter Verwendung einer immunologischen Analyse auf eine klinisch signifikante Anwesenheit von OxLDL, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält, wobei seine Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel dazu in der Lage ist, mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen einer koronaren Arterienerkrankung anzuzeigen, wobei die Analyse zumindest einen monoklonalen Antikörper mit einer hohen Affinität für das OxLDL einsetzt;
    • (b) Testen einer Probe aus dem Patienten unter Verwendung einer immunologischen Analyse auf eine klinisch signifikante Anwesenheit von MDA-modifiziertem LDL, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält, wobei seine Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel in der Lage ist, mit einem sehr großen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten Stadiums von koronarer Arterienerkrankung anzuzeigen, wobei die Analyse zumindest einen monoklonalen Antikörper verwendet, der eine hohe Affinität für MDA-modifiziertes LDL aufweist; und
    • (c) Testen einer Probe aus dem Patienten auf eine klinisch signifikante Anwesenheit eines Herzproteins, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten myokardialen Infarkt anzeigen kann.
  • Die klinisch signifikante Anwesenheit (Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel) des ersten Markers (z.B. OxLDL mit zumindest 60 substituierten Lysinresten pro apo B-100 Einheit) kann mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen einer koronaren Arterienerkrankung anzeigen. Anders ausgedrückt, unterscheidet der Test oder die Analyse dieser Erfindung, die zum Detektieren eines Markers einer koronaren Arterienerkrankung verwendet wird, mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit zwischen den folgenden Kategorien 1 und 2: (1) Solche, die keine koronare Arterienerkrankung haben, und (2) solche, die eine der Kategorien oder Stadien einer koronaren Arterienerkrankung (nämlich solche, die eine nicht-akute (oder chronische) Erkrankung, nämlich stabile Angina pectoris oder vermutlich asymptomatische koronare Arterienerkrankung haben oder solche, die akute koronare Syndrome haben, die sich klinisch als eine instabile Angina pectoris oder ein akuter myokardialer Infarkt darstellen), der aber für sich allgemein nicht in der Lage ist, zwischen den Kategorien (oder Stadien) der koronaren Arterienerkrankung zu unterscheiden.
  • Die klinisch signifikante Anwesenheit (Anwesenheit über einen vorgegebenen Pegel) des ersten Markers (z.B. OxLDL mit zumindest zumindest 60 substituierten Lysinresten pro apo B-100 Einheit) kann mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen einer koronaren Arterienerkrankung anzeigen. Anders ausgedrückt, unterscheidet der Test oder die Analyse dieser Erfindung, die zum Detektieren eines Markers einer koronaren Arterienerkrankung verwendet wird, mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit zwischen den folgenden Kategorien 1 und 2: (1) Solche, die keine koronare Arterienerkrankung haben, (d.h. solche, die entweder (a) keine koronare Arterienerkrankung haben oder eine nicht-akute koronare Arterienerkrankung haben, nämlich, (b) asymptomatische koronare Arterienerkrankung oder (c) stabile Angina pectoris), die aber selbst im allgemeinen nicht in der Lage sind, zwischen diesen drei Kategorien a, b und c zu unterscheiden, und (2) solche, welche eine oder zwei Kategorien oder Stadien von akuter koronarer Arterienerkrankung haben (d.h. solche, die entweder (a) instabile Angina pectoris oder (b) akuten myokardialen Infarkt haben), aber für sich im allgemeinen nicht in der Lage ist, zwischen zwei akuten Kategorien zu unterscheiden.
  • Die klinisch signifikante Anwesenheit (Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel) eines dritten Markers (z.B. CK-MB oder ein Troponin) kann mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten myokardialen Infarkts anzeigen. Anders ausgedrückt, unterscheidet der Test oder die Analyse dieser Erfindung zum Detektieren eines Markers des akuten myokardialen Infarkts zwischen den folgenden Kategorien 1 und 2: (1) solche, die einen akuten myokardialen Infarkt haben und (2) solche, die keinen haben (d.h. solche, die keine koronare Arterienerkrankung haben, solche, die eine nicht-akute koronare Arterienerkrankung haben, nämlich stabile Angina pectoris oder vermutlich asymptomatische koronare Arterienerkrankung, und solche, die eine instabile Angina pectoris haben), der aber selbst im allgemeinen nicht in der Lage ist, zwischen den Nicht-AMI-Kategorien zu unterscheiden.
  • Die gemeinsame Verwendung der ersten und zweiten Tests (Analysen) an einem Patienten gestatten es, den Patienten mit einem klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit in eine von drei Kategorien einzuteilen: (1) ohne koronare Arterienerkrankung (erster und zweiter Test negativ); (2) mit einer koronaren Arterienerkrankung des nicht-akuten Typs, d.h. entweder asymptomatische koronare Arterienerkrankung oder stabile Angina pectoris (erster Test positiv, zweiter Test negativ); oder (3) mit koronarer Arterienerkrankung des akuten Typs, entweder instabile Angina pectoris oder akuter myokardialer Infarkt (beide Tests positiv). Der erste und der zweite Test können gemeinsam verwendet werden, beispielsweise als Teil eines Screenings oder als Teil einer routinemäßigen ärztlichen Untersuchung. Falls der Patient in die erste Kategorie eingestuft wird, gibt es kein Problem. Falls der Patient in die zweite Kategorie eingestuft wird, kann der Arzt Aktionen ergreifen, wie etwa ein Empfehlen einer Änderung des Lebensstils, das Verschreiben geeigneter Medikation, etc. Dies ist insbesondere für asymptomatische CAD-Patienten wichtig, die in die zweite Kategorie eingestuft werden und die möglicherweise keinerlei vorherige Indikation einer koronaren Arterienerkrankung aufweisen. Falls der Patient in die Kategorie der akuten koronaren Erkrankung eingestuft wird, kann der dritte Test dieser Erfindung durchgeführt werden, um festzustellen, ob der Patient einen akuten myokardialen Infarkt hatte oder hat und, falls dies der Fall ist, kann der Arzt unmittelbare Einweisung und Medikation empfehlen (z.B. Gewebeplasminogenaktiviator, "TPA").
  • Die Verwendung des zweiten und dritten Tests (Analysen) an einem Patienten, ohne dass der erste Test ebenfalls durchgeführt wird, wird vermutlich weniger häufig vorkommen als die Verwendung des ersten und des zweiten Tests ohne den dritten Test. Jedoch kann für einen Patienten, der akute Symptome hat, die einen akuten myokardialen Infarkt suggerieren (z.B. Brustschmerzen), der Arzt den dritten Test durchführen, um festzustellen, ob der Patient tatsächlich einen akuten myokardialen Infarkt hat (in welchem Fall der dritte Test, z.B. für ein Troponin, wahrscheinlich positiv wäre) und wird wohl auch den zweiten Test durchführen wollen, um festzustellen, ob der akute myokardiale Infarkt, falls vorliegend, am wahrscheinlichsten durch koronare Arteriosklerose (der zweite Test, z.B. auf MDA-modifiziertes LDL würde positiv sein) verursacht ist, oder ob der akute myokardiale Infarkt wahrscheinlich von einer anderen Ursache herrührt. Für Patienten, die klassische Symptome eines akuten myokardialen Infarkts zeigen, ist die Verwendung des zweiten und des dritten Tests zusammen sehr vorteilhaft und der erste Test muss zunächst oder überhaupt nicht notwendig sein.
  • Somit kann gemäß dieser Erfindung, falls alle drei Tests beim Patienten durchgeführt werden, der Patient mit einem klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit in eine der folgenden Kategorien eingestuft werden: (1) ohne CAD; (2) mit nicht-akuter (chronischer) CAD, nämlich asymptomatischer oder stabiler Angina pectoris; (3) mit der ersten Form akuter CAD, nämlich instabiler Angina pectoris; und (4) mit der zweiten Form akuter CAD, nämlich, (a) einem akuten myokardialen Infarkt ("AMI"), der wahrscheinlich auf Arteriosklerose zurückzuführen ist und (b) ein AMI, der wahrscheinlich auf eine andere Ursache als Arteriosklerose zurückzuführen ist. Die Kategorien 2, 3 und 4 können als die Stadien der koronaren Arterienerkrankung (CAD) gedacht werden.
  • Die klinisch signifikante Anwesenheit eines ersten Markers in einer Probe aus einem Patienten (erste Analyse ist positiv) zeigt an, dass der Patient nicht in Kategorie 1 (kein CAD) und entweder in Kategorie 2 (asymptomatische CAD oder stabile Angina pectoris) oder (3) (instabile Angina pectoris) oder (4) (AMI) ist. Anders ausgedrückt, zeigt die klinische Anwesenheit des ersten Markers in einer Probe aus einem Patienten an, dass der Patient eine koronare Arterienerkrankung hat. Falls der erste Marker keine klinisch signifikante Anwesenheit in der Probe hat (erste Analyse ist negativ), ist der Patient in Kategorie 1, anders ausgedrückt, hat er keine CAD. Falls die Analyse für den ersten Marker negativ ist und die Analyse für den zweiten Marker positiv, zeigt dies ein wahrscheinliches Problem mit einer oder beiden Analysen an, weil diese Paarung von Testergebnissen sehr unwahrscheinlich ist und einer oder beide Tests müssen wiederholt werden. Somit ist ein anderes nützliches Merkmal der Erfindung, dass durch Verwendung der ersten und zweiten Analyse zusammen eine positive erste Analyse eine positive zweite Analyse bestätigen wird und eine negative erste Analyse signifikante Zweifel an einer positiven zweiten Analyse aufwerfen wird und damit ein wahrscheinliches Problem mit einer oder beiden Analysen anzeigen wird.
  • Die klinisch signifikante Anwesenheit des ersten Markers in einer Probe aus einem Patienten, gekoppelt mit der klinisch signifikanten Anwesenheit des zweiten Markers in einer Probe vom Patienten, zeigt an, dass der Patient nicht in der Kategorie 1 (keine CAD) oder 2 (asymptomatische CAD oder stabile Angina pectoris) ist und stattdessen in Kategorie 3 (instabile Angina pectoris) oder Kategorie 4 (AMI) ist. Falls weder der erste noch der zweite Marker ein klinisch signifikantes Vorkommen aufweisen, ist der Patient in Kategorie 1, anders ausgedrückt, hat er keine CAD.
  • Die klinisch signifikante Anwesenheit des ersten Markers einer Probe aus einem Patienten, gekoppelt mit der klinisch signifikanten Anwesenheit des zweiten Markers in einer Probe aus dem Patienten, gekoppelt mit der klinisch signifikanten Anwesenheit des dritten Markers in einer Probe aus dem Patienten zeigt an, dass der Patient nicht in Kategorie 1 (keine CAD) oder 2 (asymptomatische CAD oder stabile Angina pectoris) oder 3 (instabile Angina pectoris) ist und stattdessen in Kategorie 4 (AMI). Falls der erste und zweite und dritte Marker keine klinisch signifikantes Vorkommen aufweisen, ist der Patient in Kategorie 1, anders ausgedrückt, hat er keine CAD. Falls die ersten und zweiten Analysen negativ sind, aber die dritte Analyse positiv ist, zeigt dies einen durch etwas anderes als eine koronare ateriosklerotische Erkrankung verursachten AMI an. Falls die zweite und dritte Analyse positiv ist und die erste Analyse nicht durchgeführt wird (z.B. bei einem Patienten, der klassische AMI-Symptome zeigt), ist der Patient in Kategorie 4 und zeigt die positive zweite Analyse an, dass der Herzschaden wahrscheinlich durch koronare arteriosklerotische Erkrankung verursacht ist. Falls der erste Test negativ ist, der zweite aber positiv, sind die Ergebnisse fraglich, und dies kann beispielsweise ein mögliches Problem mit einem oder mehr Tests anzeigen. Falls der erste und dritte Test positiv sind, aber der zweite negativ ist, sind die Ergebnisse fraglich und dies kann beispielsweise ein mögliches Problem mit den Tests oder eine mögliche nicht-ateriosklerotische AMI anzeigen.
  • Tabelle 1 unten fasst die möglichen Testergebnisse und sich ergebende Kategorisierung (Diagnosen) unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung zusammen (ein Pluszeichen zeigt an, dass ein Test für diesen Marker positiv ist, ein Negativzeichen zeigt an, dass der Test für den Marker negativ ist): Tabelle I
    Figure 00150001
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  • Die "diagnostische Genauigkeit" eines Tests, einer Analyse oder eines Verfahrens betrifft die Fähigkeit des Tests, der Analyse oder des Verfahrens, zwischen Patienten mit einer Krankheit, einem Zustand oder einem Syndrom und Patienten ohne diese Krankheit, den Zustand oder das Syndrom zu unterscheiden, basierend darauf, ob die Patienten eine "klinisch signifikante Anwesenheit" eines Analyten haben. "Klinisch signifikante Anwesenheit" bedeutet, dass die Anwesenheit des Analyten (z.B. die Masse, wie etwa Milligramm oder Nanogramm, oder die Masse pro Volumen, wie etwa Milligramm pro Deziliter) im Patienten (typischerweise in einer Probe aus dem Patienten) höher ist als ein vorgegebener Schnittpunkt (oder Schwellenwert) für diesen Analyten und daher anzeigt, dass der Patient die Krankheit, den Zustand, oder das Syndrom hat, für welche die hinreichend hohe Anwesenheit dieses Analyten ein Marker ist.
  • Die Ausdrücke "hoher Grad an diagnostischer Genauigkeit" und "sehr hoher Grad an diagnostischer Genauigkeit" beziehen sich auf den Test oder die Analyse für den Analyten, bei dem der vorgegebene Schnittpunkt korrekt (genau), die Anwesenheit oder Abwesenheit der Krankheit, des Zustands oder des Syndroms anzeigt. Ein perfekter Test würde eine perfekte Genauigkeit aufweisen. Somit würde für Individuen, welche die Krankheit, die Bedingung oder das Syndrom haben, der Test nur positive Testergebnisse anzeigen und würde keine von diesen Individuen als "negativ" ausweisen (es würde keine "Falsch- Negativen" geben). Anders ausgedrückt, würde die "Sensitivität" des Tests (die wahre positive Rate) 100 % betragen. Andererseits würde bei Individuen, die die Krankheit, den Zustand oder das Syndrom nicht aufweisen, der Test nur negative Testergebnisse anzeigen und würde keine dieser Individuen als "positiv" ausweisen (es würde keine " Falschen-Positiven" geben) geben. Anders ausgedrückt, würde die "Spezifität" (die wahre negative Rate) 100 % betragen. Vergleiche z.B. O'Marcaigh AS, Jacobson RM, "Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test, How To Prevent Misleading Or Confusing Results", Clin. Ped. 1993, 32(8): 485–491, der Spezifität, Sensitivität und positive und negative Vorhersage eines Tests, z.B. eines klinischen diagnostischen Tests, diskutiert.
  • Das Ändern des Schnittpunkts oder des Schwellenwerts eines Tests (oder einer Analyse) ändert üblicherweise die Sensitivität und Spezifität, aber in einer qualitativ abträglichen Beziehung. Falls beispielsweise der Schnittpunkt erniedrigt wird, werden typischerweise mehr Individuen in der getesteten Population Testergebnisse über dem Schnittpunkt oder Schwellenwert aufweisen. Weil Individuen, welche Testergebnisse über dem Schnittpunkt haben, als die Krankheit, den Zustand oder das Syndrom, für welchen der Test durchgeführt wird, aufweisend berichtet werden, wird ein Absenken des Schnittpunktes dazu führen, dass mehr Individuen als positive Ergebnisse aufweisend berichtet werden (d.h. dass sie die Krankheit, den Zustand oder das Syndrom haben). Somit wird ein höherer Anteil an solchen, welche die Krankheit, den Zustand oder das Syndrom haben, durch den Test als es aufweisend angezeigt werden. Dementsprechend wird die Sensitivität (die wahre positive Rate) steigen. Jedoch wird es gleichzeitig mehr Falsch-Positive geben, weil mehr Leute, welche die Krankheit, den Zustand oder das Syndrom nicht haben (d.h. Leute, die wirklich "negativ" sind), vom Test als Analytenwerte über dem Schnittpunkt aufweisend angezeigt werden und daher als positiv berichtet werden (d.h. die Krankheit, den Zustand oder das Syndrom aufweisend), und vom Test nicht korrekt als negativ angezeigt werden. Dementsprechend wird die Spezifität (die wahre negative Rate) des Tests abgesenkt. In ähnlicher Weise wird das Anheben des Schnittpunkts dazu tendieren, die Sensitivität zu vermindern und Spezifität zu vergrößern. Daher sollte man beim Bewerten der Genauigkeit und Nützlichkeit eines vorgeschlagenen medizinischen Tests, einer Analyse oder eines Verfahrens zum Feststellen eines Patientenzustands immer sowohl Sensitivität als auch Spezifität berücksichtigen und bedenken, was der Schnittpunkt ist, an welchem die Sensitivität und Spezifität berichtet werden, weil die Sensitivität und Spezifität über den Bereich von Schnittpunkten signifikant variieren können.
  • Es gibt jedoch einen Indikator, der die Repräsentation der Sensitivität und Spezifität eines Tests, einer Analyse oder eines Verfahrens über den gesamten Bereich von Schnittpunkten mit nur einem einzelnen Wert gestattet. Dieser Indikator wird von einer Empfängerbetriebscharakteristik ("ROC", Receiver Operating Characteristics) – Kurve für den fraglichen Test, die Analyse oder das Verfahren abgeleitet. Man vergleiche z.B. Shultz, "Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures", Kapitel 14 in Teitz, Fundamentals of Clinical Chemistry, Burtis and Ashwood (Hrsg.), 4. Ausgabe, 1996, W. B. Saunders Company, S. 192–199; und Zweig et al., "ROC Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Patients With Coronary Artery Disease", Clin. Chem., 1992, 38(8); 1425–1428.
  • Eine ROC-Kurve ist ein x-y-Plot der Sensitivität auf der y-Achse auf einer Skala von Null bis Eins (d.h. 100 % ) gegen einen Wert gleich Eins minus Spezifizität auf der X-Achse auf einer Skala von Null bis Eins (d.h. 100 % ). Anders ausgedrückt, ist sie ein Plot der wahren Positivrate gegen die falsche Positivrate in diesem Test, dieser Analyse oder dieses Verfahrens. Um die ROC-Kurve für den fraglichen Test, die Analyse oder das Verfahren zu konstruieren, werden Patienten unter Verwendung eines perfekt genauen oder "Goldstandard"-Verfahrens beurteilt, das unabhängig vom fraglichen Test, der Analyse oder dem Verfahren ist, um zu bestimmen, ob die Patienten wirklich positiv oder negativ für die Krankheit, den Zustand oder das Syndrom sind (beispielsweise ist die Koronarangiographie ein Goldstandardtest für das Vorliegen von koronarer Arteriosklerose). Die Patienten werden auch unter Verwendung des fraglichen Tests, der Analyse oder des Verfahrens getestet und für variierende Schnittpunkte werden die Patienten als positiv oder negativ gemäß dem Test, der Analyse oder dem Verfahren berichtet. Die Sensitivität (wahr-positive Rate) und der Wert gleich Eins minus die Spezifität (welcher Wert gleich der falsch-positiven Rate ist), wenn für jeden Schnittpunkt bestimmt und jedes Paar von x-y-Werten wird als einzelner Punkt im x-y-Diagramm aufgezeichnet. Die diese Punkte verbindende "Kurve" ist die ROC-Kurve.
  • Die Fläche unter der Kurve ("AUC", area under the curve) ist der Indikator, der die Repräsentation der Sensitivität und Spezifität eines Tests, einer Analyse oder eines Verfahrens über den gesamten Bereich von Schnittpunkten von nur einem einzelnen Wert gestattet. Die maximale AUC ist eins (perfekter Test) und die minimale Fläche ist 1/2. Je näher die AUC an eins liegt, desto besser die Genauigkeit des Tests.
  • Unter einem "hohen Grad an diagonostischer Genauigkeit" versteht man einen Test oder eine Analyse (wie etwa den Test der Erfindung zum Bestimmen der klinisch signifikanten Anwesenheit eines dritten Analyten, der dabei das Vorliegen eines akuten myokardialen Infarkts anzeigt), bei dem die AUC (Fläche unter der ROC-Kurve für den Test oder die Analyse) zumindest 0,70 ist, wünschenswerterweise zumindest 0,75, wünschenswertererweise zumindest 0,80, bevorzugterweise zumindest 0,85, bevorzugtererweise zumindest 0,90 und am bevorzugtesten zumindest 0,95.
  • Unter einem "sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit" versteht man einen Test oder eine Analyse (wie etwa den Test der Erfindung zum Bestimmen der klinisch signifikanten Anwesenheit des ersten Analyten, der dadurch das Vorliegen der koronaren Arterienerkrankung anzeigt oder den Test zum Bestimmen der klinisch signifikanten Anwesenheit des zweiten Analyten, der dadurch das Vorliegen eines akuten Stadiums der koronaren Arterienerkrankung zeigt), bei dem die AUC (Fläche unter der ROC-Kurve für den Test oder die Analyse) zumindest 0,875, wünschenswerterweise zumindest 0,90, wünschenswertererweise zumindest 0,925, vorzugsweise zumindest 0,95, bevorzugtererweise zumindest 0,975 und am bevorzugtesten zumindest 0,98 ist.
  • Unter einem "klinisch hinreichenden Grad von diagnostischer Genauigkeit" versteht man ein Verfahren (wie etwa das Verfahren der Erfindung), das (1) in einem ersten Test einen ersten Marker analysieren kann, dessen Anwesenheit über einen vorgegebenen Pegel mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen einer koronaren Arterienerkrankung anzeigen kann, (2) in einem zweiten Test einen zweiten Marker analysieren kann, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten Stadiums der koronaren Arterienerkrankung anzeigen kann und (3) in einem dritten Test einen dritten Marker analysieren kann, dessen Anwesenheit über einen vorgegebenen Pegel mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten myokardialen Infarkts anzeigen kann, wobei zumindest der zweite Test durchgeführt wird und einer oder beide der ersten und dritten Tests durchgeführt werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt einen Grad an klinischer diagnostischer Genauigkeit zum Detektieren des Vorliegens von und dem Unterscheiden zwischen den nicht-akuten (chronischen) und den akuten Stadien der koronaren Arterienerkrankung für einen menschlichen Patienten aus der allgemeinen Population dar, der signifikant höher ist als der jeglichen vorbekannten Verfahrens. Jedoch beinhalten die Vorteile dieser Erfindung nicht nur die hohe Gesamtgenauigkeit, die durch ihre Tests möglich gemacht ist, sondern die Verwendung der Tests stellen die gesamte vom Kliniker über Patienten benötigte Information rasch zur Verfügung, um eine mögliche lebensrettende Behandlung zu gestatten. Somit weiß der Arzt durch Verwenden des Verfahrens dieser Erfindung für einen spezifischen Patienten, dass der Patient keine koronare Arterienerkrankung hat, falls das Vorliegen der Krankheit bereits bekannt ist, dass die bereits ergriffenen Maßnahmen zu ihrer Behandlung entweder adäquat oder inadäquat sind; oder dieser Patient hat die Krankheit, wusste es aber nicht, und dass eine Änderung in der Diät und/oder Trainungsbräuchen und/oder Medikation und/oder Behandlung notwendig sind, aber nicht notfallmäßig, oder dass der Patient ein lebensbedrohendes koronares Problem hat und notfallmäßig behandelt werden muss. Ein anderer Vorteil ist, dass ein akuter myokardialer Infarkt aufgrund von koronarer Arteriosklerose von solchen aufgrund von anderen Ursachen unterschieden werden können, welches Wissen die Behandlung signifikant beeinflussen wird. Noch ein anderer Vorteil ist, dass in einigen Fällen Tests dazu dienen, die Validität gegenseitig zu bestätigen und dadurch dem Mediziner mehr Vertrauen in die Diagnose und Behandlung zu geben.
  • Beste Ansätze zum Ausführen der Erfindung
  • Lipoproteine sind Multikomponentenkomplexe von Protein und Lipiden. Jede Art von Lipoprotein hat ein charakteristisches Molekulargewicht, Größe, chemische Zusammensetzung, Dichte und physische Rolle. Das Protein und das Lipid werden durch nicht-kovalente Kräfte zusammengehalten.
  • Lipoproteine können auf Basis ihrer Dichte, wie durch Ultrazentrifugation bestimmt, klassifiziert werden. Daher können vier Klassen von Lipoproteinen unterschieden werden: hochdichte Lipoproteine ("HDL"), intermediärdichte Lipoproteine ("IDL"), niedrigdichte Lipoproteine ("LDL") und sehr niedrigdichte Lipoproteine ("VLDL").
  • Die gereinigten Proteinkomponenten eines Lipoproteinpartikels werden Apolipoproteine (apo) genannt. Jede Art von Lipoprotein hat eine charakteristische Apolipoproteinzusammensetzung. Im LDL ist das prominente Apolipoprotein Protein apo B-100, welches eines der längsten bekannten Einzelkettenpolypeptide ist und aus 4536 Aminosäuren besteht. Von diesen Aminosäuren können die Lysinreste oder -gruppen (es gibt 356 solche Lysinreste oder -gruppen) durch Aldehyde (z.B. (Malondialdehyd) substituiert oder modifiziert werden.
  • Die Oxidation von Lipiden in LDL (ob in vitro, z.B. durch kupferinduzierte Oxidation, ob in vivo) führt zur Erzeugung von reaktiven Aldehyden, die dann mit den Lysinresten oder Gruppen von apo B-100 interagieren können. Das Ergebnis dieser Lysinsubstitution oder -modifikation ist, dass das sich ergebenden oxidierten niedrigdichte Lipoprotein ("OxLDL") welches auch Malondialdehyd-modifiziertes niedrigdichtes Lipoprotein ("MDA-modifiziertes LDL") ist, nicht mehr vom LDL-Rezeptor an der Oberfläche der Fibroblasten erkannt wird, sondern von Abfangrezeptoren auf der Oberfläche von Makrophagen. Zumindest 60 der 356 Lysine (oder Lysinreste oder -gruppen) von apo B-100 müssen substituiert werden, um von den Abfangrezeptoren erkannt zu werden. Die Aufnahme solcher OxLDLs durch Makrophagen führt zur Schaumzellerzeugung, was als ein Anfangsschritt in der Arteriosklerose angesehen wird.
  • Endothele Zellen unter oxidativem Stress (z.B. bei akuten Myokardinfarkt-Patienten) und aktivierte Blutplättchen erzeugen ebenfalls Aldehyde, die mit den Lysingruppen im apo B-100 interagieren, was zur Erzeugung von Aldehyd-modifiziertem LDL führt, das ebenfalls von den Abfangrezeptoren erkannt wird. Jedoch sind die Lipide in diesem Aldehyd-modifzierten LDL nicht oxidiert. Die enzymatische Aktivität in Makrophagen (z.B. Myeloperoxidase) führt zur Oxidation sowohl des Lipids als auch der Proteingruppen des LDL. Alle diese Pfade führen zu Aldehyd-artigen Modifikationen der Proteingruppe von LDL.
  • Der erste Marker kann jeglicher Marker sein, dessen signifikante Anwesenheit mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen von koronarer Arterienerkrankung anzeigt. Wünschenswerter ist der erste Marker ein atherogenes Protein. Vorzugsweise umfasst das atherogene Protein OxLDL, das zumindest 60, wünschenswerterweise bis zu etwa 90, wünschenswertererweise bis zu etwa 120, bevorzugterweise bis zu etwa 180, bevorzugtererweise bis zu etwa 210 und am bevorzugtesten möglicherweise bis zu 240 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält.
  • Der zweite Marker kann jeglicher Marker sein, dessen klinisch signifikante Anwesenheit mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten Stadiums der koronaren Arterienerkrankung anzeigt. Wünschenswerterweise ist der zweite Marker ein atherogenes Protein. Vorzugsweise umfasst das atherogene Protein MDA-modifiziertes LDL, das zumindest 60, wünschenswerterweise bis zu etwa 90, wünschenswertererweise bis zu etwa 120, vorzugsweise bis zu etwa 180, bevorzugtererweise bis zu etwa 210 und am bevorzugtesten möglicherweise bis zu etwa 240 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthält.
  • Der dritte Marker kann jeglicher Marker sein, dessen klinisch signifikante Anwesenheit mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen von akutem Myokardialinfarkt anzeigt. Der chemische Goldstandard-Marker für akuten Myokardialinfarkt ist CK-MB gewesen, aber er könnte sich zu den Troponinen (z.B. Troponin I, Troponin T) verschieben. Vergleiche beispielsweise Adams et al., "Cardiac Troponin I, A Marker With High Specificity For Cardiac Injury", Circulation 1993, 88(1): 101–106; Antman et al., "Cardiac-Specific Troponin I Levels To Predict The Risk Of Mortality In Patients With acute Coronary Syndromes", N. Eng. J. Med. 1996, 335(18): 1342–1349; Hamm et al., "Emergency Room Triage Of Patients With Acute Chest Pain By Means Of Rapid Testing For Cardiac Troponin T Or Troponin I", N. Eng. J. Med. 1997, 337(23): 1648–1653; Ohman et al., "Cardiac Troponin T Levels For Risk Stratification In Acute Myocardial Ischemia", N. Eng. J. Med. 1996, 335 (18):1333–1341; und Van de Werf, "Cardiac Troponins In Acute Coronary Syndromes", N. Eng. J. Med. 1996, 335(18): 1388–1389. Eine andere Substanz, die möglicherweise als der dritte Marker verwendet werden kann, ist ein Marker für aktive oder beginnende koronare Thrombose. Somit sollte sich verstehen, dass ein "Marker, dessen Anwesenheit über einen vorgegebenen Pegel mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten myokardialen Infarkts anzeigen kann", Marker aktiver und beginnender koronarer Thrombose beinhalten soll, selbst hervor Substanzen, die für kardiale Gewebebeschädigung oder -Tod indikativ sind, gebildet und/oder freigesetzt worden sind. Allgemein gesagt, wird der dritte Marker typischerweise ein "Herzprotein" sein, welches, wie hierin verwendet, ein Protein bedeutet (z.B. ein Enzym), das als Ergebnis von oder sonst wie assoziiert ist mit ischämischer Beschädigung des Herzens oder das ein Vorläufer oder Derivat dieses Proteins ist.
  • Das Testen auf die klinisch signifikante Anwesenheit der Marker kann jegliche Analysen, Methodik und Ausrüstung verwenden, solange die Vorteile dieser Erfindung erzielt werden können, z.B. können chemische Analysen und immunologische Analysen, wie etwa kompetitive und Sandwichanalysen verwendet werden. "Kompetitive Analysen" sind wohl bekannt und jegliche kompetitive Analyse kann in dieser Erfindung verwendet werden, solange die Vorzüge der Erfindung erzielt werden können. "Sandwich-Analysen" sind wohl bekannt und jegliche Sandwich-Analyse kann in dieser Erfindung verwendet werden, solange die Vorzüge der Erfindung erzielt werden können.
  • Bei einer immunologischen Analyse können jegliche Antikörper, die eine geeignet hohe Affinität für die Zielspezies aufweisen, verwendet werden und vorzugsweise sind die Antikörper monoklonale Antikörper. Wie hierin verwendet, bedeutet "hohe Affinität" eine Affinitätskonstante (Assoziationskonstante) von zumindest etwa 5×108 M–1 (wobei "M" die Molarität oder mol pro Liter anzeigt und "M–1" die reziproke Molarität oder Liter pro mol anzeigt), wünschenswerterweise von zumindest etwa 1×109 M–1, bevorzugterweise zumindest etwa 1×1010 M–1 und am bevorzugtesten zumindest etwa 1×1011 M–1. Wie hierin verwendet, bedeutet "niedrige Affinität" (im Gegensatz zur hohen Affinität) eine Affinitätskonstante (Assoziationskonstante) von weniger als etwa 1×107 M–1, wünschenswerterweise weniger als etwa 1×106 M–1 und bevorzugterweise weniger als etwa 1×105 M–1. Affinitätskonstanten werden gemäß den von Holvoet, Collen et al., J. Clin. Invest. 1994, 93:89–98 beschriebenen geeigneten Verfahren bestimmt.
  • Die in den ersten und zweiten Analysen dieser Erfindung bevorzugten Antikörper binden mit OxLDL und/oder MDA-modifiziertem LDL, dessen apo B-100 Einheiten zumindest 60, wünschenswerterweise bis zu etwa 90, wünschenswertererweise bis zu etwa 120, vorzugsweise bis zu etwa 180, bevorzugtererweise bis zu etwa 210 und am bevorzugtesten möglicherweise bis zu etwa 240 substituierte Lysinreste pro apo B-100 Einheit enthalten. Der Bereich an Lysinsubstitution wird allgemein von 60 bis hoch zu 240 substituierten Lysinresten pro apo B-100 Einheit sein und manchmal von 60 hoch bis zu etwa 180 substituierten Lysinresten pro apo B-100 Einheit.
  • Jeder in den ersten und zweiten Analysen verwendete Antikörper ist wünschenswerter hochspezifisch für ein konformationales Epitop, das vorhanden ist, wenn zumindest etwa 60, bevorzugterweise bis zu etwa 120 Lysinreste substituiert sind und er dadurch die ersten und zweiten Marker der ersten und zweiten Analysen unterscheiden kann. Antikörper, welche Epitope erkennen, die vorhanden sind, wenn weniger als 60 Lysine pro apo B-100 Einheit substituiert oder modifiziert sind, sind weniger spezifisch, aber immer noch nützlich (z.B. können sie als sekundäre Antikörper in einem Sandwich-ELISA verwendet werden).
  • Die hierin verwendeten bevorzugten Antikörper sind monoklonale Antikörper mAb-4E6, mAb-1h11 und mAb-8A2. Ihre Affinitätskonstanten für natives LDL, MDAmodifiziertes LDL und OxLDL sind wie folgt (die Einheiten sind in Liter pro mol, was das Reziprok der Molarität oder M–1 ist): Tabelle II
    Figure 00250001
  • Der monoklonale Antikörper mAb-4E6 wird durch das Hybridom Hyb4E6 hergestellt, das bei der BCCM unter der Hinterlegungszugriffsnummer LMBP 1660 CB am oder um den 24. April 1997 hinterlegt worden ist. Der monoklonale Antikörper mAb-1H11 wird durch das Hybridom Hyb1H11 hergestellt, das bei der BCCM unter der Hinterlegungszugriffsnummer LMBP 1659 CB am oder um den 24. April 1997 deponiert worden ist. Der monoklonale Antikörper mAb-8A2 wird durch Hybridom Hyb8A2 hergestellt, das bei der BCCM unter der Hinterlegungszugriffsnummer LMPB 1661 CB am oder um den 24. April 1997 hinterlegt worden ist.
  • Die BCCM ist die Belgische Koordinierte Sammlung von Mikroorganismen, die durch das Abkommen von Budapest vom 28. April 1997 über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck von Patentverfahren ("Budapester Abkommen") autorisiert worden ist. Ihre Adresse ist c/o Universität von Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgien.
  • Die drei Hinterlegungen wurden bei BCCM unter vom Budapester Abkommen vorgeschriebenen Bedingungen hinterlegt. In Übereinstimmung mit den 'United States Code Of Federal Regulations" (siehe 37 CFR § 1.808) und dem "United States Patent And Trademark Office's Manual Of Patent Examination" ("MPEP") (siehe § 2410.01) werden alle durch den Hinterleger der Verfügbarkeit gegen der Öffentlichkeit des deponierten Materials auferlegten Beschränkungen (außer wie durch die MPEP gestattet) unwiderrufbar beim Erteilen jeglicher Patenterteilung aus dieser Anmeldung oder von jeglicher fortgeführter, darauf basierender Anmeldung aufgehoben.
  • Wie anderswo beschrieben, wurden die drei monoklonalen Antikörper in der folgenden Weise erhalten (siehe PCT- Anmeldungen PCT/EP 97/03287, eingereicht 20.06.1997, und PCT/EP 97/03493, eingereicht 01.07.1997 [die beide die Vereinigten Staaten und andere Länder benennen und Paul Holvoet und DésiréCollen als Erfinder nennen]).
  • Es wurden Balb/c-Mäuse durch intravenöse und intraperitoneale Injektion von entweder OxLDL oder MDA-modifiziertem LDL immunisiert. OxLDL wurde durch in vitro-Inkubation von LDL (apo B-100 Endkonzentration 700 μglml) mit Kupferchlorid (Endkonzentration 640 μM) für 16 Stunden bei 37°C erhalten. Das MDA-modifizierte LDL wurde durch Inkubation von LDL (apo B-100 Endkonzentration 700 μg/ml) mit einer 0,25 M MDA-Lösung für 3 Stunden bei 37°C hergestellt. Die Anzahl von substituiertenLysinen, wie im TBARS-Assay gemessen, betrug typischerweise 210 pro apo B-100 Molekül für OxLDL und 240 für MDA-modifiziertes LDL. Hybridome wurden durch PEG-induzierte Fusion von Milzlymphozyten erhalten, die aus immunisierten Mäusen mit P3-X63/Ag-6.5.3 Myelomazellen gemäß Standardtechniken gewonnen wurden (Holvoet, Collen et al., J. Clin. Invest. 1994; 93: 89–98). Das Screenen auf Hybridome, welche spezifische Antikörper produzieren, wurde mit ELISA unter Verwendung von Mikrotiterplatten durchgeführt, die mit MDA-modifiziertem LDL oder Kupfer-oxidiertem LDL beschichtet waren. Dreihundertacht Hybridome wurden nach Immunisierung von Mäusen mit entweder OxLDL (211) oder MDA-modifiziertem LDL (97) erhalten. Hyb4E6 produzierte Antikörper, die für sowohl MDA-modifizierte als auch kupferoxidierte LDL spezifisch waren (mAb-4E6) und Hyb1H11 erzeugte Antikörper, die für MDA-modifiziertes LDL (mAb-1H11) allein spezifisch waren. Mit LDL immunisierte Mäuse in einem ähnlichen Verfahren ergaben das Hybridom Hyb8A2, welches den Antikörper mAb-8A2 erzeugte.
  • Die bevorzugte Analyse ist eine Enzym-gekoppelte Immunosorbens-Analyse ("ELISA"). Beispielsweise kann im Falle eines kompetitiven ELISA ein mit OxLDL oder MDA-modifiziertem LDL beschichtetes festes Substrat für eine vorgegebene Zeitdauer mit dem monoklonalen Antikörper mAb-4E6 und einer Probe, von der angenommen wird, dass sie OxLDL und/oder MDA-modifiziertes LDL enthält, kontaktiert werden, nach welchem Zeitraum ungebundener Antikörper und Probe entfernt werden und eine Bindungsreaktion zwischen Antikörper und OxLDL und/oder MDA-modifiziertem LDL, das am Substrat gebunden ist, visualisiert und/oder quantifiziert wird. Die Quantifizierung in einem kompetitiven ELISA ist indirekt, weil nicht die Bindung zwischen dem Antikörper und dem Analyten in der Probe gemessen wird, sondern die Menge an Antikörper gemessen wird, die zu der bekannten Menge an OxLDL oder MDA-modifiziertem LDL bindet, die auf das Material geschichtet oder daran angebunden wird.
  • Eine typische kompetitive Analyse, die den monoklonalen Antikörper mAb-4E6 verwendet, ist wie folgt. Sie basiert auf der Inhibition von Kupfer-oxidiertem LDL beim Binden von mAb-4E6 an die beschichteten Vertiefungen von Mikrotiterplatten. Somit werden Standard-OxLDL (oder MDA-modifiziertes LDL) und Plasmaproben in PBS (Phosphat-gepufferter Saline) verdünnt, das 1 mM EDTA, 20 μM Vitamin E, 10 μM butyliertes Hydroxytoluol, 20 μM Dipyridamol und 15 mM Theophyllin enthält, um in vitro LDL-Oxidation und Plättchenaktivierung zu vermeiden. Gleiche Volumina von verdünnter gereinigter mAb-4E6-Lösung (Endkonzentration 7,5 ng/ml) und von entweder der verdünnten Standardlösung oder verdünnten Plasmaproben (Kupfer-oxidiertes LDL, wird als kompetitiver Ligand in einer Endkonzentration im Bereich von 50 bis 500 ng/ml zugegeben) werden gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann werden 200 μl Aliquots der Mischungen in die Näpfe gegeben, die mit MDA-modifiziertem LDL oder OxLDL beschichtet sind. Die Aliquots werden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen werden die Näpfe mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Kaninchen-IgG, das gegen Mausimmunoglobuline gezogen worden ist, inkubiert und wieder gewaschen. Die Peroxidasereaktion wird durchgeführt (siehe Holvoet, Collen et al., J. Clin Invest. 1995, 95:2611–2619) und die Absorption (A) wird bei 492 nm abgelesen. Kontrollen ohne kompetitiven Liganden und Blindproben ohne Antikörper können routinemäßig eingeschlossen werden. Die Prozentinhibierung der Bindung von mAb-4E6 an den immobilisierten Liganden kann berechnet werden als:
    Figure 00280001
    und Standardkurven können durch Auftragen des Prozentsatzes von Inhibition gegen die Konzentration von kompetierendem Liganden erhalten werden. Die untere Grenze der Detektion ist 0,020 mg/dl in unverdünntem menschlichen Plasma.
  • Im Falle eines Sandwich-ELISA kann mAb-4E6 (für MDA-modifiziertes LDL und OxLDL) oder mAb-1H11 (für MDA-modifiziertes LDL) an einem Festsubstrat angebunden werden und nachfolgend mit einer zu analysierenden Probe kontaktiert werden. Nach Entfernen der Probe kann die Bindung zwischen dem spezifischen Antikörper und OxLDL und/oder MDA-modifiziertem LDL, das aus der Probe abgefangen worden ist, durch Detektionsmittel visualisiert und/oder identifiziert werden. Detektionsmittel kann ein markierter, weniger spezifischer sekundärer Antikörper sein, der einen anderen Teil der apo B-100 Einheit des erfassen Analyten erkennt (z.B. mAb-8A2).
  • Eine typische Sandwich-Analyse, welche monoklonale Antikörper mAb-4E6 und mAb-8A2 verwendet, ist wie folgt. Sie basiert auf der Bindung von immunoreaktivem Material an den Näpfen von Mikrotiterplatten, die mit dem monoklonalen Antikörper mAb-4E6 beschichtet sind und der Detektion von gebundenem immunoreaktiven Material unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers mAb-8A2, der mit Peroxidase markiert ist. Diese Version des ELISA ist mehr zur Verwendung im klinischen Labor geeignet, weil sie die Notwendigkeit beseitigt, Standardlösungen von in vitro oxidiertem und/oder Aldehyd-modifiziertem LDL herzustellen.
  • Standardpräparationen und Plasmaproben werden in PBS verdünnt, das Antioxidanzien und Antiplättchenagenzien, wie oben beschrieben, in Verbindung mit dem kompetitiven ELISA enthält, 180 μ1 Aliquots von 80-fach verdünntem Plasma und von zwischen 10 und 0,01 nM von MDA-modifiziertes LDL enthaltenden Standardlösungen werden in die Näpfe von Mikrotiterplatten eingebracht, die mit mAb-4E6 beschichtet sind (200 μl einer 4 μg/ml IgG-Lösung) und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen werden die Näpfe für 1 Stunde mit Meerrettichperoxidase, die mit mAb-8A2 konjugiert ist, IgG (End-IgG-Konzentration 65 ng/ml) inkubiert und wieder gewaschen. Die Peroxidasereaktion wird wie oben in Verbindung mit dem kompetitiven ELISA beschrieben durchgeführt. Die bei 492 nm gemessene Absorption korreliert mit dem log-Wert der MDA-modifizierten LDL-Konzentration im Bereich zwischen 1,5 nM und 0,3 nM.
  • Tests für den dritten Marker (z.B. CK-MB, Troponin I) sind bekannt. Siehe beispielsweise Adams et al., Circulation 1993, 88(1): 101–106; Antman et al., N. Eng. J. Med. 1996, 335(18): 1342–1349; Hamm et al., N. Eng. J. Med. 1997, 337(23): 1648–1653; Ohman et al., N. Eng. J. Med. 1996, 335(18): 1333–1341; und Van de Werf, N. Eng. J. Med. 1996, 335(18): 1388–1389.
  • Wie hierin verwendet, sollte ein "menschlicher Patient aus der allgemeinen Population" allgemein als ein menschliches Wesen verstanden werden und nicht auf menschliche Wesen beschränkt sein, die formell in Krankenhäusern aufgenommen worden sind oder die spezifische Erkrankungen, Zustände oder Symptome haben oder nicht. Es kann möglicherweise eine oder mehrere Untergruppen der allgemeinen Population gegeben, für die das Verfahren dieser Verfahren nicht so wünschenswert ist, jedoch ist derzeit nicht bekannt, was solch eine oder mehrere Untergruppen sind (falls sie überhaupt existieren).
  • Die hierin verwendete "Probe aus dem Patienten" kann jegliche Probe sein, welche es gestattet, die Vorzüge dieser Erfindung zu erzielen. Typischerweise ist die "Probe aus dem Patienten" eine Fluidprobe, typischerweise Gesamtblut oder ein aus Gesamtblut abgeleitetes Fluid (wie etwa Plasma oder Serum). Fluidproben (insbesondere Gesamtblut, Plasma oder Serum) im Gegensatz zu Gewebeproben haben den Vorteil, dass sie leicht und rasch gewonnen und getestet sind, was insbesondere in klinischen Umgebungen wichtig ist, wo Zeit essentiell sein kann. Auch sind die Kliniker daran gewöhnt, Fluidproben (insbesondere Blut) aus Patienten zu entnehmen und in Gewebeproben können einige der Marker in hinreichenden Mengen enthalten sein und eben auch nicht.
  • Gesamtblut kann Substanzen, z.B. Zellen, enthalten, die mit den in dem Verfahren der Erfindung verwendeten Test interferieren und daher ist Gesamtblut eine weniger bevorzugter Probe. Die bevorzugte Probe ist Plasma, was Gesamtblut ist, aus dem die Zellen (rote Blutzellen, weiße Blutzellen und Plättchen) entfernt worden sind, beispielsweise durch Zentrifugation. Serum ist Plasma, aus dem das Fibrinogen entfernt worden ist (z.B. durch Verursachen von Gerinnung und dann Entfernen des geronnenen Materials) und wird ebenfalls weniger bevorzugt als Plasma.
  • Wie oben angezeigt, können jegliche Analysen, Methodik und Ausrüstung verwendet werden, solange die Vorzüge dieser Erfindung erzielt werden können. So ist beispielsweise die Erfindung nicht auf die Verwendung von Mikronapfplatten-Technologie beschränkt. Falls beispielsweise die Tests des Verfahrens dieser Erfindung das Verwenden von Antikörpern beinhalten, können diese Antikörper in einer großen Breite von automatisierten immunologischen Analysesystemen verwendet werden, welche chemilumineszente Immunoassaysysteme, Mikropartikelenzym-Immunoassaysysteme, Fluoreszenzpolarisations-Immunoassaysysteme und Radioimmunoassaysysteme beinhalten.
  • Das Verfahren dieser Erfindung wurde in Verbindung mit fast 300 Patienten aus der allgemeinen Population (die in diesem Fall nicht Herztransplantationsindividuen beinhaltetet) verwendet, wie unten beschrieben. Allgemein gesagt, zeigte die statistische Analyse der Ergebnisse, dass von den getesteten möglichen Markern der beste Marker für den ersten Test OxLDL war, dass der beste Marker für den zweiten Test MDA-modifziertes LDL war, und dass der beste Marker für den dritten Test Troponin I war.
  • Eine Gesamtheit von 286 Individuen, die mit dem Universitätshospital von Leuven entweder als Angestellte oder als Individuen, die in die Notfallaufnahme gebracht waren und/oder in das Krankenhaus eingewiesen worden waren, assoziiert waren, wurden untersucht: 105 Patienten mit akuten koronaren Syndromen, 64 Patienten mit stabiler CAD und 117 Kontrollen.
  • Die Individuen wurden als ein akutes Koronarsyndrom (d.h. ein akutes Stadium einer koronaren Arterienerkrankung aufweisend) aufweisend klassifiziert, falls sie ischämisches Brustunbehagen mit einer ST-Segmentanhebung oder Absenkung von mehr als 0,5 mm oder T-Welleninversion von mehr als 1 mm aufwiesen. Von den Individuen mit einem akuten Stadium einer koronaren Arterienerkrankung wurden solche, deren angehobene Kreatinkinase (CK)-MB-Spiegel (und zumindest 3 % der Gesamt-CK) zum Zeitpunkt der Einlieferung oder in Proben, die 6 bis 8 Stunden nach der Einlieferung genommen wurden, vorlagen, wurden als eine AMI aufweisend klassifiziert. Alternativ wurden solche Akutstadiums-Individuen, die keine solchen CK-MB-Anhebungen hatten, als eine instabile Angina pectoris aufweisend klassifiziert.
  • Individuen mit angiographisch dokumentierter CAD und keinen klinischen Anzeichen von Ischämie innerhalb des vorhergegangenen Monats wurden als eine stabile CAD aufweisend angesehen (d.h. in diesem Fall stabile Angina pectoris).
  • 117 Individuen (72 Männer/45 Frauen; mittleres Alter = 55 Jahre) ohne eine Vorgeschichte arteriosklerotischer kardiovaskulärer Erkrankung wurden als Kontrollen verwendet. Sie wurden aus dem Labor und Klinikpersonal des Krankenhauses und aus einer Population von Individuen, die in das Krankenhaus eingeliefert wurden, welche keine Vorgeschichte arteriosklerotischer kardiovaskulärer Erkrankungen hatten, ausgewählt.
  • Venöse Blutproben wurden im Fastenzustand bei den Kontrollen und den Individuen mit stabiler Angina entnommen. Bei Individuen mit akuten Koronarsyndromen wurden Blutproben bei der Aufnahme und vor Behandlungsbeginn genommen. Die Blutproben wurden in 0,01 M Citrat aufgenommen, das 1 mM EDTA, 20 μM Vitamin E, 10 μM butyliertes Hydroxytoluol, 20 μM Dipyridamol und 15 mM Theophyllin enthielt, um eine in vitro LDL-Oxidation und Plättchenaktivierung zu vermeiden. Die Blutproben wurden bei 3.000 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur innerhalb von 1 Stunde nach Gewinnung zentrifugiert und das sich ergebende Plasma wurde bei –20°C gelagert, bis die Analysen durchgeführt wurden.
  • Die LDL wurden aus dem gepoolten Plasma von fastenden normolipidemischen Spendern durch Dichtegradient-Ultrazentrifugation (Havel et al., J. Clin. Invest. 1955, 34: 1345–1353) isoliert. MDA-modifiziertes LDL und Kupfer-oxidiertes LDL wurden wie in Haberland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79: 1712–1716 und Steinbrecher, J. Biol. Chem. 1987, 262(8): 3603–3608 beschrieben hergestellt und als Standard verwendet. Die Charakterisierung von modifiziertem LDL beinhaltete die Messung von Thiobarbituratsäure-reaktiven Substanzen ("TBARS"), die Bestimmung der elektrophoretischen Mobilität auf 1 % Agarosegelen, die Quantifizierung von Cholesterin und Fettsäuren durch HPLC auf einer Nova-Pak C-18-Umkehrphasensäule (Waters Associates, Milford, Massachusetts), die Quantifizierung von Proteinen durch Lowry-Analysen und von Phopspholipiden durch enzymatische Analyse (Biomerieux, Marcy, France). Vergleiche Holvoet, Collen et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1989, 18(1): 100–107, und Holvoet, Collen et al., J. Clin. Invest. 1995, 95: 2611–2619. Apo B-100 Moleküle von in-vitro MDA-modifiziertem LDL und von Kupfer-oxidiertem LDL enthielten einen Durchschnitt von 244 bzw. 210 substituierten Lysinen. Wie oben angemerkt, ist, obwohl das Ausmaß an Lysinsubstitution von in vitro MDA-modifziertem LDL und Kupfer-oxidiertem LDL sehr ähnlich ist, die Lipideinheit in MDA-modifiziertem LDL nicht oxidiert.
  • Ein mAb-4E6-basierter ELISA wurde für die Quantifizierung von OxLDL im Plasma verwendet (siehe Holvoet, Collen et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1998, 18(1): 100–107; Holvoet, Collen et al., Thromb. Haemost. 1996, 76(5): 663–669; Holvoet und Collen, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1997, 17(11): 2376–2382; und Holvoet, Collen et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1998, 18: 415–422). Dieser monoklonale Antikörper gestattet die Detektion von 0,025 mg/dl MDA-modifiziertem LDL oder Kupfer-oxidiertem LDL in Anwesenheit von 500 mg/dl nativem LDL. Plasmaspiegel von MDA-modifiziertem LDL wurden in einem mAb-1H 11 basiertem ELISA gemessen (siehe Holvoet, Collen et al., J. Clin. Invest. 1995, 95: 2611–2619). Der monoklonale Antikörper gestattet die Detektion von 0,025 mg/dl MDA-modifiziertem LDL, aber nicht von Kupfer-oxidiertem LDL, in Anwesenheit von 500 mg/dl nativem LDL. Weil die Spezifitäten der zwei Antikörper vom Ausmaß der Proteinmodifikation abhängen, werden alle Lipoproteinkonzentrationen anhand von Protein ausgedrückt.
  • Gesamtcholesterin, HDL, Cholesterin und Triglyceride wurden durch enzymatische Verfahren gemessen (Boehringer Mannheim, Meylon, Frankreich). LDL-Cholesterinwerte wurden mit der Friedewald-Formel berechnet. Die Troponin I-Spiegel wurden auf einem Beckman ACCESS-Immunoanalyzer unter Verwendung von kommerziell erhältlichen monoklonalen Antikörpern gemessen (Sanofi, Toulouse, Frankreich). Die C-reaktiven Proteinspiegel wurden in einer kommerziellen Immunoanalyse (Boehringer, Brüssel, Belgien) gemessen und die Plasmaspiegel von D-Dimer wurden in einem ELISA gemessen, wie früher beschrieben (siehe Declerck, Holvoet, Collen et al., Thromb. Haemost. 1987, 58(4): 1024–1029). C-reaktives Protein ist ein Marker für Entzündung. Das D-Dimer ist ein Marker für thrombotische Syndrome.
  • Die erhaltenen Werte sind in Tabelle III unten gezeigt ("n" gibt die Anzahl von Individuen an, von denen bekannt ist, dass sie unabhängig in jeder Kategorie sind).
  • Tabelle III
    Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Die Plasmaspiegel von OxLDL betrugen 0,85 ± 0,54 mg/dl (Mittel ± Standardabweichung) in den 117 Kontrollen und waren bei den 64 Patienten mit stabiler Angina pectoris 3-fach höher (p < 0,001), bei den 42 Patienten mit instabiler Angina pectoris 3,8-fach höher (p < 0,001) und bei den 63 Patienten mit AMI 3,5-fach höher (p < 0,001). (Zum Vergleich hatte eine Gruppe von 79 Herztransplantationspatienten ohne CAD OxLDL von 1,27±0,061 mg/dl oder 1,5-fach höher als die 117 Kontrollen, und eine Gruppe von 28 Herztransplantationspatienten mit stabiler CAD hatten OxLDL von 2,49±0,18 mg/dl oder 2,9-fach höher als die Kontrollen. Der Grund für die ersichtliche Differenz zwischen den Werten für die Nicht-CAD-Individuen, die Herztransplantation hatten oder nicht, ist nicht mit Sicherheit bekannt.) Die Ergebnisse zeigen, dass der Test oder die Analyse der Erfindung, die zum Detektieren eines Markers für koronare Arterienerkrankung in einem Patienten in der allgemeinen Population verwendet wird, mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit zwischen den folgenden Kategorien 1 und 2 unterscheiden wird: (1) solche, die keine koronare Arterienerkrankung haben und (2) solche, die eine der Kategorien oder Stadien von koronarer Arterienerkrankung haben, die aber selbst nicht in der Lage sind, zwischen den Kategorien (oder Stadien) von koronarer Arterienerkrankung mit einem hinreichenden Grad an Genauigkeit zu unterscheiden.
  • Plasmaspiegel von MDA-modifiziertem LDL waren 0,39 ± 0,15 mg/dl in den 117 Kontrollen, waren bei den 64 Patienten mit stabiler Angina pectoris nur 1,2-fach höher, waren aber bei den 42 Patienten mit instabiler Angina pectoris 2,7-fach höher (p < 0,001) und bei den 63 AMI-Patienten 1,3-fach höher (p < 0,001). (Zum Vergleich hatte eine Gruppe von 79 Herztransplantationspatienten ohne CAD MDA-modifiziertes LDL von 0,38 ± 0,016 mg/dl oder im wesentlichen dasselbe wie die 117 Kontrollen und hatte eine Gruppe von 28 Herztransplantationspatienten mit stabiler CAD MDA-modifiziertes LDL von 0,39 ± 0,038 mg/dl oder ebenfalls im wesentlichen dasselbe wie die Kontrollen.) Diese Ergebnisse zeigen, dass der Test oder die Analyse der Erfindung zum Detektieren eines Markers eines akuten Stadiums der koronaren arteriellen Erkrankung zwischen den folgenden Kategorien 1 und 2 unterscheiden wird: (1) solche, die kein akutes Stadium einer koronaren Arterienerkrankung aufweisen (d.h. solche, die entweder (a) keine koronare Arterienerkrankung haben oder nicht akute koronare Arterienerkrankung haben, nämlich (b) asymptomatische koronare Arterienerkrankung oder (c) stabile Angina pectoris), der aber für sich im allgemeinen nicht in der Lage ist, mit einem hinreichenden Grad an Genauigkeit zwischen solchen zwei Kategorien a, b und c zu unterscheiden und (2) solche, die eine oder zwei Kategorien oder Stadien von akuter koronarer Arterienerkrankung (d.h. solche, die entweder (a) instabile Angina pectoris oder (b) akuten myokardialen Infarkt aufweisen) haben, der aber für sich im allgemeinen nicht in der Lage ist, mit einem hinreichenden Grad an Genauigkeit zwischen den akuten Kategorien zu unterscheiden.
  • Die Plasaspiegel von Troponin I betrugen 0,0092 ± 0,011 ng/ml bei den 117 Kontrollen, waren bei den 64 Patienten mit stabiler Angina pectoris nur 3,8-fach höher, aber waren bei den 42 Patienten mit instabiler Angina pectoris 40-fach höher (p < 0,001), und bei den 63 AMI-Patienten 141-fach höher (p < 0,001). In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Daten zeigte sich, dass Troponin I ein Marker für akuten myokardialen Infarkt war (siehe Adams et al., Circulation, 1993, 88(1): 101–106; und Antman et al., N. Eng. 7. med. 1996, 335(18): 1342–1349).
  • Die Plasmaspiegel von C-reaktivem Protein betrugen 3,38+1,79 mg/dl bei den 117 Kontrollen, waren bei den 64 Patienten mit stabiler Angina pectoris nur 1,9-fach höher, waren aber bei den 42 Patienten mit instabiler Angina pectoris 5,1-fach höher (p < 0,001) und waren bei den 63 AMI-Patienten 5,4-fach höher (p < 0,001). In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Daten zeigte sich, dass das C-reaktive Protein ein Marker für akute koronare Syndrome ist (siehe Muldoon et al., Ryan et al., Oltrona et al., und Liuzzo et al., Briefe und Antwort der Autoren, N. Engl. J. Med. 1995, 332(6): 398–400).
  • Die Plasmaspiegel von D-Dimer betrugen 166 ± 162 μg/dl bei den 117 Kontrollen, waren bei den 64 Patienten mit stabiler Angina pectoris nur 1,8-fach höher, waren aber bei den 42 Patienten mit instabiler Angina pectoris 2,2-fach höher (p < 0,001) und waren bei den 63 AMI-Patienten 3,6-fach höher (p < 0,001). In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Daten zeigte sich, dass D-Dimer ein Marker für akute koronare Syndrome ist (Hoffmeister, Circulation 1995, 91(10) 2520–2527).
  • Die Daten wurden auch analysiert, um die Sensitivität und Spezifität von OxLDL (Schnittpunkt von 1,4 mg/dl), MDA-modifiziertem LDL (Schnittpunkt von 0,7 mg/dl) und Troponin I (Schnittpunkt von 0,07 ng/ml) für die individuellen Stadien der koronaren Arterienerkrankung zu bestimmen. Anders ausgedrückt, wird unter dem Schnittpunkt das Individuum als nicht das Stadium der fraglichen CAD aufweisend klassifiziert und wird an oder über dem Schnittpunkt das Individuum als dieses Stadium von CAD aufweisend klassifiziert. Die Sensitivitäten und Spezifitäten werden in Tabelle IV wie folgt gezeigt: Tabelle IV
    Figure 00360001
    Figure 00370001
  • Die Daten wurden unter Verwendung nicht-parametrischer Kruskal-Wallis ANOVA, gefolgt von Dunnets multiplem Vergleichstest unter Verwendung des Prism-Statistikprogramm (Graph Pad Software, San Diego, Californien). Plasmaspiegel von OxLDL und von MDA-modifiziertem LDL bei Patienten mit normalem oder angehobenen Spiegel an Troponin I, C-reaktivem Protein oder D-Dimer und bei Patienten mit oder ohne periphere vaskuläre Erkrankung wurden durch den Mann-Whitney-Test verglichen. Diskontinuierliche Parameter wurden durch Chi-Quadrat-Analyse verglichen.
  • Ein logistisches Regressionsmodell wurde verwendet, um die Beziehung zwischen CAD (Ja oder Nein; d.h. hat das Individuum CAD oder nicht) und mehreren Co-Varianten univariat zu beschreiben. Für die Individuen, welche CAD hatten, wurde die Beziehung zwischen der Stabilität der CAD (stabil oder instabil) und den Co-Variaten durch logistische Regressionsmodelle überprüft. Für die Individuen, die eine instabile CAD hatten, wurde die Beziehung zwischen instabiler Angina pectoris oder AMI und den Covariaten durch logistische Regressionsmodelle überprüft. Die Beziehungen zwischen (1) stabiler oder instabiler Angina pectoris, (2) stabiler Angina pectoris oder AMI und (3) stabiler Angina pectoris, instabiler Angina pectoris oder AMI, und den Covariaten wurde durch logistische (für die letzeren: Multigruppen-) Regressionsmodelle geprüft. Bei kontinuierlichen Variablen wurden kubische Spline-Funktionen verwendet, um die Beziehung zwischen den Covariaten und der Reaktion zu modulieren. Dies gestattet das Spezifizieren nicht-linearer Funktionen der Prädiktoren im Modell. Ein multiples logistisches Regressionsmodell wurde angepasst, einschließlich aller univariat signifikanten Variablen und ihrer zusammenhängenden Faktoren. Die zusammenhängenden Faktoren wurden mittels eines Spearman-Korrelationskoeffizienten überprüft. Die Messung von prädikativer Diskrimination, die zur Charakterisierung der Modell-Leistungsfähigkeit verwendet wurde, war die Fläche unter der Empfängerbetriebscharakteristikkurve (ROC). Die verwendete Software war FE Harell Jr., "Design, S Functions For Biostatistical/Epidemiologic Modeling, Testing, Estimation, Validation, Graphics, And Prediction" (erhältlich von statlib.cmu.edu; fordern Sie "send design from S" an, 1994); S-plus® 4.0 Release 3 für Windows (Mathsoft Inc., Cambridge, Massachusetts, USA); und SAS/STAT-Software, Version 6.12: SAD Institute Inc. (Cary, North Carolina, USA).
  • Tabelle V unten zeigt die Ergebnisse der simplen logistischen Regressionsanalysen zum Beschreiben der Fähigkeit von jedem der Parameter, Individuen ohne koronare Arterienerkrankung von solchen mit koronaren Arterienerkrankungen zu unterscheiden.
  • Tabelle V
    Figure 00380001
  • Die Fläche unter der ROC-Kurve ("AUC") ist 0,992 für OxLDL, was ein fast perfekter Wert ist (1 ist die maximale AUC). Dies zeigt an, dass das klinische Vorhandensein von OxLDL über einem vorgegebenen Spiegel mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen einer koronaren Arterienerkrankung im Gegensatz zur Abwesenheit von CAD anzeigen kann. Tatsächlich liegt der sehr hohe Grad an diagnostischer Genauigkeit über dem bevorzugtesten AUC-Minimum von 0,98. Der einzige andere AUC-Wert, der auch nur in der Nähe des Wertes für OxLDL ist, ist der AUC-Wert für MDA-modifiziertes LDL, der 0,826 ist, aber selbst dieser ist unter dem Minimum von 0, 875 für einen "sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit". Alle anderen AUC-Werte sind deutlich niedriger. Beispielsweise ist der für Gesamtcholesterin, das für die letzte Dekade oder so der klassische Marker zum Feststellen gewesen ist, ob jemand CAD hat oder das Risiko dafür, nur 0,623, was eine "ziemlich niedrige Genauigkeit" ist (siehe Zweig et al., "ROC Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Patients With Coronary Artery Disease", Clin. Chem. 1992, 38(8): 1425–1428, zitierend Swets, "Measuring The Accuracy Of Diagnostic Systems", Science 1988, 240: 1285–1293).
  • Tabelle VI unten zeigt die Ergebnisse der einfachen logistischen Regressionsanalysen zum Beschreiben der Fähigkeit jedes der Parameter, zwischen einem akuten Stadium der koronaren Arterienerkrankung (d.h. entweder instabile Angina pectoris oder akuter myokardialer Infarkt) und einem nicht-akuten Stadium zu unterscheiden.
  • Tabelle VI
    Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Die Fläche unter der ROC-Kurve ("AUC") ist für MDA-modifiziertes LDL 0,967, was eine sehr hohe Wertung ist. Dies zeigt an, dass die klinische Anwesenheit von MDA-modifiziertem LDL über einem gegebenen Spiegel mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten Stadiums von koronarer Arterienerkrankung (im Gegensatz zu einem nicht-akuten Stadium) anzeigen kann. In der Tat ist der sehr hohe Grad an diagnostischer Genauigkeit über dem bevorzugten AUC-Minimum von 0,95. Der einzig andere AUC-Wert, der irgendwo in der Nähe dieses Werts für MDA-modifiziertes LDL ist, ist der AUC-Wert für Troponin I, der 0, 848 ist. Alle anderen AUC-Werte sind wesentlich niedriger.
  • Tabelle VII zeigt die Ergebnisse der einfachen logistischen Regressionsanalysen zum Beschreiben der Fähigkeit jedes der Parameter, zwischen instabiler Angina und einem akuten myokardialen Infarkt unterscheiden.
  • Tabelle VII
    Figure 00400002
  • Die Fläche unter der ROC-Kurve ("AUC") ist für Troponin I 0,777, welches gemäß Swets (zitiert in Zweig et al., Clin. Chem. 1992, 38(8): 1425–1428, oben) eine für einige Zwecke nützliche Genauigkeit anzeigt. Dieser AUC-Wert von 0,777 zeigt an, dass das klinische Vorhandensein von Troponin I über einem vorgegebenen Spiegel mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten myokardialen Infarkts (im Gegensatz zur instabilen Angina pectoris) anzeigen kann. Tatsächlich liegt der hohe Grad der diagnostischen Genauigkeit deutlich über dem bevorzugten AUC-Minimum von 0,70. Der nächsthöhere AUC-Wert ist der AUC-Wert für C-reaktives Protein, der 0,637 ist. Alle anderen AUC-Werte, einschließlich der für OxLDL und MDA-modifiziertes LDL, sind wsesentlichen niedriger und kaum über dem minimalen AUC-Wert von 0,5.
  • Tabelle VIII unten zeigt die Ergebnisse der einfachen logistischen Regressionsanalysen zum Beschreiben der Beziehung zwischen jedem der Parameter und Unterscheiden zwischen stabiler koronarer Arterienerkrankung (entweder asymptomatischer koronarer Arterienerkrankung oder stabiler Angina pectoris) und instabiler Angina pectoris.
  • Tabelle VIII
    Figure 00410001
  • Der AUC für MDA-modifiziertes LDL beträgt 0,997 (fast ein perfekter Wert von 1), was zeigt, dass das Verwenden von MDA-modifiziertem LDL als Marker mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit zwischen stabiler koronarer Arterienerkrankung und instabiler Angina pectoris unterscheiden kann. Kein anderer Parameter kann auch nur annähernd die Genauigkeit von MDA-modifiziertem LDL erreichen.
  • Tabelle IX unten zeigt die Ergebnisse der einfachen logistischen Regressionsanalysen zum Beschreiben der Beziehung zwischen jedem der Parameter und Unterscheiden zwischen stabiler koronarer Arterienerkrankung (entweder einer asymptomatischen koronaren Arterienerkrankung oder instabiler Angina pectoris) und einem akuten myokardialen Infarkt.
  • Tabelle IX
    Figure 00420001
  • Der AUC für MDA-modifiziertes LDL beträgt 0,967, was zeigt, dass die Verwendung von MDA-modifiziertem LDL als Marker mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit zwischen stabiler koronarer Arterienerkrankung und einem akuten myokardialen Infarkt unterscheiden kann. Troponin I mit einem AUC-Wert von 0,921 ist gut, aber nicht annähernd so perfekt. Der nächst-höchste AUC- Wert ist 0,763 für C-reaktives Protein, aber dieser ist signifikant niedriger als die MDA-modifizierten LDL- und Troponin I-AUC-Werte.
  • Alle diese Ergebnisse zeigen, dass die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereitstellt, das einen klinisch hinreichenden Grad an diagnostischer Genauigkeit zum Detektieren des Vorliegens und für das Unterscheiden zwischen den akuten und nicht-akuten Stadien der koronaren Arterienerkrankung für einen menschlichen Patienten aus der allgemeinen Population bereitstellt, wobei das nicht-akute Stadium der koronaren Arterienerkrankung entweder asymptomatische koronare Arterienerkrankung oder stabile Angina pectoris ist und die akuten Stadien der koronaren Arterienerkrankung instabile Angina pectoris und myokardialer Infarkt sind.
  • Variationen und Modifikationen werden sich für Fachleute ergeben, und die Ansprüche sollen alle Variationen und Modifikationen abdecken, die innerhalb des wahren Geistes und Schutzumfangs der Erfindung liegen.
  • Beispielsweise hängen die Schnittpunkte für die verschiedenen Marker davon ab, welche Marker verwendet werden und welche Tests verwendet werden. Wenn die hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden, kann der Schnittpunkt 1,4 mg/dl (Milligramm/Deziliter) für OxLDL, 0,7 mg/dl für MDA-modifiziertes LDL und 0,07 ng/ml (Nanogramm/Milliliter) für Troponin I sein. Falls jedoch beispielsweise ein nicht-ionisches Detergens wie etwa Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat; Sigma Chemical Company) in der Pufferlösung (der PBS-Lösung) enthalten ist, mit der das LDL-enthaltende Material (z.B. Plasma, Standard oder Kontrolle) inkubiert wird (z.B. in einer Konzentration und Pufferlösung von bis zu 1 G/V [Gewicht/Volumen] im Bereich von etwa 0,2% G/V bis etwa 0,6 % G/V als optimal erscheinen) können die OxLDL- und MDA-modifizierten LDL-Werte signifikant ansteigen, in welchem Fall die entsprechenden Schnittpunkte erhöht werden müssten. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu wollen, wird angenommen, dass ein nicht-ionisches Detergens den Proteinanteil vom Lipidanteil des OxLDL und des MDA-modifizierten LDL trennt, dass die bevorzugten monoklonalen Antikörper mAb-4E6 und mAb-1H11 auf Epitope auf dem Proteinanteil gerichtet sind, und dass das Entfernen des Lipidanteils aus dem Proteinanteil eine sterische Behinderung entfernt und den Antikörpern gestattet, an mehr Stellen auf demselben Protein zu binden, wodurch die Gesamtmenge an Antikörper, die an einen gegebenen Betrag von OxLDL oder MDA-modifiziertem LDL bindet, ansteigt. Somit ist beobachtet worden, dass die Verwendung von Tween 30 in einer Konzentration von 0,2 G/V bis 0,6 % G/V im Puffer mit einer frisch gewonnenen Plasmidprobe die berichtete Menge an OxLDL in der Probe um einen Faktor von mehr als 10-fach im Vergleich dazu anhob, wenn im Puffer bei gleicher Probenmenge desselben Plasmas kein Tween 20 verwendet wurde. Dies ist wünschenswert, weil, allgemein gesagt, die Verfügbarkeit eines größeren Bereichs für einen Marker, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Wert in einem Test das Vorliegen einer Krankheit, eines Zustands oder eines Syndroms anzeigt, die Genauigkeit des Tests erhöhen kann.

Claims (11)

  1. Verfahren mit einem klinisch hinreichendem Grad diagnostischer Genauigkeit zum Detektieren des Vorliegens von und zum Unterscheiden zwischen den akuten und nicht-akuten Stadien koronarer Arterienerkrankung für einen menschlichen Patienten aus der allgemeinen Bevölkerung, wobei das nicht-akute Stadium der koronaren Arterienerkrankung eine asymptomatische Koronar-Arterienerkrankung und stabile Angina pectoris ist und die akuten Stadien der koronaren Arterienerkrankung instabile Angina pectoris und akute myokardiale Infarktbildung sind, und das Verfahren das Durchführen des Schrittes (b) und Durchführen zumindest eines der Schritte (a) und (c) umfasst: (a) Testen einer Probe aus einem Patienten auf eine klinisch signifikante Anwesenheit eines ersten Markers, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen einer koronaren Arterienerkrankung anzeigt, wobei der erste Marker OxLDL umfasst, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100-Einheit umfasst; (b) Testen einer Probe aus einem Patienten auf eine klinisch signifikante Anwesenheit eines zweiten Markers, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel mit einem sehr hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten Stadiums von koronarer Arterienerkrankung anzeigt, wobei der zweite Marker MDA-modifiziertes LDL umfasst, das zumindest 60 substituierte Lysinreste pro apo B-100-Einheit enthält; und (c) Testen einer Probe aus einem Patienten auf eine klinisch signifikante Anwesenheit eines dritten Markers, dessen Anwesenheit über einem vorgegebenen Pegel mit einem hohen Grad an diagnostischer Genauigkeit das Vorliegen eines akuten myokardialen Infarkts anzeigt, wobei der dritte Marker ein Herzprotein umfasst; (d) wobei die Diagnose, die auf den Ergebnissen von Schritt (b) und zumindest einem der Schritte (a) und (c) basiert, ist: (i) die Abwesenheit einer koronaren Arterienerkrankung, falls keiner der ersten, zweiten und dritten Marker über seinen jeweiligen vorgegebenen Pegel vorhanden ist; (ii) nicht-akute koronare Arterienerkrankung, falls der erste Marker, nicht aber der zweite oder dritte Marker, oberhalb seines jeweiligen vorgegebenen Pegels vorhanden ist; (iii) instabile Angina pectoris, falls jeder der ersten und zweiten Marker, nicht aber der dritte Marker, über seinem jeweiligen vorgegebenen Pegel vorhanden ist; (iv) akuter myokardialer Infarkt atherosklerotischen Ursprungs, falls jeder der ersten zweiten und dritten Marker über seinem jeweiligen vorgegebenen Pegel vorhanden ist, und (v) akuter myokardialer Infakt nicht-atherosklerotischen Ursprungs, falls weder der erste noch der zweite Marker, aber der dritte Marker über seinem jeweiligen vorgegebenen Pegel vorhanden ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) durchgeführt wird.
  3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt (a) durchgeführt wird.
  4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt (a) eine erste immunologische Analyse zum Anzeigen der klinisch signifikanten Anwesenheit des ersten Markers verwendet und/oder Schritt (b) eine zweite immunologische Analyse zum Anzeigen der klinisch signifikanten Anwesenheit des zweiten Markers verwendet.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die erste immunologische Analyse eine erste Sandwich-Analyse zum Anzeigen der klinisch signifikanten Anwesenheit des ersten Markers ist und/oder die zweite immunologische Analyse eine zweite Sandwich-Analyse zum Anzeigen der klinisch signifikanten Anwesenheit des zweiten Markers ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die erste immunologische Analyse einen ersten monoklonalen Antikörper mit hoher Affinität für den ersten Marker verwendet und/oder die zweite immunologische Analyse einen zweiten monoklonalen Antikörper mit einer hohen Affinität für den zweiten Marker verwendet.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der erste monoklonale Antikörper eine Affinität für den ersten Marker von zumindest 1 × 1010 M–1 aufweist und/oder der zweite monoklonale Antikörper eine Affinität für den zweiten Marker von zumindest etwa 1 × 1010 M–1 aufweist.
  8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei der in der Analyse von Schritt (a) verwendete monoklonale Antikörper aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus mAb-4E6 und mAb-8A2 besteht und/oder der in der Analyse von Schritt (b) verwendete monoklonale Antikörper aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus mAb-4E6, mAb-1H11 und mAb-8A2, wobei die monoklonalen Antikörper mAb-4E6, mAb-1H11 und mAb-8A2 jeweils durch Hybridome Hyb4E6, Hyb1H11 und Hyb8A2 erzeugt werden, die am 24. April 1997 bei den belgischen koordinierten Sammlungen von Mikroorganismen unter den Zugriffnummern LMBP 1660 CB, LMBP 1659 CB und LMPB 1661 CB hinterlegt worden sind.
  9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der dritte Marker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Troponin und CK-MB besteht.
  10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in Schritt (a) die getestete Probe eine Flüssigprobe ist, in Schritt (b) die getestete Probe eine Flüssigprobe ist und/oder in Schritt (c) die getestete Probe eine Flüssigprobe ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei in Schritt (a) die getestete Probe eine Gesamtblut-, Plasma- oder Serumprobe ist, in Schritt (b) die getestete Probe eine Gesamtblut-, Plasma- oder Serumprobe ist, und/oder in Schritt (c) die getestete Probe eine Gesamtblut-, Plasma- oder Serumprobe ist.
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