JP2005522669A - 卒中および脳損傷の診断マーカーおよびその使用方法 - Google Patents

卒中および脳損傷の診断マーカーおよびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は，卒中および一過性虚血性発作を診断および評価する方法に関する。特定の観点においては，患者サンプルを，脳損傷の１またはそれ以上の特異的マーカーおよび脳損傷の１またはそれ以上の非特異的マーカーを含むパネルのマーカーの存在または量について分析する。別の観点においては，サンプルをＢ型ナトリウム利尿ペプチドについて分析する。そのような診断および評価用のパネルを組み立てるための種々のマーカーが開示される。種々の観点において，本発明は，卒中症状を示す患者の予後を決定し，脳血管痙攣のリスクを有する患者を識別するために，卒中のタイプおよび一過性虚血性発作を初期に検出し区別する方法を提供する。本発明の方法は，有益な卒中治療および療法を受けることができる患者の数を大きく増加させ，不正確な卒中診断に伴うコストを低下させる，迅速な，高感度かつ特異的なアッセイを提供する。

Description

関連出願
本出願は，米国特許仮出願６０／３１３，７７５（２００１年８月２０日出願），６０／３３４，９６４（２００１年１１月３０日出願），および６０／３４６，４８５（２００２年１月２日出願）に基づく優先権を主張する。これらのそれぞれの内容は，その全体を本明細書の一部としてここに引用する。
発明の分野
本発明は，卒中および脳損傷の診断マーカーの同定および使用に関する。種々の観点においては，本発明は，卒中の症状を示したときに，初期検出し，卒中と一過性虚血性発作とを区別し，および遅延型神経症候のリスクを有する個体を識別する方法を提供する。
本発明の背景に関する以下の記述は，単に読者が本発明を理解することを助けるために提供され，本発明に対する先行技術を記載または構成すると認めるものではない。
卒中は，血管創傷が脳に現れたものであり，これは一般に，アテローム性動脈硬化症または高血圧症に派生的なものであって，米国で死亡原因の第３位である（かつ，神経学的障害の第２に多い原因である）。卒中は，“虚血性卒中”と“出血性卒中”の２つの広義のタイプに分類することができる。さらに，患者は，一過性虚血性発作を経験する場合があり，これはより重篤なエピソードが将来発症する高いリスク因子である。
虚血性卒中には，血栓性，塞栓性，腺窩性および低灌流性のタイプの卒中が包含される。血栓は脳内でインシトゥーで形成される動脈の閉塞であり，一方，塞栓は，遠方の起源，例えば心臓および主要血管からしばしば心筋梗塞または心房性細動のために移動した物質により引き起こされる閉塞である。頻度は低いが，血栓は髄膜炎等の疾患による血管炎症から生ずる場合もある。血栓または塞栓は，アテローム性動脈硬化症または他の疾患，例えば，動脈炎の結果として生ずる場合があり，これは脳への動脈血液供給の物理学的閉塞につながる。腺窩性卒中は脳の非皮質性領域内の梗塞を表す。低灌流は，局在化していない脳虚血により引き起こされる広汎性創傷の形で現れ，典型的には心筋梗塞および不整脈により生ずる。
虚血性卒中の発症はしばしば突然であり，２４−４８時間の間に悪化する神経症候として現れる“発展性卒中”となりうる。発展性卒中においては，症状は一般に一側性神経不全を含み，これは頭痛または発熱なしに進行的に拡大する。発展性卒中はまた，症状が急速に発達して数分間以内に最大となる“完全卒中”となりうる。
出血性卒中は，脳内またはクモ膜下出血，すなわち脳組織中への出血，および続く脳内の血管破裂により引き起こされる。脳内出血およびクモ膜下出血は，頭蓋内出血と称されるより広い分類の出血の部分集合である。脳内出血は，典型的には慢性高血圧症によるものであり，動脈硬化性血管が破裂する。脳内出血の症状は突然であり，頭痛が始まり，そして神経症候が着実に増加する。悪心，嘔吐，せん妄，痙攣および意識の喪失が一般的である。
これに対し，ほとんどのクモ膜下出血は，頭部外傷または動脈瘤破裂に起因しており，高圧の血液放出を伴い，これもまた直接細胞外傷を引き起こす。破裂の前に，動脈瘤が症候性であるかもしれず，あるいは時たま緊張性頭痛または片頭痛を伴うことがある。しかし，頭痛は，典型的には破裂により急性で重篤となり，種々の程度の神経症候，嘔吐，めまい感，および脈拍数および呼吸数の変化を伴う。
一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）は突然始まり，持続時間は短く，典型的には２−３０分間である。ほとんどのＴＩＡは，しばしば首の動脈に由来するアテローム斑からの塞栓によるものであり，短い血液流遮断の結果として生ずる。ＴＩＡの症状は卒中のものと同一であるが，一過性でしかない。根元的なリスク因子に伴って，ＴＩＡを経験した患者は卒中のリスクが非常に高い。
卒中の現在の診断方法には，コストがかかり時間を消費する方法，例えば，非造影剤コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）スキャン，心電図，磁気共鳴画像法（ＭＲＩ），および血管造影が含まれる。卒中の即時原因の決定および出血性卒中からの虚血性卒中の区別は困難である。ＣＴスキャンは，１ｃｍより大きい実質性出血およびすべてのクモ膜下出血の９５％を検出することができる。ＣＴスキャンはしばしば，梗塞の大きさによって，開始から６時間まで虚血性卒中を検出することができない。ＭＲＩは，虚血性卒中の初期の検出にはＣＴスキャンより有効かもしれないが，出血性卒中からの虚血性卒中の区別はあまり正確ではなく，広く利用することはできない。心電図（ＥＣＧ）は，ある種の状況において，心臓が原因の卒中を同定するために用いることができる。血管造影は，狭窄または大および小頭蓋血管の閉塞を同定する決定的な試験であり，クモ膜下出血の原因の位置を決め，動脈瘤を明確にし，脳血管痙攣を検出することができる。しかし，これは侵襲的方法であり，またコストおよび利用可能性のために制限されている。また，血液凝固研究を用いて，血液凝固疾患（凝固障害）を出血性卒中の原因から除外することができる。
卒中を経験している患者の迅速な診断および治療は重要である。例えば，虚血性卒中において症状開始から３時間以内に組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）を投与することは，選択された急性卒中患者に有益である。あるいは，患者がＴＰＡ療法の候補でなければ，抗凝固剤（例えばヘパリン）による利益を受けることができる。これに対し，血栓崩壊剤および抗凝固剤は，出血性卒中においては強い禁忌を示す。すなわち，虚血性事象を出血性事象から初期に区別することは緊急を要する。さらに，卒中診断の確認および卒中のタイプの同定の遅れが，初期の治療介入による利益を受けることができる患者の数を制限している。最後に，現在のところ，ＴＩＡを同定することができるか，遅延型神経症候を予測する診断方法はなく，これらはしばしば開始時の後，症状の発症と同時に検出されている。
したがって，当該技術分野においては，迅速で，感度が高くかつ特異的であり，また卒中のタイプを区別することができ，遅延型神経症候のリスクを有する個体を同定することができる，卒中およびＴＩＡの診断アッセイが求められている。そのような診断アッセイは，有益な卒中治療および療法を受けることができる患者の数を大きく増加させ，不適切な卒中診断に伴うコストを低下させるであろう。
本発明は，卒中および脳損傷の診断マーカーの同定および使用に関する。本明細書に記載される方法および組成物は，種々の形の卒中およびＴＩＡの診断および区別において用いるための，迅速な，感度の高い，かつ特異的な診断アッセイに対する当該技術分野における必要性を満たすことができる。さらに，本発明の方法および組成物はまた，卒中患者の治療および追加の診断および／または予後指標の開発を容易にするために用いることができる。
種々の観点においては，本発明は，患者における診断，予後，または卒中および／またはＴＩＡの区別と関連するマーカーを同定するための物質および方法；そのようなマーカーを使用して患者を診断または治療し，および／または治療計画の経過をモニターすること；そのようなマーカーを使用して，卒中および／またはＴＩＡに関連する１またはそれ以上の有害な転帰のリスクを有する被験者を識別すること；およびそのような健康状態を治療または予防するのに有益な化合物および医薬組成物をスクリーニングすることに関する。
第１の観点においては，本発明は，卒中に関連する診断または予後を決定する方法，または卒中および／またはＴＩＡのタイプを区別する方法を開示する。これらの方法は，被験者から得た試験サンプルを，脳損傷の１またはそれ以上のマーカーの存在または量について分析することを含む。これらの方法は，その存在または量が診断，予後，または卒中および／またはＴＩＡの区別と関連する１またはそれ以上のマーカーを同定することを含むことができる。そのようなマーカーがいったん同定されれば，目的とする被験者から得たサンプル中のそのようなマーカーのレベルを測定することができる。ある態様においては，これらのマーカーを，卒中および／またはＴＩＡの診断，予後，または区別と結びつけられたレベルと比較することができる。被験者のマーカーレベルを診断マーカーレベルと相関させることにより，患者における卒中の存在または非存在，将来の有害な転帰の確率等を迅速かつ正確に判定することができる。
以下の議論の目的に関しては，卒中の診断および予後に適用可能なように記載される方法は，一般にＴＩＡの診断および予後に適用可能であると考えることができる。
ある態様においては，複数のマーカーを組み合わせて，個別のマーカーまたはより小さい群から得られたものと比較して，分析の予測値を高める。好ましくは，脳損傷の１またはそれ以上の非特異的マーカーを脳損傷の１またはそれ以上の非特異的マーカーと組み合わせて，記載される方法の予測価値を高めることができる。
本明細書において用いる場合，“マーカー”との用語は，被験者から得た試験サンプルをスクリーニングするための標的として用いるべき蛋白質またはポリペプチドを表す。本発明においてマーカーとして用いられる“蛋白質またはポリペプチド”には，その任意のフラグメント，特に免疫学的に検出可能なフラグメントが含まれることが企図される。当業者は，脳発作の間に傷害を受けた中枢神経系の細胞により放出される蛋白質が，そのようなフラグメントに分解されるか切断される可能性があることを認識するであろう。さらに，ある種のマーカーは，不活性型として合成され，後に蛋白質分解により活性化されることができる。そのようなマーカーの例は以下に記載される。本明細書において用いる場合，“関連するマーカー”との用語は，マーカーそれ自身の代用物として検出されることができる特定のマーカーの１またはそれ以上のフラグメントを表す。
本発明の好ましいマーカーは，虚血性卒中，出血性卒中，およびＴＩＡを区別することができる。特に好ましいものは，血栓性，塞栓性，腺窩性，低灌流性，脳内出血，およびクモ膜下出血型の卒中を区別するマーカーである。
本発明のさらに別の好ましいマーカーは，後に起こる有害な転帰のリスクを有する被験者を識別することができる。例えば，脳内出血またはクモ膜下出血型の卒中を示している被験者のサブセットは，後に脳血管痙攣に起因する血管創傷を受けやすいであろう。別の例においては，有害な転帰のリスクを識別するために臨床的に正常な被験者をスクリーニングすることができる。好ましいマーカーには，カスパーゼ，ＮＣＡＭ，ＭＣＰ−１，Ｓ１００ｂ，ＭＭＰ−９，ｖＷＦ，ＢＮＰ，ＣＲＰ，ＮＴ−３，ＶＥＧＦ，ＣＫＢＢ，ＭＣＰ−１カルビンディン，トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ミエリン塩基性蛋白質，組織因子，ＧＦＡＰ，およびＣＮＰが含まれる。これらの用語のそれぞれは以下に定義される。特に好ましいマーカーは，クモ膜下出血を示している患者において後に起こる脳血管痙攣を予測しうるもの，例えばフォン・ビルブラント因子，血管内皮増殖因子，マトリクスメタロプロテイン−９，またはこれらのマーカーの組み合わせである。他の特に好ましいマーカーは，出血性卒中から虚血性卒中を区別するものである。
そのようなマーカーは，個々に，またはサンプル中で測定される複数のマーカーを含むマーカー"パネル"のメンバーとして用いることができる。卒中に関連する診断または予後を判定するために，または卒中および／またはＴＩＡのタイプを区別するために用いることができる。そのようなパネルは，当業者によく知られる多くの様式で分析することができる。例えば，パネルの各メンバーを，"正常な"値，または特定の結果を指示する値と比較することができる。特定の診断／予後は，各マーカーについてのこの値との比較に依存するであろう。あるいは，マーカーのあるサブセットのみが正常範囲外であれば，このサブセットは特定の診断／予後を指示するであろう。
診断試験の感度および特異性は，単に試験の"質"にのみ依存するものではなく，何が異常試験を構成するかの定義にも依存する。実用的には，典型的に，"正常"および"疾病"集団における変数の値とその相対的頻度とをプロットすることにより，"ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）"曲線を計算する。任意の特定のマーカーについて，疾病を有する被験者および有しない被験者についてのマーカーレベルの分布はおそらく重複するであろう。そのような条件下で，試験は１００％の正確性をもって疾病から正常を絶対的に区別するものではなく，重複の領域は試験が疾病から正常を区別できない場所を示す。閾値を選択し，その上（または下，疾病にともなってマーカーがどのように動くかによる）であれば試験は異常であると考えられ，その下であれば試験は正常であると考えられる。ＲＯＣ曲線の下の面積は，得られた測定値によりある状態の正しい識別が可能となるであろう確率の尺度である。ＲＯＣ曲線は，試験結果が必ずしもマーカーレベルの正確な数値を与えない場合においても用いることができる。すなわち，結果をランク付けすることができる限り，適切なＲＯＣ曲線を作成することができる。そのような方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば，Ｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３：２９−３６（１９８２）を参照。
好ましい態様においては，パネル中の１またはそれ以上のマーカーについての特定の閾値は，被験者から得たマーカーレベルのプロファイルが特定の診断／予後を示すか否かを判定するのには信頼できない。そうではなく，本発明は，パネルについて種々のカットオフにおける，特定のマーカーのパネルの感度と１−（特異性）とについてＲＯＣ曲線をプロットすることにより，プロファイル全体の評価を利用することができる。これらの方法においては，被験者からのマーカー測定値のプロファイルを一緒に考慮して，個体が卒中を起こしたか，卒中のリスクを有するか，個体が起こしたかまたはそのリスクを有する卒中のタイプ（虚血性または出血性），卒中ではなくＴＩＡを起こしたか，などの包括的確率（数字のスコアとしてまたはリスクのパーセンテージとして表現される）を与える。そのような態様においては，ひとりの患者における特定の診断／予後を示すためにはある種のサブセットのマーカーの増加で充分であり，一方，別の患者における同じまたは異なる診断／予後を示すためには異なるサブセットのマーカーの増加で充分であろう。
１またはそれ以上のマーカーは単独で考慮した場合には予測価値を欠くかもしれないが，パネルの一部として用いれば，そのようなマーカーは特定の診断／予後を決定するために高い価値を有するであろう。例えば，あるマーカーが特定の診断／予後を同定するのに特に高い有用性を有する場合，パネル中の１またはそれ以上のマーカーに重み付け率を適用してもよい。本明細書に記載される例示的パネルは卒中に関連する診断または予後を決定するか，または卒中および／またはＴＩＡのタイプを区別する能力を提供することができるが，これらの例示的パネルで１またはそれ以上のマーカーを置き換えるか，加えるか，差し引くことができ，この場合にも臨床的に有用な結果を与える。
本明細書において用いる場合，“試験サンプル”との用語は，目的とする被験者，例えば患者の診断，予後，または評価を目的として得た体液のサンプルを表す。ある態様においては，そのようなサンプルは現在進行している状態の帰結または治療計画が状態に及ぼす効果を判定する目的で得ることができる。好ましい試験サンプルには，血液，血清，血漿，脳脊髄液，尿および唾液が含まれる。さらに，当業者は，ある種の試験サンプルは，分画または精製した後に，例えば，全血液を血清または血漿成分に分離した後に，より容易に分析することができることを認識するであろう。
本明細書において用いる場合，“脳損傷の特異的マーカー”との用語は，脳組織および神経細胞と関連しており，脳損傷と相関しうるが他のタイプの創傷とは相関しない蛋白質またはポリペプチドを表す。そのような脳損傷特異的マーカーとしては，アデニレートキナーゼ，脳由来神経栄養因子，カルビンジン−Ｄ，クレアチンキナーゼ−ＢＢ，グリア線維状酸性蛋白質，乳酸デヒドロゲナーゼ，ミエリン塩基性蛋白質，神経細胞接着分子，ニューロン特異的エノラーゼ，ニューロトロフィン−３，プロテオリピド蛋白質，Ｓ−１００β，トロンボモジュリン，蛋白質キナーゼＣガンマ等が挙げられる。これらの特異的マーカーは以下に詳細に説明する。
本明細書において用いる場合，“脳損傷の非特異的マーカー”との用語は，脳損傷の事象において上昇するが，脳事象以外によっても上昇するかもしれない蛋白質またはポリペプチドを表す。そのようなマーカーは，典型的には，血液凝固および止血または急性期反応物質に関連する蛋白質でありうる。血小板の活性化および血液凝固のメカニズムにおける因子には，β−トロンボグロブリン，Ｄ−ダイマー，フィブリノペプチドＡ，プラスミン−α−２−抗プラスミン複合体，血小板第４因子，プロトロンビンフラグメント１＋２，トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体，組織因子，およびフォン・ビルブラント因子が含まれる。他の非特異的マーカーとしては，アドレノメジュリン，心トロポニンＩ，ヘッドアクチベータ，ヘモグロビンα2鎖，カスパーゼ−３，血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），１またはそれ以上のエンドセリン（例えば，エンドセリン−１，エンドセリン−２，およびエンドセリン−３），インターロイキン−８，Ａ型ナトリウム利尿ペプチド，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，およびＣ型ナトリウム利尿ペプチドが挙げられる。これらの非特異的マーカーは以下に詳細に説明する。
本明細書において用いる場合，“急性期反応物質”との用語は，種々の傷害，例えば，感染，創傷，外科手術，外傷，組織壊死等の間に生ずるストレス性または炎症性状態に対する応答においてその濃度が上昇する蛋白質を表す。急性期反応物質の発現および血清濃度の上昇は，傷害の種類に特異的ではなく，傷害に対する恒常性応答の一部として生ずるものである。
すべての急性期反応物質は，傷害に応答して産生される。ある成分は必要でないかもしれないが，これはおそらく広範な傷害を統御するためであろう。伝統的な急性期蛋白質の例には，Ｃ−反応性蛋白質，セルロプラスミン，フィブリノーゲン，α１−酸糖蛋白質，α１−アンチトリプシン，およびハプトグロビンが含まれる。種々のサイトカインおよび関連する分子，例えばインスリン様増殖因子−１，インターロイキン−１β，インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト，インターロイキン−６，トランスフォーミング増殖因子β，および腫瘍壊死因子αは，急性期反応にも密接に関連する炎症性応答の成分である。そのようなサイトカインは，傷害の部位から血流中に放出され，他の急性期蛋白質を発現するようそれ自身を誘導することができる。他の急性期反応物質には，Ｅ−セレクチン，細胞間接着分子−１，マトリクスメタロプロテアーゼ（例えば，マトリクスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）），単球走化性蛋白質−１，血管細胞接着分子等が含まれる。
本明細書において用いる場合，“診断”との語句は，患者が所定の疾病または健康状態を患うか否かを当業者が推定または判定することができる方法を表す。当業者はしばしば，１またはそれ以上の診断指標，すなわち，その存在，非存在または量が病気の存在，重度，または非存在を指示するマーカーに基づいて診断を行う。
同様に，予後はしばしば，１またはそれ以上の“予後指標”を調べることにより決定される。これらは，患者（または患者から得たサンプル）におけるその存在または量が，所定の経過または転帰が生ずるであろう確率を知らせるマーカーである。例えば，そのような患者から得たサンプルにおいて，１またはそれ以上の予後指標が充分に高いレベルに達していれば，そのレベルは，その患者がより低いマーカーレベルを示す同様の患者と比較して，将来卒中を経験する確率が増加していることを示すであろう。予後指標のレベルまたはレベルの変化は，次に病的状態または死亡の確率の増加と関連し，これは“患者における有害な転帰に至る疾病素質の増加と関連する”と称される。好ましい予後マーカーは，卒中後の患者における遅延型神経症候の発症または将来の卒中の確率を予測することができる。
本明細書において用いる場合，診断および予後指標の使用に関して，“相関させる”との用語は，患者における指標の存在または量を，所定の健康状態を患っていることが知られているか，またはそのリスクを有することが知られている人，または所定の健康状態を有しないことが知られている人におけるその存在または量と比較することを表す。上述したように，患者サンプルにおけるマーカーレベルを，特定のタイプの卒中と関連することが知られているレベルと比較することができる。サンプルのマーカーレベルは，診断と相関づけられているといわれる。すなわち，当業者は，マーカーレベルを用いて，患者が特定のタイプの卒中を患っており，それにしたがって応答しているか否かを判定することができる。あるいは，サンプルのマーカーレベルを，良好な転帰（例えば，卒中がないことなど）と関連することが知られているマーカーレベルと比較することができる。好ましい態様においては，ＲＯＣ曲線を用いてマーカーレベルのプロファイルを包括的確率または特定の転帰と相関させる。
ある態様においては，診断または予後指標を，単にその存在または非存在により健康状態または疾病と相関させる。別の態様においては，診断または予後指標の閾値レベルを確立し，患者サンプルにおける指標のレベルを単に閾値レベルと比較することができる。本発明のマーカーについての好ましい閾値レベルは，約２５ｐｇ／ｍＬ，約５０ｐｇ／ｍＬ，約６０ｐｇ／ｍＬ，約７５ｐｇ／ｍＬ，約１００ｐｇ／ｍＬ，約１５０ｐｇ／ｍＬ，約２００ｐｇ／ｍＬ，約３００ｐｇ／ｍＬ，約４００ｐｇ／ｍＬ，約５００ｐｇ／ｍＬ，約６００ｐｇ／ｍＬ，約７５０ｐｇ／ｍＬ，約１０００ｐｇ／ｍＬ，および約２５００ｐｇ／ｍＬである。この文脈において“約”との用語は，±１０％を表す。
さらに別の態様においては，１またはそれ以上の診断または予後マーカーの多数の決定を行うことができ，マーカーの時間的変化を用いて診断または予後を決定することができる。例えば，最初の時に診断指標を決定し，第２の時に再び決定することができる。そのような態様においては，最初の時から第２の時へのマーカーの増加は，特定のタイプの卒中，または所定の予後の診断上の特徴を示すかもしれない。同様に，最初の時から第２の時へのマーカーの減少は，特定のタイプの卒中，または所定の予後の診断上の特徴を示すかもしれない。
さらに別の態様においては，１またはそれ以上の診断または予後マーカーの多数の決定を行うことができ，マーカーの時間的変化を用いて，神経保護療法，血栓崩壊療法，または他の適切な療法の有効性をモニターすることができる。そのような態様においては，有効な療法の経過の間にマーカーの減少または増加が見られることが予測される。
ある態様においては，多数の時点において同じ診断マーカーの比較測定を行うが，当業者は，１つの時点で所定のマーカーを測定し，第２の時点で第２のマーカーを測定し，これらのマーカーの比較の結果から診断情報が与えられることを理解するであろう。同様に，当業者は，逐次的測定，およびマーカーの変化またはある時間にわたって組み合わせた結果もまた，診断および／または予後の価値を有することを理解するであろう。
本明細書において用いる場合，“予後を決定する”との句は，当業者が患者における健康状態の経過または転帰を予測することができる方法を表す。“予後”との用語は，病気の経過または転帰を１００％の正確性をもって予測する，または所定の経過または転帰がおそらく生じるであろうと予測することができることを表すものではない。そうではなく，当業者は，“予後”との用語は，ある種の経過または転帰が生ずるであろう確率の増加，すなわち，その健康状態を示す患者において，その健康状態を示さない個体と比較したときに，ある経過または転帰がより生じやすいことを表すものであることを理解するであろう。例えば，その健康状態を示さない個体において，所定の転帰の確率は約３％であろう。好ましい態様においては，予後は，所定の転帰の約５％の確率，約７％の確率，約１０％の確率，約１２％の確率，約１５％の確率，約２０％の確率，約２５％の確率，約３０％の確率，約４０％の確率，約５０％の確率，約６０％の確率，約７５％の確率，約９０％の確率，および約９５％の確率である。この文脈において，“約”との用語は，±１％を表す。
当業者は，予後指標を有害な転帰に至る疾病素質と関連づけることは統計学的分析であることを理解するであろう。例えば，統計学的有意性のレベルにより判定して，８０ｐｇ／ｍＬより高いマーカーレベルは，その患者が８０ｐｇ／ｍＬと同じかまたはこれより低いレベルを有する患者より有害な転帰となりやすいことを示すであろう。さらに，ベースラインレベルからのマーカー濃度の変化は，患者の予後を反映するかもしれず，マーカーレベルの変化の程度は有害な事象の重度と関連するかもしれない。統計学的有意性は，しばしば，２またはそれ以上の集団を比較し，信頼区間および／またはｐ値を決定することにより決定することができる。例えば，Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３を参照。本発明の好ましい信頼区間は，９０％，９５％，９７．５％，９８％，９９％，９９．５％，９９．９％および９９．９９％であり，好ましいｐ値は，０．１，０．０５，０．０２５，０．０２，０．０１，０．００５，０．００１，および０．０００１である。予後指標を有害な転帰に至る疾病素質と関連づけるための例示的な統計学的検定は以下に記載される。
別の態様においては，予後または診断指標のレベルの変化の閾値の値を確立し，患者サンプルにおける指標のレベルの変化の値を単にレベルの変化の閾値の値と比較することができる。本発明のマーカーのレベルの変化の好ましい閾値は，約５％，約１０％，約１５％，約２０％，約２５％，約３０％，約５０％，約７５％，約１００％，および約１５０％である。この文脈において，“約”との用語は，±１０％を表す。さらに別の態様においては，予後または診断指標のレベルを所与の転帰に至る関連する素因と直接関連づけることができる“ノモグラム”を確立することができる。当業者は，集団平均ではなく個々のサンプル測定値が参照されるために，この測定の不確定性はマーカー濃度の不確定性と同じであることを理解して，そのようなノモグラムを用いて２つの数値を関連づけることを熟知している。
さらに別の観点においては，本発明は，卒中と診断された患者において用いるための治療計画を決定する方法に関する。この方法は，好ましくは，本明細書に記載されるように１またはそれ以上の診断または予後マーカーのレベルを決定し，そしてマーカーを用いて患者の診断を決定することを含む。例えば，予後には，卒中の発症後の遅延型神経症候の発生または疾病素質も含まれるであろう。次に，診断に伴う有害な転帰の素因の増加を減らすことにより患者の予後を改良する１またはそれ以上の治療計画を用いて患者を治療することができる。そのような方法はまた，上述のように患者の予後を改良することができる試薬について，医薬化合物をスクリーニングするためにも用いることができる。
別の観点においては，本発明は，脳血管痙攣のリスクを有する患者を識別する方法に関する。この方法は，好ましくは，クモ膜下出血と診断された患者からの試験サンプル中の，後に起こる脳血管痙攣を予測するマーカーの量を，前記マーカーの予測レベルと比較することを含み，前記マーカーは，フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），およびマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）からなる群より選択され，前記患者は，前記マーカーのレベルが前記予測レベルと同等またはそれ以上であれば，脳血管痙攣のリスクを有すると識別される。
さらに別の観点においては，本発明は，そのようなマーカーパネルを用いて虚血性卒中を出血性卒中から区別する方法に関する。
さらに別の観点においては，本発明は，患者の診断または予後を決定するためのキットに関する。これらのキットは，好ましくは，患者サンプル中の１またはそれ以上のマーカーレベルを測定するための装置および試薬，およびアッセイを行うための指針を含む。任意に，キットはマーカーレベルを予後に変換する１またはそれ以上の手段を含んでいてもよい。そのようなキットは，好ましくは，１またはそれ以上のそのような判定を行うのに十分な試薬，および／またはＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）に認可されたラベルを含む。
本発明にしたがえば，被験者における診断，予後，または卒中とＴＩＡとの区別に関連するマーカーを同定および使用するための方法および組成物が提供される。そのようなマーカーは，被験者の診断および治療において，および／または，治療計画の経過をモニターするために；特定の疾病の発症またはリスクについて被験者をスクリーニングするために；およびそのような健康状態の治療または予防において有益であるかもしれない化合物および医薬組成物をスクリーニングするために用いることができる。
卒中は，血液を供給し，したがって脳に酸素および影響を供給する血管の閉塞または破裂により引き起こされる，急に発症する病理学的状態である。創傷の直近領域は“コア”と称され，これは虚血または物理学的損傷の結果として死んだ脳細胞を含む。“半影”はコア中の細胞と神経学的にまたは化学的に接続している脳細胞から構成される。半影中の細胞は傷害を受けているが，それでもなお，卒中の間に引き起こされた傷害が除かれた後に完全に回復する能力を有する。しかし，出血からの虚血または放血が続くにつれて，死亡細胞のコアは傷害の部位から拡大し，その結果半影の細胞が同時に拡大する。コアの最初の体積およびコア拡大の速度は卒中の重度と関係しており，ほとんどの場合，神経学的な転帰が生ずる。
脳は２つの主要なタイプの細胞，すなわちニューロンとグリア細胞とを含む。ニューロンは，脳において最も重要な細胞であり，電気的および化学的シグナリングを介する脳内伝達の維持を担う。グリア細胞は，主として脳の構造成分として機能し，ニューロンの約１０倍多い。中枢神経系（ＣＮＳ）のグリア細胞は星状細胞および稀突起である。星状細胞は，脳間隙の主要な細胞であり，ニューロンと絡み合いこれを取り巻く細胞プロセスを広げ，このため他のニューロンから区別される。星状細胞はまた，毛細管を囲むプロセスの終わりに‘軸索終末”を形成する。稀突起はＣＮＳにおいて軸索の周りにミエリン鞘を形成する細胞である。各稀突起は５０までの軸索を鞘で覆うことができる。シュワン細胞は，末梢神経系（ＰＮＳ）のグリア細胞である。シュワン細胞は，周囲で軸索の周りにミエリン鞘を形成し，各シュワン細胞は一つの軸索を被覆でおおう。
卒中の間の細胞死は，ＣＮＳの細胞に対する虚血または物理学的傷害の結果として生ずる。虚血性卒中の間に梗塞が生じ，これは梗塞の部位を越えて血液の流れを非常に減少させるか停止させる。梗塞を越えてすぐの領域はまもなく細胞生存に必須の栄養の適当な血液濃度を失う。代謝などの重要な機能の維持に必須の栄養を欠如した細胞はまもまく死ぬ。出血性卒中は，直接外傷，頭蓋内圧の上昇，および傷害性生化学的物質の血液への放出により細胞死を誘導することができる。細胞が死ぬと，これらはサイトゾルの成分を細胞外環境に放出する。
中枢神経系の毛細管内皮細胞の間の堅い接合の関門作用は，“血液−脳関門”と称される。この関門は，通常は蛋白質および他の分子を，大きいものも小さいものも透過させない。他の組織，例えば，骨格，心臓および平滑筋においては，内皮細胞の間の接合は，ほとんどの分子を通過させるが蛋白質を通過させない程度にゆるい。
中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンおよびグリア細胞（細胞内脳コンパートメント）から分泌される物質は，細胞外環境（細胞外脳コンパートメント）中に自由に入ることができる。同様に，細胞外脳コンパートメントからの物質は細胞内脳コンパートメント中に入ることができる。細胞内脳コンパートメントと細胞外脳コンパートメントとの間の物質の通過は，物質の出入りを制御する正常な細胞メカニズムにより制限されている。細胞外脳コンパートメントに見いだされる物質はまた，自由に脳脊髄液中に入ることができ，その逆も自由である。この動きは拡散により調節されている。
脈管構造とＣＮＳとの間の物質の動きは，血液−脳関門により制限されている。この制限は，種々の物質のなかでも特にＣＮＳの細胞が消費するための栄養（例えば，グルコースおよびアミノ酸）を関門を超えて輸送する，内皮細胞における促進輸送メカニズムにより迂回することができる。さらに，脂溶性物質，例えば，分子状酸素および二酸化炭素，ならびにすべての脂溶性薬剤または麻酔は，血液−脳関門を越えて自由に拡散することができる。
卒中または他のニューロパシーの間に傷害を受けた脳細胞から放出される脳損傷の特異的マーカーは，そのサイズによって，ＣＮＳ創傷と一緒にまたはその後に血液−脳関門の透過性が増加したときにのみ，末梢血液中に見いだされるであろう。このことは，より大きい分子について特にあてはまる。より小さい分子は，受動的拡散，能動的輸送，または血液−脳関門の透過性の増加の結果として，末梢血液に出現することができる。血液−脳関門の透過性の増加は，腫瘍の侵襲および溢血または血管破裂などの場合における物理学的破壊の結果として，または虚血による内皮細胞死の結果として生じうる。卒中の間，血液−脳関門は内皮細胞死により傷害を受け，局所的な細胞外環境中に存在する死細胞のサイトゾル成分が血流中に入ることができる。
したがって，脳損傷の特異的マーカーはまた，血液または血液成分，例えば，血清および血漿に，ならびに卒中またはＴＩＡを経験した患者のＣＳＦにも見いだされうる。さらに，虚血性卒中における遮断物体のクリアランスにより，再灌流の間の酸化的傷害からの創傷が引き起こされる可能性があり，虚血性卒中を有する患者は，再灌流または血栓崩壊性治療の結果としてしばしば出血性変態を経験しうる。さらに，血管痙攣により創傷が引き起こされる可能性がある。これは出血後の脳の基底の大容量動脈における局所性または散在性の狭窄である。血液−脳関門の透過性の増加は傷害の重度と関連しており，傷害の消散の後にその一体性が再確立される。脳損傷の特異的マーカーは，これらの大分子が関門を越えて拡散することを可能とするのに充分な血液−脳関門の透過性の増加があった場合にのみ末梢血液中に存在する。この点に関して，脳損傷の最も特異的なマーカーは，卒中またはＣＮＳに影響を及ぼす他のニューロパシーの後に脳脊髄液中に見いだすことができる。さらに，卒中における血液凝固またはフィブリン溶解マーカーの多くの研究が脳脊髄液を用いて行われている。
卒中における血液凝固カスケード
血管創傷の後に血液の喪失を停止または防止するためには，本質的に２つのメカニズムが用いられている。第１のメカニズムは，血小板を活性化して血管創傷の部位への付着を促進することを含む。次に活性化された血小板が凝集して血小板栓を形成し，これが血液の喪失を減少させ一時的に停止する。血小板凝集，栓形成および組織修復のプロセスはすべて，活性化された血小板により分泌される多くの因子により加速され増強される。血小板凝集および栓形成は，活性化された血小板の間にフィブリノーゲン架橋が形成されることを介して生ずる。第２のメカニズムである血液凝固カスケードが同時に活性化されることにより，フィブリノーゲンからフィブリンが生成し，血小板栓を強化する不溶性フィブリン凝固が形成される。
血液凝固カスケードは，通常は不活性型でまたはチモーゲン型で存在する多くのセリンプロテアーゼを含む酵素的経路である。脈管構造または血管創傷中に外来表面が存在すると，それぞれ内因性および外因性血液凝固経路が活性化される。次に最終共通経路が続き，その結果セリンプロテアーゼであるトロンビンによりフィブリンが生成し，最終的には架橋されたフィブリン凝固が生ずる。血液凝固カスケードにおいては，最初に１つの活性な酵素が形成され，これが他の酵素を活性化することができ，それらはさらに他の酵素を活性化する。このプロセスは，制御されないままであれば，すべての血液凝固酵素が活性化されるまで続きうる。幸い，フィブリン溶解や，血液凝固経路の活性および凝塊形成を制御することができる内因性プロテアーゼ阻害剤の作用などのメカニズムが存在する。
フィブリン溶解は，蛋白質分解性の凝塊溶解のプロセスである。フィブリン溶解は，血液凝固と類似する様式で，それらのチモーゲン型から活性化されるセリンプロテアーゼにより媒介される。セリンプロテアーゼであるプラスミンは，凝塊から遊離されたフィブリンをより小さい分解産物に分解して，凝塊溶解を生じさせることを担う。フィブリン溶解は，凝塊形成を制御するために，血液凝固の直後に活性化される。内因性セリンプロテアーゼ阻害剤もまたフィブリン溶解のレギュレータとして機能する。
脳脊髄液における血液凝固またはフィブリン溶解マーカーの存在は，用いられるマーカーに依存して，血液凝固またはフィブリン溶解の活性化，およびこれと連動して血液−脳関門の透過性の増加が生じたことを示すであろう。この点に関して，急性卒中に伴う血液凝固またはフィブリン溶解マーカーの存在に関するより明確な結論は，脳脊髄液を用いて得ることができる。
血小板は平均直径２−４μｍの円形又は楕円形の板であり，通常は血液中に濃度２００，０００−３００，０００／μｌで存在する。これは，血管の一体性を維持することにより止血を維持するのに本質的な役割を果たしており，最初に血管創傷の部位において血小板栓を形成することにより出血を止め，フィブリン形成のプロセスに寄与することにより血小板栓を安定化させる。血管創傷が生じたとき，血小板が創傷の部位におよび互いに付着し，付着血小板および創傷内皮細胞から放出された種々の反応物により，凝集するよう刺激される。この後に，血小板がその細胞内粒子の内容物を分泌する放出反応が生じ，血小板栓が形成される。血液凝固カスケードにおけるトロンビンによるフィブリンの形成は，栓を硬化させ，次に，架橋されたフィブリンにより凝塊が収縮し，栓が安定化する。同時に発生する血液凝固カスケードにおいて生成される活性なトロンビンもまた，血小板活性化および凝集を誘導することができる。
血液凝固カスケードは，外因性または内因性経路のいずれかにより活性化されることができる。これらの酵素的経路は１つの最終共通経路を共有する。血液凝固活性化の結果，架橋されたフィブリン凝塊が形成される。フィブリン溶解は，おそらくは凝塊形成の速度および量を制御する目的で，血液凝固活性化の直後に活性化される蛋白質分解性凝塊溶解のプロセスである。ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ（ｕＰＡ）および組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）は，蛋白質分解的にプラスミノーゲンを切断し，活性なセリンプロテアーゼであるプラスミンを生成する。プラスミンは，架橋したフィブリンを蛋白質分解的に消化し，その結果，凝塊の溶解およびフィブリン分解産物の産生および放出が生ずる。
血液凝固カスケードの共通の経路の第１段階には，Ｘａ因子／Ｖａ因子プロトロンビナーゼ複合体によるプロトロンビンの蛋白質分解性切断および活性トロンビンの生成が含まれる。トロンビンは，蛋白質分解的にフィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するセリンプロテアーゼであり，これは最終的には凝塊形成の間に架橋ネットワーク中に統合される。
代表的なマーカー
（i）損傷に特異的なマーカー
アデニレートキナーゼ（ＡＫ）は広範に分布する２２ｋＤａの細胞質ゾル酵素であり，ＡＴＰおよびＡＭＰのＡＤＰへの相互変換を触媒する。アデニレートキナーゼの４つのアイソフォームが哺乳動物組織で同定されている（Yoneda, T.ら, Brain Res Mol Brain Res 62:187-195, 1998）。ＡＫ１アイソフォームは脳，骨格筋，心臓，および大動脈に見られる。ＡＫ１の正常な血清中の質量濃度は現在のところ未知であり，これは一般に機能アッセイを使用して総ＡＫ濃度を測定するためである。正常な血清ＡＫ濃度は＜５ユニット／リットルであり，ＣＳＦを使用するとＡＫが上昇することが明らかになっている（Bollensen, E.ら, Acta Neurol Scand 79:53-582, 1989）。血清ＡＫ１は，脳損傷のマーカーとして最も特異性の高いＡＫアイソフォームであると考えられる。ＡＫは脳虚血の脳脊髄液マーカーとして最も好適でありえ，その主なソースは神経組織である。
ニューロトロフィンは哺乳動物の神経系において発現される成長因子のファミリーである。例として神経成長因子（ＮＧＦ），脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ），ニューロトロフィン（ＮＴ-３），およびニューロトロフィン-４／５（ＮＴ-４／５）がある。ニューロトロフィンは主に標的由来のパラ分泌または自己分泌神経栄養因子としてその作用を及ぼす。ニューロンの生存，分化，および維持におけるニューロトロフィンの役割は十分知られている。それらは部分的に重複しているが，異なる発現様式および細胞標的を示す。中枢神経系における作用に加え，ニューロトロフィンは末梢求心性および遠心性ニューロンにも作用を及ぼす。
ＢＤＮＦは神経細胞および／またはグリア細胞の増殖および生存能力を支持する有効な神経栄養因子である。ＢＤＮＦは３２ｋＤａの前駆体"ｐｒｏ-ＢＤＮＦ"分子として発現され，これが切断されて成熟型のＢＤＮＦとなる。Mowla ら, J. Biol. Chem. 276: 12660-6 (2001)。最も多く存在する活性型ヒトＢＤＮＦは２７ｋＤａのホモ２量体であり，２つの同じ１１９アミノ酸サブユニットから形成され，それらは強い疎水性相互作用によって結合している；しかしながら，ｐｒｏ-ＢＤＮＦは細胞外にも放出され，生物学的に活性である。ＢＤＮＦはＣＮＳ中にわたって広く分布し，インビトロで広範なニューロン細胞（海馬，小脳，皮質ニューロンを含む）に栄養作用を示す。インビボではＢＤＮＦは外傷性および毒性脳損傷から神経細胞を救助することが発見されている。例えば研究で明らかになっているところによれば，一過性中大脳動脈閉塞の後，ＢＤＮＦ ｍＲＮＡは皮質ニューロンにおいて亢進的に調節される（Schabiltz ら, J. Cereb. Blood Flow Metab. 14:500-506, 1997）。実験的に誘導した局所性片側血栓卒中では，卒中後２時間から１８時間までＢＤＮＦ ｍＲＮＡが上昇した。それらの結果はＢＤＮＦが局所性脳虚血において神経保護の役割を果たしている可能性があることを示唆している。
ＮＴ-３も２つの１１９アミノ酸サブユニットからなる２７ｋＤａのホモ２量体である。皮質細胞の初代培養液にＮＴ-３を添加すると，酸素-グルコース欠乏に起因するニューロン死が悪化することが明らかになっており，これは酸素を含まないラジカル機構を介している可能性がある（Bates ら, Neurobiol. Dis. 9:24-37, 2002）。ＮＴ-３は不活性なｐｒｏ-ＮＴ-３分子として発現され，これが切断されて生物学的に活性な成熟型となる。
カルビンジン（Calbindin）-Ｄは２８ｋＤａの細胞質ゾルビタミンＤ依存型Ｃａ2+-結合蛋白質であり，細胞内カルシウムレベルを安定化することによって細胞保護機能を示しうる。カルビンジン-Ｄは中枢神経系（主にグリア細胞），および遠位尿細管の細胞に見られる（Hasegawa, S. ら, J. Urol. 149:1414-1418, 1993）。正常なカルビンジン-Ｄの血清濃度は＜２０ｐｇ／ｍｌ（０．７ｐＭ）である。報告によれば，血清カルビンジン-Ｄ濃度は心停止後に上昇し，この上昇は脳虚血によるＣＮＳ損傷の結果であると考えられている（Usui, A. ら, J. Neurol. Sci. 123:134-139, 1994）。血清カルビンジン-Ｄの上昇は，虚血後再潅流の後すぐに上昇し，プラトーになる。最大血清カルビンジン-Ｄ濃度は７００ｐｇ／ｍｌ（２５ｐＭ）という高さにまでなりうる。
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は細胞質ゾル酵素であり，ＡＴＰおよびクレアチンからＡＤＰおよびホスホクレアチンへの可逆的な生成を触媒する。脳特異的ＣＫアイソフォーム（ＣＫ-ＢＢ）は８５ｋＤａの細胞質ゾル蛋白質であり，脳の総ＣＫ活性の約９５％を占める。これは心臓組織，小腸，前立腺，直腸，胃，平滑筋，甲状腺，子宮，膀胱，および静脈にもかなりの量で存在する（Johnsson, P. J., Cardiothorac. Vasc. Anesth. 10:120-126, 1996）。正常なＣＫ-ＢＢの血清濃度は＜１０ｎｇ／ｍｌ（１２０ｐＭ）である。血清ＣＫ-ＢＢは低酸素性および虚血性脳損傷後に上昇するが，特定の型の卒中における血清上昇を確認するには更なる調査が必要である（Laskowitz, D.T. ら, J. Stroke Cerebrovasc. Dis. 7:234-241, 1998）。血清中のＣＫ-ＢＢの上昇は，血液脳関門の透過性の上昇を伴う，虚血による脳損傷を原因とすると考えることができる。ＣＫ-ＢＢの血清濃度と損傷の程度（梗塞量）または神経学的転帰の相関性は立証されていない。ＣＫ-ＢＢの血清中の半減期は１-５時間であり，通常，血清中で＜１０ｎｇ／ｍｌ（１２０ｐＭ）の濃度で検出される。重度の卒中では，ＣＫ-ＢＢの血清濃度は卒中の発症後すぐに上昇してピークに達し（２４時間以内），徐々に回復して３-７日後に正常となる（４）。頭部を損傷した個体の血清ＣＫ-ＢＢ濃度は損傷後すぐにピークとなり，損傷の重度によって，損傷後３．５-１２時間の間に正常に戻る（Skogseid, I.M. ら, Acta Neurochir.(Wien.) 115:106-111, 1992）。最大血清ＣＫ-ＢＢ濃度は２５０ｎｇ／ｍｌ（３ｎＭ）を超えうる。ＣＫ-ＢＢは脳虚血のＣＳＦマーカーとして最も好適でありえ，その主なソースは神経組織である。ＣＫＢＢは頭部損傷後のＣＮＳ損傷の血清マーカーとしてより好適でありえ，これはそれらの個体において短時間で上昇し，その除去が損傷の重度に依存すると考えられるためである。
グリア繊維状酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）は５５ｋＤａの細胞質ゾル蛋白質であり，アストログリアフィラメントの主な構造要素で，星状細胞における主な中間径フィラメント蛋白質である。ＧＦＡＰは星状細胞に特異的であり，ＣＮＳに位置する間質細胞で，血液脳関門付近に見られる。ＧＦＡＰは通常，血清中に検出されない。血清ＧＦＡＰは虚血性卒中後に上昇する。（Niebroj-Dobosz, I., ら, Folia Neuropathol. 32:129-137, 1994）。現在のところ，卒中に伴う血清ＧＦＡＰの上昇を調査する報告は非常に限られており，全ての型の卒中のための血清マーカーとしてＧＦＡＰを確立するためには，更なる調査が必要である。卒中マーカーとしてＧＦＡＰを調査する研究のほとんどは，脳脊髄液を使用して行われてきた。血清中のＧＦＡＰの上昇は，血液脳関門の透過性の上昇を伴う，虚血による脳損傷を原因とすると考えることができる。ＧＦＡＰの血清濃度と損傷の程度（梗塞量）または神経学的転帰の相関性は立証されていない。ＧＦＡＰはＣＮＳを冒す種々の神経障害を有する個体の脳脊髄液で上昇するが，卒中以外の疾病を有する個体の血清へのＧＦＡＰの放出について記載している報告は現在のところ得られていない（Albrechtsen, M.およびBock, E. J., Neuroimmunol. 8:301-309, 1985）。ＧＦＡＰの血清濃度は卒中の発症後すぐに上昇し，連続的に増加し，ある期間（数週間，これは損傷の重度と相関関係がありうる）持続すると考えられる。ＧＦＡＰは，重度のＣＮＳ損傷，特に虚血または物理的損傷に起因する細胞死による星状細胞への損傷の非常に特異的なマーカーであると考えられる。
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は，広範に分布する１３５ｋＤａの細胞質ゾル酵素である。これはＡおよびＢ鎖の４量体であり，ＮＡＤＨによるピルビン酸の乳酸への還元を触媒する。ＬＤＨの５つのアイソフォームが哺乳動物組織で同定されており，組織特異的アイソフォームは異なる組み合わせのＡおよびＢ鎖から生成される。ＬＤＨの正常な血清中の質量濃度は現在のところ未知であり，これは一般に機能アッセイを使用して総ＬＤＨ濃度を測定するためである。正常な血清ＬＤＨ濃度は＜６００ユニット／リットルである（Ray, P. ら, Cancer Detect. Prev. 22:293-304, 1998）。卒中に関するＬＤＨ上昇の調査の大多数は脳脊髄液を使用して行われており，上昇は損傷の重度と相関する。血清ＬＤＨ活性の上昇は虚血性および出血性卒中のいずれの後でも報告されているが，この観察を確認し，損傷の重度および神経学的転帰との相互関係を確認するためには，血清においての更なる研究が必要である（Aggarwal, S.P. , J. lndian Med. Assoc. 93:331-332, 1995；Maiuri, F. ら, Neurol. Res. 11:6-8, 1989）。ＬＤＨは脳虚血の脳脊髄液マーカーとして最も好適でありえ，その主なソースは神経組織である。
ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）は実際には，１つのＭＢＰ遺伝子の異なるスプライシングによって生成される１４-２１ｋＤａの細胞質ゾル蛋白質ファミリーであり，ミエリン形成過程の際の軸索周囲のミエリンの緊密化に関係があると考えられる。ＭＢＰはＣＮＳおよび末梢神経系（ＰＮＳ）のシュワン細胞における乏突起膠細胞に特異的である。これはＣＮＳ中の総ミエリン蛋白質の約３０％，そしてＰＮＳ中の総ミエリン蛋白質の約１０％を占める。ＭＢＰの正常な血清濃度は＜７ｎｇ／ｍｌ（４００ｐＭ）である。血清ＭＢＰは全ての型の重度の卒中，特に血栓性卒中，塞栓性卒中，脳内出血，およびクモ膜下出血の後に上昇するが，ＭＢＰ濃度の上昇は軽度から中度の卒中（腺窩性梗塞または一過性虚血発作を含む）を有する個体の血清では報告されていない（Palfreyman, J.W. ら, Clin. Chim. Acta 92:403-409, 1979）。血清におけるＭＢＰの上昇は，血液脳関門の透過性の上昇を伴う，梗塞または脳内出血に起因する物理的損傷または虚血による脳損傷を原因とすると考えることができる。ＭＢＰの血清濃度は損傷の程度（梗塞量）と相互関係があることが報告されているが，これは神経学的転帰とも相互に関係しうる。卒中に伴う血清ＭＢＰの上昇に関する入手可能な情報の量は限られており，これはほとんどの調査が脳脊髄液を使用して行われてきたためである。ＭＢＰは通常，血清中に７ｎｇ／ｍｌ（４００ｐＭ）の上限で検出され，重度の卒中および脳損傷の後に上昇する。血清ＭＢＰは卒中の発症後，数時間内に上昇し，その濃度は発症後２-５日以内に最大レベルまで上昇すると考えられる。血清濃度がその最大値（１２０ｎｇ／ｍｌ（６．９ｎＭ）を超えうる）に達した後，徐々に低下して正常濃度となるまでに１週間以上かかりうる。損傷の重度はＭＢＰの放出に直接影響を与えるので，血清中でＭＢＰが上昇する時間の長さに影響を与えることによって放出速度論に影響を与える。ＭＢＰは損傷の重度が高くなるほど，長時間血清中に存在する。頭部損傷を有する患者の血清中へのＭＢＰの放出は卒中に関して記載されるのと同様の反応速度論に従うと考えられる。ただし，血清ＭＢＰ濃度は頭部損傷を有する個体の神経学的転帰と相互関係があると報告されている。（Thomas, D.G. ら, Acta Neurochir. Suppl. (Wien) 28:93-95, 1979）。頭蓋内腫瘍を有する患者の血清中へのＭＢＰの放出は持続性があると考えられるが，まだ調査が必要である。最後に，血清ＭＢＰ濃度は脱髄性疾患を有する個体で上昇することがあるが，決定的な調査はまだ報告されていない。多発性硬化症を有する個体で報告されているように，ＭＢＰはしばしば脳脊髄液中で上昇するが，多くの場合，それに匹敵する血清での上昇はない（Jacque, C. ら, Arch. Neurol. 39:557-560, 1982）。これは，脳損傷は血管脳関門の浸透性の増加を伴い，それによって血清ＭＢＰ濃度の上昇が起きることを示唆している。しかしながら，ＭＢＰは頭蓋内腫瘍を有する個体集団においても上昇しうる。これらの個体が卒中のためにこのマーカーを使用してアッセイを行う対象となりうる，より大きな個体集団中に存在することはまれである。それでもなお，これらの個体は，脳神経外科的処置を受けている個体または脱髄疾患を有する個体と合わさって，脳障害に関するＭＢＰの特異性の判定に影響を及ぼす。更に，血清ＭＢＰは重度の卒中のマーカーとして有用でありえ，卒中の療法および治療，例えばｔＰＡ投与が有益ではない個体を同定できる可能性を有している。
神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）（ＣＤ５６とも呼ばれる）は１７０ｋＤａの細胞表面結合型免疫グロブリン様インテグリンリガンドであり，神経系におけるニューロンおよびグリア細胞の相互作用の保持に関与しており，これは星状細胞，乏突起膠細胞，シュワン細胞，ニューロン，および軸索の表面上で発現される。ＮＣＡＭは発達中の骨格筋管にも局在し，その発現は骨格筋において発達，神経支配除去，および再神経支配の際に亢進的に調節される。正常な血清中のＮＣＡＭの質量濃度は報告されていない。ＮＣＡＭは一般に，機能性酵素免疫アッセイによって測定され，正常な血清濃度は＜２０ユニット／ｍｌであることが報告されている。卒中に明確に関係する血清ＮＣＡＭ濃度の変化は報告されていない。ＮＣＡＭは脳虚血のＣＳＦマーカーとして最も好適でありえ，その主なソースは神経組織である。
エノラーゼは７８ｋＤａのホモまたはヘテロ２量体細胞質ゾル蛋白質であり，α，β，およびγサブユニットから生成される。これは解糖系において２-ホスホグリセリン酸およびホスホエノールピルビン酸の相互変換を触媒する。エノラーゼはαα，ββ，αγ，およびγγアイソフォームで存在する。αサブユニットはグリア細胞および他のほとんどの組織で見られ，βサブユニットは筋組織で見られ，γサブユニットは存在するとすれば主にニューロン細胞および神経内分泌細胞で見られる（Quinn, G.B. , Clin. Chem. 40:790-795, 1994）。エノラーゼのγγアイソフォームはニューロンに最も特異的であり，ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）と呼ばれる。ＮＳＥは主にニューロンおよび神経内分泌細胞に見られるが，血小板および赤血球にも存在する。正常なＮＳＥの血清濃度は＜１２．５ｎｇ／ｍｌ（１６０ｐＭ）である。ＮＳＥは２つのサブユニットからなり，従ってＮＳＥ濃度を検出するために使用される最も適した免疫学的アッセイは，サブユニットの１つを対象とするものである。この場合，γサブユニットが理想的な選択である。しかしながら，γサブユニット単独ではγγアイソフォームほど脳組織に特異的ではなく，これはγサブユニット単独の測定ではαγおよびγγアイソフォームの両方が検出されるためである。この点で，ＮＳＥの最良の免疫アッセイはγγアイソフォームを特異的に検出できる２部位アッセイである。報告によれば，血清ＮＳＥはＴＩＡも含む全ての型の卒中後に上昇し，これは，脳内で起こり，個体に後日更に重度の卒中を起こさせると考えられる（Isgro, F. ら, Eur. J. Cardiothorac. Surg. 11:640-644, 1997）。血清中のＮＳＥの上昇は，血液脳関門の透過性の上昇を伴う，梗塞または脳内出血に起因する物理的損傷または虚血による脳損傷を原因とすると考えることができ，ＮＳＥの血清濃度は損傷の程度（梗塞量）および神経学的転帰と相互関係があることが報告されている。（Martens, P. ら, Stroke 29:2363-2366, 1998）。更に，血清ＮＳＥ濃度の２次的な上昇は，脳血管攣縮から起こる後発性神経損傷の指標となりうる（Laskowitz, D.T. ら, J. Stroke Cerebrovasc. Dis. 7, 234-241, 1998）。ＮＳＥの生物学的半減期は４８時間であり，通常１２．５ｎｇ／ｍｌ（１６０ｐＭ）の上限で血清中に検出されるが，これは卒中および脳損傷後に上昇する。血清ＮＳＥは卒中の発症から４時間後に上昇し，濃度は発症の１-３日後に最大に達する（Missler, U. ら, Stroke 28:1956-1960, 1997）。血清濃度はその最大（３００ｎｇ／ｍｌ（３．９ｎＭ）を超えうる）に達した後，徐々に低下して約１週間で正常濃度になる。損傷の重度はＮＳＥの放出に直接影響を与えるので，血清中でＮＳＥが上昇する時間の長さに影響を与えることによって放出速度論に影響を与える。ＮＳＥは損傷の重度が高いほど長い時間血清中に存在する。頭部損傷を有する患者の血清中へのＮＳＥの放出は卒中で見られるのとは異なる反応速度論に従い，血清濃度は損傷後１-６時間以内に最大となり，多くの場合，２４時間以内にベースラインまで戻る（Skogseid, I.M. ら, Acta Neurochir. (Wien.) 115:106-111, 1992）。ＮＳＥは脳損傷，特に虚血または物理的損傷に起因する細胞死によるニューロン細胞への損傷に特異的なマーカーである。脳におけるニューロンはグリア細胞より約１０倍少なく，そのため脳血液関門の透過性の上昇を伴う脳損傷はニューロンの有意な局所的集団を有する領域で起こり，血清ＮＳＥ濃度が有意に上昇するはずである。更に，血清ＮＳＥ濃度の上昇はＡＭＩおよび心臓手術後の脳損傷に関係する合併症も示唆しうる。ＮＳＥの血清濃度の上昇は損傷の重度および個体の神経学的転帰と関係する。ＮＳＥはＴＩＡを含む全ての型の卒中のマーカーとして使用できる。しかしながら，ＮＳＥを使用して虚血性卒中と出血性卒中とを識別することはできず，これは神経内分泌性の腫瘍を有する個体群でも上昇する。
プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）は３０ｋＤａの膜内在性蛋白質であり，ＣＮＳミエリンの主要な構造要素である。ＰＬＰはＣＮＳの乏突起膠細胞に特異的で，中枢鞘（central sheath）中の総ＣＮＳミエリン蛋白質の約５０％を占めるが，末梢神経系（ＰＮＳ）ミエリン中に見られるＰＬＰは非常に低レベルである（＜１％）。正常なＰＬＰの血清濃度は＜９ｎｇ／ｍｌ（３００ｐＭ）である。血清ＰＬＰは脳梗塞後に上昇するが，一過性虚血発作後には上昇しない（Trotter, J.L. ら, Ann. Neurol. 14:554-558, 1983）。卒中に伴う血清ＰＬＰの上昇を調査した報告は現在のところ非常に限られている。血清中のＰＬＰの上昇は，血液脳関門の透過性の上昇を伴う，梗塞または脳内出血に起因する物理的損傷または虚血による脳損傷を原因とすると考えることができる。ＰＬＰの血清濃度と損傷の程度（梗塞量）または神経学的転帰の相関性は立証されていない。血清中へのＰＬＰの放出速度論およびその後の除去を試験する研究は報告されていないが，６０ｎｇ／ｍｌ（２ｎＭ）に近い最大濃度が脳炎患者で報告されており，これは卒中後に見られる濃度の２倍近い。ＰＬＰは重度のＣＮＳ損傷，特に乏突起膠細胞の損傷に非常に特異的なマーカーであると考えられる。血清ＰＬＰの上昇および卒中に関して得られている情報は，非常に限られている。ＰＬＰはＣＮＳを冒す種々の神経障害を有する個体の血清中でも上昇する。卒中のためにこのマーカーを使用してアッセイを行う対象となりうる個体のより大きな集団中に，これらの診断されていない個体が存在することはまれである。
Ｓ-１００はαおよびβサブユニットから生成される２１ｋＤａのホモまたはヘテロ２量体の細胞質ゾルＣａ2+結合蛋白質である。これはＣａ2+依存型シグナル変換経路に沿った細胞過程の活性化に関係していると考えられる（Bonfrer, J.M. ら, Br. J. Cancer 77:2210-2214, 1998）。Ｓ-１００ａｏ（ααアイソフォーム）は横紋筋，心臓，および腎臓に見られ，Ｓ-１００ａ（αβアイソフォーム）はグリア細胞に見られるがシュワン細胞には見られず，そしてＳ-１００ｂ（ββアイソフォーム）はグリア細胞およびシュワン細胞中に高濃度で見られ，ここでそれは主要な細胞質ゾル成分である。βサブユニットは正常な生理学的条件下で神経系（主にＣＮＳ）に特異的であり，事実，脳に見られる総Ｓ-１００蛋白質の約９６％を占める（Jensen, R. ら, J. Neurochem. 45:700-705, 1985）。更に，Ｓ-１００βは神経内分泌性腫瘍，例えば神経膠腫，黒色腫，シュワン鞘腫，神経線維腫，そして，神経節芽腫および神経節細胞腫のような高度に分化した神経芽腫にも見られる（Persson, L. ら, Stroke 18:911-918, 1987）。正常なＳ-１００βの血清濃度は＜０．２ｎｇ／ｍｌ（１９ｐＭ）であり，これは使用される免疫学的検出アッセイの検出限界である。血清Ｓ-１００βはＴＩＡを含む全ての型の卒中後に上昇する。血清中のＳ-１００βの上昇は，血液脳関門の透過性の上昇を伴う，梗塞または脳内出血に起因する物理的損傷または虚血による脳損傷を原因とすると考えることができ，Ｓ-１００βの血清濃度は損傷の程度（梗塞量）および神経学的転帰と相互に関係することが明らかになっている（Martens, P. ら, Stroke 29:2363-2366, 1998；Missler, U. ら, Stroke 28:1956-1960, 1997）。Ｓ-１００βの生物学的半減期は２時間であり，通常は血清中で検出されないが，卒中および脳損傷後には上昇する。血清Ｓ-１００βは卒中の発症から４時間後に上昇し，その濃度は発症の２-３日後に最大に達する。血清濃度はその最大（約２０ｎｇ／ｍｌ（１．９ｍＭ）近くになりうる）に達した後，徐々に低下して約１週間で正常になる。損傷の重度はＳ-１００βの放出に直接影響を与えるので，血清中でＳ-１００βが上昇する時間の長さに影響を与えることによって放出速度論に影響を与える。Ｓ-１００βは損傷の重度が高いほど長い時間血清中に存在する。頭部損傷を有する患者の血清中へのＳ-１００βの放出は卒中で報告されているのと多少類似した反応速度論に従う。ただし，血清Ｓ-１００βは発症の２．５時間以内に検出され，発症後約１日で最大血清濃度に達する（Woertgen, C. ら, Acta Neurochir. (Wien) 139:1161-1164, 1997）。Ｓ-１００βは脳損傷，特に虚血または物理的損傷に起因する細胞死によるグリア細胞への損傷に特異的なマーカーである。脳においてグリア細胞はニューロンより約１０倍多く，そのため血液脳関門の透過性の上昇を伴う脳損傷は血清Ｓ-１００βの上昇を起こすと考えられる。更に，Ｓ-１００βの血清濃度の上昇はＡＭＩおよび心臓手術後の脳損傷に関係する合併症も示唆しうる。Ｓ-１００βは正常な個体では実質的に検出されておらず，その血清濃度の上昇は個体の損傷の重度および神経学的転帰と相関する。Ｓ-１００βはＴＩＡを含む全ての型の卒中のマーカーとして使用できる。しかしながら，Ｓ-１００βを使用して虚血性および出血性卒中を識別することはできず，これは神経内分泌性の腫瘍（一般に進行期）を有する個体群でも上昇する。
トロンボモジュリン（ＴＭ）は血管内皮細胞の表面上に見られる７０ｋＤａの１本鎖膜内在性糖蛋白質である。ＴＭは，トロンビンの基質特異性を変化させることによって抗凝血活性を示す。トロンビンおよびＴＭ間の１：１化学量論的複合体の生成により，トロンビンの機能が前凝血剤から抗凝血剤へ変化する。この変化はトロンビンの基質特異性を変化させることによって促進されるが，これによってトロンビンは蛋白質Ｃ（Ｖａ因子およびVIIIａ因子の不活性化剤）を活性化するが，フィブリノーゲンの切断または他の凝固因子の活性化は起こさない（Davie, E.W. ら, Biochem. 30:10363-10370, 1991）。ＴＭの正常な血清濃度は２５-６０ｎｇ／ｍｌ（３５０-８５０ｐＭ）である。これまでに虚血性卒中後の血清ＴＭ濃度の変化について記載している報告は，変化がないことを報告しているもの，または有意な上昇を報告しているものが混在している（Seki, Y. ら, Blood Coagul. Fibrinolysis 8:391-396, 1997）。血清中のＴＭ濃度の上昇は内皮細胞の損傷を反映しており，凝血またはフィブリン溶解の活性化を示すものではない。
蛋白質キナーゼＣのガンマ・アイソフォーム（ＰＫＣｇ）はＣＮＳ組織に特異的であり，一般に循環中には見られない。ＰＫＣｇは脳虚血に際して活性化され，虚血性半影（ischemic penumbra）には対側組織より２-２４倍高いレベルで存在する（Krupinski, J. ら, Acta Neurobiol. Exp. (Warz) 58:13-21, 1998）。更に，動物モデルにより，中大脳動脈閉塞後のラットの末梢循環におけるＰＫＣｇレベルの上昇が確認されている（Cornell-Bell, A. ら, 国際特許公開WO 01/16599号）。ＰＫＣの更なるアイソフォームであるベータＩおよびベータIIは，脳虚血を有する患者由来の脳細胞の梗塞したコアでレベルが上昇していることが発見された（Krupinski, J. ら, Acta Neurobiol. Exp. (Warz) 58:13-21, 1998）。更に，ＰＫＣのアルファおよびデルタ・アイソフォーム（それぞれＰＫＣａおよびＰＫＣｄ）はイヌ出血モデルを使用したクモ膜下出血後の血管痙攣の発生に関係することが確認されている。ＰＫＣｄ発現は血管痙攣の初期段階に脳底動脈で有意に上昇し，ＰＫＣａは血管痙攣の進行に従って有意に上昇した（Nishizawa, S. ら, Eur. J. Pharmacol. 398:113-119, 2000）。従って，ＰＫＣの種々のアイソフォームを，個別に，または種々の組み合わせで測定することは，クモ膜下出血後の脳損傷，虚血性半影の存在，並びに脳血管痙攣の発生および進行の同定ために有益である。ＰＫＣアイソフォーム（例えばＰＫＣｇと，ＰＫＣｂＩ，ＰＫＣｂIIのいずれか，または両方）の比率も，虚血性半影が不可逆的に損傷した梗塞組織に変換する，進行性卒中の同定に有益でありうる。この点について，ＰＫＣｇを使用して虚血性半影の存在および量を同定してもよく，ＰＫＣｂＩ，ＰＫＣｂIIのいずれか，またはその両方を使用して卒中の際の不可逆的に損傷した組織の梗塞したコアの存在および量を同定してもよい。ＰＫＣｄ，ＰＫＣａ，およびＰＫＣｄとＰＫＣａの比率は，クモ膜下出血後の脳血管痙攣の存在および進行の同定に有用でありうる。
（ii）血液凝固に関係する脳損傷の非特異的マーカー
プラスミンは７８ｋＤａのセリンプロティナーゼであり，架橋構造を有するフィブリンをタンパク分解し，凝血塊の溶解を起こす。７０ｋＤａのセリンプロティナーゼ阻害剤，α２-抗プラスミン（α２ＡＰ）は，プラスミンと１：１の化学量論的共有結合複合体を生成することによってプラスミン活性を調節する。得られる-１５０ｋＤａのプラスミン-α２ＡＰ複合体（ＰＡＰ。プラスミン阻害複合体（ＰＩＣ）とも呼ばれる）は，α２ＡＰがフィブリン溶解の際に活性化されるプラスミンと接触した直後に生成される。ＰＡＰの正常な血清濃度は＜１μｇ／ｍｌ（６．９ｎＭ）である。血清ＰＡＰ濃度は塞栓性および出血性卒中後に有意に上昇するが血栓性または腺窩性卒中では上昇せず，上昇の程度は損傷の重度および神経学的転帰と相関する（Seki, Y. ら, Am. J. Hematol. 50:155-160, 1995；Yamazaki, M. ら, Blood Coagul. Fibrinolysis 4:707-712, 1993；Uchiyama, S. ら, Semin. Thromb. Hemost. 23:535-541, 1997；Fujii, Y. ら, Neurosurgery 37:226-234, 1995）。一過性脳虚血発作後の血清ＰＡＰ濃度の上昇を確認した報告はない。ＰＡＰの血清濃度の上昇はフィブリン溶解の活性化によると考えることができる。ＰＡＰの血清濃度の上昇は凝血塊の存在，またはフィブリン溶解の活性化の原因もしくは結果である症状に関係しうる。これらの症状にはアテローム性動脈硬化症，播種性血管内凝固，ＡＭＩ，手術，外傷，不安定狭心症，および血栓性血小板減少性紫斑病がある。ＰＡＰはタンパク分解によるプラスミンの活性化の直後に生成される。血清ＰＡＰは塞栓性および出血性卒中において上昇する。血清濃度は卒中の発症後直ぐに上昇し，２週間にわたって持続しうる（Fujii, Y. ら, J. Neurosurg. 86:594-602, 1997）。更に，血清ＰＡＰ濃度は出血性卒中では虚血性卒中より高くなりうる。これは出血に関係する血液凝固の活性化の程度の上昇を反映している。卒中に伴うＰＡＰの血清濃度は６μｇ／ｍｌ（４１ｎＭ）近くになりうる。ＰＡＰはフィブリン溶解の活性化，および最近のまたは断続的な凝血亢進状態の存在の特異的マーカーである。これは卒中または脳損傷に特異的ではなく，他の多くの疾病状態で上昇しうる。しかしながら，ＰＡＰを使用して出血性卒中を虚血性卒中と識別することは可能であり，血栓溶解療法のための患者の除外，並びに塞栓性および非塞栓性虚血性卒中の同定に有益である。
β-トロンボグロブリン（βＴＧ）は血小板の活性化の際に放出される３６ｋＤａの血小板α顆粒成分である。βＴＧの正常な血清濃度は＜４０ｎｇ／ｍｌ（１．１ｎＭ）である。血清βＴＧ濃度は虚血性および出血性卒中後に上昇する（Landi, G. ら, Neurol. 37:1667-1671, 1987）。血清中の上昇と損傷の重度または神経学的転帰との相関は見い出されていない。卒中における血清βＴＧの上昇に関する研究は非常に限られている。血清中のβＴＧ濃度の上昇は血小板の活性化によるものと考えることができ，これは血管損傷の存在を間接的に示しうる。βＴＧの血清濃度の上昇は凝血塊の存在または血小板の活性化の原因となる症状と関係しうる。これらの症状にはアテローム性動脈硬化症，播種性血管内凝固，ＡＭＩ，手術，外傷，不安定狭心症，および血栓性血小板減少性紫斑病がある。βＴＧは血小板の活性化および凝集の直後に循環中に放出される。これは血清中で２相の半減期を有し，１０分，そしてその後の半減期は１時間という長さである（Switaiska, H.I. ら, J. Lab. Clin. Med. 106:690-700, 1985）。血清βＴＧ濃度は種々の型の卒中で上昇することが報告されているが，これらの研究は完全に信頼できるものではないかもしれない。血液サンプリング過程で血小板の活性化を回避するために，特別な注意を払わなければならない。血小板の活性化は通常の血液サンプリングで一般的なことであり，人工的な血清βＴＧ濃度の上昇を引き起こしうる。更に，血流中に放出されるβＴＧの量は個体の血小板数に依存し，かなり変化しうる。卒中に伴うβＴＧの血清濃度は７０ｎｇ／ｍｌ（２ｎＭ）近くになりうる。βＴＧは血小板の活性化の特異的マーカーであるが，卒中または脳損傷に特異的ではなく，多くの他の疾病状態で上昇しうる。
血小板第４因子（ＰＦ４）は血小板の活性化の際に放出される４０ｋＤａの血小板α顆粒成分である。ＰＦ４は血小板活性化のマーカーであり，ヘパリンに結合し，それを中和する能力を有する。正常なＰＦ４の血清濃度は＜７ｎｇ／ｍｌ（１７５ｐＭ）である。血清ＰＦ４濃度は脳内梗塞後にわずかに上昇するが，脳内出血を有する個体では上昇しない（Carter, A.M. ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1124-1131, 1998）。更に，血清ＰＦ４濃度はクモ膜下出血の５-９日後に上昇し，これは脳血管痙攣の発症と関係しうる（Hirashima, Y. ら, Neurochem. Res. 22:1249-1255, 1997）。卒中における血清ＰＦ４の上昇に関する研究は非常に限られている。血清ＰＦ４濃度の上昇は血小板の活性化によるものと考えることができ，これは血管損傷の存在を間接的に示しうる。ＰＦ４の血清濃度の上昇は凝血塊の存在または血小板の活性化の原因となる症状と関係しうる。これらの症状にはアテローム性動脈硬化症，播種性血管内凝固，ＡＭＩ，手術，外傷，不安定狭心症，および血栓性血小板減少性紫斑病がある。ＰＦ４は血小板の活性化および凝集の直後に循環中に放出される。これは血清中で２相の半減期を有し，１分，そしてその後の半減期は２０分という長さである。血清中でのＰＦ４の半減期はヘパリンの存在によって２０-４０分に延長されうる（Rucinski, B. ら, Am. J. Physiol. 251:H800-H807, 1986）。血液サンプリング過程で血小板の活性化を回避するために，特別な注意を払わなければならない。卒中に伴うＰＦ４の血清濃度は２００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）を超えうるが，この数値はサンプリング操作の際の血小板の活性化の影響を受けていると考えられる。更に，血清ＰＦ４濃度は血小板数に依存しており，濃度の見積もりに加えて第２の変数を測定することが必要とされる。最後に，アスピリンまたは他の血小板活性化阻害剤を摂取している患者は，血小板活性化のマーカーとしてのＰＦ４の臨床的有用性を考え合わせて処理しなければならない。
フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）はトロンビンの作用によってフィブリノーゲンのアミノ末端から遊離される１６個のアミノ酸，１．５ｋＤａのペプチドである。フィブリノーゲンは肝臓で合成および分泌される。正常なＦＰＡの血清濃度は＜４ｎｇ／ｍｌ（２．７ｎＭ）である。血清ＦＰＡは一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を含む全ての型の卒中後に上昇する（Fon, E.A. ら, Stroke 25:282-286, 1994；Tohgi, H.ら, Stroke 21:1663-1667, 1990；Landi, G. ら, Neurol. 37:1667-1671, 1987）。血清中のＦＰＡの上昇は凝血の活性化によるものと考えることができ，ＦＰＡの血清濃度は神経学的転帰と相互に関係することが報告されているが，損傷の重度または程度（梗塞量）との関係は報告されていない（Feinberg, W.M. ら, Stroke 27:1296-1300, 1996）。ＦＰＡの血清濃度の上昇は凝血活性化の原因または結果である症状と関係する。これらの症状にはＡＭＩ，手術，癌，播種性血管内凝固，ネフローゼ，血栓性血小板減少性紫斑病，および不安定狭心症がある。ＦＰＡは凝血塊の生成の際に速やかに血流中に放出され，１ヶ月以上の間上昇したままでありうる。卒中後の最大血清ＦＰＡ濃度は５０ｎｇ／ｍｌ（３４ｎＭ）を超えうる。
プロトロンビンフラグメント１＋２はトロンビン活性化の際にトロンビンのアミノ末端から遊離される３２ｋＤａのポリペプチドである。Ｆ１＋２の正常な血清濃度は＜３２ｎｇ／ｍｌ（１ｎＭ）である。血清Ｆ１＋２濃度は腺窩性卒中および出血性卒中後に有意に上昇する（Kario, K. ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:734-741, 1996；Fujii, Y. ら, J. Neurosurg. 86:594-602, 1997）。他の型の虚血性卒中または一過性脳虚血発作に関係する血清Ｆ１＋２濃度の上昇に関しては情報は得られていない。血清Ｆ１＋２濃度の上昇は凝血活性化状態，特にトロンビンの生成を反映する。Ｆ１＋２の血清濃度の上昇は凝血の原因または結果である症状と関係する。これらの症状には播種性血管内凝固，ＡＭＩ，手術，外傷，不安定狭心症，および血栓性血小板減少性紫斑病がある。Ｆ１＋２はトロンビン活性化の直後に血流中に放出される。血清Ｆ１＋２濃度は腺窩性および出血性卒中で上昇するが，血流中への放出およびその後の除去の速度論についての情報は得られていない。Ｆ１＋２は凝血の活性化および一般的な凝血亢進状態の存在の特異的マーカーである。これは卒中または脳損傷に特異的ではなく，多くの疾病状態で上昇しうるものであり，血液サンプリング操作でも人工的に上昇しうる。しかしながら，Ｆ１＋２を使用して出血性卒中を虚血性卒中と識別することが可能でありえ，それは出血性卒中がより高い凝血の活性化を起こしうるためである。更に，血管損傷を有する患者は血清Ｆ１＋２濃度が非常に上昇しうるが，塞栓性卒中後の最初の数時間に一般的に使用される血栓溶解療法から除外すべきである。血栓溶解療法の際の組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の輸液によってフィブリン溶解が活性化され，患者は凝血塊を保持できない。血管損傷を有する個体にｔＰＡを投与すると，最終的に出血を起こしうる。
トロンビンは３７ｋＤａの血清プロティナーゼであり，フィブリノーゲンをタンパク分解によって切断してフィブリンを生成し，これは最終的に凝血塊生成の際，架橋網に組み込まれる。抗トロンビンIII（ＡＴIII）は６５ｋＤａの血清プロティナーゼ阻害剤であり，トロンビン，XI因子，XIIａ因子，およびIXａ因子のタンパク分解活性の生理学的調節剤である。ＡＴIIIの阻害活性はヘパリンの結合に依存する。ヘパリンはＡＴIIIの阻害活性を２〜３オーダー増加させ，ＡＴIIIによって阻害されるプロティナーゼをほとんど瞬時に不活性化する。ＡＴIIIは共有結合した１：１化学量論的複合体の生成によって，その標的プロティナーゼを阻害する。約１００ｋＤａのトロンビン-ＡＴIII複合体（ＴＡＴ）の正常な血清濃度は＜５ｎｇ／ｍｌ（５０ｐＭ）である。血清ＴＡＴ濃度は塞栓性および出血性卒中後に有意に上昇するが，血栓性または腺窩性卒中では上昇せず，上昇の程度は損傷の重度および神経学的転帰と相互に関係する（Takano, K. ら, Stroke 23:194-198, 1992；Fujii, Y. ら, J. Neurosurg. 86:594-602, 1997）。血清ＴＡＴ濃度はＴＩＡの後にも上昇しうる（Fon, E.A. ら, Stroke 25:282-286, 1994）。血清ＴＡＴ濃度の上昇は凝血活性化状態，特にトロンビンの生成を反映している。ＴＡＴの血清濃度の上昇は凝血活性化の原因または結果である症状と関係がある。これらの症状には播種性血管内凝固，ＡＭＩ，手術，外傷，不安定狭心症，および血栓性血小板減少性紫斑病がある。ＴＡＴは，この相互作用における制限因子であるヘパリンの存在下で，トロンビン活性化の直後に生成される。血清ＴＡＴの半減期は５分であるが，これは種々の型の卒中で上昇する。出血性卒中では，血清濃度は発症後２時間以内にピークに達し，その後徐々に低下して，発症の２-３日後にベースラインとなる（Fujii, Y. J., Neurosurg. 88:614-615, 1998）。更に，血清ＴＡＴ濃度は多くの場合，虚血性卒中より出血性卒中の方が高い。これは出血に伴う凝血活性化の程度の高さを反映している。卒中に関係する血清ＴＡＴ濃度は２５０ｎｇ／ｍｌ（２．５ｎＭ）を超えうる（Fujii, Y. ら, Neurosurgery 37:226-234, 1995）。ＴＡＴは凝血の活性化および一般的な凝血亢進状態の存在の特異的マーカーである。これは卒中または脳損傷に特異的ではなく，多くの疾病状態で上昇し，血液サンプリング操作でも人工的に上昇しうる。しかしながら，ＴＡＴを使用して発症の１２時間以内に出血性卒中を虚血性卒中と識別し，塞栓性および非塞栓性虚血性卒中を同定することが可能でありうる。更に，血管損傷を有する患者は血清ＴＡＴ濃度が非常に高くなりうるが，一般に塞栓性卒中後の初めの数時間に使用される血栓溶解療法から除外すべきである。最後に，一定の放出パターンが同定されれば，ＴＡＴの測定を使用して卒中の発症からの経過時間を概算できる。
Ｄ-ダイマーは分子量が約２００ｋＤａの架橋したフィブリンの分解産物である。Ｄ-ダイマーの正常な血清濃度は＜１５０ｎｇ／ｍｌ（７５０ｐＭ）である。血清Ｄ-ダイマー濃度は塞栓性および出血性卒中後に有意に上昇するが，血栓性または腺窩性卒中では上昇せず，上昇の程度は損傷の重度および神経学的転帰と相互に関係する（Feinberg, W.M. ら, Stroke 27:1296-1300, 1996；Takano, K. ら, Stroke 23:194-198, 1992；Fujii, Y. ら, J. Neurosurg. 86:594-602, 1997）。更に，血清Ｄ-ダイマー濃度は一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）後に上昇する（Fon, E.A. ら, Stroke 25:282-286, 1994）。血管痙攣のある個体における出血性卒中の発症３日後に血清Ｄ-ダイマー濃度の顕著な上昇がある（Fujii, Y. ら, 上記）。血清Ｄ-ダイマー濃度の上昇はフィブリン溶解活性化状態，特に凝血塊の溶解を反映している。Ｄ-ダイマーの血清濃度の上昇は凝血塊の存在またはフィブリン溶解の活性化の原因もしくは結果である症状に関係する。これらの症状にはアテローム性動脈硬化症，播種性血管内凝固，ＡＭＩ，手術，外傷，不安定狭心症，および血栓性血小板減少性紫斑病がある（Heinrich, J. ら, Thromb. Haemost. 73:374-379, 1995；Wada, H. ら, Am. J. Hematol. 58:189-194, 1998）。血清濃度は卒中の発症後まもなく上昇し，３日以内にピークに達した後，徐々に減少して発症の＞１ヶ月後にベースラインとなる。更に，血清濃度は出血性卒中の方が虚血性卒中より高くなりうる。これは出血に関係する凝血活性化の程度が高いことを反映している。卒中に関係するＤ-ダイマーの血清濃度は３μｇ／ｍｌ（１５ｎＭ）近くになりうる。Ｄ-ダイマーはフィブリン溶解活性化の特異的マーカーであり，最近の，または断続的な凝血亢進状態の存在を示しうるため，卒中または脳損傷に特異的ではなく，多くの他の疾病状態においても上昇しうる。しかしながら，Ｄ-ダイマーを使用して出血性卒中を虚血性卒中と識別することが可能でありえ，これは患者を血栓溶解療法から除外し，塞栓性および非塞栓性虚血性卒中を同定するのに有益である。更に，Ｄ-ダイマーを使用して，虚血性卒中の出血性転換および出血性卒中後の脳血管痙攣のような遷延型神経症候を検出しうる。
フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）は血小板，巨核球，および内皮細胞で生成される血漿蛋白質であり，２２０ｋＤａのモノマーが結合して一連の高分子量マルチマーを形成したものからなる。これらのマルチマーの分子量は通常，６００-２０，０００ｋＤａの範囲である。ｖＷＦは循環中の凝固因子VIIIを安定化し，暴露された内皮下層並びに他の血小板への血小板の接着に介在することによって凝血過程に関与している。ｖＷＦのＡ１ドメインは血小板糖蛋白質lb-IX-V複合体および非線維性コラーゲンVI型に結合し，Ａ３ドメインは線維性コラーゲンＩおよびIII型に結合する（Emsley, J. ら, J. Biol. Chem. 273:10396-10401, 1998）。ｖＷＦ分子に存在する他のドメインにはインテグリン結合ドメイン（血小板-血小板相互作用に介在する），プロテアーゼ切断ドメイン（１１Ａ型フォン・ビルブラント病の病因論に関係する）がある。ｖＷＦと血小板の相互作用は，正常な生理学的条件におけるｖＷＦおよび血小板間の相互作用を阻害するように強く制御されている。ｖＷＦは通常，球状で存在し，非常に強いストレス条件下ではコンフォメーション変化を受けて伸長された鎖構造となり，一般にこれは血管損傷部位で見られる。このコンフォメーション変化によって分子の分子内ドメインが暴露され，ｖＷＦが血小板と相互作用できるようになる。更に，強いストレスによって内皮細胞からのｖＷＦ放出が起こり，より多くのｖＷＦ分子が血小板と相互作用できるようになる。ｖＷＦのコンフォメーション変化はリストセチンおよびボトロセチンのような非生理学的モジュレーターを添加することによってインビトロで誘導できる（Miyata, S. ら, J. Biol. Chem. 271:9046-9053, 1996）。血管損傷部位では，ｖＷＦが内皮下マトリクス中のコラーゲンと迅速に結合し，血小板と実質的に不可逆的に結合し，損傷部位で血小板および血管内皮下層間の架橋構造を効率的に形成する。ｖＷＦのコンフォメーション変化は内皮下マトリクスとの相互作用に必要とされないことも証拠によって示されている（Sixma, J.J.およびde Groot, P.G., Mayo Clin. Proc. 66:628-633, 1991）。これはｖＷＦが血管損傷部位の暴露された内皮下マトリクスに結合し，局在化された非常に強いストレスによってコンフォメーション変化を受け，そして循環中の血小板に迅速に結合し，それが新たに形成された血栓に組み込まれることを示唆している。ｖＷＦの総量を測定することによって，当業者は卒中または心血管疾患に関係する総ｖＷＦ濃度の変化を確認することができる。この測定は種々の形態のｖＷＦ分子の測定によって行いうる。Ａ１ドメインの測定により循環中の活性ｖＷＦの測定が可能となり，これはＡ１ドメインが血小板結合に利用されることが可能なので前凝血状態が存在することを示す。この点に関して，暴露されたＡ１ドメインおよびインテグリン結合ドメインまたはＡ３ドメインのいずれかの両方を有するｖＷＦ分子を特異的に測定するアッセイによって，それぞれ血小板-血小板相互作用への介在または血小板の血管内皮下細胞への架橋への介在が可能である活性ｖＷＦの同定が可能となる。プロテアーゼ切断ドメインに特異的な抗体を利用するアッセイに使用する場合，これらのｖＷＦ型のいずれかの測定によって，フォン・ビルブラント症の有無に関わらず，いずれの個体でも種々のｖＷＦ型の循環中濃度を測定するのにアッセイを使用できるようになる。正常なｖＷＦの血漿濃度は５-１０μｇ／ｍｌ，または６０-１１０％活性である（血小板凝集で測定）。特定の型のｖＷＦの測定が卒中および心血管疾患を含むいずれかの型の血管疾患で重要でありうる。ｖＷＦ濃度は卒中およびクモ膜下出血患者で上昇することが明らかになっているが，卒中後の死亡リスクの評価にも有用であると考えられる（Blann, A. ら, Blood Coagul. Fibrinolysis 10:277-284, 1999；Hirashima, Y. ら, Neurochem. Res. 22:1249-1255, 1997；Catto, A.J. ら, Thromb. Hemost. 77:1104-1108, 1997）。血漿ｖＷＦ濃度はＡＭＩおよび不安定狭心症を有する個体で上昇するが，安定狭心症では上昇しないことが報告されている（Goto, S. ら, Circulation 99:608-613, 1999；Tousoulis, D.ら, Int. J. Cardiol. 56:259-262, 1996；Yazdani, S. ら, J. Am. Coll. Cardiol. 30:1284-1287, 1997；Montalescot, G. ら, Circulation 98:294-299）。更に，血漿ｖＷＦ濃度の上昇は不安定狭心症患者における有害な臨床的転帰を予測しうる（Montalescot, G. ら；上記）。ｖＷＦの血漿濃度は内皮細胞損傷または血小板活性化に関係する事象と関連して上昇しうる。ｖＷＦは血流中に高濃度で存在し，活性化の際に血小板および内皮細胞から放出される。ｖＷＦは血小板活性化，または，特に血小板の活性化および血管損傷部位への接着の傾向がある症状のマーカーとして最も有益であると考えられる。ｖＷＦのコンフォメーションは，部分的に狭窄した血管に伴うような強いストレスによって変化を受けることも知られている。血液が狭窄した血管を流れて通過する時，疾病にかかっていない個体の循環で遭遇するよりかなり強いストレスにさらされる。本発明の別の観点は，強いストレスから生じるｖＷＦの型，および型と卒中の存在との相関関係を測定する。
組織因子は４５ｋＤａの細胞表面蛋白質であり，脳，腎臓，および心臓，そして転写的に制御された様式で血管周囲細胞および単球で発現される。ＴＦはＣａ2+イオンの存在下でVIIａ因子と複合体を形成し，これは膜に結合している時，生理学的に活性である。この複合体はＸ因子をタンパク分解して切断し，Ｘａ因子を生成する。これは通常，血流から隔離されている。組織因子は血流中で，可溶な形態で，VIIａ因子に結合した形態で，またはVIIａ因子および組織因子経路阻害剤（Xa因子を含んでもよい）との複合体で，検出できる。正常なＴＦの血清濃度は＜０．２ｎｇ／ｍｌ（４．５ｐＭ）である（Albrecht, S. ら, Thromb. Haemost. 75:772-777, 1996）。卒中後の血清ＴＦ濃度変化はこれまで記載されていない。しかしながら，ＴＦはクモ膜下出血後のＣＳＦで観察されている（Hirashima, Y. ら, Stroke 28:1666-1670, 1997）。血清中のＴＦの上昇は外因性凝血経路の活性化によるものであると考えることができ，血管損傷を示唆しうる。ＴＦの血清濃度の上昇は外因性経路による凝血活性化の原因または結果である症状と関係する。これらの症状には播種性血管内凝固，虚血性心疾患，腎不全，脈管炎，および鎌状赤血球病がある（Takahashi, H. ら, Am. J. Hematol. 46:333-337, 1994；Koyama, T. ら, Br. J. Haematol. 87:343-347, 1994）。ＴＦは血管損傷が血管外細胞損傷と合わさると直ぐに放出される。卒中に関係するＴＦの血清への放出速度論およびその後の除去を確認するには更なる調査が必要である。
（iii）脳損傷のための他の非特異的マーカー
卒中に関係する細胞損傷の非特異的血清マーカーは，外見上は急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後に見られるのと同様の様式に従う。クレアチンキナーゼＭＢイソエンザイム（ＣＫ-ＭＢ）は心組織中に高濃度で見られる細胞質ゾル酵素であり，死滅した筋肉細胞から血流中への放出後，ＡＭＩに関係する虚血に由来する心組織損傷の血清マーカーとして使用される。心トロポニンＩおよびＴは心組織筋原線維の細胞骨格蛋白質であり，不安定狭心症およびＡＭＩの症例に関係する損傷した心筋からも放出される。更に，卒中および重度の頭部外傷は生命に関わる不整脈および肺浮腫を起こす可能性があるが，これも心トロポニンの血清レベルを上昇させる。最後に，ミオグロビンは筋細胞中に見られるヘム蛋白質であるが，これは心組織に特異的ではなく，ＡＭＩの初期段階でも上昇する。
ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は２量体蛋白質であり，報告されているその活性には内皮細胞増殖，血管新生，および毛細管透過性の刺激がある。ＶＥＧＦは種々の血管化組織で分泌される。酸素欠乏環境では，血管内皮細胞は損傷を受け，最終的には生存できない。しかしながら，それらの内皮細胞損傷は血管平滑筋細胞によるＶＥＧＦの生成を刺激する。血管内皮細胞はＶＥＧＦの存在下で高い生存率を示し，これはＢｃｌ-２の発現が介在すると考えられる作用である。ＶＥＧＦはＶＥＧＦ（１８９），ＶＥＧＦ（１６５），ＶＥＧＦ（１６４），ＶＥＧＦ（１５５），ＶＥＧＦ（１４８），ＶＥＧＦ（１４５），およびＶＥＧＦ（１２１）で知られる種々のスプライシング異型で存在しうる。
インスリン様増殖因子-１（ＩＧＦ-１）は広範に分布する７．５ｋＤａの分泌蛋白質であり，発生の際に増殖ホルモンのタンパク同化および体形成作用に介在する（１，２）。循環中で，ＩＧＦ-１は通常，ＩＧＦ活性を制御するＩＧＦ結合蛋白質に結合する。正常なＩＧＦ-１の血清濃度は約１６０ｎｇ／ｍｌ（２１．３ｎＭ）である。血清ＩＧＦ-１濃度は虚血性卒中を有する個体で有意に低下することが報告されており，低下の程度は損傷の重度と相互に関係すると考えられる（Schwab, S. ら, Stroke 28:1744-1748, 1997）。外傷および免疫系の高度な活性化を有する個体では血清ＩＧＦ-１濃度が低下することが報告されている。その広範な発現のため，血清ＩＧＦ-１濃度は脳虚血ではない症例でも低下しうる。興味深いことに，ＩＧＦ-１の血清濃度は，その細胞発現が梗塞領域で亢進的に調節されるにも関わらず，虚血性卒中後に低下する（Lee, W.H.およびBondy, C., Ann. N. Y. Acad. Sci. 679:418-422, 1993）。血清濃度の低下は増殖因子の要求の増加または代謝によるクリアランス速度の上昇を反映する。血清レベルは卒中の発症から２４時間後に有意に低下し，１０日間にわたって低下したままであった（Schwab, S. ら, Stroke 28:1744-1748, 1997）。血清ＩＧＦ-１は感度の高い脳損傷の指標となりうる。しかしながら，ＩＧＦ-１の広範な発現様式は，全ての組織が血清ＩＧＦ-１濃度に影響を与える可能性があることを示唆しており，これによって，卒中のマーカーとしてＩＧＦ-１を使用するアッセイの特異性は低くなる。この点でＩＧＦ-１は脳虚血の脳脊髄液マーカーとして最も好適でありえ，その主なソースは神経組織である。
インターロイキン-１β（ＩＬ-１β）は急性期反応に関係する１７ｋＤａの分泌前炎症サイトカインであり，多くの疾病の病原性メディエーターである。ＩＬ-１βは通常，マクロファージおよび上皮細胞で生成される。ＩＬ-１βはアポトーシスを起こしている細胞からも放出される。正常なＩＬ-１βの血清濃度は＜３０ｐｇ／ｍｌ（１．８ｐＭ）である。血清ＩＬ-１β濃度は出血性卒中後に一時的にのみ上昇することが見いだされており，いくつかの報告で，ＩＬ-１βの血清濃度は虚血性卒中後には上昇しないことが示されている（Hirashima, Y. ら, Neurochem. Res. 22:1249-1255, 1997；Kim, J.S., J. Neurol. Sci. 137:69-78, 1996；Fassbender, K. ら, J. Neurol. Sci. 122:135-139, 1994；McKeating, E.G. ら, Br. J. Anaesth. 78:520-523, 1997）。ＩＬ-１βは卒中後にＣＳＦで上昇する。血清ＩＬ-１β濃度の上昇は免疫系および細胞死の活性化を示す。血清ＩＬ-１βの上昇は不特定の前炎症状態，例えば外傷，感染，または他の急性期疾患に関係する。血清ＩＬ-１βは２相の半減期を有し，５分，そしてその後の半減期はそれより長い４時間である（Kudo, S. ら, Cancer Res. 50:5751-5755, 1990）。ＩＬ-１β蛋白質発現は虚血の１時間以内にニューロンおよびグリア細胞で上昇し，数日にわたって高いままである（Kim, J.S., 上記）。ＩＬ-１βは卒中後短時間の間のみ上昇する可能性があり，発症からこの時間内の血清サンプルは得られなかった。ＩＬ-１βは卒中発症後の初期段階における脳損傷の結果である細胞死の有用なマーカーであることがわかるかもしれない。
インターロイキン-１受容体アンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）は１７ｋＤａのＩＬ−１ファミリーのメンバーであり，主に肝細胞，上皮細胞，単球，マクロファージ，および好中球で発現される。ＩＬ-１ｒａは細胞内型および細胞外型の両方を有し，それらは異なるスプライシングによって生成される。ＩＬ-１ｒａはＩＬ-１の生理学的活性の制御に関与していると考えられる。ＩＬ-１ｒａはＩＬ-１のような生理学的活性を有さず，ＩＬ-１βと同様の親和性でＴ細胞および線維芽細胞上のＩＬ-１受容体と結合し，ＩＬ-１αおよびＩＬ-１βの結合を阻害し，そしてその生体活性を阻害することができる（Stockman, B.J. ら, Biochemistry 31:5237-5245, 1992；Eisenberg, S.P. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5232-5236, 1991；Carter, D.B. ら, Nature 344:633-638, 1990）。ＩＬ-１ｒａは通常，血漿中にＩＬ-１より高濃度で存在し，これはＩＬ-１よりＩＬ-１ｒａレベルの方が疾病の重度と深い相関関係を有することを示唆している（Biasucci, L.M. ら, Circulation 99:2079-2084, 1999）。更に，ＩＬ-１ｒａが急性期蛋白質であるという証拠がある（Gabay, C. ら, J. Clin. Invest. 99:2930-2940, 1997）。正常なＩＬ-１ｒａの血漿濃度は＜２００ｐｇ／ｍｌ（１２ｐＭ）である（Biasucci, L.M. ら, 上記）。動物モデルを使用した初期の研究で，ＩＬ-１ｒａ濃度が脳虚血後に上昇することが証明されており，また，クモ膜下出血患者の脳脊髄液中でＩＬ-１ｒａが上昇している証拠がある（Legos, J.J. ら, Neurosci. Lett. 282:189-192, 2000；Mathiesen, T. ら, J. Neurosurg. 87:215-220, 1997）。更に，ＩＬ-１ｒａが脳虚血後の神経保護において役割を果たしている証拠がある（Yang, G.Y. ら, Brain Res. 751:181-188, 1997；Stroemer, R.P. および Rothwell, N.J., J. Cereb. Blood Flow Metab. 17:597-604, 1997）。ＩＬ-１ｒａの血漿濃度はＡＭＩ，およびＡＭＩ，死亡，または抗療性狭心症に進行した不安定狭心症患者でも上昇する（Biasucci, L.M. ら, 上記；Latini, R. ら, J. Cardiovasc. Pharmacol. 23:1-6, 1994）。更に，ＩＬ-１ｒａは悪化していないＡＭＩに比較して重度のＡＭＩでは有意に上昇した（Latini, R. ら, 上記）。ＩＬ-１ｒａの血漿濃度の上昇は炎症の活性化または急性期反応に関係する症状と関連し，それらには感染，外傷，および関節炎がある。ＩＬ-１ｒａは前炎症状態で血流中に放出され，急性期反応に関係するものとしても放出されうる。血流からのＩＬ-１ｒａのクリアランスの主なソースは腎臓および肝臓であると考えられる（Kim, D.C. ら, J. Pharm. Sci. 84:575-580, 1995）。更にこれは前炎症状態でＩＬ-１の放出と共に，またはその直後に放出されると考えられ，ＩＬ-１より高濃度で見られる。これはＩＬ-１ｒａがＩＬ-６の生成を誘引するＩＬ-１活性の有用な間接的マーカーとなりうることを示している。従ってＩＬ-１ｒａは卒中の診断マーカーとして有用なだけでなく，ＩＬ-６濃度が有意に上昇する前の，急性期反応の初期段階の同定にも有用でありうる。
インターロイキン-６（ＩＬ-６）は２０ｋＤａの分泌蛋白質で，ヘマトポイエチンファミリーの前炎症サイトカインである。ＩＬ-６は急性期の反応物質であり，接着分子を含む種々の蛋白質の合成を刺激する。その主な機能は急性期の肝蛋白質生成に介在することである。ＩＬ-６は通常，マクロファージおよびＴリンパ球で生成される。正常なＩＬ-６の血清濃度は＜１０ｐｇ／ｍｌ（０．５ｐＭ）である。血清ＩＬ-６濃度は虚血性および出血性卒中のいずれの後にも上昇する（Fassbender, K. ら, J. Neurol. Sci. 122:135-139, 1994；Hirashima, Y. ら, Neurochem. Res. 22:1249-1255, 1997；Kim, J.S., J. Neurol. Sci. 137:69-78, 1996）。ＩＬ-６濃度がＴＩＡ後に上昇するかどうかは知られていない。興味深いことに，ＩＬ-６は卒中後のＣＳＦでより有意に上昇し，これは脳組織におけるＩＬ-６の生成を反映しうるもので，そこで神経保護の役割を果たしているのかもしれない（Kim, J.S. J., 上記）。血清ＩＬ-６の上昇は急性期反応の免疫系の活性化を示しており，損傷の重度および神経学的転帰と相互に関係することが報告されている。血清ＩＬ-６の上昇は外傷，感染，または他の急性期疾患のような不特定の前炎症状態と関係がある。血清ＩＬ-６の半減期は約２時間であり，卒中後に上昇する。血清ＩＬ-６濃度は卒中発症後１時間以内に有意に上昇し，１０時間後にプラトーとなる。このプラトー状態は２．５日間継続し，その後４-５日にわたって徐々にベースのレベルまでもどる（Fassbender, K. ら, 上記）。血清ＩＬ-６濃度は出血性卒中を有する個体でより長時間にわたって上昇しうる。ＩＬ-６の最大血清濃度は３００ｐｇ／ｍｌ（１５ｐＭ）を超えうる。血清ＩＬ-６は感度の高い脳損傷のマーカーであると考えられる。更に血清ＩＬ-６の上昇の持続期間は虚血性卒中を出血性卒中と識別するための手段となる。
インターロイキン-８（ＩＬ-８）は単球，内皮細胞，肺胞マクロファージ，および線維芽細胞で生成される６．５ｋＤａのケモカインである。ＩＬ-８は好中球およびＴ細胞の走化性および活性化を誘導する。
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）は２５ｋＤａの分泌ホモまたはヘテロ３量体蛋白質であり，ＴＮＦαアンタゴニストおよび抗炎症メディエーターである。これは細胞増殖および分化に対して刺激作用および阻害作用の両方を有する。ＴＧＦβは通常，中枢神経系のグリア細胞およびニューロン，軟骨細胞，単球，マクロファージ，および血小板で生成される。正常なＴＧＦβの血清濃度は約１２０ｎｇ／ｍｌ（４．８ｎＭ）である。血清ＴＧＦβ濃度は虚血性および出血性卒中を有する個体で低下することが報告されており，その程度は損傷の重度または神経学的転帰と有意な関係を有さなかった（Kim, J.S. ら, Stroke 27:1553-1557, 1996）。ＴＧＦβの血清濃度の低下は外傷または感染のような不特定の前炎症状態から起こり，その結果としてＴＮＦαアンタゴニストおよび抗炎症剤としてＴＧＦβが消費される。ＴＧＦβの血清濃度は卒中後に低下する。血清濃度の低下は，前炎症状態におけるＴＧＦβおよび他の抗炎症メディエーターの要求の増加を反映している。血清レベルは卒中発症の２４時間および３日後に有意に低下し，発症の７日後にコントロール値近くになった。卒中に関して血清ＴＧＦβ濃度の変化を調査するためには更なる研究が必要である。血清ＴＧＦβは感度の高い脳損傷のマーカーでありうる。しかしながら，不特定の前炎症状態の存在がＴＧＦβの血清濃度に影響を与えうる。この点で，ＴＧＦβは脳虚血のＣＳＦマーカーとして最も好適でありえ，その主なソースは神経組織である。更に，血清ＴＧＦβ濃度は卒中患者で一時的にのみ低下すると考えられ，個体間で変化する多くの因子（血小板数を含む）が血清ＴＧＦβ濃度に影響しうる。
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は１７ｋＤａの分泌前炎症サイトカインであり，急性期反応に関係し，多くの疾病の病原性メディエーターである。ＴＮＦαは通常，マクロファージおよびナチュラルキラー細胞で生成される。正常なＴＮＦαの血清濃度は＜４０ｐｇ／ｍｌ（２ｐＭ）である。卒中後の血清ＴＮＦα濃度の変化の調査から得られた結果は様々なものが混在している（Carlstedt, F. ら, J. lntern. Med. 242:361-365, 1997；Fassbender, K. ら, J. Neurol. Sci. 122:135-139, 1994；Hirashinia, Y. ら, Neurochem. Res. 22:1249-1255, 1997；Kim, J.S., J. Neurol. Sci. 137:69-78, 1996；McKeating, E.G. ら, Br. J. Anaesth. 78:520-523, 1997）。ＴＮＦα蛋白質の発現は虚血の１時間以内にニューロンおよびグリア細胞で上昇し，数日間上昇したままである。ＴＮＦαは卒中後，短時間しか上昇しない可能性があり，血清サンプルは発症からこの時間以内に得られなかった。血清中のＴＮＦαの上昇は外傷，感染，または他の急性期疾患のような不特定の前炎症状態と関係する。血清ＴＮＦαの半減期は約１時間であり，最大血清濃度は７．５ｎｇ／ｍｌ（３７５ｐＭ）を超えうる。ＴＮＦαの血清濃度の上昇は免疫系の急性期反応の活性化を示すと考えられる。
Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）は２１ｋＤａのサブユニットを有するホモ５量体Ｃａ2+結合型急性期蛋白質であり，ホストの防御に関係する。ＣＲＰは微生物膜の共通要素であるホスホリルコリンに選択的に結合する。ホスホリルコリンは哺乳動物細胞膜にも見られるが，ＣＲＰと反応できる形態では存在しない。ＣＲＰとホスホリルコリンの相互作用により，細菌の凝集作用およびオプソニン作用，並びに補体カスケードの活性化が促進されるが，これらは全て細菌のクリアランスに関係する。更に，ＣＲＰはＤＮＡおよびヒストンと相互作用でき，ＣＲＰは損傷した細胞から循環中に放出される核物質のスカベンジャーであることが示唆されている（Robey, F.A. ら, J. Biol. Chem. 259:7311-7316, 1984）。ＣＲＰ合成はＩＬ-６，および間接的にＩＬ-１によって誘導されるが，これはＩＬ-１が肝シヌソイドにおいてクッパー細胞によるＩＬ-６の合成の引き金となるためである。正常なＣＲＰの血漿濃度は，健康な集団の９０％で＜３μｇ／ｍｌ（３０ｎＭ），健康な個体の９９％で＜１０μｇ／ｍｌ（１００ｎＭ）である。結晶ＣＲＰ濃度は比濁分析またはＥＬＩＳＡで測定できる。ＣＲＰの血漿濃度はＡＭＩおよび不安定狭心症患者で有意に上昇するが，安定狭心症では上昇しない（Biasucci, L.M. ら, Circulation 94:874-877, 1996；Biasucci, L.M. ら, Am. J. Cardiol. 77:85-87, 1996；Benamer, H. ら, Am. J. Cardiol. 82:845-850, 1998；Caligiuri, G. ら, J. Am. Coll. Cardiol. 32:1295-1304, 1998；Curzen, N.P. ら, Heart 80:23-27, 1998；Dangas, G. ら, Am. J. Cardiol. 83:583-5, A7, 1999）。ＣＲＰは異型狭心症または解決可能な（resolving）不安定狭心症を有する個体の血漿でも上昇しうるが，雑多な結果が報告されている（Benamer, H. ら, 上記；Caligiuri, G. ら, J. Am. Coll. Cardiol. 32:1295-1304, 1998）。ＣＲＰはＡＭＩまたは不安定狭心症患者の転帰を予測するのには有用でない（Curzen, N.P. ら, Heart 80:23-27, 1998；Rebuzzi, A.G. ら, Am. J. Cardiol. 82:715-719, 1998；Oltrona, L. ら, Am. J. Cardiol. 80:1002-1006, 1997）。ＣＲＰ濃度は急性期反応を誘引しうる症状，例えば感染，手術，外傷，および卒中を有する個体由来の血漿で上昇する。ＣＲＰは合成直後に血流中に放出される分泌蛋白質である。ＣＲＰ合成はＩＬ-６によって亢進的に調節され，血漿ＣＲＰ濃度は刺激の６時間以内に有意に上昇する（Biasucci, L.M. ら, 上記）。血漿ＣＲＰ濃度は刺激後約５０時間でピークとなり，低下し始め，血流中での半減期は約１９時間である（Biasucci, L.M. ら, Am. J. Cardiol., 上記）。他の調査により，不安定狭心症を有する個体における血漿ＣＲＰ濃度が確認されている（Biasucci, L.M. ら, 上記）。ＣＲＰの血漿濃度はＡＣＳを有する個体で１００μｇ／ｍｌ（１μＭ）近くになりうる（Biasucci, L.M. ら, 上記；Liuzzo, G. ら, Circulation 94:2373-2380, 1996）。ＣＲＰは急性期反応の特異的マーカーである。ＣＲＰの上昇はＡＭＩおよび不安定狭心症を有する個体の血漿で確認されており，これはアテローム斑破裂または心組織損傷に関係する急性期反応の活性化の結果である可能性が最も高い。ＣＲＰはＡＣＳの非常に非特異的なマーカーであり，血漿中のＣＲＰ濃度の上昇は免疫系の活性化に伴う無関係の症状からも起こりうる。ＡＣＳに対するその高度な非特異性にも関わらず，ＣＲＰは，心組織損傷に特異的な他のマーカーと共に使用する場合，不安定狭心症およびＡＭＩの同定に有用でありうる。血漿は高濃度のＣＲＰを含有し，報告されている健康な個体の血液中のＣＲＰ濃度にはかなりの変動がある。外見上健康な個体の血漿ＣＲＰ濃度の上限を測定するには，一連の血漿サンプルについての均一のアッセイ（競合免疫アッセイが最も適当と思われる）を使用した更なる調査が必要である。
接着分子は炎症反応に関係しており，損傷の結果として発現レベルが変化するので，急性期反応物質とみなすことができる。それらの接着分子の例としてＥ-セレクチン，細胞間接着分子-１，血管細胞接着分子などがある。
Ｅ-セレクチンはＥＬＡＭ-１およびＣＤ６２Ｅとも呼ばれ，ＩＬ-１およびＴＮＦαに応答して内皮細胞で発現される１４０ｋＤａの細胞表面Ｃ型レクチンであり，好中球のリクルートの際に好中球と内皮細胞との"ローリング"相互作用に介在する。正常なＥ-セレクチンの血清濃度は約５０ｎｇ／ｍｌ（２．９ｎＭ）である。卒中後の血清Ｅ-セレクチン濃度の変化に関する調査は，異なる結果が混在して報告されている。虚血性卒中後の血清Ｅ-セレクチン濃度の上昇を報告している研究もあれば，変化が見いだされなかったものもある（Bitsch, A. ら, Stroke 29:2129-2135, 1998；Kim, J.S., J. Neurol. Sci. 137:69-78, 1996；Shyu, K.G. ら, J. Neurol. 244:90-93, 1997）。Ｅ-セレクチン濃度はクモ膜下出血を有する個体のＣＳＦで上昇し，血管痙攣を予測しうる（Polin, R.S. ら, J. Neurosurg. 89:559-567, 1998）。血清Ｅ-セレクチン濃度の上昇は免疫系の活性化を示す。血清Ｅ-セレクチン濃度はアテローム性動脈硬化症，種々の型の癌，子癇前症，糖尿病，嚢胞性線維症，ＡＭＩ，および他の不特定の炎症状態を有する個体で上昇する（Hwang, S.J. ら, Circulation 96:4219-4225, 1997；Banks, R.E. ら, Br. J. Cancer 68:122-124, 1993；Austgulen, R. ら, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 71:53-58, 1997；Steiner, M. ら, Thromb. Haemost. 72:979-984, 1994；De Rose, V. ら, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:1234-1239, 1998）。Ｅ-セレクチンの血清濃度は虚血性卒中後に上昇しうるが，これらの変化が一過性のものであるか，または未だ確認されていない機構によって制御されているのかは明らかでない。血清Ｅ-セレクチンは内皮細胞損傷の特異的マーカーである。しかしながらこれは，炎症状態の発生の原因となる種々の症状を有する個体の血清で上昇するため，卒中または脳損傷の特異的マーカーではない。更に，血清Ｅ-セレクチン濃度の上昇は卒中に関係するリスク因子のいくつかと関係する。
細胞間接着分子（ＩＣＡＭ-１）（ＣＤ５４とも呼ばれる）は８５-１１０ｋＤａの細胞表面結合型免疫グロブリン様インテグリンリガンドであり，白血球のリクルートおよび移動の際に抗原提示細胞および内皮細胞への白血球の結合を促進する。ＩＣＡＭ-１は通常，血管内皮，造血幹細胞，および非造血幹細胞で生成され，腸および表皮に見られる。正常なＩＣＡＭ-１の血清濃度は約２５０ｎｇ／ｍｌ（２．９ｎＭ）である。卒中後の血清ＩＣＡＭ-１濃度の変化に関する調査は，異なる結果が混在して報告されている（Kim, J.S., J. Neurol. Sci. 137:69-78, 1996；Laskowitz, D.T. ら, J. Stroke Cerebrovasc. Dis. 7:234-241, 1998）。ほとんどの報告は，血清ＩＣＡＭ-１濃度が虚血性卒中後には上昇するが一過性脳虚血発作後には上昇しないことを示しており，血清濃度と損傷または神経学的転帰間の相互関係はないことが立証されている（Bitsch, A. ら, Stroke 29:2129-2135, 1998；Shyu, K.G. ら, J. Neurol. 244:90-93, 1997）。ＩＣＡＭ-１濃度はクモ膜下出血患者のＣＳＦでも上昇する（Polin, R.S. ら, J. Neurosurg. 89:559-567, 1998）。ＩＣＡＭ-１の血清濃度の上昇は免疫系の活性化を示している。血清ＩＣＡＭ-１濃度は頭部外傷，アテローム性動脈硬化症，種々の型の癌，子癇前症，多発性硬化症，嚢胞性線維症，ＡＭＩ，および不特定の他の炎症状態を有する個体でも上昇する（McKeating, E.G. ら, Acta Neurochir. Suppl. (Wien) 71:200-202, 1998；Hwang, S.J. ら. Circulation 96:4219-4225, 1997；Banks, R.E. ら, Br. J. Cancer 68:122-124, 1993；Austgulen, R. ら, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 71:53-58, 1997；De Rose, V. ら, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:1234-1239, 1998）。ＩＣＡＭ-１の血清濃度は虚血性卒中後に上昇する。血清濃度は発症の２４時間以内にピークとなり，徐々に回復して５日以内に正常値に戻る（Bitsch, A. ら, 上記）。血清ＩＣＡＭ-１濃度は卒中を有する個体で４００ｎｇ／ｍｌ（４．６ｎＭ）を超えうる（Polin, R.S. ら, 上記）。卒中に関して血清ＩＣＡＭ-１濃度の変化を調査するためには更なる研究が必要である。血清ＩＣＡＭ-１は脳損傷の非常に非特異的なマーカであり，これは炎症状態の発生の原因となる種々の症状を有する個体の血清中で上昇するからである。更に，血清ＩＣＡＭ-１濃度の上昇は卒中に関係するリスク因子のいくつかにも関係する。
血管細胞接着因子（ＶＣＡＭ）（ＣＤ１０６とも呼ばれる）は１００-１１０ｋＤａの細胞表面結合型免疫グロブリン様インテグリンリガンドであり，リンパ球リクルートの際にＢリンパ球および発達中のＴリンパ球の抗原提示細胞への結合を促進する。ＶＣＡＭは通常，血管および脈管，心臓，および他の体腔の表面を覆う内皮細胞で生成される。正常なＶＣＡＭの血清濃度は約６５０ｎｇ／ｍｌ（６．５ｎＭ）である。血清ＶＣＡＭ濃度は虚血性卒中後の個体で上昇するが，ＴＩＡでは上昇しないことが報告されており，血清濃度と損傷の重度または神経学的転帰の間の相互関係は確認されていない（Bitsch, A. ら, Stroke 29:2129-2135, 1998）。ＶＣＡＭ濃度はクモ膜下出血患者の脳脊髄液中でも上昇する（Polin, R.S. ら, J. Neurosurg. 89:559-567, 1998）。血清ＶＣＡＭ濃度の上昇は免疫系の活性化および炎症反応の存在を示していると考えられる。血清ＶＣＡＭ濃度はアテローム性動脈硬化症，種々の型の癌，糖尿病，子癇前症，血管損傷，および他の不特定な炎症状態を有する個体で上昇する（Otsuki, M. ら, Diabetes 46:2096-2101, 1997；Banks, R.E. ら, Br. J. Cancer 68:122-124, 1993；Steiner, M. ら, Thromb. Haemost. 72:979-984, 1994；Austgulen, R. ら, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 71:53-58, 1997）。ＶＣＡＭの血清濃度は虚血性卒中後に上昇する。血清濃度は発症の５日後に上昇し，発症の１４日後に正常値に戻る。血清ＶＣＡＭ濃度は卒中患者で９００ｎｇ／ｍｌ（９ｎＭ）近くになりうる。卒中に関して血清ＶＣＡＭ濃度の変化を調査するには更なる研究が必要である。血清ＶＣＡＭ濃度は内皮細胞損傷の程度と関係があると考えられる。血清ＶＣＡＭは内皮細胞損傷の感度の高いマーカーでありうる。しかしながら，血清ＶＣＡＭの上昇は卒中または脳損傷に特異的ではない。更に，現在の情報では，ＶＣＡＭの血清濃度は卒中の５日後までは有意に上昇しないことが示されている。この時点は治療の時間枠を十分超えており，ＶＣＡＭが卒中の好適なマーカーではないことを示している。
単球走化性蛋白質-１（ＭＣＰ-１）（単球遊走誘引蛋白質-１（monocyte chemoattractant protein-1）とも呼ばれる）は１０ｋＤａの走化性因子であり，単球および好塩基球を誘引するが，好中球または好酸球は誘引しない。ＭＣＰ-１は通常，単量体およびホモ２量体間の平衡状態で見られ，通常，単球および血管内皮細胞で生成，分泌される（Yoshimura, T. ら, FEBS Lett. 244:487-493, 1989；Li, Y.S. ら, Mol. Cell. Biochem. 126:61-68, 1993）。ＭＣＰ-１は単球浸潤を伴う種々の疾病（乾癬，リウマチ性関節炎，およびアテローム性動脈硬化症を含む）の病因と関係があるとされている。正常な血漿中のＭＣＰ-１濃度は＜０．１ｎｇ／ｍｌである。動物モデルを使用した調査により，ＭＣＰ-１のｍＲＮＡおよび蛋白質はいずれも，虚血性脳組織での発現量が増加することが証明されている（Wang, X. ら, Stroke 26:661-665, 1995；Yamagami, S. ら, J. Leukoc. Biol. 65:744-749, 1999）。ＭＣＰ-１の血清濃度の上昇は炎症に関係する種々の症状，例えばアルコール性肝疾患，間質性肺疾患，敗血症，全身性エリテマトーデス，および急性冠状動脈症候群（acute coronary syndromes）に関係する（Fisher, N.C. ら, Gut 45:416-420, 1999；Suga, M. ら, Eur. Respir. J. 14:376-382, 1999；Bossnik, A.W. ら, Blood 86:3841-3847, 1995；Kaneko, H. ら, J. Rheumatol. 26:568-573, 1999；Nishiyama, K. ら, Jpn. Circ. J. 62:710-712, 1998；Matsumori, A. ら, J. Mol. Cell. Cardiol. 29:419-423, 1997）。ＭＣＰ-１は単球および内皮細胞の活性化の際，血流中に放出される。卒中に関するＭＣＰ-１血流への放出および血流からのクリアランスの速度論は現在のところまだ知られていない。
発現が損傷の結果として，急性期蛋白質によって直接的に，または急性期蛋白質と同時に，特異的に変更される蛋白質は，急性期反応物質であるとみなすことができる。卒中に関しては，細胞死の直接的な結果としてその血清濃度が上昇するような蛋白質は急性期反応物質であるとはみなされないが，遺伝子発現とそれによって生じる分泌および血清濃度が脳損傷または虚血に応答して変化するような蛋白質は急性期反応物質とみなされる。それらの蛋白質の例にはマトリクス・メタロプロティナーゼ-３およびマトリクス・メタロプロティナーゼ-９がある。
マトリクス・メタロプロティナーゼ-３（ＭＭＰ-３）（ストロメリシン-１とも呼ばれる）は４５ｋＤａの亜鉛およびカルシウム結合型プロティナーゼであり，不活性な６０ｋＤａの前駆体として合成される。成熟ＭＭＰ-３はプロテオグリカン，フィブリネクチン，ラミニン，およびIV型コラーゲンを切断するが，Ｉ型コラーゲンは切断しない。ＭＭＰ-３は種々の細胞で合成されるが，それらには平滑筋細胞，マスト細胞，マクロファージ誘導型泡沫細胞，Ｔリンパ球，および内皮細胞がある（Johnson, J.L., ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1707-1715, 1998）。ＭＭＰ-３は他のＭＭＰのように細胞外マトリクスのリモデリングに関係し，これは損傷後または細胞の脈管間移動の際に起こりうる。ＭＭＰ-３は通常，血漿中に＜１２５ｎｇ／ｍｌの濃度でみられる（Zucker, S. ら, J. Rheumatol. 26:78-80, 1999）。血清ＭＭＰ-３濃度は年齢と共に上昇することが明らかになっており，男性の濃度は女性より約２倍高い（Manicourt, D.H. ら, Arthritis Rheum. 37:1774-1783, 1994）。ＭＭＰ-３はアテローム斑のショルダー域（最も破裂しやすい領域である）で見られ，アテローム斑の不安定化に関係しうる（Johnson, J.L. ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1707-1715, 1998）。従って，循環ＭＭＰ-３濃度はアテローム斑の破裂の結果として上昇しうる。血清ＭＭＰ-３はマスト細胞の脱顆粒を誘導する炎症状態で上昇しうる。血清ＭＭＰ-３濃度は関節炎および全身性エリテマトーデス患者で上昇する（Zucker, S. ら, J. Rheumatol. 26:78-80, 1999；Keyszer, G. ら, J. Rheumatol. 57:392-398, 1998；Keyszer, G. ら, J. Rheumatol. 26:251-258, 1999）。血清ＭＭＰ-３は前立腺癌，尿路上皮癌，および腎炎患者でも上昇する（Lein, M. ら, Urologe A 37:377-381, 1998；Gohji, K. ら, Cancer 78:2379-2387, 1996；Akiyama, K. ら, Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 95:115-128, 1997）。ＭＭＰ-３の血清濃度は他の型の癌患者でも上昇しうる。血清ＭＭＰ-３はヘモクロマトーシス患者で低下する（George, D.K. ら, Gut 42:715-720, 1998）。ＭＭＰ-３はマスト細胞の脱顆粒の際に放出され，おそらくはアテローム斑破裂の際に放出される。この点で，ＭＭＰ-３は斑破裂に関係する卒中のマーカーとして有用でありうる。
マトリクス・メタロプロティナーゼ９（ＭＭＰ-９）は好中球および種々の組織で生成される９２ｋＤａの分泌型セリンプロティナーゼであり，その基質には細胞外マトリクスの成分が含まれる。ＭＭＰは不活性なチモーゲンとして合成され，タンパク分解によって切断して活性ＭＭＰを生成する。それらは２価のカチオン（最も一般的にはＺｎ2+）と結合する能力を有し，この結合はプロティナーゼ活性に必須である。癌細胞は浸潤および転移の際にＭＭＰを生成して細胞外マトリクスの分解を促進する場合がある。ＭＭＰは通常，脳に見られ，その発現は種々のサイトカインで誘導される（Mun-Bryce, S. および Rosenberg, GA., J. Cereb. Blood Flow Metab. 18:1163-1172, 1998）。正常なＭＭＰ-９の血清濃度は＜３５ｎｇ／ｍｌ（３８０ｐＭ）である。ラットモデルでは脳虚血後に血清ＭＭＰ-９濃度がわずかに上昇するが，ヒトに関する研究は報告されていない（Romanic, A.M. ら, Stroke 29:1020-1030, 1998）。ＭＭＰ-９の遺伝子発現はラットにおいて脳出血または前炎症性サイトカインの脳内注射の１６-２４時間後に最大まで上昇する（Rosenberg, G.A., J. Neurotrauma 12:833-842, 1995）。更に，ＭＭＰ-９は遷延型神経症候，特に虚血性卒中の出血性への転換および出血性卒中後の血管痙攣の発生に部分的に関与しうる。この点で，血清ＭＭＰ-９濃度の上昇は遷延型神経症候の発生の可能性を示しうる。ＭＭＰ-９の血清濃度の上昇は種々の癌腫および巨細胞性動脈炎と関係しうる（Blankaert, D. ら, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 18:203-209, 1998；Endo, K. ら, Anticancer Res. 17:2253-2258, 1997；Hayasaka, A. ら, Hepatology 24:1058-1062, 1996；Moore, D.H. ら, Gynecol. Oncol. 65:78-82, 1997；Sorbi, D. ら, Arthritis Rheum. 39:1747-1753, 1996）。ＭＭＰ-９は種々の型の卒中後に生成され，循環中に放出されるが，これらの研究はヒト由来サンプルを使用しては行われていない。ＭＭＰ-９の血清濃度はヒトで６００ｎｇ／ｍｌ（６．５ｎＭ）を超えることが証明されている。ＭＭＰ-９は細胞外マトリクス分解の特異的マーカーであるが，卒中または脳損傷に特異的ではなく，癌のような他の疾病状態でも上昇しうる。しかしながら，血清ＭＭＰ-９濃度の上昇が測定されれば，それは個体が虚血性卒中後の出血性への転換，または出血性卒中後の血管痙攣の発生リスクが高いことを示しうる。この決定は，ＭＭＰ-９がこれらの遷延型神経症候の病原性メディエーターであるという仮説に基づいている。
脳損傷の他の非特異マーカーにはカスパーゼ-３，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，心筋トロポニンＩ，ヘッドアクチベータ，およびヘモグロビンα2鎖がある。更に，本発明は卒中およびＴＩＡの診断のための新規のマーカーを同定する方法を提供する。
カスパーゼ-３（ＣＰＰ-３２，ＹＡＭＡ，およびアポパインとも呼ばれる）はインターロイキン-１β変換酵素（ＩＣＥ）様細胞内システインプロティナーゼであり，細胞アポトーシスの際に活性化される。カスパーゼ-３は３２ｋＤａの不活性な前駆体として存在し，アポトーシス誘導の際にタンパク分解によって活性化され，２０ｋＤａおよび１１ｋＤａのサブユニットのヘテロ２量体となる（Fernandes-Alnemri, T. ら, J. Biol. Chem. 269:30761-30764, 1994）。その細胞基質にはポリ（ＡＤＰ-リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）およびステロール調節要素結合蛋白質（ＳＲＥＢＰ）がある（Liu, X. ら, J. Biol. Chem. 271:13371-13376, 1996）。正常なカスパーゼ-３の血漿濃度は知られていない。動物モデルでの研究により，カスパーゼ-３の発現は脳虚血後に上昇することが証明されている（Phanithi, P.B. ら, Neuropathol. 20:273-282, 2000；Kim, G.W. ら, J. Cereb. Blood Flow Metab. 20:1690-1701, 2000）。また，永続性および一過性脳虚血患者では，脳虚血によってカスパーゼ-３の活性化が起こる（Love, S. ら, Neuroreport 11:2495-2499, 2000）。更に，虚血および低酸素に伴う心筋細胞におけるアポトーシス誘導の仮説を支持する証拠は増えている（Saraste, A., Herz. 24:189-195, 1999；Ohtsuka, T. ら, Coron. Artery Dis. 10:221-225, 1999；James, T.N., Coron. Artery Dis. 9:291-307, 1998；Bialik, S. ら, J. Clin. Invest. 100:1363-1372, 1997；Long, X. ら, J. Clin. Invest. 99:2635-2643, 1997）。血漿カスパーゼ-３濃度の上昇はアポトーシスに関与する生理学的事象に関係しうる。カスパーゼ-３の血流への放出および血流からの除去の反応速度論は現在のところ未知である。興味深いことに，虚血誘導型アポトーシスは他の型のアポトーシスと区別される特徴を有しうるが，カスパーゼ-３の誘導は全てのアポトーシス経路に共通である。
トロポニンＩ（ＴｎＩ）は２５ｋＤａの，トロポニンＴＩＣ複合体の阻害要素であり，全ての横紋筋組織に見られる。ＴｎＩはＣａ2+の非存在下でアクチンに結合し，アクトミオシンのＡＴＰアーゼ活性を阻害する。心組織に見られるＴｎＩアイソフォーム（ｃＴｎＩ）は骨格筋ＴｎＩとは４０％相違しており，これによって両アイソフォームの免疫学的識別が可能となる。正常なｃＴｎＩの血漿濃度は＜０．１ｎｇ／ｍｌ（４ｐＭ）である。血漿ｃＴｎＩ濃度はＡＭＩを含む急性冠状動脈症候群患者で上昇する。その心臓特異性のため，ｃＴｎＩは卒中に同様に関係する種々のマーカーの上昇の心臓的要因を除外するのに有用でありうる。この点で，心筋トロポニンＴＩＣ複合体，並びにその総ｃＴｎＩとの比率の測定は，卒中を診断するのに使用されるマーカーの上昇の心臓的要因を同定するのに重要でありうる。
ヘッドアクチベータ（ＨＡ）は１１アミノ酸の，１．１ｋＤａの神経ペプチドであり，視床下部および腸に見られる。これは元来，淡水腔腸動物ヒドラに見られ，頭部特異的成長および分化因子として作用する。ヒトでは，脳の発達の際の成長調節物質であると考えられる。正常な血清ＨＡ濃度は＜０．１ｎｇ／ｍｌ（１００ｐＭ）である。血清ＨＡ濃度は神経または神経内分泌起源の腫瘍を有する患者で持続的に上昇する（Schaller, H.C. ら, J Neurooncol. 6:251-258, 1988；Winnikes, M. ら, Eur. J. Cancer 28:421-424, 1992）。卒中に関係する血清ＨＡの上昇に関する研究は報告されていない。ＨＡは神経または神経内分泌起源の腫瘍で継続的に分泌されると推定されており，血清濃度は腫瘍の除去後に正常に戻る。血清ＨＡ濃度は神経内分泌誘導型腫瘍を有する個体で６．８ｎｇ／ｍｌ（６．８ｎＭ）を超えうる。卒中パネル（panel）の一部としてのＨＡの有用性は神経または神経内分泌起源の腫瘍を有する個体を同定することである。これらの個体は癌の結果としての脳損傷に伴って血清中のマーカーの上昇が起こりうるが，卒中に関連する脳損傷では上昇しない。これらの個体は脳損傷の迅速な診断による利益を被る個体群の小さな亜集団かもしれないが，マーカーとしてのＨＡの使用はその同定の助けとなる。最後に，アンギオテンシン変換酵素（血清酵素）はＨＡを分解する能力を有し，血液サンプルはこの活性を阻害するために抗凝固物質としてＥＤＴＡを使用して採取しなければならない。
ヘモグロビン（Ｈｂ）は酸素運搬鉄含有球状蛋白質で，赤血球中に見られる。これは２つのグロブリンサブユニットのヘテロ２量体である。α2γ2は胎児Ｈｂ，α2β2は成人ＨｂＡ，そしてα2δ2は成人ＨｂＡ2と呼ばれる。ヘモグロビンの９０-９５％はＨｂＡであり，α2グロブリン鎖は全てのＨｂ型に（鎌状赤血球ヘモグロビンでも）見られる。Ｈｂは全身の細胞への酸素の運搬に関与する。Ｈｂα2は通常，血清中では検出されない。卒中パネルに関してのＨｂα2の有用性は，溶血の程度，およびその結果としての測定された血清濃度への赤血球起源蛋白質の寄与を測定することである。赤血球中に存在する血清マーカーの測定のために，溶血の許容レベルを確立しなければならない。ある場合には，卒中または他の脳損傷によって血圧の局所的変化が起こり，これらの血圧変化に関係するマーカーから被験体の病状に関する重要な診断および／または予後兆候の情報が得られうる。例えば虚血性卒中では，閉塞によって関係する動脈での血圧上昇が起こり，出血性卒中では，出血によって関係する動脈での血圧低下が起こる。更に，出血性卒中後にしばしば起こるような血管痙攣の際，血圧の上昇が関係する痙攣動脈で観察されうる。
局所的または全身的に血圧に影響を与えうるペプチドは種々の機構によって，例えば動脈の直径の変化（血管収縮または血管拡張）によって，または血液総量を増加もしくは減少させる，腎臓の流出量の増加もしくは減少によって作用する。特に興味深いのは，損傷部位で，またはその近辺で，更に全身に作用が広がることなく，血管収縮または血管拡張を起こす調節物質である。血圧の調節物質は卒中の型によって，また，調節物質が血圧を上昇させるか，もしくは低下させるかによって，上昇または抑制される。結果として種々の血圧関連マーカーのレベル変化によって虚血性および出血性卒中間の識別が可能となりうる。
例えば，虚血性卒中の際，１つ以上の血管拡張物質のレベルが上昇し，そして／または１つ以上の血管収縮物質が低下するか，もしくは変化しないままでありうる；反対に，出血性卒中ではこの逆が起こりうる。更に，被験体が出血性卒中であると診断されると，種々の血圧調節物質の変化を観察することによって，被験体の血管痙攣の傾向またはその発生をモニタリングすることができる。最後に，これらの局所的血圧変化を相殺する１つ以上の物質によって，局所的な血圧の緩解することのない上昇または低下作用に対する重要な防御を提供できる。
卒中のマーカーとして有用でありうる血圧調節物質にはパラクリン作用を持つもの，すなわち，損傷部位で，またはその近辺で分泌され，作用するものがある。ナトリウム利尿ペプチドＡＮＰ，ＢＮＰ，およびＣＮＰは血管拡張作用を有することが知られている。ＣＮＰはパラクリン作用を有することが広く信じられており，脳の血管内皮に見られ，その受容体も脳の血管内皮に見られ，そして単離したラット脳動脈の用量依存的血管拡張を起こすことが知られているので，特に興味深い（Mori, Y., ら, Eur J Pharmacol 320:183, 1997）。
Ａ型ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（心房型ナトリウム利尿ペプチドとも呼ばれる）は２８アミノ酸ペプチドであり，心房性拡張，アンギオテンシンＩ刺激，エンドセリン，および交感神経刺激（β-アドレナリン作動性受容体介在型）に応答して心筋細胞で合成，貯蔵，および放出される。ＡＮＰは前駆体分子（プロ-ＡＮＰ）として合成され，タンパク分解による切断によって活性型に変換する。心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ９９-１２６）そのものに加え，そのＮ-末端プロホルモンセグメントからの直線ペプチドフラグメントも生物学的活性を有することが報告されている。
ＡＮＰレベルの上昇は血液量過多およびうっ血性心不全の際に見られる。ＡＮＰはナトリウム／水バランス，血液量，および動脈圧の長期的制御に関与している。このホルモンは副腎皮質ホルモンによるアルドステロンの放出を低下させ，糸球体濾過率（ＧＦＲ）を上昇させ，ナトリウム排泄増加および利尿（カリウムの節約）を起こし，レニン放出を低下させ，従ってアンギオテンシンIIを低下させる。これらの作用は血液量の低下，およびそれによって中心静脈圧（ＣＶＰ），心送血量，および動脈圧の低下に寄与する。ＡＮＰのいくつかのアイソフォームが同定されており，それらと卒中発生率の関係が研究されてきた。例えばRubatu ら, Circulation 100:1722-6, 1999；Estrada ら, Am. J. Hypertens. 7:1085-9, 1994を参照されたい。
ＡＮＰの慢性的上昇は，主に全身の血管抵抗の低下によって，動脈圧を低下させると考えられる。全身性血管拡張の機構は，ＡＮＰ受容体が介在する血管平滑筋ｃＧＭＰの上昇ならびに交感神経性血管緊張の弱力化によるものでありうる。この後者の機構は中枢神経系内の部位へのＡＮＰの作用ならびに交感神経末端によるノルエピネフリン放出の阻害によるものでありうる。ＡＮＰはレニン-アンギオテンシン系の逆調節系であると見なしてもよい。中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤である新しい種類の薬剤は心不全に有効であることが証明されている。これらの薬剤はＡＮＰの分解の原因である酵素，中性エンドペプチダーゼを阻害し，それによってＡＮＰの血漿レベルを上昇させる。ＮＥＰ阻害は，薬剤がＮＥＰおよびＡＣＥ阻害性の両方を併せ持つ場合，心不全に特に有効である。
Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）（脳型ナトリウム利尿ペプチドとも呼ばれる）は３２アミノ酸，４ｋＤａのペプチドであり，ナトリウム利尿系に関係し，血圧および体液バランスを調節する（Bonow, R.O., Circulation 93:1946-1950, 1996）。ＢＮＰの前駆体は１０８アミノ酸分子として合成され（"前プロＢＮＰ"と呼ばれる），タンパク分解されて７６アミノ酸のＮ-末端ペプチド（アミノ酸１-７６）（"ＮＴプロＢＮＰ"と呼ばれる）および３２アミノ酸の成熟ホルモン（ＢＮＰまたはＢＮＰ３２と呼ばれる）（アミノ酸７７-１０８）となる。これらの種-ＮＴプロＢＮＰ，ＢＮＰ３２，および前プロＢＮＰ-はそれぞれヒト血漿中で循環されることが示唆されている（Tateyama ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 185:760-7, 1992；Hunt ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 214:1175-83, 1995）。２つの型，前プロＢＮＰおよびＮＴプロＢＮＰ，そしてＢＮＰ，前プロＢＮＰ，およびＮＴプロＢＮＰから誘導され，ＢＮＰ，ＮＴプロＢＮＰ，および前プロＢＮＰのタンパク分解の結果として血液中に含有されるペプチドを，ＢＮＰに関係する，またはそれに伴うマーカーとして集合的に記述する。ＢＮＰおよびＢＮＰに関連するペプチドのタンパク分解は文献にも記載されており，これらのタンパク分解フラグメントも"ＢＮＰ関連ペプチド"という用語に含まれる。ＢＮＰおよびＢＮＰ関連ペプチドは主に心室の分泌顆粒中に見られ，心室容積の拡大および圧負荷の両方に応答して心臓から放出される（Wilkins, M. ら, Lancet 349:1307-1310, 1997）。
ＢＮＰはクモ膜下出血患者の血漿で上昇することが証明されている（Sviri, G.E., ら, Stroke 31:118-122, 2000；Tomida, M. ら, Stroke 29:1584-1587, 1998；Berendes, E. ら, Lancet 349:245-249, 1997；Wijdicks, E.F., ら, J. Neurosurg. 87:275-280, 1997）。更に，うっ血性心不全および腎不全に伴うＢＮＰ濃度の上昇についての多数の報告がなされている。ＢＮＰおよびＢＮＰ関連ペプチドは卒中に特異的でないと考えられるが，それらは卒中に伴うナトリウム利尿系の混乱を示しうるので，感度の高い卒中のマーカーとなりうる。ここで使用する"ＢＮＰ"という用語は３２アミノ酸の成熟ＢＮＰ分子そのものをさす。しかしながら当業者に認識されるように，ＢＮＰに関連する他のマーカーも卒中患者の診断または予後の指示に役立ちうる。例えばＢＮＰは１０８アミノ酸の前プロＢＮＰ分子として合成され，タンパク分解によって７６アミノ酸の"ＮＴプロＢＮＰ"および３２アミノ酸のＢＮＰ分子となる。そのＢＮＰとの関係のため，ＮＴプロＢＮＰ分子の濃度から，患者における診断または予後兆候の情報を得ることができる。
"ＢＮＰに関連するマーカーまたはＢＮＰ関連ペプチド"というフレーズは，３２アミノ酸ＢＮＰ分子そのもの以外の，前プロＢＮＰ分子由来のポリペプチドをさす。従って，ＢＮＰに関係する，またはそれに伴うマーカーにはＮＴプロＢＮＰ分子，プロドメイン，完全な３２アミノ酸配列より小さいＢＮＰのフラグメント，ＢＮＰ以外の前プロＢＮＰのフラグメント，およびプロドメインのフラグメントがある。また当業者に認識されるように，循環はＢＮＰおよびＢＮＰ関連分子をタンパク分解できるプロテアーゼを含有し，これらのタンパク分解された分子（ペプチド）は"ＢＮＰに関連する"と見なされ，本発明の更なる対象である。
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）は２２アミノ酸ペプチドで，ヒト脳における主要な活性ナトリウム利尿ペプチドである；ＣＮＰも内皮誘導型弛緩因子であると見なされ，酸化窒素（ＮＯ）と同様に作用する（Davidson ら, Circulation 93:1155-9, 1996）。ＣＮＰはＡ型ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）およびＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）と構造的に関係している；しかしながら，ＡＮＰおよびＢＮＰは主に心筋で合成されるのに対し，ＣＮＰは血管内皮で前駆体（プロ-ＣＮＰ）として合成される（Prickett ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 286:513-7, 2001）。ＣＮＰは動脈および静脈の両方に対する血管拡張作用を有すると考えられ，血管平滑筋細胞における細胞内ｃＧＭＰ濃度を増加させることによって，主に静脈で作用することが報告されている。
脳で作用する内皮由来の他のペプチドにはアドレノメジュリン（adrenomedullin）（ＡＤＭ），他の有効な血管拡張剤（Jougasaki, M. および Burnett, J.C. Jr., Life Sci 66:855, 2000），およびエンドセリン（Guimaraes ら, Hypertension 19, 2 Suppl. II79-86, 1992；Ortega Mateo, A. および de Artinano, A.A., Pharmacol Res 36:339, 1997）がある。エンドセリンは，血管内皮で生成され，別々の遺伝子にコードされる３つの関連ペプチド（エンドセリン-１，エンドセリン-２，およびエンドセリン-３）であり，そのそれぞれは有効な血管収縮作用を示す。
アドレノメジュリン（ＡＭ）は多くの組織（副腎皮質，肺，腎臓，および心臓を含む）で生成される５２アミノ酸ペプチドである（Yoshitomi ら, Clin. Sci. (Colch) 94:135-9, 1998）。実験動物において，ＡＭの静脈内投与によって，長期にわたる降圧作用が心送血量の増加と共に起こる。ＡＭは右心房からのＡＮＰの伸張誘導型放出を促進するが，心室ＢＮＰ発現には影響しないことが報告されている。ＡＭは前駆体分子（プロ-ＡＭ）として合成される。ＡＭ前駆体から加工されたＮ-末端ペプチドも降圧ペプチドとして作用することが報告されている（Kuwasako ら, Ann. Clin. Biochem. 36:622-8, 1999）。
エンドセリン-１（ＥＴ-１）は２１アミノ酸残基ペプチドであり，２１２残基の前駆体（前プロＥＴ-１）として合成されるが，これは１７残基のシグナル配列を含有し，それが除去されてｂｉｇ ＥＴ-１として知られるペプチドを提供する。この分子は更にエンドセリン変換酵素によるｔｒｐ２１およびｖａｌ２２間の加水分解によってプロセシングされる。ｂｉｇ ＥＴ-１およびＥＴ-１はいずれも生物学的活性を示す；しかしながら成熟ＥＴ-１型はより高い血管収縮活性を示す（Brooks および Ergul, J. Mol. Endocrinol. 21:307-15, 1998）。同様に，エンドセリン-２およびエンドセリン-３は２１アミノ酸残基長であり，それぞれｂｉｇ エンドセリン-２およびｂｉｇ エンドセリン-３の加水分解によって生成される（Yap ら, Br. J. Pharmacol. 129:170-6, 2000；Lee ら, Blood 94:1440-50, 1999）。
アッセイ測定の戦略
本発明のマーカーの検出および分析のための多くの方法および装置は当業者に十分知られている。患者の試験サンプル中のポリペプチドまたは蛋白質に関しては，免疫アッセイ装置および方法が多くの場合使用される。例えば米国特許第6,143,576号；6,113,855号；6,019,944号；5,985,579号；5,947,124号；5,939,272号；5,922,615号；5,885,527号；5,851,776号；5,824,799号；5,679,526号；5,525,524号；および5,480,792号を参照されたい。これらはそれぞれ，全ての表，図，および請求の範囲を含めて，その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの装置および方法は種々のサンドイッチ，競合，または非競合アッセイフォーマットで標識された分子を使用して，対象分析物の存在または量に関係するシグナルを生成する。更に，ある種の方法および装置，例えばバイオセンサーおよび光学免疫アッセイを使用して，標識分子を必要とせずに，分析物の存在または量を測定してもよい。例えば米国特許第5,631,171号および第5,955,377号を参照されたい。そのそれぞれは全ての表，図，および請求の範囲を含めて，その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
好ましくはマーカーは免疫アッセイを使用して分析するが，他の方法は当業者に周知である（例えばマーカーのＲＮＡレベルの測定）。マーカーの存在または量は一般に各マーカーに特異的な抗体を使用し，特異的結合を検出して測定する。好適な免疫アッセイ，例えば酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ），ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），競合結合アッセイなどを利用してもよい。マーカーへの抗体の特異的免疫学的結合は直接的または間接的に検出できる。直接標識には抗体に結合させた蛍光または発光タグ，金属，色素，放射性核種などがある。間接標識には当該分野で周知の種々の酵素，例えばアルカリホスファターゼ，ホースラディッシュペルオキシダーゼなどがある。
マーカーに特異的な固定化された抗体の使用も本発明で企図される。抗体は種々の固相支持体，例えば磁気またはクロマトグラフ用マトリクス粒子，アッセイ箇所の表面（例えばマイクロタイターウェル），固体基質物質片（例えばプラスチック，ナイロン，紙）などに固定化できる。アッセイ片は固相支持体上に抗体または複数の抗体をアレイ状にコーティングすることによって調製できる。次いでこの断片を試験サンプルに浸漬した後，素早く洗浄および検出段階を行って測定可能なシグナル（例えば着色したスポット）を得る。
マーカーの分析は同様に種々の物理的フォーマットでも実施できる。例えば，マイクロタイタープレートまたは自動操作を使用して大量の試験サンプルの処理を容易にすることができる。あるいはまた，単独のサンプルフォーマットを開発して，例えば救急輸送または救急処置室のような状況で，即時治療および診断をタイムリーに行うことが容易にすることができる。
複数のマーカーの分析を個別に，または１つの試験サンプルで同時に行ってもよい。いくつかのマーカーを併せて１つの試験とし，多数のサンプルの効率的な処理を行ってもよい。更に当業者に認識されるように，同じ個体から複数のサンプル（例えば連続的な時点での）を試験することも有益である。そのような連続的なサンプルの試験によって，一定期間にわたるマーカーレベルの変化を同定することが可能となる。マーカーレベルの上昇または低下，並びにマーカーレベルの変化が見られないということから，疾病状態に関する有用な情報が得られ，それには，限定されるわけではないが，事象の発生からのおおよその時間の同定，救出可能な組織の存在および量，神経保護物質または血栓溶解剤療法の好適性，再潅流または症状の解決によって示されるような種々の卒中療法の有効性，虚血性卒中と出血性卒中との識別，一過性虚血発作の同定，事象の重度の同定，疾病の重度の同定，および患者の転帰の同定（将来的な事象のリスクを含む）がある。
上記のマーカーからなるパネルを構築して，卒中の診断および卒中患者の管理に関係する関連情報を得てもよい。それらのパネルは１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，または２０個の個別マーカーを使用して構築してもよい。当業者は１個のマーカー，またはより大きなマーカー集団を含むマーカーのサブセットの分析を行って，種々の臨床状況で臨床的な感度または特異性を最適化することができる。これらには，限定されるわけではないが，救急，緊急治療，臨床治療，集中治療，モニタリングユニット，入院患者，外来患者，医院，診療所，および健康診断の背景がある。更に，当業者は１つのマーカーまたはより大きなマーカー集団を含むマーカーのサブセットを，上記の背景のそれぞれにおける診断閾値の調節と併せて使用し，臨床における感度および特異性を最適化することができる。アッセイの臨床的感度は，アッセイが正確に予測する，疾病を有する患者のパーセンテージと定義され，アッセイの特異性はアッセイが正確に予測する，疾病を有さない患者のパーセンテージと定義される（Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 第２版, Carl Burtis および Edward Ashwood e編, W.B. Saunders and Company, p. 496）。
好ましい態様では，脳損傷の１つ以上の特異的マーカーを脳損傷の１つ以上の非特異的マーカーと組み合わせて卒中またはＴＩＡの診断パネルを生成する。更に，本発明はそれらの複数のマーカーの要素を決定する方法を提供する。そのようなパネルが構築されると，種々のマーカーのそれぞれの存在またはレベルを１つ以上の患者サンプルで測定し，必要により各マーカーの診断レベルまたは正常レベルと比較する。
いくつかのマーカーから得られた個々の結果を種々に組み合わせて，個体の診断および／または予後に関する更なる情報を得てもよい。例えば，ＲＯＣ曲線を使用して一連のマーカーのそれぞれの閾値を測定し，サンプルからの値をこれらの閾値と比較してもよい。
好ましい別法では，種々のパネルの結果を合わせたものを，個体が卒中を有する確率（数値によるスコアまたはパーセンテージのいずれかで表す），更に特定のパネル選択に基づいてそれが虚血性卒中である確率，および特定のパネル選択に基づいてそれが出血性卒中である確率として解釈することができる。ＲＯＣ曲線は，パネルについて，種々のカットオフで，特定のパネルのマーカーの感度と１−（特異性）とのＲＯＣ曲線をプロットすることによって得られる。結果から，決定の閾値効果の経験的説明ができる。"ＲＯＣ面積"はＲＯＣ曲線より下の面積をいう。ＲＯＣ曲線より下の面積は，認められた測定によって症状の正確な同定ができる確率の尺度である。曲線より下の面積（ＡＵＣ）が大きいほど，識別能力が大きい。識別能力が無い試験のＡＵＣは０．５である。完全な識別能力がある試験のＡＵＣは１．０である。そのようにして，組み合わせた情報を使用して個々のマーカーアッセイの価値を向上させることができる。
多数のマーカーから得られたデータを迅速に処理するために，上記のＲＯＣ曲線を計算し，患者の確率スコアを分析するためにコンピューター演算法を使用することが好適でありうる。それらのプログラムを使用して，あらかじめ設定したマーカー群およびその組み合わせに基づいて同時に実施したマーカーアッセイのいくつかのサブセットを，係数を求め，重み付けすることができる。
別の態様では，本発明はマーカーの分析キットを提供する。それらのキットは好ましくは少なくとも１つの試験サンプルの分析のための装置および試薬，そしてアッセイの実施に関する説明書を含む。必要により，キットはマーカーレベルを患者の診断に変換するための１つ以上の方法，例えば確率を計算するためのノモグラム，標準値表，またはコンピュータープログラムを含んでもよい。
以下の実施例により本発明を例示する。これらの実施例は，いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１． 血液サンプリング
血液標本は，熟練研究者により抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いて採取し，１０分間以上遠心分離した。血漿成分を滅菌低温バイアルに移し，−２０℃またはそれ以下で凍結した。患者および正常健康ドナーの以下の集団からの標本を収集した（表１）。アッセイデータの統計学的分析を助けるために，それぞれの患者について病歴が入手可能であった。
Figure 2005522669
実施例２． 生化学的分析
マーカーは，標準的なイムノアッセイ手法を用いて測定した。これらの手法は，蛋白質標的に特異的に結合する抗体を使用する。選択されたマーカーに対するモノクローナル抗体は，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）を抗体あたり約５ＮＨＳ−ビオチン成分の比率で用いてビオチン化した。次に，抗体−ビオチンコンジュゲートを標準的なアビジン３８４ウエルマイクロタイタープレートのウエルに加え，プレートに結合しなかった抗体コンジュゲートを除去した。これにより，マイクロタイタープレート中に“抗マーカー”が形成された。同じマーカーに対する別のモノクローナル抗体を，スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびＮ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてアルカリホスファターゼとコンジュゲート化させた。
ＢＮＰのアッセイは，Ｓｃｉｏｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から得たネズミ抗ＢＮＰモノクローナル抗体１０６．３を用いて行った。ＦＯＸ−ＮＹ細胞と，ＢＳＡにコンジュゲート化したヒトＢＮＰ１−３２で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスからの脾臓細胞とを融合させて，ｍＡｂ１０６．３を分泌するハイブリドーマ細胞株を作製した。第２のネズミ抗ＢＮＰ抗体は，Ｂｉｏｓｉｔｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により，先に記載されているように（米国特許６，０５７，０９８），ＫＬＨにコンジュゲート化したヒトＢＮＰ抗原（Ｓｃｉｏｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ；米国特許５，１１４，９２３）を用いて，抗体ファージディスプレイにより標準的な手法によって製造した。アッセイの標準化のためにヒトＢＮＰ抗原も用いた。
ＩＬ−６のアッセイは，市販のネズミ抗ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体（クローン＃６７０８．１１１）およびヤギ抗ヒトＩＬ−６ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて行った。アッセイの標準化に用いたヒトＩＬ−６は，Ｂｉｏｓｉｔｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄで発現させ精製した。ＩＬ−６ｃＤＮＡはヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲにより調製し，細菌発現ベクターｐＢＲｎｃｏＨ３にサブクローニングした。組換えＩＬ−６の発現および精製は，米国特許６，０５７，０９８に先に記載されている方法を用いて行った。
ＭＭＰ−９のアッセイは，Ｂｉｏｓｉｔｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄで先に記載されているように（米国特許６，０５７，０９８），ファージディスプレイおよび組換え蛋白質発現を用いて生成したネズミ抗ＭＭＰ−９抗体を用いて行った。アッセイの標準化には市販のＭＭＰ−９抗原を用いた（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。抗体生成に用いた免疫原は，Ｂｉｏｓｉｔｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄで調製した。ＰＣＲプライマーは，ヒトＭＭＰ−９の５’末端の配列およびヒトＭＭＰ−９の３’末端のコーディング配列に対応するように作製し（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ０５０７０），金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによる組換え蛋白質の精製を容易にするように，コーディング配列の最後と停止コドンとの間に挿入された６個のヒスチジンコドンを含めた。プライマーＡ（５’（ＡＧＧＴＧＴＣＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧ）配列番号１）およびＢ（５’（ＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＧＧＣＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧ）配列番号２）。５’プライマーはまた，ＥｃｏＲＩ部位およびそのすぐ上流の配列に対応する２１塩基対のｐＥＡＫ１２ベクター配列（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）をその５’末端に含む。３’プライマーは，その５’末端に，ベクター配列の６塩基のＮｏｔＩ部位およびそのすぐ下流の配列の追加の２０塩基対を含む。これらのプライマーの５’末端のベクター配列は，Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理すると，ｐＥＡＫ１２ベクターの配列と特異的かつ相補的な一本鎖オーバーハングを形成する。ＭＭＰ−９遺伝子挿入物のＰＣＲ増幅は，１００ｐｍｏｌの５’プライマー（Ａ），１００ｐｍｏｌの３’プライマー（Ｂ），２．５ユニットのＥｘｐａｎｄポリメラーゼ，１０μｌの２ｍＭｄＮＴＰｓ，１０μｌの１０ｘＥｘｐａｎｄ反応緩衝液，テンプレートとして１μｌのＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｑｕｉｃｋ−クローンヒト脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ），および１００μｌまでの残量の水を含む２ｘ１００μｌの反応スケールで行った。反応は，実施例１８（米国特許６，０５７，０９８）に記載されるように，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ熱サイクラーで行った。ＰＣＲ生成物を沈殿させ，アガロースゲル電気泳動により分離し，全長生成物をゲルから切り出し，精製し，水に再懸濁した（実施例１７，米国特許６，０５７，０９８）。ｐＥＡＫ１２ベクターをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化することにより，挿入物を入れられるように用意した。１．０μｌの１０ｘＢｕｆｆｅｒＡを１．０μｇのＤＮＡに加え，水で最終容量を９μｌにすることにより，挿入物およびＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＥＡＫ１２ベクターを，Ｔ４エキソヌクレアーゼ消化用に調製した。サンプルを１μｌ（１Ｕ／μｌ）のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで３０℃で４分間消化した。７０℃で１０分間インキュベートすることによりＴ４ＤＮＡポリメラーゼを熱不活性化させた。サンプルを冷却し，軽く遠心分離し，新たなミクロ遠心管で４５ｎｇの消化挿入物を１００ｎｇの消化ｐＥＡＫ１２ベクターに加えた。１．０μｌの１０ｘアニーリング緩衝液を加えた後，水で容量を１０μｌにした。混合物を７０℃で２分間加熱し，２０分間かけて室温に冷却して，挿入物とベクターとをアニーリングさせた。アニーリングしたＤＮＡを蒸留水で４倍に希釈し，３０μｌのエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にエレクトロポレーションした（実施例８，米国特許６，０５７，０９８）。トランスフォームした細胞を２ｘＹＴ培地で１．０ｍｌに希釈し，１０μｌ，１００μｌ，３００μｌをアンピシリン（７５μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ寒天プレートに播種し，３７℃で一晩成長させた。コロニーを採取し，２ｘＹＴ（７５μｇ／ｍｌアンピリシン）で３７℃で一晩成長させた。翌日，−８０℃での長期保存用にグリセロール凍結保存物を作製した。これらのクローン（ＭＭＰ９ｐｅａｋ１２）の配列を，ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）において，Ｓｅｑｕａｔｈｅｒｍシークエンシングキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），ｐＥＡＫ１２ベクターの挿入物のそれぞれ５’側および３’側に結合するオリゴヌクレオチドプライマーＣ５’（ＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧ）配列番号３）およびＤ（５’（ＣＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＣＴＡＣＴＣＴＡＧ）配列番号４），およびＬＩ−ＣＯＲ４０００Ｌ自動化シークエンサー（ＬＩ−ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を用いて，ジデオキシ鎖終止法により確認した。ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔを製造元（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の推奨にしたがって使用して，クローンＭＭＰ９ｐｅａｋ１２．２から，ヒトＭＭＰ−９のトランスフェクションおよび続く発現および精製に適したプラスミドを製造した。ＨＥＫ２９３（“ピーク”）細胞は，１ｍｌ凍結バイアル保存物（５ｘ１０6細胞／ｍｌ）から，Ｔ−７５フラスコ中の，５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ），２０ユニット／ｍｌのヘパリン，０．１％プルロニックＦ−６８（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ），および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＩＳ２９３培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）中で増殖させた。３７℃，８５％湿度，および５％ＣＯ2で２−３日間インキュベートした後，細胞をＴ−１７５フラスコ中で培地中のＦＢＳを２％に減少して拡張させた。次に細胞を２−３週間の間１：２で連続的に拡張させて，一様の単層の付着細胞を確立した。上述の方法で成長させたピーク細胞を１０００ｒｐｍで６分間遠心分離し，上清を廃棄した。細胞を計数して密度を求め，標準的な染色試験により少なくとも９０％の生存率を確認した後，細胞を５ｘ１０5細胞／ｍｌで２％ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む４００ｍｌのＩＳ２９３に再懸濁し，１Ｌスピナーフラスコに加えた。次に，円錐管に４００ｍｌスピナーフラスコあたり５ｍｌのＩＳ２９３および３２０μｇのＭＭＰ−９ＤＮＡを加えた。これを混合し，室温で２分間インキュベートした。スピナーフラスコあたり４００μｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＲＯ−１５３９トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を管に加え，次にこれを混合し，室温で２０分間インキュベートした。混合物をスピナーフラスコに加え，３７℃で，８５％湿度，および５％ＣＯ2で１００ｒｐｍで４日間インキュベートした。上述のスピナーフラスコからの細胞培養液を３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し，上清をＭＭＰ−９の精製用に保存した。２０ｍｌのＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含みＮｉＣｌ2を加えたカラムをＢＢＳで平衡化した。次にスピナーフラスコからの上清をカラムに負荷し，ＢＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで洗浄し，２００ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出液にＣａＣｌ2を加えて１０ｍＭとした後，これを次の精製工程において負荷した。５ｍｌゼラチンセファロース４Ｂ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を入れたカラムをＢＢＳ＋１０ｍＭＣａＣｌ2で平衡化した。抗原を負荷した後，カラムを平衡緩衝液で洗浄し，平衡緩衝液＋２％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いてＭＭＰ−９を溶出した。ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル（ＢＲＩＪ−３５）（０．００５％）およびＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を溶出液に加え，次にこれを最終緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ，４００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＣａＣｌ2，０．０１％ＮａＮ3，ｐＨ７．５，０．００５％ＢＲＩＪ−３５，１０ｍＭＥＤＴＡ）で透析した。最後に，蛋白質を約０．２５ｍｇ／ｍｌに濃縮して，４℃で保存した。Ｚｙｍｏｇｒａｍゲルを用いてＭＭＰ−９の製造および精製を確認した。またウエスタンブロットを用いて蛋白質の活性を確認した。ＭＭＰ−９（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて，ピーク細胞システムを用いて作製した精製抗原と既知標準とを比較した。
ＴＡＴ複合体のアッセイは，市販のネズミ抗ヒトＴＡＴ複合体特異的モノクローナル抗体，クローンＥＳＴ１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ），およびネズミ抗ヒトＴＡＴ複合体抗体（Ｂｉｏｓｉｔｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより，先に記載されたように（米国特許６，０５７，０９８）ファージディスプレイおよび組換え蛋白質発現を用いて製造）を用いて行った。免疫およびアッセイの標準化に用いたヒトＴＡＴ複合体は，ホウ酸緩衝化食塩水中でヒト抗トロンビンＩＩＩをヒトトロンビン（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＶＴ）とともに室温で１５分間インキュベートすることにより製造した。ＴＡＴ複合体は，ホウ酸緩衝化食塩水で平衡化した１．５ｃｍ(１００ｃｍのＳＵＰＥＲＤＥＸ７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラムを用いて，流速１ｍｌ／分間でゲル濾過により精製した。
Ｓ−１００βのアッセイは，市販のネズミ抗ヒトＳ−１００βモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）を用いて行った。市販のヒトＳ−１００β抗原をアッセイの標準化に用いた（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｇ Ｂｅａｃｈ，ＣＡ）。
ｖＷＦＡ１−インテグリンのアッセイは，ｖＷＦＡ１（クローンＲＧ４６−１−１）およびインテグリン（クローン１５２Ｂ）ドメインに特異的なネズミモノクローナル抗体を用いて行い，ｖＷＦ抗原を用いて標準化した。これらはすべてＤｒ．Ｚａｖｅｒｉｏ Ｒｕｇｇｅｒｉ（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から入手した。
ＶＥＧＦのアッセイは，先に記載されるように（米国特許６，０５７，０９８），ファージディスプレイおよび組換え蛋白質発現を用いて製造した２つのネズミ抗ヒトＶＥＧＦ抗体を用いて行った。組換えヒトＶＥＧＦを免疫およびアッセイの標準化に用いた。組換えヒトＶＥＧＦ（１６５）はＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｔ＃ＲＤＩ−１０２０），Ｐａｎｖｅｒａ（Ｃａｔ＃Ｐ２６５４），およびＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｔ＃ＰＨＧ０１４５）から入手可能である。
イムノアッセイは，ＴＥＣＡＮ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＲＳＰ２００／８ワークステーションで行った。アビジンで予めコーティングしたマイクロタイタープレートのウエルにビオチン化抗体をピペットで加え，６０分間インキュベートした。未結合抗体を含む溶液を除去し，細胞を１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％アジ化ナトリウム，および０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２０ｍＭホウ酸（ｐＨ７．４２）からなる洗浄緩衝液で洗浄した。血漿サンプル（１０μＬ）をマイクロタイタープレートにピペットで加え，６０分間インキュベートした。次にサンプルを除去し，ウエルを洗浄緩衝液で洗浄した。次に，抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートをウエルに加え，さらに６０分間インキュベートし，その後，抗体コンジュゲートを除去し，ウエルを洗浄緩衝液で洗浄した。基質（ＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をウエルに加え，蛍光生成物の形成速度を患者サンプル中のマーカーの濃度と関連づけた。
実施例３．統計学的分析
上述のマーカーの任意の組み合わせを含むパネルを構築して，卒中の診断および卒中およびＴＩＡを有する患者の管理に関する適切な情報を提供することができる。さらに，この疾病のより大きいパネルからのマーカーのサブセットを用いて，卒中および種々の観点の疾病についての感度および特異性を最適化することができる。ここに記載される例は，６−マーカーパネルとして用いたＢＮＰ，ＩＬ−６，Ｓ−１００β，ＭＭＰ−９，ＴＡＴ複合体，およびｖＷＦのＡ１およびインテグリンドメイン（ｖＷＦＡ１−インテグリン）に特異的なイムノアッセイから得たデータの統計学的分析を示す。これらのアッセイにおいて用いた閾値は，ＢＮＰについて５５ｐｇ／ｍｌ，ＩＬ−６について２７ｐｇ／ｍｌ，Ｓ−１００βについて１２ｐｇ／ｍｌ，ＭＭＰ−９について２００ｎｇ／ｍｌ，ＴＡＴ複合体について６３ｎｇ／ｍｌ，およびｖＷＦＡ１−インテグリンについて１２００ｎｇ／ｍｌである。マーカーパネルが，虚血性卒中，クモ膜下出血，脳内出血，すべての出血性卒中（頭蓋内出血），すべての卒中のタイプ，およびＴＩＡを有する患者を識別する有効性を判定するために，これらの閾値を用いて臨床的感度および特異性の統計学的分析を行った。さらに，臨床的感度および特異性の分析により，マーカーパネルの有効性を現在の診断方法であるコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンと比較した。
コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンは，卒中の診断においてしばしば用いられている。脳についてイメージングを行うため，ＣＴスキャンは卒中について高度に特異的である。ＣＴスキャンの感度は，開始後初期の出血性卒中を有する患者においては非常に高い。これに対し，虚血性卒中後の早い時間のＣＴスキャンの感度は低く，約３分の１の患者の来院時におけるＣＴスキャンはネガティブである。さらに，開始後最初の２４時間以内には５０％の患者のＣＴスキャンはネガティブでありうる。ここに記載されるデータは，２４名の患者の来院時のＣＴスキャンの感度が，虚血性卒中を有する患者の３分の１しかＣＴスキャンがポジティブではないという予測と一致していることを示す。６−マーカーパネルを用いて，少なくとも２つのマーカーが上昇していれば患者が卒中を有するものとポジティブに識別することにより，高い特異性（９２％）をもってＣＴスキャンよりほぼ２．５倍高い７９％の感度が得られる。実験集団におけるＣＴスキャンの特異性は１００％に近いと仮定する。この仮定の１つの限界は，正常集団を含む個体からはＣＴスキャンを得なかったことである。したがって，この分析におけるＣＴスキャンの特異性は，ポジティブのＣＴスキャンを生ずるかもしれない他の疾病または病気を考慮に入れて計算する。ＣＴスキャンは，卒中以外の病気，例えば，頭蓋内腫瘍，動静脈奇形，多発性硬化症，または脳炎を有する個体でポジティブであろう。これらの卒中以外の病気のそれぞれは，全米人口の１％の発症率であると見積もられている。多発性硬化症および脳炎の特徴を示すポジティブＣＴスキャンは一般に卒中から区別することができ，卒中の診断についてのＣＴスキャンの特異性は９８％より高いと考えられる。表２に示されるデータは，マーカーのパネルを使用することにより，ＣＴスキャンより高い特異性および高い感度で，虚血性卒中を経験した患者を初期に同定することが可能となることを示す。
Figure 2005522669
６−マーカーパネルの感度および特異性を，虚血性卒中，クモ膜下出血，脳内出血，すべての出血性卒中（頭蓋内出血），およびすべての卒中のタイプに関して，開始からの種々の時間と組み合わせて評価した。６−マーカーパネルの特異性は９２％に設定し，患者は２つのマーカーが上昇している場合に疾病を有すると分類した。さらに，ＢＮＰ，Ｓ−１００β，ＭＭＰ−９およびｖＷＦＡ１−インテグリンからなる４−マーカーパネルを，６−マーカーパネルと同じ状況で，特異性を９７％に設定し，同じ閾値レベルを用いて評価した。先に記載したように，疾病に対する感度または特異性を改良するために，より大きいマーカーのパネルからマーカーのサブセットを選択するためのモデルとして４−マーカーパネルを用いる。表３−７に示されるデータは，いずれのパネルもすべての卒中のタイプ，特に開始から初期のものの診断に有用であることを示す。４−マーカーパネルの使用は，６−マーカーパネルより高い特異性を与え，開始から最初の４８時間以内の出血性卒中に対する感度は同等である。６−マーカーパネルは，すべての時点において４−マーカーパネルより虚血性卒中に対して高い感度を示し，このことは，６−マーカー法は高い感度（すなわちより少ない偽陰性）を得るのに有用であり，４−マーカーパネルは高い特異性（すなわち，より少ない擬陽性）を得るのに有用であることを示す。
Figure 2005522669
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６−マーカーパネルおよび４−マーカーパネルはまた，一過性虚血性発作（ＴＩＡ）を有する患者を同定する能力についても評価した。本質的には，ＴＩＡは永久の神経損傷を引き起こさない短期間の虚血性事象である。ＴＩＡは，マーカーが血流中に局所的に放出され，これがその事象の消散によって中断されることにより特徴づけることができる。したがって，マーカーのパネルの感度は時間とともに低下するであろうことが予測される。６−マーカーパネル（特異性を９２％に設定）および４−マーカーパネル（特異性を９７％に設定）のいずれも，事象の最初の２４時間以内に感度の有意な減少を示し，これは表８に示される。このような減少は表３−７に記載される卒中の集団のいずれでも認められなかった。データは，患者からのデータを連続する時点で収集することにより，ＴＩＡを有する患者を他のタイプの卒中を有する患者から区別することが可能であることを示す。ＴＩＡを有する患者の識別は有益である。これは，これらの患者においては，将来の卒中のリスクが増加しているためである。
Figure 2005522669
実施例４． クモ膜下出血を示す患者における脳血管痙攣のマーカー
４５名の患者，すなわち，動脈瘤性クモ膜下出血（ＳＡＨ）で来院した３８名，および選択的動脈瘤クリッピングで来院した７名の対照患者をこの研究に含めた。ＳＡＨを有するすべての患者において，来院時およびその後１２日間または血管痙攣の開始まで毎日連続して，静脈穿刺により静脈血液サンプルを採取した。脳血管痙攣の発現は，ＳＡＨの４−１２日後の局所性神経欠損の開始または＞１９０ｃｍ／ｓの経頭蓋ドップラー（ＴＣＤ）速度として定義した。選択的動脈瘤クリッピングを受ける患者においては，手術後中央値で１３日間の経過中，患者１名あたり３±１回の静脈血液サンプルを採取した。採取した血液は遠心分離し（１０，０００ｇ），得られた上清は直ちに，分析が完了するまで−７０℃で凍結した。ｖＷＦ，ＶＥＧＦ，およびＭＭＰ−９の測定は，免疫測定酵素イムノアッセイを用いて行った。
前血管痙攣コホートにおいて血漿ｖＷＦ，ＶＥＧＦ，およびＭＭＰ−９の変化が観察された場合，これが症状発現前の虚血の結果であるか，または脳血管痙攣の発現に特異的であるかを判定するために，これらのマーカーを塞栓性または血栓性の局所性脳虚血の設定でも測定した。症候性局所性虚血の開始から２４時間以内に来院した一連の５９名の患者から，来院時に１回静脈穿刺により静脈血液サンプルを採取した。症候性局所性虚血と認められた４２名の患者は，後にＭＲＩの証拠により脳梗塞が示された。脳梗塞の放射線医学的証拠を示さなかった１７名の患者は，症候の消散を経験し，これは一過性虚血性発作として分類し，したがって分析には含めなかった。
統計学的分析
３つのコホートを，非血管痙攣（ＳＡＨを有すると認められたが脳血管痙攣を発現しなかった患者），前血管痙攣（ＳＡＨを有すると認められ，後に脳血管痙攣を発現した患者），および局所性虚血（症候性局所性虚血と認められ，後にＭＲＩで脳梗塞であると規定された患者）として分類した。コホート間で平均ピーク血漿ｖＷＦ，ＶＥＧＦ，およびＭＭＰ−９のレベルを２元配置ＡＮＯＶＡにより比較した。アルファ誤差は０．０５に設定した。分布が尖度，有意な非対称性を有する場合，または分散が有意に異なる場合には，群間比較のためのノンパラメトリック・マン・ホィットニー・Ｕ統計学を用いた。フィッシャー等級と血漿マーカーとの間の相関はスパーマン・ランク相関係数により評価した。患者の年齢，性別，人種，ハント・ヘス（Ｈｕｎｔ ａｎｄ Ｈｅｓｓ），およびフィッシャー等級について調節したロジスティック回帰分析を用いて，血漿マーカーの閾値あたりの血管痙攣の発現のオッズ比を計算した。
結果
２８名の患者が来院し，ＳＡＨ後の１±１日に第１回の血液サンプルを採取した。これらのうち，２２名（５７％）はＳＡＨ後中央値７日間（範囲，４−１１日間）で脳血管痙攣を発現した。１８名（４７％）は局所性神経欠損を発現し，４名（１０％）は血管痙攣のみのＴＣＤの証拠を示した。ＳＡＨ，非血管痙攣コホートの３名の患者はフィッシャー等級１であり，コホート間の血漿マーカー比較には含めなかった。非血管痙攣および前血管痙攣コホートについての患者の人口統計学，臨床的特徴，およびフィッシャー等級は表９に示される。
Figure 2005522669
非血管痙攣コホートにおいては，平均ピーク血漿ｖＷＦ（ｐ＝０．９７４），ＶＥＧＦ（ｐ＝０．３５７），およびＭＭＰ−９（ｐ＝０．７６３）は対照と比較して変化がなかった（表１０）。血漿ｖＷＦ，ＶＥＧＦ，およびＭＭＰ−９は，前血管痙攣において非血管痙攣コホートより増加していた（表１０）．フィッシャー等級の増加は，より高いピーク血漿ｖＷＦ（ｐ＜０．０５），ＶＥＧＦ（ｐ＜０．０１）およびＭＭＰ−９（ｐ＜０．０５）と相関していた。
さらに，２０名の男性および２２名の女性（年齢：５９±１５歳）は，２４時間以内の症候性局所性虚血を示し，平均ＮＩＨ卒中スケールスコアは６．７±６．６であった。局所性虚血コホートにおいては，平均ピーク血漿ｖＷＦ（ｐ＝０．８６４），ＶＥＧＦ（ｐ＝０．４６９），およびＭＭＰ−９（ｐ＝０．６２３）は対照に対して変化がなかった（表１０）。血漿ｖＷＦ，ＶＥＧＦ，およびＭＭＰ−９は，局所性虚血コホートに対して前血管痙攣において顕著に増加していた（表１０）。
Figure 2005522669
ＳＡＨの後，上昇した血漿ｖＷＦ，ＶＥＧＦ，およびＭＭＰ−９は，独立して，後に起こる血管痙攣のオッズを１７から２５倍増加させ，ポジティブ予測値は７５％−９２％の範囲であった（表１１）。
Figure 2005522669
実施例５． 卒中を診断するための例示的パネル
以下の表は，卒中を診断するための本発明の方法の使用を示す。“被検物質パネル”は，卒中患者からおよび卒中以外のドナーから得た試験サンプルを分析するために用いられるマーカーの組み合わせを表す（ＮＨＤは正常健康ドナーを示す；ＮＳＤは非特異的疾病ドナーを示す）。時間（示されている場合）は，症状の開始とサンプル採取の間の間隔を表す。種々のカットオフ値で，マーカーの特定のパネルの感度対パネルの１−（特異性）についてＲＯＣ曲線を計算し，曲線の下の面積を決定した。９２．５％の特異性（Ｓｐｅｃ）で診断の感度（Ｓｅｎｓ）を決定し，また，９２．５％の感度で診断の特異性を決定した。
Figure 2005522669
Figure 2005522669
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Figure 2005522669
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実施例６． 虚血性卒中と出血性卒中とを区別するための例示的パネル
以下の表は，異なるタイプの卒中，この例では虚血性卒中と出血性卒中とを区別するための本発明の方法の使用を示す。“被検物質パネル”とは，虚血性卒中患者および出血性卒中患者から得た試験サンプルを分析するために用いられたマーカーの組み合わせを表す。診断の感度（Ｓｅｎｓ）は９２．５％の特異性（Ｓｐｅｃ）で決定し，また９２．５％の感度で診断の特異性を決定した。
Figure 2005522669
当業者が本発明を製造および使用することができるように本発明を詳細に記載し例示してきたが，発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更，改変および改良をしうることが明らかであろう。
当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される方法および組成物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，個々の刊行物が特定的にかつ個別に本明細書の一部としてここに引用すると示されているのと同じ程度に，本明細書の一部としてここに引用される。
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (44)

  1. 被験者において卒中の診断を決定する方法であって，
    被験者から得た試験サンプルを，脳損傷の１またはそれ以上の特異的マーカーおよび脳損傷の１またはそれ以上の非特異的マーカーの存在または量について分析し；そして
    脳損傷についての前記１またはそれ以上の特異的マーカーおよび脳損傷についての前記１またはそれ以上の非特異的マーカーの存在または量を，前記被験者が卒中を経験した確率と相関させる，
    ことを含む方法。
  2. 前記脳損傷の特異的マーカーが，アデニレートキナーゼ，脳由来神経栄養因子，カルビンジン−Ｄ，クレアチンキナーゼ−ＢＢ，グリア線維状酸性蛋白質，乳酸デヒドロゲナーゼ，ミエリン塩基性蛋白質，神経細胞接着分子，ニューロン特異的エノラーゼ，ニューロトロフィン−３，蛋白質キナーゼＣの１またはそれ以上のアイソフォーム，プロテオリピド蛋白質，Ｓ−１００β，脳由来神経栄養因子，およびトロンボモジュリンからなる群より選択される，請求項１記載の方法。
  3. 前記脳損傷の非特異的マーカーが，急性期反応物質，Ａ型ナトリウム利尿ペプチド，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド，アドレノメジュリン，エンドセリン−１，エンドセリン−２，エンドセリン−３，β−トロンボグロブリン，心トロポニンＩ，カスパーゼ−３，クレアチンキナーゼ−ＭＢ，Ｄ−ダイマー，フィブリノペプチドＡ，ヘッドアクチベータ，ヘモグロビンα2鎖，インターロイキン−８，ミオグロビン，プラスミン−α−２−抗プラスミン複合体，血小板第４因子，プロトロンビンフラグメント１＋２，トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体，組織因子，血管内皮増殖因子および１またはそれ以上の型のフォン・ビルブラント因子からなる群より選択される，請求項１記載の方法。
  4. 前記急性期反応物質が，Ｃ−反応性蛋白質，Ｅ−セレクチン，インスリン様増殖因子−１，細胞間接着分子−１，インターロイキン−１β，インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト，インターロイキン−６，マトリクスメタロプロテアーゼ−３，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，単球走化性蛋白質−１，トランスフォーミング増殖因子β，腫瘍壊死因子α，および血管細胞接着分子からなる群より選択される，請求項３記載の方法。
  5. 前記特異的および非特異的マーカーが，カスパーゼ−３，グリア線維状酸性蛋白質およびマトリクスメタロプロテアーゼ−９を含む，請求項１記載の方法。
  6. 前記特異的および非特異的マーカーが，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，インターロイキン−６，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，Ｓ−１００β，トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体，および１またはそれ以上の型のフォン・ビルブラント因子を含む，請求項１記載の方法。
  7. 前記特異的および非特異的マーカーが，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，インターロイキン−６，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，Ｓ−１００β，トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体，および１またはそれ以上の型のフォン・ビルブラント因子のサブセットを含む，請求項１記載の方法。
  8. 前記特異的および非特異的マーカーが，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，インターロイキン−６，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，Ｓ−１００β，トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体，およびフォン・ビルブラント因子のＡ１およびインテグリンドメインを含む，請求項１記載の方法。
  9. 前記特異的および非特異的マーカーが，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，インターロイキン−６，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，Ｓ−１００β，トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体，およびフォン・ビルブラント因子のＡ１およびインテグリンドメインのサブセットを含む，請求項１記載の方法。
  10. 前記特異的および非特異的マーカーが，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，Ｓ−１００β，および１またはそれ以上の型のフォン・ビルブラント因子を含む，請求項１記載の方法。
  11. 前記特異的および非特異的マーカーが，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，Ｓ−１００β，およびフォン・ビルブラント因子のＡ１およびインテグリンドメインを含む，請求項１記載の方法。
  12. 前記特異的および非特異的マーカーが，脳由来神経栄養因子，カスパーゼ−３，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，神経細胞接着分子，血管内皮増殖因子およびフォン・ビルブラント因子のＡ１ドメインを含む，請求項１記載の方法。
  13. 前記特異的および非特異的マーカーが，脳由来神経栄養因子，カスパーゼ−３，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，神経細胞接着分子，Ｓ−１００βおよびフォン・ビルブラント因子のＡ１ドメインを含む，請求項１記載の方法。
  14. 前記特異的および非特異的マーカーが，脳由来神経栄養因子，カスパーゼ−３，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，単球走化性蛋白質−１，神経細胞接着分子，およびフォン・ビルブラント因子のＡ１ドメインを含む，請求項１記載の方法。
  15. 前記特異的および非特異的マーカーが，脳由来神経栄養因子，カスパーゼ−３，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，神経細胞接着分子，血管内皮増殖因子，およびフォン・ビルブラント因子のインテグリンドメインを含む，請求項１記載の方法。
  16. 前記特異的および非特異的マーカーが，脳由来神経栄養因子，グリア線維状酸性蛋白質，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，単球走化性蛋白質−１，Ｓ−１００β，およびフォン・ビルブラント因子のインテグリンドメインを含む，請求項１記載の方法。
  17. 前記特異的および非特異的マーカーが，脳由来神経栄養因子，カスパーゼ−３，グリア線維状酸性蛋白質，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，Ｓ−１００β，およびフォン・ビルブラント因子のＡ１ドメインを含む，請求項１記載の方法。
  18. 前記特異的および非特異的マーカーが，脳由来神経栄養因子，グリア線維状酸性蛋白質，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，神経細胞接着分子，Ｓ−１００β，およびフォン・ビルブラント因子のＡ１ドメインを含む，請求項１記載の方法。
  19. 前記特異的および非特異的マーカーが，脳由来神経栄養因子，カスパーゼ−３，グリア線維状酸性蛋白質，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，神経細胞接着分子，およびＳ−１００βを含む，請求項１記載の方法。
  20. 前記特異的および非特異的マーカーが，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，カスパーゼ−３，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，単球走化性蛋白質−１，神経細胞接着分子，Ｓ−１００β，およびフォン・ビルブラント因子のインテグリンドメインを含む，請求項１記載の方法。
  21. 前記特異的および非特異的マーカーが，Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド，カスパーゼ−３，グリア線維状酸性蛋白質，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，単球走化性蛋白質−１，神経細胞接着分子，Ｓ−１００β，およびフォン・ビルブラント因子のＡ１ドメインを含む，請求項１記載の方法。
  22. 前記特異的および非特異的マーカーのレベルを，正常な個体における前記特異的および非特異的マーカーのレベルと比較することをさらに含み，患者から得た前記試験サンプルにおける正常な個体と比較した前記レベルの変化が，卒中の兆候を経験した患者を示す，請求項１記載の方法。
  23. 患者から得た試験サンプルにおける，正常な個体と比較した前記特異的および非特異的マーカーの少なくとも２つのレベルの上昇が，卒中の兆候を経験した患者を示す，請求項２１記載の方法。
  24. 被験者が卒中のリスクを有するか否かを識別する方法であって，
    被験者から得た試験サンプルを，脳損傷の１またはそれ以上の特異的マーカー，および脳損傷の１またはそれ以上の非特異的マーカーの存在または量について分析し；そして
    脳損傷の前記１またはそれ以上の特異的マーカーおよび脳損傷の前記１またはそれ以上の非特異的マーカーの存在または量を，前記被験者が卒中のリスクを有する確率と相関させる，
    ことを含む方法。
  25. 前記試験サンプルが，血液，血清，血漿，脳脊髄液，尿および唾液からなる群より選択される，請求項１記載の方法。
  26. 前記試験サンプルが分析の前に分画される，請求項１記載の方法。
  27. 前記試験サンプルが，イムノアッセイを用いて分析される，請求項１記載の方法。
  28. クモ膜下出血および脳内出血を含む出血性卒中を区別することをさらに含む，請求項１記載の方法。
  29. 出血性卒中を診断する方法である，請求項１記載の方法。
  30. クモ膜下出血を診断する方法である，請求項１記載の方法。
  31. 脳内出血を診断する方法である，請求項１記載の方法。
  32. 被験者において一過性虚血性発作の診断を決定する方法であって，
    被験者から得た試験サンプルを，脳損傷の１またはそれ以上の特異的マーカーおよび脳損傷の１またはそれ以上の非特異的マーカーの存在または量について分析し；そして
    脳損傷の前記１またはそれ以上の特異的マーカーおよび脳損傷の前記１またはそれ以上の非特異的マーカーの存在または量を，前記被験者が一過性虚血性発作を経験した確率と相関させる，
    ことを含む方法。
  33. 患者が脳血管痙攣のリスクを有するか否かを識別する方法であって，クモ膜下出血と診断された患者からの試験サンプル中の，後に起こる脳血管痙攣を予測するマーカーの量を，前記マーカーの予測レベルと比較し，前記マーカーは，フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），およびマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）からなる群より選択され，ここで，前記患者は前記予測レベルと等しいかまたは大きいレベルの前記マーカーにより脳血管痙攣のリスクを有すると識別されることを特徴とする方法。
  34. 前記マーカーがｖＷＦであり，前記予測レベルが５２００ｎｇ／ｍＬより高い，請求項３３記載の方法。
  35. 前記マーカーがＶＥＧＦであり，前記予測レベルが０．０６ｎｇ／ｍＬより高い，請求項３３記載の方法。
  36. 前記マーカーがＭＭＰ−９であり，前記予測レベルが５００ｎｇ／ｍＬより高い，請求項３３記載の方法。
  37. 後に起こる脳血管痙攣を予測する２つのマーカーの量を前記マーカーのそれぞれの予測レベルと比較し，ここで，前記患者は各前記マーカーの前記予測レベルと等しいかまたは大きいレベルの各前記マーカーにより脳血管痙攣のリスクを有すると識別される，請求項３３記載の方法。
  38. 後に起こる脳血管痙攣を予測する３つのマーカーの量を前記マーカーのそれぞれの予測レベルと比較し，ここで，前記患者は，各前記マーカーの前記予測レベルと等しいかまたは大きいレベルの各前記マーカーにより脳血管痙攣のリスクを有すると識別される，請求項３３記載の方法。
  39. 被験者における虚血性卒中を出血性卒中から区別する方法であって，
    被験者から得た試験サンプルを，脳損傷の１またはそれ以上の特異的マーカーおよび脳損傷の１またはそれ以上の非特異的マーカーの存在または量について分析し；そして
    脳損傷の前記１またはそれ以上の特異的マーカーおよび脳損傷の前記１またはそれ以上の非特異的マーカーの存在または量を，前記被験者が出血性卒中ではなく虚血性卒中を有する確率と相関させる，
    ことを含む方法。
  40. 前記特異的および非特異的マーカーが，ｃ−反応性蛋白質，クレアチンキナーゼ−ＢＢ，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，ニューロトロフィン−３，血管内皮増殖因子，および１またはそれ以上の型のフォン・ビルブラント因子を含む，請求項３９記載の方法。
  41. 前記特異的および非特異的マーカーが，ｃ−反応性蛋白質，クレアチンキナーゼ−ＢＢ，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，単球走化性蛋白質−１，神経細胞接着分子，および血管内皮増殖因子を含む，請求項３９記載の方法。
  42. 前記特異的および非特異的マーカーが，ｃ−反応性蛋白質，クレアチンキナーゼ−ＢＢ，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，単球走化性蛋白質−１，ニューロトロフィン−３，および血管内皮増殖因子を含む，請求項３９記載の方法。
  43. 前記特異的および非特異的マーカーが，ｃ−反応性蛋白質，カルビンジン−Ｄ，クレアチンキナーゼ−ＢＢ，Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド，グリア線維状酸性蛋白質，インターロイキン−６，インターロイキン−８，マトリクスメタロプロテアーゼ−９，単球走化性蛋白質−１，ミエリン塩基性蛋白質，プロテオリピド蛋白質，Ｓ−１００β，トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体，組織因子，血管内皮増殖因子，および１またはそれ以上の型のフォン・ビルブラント因子を含む，請求項３９記載の方法。
  44. 卒中を診断または予防するためのキットであって，
    脳損傷の１またはそれ以上の特異的マーカーの存在または量を決定するための１またはそれ以上の試薬；
    脳損傷の１またはそれ以上の非特異的マーカーを決定するための１またはそれ以上の試薬；および
    アッセイを実施して前記決定を行うための指針，
    を含むキット。
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