KR101110758B1

KR101110758B1 - 뇌졸중 표적용 펩티드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101110758B1
Application number: KR1020080051555A
Authority: KR
Inventors: 이병헌; 김인산; 한형수; 유정수
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2008-06-02
Filing date: 2008-06-02
Publication date: 2012-02-15
Also published as: WO2009148252A2; WO2009148252A3; US20110150764A1; KR20090125440A; WO2009148252A9; US8748398B2

Abstract

본 발명은 뇌졸중 표적용 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 표적 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 펩티드는 생체 내에서 뇌졸중 세포에 특이적으로 결합하는 특징이 있어, 뇌졸중 진단 마커, 키트, 뇌졸중을 표적으로 하는 약물 전달용 조성물, 약학적 조성물 및 뇌졸중 영상화용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

뇌졸중, 세포사멸, 표적, 펩티드, 분자영상, 진단, 약물전달

Description

뇌졸중 표적용 펩티드 및 이의 용도{Stroke-targeting peptides and uses thereof}

본 발명은 뇌졸중 표적용 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 표적 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.

뇌졸중은 크게 2가지로 나누는데, 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직의 허혈상태로 발생하는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으키는 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke)으로 구분하고 있으며, 허혈성 뇌졸중은 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지하고 환자의 약 3분의 1은 사망하는 심각한 질환이라고 할 수 있다. 특히 상기 허혈성 뇌졸중은 동맥 혈액 유입의 폐쇄에 의해 유발되는 혈액의 불충분한 뇌 순환으로부터 발생한다. 통상적으로, 적절한 뇌 혈액 공급은 뇌 내부의 동맥 체계에 의해 보장된다. 그러나 염증 및 죽상동맥경화증을 포함하는 다양한 질환은 혈전, 즉, 혈관에 생성되는 혈괴를 발생시킬 수 있다. 혈전은 동맥 혈류를 방해하여, 뇌 허혈 및 후속적인 신경 증상을 일으킬 수 있다. 허혈성 뇌졸중은 또한 심장에서 형성된 혈전의 조각 인 색전이 혈관을 차단함으로써 발생될 수 있고, 부적절한 뇌 혈류와 함께 감소된 관류 압력 또는 증가된 혈액 점성을 유발한다.

상기 뇌졸중에 이용 가능한 두 가지 치료법이 있다. 하나는 혈류를 증가시킴으로써 동맥에서의 산소 및 글로코오스의 결핍을 완화시키는 것이고, 다른 하나는 대뇌 허혈 및 흥분독성에 의해 유도되는 신경 파괴를 차단하는 것을 통해 뉴런을 보호하는 것이다. 임상적으로 이용되는 뉴런 보호제는 칼슘 채널 차단체, 글루타메이트 수용체의 일종인 NMDA 수용체 길항제 등이 있다. 그러나 상기 치료방법은 효능이 낮은 반면에 부작용 발생률이 높아 상기 치료제의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 있는 방법의 개발이 절실하게 필요한 상황이다.

한편, 상기와 같은 뇌졸중을 진단하기 위한 방법은 예방 진단법과 발병 후 진단법으로 구분되어지는데, 상기 예방 진단법으로는 혈액 검사법이 대표적이며, 상기 발병 후 진단법으로는 혈액검사법, 경두개 초음파검사법, 컴퓨터 단층촬영법, 뇌자기 공명 영상법, 뇌혈관 촬영법 등이 있다. 상기 종래의 뇌졸중 예방 진단법으로 아직까지 공인된 확실한 혈액검사법이 없고, 발병 후 진단법의 경우 여러 가지 방법이 개발되어 임상에서 활용되고 있으나, 대부분 손상부위의 확인이 가능할 뿐 손상부위가 다시 회복할 가능성이 있는 반음영부(penumbra)인지 아닌지 판정하여 뇌졸중 치료의 예후를 예측할 수 있는 진단법은 존재하지 않아 치료방침을 결정하 는데 제약이 되고 있다.

한편, 약물을 특정 조직으로 선택적으로 전달하는 약물전달체계 또는 표적 치료는 많은 관심을 받아온 기술이다. 왜냐하면 동일 양의 치료제를 사용하더라도 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 있기 때문이다. 또한 유전자 치료에 적용할 경우 바이러스를 특정 조직에 선택적으로 전달시킴으로써 치료 효율을 올리고 심각한 부작용을 줄일 수 있다. 이를 위해 지금까지는 주로 특정 조직에 특이한 항원 및 이를 표적하는 항체를 개발하여 왔다. 그러나 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제가 존재한다. 반면 펩티드의 경우는 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내 침투가 용이한 것이 장점이다. 따라서 표적 펩티드를 기존의 치료제와 연결하게 되면 특정 조직에 선택적으로 약물을 전달하는 지능형 약물전달체로 활용될 수 있으므로, 표적 펩티드의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 뇌졸중 치료 및 진단에 사용될 수 있는 뇌졸중 표적 펩티드를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 파지 펩티드 디스플레이 기술을 이용하여 뇌졸중 조직에 특이적인 펩티드를 탐색하고, 상기 펩티드가 뇌졸중의 진단 마커 및 지능형 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 표적 펩티드를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 암호화하는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 포함하는 뇌졸중 진단용 마커를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 포함하는 뇌졸중 진단용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 포함하는 뇌졸중에 특이적인 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 영상화용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 표적 펩티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩티드를 암호화하는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩티드를 포함하는 뇌졸중 진단용 마커를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩티드를 포함하는 뇌졸중 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩티드를 포함하는 뇌졸중에 특이적인 약물 전달용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 영상화용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 용어 “뇌졸중”은 뇌의 혈액순환장애에 의하여 일어나는 급격한 의식장애와 운동마비를 수반하는 증후군으로, 상기 뇌졸중의 발생 부위는 크게 비가역 손상부위인 음영부(umbra)와 이를 둘러싸고 있는 회복 가능성이 있는 부위인 반음영부(penumbra)로 나뉘며, 본 발명에서 특별한 언급이 없는 한 상기 뇌졸중은 음영부(umbra)와 반음영부(penumbra)의 손상을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어 “진단”은 질병 발생의 예측, 질병 발생 위험도 및 치료 예후를 판단하거나 결정하는데 사용되는 모든 유형의 분석을 말한다.

본 발명에서 용어 “개체(subject)”는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물을 의미한다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다.

본 발명의 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 상기 본 발명의 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 뇌졸중 조직에 특이적으로 결합하는 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에서는 뇌의 한쪽 반구에 국소적으로 뇌졸중이 유도된 동물모델을 제조하여(<실험방법 1> 참조) 파지-디스플레이드 펩티드 라이브러리 방법(<실험방법 2> 참조)을 수행한 결과, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 펩티드가 뇌졸중 조직에 결합하거나 유도한다는 것을 확인하였다(<실험결과 1> 및 표 1 참조).

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 펩티드 중 뇌졸중 조직으로 유도하는 빈도가 가장 높은 서열번호 1의 아미노산 서열(CLEVSRKNC)로 표시되는 펩티드를 선발하고 상기 펩티드가 표면에 디스플레이된 파지를 뇌졸중이 유도된 동물모델에 투여한 결과, 상기 파지는 뇌졸중 조직에 특이적으로 결합한다는 것을 확인하였다(<실험결과 2> 및 도 1 참조).

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 파지의 특이적 유도가 파지에 디스플레이된 펩티드에 의한 것인지 확인하기 위하여 펩티드를 합성한 후 투여한 결과, 본 발명의 펩티드가 뇌졸중 조직에 특이적으로 결합하고 특히 반음영부의 뇌졸중 세포에 결합하는 것을 확인하였다. 또한 비장, 간 및 폐와 같은 대조군 기관에는 결합하지 않음을 확인하였다. 또한 TUNEL 염색을 이용한 세포사멸 분석을 수행한 결과, 상기 펩티드가 뇌졸중 조직에서의 세포사멸을 검출할 수 있음을 확인하였으며, 특히 뇌졸중 부위 중 반음영부에 특이적으로 결합함을 확인하였다(<실험결과 3> 및 도 2 참조).

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 펩티드가 뇌졸중 조직에서 결합하는 세포 타입을 분석하기 위하여 세포 타입에 특이적인 항체를 사용한 면역 형광 염색법을 수행한 결과, 본 발명의 펩티드는 뇌졸중 조직에서 특이적으로 β-튜블린-양성 뉴런 세포와 동일 장소에 배치됨을 확인하였다(<실험결과 4> 및 도 3 참조).

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 펩티드를 방사성 동위원소 표지하여 오토라디오그램을 수행한 결과, 뇌졸중 조직에서 특이적으로 본 발명의 펩티드가 관찰됨을 확인하였다(<실험결과 5> 및 도 4 참조). 특히 방사선의 흡수가 뇌졸중이 유발된 후 1일째 증가하고 3일째 피크에 도달하여 7일째 감소된 사실은 종래 뇌졸중에 의한 세포사멸이 발병 후 1 내지 3일째 가장 극심하다는 연구 결과(U. Dirnagl, C. Iadecola, M.A. Moskowitz; Pathobiology of ischaemic stroke : an integrated view , Trends Neurosci . 22(9): 391-397, 1999)와 일치하였다.

따라서 본 발명의 펩티드는 뇌졸중 조직에 특이적으로 결합하여 뇌졸중의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 펩티드는 생체 내에 투여한 후 15분도 지나지 않아 뇌졸중 조직으로 유도되므로 신속한 뇌졸중 진단에 유용하게 사용될 수 있다(<실험 결과 3> 참조). 상기 뇌졸중은 이에 한정되지 않지만 허혈성 뇌졸중인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 펩티드는 뇌졸중 부위 중 반음영부에 특이적으로 결합하므로 반음영부를 검출 및 정량하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). 또한 본 발명의 펩티드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩티드'라 함은 본 발명에 따른 펩티드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 본 발명의 펩티드를 암호화하는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루 어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 표적 펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 통상적인 발현에 의하여 본 발명의 펩티드를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

따라서 본 발명의 마커는 본 발명의 펩티드를 포함하여 뇌졸중을 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 뇌졸중은 이에 한정되지 않지만 허혈성 뇌졸중인 것이 바람직하다.

본 발명의 펩티드를 이용한 뇌졸중 진단은 바람직하게는 뇌졸중으로 의심이 되는 개체의 뇌졸중 세포를 검출함으로써 용이하게 수행할 수 있다. 뇌졸중으로 의심이 되는 개체로부터 생검(biopsy)에 의해 직접 얻은 뇌 조직 또는 뇌 세포에 본 발명의 펩티드를 반응시켜 이들의 결합을 검출함으로써 뇌졸중을 진단할 수도 있다. 보다 정확한 진단을 위해서는 정상 개체의 뇌 세포에 대한 본 발명의 펩티드의 결합을 대조군으로서 함께 측정할 수 있다. 뇌졸중의 진단은 뇌졸중 세포와 본 발명의 펩티드의 결합을 나타낼 수 있는 시그널, 예컨대 형광 퀀칭(quenching)을 검출함으로써 평가될 수 있다. 이와 같이 뇌졸중을 표적하는 본 발명의 펩티드를 검출 가능한 표지와 결합시켜 뇌 세포와 반응시키고, 뇌졸중 세포와 본 발명의 펩티드의 결합을 나타내는 시그널을 검출함으로써 뇌졸중 세포를 찾아내는 것은 종래 뇌졸중의 진단에 사용되는 염색법에 비해 더욱 정확하다.

이에 더하여, 본 발명의 펩티드를 이용하여 생체 내에서도 뇌졸중을 진단할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 펩티드를 형광물질로 표지한 후, 이를 뇌 내부에 분사하고 뇌 세포와 반응시켜 생체내 형광 검출이 가능한 영상장비를 이용함으로써 뇌졸중 세포를 찾아낼 수 있다.

또한 본 발명의 키트는 본 발명의 펩티드를 포함하여 뇌졸중을 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 뇌졸중은 이에 한정되지 않지만 허혈성 뇌졸중인 것이 바람직하다. 상기 진단용 키트에 포함되는 본 발명의 펩티드는 상기 기재한 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 또는 뇌졸중 세포에 결합한 본 발명의 펩티드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 펩티드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출 가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 125I, 32P, 35S), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC), 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 크로모포어(chromophore)일 수 있다. 유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체, 에피토프, 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩티드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩티드에 추가로 수행될 수도 있다. 보다 용이하게 뇌졸중의 진단 및 분자 영상이 가능할 것이다.

만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법으로 뇌졸중을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩티드를 뇌 세포와 반응시키고 형광현미경 하에서 펩티드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 뇌졸중으로 진단된다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 뇌졸중 세포를 검출하여 뇌졸중을 진단할 수 있다.

본 발명의 키트에는 본 발명의 펩티드 이외에 상기 펩티드와 뇌졸중 세포의 결합 반응을 위한 적당한 완충용액 또는 배지 및 대조군 세포(정상 뇌세포)를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 펩티드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 펩티드의 표지를 위한 검출가능한 표지가 추가로 키트에 포함될 수 있다. 양자택일적으로, 본 발명의 펩티드에 대한 항체, 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등이 상기 키트에 추가로 포함될 수도 있다. 본 발명의 펩티드에 대한 항체는 상기 기재한 바와 같이 당업계에 공지된 통상적인 항체의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.

또한 본 발명의 펩티드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 뇌 세포를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 뇌졸중 세포와 펩티드의 결합을 관찰하여 뇌졸중을 진단할 수 있다.

상기 방법들에서 이용될 수 있는 실험과정, 시약 및 반응 조건은 종래 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 것들을 이용할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 일이다.

또한 본 발명의 약물 전달용 조성물은 본 발명의 펩티드를 포함하는 뇌졸중에 특이적인 약물 전달용 조성물인 것을 특징으로 한다. 상기 약물은 뇌졸중 치료제를 말하며, 상기 뇌졸중은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 허혈성 뇌졸중을 말한다.

본 발명의 펩티드는 뇌졸중 치료제와 같은 약물을 뇌졸중 조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 종래 뇌졸중 치료제와 연결하여 뇌졸중 치료에 이용한다면 본 발명의 펩티드에 의해 뇌졸중 치료제가 뇌졸중 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 뇌졸중 치료제의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.

본 발명의 펩티드에 연결될 수 있는 뇌졸중 치료제는 종래 뇌졸중의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 뇌졸중 치료제는 바람직하게는 칼슘 채널 차단체, 글루타메이트, NMDA 수용체 길항제, 항산화제, 세포사멸(apoptosis) 억제제 및 미노사이클린(minocycline) 계열의 항생제로 이루어진 군에서 선택된 것을 말한다. 상기 치료제와 본 발명의 펩티드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩티드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 함유하여 뇌졸중 치료제와 같은 약물을 뇌졸중 조직에 선택적으로 전달함으로써 뇌졸중의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 약물은 바람직하게는 앞서 기술한 뇌졸중 치료제를 말하며, 상기 뇌졸중은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 허혈성 뇌졸중을 말한다.

또한 본 발명의 뇌졸중 영상화용 조성물은 본 발명의 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 뇌졸중 영상화용 조성물은 본 발명의 펩티드를 함유하여 뇌졸중을 영상화하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 펩티드가 뇌졸중 부위 중 상기 반음영부에 특이적으로 결합함을 확인하였다(<실험결과 3> 참조).

특히 뇌졸중 부위에 음영부에 비하여 반음영부의 비율이 높을수록 뇌졸중으로 인한 손상 부위가 다시 회복할 가능성이 커져 치료 예후가 좋은 것으로 알려져 있다(Ford GA., Br. J. Pharmacol. 153(Suppl 1):S112-9, 2008; Segura T. et al., Expert. Opin . Pharmacother. 9:1071-1085, 2008). 따라서 본 발명의 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 영상화용 조성물은 반음영부를 영상화하거나 검출 및 정량하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 종래 음영부의 영상화 기술을 이용하여 반음영부와 음영부의 상대적 크기 및 정도를 측정함으로써 약물 치료를 통한 예후를 예측하는데도 유용하게 사용될 수 있다.

상기 펩티드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출 가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가 교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 자기공명영상(MRI)에 사용되고 있는 초상자성입자(예: iron oxide) 및 상자성입자, 양전자 방출 단층촬영(PET)에 사용되고 있는 방사성 동위원소(예: ¹²⁴I, ¹⁸F,¹¹C, ⁶⁴Cu), 감마카메라에 사용되고 있는 방사성 동위원소(예: ⁹⁹ ^mTc, ¹³¹I, ¹²⁵I) 및 기타 방사성 동위원소(예, ³²P, ³⁵S), 발광물질 또는 형광물질(예: Cy7.5, Cy5.5, FITC, RITC), 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 크로모포어(chromophore)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 한다. 상기 표지는 본 발명의 펩티드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩티드에 추가로 수행될 수도 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩티드의 양은 결합되는 뇌졸중 치료제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 치료를 위해 투여되는 양의 뇌졸중 치료제를 뇌졸중 조직에 충분히 전달할 수 있는 양일 수 있다. 그러나 약물은 그 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩티드를 뇌졸중 치료제와 결합시켜 뇌졸중을 치료하기 위한 용도에 따른 본 발명의 펩티드의 적절한 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 조성물에는 상기 펩티드의 안정성을 유지/보존하기 위한 적당한 완충용액이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드를 포함하는 조성물은 본 발명에 의한 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 예컨대, 본 발명의 펩티드는 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 위장관 내 소화효소에 의한 분해를 방지하기 위하여 본 발명의 펩티드를 D 형 아미노산으로 구성하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비경구 투여로는 피하 주사, 근육내 주사, 정맥 주사, 동맥 주사 등이 있는데, 바람직하게는 정맥 주사 또는 동맥 주사일 수 있다.

이외에도 본 발명의 조성물에는 일반적인 약학적 조성물에 통상적으로 첨가되는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 포함될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 사람이나 동물에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 주사제의 경우에는, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩티드를 포함하는 약물 전달용 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 약물 투여 방법으로 투여될 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 뇌졸중의 진단에 유용하게 사용 될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 이용한 뇌졸중의 진단은 종래 뇌졸중 진단법에 비하여 더욱 용이하고 정확하게 뇌졸중을 진단할 수 있다. 또한 본 발명에 의한 뇌졸중의 진단을 종래 뇌졸중 진단법과 병행하는 경우 뇌졸중의 조기 진단 및 재발의 조기 발견에 효과적이다. 또한 본 발명의 펩티드는 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 펩티드를 뇌졸중 치료제와 같은 약물을 연결하여 뇌졸중의 치료에 사용하는 경우 상기 약물을 뇌졸중 조직에 선택적으로 전달하여 약의 효력을 높이고 부작용을 줄일 수 있게 하는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

<실험방법>

1. 국소 뇌허혈(focal cerebral ischemia)의 설치동물 모델

모든 동물실험은 본 발명자의 소속 기관 실험윤리위원회의 지침에 따라 수행되었다. 290 내지 320g 몸무게의 성장한 수컷 스프래그-돌리(Sprague-Dawle) 랫트(Hyochang Science, 대전, 한국)를 외과수술과정 동안 80% N₂O/20% O₂에서 엔플루란의 흡입으로 마취시켰다. 먼저 좌측 경동맥과 그 분지를 분리시켰다. 끝이 둥근 3-0 나일론 봉합사의 코팅되지 않은 30mm 단편을 상기 경동맥의 기부에 삽입하여 내경동맥 분기점으로부터 약 20mm의 내경동맥 내부로 나아가게 하여 중대뇌동맥 (MCA)의 입구를 막고 2시간 동안 방치하였다. 허혈기간이 끝날 무렵, 상기 봉합사를 제거하였다. 이후, 상기 일시적인 중대뇌동맥(MCA) 폐색 동물을 다시 관류하여 이후 상세한 분석을 수행하였다.

2. 파지 라이브러리( phage library )의 생체내 스크리닝

CX7C(C, 시스테인; X, 무작위 펩티드)를 나타내는 T7 415-1b 파지 벡터를 기초로 하는 파지 펩티드 라이브러리가 제조자의 지침(Novagen, Madison, WI, 미국)에 따라 제조되었다. 상기 라이브러리는 약 5x10⁸의 PFU(plaque forming unit)의 다양성을 가지고 있다.

상기 중대뇌동맥(MCA) 폐색의 재관류 후 2시간이 지나 상기 파지 라이브러리(500㎕ 배양 배지에 5x10¹¹ pfu)를 랫트의 꼬리 정맥을 통하여 주입하여 2시간 동안 순환되도록 하였다. 순환시기가 끝나고 랫트는 마취상태에서 50㎖의 PBS (phosphate-buffered saline)로 심장을 통하여 관류하였다. 뇌를 분리하고 동측성(손상된)과 대측성(손상되지 않은) 반구를 분리하여 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)/1% BSA(bovine serum albumin) 배지에 놓았다. 상기 조직을 DMEM/1% BSA 배지에 담긴 상태에서 Medimachine(DAKO, 미국) 기기를 사용하여 균질화하고 ice-cold DMEM/1% BSA 배지에서 3번 세척하였다. 조직에 부착된 파지를 대 장균(E. coli) 감염으로 회수하고 다음 라운드의 스크리닝을 위해 증폭하였다. 3 라운드의 스크리닝 후, 파지 클론을 무작위적으로 선택하여 그들의 삽입 DNA 서열을 결정하였다(Koma Biotech Co., 대전, 한국). 상기 DNA 서열과 상응하는 펩티드 서열을 번역하였다. 아미노산 서열과 공유된 모티브를 알아보기 위해 Clustal W 프로그램으로 분석하였고 또한 상동하는 모티브를 가지는 단백질을 확인하기 위하여 NCBI BLAST search 프로그램으로 분석하였다.

각각의 파지 클론의 평가를 위해, 각 파지 클론(500㎕ 배양 배지에 5x10¹¹ pfu)을 허혈 손상후 24시간이 지난 랫트의 꼬리 정맥으로 주입하였다. 2시간의 순환 후, 랫트는 심장을 통하여 PBS로 관류하였고 뇌를 분리하였다. 동측성과 대측성 반구를 분리하고 조직에 부착된 파지의 타이터(titer)를 플라크 측정법에 의해 측정하였다.

3. 생체내에서 펩티드의 유도 및 면역형광법

본 발명자들은 전문회사(Anygen Co., 광주, 한국)에 의뢰하여 표준 Fmoc 방법에 의하여 N-말단에 플루오레세인이 결합된 펩티드를 합성하였다. 500㎕의 PBS에서 1mmol/L 농도로 일정량의 펩티드를 허혈 손상 후 24시간이 지난 랫트의 좌심실로 주입하였다. 15분 동안의 순환 후, 랫트를 PBS로 관류한 후 4% PFA(paraformaldehyde)로 다시 관류하였다. 뇌와 다른 기관을 분리하여 냉동 절편을 위해 준비하였으며, 10μm의 두께로 순차적으로 절단하였다. 핵의 대조염색을 위해 DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole) (Vector Laboratories, Berlingame, CA)가 함유된 배지로 옮긴 후, 조직 슬라이드를 형광현미경(Zeiss, Oberkochen, 독일)으로 관찰하였다.

펩티드가 결합하는 세포 타입을 알아보기 위하여 절편들을 상온에서 1시간 동안 항-튜블린(Chemicon, Temecula, CA, 미국) 및 항-GFAP(glial fibrillary acidic protein) 칵테일(BD Pharmingen, San Diego, CA, 미국) 항체로 면역염색 하였다. 다음으로, Alexa594가 결합된 2차 항체(Molecular Probe, Carlsbad, CA)를 상온에서 30분 동안 반응하였다.

허혈 손상 분석을 위해, 이웃 절편을 TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)로 염색하였다. TTC는 생존한 세포에서 미토콘드리아 효소인 숙신산 탈수소효소에 의해 붉은색의 포르마잔으로 환원되며, 반면에 손상된 세포에서는 미토콘드리아 기능이 손실되어 백색이 된다. TTC 염색 결과를 바탕으로, 손상된 지 하루째에는 TTC 염색에 의해 백색이 되지만 일주일이 지나서 붉은색이 되는 곳을 반음영부(penumbra)로 지정하였다.

4. 펩티드의 방사성동위원소 표지 및 오토라디오그램

방사선 동위원소인 ¹³¹I를 연결하기 위해, 각 펩티드는 합성하는 동안 티로신(tyrosine, Y) 잔기를 N-말단에 추가하였다. 상기 펩티드를 요오드 비드(Pierce Biochemical Co., Rockford, IL)를 사용하여 [¹³¹I]NaI로 표지하였다. [¹³¹I]NaI(반감 기= 8.0 일)는 원자력연구소(대전, 한국)에서 구입하였다. 요약하면, 상기 비드를 PBS에서 [¹³¹I]NaI(100MBq) 용액과 반응한 다음 상온에서 15분 동안 펩티드 용액(20㎖ 물에 14㎎)과 반응하였다. radio-TLC에 의해 측정된 [¹³¹I]의 도입율은 47%이었다. [¹³¹I]로 표지된 펩티드는 1 ㎖/min 속도로 칼럼(Shiseido Capcell Pak C-18)과 용리 용매(용매 A: 물속에 0.1% TFA(trifluoroacetic acid), 용매 B: 아세토니트릴 속에 0.1% TFA, 용매 A : 용매 B의 비는 97:3에서 30분 경과후 20:80로)를 통해 HPLC에 의하여 정제하였다. 최종 용액의 방사화학적 순도는 81.2%를 넘었다.

방사선 사진촬영을 위하여 ¹³¹I으로 표지된 펩티드는 중대뇌동맥 폐색후 지정된 시간에 랫트의 꼬리 정맥을 통하여 주입하였다. 1시간의 순환 후 랫트는 심장을 통하여 PBS로 관류하였다. 뇌를 분리하고 냉동 절편을 준비하였다. 40μm 관상절편의 조직 슬라이드를 카세트에 놓고 통상적인 X-ray 필름이나 형광 영상판(phosphor imaging plate, Fujifilm Co., 도쿄, 일본)으로 덮어 3일 동안 노출하였다. 방사능 강도의 시간에 따른 정량을 위해 상기 형광 영상판은 FLA-3000^TM 형광 영상판 스캐너(Fujifilm Co.)를 사용함으로써 스캔하였다. 관심 부위가 이미지 상에 표시되고 상기 부위의 광-자극된 발광 수치는 MultiGauge^TM 소프트웨어(Fujifilm Co.)를 사용함으로써 계산하였다.

<실험 결과>

1. 파지- 디스플레이드 펩티드 라이브러리의 스크리닝

본 발명자들은 중대뇌동맥이 폐색된 랫트에서 뇌졸중 병변에 선택적으로 유도하는 파지를 선택하기 위하여 생체 내에서 파지 디스플레이를 실행하였다. 바이러스 표면에서 CX7C 무작위 펩티드를 디스플레이하는 파지 라이브러리를 허혈 손상된 후 4시간(혹은 2시간의 중대뇌동맥 폐색의 재관류 후 2시간)지나 랫트의 꼬리 정맥으로 주입하였고 2시간 동안 순환시켰다. 뇌의 동측성(허혈된) 반구를 적출하고 조직에 부착된 파지를 회수하여 다음 라운드의 스크리닝을 위하여 증폭하였다. 3 라운드의 스크리닝 후, 회수된 파지의 타이터는 대략 60배 정도 증폭되었다(데이터 미기재). 2번째와 3번째 라운드에서의 총 30개의 파지 클론을 무작위적으로 선택하였다. 상기 펩티드를 코딩하는 삽입 DNA의 염기서열을 전문회사(바이오니아사, 대전)에 의뢰하여 판독하고 이를 펩티드 서열로 번역하였다. Clustal W 프로그램을 사용한 펩티드 서열의 배열 분석 결과, CLEVSRKNC, CKRGGATAC 및 CRSAVAKNC와 같은 빈번히 발생하는 서열을 나타내었다(표 1 참조). 표 1은 또한 Swissprot 데이터베이스를 검색함으로써 보여진 펩티드와 상동성 있는 모티브를 포함하는 랫트 단백질의 예를 기입하였다. 상기 파지 디스플레이된 펩티드는 이들 단백질 중 하나 또는 그 이상의 단백질을 모방하여 뇌졸중 조직에 결합할 가능성이 있다.

펩티드 서열과 상동 모티브를 포함하는 랫트 단백질의 예

펩티드 서열	빈도(%)	랫트 단백질의 예(상동 모티브)	Accession No.
CLEVSRKNC(서열번호1)	9/30(30%)	Neuronal voltage-gated calcium channel gamma-3 subunit (⁴⁹ETSRKN⁵⁴)	Q8VHX0
		Potassium channel subfamily T member 2 (¹¹²¹EPSRKN¹¹²⁶)	Q6UVM4
		Stress 70 protein chaperone microsome-associated 60 kDa protein (³⁶⁴EVSRK³⁶⁸)	O35162
CKRGGATAC(서열번호2)	7/30(23%)	Neuronal voltage-gated calcium channel gamma-6 subunit (²⁵⁴KRGGPTA²⁶⁰)	Q8VHW7
CRSAVAKNC(서열번호3)	5/30(17%)	Thyroid receptor-interacting protein 15 (¹⁰⁰RSAVTRN¹⁰⁶)	P61203
CTKRNAPDC(서열번호4)	3/30(10%)	Nerve growth factor-inducible protein PC4 (⁶KRNAP¹⁰)	P20695

2. 생체내 허혈성 뇌졸중 조직으로 CLEVSRKNC -파지의 유도

본 발명자들은 생체내에서 뇌졸중 조직으로 CLEVSRKNC 펩티드를 디스플레이하는 파지의 유도를 확인하였다. 상기 CLEVSRKNC 서열은 선택된 펩티드 서열(표 1)에서 가장 빈번히 발생하는 서열이어서 이후 연구에 우선하였다. 상기 CLEVSRKNC-파지를 허혈 손상된 후 24시간(혹은 2시간의 중대뇌동맥 폐색의 재관류 후 22시간)지난 랫트 또는 보통의 대조군 랫트에 정맥주사로 투여하였다. 2시간의 순환 후, 동측성(허혈성)과 대측성(비허혈성) 반구를 분리하고 부착된 파지를 각각 회수하였다.

그 결과, 동측성 뇌 조직으로 유도된 CLEVSRKNC-파지의 타이터는 중대뇌동맥이 폐색된 랫트에서 대측성 조직보다 대략 5.3 배 더 높았고, 대조군 랫트의 정상적 뇌 조직보다는 68 배 더 높았다(P<0.05, 도 1 참조). 동측성 또는 대측성 조직으로 유도된 재조합되지 않은 대조군 파지의 타이터는 CLEVSRKNC-파지와 비교할 때 극히 작았다(P<0.01, 도 1 참조).

3. 생체내 허혈성 뇌졸중 조직으로 CLEVSRKNC 펩티드의 유도 및 세포사멸의 검출

본 발명자들은 뇌졸중 조직으로 CLEVSRKNC-파지의 선택적 유도가 파지에 디스플레이된 펩티드에 의하여 매개되는지 여부를 검토하였다. 플루오레세인이 결합된 CLEVSRKNC 펩티드와 뒤섞인(scrambled) 아미노산 서열을 포함하는 CNSREVLKC 펩티드를 대조군 펩티드를 합성하고 허혈성 손상이 된 지 24시간이 지난 랫트의 좌심실에 투여하고 15분 동안 순환시켰다.

그 결과, 중대뇌동맥 폐색 후에 수행된 TTC 염색으로 좌 동측성 반구는 염색되지 않고 허혈성 세포 손상을 지시하는 백색을 나타내었지만, 우 대측성 반구는 생존 세포를 표시하는 짙은 붉은 색을 나타내었다(도 2A 참조). 냉동 절편에 대한 형광 현미경 관찰로 CLEVSRKNC 펩티드가 대측성 조직(도 2C 참조)으로 유도되지 않고 동측성 조직(도 2B 참조)으로 유도된다는 사실을 증명하였다. 흥미롭게도 펩티드의 유도는 도 2A의 박스로 표시된 허혈성 중심 부위와 주변의 비허혈성 조직사이의 반음영부에서 관찰되었다. 반대로 대조군 아미노산 서열의 유도는 동측성 또는 대측성 조직에서 관찰되지 않았다(도 2D 및 E 참조). 비장, 간 및 폐와 같은 대조군 기관으로의 CLEVSRKNC 펩티드의 유도는 극히 작았다(도 2F 내지 H 참조). 생체내에서 유도 분석은 5 마리의 랫트에서 수행한 결과 유사한 결과가 나타났다. 상기 15분의 순환 실험과 비슷하게, 2시간 동안 순환된 CLELVSRKNC 펩티드도 허혈성 반구에 유도하였다(데이터 미기재).

DNA 단편의 TUNEL 염색을 이용한 세포사멸의 분석을 통하여 반음영부의 많은 세포들이 TUNEL에 의해 염색되는 사멸 세포이지만 여전히 TUNEL에 의해 염색되지 않은 생존 세포가 있다는 사실을 관찰할 수 있었다(도 2I 및 J 참조). 이 영역에서 TUNEL 염색이 된 사멸 세포는 일부분의 세포를 제외하면 대부분 CLELVSRKNC 펩티드와 결합하였다(도 2J 내지 L 참조). 이러한 결과는 CLELVSRKNC 펩티드가 허혈성 뇌 조직의 반음영부에서 세포사멸을 검출할 수 있어, 상기 펩티드는 반음영부를 영상화하거나 검출 및 정량하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 종래 음영부의 영상화 기술을 이용하여 반음영부와 음영부의 상대적 크기 및 정도를 측정함으로써 약물 치료를 통한 예후를 예측하는데도 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

4. 허혈성 뇌졸중 조직에서 CLEVSRKNC 펩티드의 분포

본 발명자들은 생체내에서 유도되는 CLEVSRKNC 펩티드의 뇌졸중 조직에서 분포 즉, 펩티드가 결합하는 세포의 타입을 분석하였다. 세포 타입에 특이적인 항체를 사용한 면역 형광 염색법은 형광성의 CLEVSRKNC 펩티드가 허혈성 뇌 조직에서 β-튜블린-양성 뉴런 세포와 위치가 일치하지만(도 3A 내지 C 참조), GFAP-양성 성상 세포와는 일치하지 않는다는 사실을 보여 주었다(도 3G 내지 I 참조). 예상했던 것과 같이, CLEVSRKNC 펩티드의 유도는 대측성 뇌 조직의 뉴런 세포와 성상세포에서는 관찰되지 않았다(각각 도 3D 및 J 참조). 허혈 손상이 있은 후 24시간 지나 펩티드와 결합한 세포는 뉴런과 유사한 형태를 가졌지만, β-튜블린 염색을 통해 살펴 본 뉴런 세포 모양의 파괴나 수축은 대측성 조직과 비교할 때 동측성 조직에서 심하였다(도 3B 및 E 참조). 또한 성상세포에서 증가된 수준의 GFAP 발현이 허혈성 조직에서 관찰되었다(도 3H 및 K 참조).

5. 허혈성 뇌졸중 조직에서 CLEVSRKNC 펩티드 흡수의 오토라디오그램

본 발명자들은 중대뇌동맥이 폐색된 랫트의 허혈성 조직에서 방사성동위원소로 표지된 CLEVSRKNC 펩티드 흡수에 대해 이미지화 하였다. ¹³¹I-표지된 CLEVSRKNC 또는 뒤섞인(scrambled) 대조군 펩티드를 허혈 손상된 지 24시간이 지난 랫트의 꼬리 정맥에 주입하고 1시간 동안 순환하였다. 뇌 전부를 분리하고 오토라디오그램 분석을 수행하였다.

그 결과, ¹³¹I-CLEVSRKNC 펩티드의 선택적인 흡수가 동측성 반구에서 관찰되었지만, 대측성 영역(도 4A 참조)과 대조군 랫트의 일반적인 뇌(도 4C 참조)에서는 그 흡수가 부족하였다. ¹³¹I-대조군 펩티드의 흡수는 CLEVSRKNC 펩티드에 비하여 동측성 반구에서 훨씬 더 낮은 농도로 관찰되었다(도 4B 참조).

시간 경과에 따른 ¹³¹I-CLEVSRKNC 펩티드 흡수는 허혈성 조직에서 그 흡수가 허혈 손상이 있은 지 1일째 증가하였고 3일째 피크에 도달하여 7일째 감소되는 것을 보여 주었다(도 4D 참조). 광-자극된 발광 수치를 측정함으로써 4개의 관상 단면에서 흡수율이 손상 후 1일째 및 7일째와 비교할 때 3일째 흡수가 상당히 높았다는 사실은 이러한 점을 지지해 주었다(P<0.01, 도 4E). 대조군 조직에 대한 허혈성 조직의 평균 흡수율은 허혈 손상 후 각 시간에 대략 2:1이었다(P<0.05 or P<0.01, 도 4E 참조).

도 1은 CLEVSRKNC-파지가 생체 내에서 뇌졸중 조직인 동측성 반구로 유도하는 것을 나타내는 그래프이다(MCAO: 중대뇌동맥 폐색, *: P < 0.05, **: P < 0.01).

도 2는 생체내에서 CLEVSRKNC 펩티드가 뇌졸중 조직으로 유도하고 뇌졸중 조직에서 세포사멸을 검출할 수 있음을 나타내는 사진이다.

A: 중대뇌동맥 폐색 후 TTC 염색에 의하여 동측성 반구가 허혈성 세포 손상을 지시하는 백색을 나타내지만 대측성 반구는 생존 세포를 지시하는 짙은 붉은 색깔로 염색된 사실을 나타내는 사진이다.

B: CLEVSRKNC 펩티드가 동측성 조직으로 유도하는 것을 나타내는 사진이다.

C: CLEVSRKNC 펩티드가 대측성 조직으로 유도하지 않는 것을 나타내는 사진이다.

D: 뒤섞인 펩티드는 동측성 조직에서 관찰되지 않음을 나타내는 사진이다.

E: 뒤섞인 펩티드는 대측성 조직에서 관찰되지 않음을 나타내는 사진이다.

F, G, H: 각각 비장, 간 및 폐와 같은 대조군 기관에는 CLEVSRKNC 펩티드가

유도하지 않음을 나타내는 사진이다.

I: DAPI 염색에 의하여 세포가 존재하는 영역을 나타내는 사진이다.

J: TUNEL 염색에 의하여 사멸세포가 존재하는 영역을 나타내는 사진이다.

K: CLEVSRKNC 펩티드와 결합하여 형광을 나타내는 영역을 나타내는 사진이 다.

L: J와 K 사진을 합성하여 일부분의 세포를 제외하면 TUNEL-양성의 세포사멸 세포의 대부분은 CLELVSRKNC와 결합하는 것을 나타내는 사진이다.

도 3은 면역 형광 염색법을 이용하여 생체내에서 유도하는 CLEVSRKNC 펩티드가 뇌졸중 조직에서 결합하는 세포 구성성분의 타입을 분석한 사진이다.

A 내지 C: CLEVSRKNC 펩티드가 허혈성 뇌 조직에서 β-튜블린-양성 뉴런 세포와 같은 장소에 배치됨을 나타내는 사진이다.

D 내지 F: CLEVSRKNC 펩티드가 허혈성 뇌 조직이 아닌 대측성 반구에서는 관찰되지 않음을 나타내는 사진이다.

G 내지 I: CLEVSRKNC 펩티드가 허혈성 뇌 조직에서 GFAP-양성 성상 세포와 같은 장소에 배치되지 않음을 나타내는 사진이다.

J 내지 L: CLEVSRKNC 펩티드가 허혈성 뇌 조직이 아닌 대측성 반구에서는 관찰되지 않음을 나타내는 사진이다.

도 4는 허혈성 뇌졸중 조직에서 방사성동위원소로 표지된 CLEVSRKNC 흡수에 대한 오토라디오그램 검사를 한 결과를 나타낸 사진이다.

A: ¹³¹I-CLEVSRKNC 펩티드 흡수가 동측성 반구에서만 관찰되는 것을 나타내는 사진이다.

B: ¹³¹I-뒤섞인 대조구 펩티드의 흡수가 ¹³¹I-CLEVSRKNC 펩티드에 비하여 동측성 반구에서 훨씬 더 낮은 농도로 관찰됨을 나타낸 사진이다.

C: 대조군 랫트의 일반적인 뇌에서 ¹³¹I-CLEVSRKNC 펩티드 흡수가 비교적 낮음을 나타내는 사진이다.

D: ³¹I-CLEVSRKNC 펩티드 흡수가 허혈성 조직에서 허혈 손상 후 3일째 피크에 도달함을 나타낸 사진이다.

E: 광-자극된 발광 수치를 측정하여 ³¹I-CLEVSRKNC 펩티드의 흡수율이 허혈 손상 후 3일째 상당히 높게 도달함을 나타낸 그래프이다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Stroke-targeting peptides and uses thereof <130> NP08-0043 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stroke-targeting peptide 1 <400> 1 Cys Leu Glu Val Ser Arg Lys Asn Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stroke-targeting peptide 2 <400> 2 Cys Lys Arg Gly Gly Ala Thr Ala Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stroke-targeting peptide 3 <400> 3 Cys Arg Ser Ala Val Ala Lys Asn Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stroke-targeting peptide 4 <400> 4 Cys Thr Lys Arg Asn Ala Pro Asp Cys 1 5

Claims

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서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드를 포함하는 뇌졸중 진단용 키트.
제7항에 있어서, 상기 펩티드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질 및 형광물질(fluorescer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 키트.
제7항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 키트.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드를 포함하는 뇌졸중에 특이적인 약물 전달용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 약물은 뇌졸중 치료제인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 뇌졸중 치료제는 칼슘 채널 차단체, 글루타메이트, NMDA 수용체 길항제, 항산화제, 세포사멸(apoptosis) 억제제 및 미노사이클린(minocycline) 계열의 항생제로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
제10항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드를 유효성분으로 하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제14항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 영상화용 조성물.
제16항에 있어서, 상기 펩티드는 초상자성입자, 상자성입자, 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질 및 형광물질(fluorescer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 뇌졸중 영상화용 조성물.
제16항에 있어서, 상기 뇌졸중은 뇌졸중의 반음영부인 것을 특징으로 하는 뇌졸중 영상화용 조성물.