TWI432211B - 與登革病毒相關之胜肽及抗體以及其用途 - Google Patents

Description

與登革病毒相關之胜肽及抗體以及其用途

本發明係關於一種胜肽及抗體及其用途，特別關於一種與登革病毒相關之胜肽及抗體及其用途。

登革病毒(Dengue virus,DV)，屬於黃熱病毒科(Flaviriridae )的一種病毒，會引發從輕微登革熱到如登革出血熱(dengue haemorrhagic fever,DHF)及登革休克症候群(Dengue shock syndrome,DSS)等嚴重症狀。源發性登革病毒感染通常引起疼痛但非致命性，並且會使患者免於受到相同血清型的登革病毒的再次感染。然而，續發性的受不同血清型的登革病毒感染會引發更為嚴重且具致命力的登革出血熱及登革休克症候群(DHF/DSS)。臨床上出現的登革出血熱/登革休克症候群係包含血小板減少症(thrombocytopenia)、血管漏損(vascular leakage)、出血(hemorrhage)及補體活化。由於這些症狀的病理機制尚未明瞭，因此未發展出有效的對策用以防治症狀的發生。

目前已提出幾個關於登革出血熱及登革休克症候群致病機制的理論，其中一個理論係為抗體依賴性增強作用(antibody-dependent enhancement,ADE)，指出當第二次受到不同血清型的登革病毒感染時，單核球及/或巨噬細胞會增強攝入病毒與非具中和性、次中和性或是低效價的抗體所形成的複合體，透過Fc受器感染細胞。因此，所增加的病毒量會引發血漿滲漏或登革出血熱及登革休克症候群的出血症狀。然而，在毒血症達到平原期後，血漿滲漏的發生通常會延續幾天，說明了除了抗體依賴性增強作用外，還有其他因素參與登革出血熱及登革休克症候群的發生。

宿主的免疫反應包含補體活化、免疫細胞活化、細胞激素的產生以及免疫偏差，上述反應均可能與引起登革出血熱/登革休克症候群有關。另一理論係提出病毒的毒性對於登革出血熱/登革休克症候群的病理機制可能具有影響。儘管已提出諸多理論，關於引發登革出血熱/登革休克症候群的主要機制至今仍不明。

部份病毒具有相同的作用點(antigenic determinant)，使他們能與宿主的蛋白相仿，此一現象稱作分子模擬(molecular mimicry)。這些病毒通常會起始自體抗體的產生來對抗宿主自身的組織。引發對抗內皮細胞的交叉反應之抗體以發現於受人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus,hCMV)、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus,EBV)及人類免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的感染時發生。血清中抗體會在全身性硬化症(systemic sclerosis)的患者體內引發內皮細胞細胞凋亡並且也會辨認hCMV的晚期蛋白UL94。

在目前所應用的治療方法不足且無法因應臨床上治療這些疾病的情況下，急需新的治療方法用以避免或減低發炎及如上所述的相關症狀之纖維化。

因此，如何提供一種有效治療因受登革病毒感染造成自體免疫所引發之併發症之方法及醫藥組合物，及針對登革病毒感染之檢測、診斷、或治療後病情之預後已成為重要課題之一。

有鑑於上述課題，本發明之目的為提供一種單離胜肽及抗體，用以治療因受登革病毒感染之併發症之醫藥組合物，同時也透過治療方法，減緩感染後之相關症狀，同時，本發明之單離胜肽及單株抗體更提供了登革病毒感染之檢測、偵測、或治療後病情之預後等用途。

為達上述目的，本發明提供一種單離胜肽係包含一胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly，其中x係為任一胺基酸，此胜肽包含一抗原決定區可與DB16-1單株抗體作專一性地結合，其中，DB16-1重鏈之互補決定區1(CDR1)胺基酸序列係包含YVFSNYWMNW，CDR2胺基酸序列係包含QIYPGDGDTNYNENFRGKA，CDR3胺基酸序列係包含ARWGPYKGSDGFAY；而DB16-1輕鏈之CDR1胺基酸序列係包含SSQSLLYSTNQKNYLA，CDR2胺基酸序列係包含WASTRES，CDR3胺基酸序列係包含KQSYNLYT。

在本發明一實施例中，抗原決定區之胺基酸序列包含胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly。

在本發明一實施例中，單離胜肽係抑制DB16-1單株抗體與一自體胜肽結合。

在本發明一實施例中，自體胜肽係包含胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly。

在本發明一實施例中，自體胜肽係存在於血管內皮細胞。

在本發明一實施例中，DB16-1單株抗體係為抗登革病毒非結構蛋白NS1的抗體。

在本發明一實施例中，單離胜肽係與一人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白(LYRIC)之胺基酸序列或與登革病毒的非結構性蛋白1(NS1)的胺基酸序列至少85%相同。

在本發明一實施例中，單離胜肽之胺基酸序列係選自HKYSWKSWGKAK(SEQ ID NO：1)、LKYSWKTWGKAK(SEQ ID NO：2)、LKYSWKTWGLAK(SEQ ID NO：3)、ANTNGKDWGRSW(SEQ ID NO：4)以及LRYSWKTWGKAK(SEQ ID NO：5)所組成群組其中之在本發明一實施例中，單離胜肽係包含一B細胞抗原決定區胜肽。

本發明另提供一種用於治療感染登革病毒所引起併發症之醫藥組合物包含如上所述之有效劑量之單離胜肽。

本發明也提供一種單株抗體，其係具有專一性地與一人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白(LYRIC)之擬抗原決定區結合，且具有專一性地與一登革病毒的非結構蛋白NS1的抗原決定區結合。

在本發明一實施例中，非結構蛋白NS1係與一DB16-1單株抗體具有專一性結合。

在本發明一實施例中，人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白帶有抗擬抗原決定區胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly。

在本發明一實施例中，人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白之抗擬抗原決定區及非結構蛋白NS1之抗原決定區均包含一胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly。

在本發明一實施例中，單株抗體係具有一單鏈Fv、一免疫球蛋白G、一Fab、一(Fab’)2或一(scFv’)2，且係含有與DB16-1抗體之互補決定區之相同胺基酸序列。

本發明另提供一種醫藥組合物，係包含如上所述之一有效劑量之單株抗體。

本發明另提供一種用於治療登革病毒所引起之併發症之方法，包含投藥於一個體，以給予如上所述之一有效劑量之單離胜肽。

在本發明一實施例中，上述之併發症係包含登革出血熱、或登革休克症候群。

本發明另提供一種偵測人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白的方法，包含將一生物樣本與如上所述之抗體接觸，以及偵測與生物樣本結合的單株抗體。

本發明另提供一種檢測登革熱之方法，與一生物樣本配合，方法包含將生物樣本與如上所述之單離胜肽接觸，以及偵測與生物樣本結合的單離胜肽。

本發明另提供一種用於檢測登革熱之方法，包含將一生物樣本與如上所述之單株抗體接觸，以及偵測與生物樣本結合的單株抗體。

本發明另提供一種用於登革熱預後之方法，包含將一生物樣本與如上所述之單離胜肽接觸，以及偵測與結合生物樣本結合的單離胜肽。

本發明另提供一種用於登革熱預後之方法，包含將一生物樣本與如上所述之抗體接觸；以及偵測與生物樣本結合的抗體。

本發明所提供之醫藥組合物及方法用以治療因登革熱感染所引起之疾病，從輕微登革熱到如登革熱(dengue fever,DF)及登革休克症候群(dengue shock syndrome,DSS)等嚴重症狀。本發明之組合物包含至少一種單離胜肽。本發明所揭露之單離胜肽係包含一抗原決定區，其與位於人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白(human protein Lysine-Rich CEACAM1 co-isolated,LYRIC)的擬抗原決定區及/或登革病毒的非結構蛋白NS1(nonstructural protein 1,NS1)的抗原決定區相似或相同。其中，胜肽中的一結合結構(motif)係為Lys-x-Trp-Gly(K-x-W-G)，其中x可為任一胺基酸。

本發明之組合物及方法係用於治療具有登革病毒所引發之併發症或有併發危險之患者。更進一步地，本發明係關於將一含有LYRIC及NS1的抗原決定區之胜肽進行投藥，以減輕由登革病毒所引發的疾病之相關症狀。

在本發明中，分離出多種登革單株抗體，且一抗-NS1的單株抗體DB16-1係成功地分離出來。DB16-1被發現能與人類臍血管內皮細胞(human umbilical vessel endothelial cells,HUVECs)及人類血管交叉反應。利用免疫沈澱法將DB16-1的標的蛋白分離出來，鑑定係為LYRIC，並進一步利用質譜分析法確認。利用噬菌體展示(phage display)鑑定DB16-1的B細胞抗原決定區，發現登革病毒的NS1及LYRIC具有相似的抗原決定區可引發一自體抗體(autoantibody)的產生。基於這項發現，DB16-1可作為抗內皮細胞上的LYRIC之一自體抗體，導致登革出血熱/登革休克症候群所出現的血管漏損的症狀。

綜上所述，本發明所分離出與登革病毒相關之一種單離胜肽其序列包含Lys-x-Trp-Gly，係與登革病毒之NS1具有相同之抗原結合區，能為本發明之單株抗體專一性地辨認。因此，本發明以單離胜肽及單株抗體作為醫藥組合物，單離胜肽能與患者體內之自體抗體相結合，使自體的標的蛋白免於受到自體抗體的攻擊，或者，利用單株抗體與NS1專一性結合特性，去除病毒的NS1，進而達到減緩登革熱症狀之治療功效。另外，透過單離胜肽及單株抗體兩者之特性，可專一性地辨認生物樣本中的自體抗體量或登革病毒NS1的含量以檢測患者是否有受到登革病毒感染的目的，依據治療後檢測結果與治療前相比，可作為預後之用途。再者，單株抗體更能應用於生物技術中，作為鑑定可表現特定標的蛋白的生物樣本之用途。因此，本發明所提供之關於登革病毒相關之胜肽及抗體可應用於治療、診斷、偵測、預後、分析等用途中。

以下將參照相關圖式，說明依據本發明實施例之與登革病毒相關之胜肽及抗體及其用途，另外，亦將舉複數個實施例以具體說明。

上述達成本發明之技術特徵、優勢及物件之手段將透過本發明複數個實施例詳細說明並作簡短結論，並參照實施例以圖示說明。需注意的是，圖示說明僅用於說明本發明之特定實施例，並非用來限制本發明之專利範圍。

在說明本發明醫藥組合物之前，將先針對治療的劑型及方法說明，必須說明的是，本發明不限於所描述之特殊方法及產品，當然亦可能更為廣泛。同時，在此所使用之方法僅為了達到描述實施例之目的，並非用於限制本發明所屬之專利範圍。

需特別注意的是，本發明之申請專利範圍，單數型態之「一」、「以及」、以及「該」除非上下文中有特別清楚說明，否則均係包含複數所指對象。例如「一治療胜肽」係指一個以上的治療胜肽，而「該生產方法」係包含熟習本領域者所知之等效步驟及方法等。

所提供之數值範圍，除非上下文中特別說明，否則介於上下限之間的中間數值到下限的小數點第一位亦被涵蓋。在設定的範圍中，任一設定值或中間值到該設定範圍中的任何其他設定值或其他中間數值之間的一較小範圍亦被包含於本發明中。範圍中被包含或排除的較小範圍之上限及下限，以及較小範圍當中的一範圍之上限或下限、或上限或下限以外、或上限及下限係均包含於本發明當中，受限於設定範圍中特別排除的限制數值。設定範圍包含一個以上的限制數值，而排除範圍中一個或兩個限制數值的範圍係也被涵蓋於本發明中。

除非特別定義，不然，在本說明書中所述之所有技術或科學名詞均係為本發明所屬之技術領域中熟習此技藝者所了解。本說明書中所提及之文獻所描述及揭露之裝置、劑型及方法皆以全文納入本說明書作為參考文獻，並與本發明說明連結。在本說明書中所討論的文獻係個別地提供並優先於本發明之申請日揭露。在此需聲明，本發明並未授權於該些優先於本發明公告之先前發明。另外，所提供之公告日可能並非實質上的公告日，其需進一步個別確認。

以下所述，多數特定細節係如上所述以提供本發明揭露更完善的瞭解。然而，本發明所揭露之組合物及方法所屬之技術領域中熟習此技藝者，可不必依據當中一個以上之實施例細節就可具以實施。在其他實施例中，一些於本技術領域中的已知特徵或製程，為避免混淆本發明之組合物及方法，本發明在此並未描述。舉例來說，劑型、運送裝置之額外描述及其諸多相關者係均被包含但未描述，但其均為本領域所熟知。

首先將就本發明說明書中所使用之字、詞進一步統一定義，除非其所延伸的上下文有特別表示。

本發明書中所述之「登革病毒(dengue virus,DV)」一詞，意指有密切關係的四種血清型的黃熱病毒屬(genus Flavivirus)黃熱病毒科(family Flaviviridae)病毒。一般來說該病毒係透過蚊子叮咬而傳播至人體中。

本發明亦提供一種以上的單株抗體，其係能專一性地與人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白(LYRIC)之一擬抗原決定區結合且能登革病毒的非結構蛋白NS1的一抗原決定區結合。本發明之單株抗體係能與LYRIC結合或與非結構蛋白NS1結合或為具有同時與這兩個蛋白相結合之活性。其中，非結構蛋白NS1係具有與一DB16-1單株抗體專一性結合的能力。

「抗體」一詞，表示一能與抗原相結合之免疫球蛋白。在本說明書中所述之抗體意指包含整體抗體及所有抗體片段(如F(ab)’、Fab、Fv)能與抗原決定區(epitope)、抗原、或有意義之抗原片段。應用於本發明之單株抗體係對於人類LYRIC登革病毒之NS1有免疫反應或免疫專一性的抗體。「抗體」一詞係包含噬菌體展示庫方法中所使用的抗體。

「抗體」一詞係包含多株抗體(polyclonal)及單株抗體(monoclonal)製備物，其中抗體係可為任一類型(如IgM、IgG及其次類型)及製備物包含混合抗體(hybrid antibodies)、修改抗體(altered antibodies)、F(ab’)2片段、Fab分子、可變異展示於噬菌體上的單鏈片段(single chain variable,scFv)、單鏈抗體、單一區域抗體(single domain antibodies)、雙鏈抗體(diabodies)、嵌合抗體(chimeric antibody)、人源化抗體(humanized antibodies)及其具有功能的片段，能展現原始抗體所具有的免疫結合特性。且其與DB16-1之互補決定區(CDR)有相同胺基酸序列。使用於本發明之方法中的抗體可具有可被偵測的標示，例如具有一放射性同位素、一產生可偵測的產物之酵素、一螢光蛋白，及其相似物。抗體可進一步連結其他的主體(例如以提供傳送一抗發炎物質到一組織區域)、專一結合對的構件，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白(boitin-avidin)專一結合對)、及其相似物。抗體也可結合於一支撐件上(如一固體支撐件)，例如一聚苯乙烯(polystyrene)製平板或珠、試紙、及其相似物。

「免疫疾病」一詞，意指免疫系統缺乏分辨外來分子及自我分子的功能，並且缺乏對於自我抗原的免疫容忍力，導致自我分子的破壞。

「抗原」及「抗原決定區(epitope)」一詞，係意指本技術領域中所熟知之一巨分子之蛋白質(如一多胜肽)係被免疫系統的一組成如一抗體或一T-細胞受器專一性地辨認。本說明書中所述之「抗原」包含抗原性的抗原決定區，例如一抗原的片段，其具抗原性的抗原決定區。抗原決定區可在溶液中被抗體辨認，與其他分子則為分離。當抗原決定區與第一型或第二型的主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex,MHC)分子結合，抗原決定區可被T-細胞抗原受器辨認。

「自體抗原(autoantigen)」一詞，意指自身的抗原(self-antigen)，也就是在一哺乳類動物體內正常情況下被辨認為自我的一物質，因受到感染或受到不正確的刺激免疫系統而被哺乳類動物體內誤認為外來物。亦即，一自體抗原係不被哺乳類的淋巴細胞或抗體辨認為是自身的一部分，而認作是外來物，被哺乳類的免疫調控系統錯誤地攻擊。一自身抗原亦包含一擬抗原決定區，或源於被哺乳類動物辨認為外來物的自身抗體的抗原決定區組合物，以及在非疾病狀態時係為一自身抗原的自體抗原。

「免疫容忍(immunological tolerance)」一詞，意指免疫系統不攻擊一抗原的過程。健康的個體中，對於所有自身的抗原具有一適當地免疫容忍，使不會引發免疫反應，除非受一外來物攻擊或體內有病態生長。

「治療胜肽(therapeutic peptide)」一詞，意指所有醫藥上具活性的胜肽，其能減輕由登革病毒感染所引起的症狀。當胜肽投藥於一患者時，可展現如以下所述一種以上之作用，例如(1)減輕或抑制自體抗體的產生；(2)減輕或抑制登革出血熱(dengue hemorrahagic fever,DHF)及/或登革休克症候群(dengue shock syndrome,DSS)的感受性。

「受試者(subject)」、「個體(individual)」以及「患者(patient)」等詞，在本說明書中係為可相通地表示為一哺乳類動物經治療評估及/或被治療之一哺乳類動物。在一實施例中，哺乳類動物係為人類。「受試者(subject)」、「個體(individual)」以及「患者(patient)」等詞因此係包含具有或已受登革病毒感染的一個體。受試者可為人類但也包含其他哺乳類動物，特別是作為人類疾病研究的實驗模式哺乳類動物，如小鼠及大鼠等等。

「治療(treatment)」或「處理(treating)」一詞，意指針對得到一效果的目的，以一試劑投藥或執行一過程(例如胜肽的投藥等)。達到的作用可以係預防，即完成或部份避免一疾病或其症狀，及/或達到一疾病及/或該疾病所引發之症狀的部份或完全地治療。本說明書中所述之「治療(treatment)」涵蓋所有在哺乳類動物中，特別係人類因受登革病毒感染索引發的症狀之治療，包含：(a)暴露於病毒下之一受試者但尚未經過診療，使一受試者免於產生一疾病的一症狀的發生(如包含對於源發性感染後再次感染後的症狀)；(b)抑制登革病毒感染的症狀蔓延，如阻止其發展；以及(c)感染症狀的解除。

「細胞培養(cell culture)」或「培養(culture)」一詞，意指在體外環境下以人工方式維持細胞。然而，已知「細胞培養(cell culture)」係為一一般普遍的用詞並包含個體細胞、組織、或器官的培養。

「診斷(diagnosis)」一詞，在本說明書中意指一分子、病理狀態、疾病或症狀的鑑定，如一感染媒介的鑑定、位置、定量，判斷一受試者對其感染之感受性，或對感染所引發之二級免疫反應，判斷受試者是否受當前感染的影響、一受試者受感染後之預後以及偵測一受試者之情況以提供治療效率及效果之訊息。

「關於(correlates)」相關之詞，意指兩事件的情況在統計上的關聯，事件係包含數目、資料集、及其相關等。例如，當事件包含數目，一正相關(positive correlation)(在此亦作為直接相關(direct correlation))意指一個增加，其餘也跟著增加。一負相關(negative correlation)(在此亦作為反相關(inverse correlation))意指一個增加，其餘則降低。

「單離(isolated)」一詞，意指自然情況下一化合物與其他伴隨的所有或部份成份分離。單離亦可以指在製造過程(例如化學合成、重組表現、培養基等等)中，一化合物自其所伴隨的所有或部份成份分離的狀態。

一「生物樣本」包含各種取自於一個體的樣本型態，其定義包含血液及其他生物來源的液體樣本、固體組織樣本如活組織切片樣本或組織培養或其所衍生之細胞或其細胞子代。其定義亦包含樣本在取得之後的各種操作方式，如以試劑處理、清洗、或濃縮特定細胞群如內皮細胞。其定義亦包含樣本對特定型態的分子或細胞濃縮，例如表現LYRIC的細胞。該「生物樣本」一詞，包含一臨床上樣本，同時也包含由手術切除所獲得之組織、活組織切片所獲得之組織、進行培養的細胞、細胞上清液、細胞溶解液、組織樣本、器官、骨髓、血液、血漿、血清等等。一「生物樣本」係包含取自患者之含有多核苷酸及/或多胜肽的一樣本，例如，含有多核苷酸及/或多胜肽的一細胞溶解物或其他細胞萃取物。

如上所述，本發明係提供一種單離胜肽，其包含一胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly，其中x係為任一胺基酸，其中胜肽包含一抗原決定區以讓一DB16-1單株抗體作專一性地結合。

在此所用之「多胜肽」、「胜肽」以及「蛋白」等詞在本發明中對於胺基酸殘基所構成之聚合物係可相互變換。該等詞係用於胺基酸聚合物中一個以上的胺基酸殘基係為可對應自然下存在的胺基酸相似物，及用於自然下存在的胺基酸聚合物。例如，胜肽長度係至少約8個胺基酸但不超過16個胺基酸，通常係至少10個胺基酸但不超過14個胺基酸長度，也可係約12個胺酸長度。「多胜肽」、「胜肽」以及「蛋白」等詞包含醣蛋白及非醣蛋白。本發明所展示之多胜肽序列係如一般N端到C端方向。

本發明所提供之單離胜肽係包含一可與抗體DB16-1的B細胞抗原決定區(B-cell epitope)結合的一抗原決定區。DB16-1的B細胞抗原決定區(B-cell epitope)能專一性地辨認登革病毒之NS1蛋白上的一抗原決定區，且在該抗原決定區上具有一包含Lys-x-Trp-Gly之胺基酸序列。而在本發明之一實驗例中發現，人類之LYRIC係具有與NS1上之一抗原決定區相同的擬抗原決定區(mimotopes)，該擬抗原決定區上係包含Lys-x-Trp-Gly，其中x係為任一胺基酸。換句話說，DB16-1抗體係對本發明之單離胜肽之一抗原決定區具有專一性，且單離胜肽之抗原決定區亦被發現存在於登革病毒之NS1及LYRIC。LYRIC蛋白也稱作異黏蛋白(metadherin)(Brown and Ruoslahti(2004)Cancer Cell5：365-374)、3D3(Sutherland et al.(2004)Exp Cell Res 294：94-105)或星狀細胞調升基因1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)(Kang et al.(2005)Gene353：8-15)，且在物種間係為高度保留(conserved)。LYRIC在本發明一實驗例中係表現於人類臍血管內皮細胞(HUVECs)上之一蛋白。因此，DB16-1也可視為辨認與人類自體的富含賴氨酸CEACAM1共分離蛋白(human lysine-Rich CEACAM1 co-isolated,LYRIC)及/或亦可與抗體DB16-1結合之登革病毒之非結構蛋白(NS1)上的一抗原決定區相同或相似之一抗體。以下，本說明書將此能被B細胞抗原決定區所辨認之「單離胜肽」稱為「B細胞抗原決定區胜肽」，並作進一步說明。

多種分析方法均可用於判斷一胜肽是否可被抗體DB16-1專一性地結合。例如，固相ELISA免疫分析、免疫沉澱、流動是生物感測系統(Biacore)及西方墨點法均可用以鑑定與抗體專一性反應的胜肽。基本上，一專一性的或有選擇性的反應係至少為背景值或雜訊的兩倍訊號或基本上為十倍背景值的訊號強度。

B細胞抗原決定區胜肽係至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約100%與LYRIC或NS1片段相同。其中，本發明之B細胞抗原決定區胜肽係源於LYRIC片段包含起始於位於334、333、332、331、330的位置，或位於N端至330的一位置之一連續的胺基酸序列，並中止於約337、338、339、340、341位置或C端至341的一位置。例如，一片段係含有LYRIC上334到337位置的一連續胺基酸序列。本發明之B細胞抗原決定區胜肽係源於NS1的一片段，一片段係含有一連續的胺基酸序列，起始於約116、115、114、113、112的位置或一位於N端到112的一位置，並終止於119、120、121、122、123、或位於C端至123的一位置。

本發明之B細胞抗原決定區胜肽係包括一多胜肽，其所含有一胺基酸序列係至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%的胺基酸序列相同於一人類LYRIC(例如，人類LYRIC UniProt No. Q86UE4或GenBank Accession No. NP_848927.2)之一連續上8個胺基酸到16個胺基酸、16個胺基酸到20個胺基酸、20個胺基酸到50個胺基酸的一長度。

本發明之B細胞抗原決定區胜肽含有一胺基酸序列，胺基酸序列係實質上相似於登革病毒之NS1之胺基酸序列，胜肽包含一多胜肽，多胜肽包含一胺基酸序列係至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%的胺基酸序列相同於一登革病毒之NS1多胜肽(UniProt No. Q9YP96;GenBank Accession No. NP_739584.2)之一連續上8個胺基酸到16個胺基酸、16個胺基酸到20個胺基酸、20個胺基酸到50個胺基酸的一長度。

比較這些較短的序列的相似百分比。已知的程式如BLASTN(2.0.8)(Altschul et al.(1997)Nucl. Acids. Res. 25：3389-3402)利用系統內定參數及無篩選條件來進行一序列之比對。

在本說明書中，描述一胺基酸序列或多核苷酸序列所使用「源於」一詞(例如一胺基酸序列「源於」LYRIC)意指多胜肽或核酸具有一序列係基於它們的一參考多胜肽或核酸(例如，一自然下存在的人類LYRIC或編碼核酸)而非以該蛋白或核酸製造的來源或方法限制其定義。

本發明所揭露之B細胞抗原決定區胜肽包含如下所定義之一結合結構：Lys-x-Trp-Gly(K-x-W-G)，其中x係可為任一胺基酸殘基，上述胺基酸序列為連續的胺基酸序列。如圖6A所示，本發明之B細胞抗原決定區胜肽可包含一種以上之如下序列：HKYSWKSWGKAK(SEQ ID NO：1)、LKYSWKTWGKAK(SEQ ID NO：2)、LKYSWKTWGLAK(SEQ ID NO：3)、ANTNGKDWGRSW(SEQ ID NO：4)以及LRYSWKTWGKAK(SEQ ID NO：5)。

本發明之B細胞抗原決定區胜肽的任一胺基酸序列可包含一個以上插入、刪除、或取代的胺基酸，但所揭露對抗體DB16-1之抗原決定區係仍然存在。

「保守胺基酸置換(conservative amino avid substitution)」意指一胺基酸殘基置換成另一個在化學及物理性質(如，電荷、大小、疏水性/親水性)上可共用的胺基酸支鏈。「保守置換(conservative substitutions)」係包含以下列胺基酸殘基所構成之一族群置換：甘胺酸(gly)、丙胺酸(ala)、纈胺酸(val)、異白胺酸(isoleucine，ile)、白胺酸(leu)、天冬醯胺酸(asp)、麩醯胺酸(glu)、天冬醯胺(asn)、榖胺酸(gln)、絲胺酸(ser)、蘇胺酸(thr)、賴胺酸(lys)、精胺酸(arg)、苯丙胺酸(phe)及酪胺酸(tyr)。在本說明書中的胜肽係採用保守胺基酸置換以維持有興趣的一抗原決定區。此置換方式係可將具有感興趣的抗原決定區的胜肽之胺基酸列拉直排列。

本發明亦提供一種以上的單株抗體，其係能專一性地與人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白(LYRIC)之一抗原決定區結合且能與登革病毒的非結構蛋白NS1的一抗原決定區結合。本發明之單株抗體包含：DB16-1、Lyric 1-7、Lyric 2-1、Lyric 3-13及Lyric 4-7。抗體DB16-1係可與人類LYRIC上的一擬抗原決定區及NS1上的一抗原決定區專一性地結合。單株抗體係發現其與LYRIC及NS1上的一區域係具有專一性的，可單獨僅結合LYRIC或僅與NS1結合，當然，也可以同時結合這兩個蛋白，該區域上係包含Lys-x-Trp-Gly(K-x-W-G)的一結合結構，其中x係為任一胺基酸殘基。由於這個專一性，DB16-1可與表現LYRIC的人類臍血管內皮細胞(human umbilical vessel endothelial cells,HUVECs)進行專一性地結合。其中，DB16-1重鏈之CDR1胺基酸序列係包含YVFSNYWMNW(SEQ ID NO：15)，CDR2胺基酸序列係包含QIYPGDGDTNYNENFRGKA(SEQ ID NO：17)，CDR3胺基酸序列係包含ARWGPYKGSDGFAY(SEQ ID NO：19)；而DB16-1輕鏈之CDR1胺基酸序列係包含SSQSLLYSTNQKNYLA(SEQ ID NO：22)，CDR2胺基酸序列係包含WASTRES(SEQ ID NO：24)，CDR3胺基酸序列係包含KQSYNLYT(SEQ ID NO：26)。關於DB16-1的CDR胺基酸及FR詳細胺基酸序列係顯示於圖7中。

Lyric 1-7、Lyric 2-1、Lyric 3-13及Lyric 4-7係對於人類LYRIC蛋白具有專一性。本發明所揭示的抗體係能被重組表現或是自然情況下產生(例如在特定的細胞培養中或人類臍血管內皮細胞)。「自然情況下產生」係針對一對象，該對象係存在於自然情況下。舉例來說，一多胜肽或多核苷酸序列係自然情況下存在於一生物體中(包含病毒)，多胜肽或多核苷酸序列係分離自自然環境中，且在實驗中並非經人為刻意修飾。

「專一性結合(specific binding)」意指一本發明之單株抗體係較其他非專一性的抗體優先與一特定目標結合。「專一性地(或選擇性地)結合於(specifically(or selectively)bind)」一詞意指在於不同的蛋白族群及其他生物物質中一抗體決定與當中一蛋白之結合反應。原則上，抗體與一蛋白結合的結合常數(association constant,Ka)係至少約1×10⁶ M^-1 至10⁷ M^-1 、或約10⁸ M^-1 至10₉ M^-1 、或約10¹⁰ M^-1 至10¹¹ M^-1 或更高，並且與一特定蛋白具有一親和力係與一非專一性抗原或非相近似的抗原(如BSA、酪蛋白)結合的親和力至少兩倍大。「一抗體辨認一抗原」一詞及「一抗體對一抗原具有專一性」一詞係與「一抗體係專一性地結合於一抗原」意義上相互通用。在本發明之一實施例中，單株抗體係為一個體之自體抗體(autoantibody)，意指該自體抗體係能辨認自體所產生之一蛋白或一胜肽。在本發明一實驗例中，DB16-1係具有相同於人體中之一自體抗體之辨識功能，能辨認人類的自體胜肽LYRIC。

本發明之單株抗體與登革病毒NS1、人類LYRIC，及/或HUVECs具有高度親和力。「高度親和力」意指一抗體達到一平衡結合常數(equilibrium association constant,Ka)係至少約10⁷ M^-1 、至少約10⁸ M^-1 至少約10⁹ M^-1 至少約10¹⁰ M^-1 至少約10¹¹ M^-1 至少約10¹² M^-1 或更大，例如，高達10¹³ M^-1 或10¹⁴ M^-1 或更高。然而「高親和力」結合可隨結合情況及抗體的同型不同而有所差異。

本發明之B細胞抗原決定區胜肽及單株抗體係以任一適當地方法產生，包含重組或非重組方法(例如化學合成)。其中，多胜肽係利用化學性地合成，其合成方法係經由液相或固相的過程。固相合成(solid-phase synthesis,SPPS)係併入非天然的胺基酸、胜肽/蛋白骨架修飾。各種形式的SPPS如Fmoc及Boc係用於本發明之單離胜肽的合成。關於化學合成的詳細內容(如Ganesan A.(2006)Mini Rev. Med Chem. 6:3-10及Camarero JA et al.(2005)Protein Pept Lett. 12:723-8)係為本領域所熟知。簡而言之，B細胞抗原決定區胜肽係可建構於帶有功能單元的小型不溶、有孔的珠。在重複偶合/去保護(coupling/deprotection)之後，固相附著處的游離N端胺基會與一單一的N端受保護之胺基酸單元結合。之後這個單元進行去保護，呈現一新的N端胺基並再與另一胺基酸附著。再切除前，胜肽係固定於固相並經過一過濾過程。

其中，B細胞抗原決定區胜肽及單株抗體係利用重組技術製造，蛋白可以任一適當的建構技術或任一適當的宿主細胞產生作為一細胞內蛋白或作為一分泌性蛋白，宿主細胞可為一原核細胞或真核細胞，如一細菌(如大腸桿菌)或一酵母菌宿主細胞等。

單株抗體可包含編碼於一多核苷酸的一輕鏈或重鏈。用於產生重組胜肽的方法已為本技術領域所熟知。例如，編碼該胜肽或抗體的核酸、或至少一重鏈多胜肽或一輕鏈多胜肽的一互補決定區(CDR)係送入一宿主細胞，並且將細胞培養於適合使細胞表現編碼產物的一環境中。重組胜肽或抗體在宿主細胞中可在醣基化酶(glycosylase)的作用下被醣基化、無醣基化、或可具有一變更的醣基化態樣。

B細胞抗原決定區胜肽或單株抗體可以係被嵌合的。例如，嵌合抗體(chimeric antibody)係包含人類及非人類部份的免疫球蛋白分子。更精確地說，一人源化的嵌合抗體的抗原結合區(或變異區(variable region))係源於非人類的來源(如鼠類)，嵌合抗體(其作為免疫球蛋白的作用器(effector))的固定區(constant region)則係來自於人類。嵌合抗體可具有非人類抗體部份的抗原結合專一性並且憑藉人類抗體分子而具有作用器功用。已有許多用於製造嵌合抗體的方法為熟習本技術領域者所熟知。另一發法係為產生人源化抗體，透過重組DNA技術，將非人類抗體的CDR區域連結在人類抗體的固定區。參見Queen et al.,Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86: 10029-10033(1989)及WO 90/07861。

本發明中之重組融合(recombinant fusion)係為胜肽或抗體經修飾後包含一異源性蛋白，也就是連結到一多胜肽，而非接到DB16-1抗體的一部分上。例如，DB16-1的重鏈多胜肽或DB16-1的輕鏈多胜肽係連接於一具有抗發炎化抗病毒效用的一蛋白上。同樣地，本發明之B細胞抗原決定區胜肽也可與一異源性的一蛋白融合。融合胜肽或抗體係連接於一報導蛋白上，例如，一螢光蛋白。本發明之B細胞抗原決定區胜肽或抗體係也可以連接於二級抗體上(至少係二級抗體之抗原結合區)，例如，一抗體係專一性地辨認NS1上不同的抗原決定區。以一已知的核酸序列來產生一融合蛋白的方法係為本領域所熟知。

本發明之單株抗體係包含人源化抗體。一原始非人類抗體的架構區(framework regions)的胺基酸係可被置換而產生一修飾抗體，改造抗體在人體中比原始非人類抗體較不具免疫性。抗體可以利用本領域中的各項技術進行人源化，例如，CDR-移植(CDR-grafting)、膠合(veneering)及鏈交換(chain shuffling)。架構置換係透過將CDR與架構殘基交叉反應而建立的模組確認，以鑑定架構殘基在一特定位置相較於非一般的架構殘基係具有重要的抗原結合及序列。其他用於本發明之關於人源化抗體的製造方法係為本技術領域所熟知，且抗體係可依據任何已知的方法進行人源化。

本發明之單株抗體係為人類抗體。人類抗體係主要包含人類所特有的多胜肽序列。本發明之人類抗體係可以本領域所熟知之方法製造。人類抗體可先於一三源雜交瘤(trioma cells)(源於三個細胞，兩個人類細胞及一個老鼠細胞)中產生。編碼一抗體的基因接著在其他細胞中，特別是非人類的哺乳類細胞中，進行選殖及表現。一般利用三源雜交瘤技術產生人類抗體的方法已有描述。

本發明之B細胞抗原決定區胜肽或單株抗體係可包含一個以上的聚乙烯二醇(polyethylene glycol,PEG)部份，該胜肽或抗體係稱為「被PEG化(PEGylated)」。關於用於被抗體PEG化的方法及適合的試劑以為本技術領域所熟知。一般而言，PEG適合連結於在室溫下為可溶於水的抗體，PEG所具有的通式為R(O-CH2-CH2)_n O-R，其中R係為氫或依據保護功能之基團如一烷基或一烷醇基，n係為1至100間之一整數。其中R作為一具有保護功用之一基團，其具有1至8個碳。

PEG可以直接或透過一連結物(linker)連接於本發明之B細胞抗原決定區胜肽或抗體上的一胺基酸殘基上。在部份實施例中，一連結物係加在一多胜肽上，形成一連結物-修飾多胜肽(linker-modified polypeptide)。這些連結物提供了各種功能，例如將可反應的基團如氫硫基(sulfhydryl)、胺基、或羧基(carboxyl)連結一PEG試劑於該連結物-修飾抗體多胜肽(linker-modified antibody polypeptide)。

連結於B細胞抗原決定區胜肽或抗體的PEG係可為直鏈型的。在其他實施例中，連結於B細胞抗原決定區胜肽或抗體上的PEG係為支鏈型的。關於支鏈型的PEG之衍生物係描述於美國專利案No.5643575,“star-PEG’s”及於多臂的PEG係如Shearwater polymers,Inc.型錄「聚乙烯二醇衍生物1997-1998(“Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998”)」。星形PEG(Star PEG)於本技術領域中已有所描述，包含美國專利No. 6046305。

當一接合物(conjugate)依據一特定的特性被用作為第二分子時，本發明之B細胞抗原決定區胜肽或抗體連結物係保留該特定活性。舉例來說，本發明之B細胞抗原決定區胜肽及抗體係連結於一可幫助溶解、儲存、或其他操作上的特性、細胞滲透、半衰期、控制物的釋放及/或分佈如藉由標定一特定細胞(如內皮細胞等)或細胞位置、組織或其他存在體中的位置(如血液、中性組織、特定器官等)之第二分子。其他接合物的例子包含一染劑、螢光團(fluorophore)、或其他可偵測的標示物或報導分子用以分析、追蹤等。更進一步地，本發明之B細胞抗原決定區胜肽或抗體可被連結一第二分子如一第二胜肽、染劑、螢光團、核酸、碳水化合物、脂質等，比方附著於一脂質部份。

本發明所提供一接合物更進一步包含相對於非接合材料的一接合物具有一可調整細胞攝取的一部分。B細胞抗原決定區胜肽或抗體接合物係展現相對於非接合材料具有增進細胞攝取的特性。在另一實施例中，接合物係展現相對於非接合材料具有降低細胞攝取的功效。在本實施例中，細胞的攝取效率係藉由連結於其他胜肽或蛋白便於進行胞飲作用來增加或降低。

一具有接合物之B細胞抗原決定區胜肽或抗體所具有的其他特徵包含相對於非接合材料，該接合物係能降低毒性。另一接合物係相對於非接合材料具有較佳效率去辨認一組織區域(如血管系統)。其他例子包含一個以上分子具有互補、提供潛在能力、增強或可協同地操作與本發明之B細胞抗原決定區胜肽或抗體連結。舉例來說，抗體係可選擇性地附著在一藥物上，該藥物係具有降低發炎反應、降低補體活化、增加血小板數、降低免疫細胞活化、減少細胞激素產生及/或可選擇性地經修飾而能增進藥物動力的情況(如藉由PEG化、高度醣基化等)。

其他額外與B細胞抗原決定區胜肽或蛋白的N-端或C-端融合的元件可被用以在一細菌細胞(如大腸桿菌)中提供N端甲硫胺酸(methionine)或其衍生物(如焦麩胺酸(pyroglutamate))，及/或用以提供一嵌合多胜肽，在其N端或C端具有一相融合的物件。相融合的物件如麩胺基硫-S-轉移酶(glutathione-S-transferase)、麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein,MBP)、組胺酸6-標籤(His₆ -tag)等，以及其他蛋白的前導胜肽(leader peptide)。這些種類的融合物質可便於分離、純化、偵測、本發明之B細胞抗原決定區胜肽或抗體的致免疫性(immunogenicity)。

連結於本發明之其他元件係包含一攜帶分子(如一攜帶蛋白如鎖孔笠貝血青素(keyhole limpet hemocyanin,KLH))。攜帶者包含免疫調節物質、一可直接或間接調控免疫反應的一分子。一特定免疫調節物質包含那些可刺激或降低一免疫反應的物質。攜帶分子也可便於運送一特定細胞或組織。

如上所述之本發明之B細胞抗原決定區胜肽或抗體也可透過一連結物連結一元件，如一彈性連結物。適用於修飾本發明之B細胞抗原決定區胜肽或抗體係包含「彈性連結物(flexible linkers)」。適當地連結物可隨意選擇，其可為一適當地任意長度，如從1個胺基酸(如胺乙酸(glycine))到20個胺基酸、從2個胺基酸到15個胺基酸、從3個胺基酸到12個胺基酸，及包含從4個胺基酸到10個胺基酸、從5個胺基酸到9個胺基酸、從6個胺基酸到8個胺基酸、或從7個胺基酸到8個胺基酸，以及可為1、2、3、4、5、6、或7個胺基酸。

彈性連結物的例子包含胺乙酸聚合物(G)n、胺乙酸-絲胺酸(glycine-serine)聚合物(如包含(GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO：6)及GGGSn(SEQ ID NO：7)，其中n係為大於或等於1之一整數)、胺乙酸-丙胺酸(glycine-alanine)聚合物、丙胺酸-絲胺酸(alanine-serine)聚合物及其他本技術領域中所熟知之其他彈性連結物。胺乙酸及胺乙酸-丙胺酸係感興趣的，因這兩者結構係較為鬆散的，因此可作為元件間一天然的繫鏈。胺乙酸係最為感興趣的，因胺乙酸較丙胺酸係更具有德蘭空間(Ramachandran(或phi-psi)space)，且比起其他具有較長支鏈的殘基較無約束。彈性連結物在此作為舉例說明但不限於為GGSG(SEQ ID NO：8)、GGSGG(SEQ ID NO：9)、GSGSG(SEQ ID NO：10)、GSGGG(SEQ ID NO：11)、GGGSG(SEQ ID NO：12)、或GSSSG(SEQ ID NO：13)等。於本技術領域具有通常知識者係均明瞭一接合物的設計可包含完全或部份連結物，如連結物係可包含一彈性連結物及一個部份以上具有彈性較差的結構。

本發明所揭露的核酸分子係包含，或擇一地包含一多核酸序列係至少80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同於含如上所述之B細胞抗原決定區胜肽或抗體密碼的一多核酸序列。核酸係包含融合於一異源性的多核酸序列的多核酸序列，以及其所轉譯出來的多胜肽。

具體地說，本發明之一DNA分子包含可被表現為一B細胞抗原決定區胜肽的一核酸序列，B細胞抗原決定區胜肽係含有人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白(human lysine-Rich CEACAM1 co-isolated,LYRIC)擬抗原決定區及/或登革病毒之非結構蛋白NS1上的一抗原決定區，該抗原決定區與抗體DB16-1可專一性地結合。核酸序列可取自GenBank Accession No. NM_178812之核酸序列，其係編碼一來自人類LYRIC的胜肽。若B細胞抗原決定區胜肽係來自於登革病毒的NS1，則核酸序列也可係取自DENV_gp1基因。

具有此核酸的載體或宿主細胞係也被本發明包含。本發明更進一步地包含核酸、載體及含有他們的宿主細胞，核酸係編碼了一抗體(如DB16-1)的一重鏈多胜肽及一輕鏈多胜肽的至少一CDR。

核酸組合物係包含片段(fragments)及引子，並且係至少約15個鹼基對(bp)的長度、至少約30 bp的長度、至少約50 bp的長度、至少約100 bp的長度、至少約200 bp的長度、至少約300 bp的長度、至少約500 bp的長度、至少約800 bp的長度、至少約1 kb的長度、至少約2 kb的長度、至少約3 kb的長度、至少約5 kb的長度、至少約10 kb的長度、至少約50 kb的長度但通常係小於200 kb的長度。在部分實施例中，一多核苷酸的一片段係為該多核苷酸的編碼序列(coding sequence)，如GenBank Accession No. NM_178812。同時，本發明之核酸係也包含變異型(variants)或本發明所提供之序列之降解的變異型(degenerate variants)。一般來說，本發明之多核苷酸之變異型相較於所提供一同等大小片段之序列係具有至少大於約65%、至少大於約70%、至少大於約75%、至少大於約80%、至少大於約85%、至少大於約90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的相似度(亦即100%)，關於相似度之比對係經由MPSRCH程式中的Smith-Waterman同源搜尋演算法(Smith-Waterman homology search algorithm)做為工具。具有相似部份的核酸係可於低嚴謹度的條件下透過雜合作用來偵測，例如，在50℃下於10×SSC(0.9 M食鹽水(saline)/0.09 M檸檬酸鈉(sodium citrate))中於55℃下以1×SSC清洗後仍結合者。關於雜合方法及其條件係為本領域所熟知之技術，並請參見如美國專利No. 5707829。本發明之核酸實質上係與本發明所提供的多核苷酸序列相同，例如對偶基因變異型(allelic variants)，基因在遺傳上的變異版本等，當以嚴謹的條件進行雜合時，可與本發明所提供的多核苷酸序列相雜合。

一般來說，本發明之B細胞抗原決定區胜肽具有至少約80%、通常至少約90%、較常係約98%的序列係與在此所描述之B細胞抗原決定區胜肽完全相同。胺基酸序列係可選自一人類LYRIC UniPro No. Q86UE4或GenBank Accession No. NP_848927.2，當中的B細胞抗原決定區胜肽係來自於人類LYRIC。關於登革病毒的NS1之B細胞抗原決定區胜肽其胺基酸序列係選自於GenBank Accession No.NP_739584.2。

各種多胜肽可以係自然地或非自然地被醣基化，亦即，多胜肽具有的醣基化態樣係與自然情況下蛋白的醣基化態樣有所不同。

在此所述之多胜肽的片段，特別是具生物活性的片段及/或對應於感興趣的DB16-1的抗原決定區的片段。感興趣的片段基本上係至少約10個胺基酸至至少約15個胺基酸長度、通常係至少約50個胺基酸長度，及可為300個或更長的胺基酸長度，但通常係不超過1000個胺基酸長度。其中具有一延展的胺基酸片段係與一多胜肽相同，多胜肽係編碼於本發明所提供之任一多核苷酸及其同源物。「至少20個胺基酸長度」為包含20個以上的連續的胺基酸，並且係取自於如被存在於一cDNA選植株中的cDNA所編碼的多胜肽以及取自該cDNA互補股(complementary strand)所編碼之多胜肽，其中該cDNA選植株係儲存於一選殖庫中。本說明書中所述之「約」指特別標示之數值或一數值係較多或較少幾個胺基酸(5、4、3、2、或1)。在此所述之蛋白變異體係被編碼於本發明所涵蓋的範疇中的幾個多核苷酸。基因密碼可用以選擇適當的密碼子(codons)來建構對應的變異型。多核苷酸可用以產生多胜肽，並且這些多胜肽可用以透過上下文中所述之方法來產生抗體。

在此所述之核酸探針、抗體、胜肽可以化學性的方式合成或可取自較長的衍生物(如利用限制酵素(restriction enzyme))。多胜肽及核酸係可以一放射性元素、生物素、或螢光標籤(fluorescent tag)來標記。

這些多核苷酸、多胜肽及其片段係包含但不限於檢測標籤及引子，如治療胜肽係用於登革病毒感染及其相關症狀的診斷及治療以及篩選方法。

本發明所提供之醫藥組合物包含一種以上本發明如上所述之B細胞抗原決定區胜肽及單株抗體，B細胞抗原決定區胜肽及單株抗體可用以對一需要診斷或治療的受試者進行投藥。

本發明之組合物除包含一種以上的胜肽及抗體外，還包含一種以上的；一鹽類，如NaCl,MgCl,KCl,MgSO₄ ；一緩衝液，如一Tris緩衝液(Tris buffer)、N-2-(羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N’-(2-ethanesulfonic acid),HEPES)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid,MES)、(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt,MES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid,MOPS)、N-tris[羥甲基]甲基-3-胺基丙磺酸(N-tris[hydroxymethyl]methyl-3-aminopropanesulfonic acid,TAPS)等；一增溶劑；一介面活性劑(detergent)如一非離子介面活性劑如Tween-20等；一蛋白酶抑制劑；甘油等等。

本發明另提供之醫藥組合物及方法係用以治療登革病毒感染所引發之症狀。醫藥組合物包含一B細胞抗原決定區胜肽，此B細胞抗原決定區胜肽係與人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白(LYRIC)及/或登革病毒中的非結構蛋白NS1上的抗原決定區係為相似或相同。因此當B細胞抗原決定區胜肽作為醫藥組合物對一受試者進行投藥時，B細胞抗原決定區胜肽能抑制自體抗體與自體標的蛋白相結合。在本發明一實驗例中，一B細胞抗原決定區胜肽能抑制DB16-1與人體胜肽結合，糗成劑量依賴關係。B細胞抗原決定區胜肽的結合結構係為Lys-x-Trp-Gly(K-x-W-G)，其中，x可為任一胺基酸。在說明書中亦提供LYRIC及/或NS1相關的多核苷酸及多胜肽。多核苷酸及多胜肽可用於偵測自體抗體、評估、試劑篩選以及降低由登革病毒感染所引起的症狀。可利用自然產生的LYRIC及/或NS1之一種以上之同型異構物/變異型。本發明之B細胞抗原決定區胜肽可以被修飾或被連結(如連結一可偵測到的標示)。

醫藥組合物可包含B細胞抗原決定區胜肽及抗體之所需之一緩衝液，也可包含其他符合使用所需之物質。熟知本技術領域者，可依據適於欲應用之用途任意自本領域所知的各種緩衝液中選擇一適當緩衝液。

醫藥組合物可包含一醫藥上可接受之賦形劑，此賦形劑為本技術領域所熟之而無須在此作進一步討論。關於賦形劑已有諸多文獻中有所描述，如“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”，第19版(1995)或最新版Mark Publishing,Co. A. Gennaro(2000)、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”，第20版，Lippincoott,Williams and Wilkins；Pharmaceutucal Dosages Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C. Ansel et al.,第7版，Lippincoott,Williams and Wilkins以及Handbook pf Pharmaceutical Excipients(2000)A.H. Kibb et al.,第3版，Amer.Pharmaceutical Assoc.。

醫藥組合物可包含其他成份，如醫藥級的甘露醇(mannitol)、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂(magnesium stearate)、糖精鈉(sodium saccharin)、滑石(talcum)、半纖維素(cellulose)、葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、鎂(magnesium)、碳酸酯(carbonate)等。醫藥組合物可包含醫藥上可接受之輔助物質需接近生理條件如pH質調整及緩衝液、毒性調節劑等，如醋酸鈉(sodium acetate)、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉(sodium lactate)、氯化氫、硫酸鹽、溶劑化物(如混合離子鹽、水、有機物)、水合物(如水)等等。

舉例來說，醫藥組合物可包含為水溶液、粉末、顆粒、錠劑、藥丸、栓劑、膠囊、懸浮液等劑型。醫藥組合物可依據下述不同投藥途徑而被塑形。

其中，蛋白係以注射方式(如皮下注射、腹腔注射及/或靜脈注射)進行投藥於一組織，所提供之一形式係為一現成可使用(ready-to-use)的劑型、或非液體形態(如一可復水並可穩定儲存的粉末)或液體形態，如液態組成的醫藥上可接受之載劑及賦形劑。另外，也可提供含單離胜肽的劑型以增長投藥後單離胜肽引發之血清半衰期。舉例來說，B細胞抗原決定區胜肽係可以一微脂體形式、製成膠體或其他用以延長血清半衰期的習知技術來被提供。已有多種方法用以製備微脂體，如Szoka et al. 1980 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467,U.S. Pat. Nos. 4235871,4501728及4837028中所述。製備形式也可以係以在控制在釋放或緩慢釋放的形式被提供。聚合物也可提供用以延長半衰期。如聚乙烯多元醇(polyethylene polyol)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚氧乙烯山梨醇(polyoxyethylene Sorbitol)、聚氧乙烯葡萄糖(polyoxyethylene glucose)等。

其他適用於非腸胃途徑的投藥劑型中包含等張無菌注射液、抗氧化劑、制菌劑(bacteriostats)，以及幫助欲使用之賦形劑、懸浮劑、增溶劑、增黏劑、安定劑以及防腐劑等與血液形成等張的溶質於劑型中。劑型可以單一劑量或多劑量並置於密封容器如安瓶或藥瓶中的形式呈現，且可以冷凍乾燥(凍乾)狀態保存，當需要使用前以無菌的液態賦形劑如注射用的水立即添加即可。臨時注射液(extemporaneous injection solution)及懸浮液可自先前所描述之各種無菌粉末、顆粒及錠劑製得。

本發明所提供之B細胞抗原決定區胜肽或單株抗體在一劑型中的濃度非常廣泛(如從小於0.1%、通常係為或至少2%至高達20%與50%之間或更高之重量百分比)，且通常係主要基於液體體積、黏性及配合所選擇投藥的特殊模式及病人所需之患者因素來決定其濃度。

施用於體內投藥之B細胞抗原決定區胜肽或單株抗體組合物必須係為無菌的。因此在冷凍乾燥及復水(reconstitution)之前或之後以一過濾膜進行過濾。一般情況下，B細胞抗原決定區胜肽係可以冷凍乾燥形式或溶液形式進行儲存。治療胜肽醫藥組合物一般係置於一具有無菌出入孔之容器，例如，一靜脈注射溶液帶或藥瓶具有一可由皮下注射針頭穿刺的塞子。

本發明之B細胞抗原決定區胜肽的醫藥組合物之劑型，其可用以儲存的製備方式是將具有所需純度之B細胞抗原決定區胜肽或單株抗體與選擇性生理可接受之載劑、賦形劑、或安定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences,supra)混合製成冷凍乾燥塊或液態溶液。可接受之載劑、賦形劑、或安定劑在所提供之劑量及濃度下係對於接受者不具毒性，且包含緩衝溶液如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包含血清白蛋白、胺基酸如甘胺酸(glycine)、麩胺酸(glutamine)、天冬醯胺酸(asparagine)、精胺酸(arginine)或賴胺酸(lysine)；單醣、雙醣及其他碳水化合物含葡萄糖、甘露醣(mannose)、或糊精(dextrin)；螯合劑如EDTA；醣醇(sugar alcohol)如甘露醇(mannitol)或山黎醇(sorbitol)；鹽形成相對離子(salt-forming counter ion)如鈉；及/或非離子型介面活性劑如Tween、Pluronics或聚乙烯二醇(PEG)。

本發明另提供利用B細胞抗原決定區胜肽來治療或處理登革病毒感染所引起的併發症之方法。此方法係也可利用B細胞抗原決定區胜肽引發對登革病毒之NS1的低反應(hyporesponsiveness)或免疫容忍(immunological tolerance)。

本發明之方法係關於將本發明之B細胞抗原決定區胜肽對一受試者進行投藥，受試者係為已受登革病毒感染、受登革病毒感染當中、或易受登革病毒感染者。本發明所揭露之方法係包含將投藥於一個體，以給予本發明之有效劑量之B細胞抗原決定區胜肽進行投藥(如皮下注射或靜脈注射)以治療由登革病毒所引起之症狀，包含登革出血熱、或登革休克症候群(DHF/DSS)(預防兩者或診斷後治療)。

本發明在此接受治療或診斷之受試者係具有、疑似具有、或處於引發DHF/DSS的危險下者。「治療」意指至少將使患者不適之症狀得到改善，其中，改善係指至少將一參數的程度降低，如症狀，其係與被治療之症狀相關。如此，治療係包含情況或至少與治療相關的症狀的狀態均獲得減輕或避免。

在本發明所揭露之方法中，在此所描述之一有效劑量B細胞抗原決定區胜肽或單株抗體可被用以投藥於一受試者(如一人類患者)作為單獨治療或結合其他類型之治療。治療的效果可為減輕與DHF/DSS相關之症狀及包含如血流中血小板數增加、減緩出血、減少補體活化、減少免疫細胞活化、降低細胞激素產生及/或減緩血管滲漏。

本發明之一治療之食物療法(regimen)可包含一「免疫調控治療食物療法(immunomodulatory treatment regimen)」包含將一有效劑量之一試劑(如本發明之B細胞抗原決定區胜肽或抗發炎試劑)對一個體進行投藥，試劑係減輕對於個體中的人類LYRIC的自體免疫反應。用以治療DHF/DSS的免疫調控治療食物療法係包含任何單獨治療或結合其他調控一個體中之免疫反應之治療，以降低對於人類LYRIC之自體免疫反應。

大致上，方法牽涉對一有需要之個體進行共同投藥(co-administering)，其醫藥劑型係包含一種以上有效量之本發明之B細胞抗原決定區胜肽，以吸收由DHF/DSS所引起的自體抗體。自體抗體被本發明之B細胞抗原決定區胜肽吸收，可以降低會導致DHF/DSS發生之免疫反應，並且可以增強對於表現內皮細胞上的LYRIC之免疫容忍。

關於B細胞抗原決定區胜肽的投藥途徑係如同已知之方法。非腸胃道之投藥途徑包含但不限於皮下、肌肉、靜脈、動脈以及腹腔投藥，或如上所述持續釋放的系統。本發明之B細胞抗原決定區胜肽治療上的有效量也可被運輸至全身系統或局部。局部的運輸係將B細胞抗原決定區胜肽直接提供在受損部位，此為標的性方法來減緩與DHF/DSS相關的症狀。關於運輸的例子包含但不限於透過導引裝置的使用來投藥、透過一導管投藥(選擇性地與一滲透幫浦連接)、直接在受損部位或受傷組織附近注射、局部補給注射等。習知已有蛋白質投藥療法，在熟知本領域之技術者均可以此項投藥療法應用於治療胜肽之組合物、劑型及本發明在此所描述之方法的實行運輸。

關於本發明之B細胞抗原決定區胜肽治療上之有效劑量主要係依據如投藥途徑患者之病況。因此，為達最佳之治療效果，劑量的定量及修正投藥途徑對於治療專家係為必要的。一般來說，臨床醫生係投藥治療B細胞抗原決定區胜肽直到達到所預期之效果之一劑量。此劑量係較佳地低於對患者產生毒性或使患者對感染產生高度感受性之劑量。此種治療的進展可藉由習知的分析方法輕易偵測，並且係受被處理的適應症影響。

在部份實施例中，一B細胞抗原決定區胜肽之一有效量係為具有作用之劑量，當投以一種劑量以上的B細胞抗原決定區胜肽可相對於未處理此B細胞抗原決定區胜肽的個體，其所降低係至少約10%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、或大於80%的自體抗體量。

在部份實施例中，方法係關於將一有效量之本發明之單株抗體投藥於一有需要之個體。如上所述，抗體係對於登革病毒之NS1及人類LYRIC上所具有之一抗原決定區係具有專一性。如同上述投藥本發明之B細胞抗原決定區胜肽，抗體係可以一種劑量以上進行投藥。在部份實施例中，本發明之相關方法係關於將本發明之單株抗體、或包含附有一免疫調節劑(如抗發炎試劑)之抗體進行投藥。本發明之單株抗體係如上所述之B細胞抗原決定區胜肽，可於結合一種以上之醫藥上可接受之載劑被投藥。

在部份實施例中，一抗體之一有效劑量係為具有作用之劑量，當投以一種劑量以上的抗體可相對於未處理此B細胞抗原決定區胜肽的個體，其所減輕該個體DHF/DSS的症狀係至少約10%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、或大於80%。

本發明也同時提供套組，套組係包含如上所述之醫藥組合物中之B細胞抗原決定區胜肽及/或單株抗體，並立即可供治療及檢測方法使用。套組可包含一種以上在本發明中所揭露之B細胞抗原決定區胜肽並裝於一無菌容器中，並且可以一劑型被提供，劑型中有一適當之醫藥上可接受之賦形劑可投藥於受試者。B細胞抗原決定區胜肽係可伴隨一劑型被提供，當劑型復水後可具有欲提供之濃度使劑型可立即被使用。例如，在一套組中的B細胞抗原決定區胜肽組合物可係為能立即用於注射之一劑型，並具有一特定劑量。B細胞抗原決定區胜肽係能經使用者將其復水後而被提供，套組中也提供緩衝液、醫藥上可接受之賦形劑等，並與本發明之蛋白分開包裝。本發明之套組中之蛋白可與其他藥物結合另行製成一劑型。

用於檢測之套組，其中包含了本發明之單株抗體作為鑑定本發明LYRIC陽性細胞的染色試劑。抗體係可被標記可被偵測的標籤(label)。同樣地，B細胞抗原決定區胜肽係也被提供於套組中用於診斷。在特定例個案中，套組係包含固定在一固體的支撐件上的單離胜肽以及能與一抗體結合之一標籤試劑。

套組可包含管子、緩衝液等以及使用指南。舉例來說，套組中可提供用於辨認抗體(如人類IgG)之二級抗體。標記，係指除非所附上之特別描述或紀錄之材料，否則標記係伴隨在套組製程、運送、販售或使用中的任何時間進行。例如，標記一詞係包含廣告頁及小手冊、包裝材料、使用手冊、影音資料、光碟以及直接印在套組上。

本發明可利用如上所述之B細胞抗原決定區胜肽及/或單株抗體以及其醫藥組合物所製成之一試劑用於檢測及/或預後登革病毒的感染及/或對於DHF/DSS之感受性。此方法係可用以決定症狀嚴重程度、疾病感染的時期以及易受與DHF/DSS相關之自體抗體影響之組織。

本發明之一種檢測登革熱之方法，與一生物樣本配合，方法包含將該生物樣本與如上述之單株抗體接觸，並偵測與生物樣本結合的該抗體。抗體可被用以檢測細胞及生物樣本的表現型，並可作為篩選表現LYRIC的細胞族群。能藉由單株抗體篩選表現LYRIC的細胞族群之多種技術係能被使用，包含利用抗體附著磁珠(antibody-coated magnetic beads)之磁性分離、利用一抗體附著於一基材(如平板)與目標物結合(panning)以及流式細胞儀(參見如美國專利No.5985660；及Morrison et al. Cell,96:737-49)。這些技術係可用於篩選特殊族群之細胞；以免疫組織化學分析法分析活組織切片樣本；偵測LYRIC之表現。若受登革病毒的感染，LYRIC的高度表現可作為一受試者易引發DHF/DSS的指標。

除本發明之單株抗體外，本發明之一種檢測登革熱之方法，本發明之B細胞抗原決定區胜肽係可被用於檢測方法。本發明之B細胞抗原決定區胜肽可被用以偵測自體抗體的表現及其量。與本發明之B細胞抗原決定區胜肽相結合之抗體的表現係作為一受試者引發DHF/DSS或易引發DHF/DSS相關的症狀之指標。由於這些抗體係也能與登革病毒之NS1結合，因此係可用以表示受試者正受登革病毒感染或已受登革病毒之感染。

本方法係也可便於一受試者預後的判斷以及評估受試者對於治療的反應。本發明之偵測方法係可被用於體外或體內、分離的細胞上、或於整個組織或一體液中，如血液、淋巴結之組織切片樣本等。一自體抗體量相較於治療前有明顯降低可表示為對於減輕DHF/DSS相關的症狀之治療係為有效的。

藉由提供患者對於DHF/DSS的感受性及登革病毒的感染等相關資訊，本發明之方法可使治療達到最佳化，如選擇一適當之治療、劑量、處理形式等。本方法係使用於預防、治療、偵測或研究登革病毒感染之領域。

用於本發明之方法的臨床生物樣本係可來自各種來源，特別係活組織切片樣本，雖然在一些例子中，如血液、骨髓、淋巴液、腦脊髓液(cerebrospinal fluid)、滑液(synovial fluid)等樣本也可被使用。這些樣本可在分析前透過離心、滔析(elutriation)、密度梯度分離、血漿分離置換法(apheresis)、親和性篩選、與目標物結合(panning)、流式細胞儀(FACS)、以Hypaque進行離心等方法分離。一旦取得樣本後，其可直接使用、冷凍、或短時間內保存於一適當地培養基。各種培養基可被用以維持細胞。樣本可以各種方便的流程取得，如抽血、靜脈穿刺(venipuncture)、活組織切片等。通常一樣本中係至少包含約102個細胞，較常係至少包含約10³ 個細胞，且最佳係104、105或更多細胞數。基本上，生物樣本係取自於人類，雖然動物模式如馬、牛、豬、犬、貓、囓齒類動物如小鼠、大鼠、倉鼠、靈長類動物等係也被採用。在部份實施例中，用於分析之一樣本係取自於經診斷之受試者身上完整的活細胞。

關於細胞染色的分析係採用習知技術。可提供準確計數之技術包含螢光活化細胞分類器(sorter)，其具廣泛複雜度，如多個顏色通道、低角度及鈍光散射偵測通道(obtuse light scattering detecting channels)、阻抗通道(impedence channel)等。細胞可以透過染料(如碘化丙啶(propidium iodide))用於死細胞來作為排除死細胞之細胞篩選。被染色之細胞也可利用顯微鏡來進行偵測。

樣本中LYRIC、登革病毒之NS1或抗LYRIC之自體抗體的產生係可藉由孔盤上進行結合分析來偵測。一種孔盤方法係被使用，一微量孔盤的孔洞係覆蓋(coated)一具LYRIC專一性之抗體(如DB16-1)或本發明之用於偵測自體抗體之B細胞抗原決定區胜肽。含有或疑似具有感興趣的抗原之一生物樣本，接著加到已覆蓋的孔洞中。培養一段時間，使抗體結合後，清洗孔盤孔洞以移除位結合的部份並加入可被偵測的二級結合分子。二級結合分子係能與任一被結合的抗原進行反應，接著再進行清洗，用於偵測二級分子結合與否的方法係為本技術領域所熟知。含有細胞之樣本也可利用西方墨點法(Western blot)或免疫沉澱法(immunoprecipitation)進行偵測。

偵測方法係可以原位雜合(in situ)或於溶液中進行。一適當的溶液係可用於分散或懸浮細胞樣本。該溶液一般情況下係為一平衡鹽類溶液，如正常的生理食鹽水、磷酸緩衝液、漢克平衡鹽緩衝液(Hank's balanced salt solution)等，方便補充的胎牛血清或其他天然因子，與一可接受之緩衝液在低濃度下合併，大致上係從5-25 mM。便利型的緩衝液包含HEPES、磷酸緩衝液、乳酸緩衝液等。

抗體及B細胞抗原決定區胜肽係用於檢測方法中，單株抗體及B細胞抗原決定區胜肽係可被直接或間接地被標記上可被偵測之標籤(label)。標籤包含放射同位素(如¹²⁵ I、³⁵ S、¹¹¹ Tc等)；可產生具有訊號功能之酵素(如螢光酵素(luciferase)、β-半乳糖酶(β-galactosidase)、辣根過氧化氫酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)等)；螢光標籤(如螢光劑(fluorescein isothiocynate)、玫瑰紅(rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)等)；螢光發射金屬(fluorescenceemitting metals)如¹²⁵ Eu及其他鑭系元素(lanthanide series)；化學發光化合物(chemiluminescent compounds)如螢光素(luciferin)、螢光蛋白等。間接的標記包括對本發明之單離抗體具有專一性之二級抗體，其中，二級抗體係如上所述係被標記的；以及專一性結合對(binding pair)成員如生物素-抗生物素(biotin-avidin)等。標籤可以係共價或非共價地被附著(如透過金屬螯合基如EDTA)。

被接合的標籤可被用於分離之用途。這些標籤包含可直接分離之磁珠、生物素，期可藉由被連結在一支撐件上的抗生物素(avidin)及鏈抗生物素(streptavidin)來移除。

關於本發明之單株抗體的一用途，舉一例說明，抗體係加至一細胞懸浮液，並培養一段時間始足以能與LYRIC之有效的抗原決定區相結合。此方法可被用於偵測具表現LYRIC的細胞。培養時間可以從約5分鐘至約30分鐘甚至更長。再反應混合液中的抗體最好係具有一充足的濃度，以使分離的效率不會因缺乏抗體而受限。適當的濃度係可透過滴定(titration)來決定。被分離的細胞所處的培養基可以是任何用以維持細胞活性之培養基。一較佳之培養基係為含有0.1至0.5%BSA之磷酸緩衝鹽類。已有多種市售之培養基，且這些培養基可依據細胞特性來使用，如Dulbecco’s改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)、漢克氏基礎鹽溶液(Hank’s Basic Salt Solution,HBSS)、Dulbecco’s磷酸緩衝鹽(Dulbecco’s phosphate buffered saline,DPBS)、RPMI培養基(Rosewell Park Memorial Institute,RPMI)、Iscove’s培養基(Iscove’s Medium)以及含有5mM之PBS等，可常以胎牛血清、BSA、HAS等補充於培養基中。被標記的細胞係接著根據細胞表面表現聚羟基丁酯(PHB)來進行定量。

在本發明之方法中，患者的樣本係與一控制組或一標準參考值相比。在另一實施例中，患者的樣本係與一從未受到登革病毒感染的個體中所取得之樣本相比，或是與一個以上在病程中不同時間點所取得的樣本相比。

所獲得的訊息對於預後及診斷是有用的，包含對於DHF/DSS的感受性、對於加速引發登革病毒感染之相關症狀、對於感染及重複感染後之反應狀態、及/或經藥物治療或其他形式的療法之反應。

本發明所揭露之B細胞抗原決定區胜肽及DB16-1抗體，其相關之基因產物(如多胜肽、mRNA、或cDNA)、或其細胞的表現均對於體內及體外用於篩選對於有效診斷及治療登革病毒的因子及試劑(如抗體)是有用的。這些篩選方法可用於實驗、診斷、及/或治療用途。

本發明之方法亦包含利用一抗體用以鑑定具有與登革病毒之NS1有相同抗原決定區的受試者之細胞。

本發明之單株抗體的一用途，係可作為提供一種偵測人類LYRIC蛋白的方法，包含將含一生物樣本與本發明之單株抗體接觸並透過上述之偵測方法偵測與生物樣本結合的抗體。其中，生物樣本之取得來源及形式係如上所述。舉例來說，抗體可被用以鑑定表現LYRIC細胞，以增加對於DHF/DSS的瞭解。本發明之B細胞抗原決定區胜肽也可被用於進一步篩選及發現其他對於同時存在LYRIC及NS1上的一抗原決定區具有專一性之抗體。抗體可用於進行沈澱或結合所對應的細胞中天然蛋白質(native protein)或組織的準備或在一體外表現系統的無細胞萃取物(cell-free extract)中的天然蛋白質。

當中感興趣的係為試劑的篩選，該試劑係具有能使表面表現高量LYRIC的細胞免於受到自體抗體及自體免疫的攻擊。對於這項目的已有多種分析方法被使用，包含分析自體抗體產生之免疫分析；判斷免疫反應(如對一抗原具有專一性之自體抗體產生量、抗原專一性的T細胞表現量、發炎、T細胞如CD₄ ⁺ 反應CD₈ ⁺ 反應的偵測)。這些方法已為本技術領域所熟知。

用於篩選具生物活性之試劑或免疫調節藥物等之篩選方法，係可利用動物模式或細胞培養。用於篩選的方法之細胞係可為新鮮分離的、培養、基因上改變的細胞等。細胞可為細胞株培養之環境引發的變異細胞：如分成獨立培養並在個別的情況下生長如含或不含藥物、有或沒有細胞激素或其綜合。細胞對一試劑特別係一醫藥試劑的方法包含反應的時間，對於細胞之生理狀態的反應式重要的。

所適用的動物模式可含有具有LYRIC的細胞、暴露在NS1、被一登革病毒所感染、受登革病毒感染超過一次、或其中任何組合者。將一種以上之試劑用以對動物處理，再評估試劑的效用。或也可評估經一試劑結合一已知的免疫調節劑處理後之效用。

被評估的效用係包含但不限於：補體活化、免疫功能、免疫細胞活化、細胞激素的產生、其他與免疫系統相關的基因表現、血管滲漏、與登革病毒感染相關之症狀、抗LYRIC自體抗體的表現量等。被選用的試劑用以進一步研究或用於本發明所揭露之治療或診斷/預後之方法，其係包含那些特別能減緩DHF/DSS相關的症狀(如減緩抗LYRIC的自體抗體之表現量)之試劑。

大部分參數將提供一定量讀出數據，在一些例子中係為半定量或定量之結果。讀出數據可為一單一測定數值、或可包含平均值、中間值或變異值等。參數讀出數值的範圍係來自於同一分析中之重複性測試所獲得之一參數。變異係可預期的並且透過用於提供單一數值的一般標準統計方法可獲得一組測試參數之範圍。

本說明書中所引用之各文獻將全文納入本說明書中作為參考文獻。

必須說明的是，本發明係不限於本說明書中所述之特定之方法、步驟流程、細胞株、動物物種、或屬以及試劑。同時，也必須說明的是，本發明所述之名詞僅用於描述特定實施例，並非用於限制本發明之專利範圍。

在本說明書中所描述之「一」、「以及」以及「該」除非本說明書中有特別說明否則係包含複數的所指對象。因此，舉例來說，「一細胞」係包含複數此種類之細胞，且「該培養」意指一種以上之培養且本技術領域所熟知之培養等。本說明書中所有技術及科學用詞除非本說明書中有特別說明，否則係等同於本發明所屬之技術領域中所熟知之詞彙。

以下，將以數個實驗例具體說明本發明的內容。

首先針對實驗例中所使用之材料及方法詳細說明。

細胞及病毒

在白線斑蚊(Aedes albopictus)細胞株C6/36細胞中繼代該四種血清型的登革病毒，即DV-1(夏威夷(Hawaii))、DV-2(新幾內亞(New Guinea C))、DV-3(H87)及DV-4(H241)。該C6/36細胞係生長於在一28℃的培養箔中之50%的Mitsuhashi-Maramorosch昆蟲培養基(MMIM)加上含有10%胎牛血清(FBS,GIBCO,CA,USA)之50%的Dulbecco’s最低必需培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium,DMEM)(GIBCO,CA,USA)中。該等病毒的滴定量係利用培養於含有10%FBS之MEM培養基(GIBCO,CA,USA)中的BHK-21細胞，以溶菌斑檢定來測定。人類臍血管內皮細胞(HUVECs)(LONZA,Walkersville,MD)並使其生長於EGM-2培養基(LONZA,Walkersville,MD)中。

免疫組織化學

HUVECS係在蓋玻片上培養至約群集80%(80%confluence)。該等蓋玻片係以磷酸鹽緩衝液(PBS)淋洗，以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定，並利用3%過氧化氫(hydrogen peroxide)處理以抑制內生性過氧化氫酶(peroxidase)活性，再用正常人類血清(normal human serum,NHS)、DF或DHF患者的血清在室溫(RT)下培養1小時(Lin et al.,2003)。在以含有0.1% Tween 20之磷酸鹽緩衝液(PBST_0.1 )清洗後，將該等蓋玻片用山葵過氧化氫酶連結抗老鼠免疫球蛋白G(HRP-conjugated anti-mouse IgG,Jackson ImmunoResearch,PA,USA)在室溫下培養1小時。在最後的沖洗之後，使用含有0.03%H₂ O₂ 、pH 7.4之在50mM三(羥甲基)胺基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)中的0.02%二胺基聯苯胺(diaminobenzidineDAB)作為顯色劑來顯現過氧化氫酶的活性。

酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)

HUVECs係生長於96孔盤上，以4%三聚甲醛固定，並利用PBS(阻斷緩衝液(blocking buffer))中的1%牛血清蛋白(BSA)阻斷。將經稀釋之抗登革病毒的NS1或抗登革病毒顆粒的老鼠血清與HUVECs在室溫下培養1小時。該等孔盤係以PBST-_0.1 清洗並以山葵過氧化氫酶連結抗老鼠免疫球蛋白G(HRP-conjugated anti-mouse IgG,Jackson ImmunoResearch,PA,USA)在室溫下培養1小時。在用PBST_0.1 清洗後，將該等孔盤用過氧化氫酶受質磷苯二胺二鹽酸鹽(o-phenelenediamine dihydrochloride,OPD,Sigma-Aldrich,St. Louis,MO)。該反應係以3N HCl中止，且該等孔盤係利用一微孔盤讀取器在波長490 nm下進行偵測。

抗 重組的DV-2 NS1及人類LYRIC之單株抗體

抗重組DV-2 NS1(D2NS1)及人類LYRIC之單株抗體的製造係採用一經稍微改良(Wu et al.,2003)之標準程序(Kohler and Milstein,1975)。簡言之，利用經純化之D2NS1或LYRIC腹腔注射到雌性BALB/c老鼠體內引發免疫反應，共進行4次，間隔時間為3週。在最後一次注射後第4天，自經免疫之老鼠脾臟取得淋巴細胞，並藉由50%聚乙二醇(polyethylene glycol,GIBCO,CA,USA)與NSI/1-Ag4-1骨髓瘤細胞(myeloma cells)融合。使融合細胞懸浮於含有20%胎牛血清(FCS)、次黃嘌呤-胺蝶呤-胸腺嘧啶(hypoxanthine-aminopterin-thymidine,HAT)及融合瘤複製因子(hybridoma cloning factor,ICN Biomedicals,Aurora,OH)之DMEM中。為了確認由融合瘤所產生之抗體的專一性，將經培養之融合瘤上清液與經DV-2病毒感染之C6/36細胞進行培養，或將純化的LYRIC(1 μg/ml)蛋白溶於如上以ELISA為標題之段落所述之0.1M之pH8.6的NaHCO₃ (被覆緩衝液)中進行覆蓋。融合瘤細胞株係生長於含有10%FCS之DMEM中。自經預免疫(pristine-primed)BALB/c老鼠所產生之腹水中，利用蛋白G瓊脂糖凝膠4G膠體(protein G Sepharose 4G gel,GE Healthcare Biosciences,Pittsburgh,PA)純化出單株抗體。

免疫螢光分析法

HUVECs係生長於蓋玻片上，再以PBS淋洗並以4%三聚甲醛固定，隨後與老鼠抗-NS1超免疫血清(hyper-immune sera)、DB16-1、4G2抗體及正常老鼠血清(NMS)或正常老鼠IgG(NMIgG)在室溫下培養1小時。蓋玻片接著與以螢光異硫氰酸酯(FITC)標記之抗老鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)在室溫下培養30分鐘。在此欲證明DB16-1與人類內皮細胞交叉反應。為此，切取4 μm肺癌組織切片，在二甲苯(xylene)中脫蠟，在降梯度酒精中淋洗(hydrated in descending alcohol)，並以PBS淋洗。在一壓力鍋中使切片與0.01M、pH 6.0之檸檬酸鹽緩衝液(citrate buffer)沸騰5分鐘以恢復抗原性(antigenicity)。在以PBS淋洗後，在室溫下將該切片與DB16-1及經生物素化(biotinylated)之刺金雀花凝集素-1(ulex europaeus agglutinin-1,UEA-1,Vector Laboratories,Burlingame,CA)培養1小時。在室溫下以藻紅素(phycoerythrinPE)標記之抗老鼠IgG(anti-mouse IgG,Jackson ImmunoResearch)及經FITC標記之鏈抗生物素(streptavidin)(Thermo Scientific,Waltham,Massachusetts)處理該切片30分鐘。將該載物片以含有H33258(Molecular probe,OR USA)之封固劑(mounting medium)進行複染，並在螢光顯微鏡下分析。

西方墨點法

將以DV-1-、DV-2-、DV-3-及DV-4-感染的C6/36細胞溶菌液所製備的蛋白質萃取物與一等體積之含有5% β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol,Bio-Rad,Hercules,CA)的Laemmli樣本緩衝液(Bio-Rad,Hercules,CA)混合，再利用SDS-PAGE分離並轉移至硝化纖維(nitrocellulose,NC)膜(Millipore,Billerica,MA)上。該膜係在PBS中以5%脫脂牛奶阻斷，再與DB16-1進行培養。為了辨識DB16-1的抗原決定區(epitope)，該NC膜係與DB16-1及不同濃度的SP16-1(LKYSWKTWGKAK,與D2NS1的胺基酸殘基111-122相符合)或控制組胜肽(control peptide)P7M(SHRLHNTMPSES)(Wu et al.,2003)進行培養。為了確認該抗-LYRIC抗體的特性，單株抗體Lyric 1-7、Lyric 2-1、Lyric 3-13及Lyric 4-7係與由HUVECs及COLO 205之細胞溶菌液所製備之NC膜培養，其中COLO 205係一過度表現(overexpressing)LYRIC之大腸癌細胞株。以DB16-1及抗-異黏蛋白(anti-metadherin,anti-Mid)(Zymed,San Francisco,CA)做為控制組，其中，抗-異黏蛋白(anti-Mid)係一市售的抗-LYRIC抗體。競爭性抑制分析(competitive inhibition assay)，係將單株抗體與合成胜肽SP16-1、SP-Ly(NTNGKDWGRS，與LYRIC的氨基酸殘基330-339配對)及SP5-52(SVSVGMKPSPRP)(Lee et al.,2007)進行培養。該抗-V5抗體(anti-V5,Invitrogen,Carlsbad,CA)可供含有該V5抗原決定區之重組蛋白的偵測。在以PBST_0.1 清洗後，將該墨點分析與HRP-連結抗老鼠或抗兔子IgG(Jackson ImmunoResearch)培養，並藉由增強化學螢光反應劑(ECL)(Thermo Scientific,Rockford,IL)的使用來顯影。

流式細胞儀分析

以2 mM的EDTA來分離HUVECs並以PBS沖洗之。該細胞(1×10⁵ )係在4℃下與下述抗體培養1小時：老鼠抗人類CD31(mouse anti-human CD31,BD San Jose,CA)、DB16-1、Lyric 1-7、Lyric 2-1、Lyric 3-13、Lyric 4-7抗體。該等隨後在4℃下以經PE連接抗-老鼠IgG(PE-conjugated anti-mouse IgG,Jackson ImmunoResearch)進行探測30分鐘。在最後的清洗後，在PBS中用1%之FBS懸浮(resuspend)該等細胞，並利用流動型細胞儀分析(BD San Jose,CA)。

免 疫沉澱法

利用免疫沉澱法辨識DB16-1的目標蛋白質。將HUVECs(1×10⁷ )溶解於溶解緩衝液(lysis buffer,50 mM的Tris-HCl(pH 7.4)，150 mM的NaCl，1%的NP-40)中，補充一蛋白質抑制劑混合片(protease inhibitor cocktail tablet,Roche,Indianapolis,IN)並在冰上保持30分鐘。細胞溶菌液係在4℃下以10000×g 15分鐘來離心製備。該上清液係與DB16-1培養，接著再以蛋白質G瓊脂糖凝膠(sepharose)(GE Healthcare Biosciences)析出該免疫複合物。在以PBS清洗後，以丙胺酸緩衝液(0.2M alanine,pH 2.5,150mM的NaCl，及1%的NP-40)淋洗結合至DB16-1的蛋白質，並以1M的Tris-HCl(pH 9.1)中和該洗出物(elutes)。將該洗出物以SDS-PAGE分離片段(fractionated)並與DB16-1進行免疫分析(immunoblot)。自凝膠中切取所需要的片段(band)，在37℃下，在25 mM、pH 8.5的碳酸氫銨(ammonium bicarbonate,ABC)中以50mM的二硫赤蘚糖醇(dithioerythreitol，DTE)還原1小時，再於黑暗的室溫下，在ABC中以100mM的碘乙醯胺(iodoacetamide,IAA)烷化(alkylated)1小時。在ABC中以50%乙腈(acetonitrile)清洗後，將該凝膠浸泡於100%乙腈中，並與0.02 μg胰蛋白酶(trypsin)在37℃下培養16小時。在5%的TFA以50%乙腈來萃取該經分解之胜肽，並以一濃縮器(Concentrator,Eppendorf,Hamburg,Germany)濃縮之。以LC-MS/MS定序來分析該樣本，該LC-MS/MS係位於中研院的蛋白質體學暨結構生物學研究核心設施內(the Core Facility for Proteomics and Structural Biology Research at Academic Sinica)。

共同免疫沉澱及免疫轉印法

藉由共同免疫沉澱及免疫轉印法來偵測LYRIC。HUVEC或COLO 205細胞溶菌液係在4℃下與抗-異黏蛋白(2 μg/ml)及DB16-1(5μg/ml)免疫共沉澱1小時。該免疫複合物隨後與蛋白質G瓊脂糖凝膠(GE Healthcare Biosciences)偶合。樣本係以抗-異黏蛋白(Zymed)及DB16-1抗體，採用與標題「西方墨點法」下所述相同的程序來進行西方墨點分析。

噬菌體展示篩選(biopanning)

該ELISA孔盤係在室溫下，在覆蓋緩衝液(coating buffer)中以100 μg/ml的DB16-1覆蓋2小時，並在4℃下用阻斷緩衝液(blocking buffer)進行阻斷至隔夜。將一噬菌體展示胜肽庫稀釋成4×10¹⁰ 噬菌體，並在室溫下與該經抗體覆蓋之孔盤培養50分鐘。在以PBST_0.5 清洗後，以0.2 M甘胺酸(pH 2.2)洗提結合的噬菌體。以1M的Tris-HCl(pH 9.1)中和該洗出物。將該經洗提之噬菌體在ER2738(New England Biolabs,Inc. MA,USA)培養液中放大進行至隔夜，該培養液係在37℃下劇烈震盪4.5小時。在4℃下，在2.5 M的NaCl中以20%聚乙二醇8000(polyethylene glycol-8000)(PEG/NaCl)沉澱經放大的噬菌體進行至隔夜。該噬菌體係在4℃下以8000×g離心20分鐘，並用PBS懸浮。將噬菌體以PEG/NaCl再沉澱，並藉由在4℃下離心10分鐘來離析，且在PBS中懸浮。在LB/IPTG/X-Gal培養盤上滴定經放大之噬菌體。第二輪除了加入自先前所放大之噬菌體的2×10¹¹ 溶菌斑形成單元(plaque forming unit,pfu)之外係與第一輪相同。而第三輪的篩選係再次以2×10¹¹ pfu之第二輪所放大的噬菌體來操作。在LB/IPTG/X-Gal盤上定量第三輪所洗提之噬菌體並為ELISA作選擇。

免疫陽性噬菌體株之辨識與定序

在室溫下，ELISA孔盤以50 μg/ml的DB16-1或NMIgG在覆蓋緩衝液中進行覆蓋2小時並以阻斷緩衝液在4℃下進行阻斷至隔夜。將該經洗提之噬菌體與經覆蓋之孔盤在室溫下培養1小時。在清洗後，採用與前述「ELISA」標題下之段落中所述相同的程序，以HRP-連接老鼠抗M13單株抗體(HRP-cinjugated mouse anti-M13 monoantibody,GE Healthcare Biosciences)進行探測。將該免疫陽性噬菌體株利用-96引子5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’進一步定序，該引子係對應於M13噬菌體之pIII基因序列。該噬菌體展示胜肽序列係以ExPASy蛋白質體學資料庫(ExPASy Proteomics Server)進行轉譯。

噬菌體結合分析法(phage binding assay)

以濃度為10 μg/ml的DB16-1覆蓋ELISA孔盤，並以阻斷緩衝液在4℃下進行阻斷至隔夜。將該等孔盤與PC16-10及控制組噬菌體HB47-1(Wu et al.,2001)培養，其中該PC16-10係由10⁹ pfu連續稀釋至10⁴ pfu，而控制組噬菌體HB47-1係由10⁹ pfu連續稀釋至0 pfu。在以PBST_0.5 清洗後，採用與前述「ELISA」標題下之段落中所述相同的程序，在室溫下將該孔盤與HRP-連接老鼠抗M13單株抗體(GE Healthcare Biosciences)培養一小時。

抗體結合及競爭性抑制分析法

為了進行結合分析，以濃度5 μg/ml來覆蓋SP16-1、SP-Ly及任意的控制組胜肽SP5-52。將DB16-1兩倍連續稀釋濃度從0.5至0.007 μg/ml用於SP16-1、三倍連續稀釋濃度從10至0.013 μg/ml係用於SP-Ly，再於室溫下培養1小時。進行競爭性抑制分析，係以濃度5 μg/ml來覆蓋SP-Ly並與DB16-1(1 μg/ml)及SP16-1或控制組L-peptide (RLLDTNRPLLPY)(Lee et al.,2004)(從50至0.05μg/ml兩倍連續稀釋)在室溫下培養一小時。該等孔盤係採用在「ELISA」段落中所描述之程序，以HRP-連接抗老鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)來進行探測。

重組DV-2 NS1與人類LYRIC蛋白的建構與表現

將全長的D2NS1(New Guinea C Strain)cDNA接到pcDNA3.1載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)。將全長的LYRIC cDNA接到載體pET151-directional TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)。利用定點突變(site-directed mutagenesis)建立D2NS1(經刪除之116至119胺基酸殘基)及LYRIC(經刪除之334至337胺基酸殘基)的刪除態。利用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)將pcDNA3.1-D2NS1及pcDNA3.1-D2NS1-d116-119質體轉染到BHK21細胞，並利用RIPA緩衝液(150 mM的NaCl、10 mM的Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM的EDTA、1% Triton X-100、0.1% SDS及1%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate))來製備細胞溶菌液。將該pET151-LYRIC及pET151-LYRIC-d334-337質體引入大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlbad,CA)中。該LYRIC蛋白質係利用1 mM之異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導表現，且利用高流速Ni瓊脂糖凝膠(Ni sepharose 6 Fast Flow)(GE Healthcare Biosciences)。按照與前述「西方墨點法」段落中所述相同之程序，以DB16-1及抗V5抗體來分析D2NS1及LYRIC蛋白質之全長及刪除態。

統計分析

在適當時利用非成對司徒頓t分布檢測統計(unpaired Student’s t test)的結果。當P<0.05時視為(統計上)有意義。

DB16-1之可變區序列的辨識

利用NuceoTrap mRNA mini Kit(Macherey-Nagel GmbH & Co. KG)從1×10⁷ 個融合瘤細胞中分離出DB16-1的mRNA。使用M-MuLV RT-PCR系統(Fermentas)來反轉錄mRNA。以一群引子組(Dubel et al.,1994;Orlandi et al.,1989;Orum et al.,1993)從該cDNA放大其可變重鏈及輕鏈片段(VH及VL)。利用Tagplus DNA聚合酶(GeneMark)以在95℃下進行30秒、55℃下進行30秒及68℃下進行30秒之條件執行30個循環的PCR。在DNA膠體萃取後，將該PCR產物複製到pGEM-T簡單TA載體(pGEM-T Easy TA vector)(Promega,Madison,WI)，並將其定序以決定該VH及VL序列。ApE軟體係被使用於定序分析。架構區(Framework region,FRs)以及互補決定區(CDRs)係以ImMunoGeneTics資料庫比對。

實驗例一：抗登革病毒NS1與人類內皮細胞有交叉反應之血清抗體

如圖1A所示，為了暸解登革出血熱及登革休克症候群(DHF/DSS)的免疫致病機制，是否在登革熱病人中血清樣品的抗登革病毒抗體能與內皮細胞反應，經由免疫組織化學技術顯示來自DV-2感染具有DF或DHF症狀的病人血清抗體的確能與人類臍血管內皮細胞(HUVECs)結合，但正常人類血清(NHS)則無與人類臍血管內皮細胞(HUVECs)結合之現象。這表示登革熱病人血清具有抗內皮細胞的自體抗體。如圖1B所示，為了更進一步鑑定抗內皮細胞的自體抗體，利用純化的NS1蛋白或登革病毒的病毒顆粒引發老鼠的超免疫血清，進行了HUVECs細胞的ELISA試驗，結果證實抗登革病毒NS1蛋白的抗體會與HUVECs結合，而抗-登革病毒的病毒顆粒抗體則沒有。如圖1C所示，藉由進行免疫螢光試驗，可進一步確認是否抗登革病毒NS1蛋白的抗體會與HUVECs反應，結果發現，經四種血清型NS1蛋白誘發的高免疫老鼠血清，能辨識出HUVECs。總而言之，抗-登革病毒NS1抗體是自發性地與內皮細胞交互反應，且為一個出血的因子。

實驗例二：單株抗體辨識登革病毒NS1以及與HUVECs和人類血管的交互反應

利用多株抗體來辨識抗內皮細胞自體抗體的標的蛋白是相當困難的，因此，發明人利用了100個以上的單株抗體並利用ELISA來篩選抗內皮細胞的自體抗體。如圖1E所示，與HUVECs具有相對高反應性的DB16-1單株抗體，能辨識來自四種登革病毒血清型的NS1蛋白。如圖1D所示，進一步利用免疫螢光法(IFA)來確認DB16-1 的反應性，結果發現此單株抗體能辨識HUVECs，而非另一個4G2單株抗體(能抗登革病毒的外套蛋白)，也非正常老鼠免疫球蛋白(NMIgG)，或是正常老鼠血清(NMS)。進一步藉由免疫螢光雙重染色來研究DB16-1能否與人體血管結合，由圖1F的b中顯示，藉由免疫螢光固定後可看出DB16-1能與在人類肺組織的樣品中的血管結合。如圖1F的c中顯示，DB16-1的標的蛋白也與內皮細胞的一標記刺金雀花凝集素-1(ulex europeus agglutinin-1,UEA-1)被共同固定於人類肺組織的血管中。

於圖1D中，藉由免疫螢光染色可知DB-16能與HUVECs結合後，進一步利用流式細胞儀來檢測DB-16的HUVEC結合活性。圖2A中右移的峰表示DB16-1結合於HUVECs，且可顯著地看出所有的HUVECs均被內皮細胞的標記CD31所辨識，但只有部分(39%)能被DB16-1所辨識。同時由圖2A和圖2B可看出，抗登革病毒E蛋白抗體，4G2，並未能與HUVECs結合。(圖中NC為有螢光標定的二級抗體但該二級抗體不能與HUVECs結合，做為實驗控制組。)

實驗例三：鑑定HUVECs上具有DB16-1的標的蛋白LYRIC

既然分子模擬是感染和自體免疫之間的主要機制之一(Di Rosa and Barnaba,1998；Wucherpfennign et al.,1995；Zhao et al.,1998)，因此也不免讓人好奇是否DB16-1標的蛋白是否表現在人類內皮細胞上。HUVECs的萃取物中的標的蛋白，係以DB-16-1進行免疫沉澱。如圖3A所示，經西方墨點法可顯示DB16-1能辨識一個分子量80 kDa的標的蛋白，於銀染色的膠體中，截取此對應的片斷。經過膠體分離後，如圖3B所示，利用LC-MS/MS分析可發現有四個胜肽序列和人類LYRIC蛋白具有相同的序列。如圖3C所示，利用DB16-1及市售的抗-LYRIC抗體(anti-Mid)進行共免疫沉澱，顯示此二種抗體能辨識HUVECs上的相同標的。也就是說，登革病毒NS1和人類LYRIC蛋白均是DB16-1的標的。

實驗例四：DB16-1和抗LYRIC抗體辨識LYRIC蛋白和HUVECs

為了確認DB16-1辨識LYRIC蛋白，將人類LYRIC蛋白進行選殖並表現，且產出抗此蛋白的單株抗體。利用ELISA及西方墨點法進行篩選，分離出四種新的抗LYRIC蛋白的單株抗體，分別是Lyric1-7、Lyric 2-1、Lyric 3-13及Lyric 4-7。此四種抗LYRIC的單株抗體、DB16-1和anti-Mid可辨識重組LYRIC蛋白(圖4A中的上排)。表現在COLO 205及HUVECs的LYRIC係能被這些抗體辨認(圖4A中的下排)。經流式細胞儀進一步確認，可表現LYRIC的HUVECs及LYRIC蛋白能被DB16-1和抗LYRIC的抗體所辨識(圖4B中的C)。(圖中NC為有螢光標定的二級抗體但該二級抗體不能與HUVECs結合，做為實驗控制組。)

上述結果顯示LYRIC是在HUVECs的細胞表面上表現，且抗登革病毒NS1的抗體能透過LYRIC來與這些細胞產生交叉反應。

實驗例五：DB16-1的B細胞抗原決定區之辨別及其特性

為了確認DB16-1與LYRIC的交叉反應機制，發明人利用噬菌體展示隨機胜肽基因庫(phage-display random peptide library)來確認DB16-1精確的抗原決定區。在經過三次的噬菌體展示的反應(phage displaybiopanning)，並經ELISA試驗後發現，由20個隨機選出的噬菌體株中有18個具有與DB16-1顯著地反應性(噬菌體株中之插入片段係如表1所列)，但是控制組的抗體NMIgG則沒有反應性(如圖5A所示)。

經過檢視並排被選取的噬菌體胜肽，發現在大多的噬菌體株中，具有共同的結合結構Lysine-x-Tryptophan-Glycine(K-x-W-G,x可代表任何胺基酸)。而且，此共同的結合結構係與四種登革病毒四種血清型的NS1之116-119胺基酸組成係相吻合的(如表中所示)。為了確認被選取噬菌體株的專一性，係將控制組的噬菌體HB47-1(Wu et al.,2001)、噬菌體PC16-10與披覆有DB16-1的ELISA孔盤進行培養，其中噬菌體PC16-10是對登革病毒NS1最具同源性的。由圖5B可知，PC16-10係與DB16-1呈現劑量依賴性的專一結合，但是控制組的噬菌體則無。合成的胜肽SP16-1(LRYSWKTWGKAK)係對應D2NS1的第111-122個胺基酸序列，且SP16-1係呈現劑量依賴的模式與DB16-1相結合。相反地，如圖5C所示，DB16-1則未與控制組胜肽SP5-52結合。控制組的抗體NMIgG並未結合至SP16-1及SP5-52(如圖5D所示)。再者，胜肽競爭試驗指出DB16-1結合至D2NS1蛋白的結合活性，是被SP16-1以劑量依賴模式被競爭抑制。而控制組胜肽P7M對於DB16-1的結合活性則不具抑制作用(如圖5E所示)。也就是說，DB16-1能辨識的抗原決定區係對應到登革病毒NS1第111至122個胺基酸序列。

實驗例六：登革病毒NS1蛋白及LYRIC蛋白對DB16-1具有相同的的結合結構

如圖6所示，將登革NS1與LYRIC蛋白的胺基酸序列進行比較後，係發現有一K-x-W-G序列可對應至人類LYRIC上334至337胺基酸序列。為了確認K-x-W-G的結合結構對於結合至DB16-1是否重要，故進行了胜肽結合試驗。合成的胜肽SP-Ly(NTNGKDWGRS)對應人類LYRIC蛋白的330至339胺基酸序列，DB16-1呈現劑量依賴地關係辨認此區(如圖6B)，而與合成的胜肽SP-Ly相同濃度的控制組的SP5-52胜肽則並沒有與DB16-1結合。再者，於胜肽競爭抑制試驗中則顯示，SP16-1以劑量依賴的形式抑制SP-Ly胜肽和DB16-1之間的結合活性(如圖6C)，但控制組的胜肽則沒有此現象。西方墨點分析中也顯示，SP16-1能以劑量依賴的形式，抑制DB16-1結合至HUVECs及COLO205細胞，但控制組的胜肽SP5-52則無此現象(如圖6D)。為了確認K-x-W-G結合結構對DB16-1結合至登革NS1和LYRIC蛋白是重要的，發明人表現了D2NS1和LYRIC的刪除態變異型(deleted mtants)，其不具有K-x-W-G結合結構。經西方墨點法分析這些重組蛋白，顯示DB16-1能辨識D2NS1(如圖6E)和LYRIC蛋白(如圖6F)。然而，當在D2NS1或LYRIC蛋白中的K-x-W-G結合結構被刪除後，DB16-1並無法辨識這些蛋白。再者，截斷型(truncated)LYRIC 1-340(第1-340個胺基酸殘基)蛋白含有K-x-W-G結合結構可被DB16-1辨識，而截斷型LYRIC 1-333(第1-333個胺基酸)蛋白不具有K-x-W-G結合結構，則不會被DB16-1辨識(如圖6F)。上述結果強烈地顯示在登革病毒NS1上的K-x-W-G共同結合結構，能分子上相似於人類LYRIC蛋白，且能被自體抗體DB16-1所辨識。

綜上所述，本發明所分離出與登革病毒相關之一種B細胞抗原決定區胜肽其序列包含Lys-x-Trp-Gly，係與登革病毒之NS1具有相同之抗原結合區，能為本發明之單株抗體DB16-1專一性地辨認。因此，本發明以B細胞抗原決定區胜肽及單株抗體作為醫藥組合物，B細胞抗原決定區胜肽能與患者體內之自體抗體相結合，使自體的標的蛋白免於受到自體抗體的攻擊，或者，利用單株抗體與NS1專一性結合特性，去除病毒的NS1，進而達到減緩症狀之治療功效。另外，透過B細胞抗原決定區胜肽及單株抗體兩者之特性，可專一性地辨認生物樣本中的自體抗體量或登革病毒NS1的含量以檢測患者是否有受到登革病毒感染的目的，依據治療後檢測結果與治療前相比，可作為預後之用途，再者，單株抗體更能應用於生物技術中，作為鑑定可表現特定標的蛋白的生物樣本之用途。因此，本發明所提供之關於登革病毒相關之胜肽及抗體可應用於治療、診斷、偵測、預後、分析等用途中。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

<120> 與登革病毒相關之胜肽及抗體以及其用途

<160> 27

<150> US 61/398,181

<151> 2010-06-21

<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<400> 25

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

圖1係為抗-登革病毒的NS1抗體與HUVECs及人類血管交叉反應：A：取自受DV-2感染引發登革熱(DF)的病人血清抗體(b)及引發登革出血熱(DHF)的病人血清抗體(c)透過免疫組織化學染色法與HUVECs結合。正常人類血清(NHS)(a)係作為負控制組；B：以ELISA方法顯示抗-登革病毒的NS1抗體係與HUVECs交叉反應，而抗-登革病毒顆粒抗體則無；C：透過免疫螢光法，由四種血清型的登革病毒NS1蛋白誘發之抗-NS1的超免疫血清含有可與HUVECs結合的抗體；E：四種血清型的登革病毒NS1可藉由西方墨點法被單株抗體DB16-1辨認；D：DB16-1與HUVECs交叉反應(a)，而NMIgG(b)及4G2(c)則無；F：透過免疫螢光雙重染色發現DB16-1係結合於人類血管，UEA-1係為人類內皮細胞的一凝集素，係作為人類血管分佈的一標記；

圖2係為DB16-1結合於HUVECs：A：流式細胞儀中一右移的峰表示DB16-1結合於HUVECs，抗-CD31及4G2抗體係分別作為正控制組及負控制組；B：定量DB16-1結合於HUVECs的百分比，本數據係以平均值±三次獨立實驗的標準偏差，P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

圖3係自HUVECs鑑定DB16-1的標的蛋白：A：標的蛋白係以DB16-1對HUVEC的溶解物進行免疫沉澱並利用銀染色法及西方墨點法進行分析；B：透過LC-MS/MS分析標的蛋白的胜肽序列，以底線標示的序列係呈現於LYRIC蛋白中；C：以DB16-1及一市售的多株抗體抗-LYRIC(anti-Mid)抗體對HUVEC溶解物進行共同免疫沉澱並接續以anti-Mid及DB16-1進行免疫轉印分析，而這兩個抗體均辨識HUVECs上相同的標的；

圖4係為DB16-1辨認標的蛋白LYRIC：A：人類重組LYRIC蛋白係以DB16-1及anti-Mid一西方墨點法辨認，相同地，四種新建立的抗-LYRIC單株抗體，Lyric1-7、Lyric 2-1、Lyric 3-13及Lyric 4-7也結合於LYRIC蛋白(上排)，表現在COLO 205及HUVECs的LYRIC係能被這些抗體辨認(下排)；B：流式細胞儀中一右移的峰表示DB16-1、Lyric1-7、Lyric 2-1、Lyric 3-13及Lyric 4-7結合於HUVECs，CD31及4G2抗體係分別作為正控制組及負控制組；C：這些結合於HUVECs的單株抗體的結合活性係被定量並以平均值平均值±三次獨立實驗的標準偏差，*P<0.05，**P<0.01；

圖5係為DB16-1的B細胞抗原決定區之辨別及其特性：A：透過ELISA技術選出與DB16-1有高親和性的噬菌體株；B：DB16-1與噬菌體株PC16-10及HB47-1的結合分析，這兩株噬菌體自10⁹ 連續稀釋到10⁴ 及0 pfu，其中，PC16-10係與DB16-1專一性地結合，但控制組噬菌體HB47-1則否；C及D：對應D2NS1蛋白(SP16-1)合成的胜肽與DB16-1的結合呈現劑量依賴關係，其中，NMIgG作為負控制組；E：利用SP16-1競爭抑制DB16-1與D2NS1結合，並以西方墨點法分析證明，控制組胜肽P7M則不具抑制作用；

圖6登革病毒NS1及LYRIC含有DB16-1的B細胞抗原決定區：A：比較四種血清型的登革病毒之NS1及LYRIC蛋白的胺基酸序列，這些蛋白均具有K-x-W-G結合結構，其中，x係為任一胺基酸；B：DB16-1以劑量依賴型態辨認與LYRIC蛋白相對應的合成胜肽(SP-Ly)，合成胜肽SP5-52係作為負控制組；C：DB16-1與SP-Ly的結合活性係受SP16-1的競爭抑制，而控制組L-胜肽則無此現象；D：藉由西方墨點法分析發現SP16-1抑制DB16-1結合於HUVECs及COLO205細胞上的LYRIC；E：DB16-1辨認帶有K-x-W-G結合結構的野生型D2NS1蛋白，而刪除116至119的胺基酸序列之DV-2的NS1蛋白(D2NS1 d116-119)則無法被辨認；F：DB16-1辨認野生型LYRIC(LYRIC WT)，但刪除形式的LYRIC(LYRIC d334-337)則無法被辨認；截短的LYRIC(LYRIC 1-340)蛋白但含有K-x-W-G結合結構可被DB16-1辨認，但刪除K-x-W-G結合結構的LYRIC蛋白(LYRIC 1-333)則失去與DB16-1結合活性，抗-V5係作為一內控制組；以及

圖7係DB16-1變異區的序列分析：DB16-1的架構區(framework regions,FRs)及互補決定區(complementarity determining regions,CDRs)係如圖所示為分開的，上排為重鏈，下排為輕鏈。

Claims (19)

1. 一種單離胜肽，包含：一抗原決定區，該抗原決定區包含一胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly，其中x係為任一胺基酸，以讓一DB16-1單株抗體作專一性地結合，該DB16-1重鏈之CDR1胺基酸序列係包含YVFSNYWMNW，CDR2胺基酸序列係包含QIYPGDGDTNYNENFRGKA，CDR3胺基酸序列係包含ARWGPYKGSDGFAY；而DB16-1輕鏈之CDR1胺基酸序列係包含SSQSLLYSTNQKNYLA，CDR2胺基酸序列係包含WASTRES，CDR3胺基酸序列係包含KQSYNLYT。
2. 如申請專利範圍第1項所述之單離胜肽，其中該單離胜肽係抑制該DB16-1單株抗體與一自體胜肽結合，其中該自體胜肽係包含胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly。
3. 如申請專利範圍第2項所述之單離胜肽，其中該自體胜肽係存在於血管內皮細胞。
4. 如申請專利範圍第1項所述之單離胜肽，其中該DB16-1單株抗體係為抗登革病毒非結構蛋白NS1的抗體。
5. 如申請專利範圍第1項所述之單離胜肽，其係與一人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白(human lysine-Rich CEACAM1 co-isolated,LYRIC)之胺基酸序列或與登革病毒的非結構蛋白NS1的胺基酸序列至少85%相同。
6. 如申請專利範圍第1項所述之單離胜肽，其中該胺基 酸序列係選自HKYSWKSWGKAK(SEQ ID NO：1)、LKYSWKTWGKAK(SEQ ID NO：2)、LKYSWKTWGLAK(SEQ ID NO：3)、ANTNGKDWGRSW(SEQ ID NO：4)以及LRYSWKTWGKAK(SEQ ID NO：5)所組成群組其中之一。
7. 如申請專利範圍第1項所述之單離胜肽，其中該單離胜肽係包含一B細胞抗原決定區胜肽。
8. 一種用於治療感染登革病毒所引起之登革出血熱、或登革休克症候群之醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項所述之有效劑量之單離胜肽。
9. 一種單株抗體，其中該單株抗體重鏈之CDR1胺基酸序列係包含YVFSNYWMNW，CDR2胺基酸序列係包含QIYPGDGDTNYNENFRGKA，CDR3胺基酸序列係包含ARWGPYKGSDGFAY；而該單株抗體之輕鏈之CDR1胺基酸序列係包含SSQSLLYSTNQKNYLA，CDR2胺基酸序列係包含WASTRES，CDR3胺基酸序列係包含KQSYNLYT；藉此該單株抗體係專一性地與一人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白(LYRIC)之一抗擬抗原決定區結合，且具有專一性地與登革病毒非結構蛋白NS1的一抗原決定區結合。
10. 如申請專利範圍第9項所述之單株抗體，其中該非結構蛋白NS1係與一DB16-1單株抗體具有專一性結合。
11. 如申請專利範圍第9項所述之單株抗體，其中該人類 蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白帶有該抗擬抗原決定區胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly。
12. 如申請專利範圍第9項所述之單株抗體，其中該人類蛋白富含賴胺酸CEACAM1共分離蛋白之該抗擬抗原決定區及該非結構蛋白NS1之抗原決定區均包含一胺基酸序列Lys-x-Trp-Gly。
13. 如申請專利範圍第9項所述之單株抗體，其係具有一單鏈Fv、一免疫球蛋白G、一Fab、一(Fab’)₂ 或一(scFv’)₂ ，且係含有與DB16-1抗體之互補決定區有相同胺基酸序列。
14. 一種用於治療感染登革病毒所引起之登革出血熱、或登革休克症候群之醫藥組合物，係包含如申請專利範圍第11項所述之一有效劑量之單株抗體。
15. 一種偵測人類蛋白富含賴氨酸CEACAM1共分離蛋白的方法，包含：將含一生物樣本與如申請專利範圍第9項所述之單株抗體接觸；以及偵測與該生物樣本結合的單株抗體。
16. 一種檢測登革熱之方法，與一生物樣本配合，該方法包含：將該生物樣本與如申請專利範圍第1項所述之單離胜肽接觸；以及偵測與該生物樣本結合的該單離胜肽。
17. 一種用於檢測登革熱感染之方法，包含： 將一生物樣本與如申請專利範圍第9項所述之單株抗體接觸；以及偵測與該生物樣本結合的該單株抗體。
18. 一種用於評估登革熱預後之方法，包含：將一生物樣本與如申請專利範圍第1項所述之單離胜肽接觸；以及偵測與結合該生物樣本結合的該單離胜肽。
19. 一種用於評估登革熱預後之方法，包含：將一生物樣本與如申請專利範圍第9項所述之單株抗體接觸；以及偵測與該生物樣本結合的該單株抗體。