PT1835937E - Composições e métodos para tratar infeção viral - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR INFEÇÃO VIRAL CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com métodos e composições para o tratamento de infeções virais tal como o HIV (VIH, Vírus da Imunodeficiência Humana), e HCV (Vírus da Hepatite C). Mais particularmente, a invenção relaciona-se com a utilização de um anticorpo monoclonal (mAc) específico para um ou mais receptores exterminadores tipo Ig (KIR) humanos para o tratamento destas e de outras doenças virais. Numa forma de realização particular, a invenção relaciona-se com a utilização de tais mAc' s no tratamento de pacientes com HIV que passaram por terapêutica HAART ou Terapêutica Antirretroviral Altamente Ativa. Numa outra forma de realização particular, a invenção relaciona-se com a utilização de um anticorpo terapêutico específico para uma molécula de superfície expressa em células infetadas com o vírus em combinação com um mAc (ou outro composto) que se liga e bloqueia os receptores KIR inibitórios de células exterminadoras

naturais e possibilitam uma potenciação da citotoxicidade da célula exterminadora natural em sujeitos mamíferos de maneira a aumentar a eficiência do tratamento em sujeitos humanos, particularmente através de um aumento do mecanismo de citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) conduzindo à erradicação de células infetadas por vírus. ANTECEDENTE DA INVENÇÃO Várias estratégias terapêuticas em seres humanos são baseadas na utilização de anticorpos terapêuticos. Isto inclui, por exemplo, a utilização de anticorpos terapêuticos desenvolvidos para reduzir as células alvo, particularmente células doentes tais como células infetadas com vírus, células tumorais ou outras células patogénicas. 2

Tais anticorpos são tipicamente anticorpos monoclonais, da espécie imunoglobulina gama (IgG), tipicamente com uma porção Fc de IgGl ou IgG3 humanas. Estes anticorpos podem ser nativos ou anticorpos recombinantes, anticorpos de ratinho humanizados (isto é, que compreendem domínios funcionais de várias espécies, tipicamente porção Fc de origem em primata humano ou não humano, e região variável ou região determinante complementar (CDR) de origem em ratinho). Em alternativa, o anticorpo monoclonal pode ser completamente humano através da imunização em ratinhos transgénicos com locus de Ig humanas ou obtido através de bibliotecas de ADNc derivadas de células humanas. Um exemplo particular de tais anticorpos terapêuticos é rituximAc (Mabthera ®, Rituxan ®), que é um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico feito com regiões constantes γΐ e κ humanas (por isso com porção Fc de IgGl humana) ligado a domínios variáveis murinos conferindo especificidade CD20. Nos últimos anos, rituximab modificou consideravelmente a estratégia terapêutica contra as malignidades linfoproliferativas B, particularmente linfomas de não-Hodgkin (NHL). Outros exemplos de anticorpos IgGl humanizados incluem alemtuzumab (Campath-1H ®) , que é usado no tratamento de malignidades de célula B ou trastuzumab (Herceptin ®) , que é usado no tratamento de cancro da mama. Exemplos adicionais de anticorpos terapêuticos em desenvolvimento são revelados na arte. 0 mecanismo de ação dos anticorpos terapêuticos desenvolvidos para redução de células que transportam o antígeno especificamente reconhecidas pelo anticorpo. Esta redução pode ser mediada através de, pelo menos quatro mecanismos: ADCC, lise dependente do complemento, fagocitose e efeitos anti-tumorais diretos, por exemplo inibição do crescimento tumoral por bloqueio mediado pelo mAc da sinalização do receptor de crescimento.

Enquanto estes anticorpos representam uma abordagem 3 inovadora à terapêutica humana, particularmente no tratamento de neoplasmas, nem sempre exibem uma grande eficácia. Por exemplo, embora tenha sido demonstrado que rituximab, isolado ou em combinação com quimioterapia é eficaz no tratamento de NHL quer de alto grau e grau baixo-intermédio, 30% a 50% dos pacientes com baixo grau de NHL não apresentam qualquer resposta clinica ao rituximab. Tem sido sugerido que o nível de expressão do CD20 nas células dos linfomas, a presença de elevada carga tumoral no momento do tratamento ou concentrações baixas de rituximab no soro podem explicar a ausência de eficácia de rituximab em alguns pacientes. Ainda assim, as causas reais para a falha no tratamento permanecem em geral desconhecidas. Os inventores descobriram previamente que a eficácia para matar as células tumorais do rituximab pode ser aumentada estimulando o ADCC por células exterminadoras naturais (NK) . Um mecanismo pelo qual as células NK podem matar células alvo é pelo ADCC, quando um mAc liga uma porção específica do antígeno com um antígeno numa célula alvo, e ao mesmo tempo a porção Fc do mAc liga-se a um receptor Fc (designado CD16) nas células NK. Isto conduz à ativação do CD16 na célula NK, que despoleta a ativação da maquinaria citolítica da célula NK. Porém, as células NK também expressam receptores inibitórios, tais como KIR, que enviam sinais negativos às células NK, equilibrando assim os sinais positivos, por exemplo transduzidos via CD16. Os inventores verificaram que bloqueando os receptores inibitórios KIR, usando mAc que se ligam a KIR e previnem a sua função, a sinalização estimuladora através do CD16 pode ser aumentada, conduzindo à morte aumentada pelas NK das células alvo tumorais, na presença de mAc que podem simultaneamente ligar-se a um antígeno no alvo e ao CD16 nas células NK.

Os documentos W02005003168 e W02005003172 descrevem a utilização de anticorpos anti-KIR de reação cruzada para o 4 tratamento, por exemplo, de cancro, uma doença infeciosa ou um distúrbio imune. 0 documento W02005009465 descreve a utilização de um anticorpo que bloqueia um receptor inibitório de célula NK e um anticorpo terapêutico que pode ser ligado por CD16 para tratar cancro, uma doença infeciosa, ou um distúrbio imune.

Ahmad e Ahmad (Current HIV research, 2007; 1:295-307) revelam a evasão do HIV da resposta das células NK do hospedeiro. A memória descritiva revela um método de aumentar a resposta ADCC mediada por NK contra as células infetadas com vírus na presença de mAc terapêuticos específicos para antígenos expressos em células infetadas com vírus, como um tratamento de infeções virais, por exemplo infeções por HIV.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A memória descritiva revela abordagens inovadoras para tratar o HIV e aumentar a eficácia de anticorpos terapêuticos para o tratamento de infeções virais. Estas abordagens são baseadas num subgrupo específico de pacientes com HIV que são adequados para tratamento com compostos que têm como alvo os receptores inibitórios da célula NK, e num aumento do mecanismo ADCC in vivo, quando os anticorpos terapêuticos são injetados. De facto, a presente invenção providencia agora novas composições e métodos que superam a dificuldade actual relacionada com a baixa eficácia dos anticorpos terapêuticos no tratamento de infeções virais. Mostra-se na presente invenção que as células NK de um indivíduo têm um baixo ADCC mediado por mAc (anticorpos monoclonais) terapêuticos porque é inibido por receptores inibitórios nas células NK. Preferencialmente, um aumento do mecanismo ADCC é conseguido pela administração de compostos que bloqueiam o receptor inibitório das células exterminadoras naturais e permitem uma potenciação da citotoxicidade das células 5 exterminadoras naturais em sujeitos mamíferos. Preferencialmente o composto é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Os anticorpos reagem com um receptor inibitório das células NK, isto é moléculas de receptor inibitório exterminador (KIR ou CD94/NKG2A/C) nas células NK, e neutralizam os seus sinais inibitórios, aumentando assim a sua atividade do ADCC.

Em conformidade, num aspeto, a memória descritiva revela um método de tratamento de uma doença virai causada pelo HIV num sujeito humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito humano um primeiro composto que bloqueia um receptor inibitório de uma célula NK, em que o sujeito humano foi tratado com terapêutica antirretroviral altamente ativa (HAART), em que o composto é um anticorpo que liga a KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, que bloqueia a inibição mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 da citotoxicidade da célula NK. Num outro aspeto, o anticorpo compete com o anticorpo monoclonal DF200 na ligação a, pelo menos um dos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, ou com o anticorpo monoclonal 1-7F9 na ligação a, pelo menos um dos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Num aspeto particular, o anticorpo é o anticorpo monoclonal 1-7F9. Num outro aspeto, o sujeito humano pode ter sido tratado com HAART por um período de tempo suficiente para conseguir um nível de HIV no plasma abaixo de um nível pré-determinado antes de administrar o primeiro composto. Num outro aspeto, o método compreende ainda administrar ao sujeito um segundo composto que é um anticorpo terapêutico ou proteína de fusão que liga um antígeno expresso numa célula infetada por HIV. Num aspeto particular, o segundo composto é um anticorpo terapêutico.

Num outro aspeto, a memória descritiva revela um método de tratamento de uma doença virai num sujeito humano em necessidade do mesmo, compreendendo (a) administrar a um sujeito um primeiro composto que bloqueia um receptor 6 inibitório de uma célula NK, e (b) administrar ao sujeito um segundo composto que é um anticorpo terapêutico ou proteína de fusão que liga um antígeno expresso numa célula infetada com vírus. Num aspeto, a doença virai é causada por HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana), RSV (Vírus Sincicial Respiratório), CMV (Citomegalovírus) , vírus do Ébola, vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Heptatite C, vírus de Epstein-Barr, vírus da varicela-zóster (VZV), vírus Hantaan, vírus da influenza, herpesvírus simples (HSV), herpesvírus humano 6 (HHV-6), herpesvírus humano 8 (HHV-8), vírus do papiloma humano, ou parvovírus. Em aspetos particulares separados, a doença virai é causada pelo HIV ou pelo vírus da Hepatite C.

Num aspeto, o segundo composto é um anticorpo terapêutico. Num outro aspeto, o segundo composto é um anticorpo ou proteína de fusão que compreendem uma porção Fc de um anticorpo da IgGl ou IgG3 humana. Num aspeto, o primeiro composto é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Num aspeto particular, pelo menos um do primeiro e segundo compostos é um anticorpo monoclonal. Num outro aspeto particular, pelo menos um do primeiro e segundo compostos é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico. 0 primeiro composto pode ligar, por exemplo, pelo menos um de um receptor CD94, um NKG2A/C, um KIR2DL e um KIR3DL humano e reduzir a inibição da citotoxicidade da célula NK mediada pelo receptor humano ao qual se liga. Numa forma de realização, o primeiro composto liga um determinante comum de, pelo menos dois receptores KIR2DL humanos e reduz a inibição da citotoxicidade da célula NK mediada pelos receptores KIR2DL humanos aos quais se liga. Por exemplo, o pimeiro composto pode ligar um determinante comum dos receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e prevenir a inibição mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 da citotoxicidade da célula NK. 0 primeiro composto pode, por exemplo, ser um anticorpo que compete com o anticorpo 7 monoclonal DF200 ou o anticorpo monoclonal 1-7F9 na ligação a, pelo menos um dos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3.

Num aspeto, o primeiro e segundo compostos são administrados simultaneamente ao sujeito. Num outro aspeto, o segundo composto é administrado no sujeito dentro das quatro semanas da administração do primeiro composto. 0 antigeno pode ser selecionado a partir do, por exemplo, grupo que consiste em CD3, CD28, CD4, CCR5, gpl20, e gp41.

Num outro aspeto, a especificação também revela um método para tratamento de uma doença virai num sujeito humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito um composto que bloqueia um receptor inibitório de uma célula NK.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. (A) Células NK foram definidas como todas células CD56+CD3- no linfócito portal. As caixas mostram células CD56 escuras (caixa inferior) bem como células CD56 claras (caixa superior). (B) É mostrada a proporção de células NK de todos os linfócitos para os controlos saudáveis e pacientes infetados com HIV-1 e tratados com HAART, com uma linha a indicar a mediana. Não foi observada diferença significativa.

Figura 2. Percentagem de KIR que expressam células NK em controlos saudáveis (caixas brancas) e pacientes infetados com HIV-1 (caixas cinzentas), P>0,05 para todos os KIR. Os anticorpos contra KIR2DL1, K1R2DL2 e KIR3DL1 reconhecem receptores KIR diferentes e o anticorpo 1-7F9 Pan KIR reconhece KIR2DUS1, KIR2DUS2 e KIR2DL3.

Figura 3. Expressão do marcador de desgranulação CD107a em células NK CD56+CD3 portais sem estimulação (A) e após estimulação com a linha celular K562 sensível à NK (B) . (C) A expressão percentual do CD107a após a estimulação com células K562 é mostrada para controlos saudáveis bem como para pacientes infetados com HIV-1. Não 8 houve diferença significativa entre os grupos. É apresentada a mediana para cada grupo.

Figura 4. (A) É mostrada a expressão aumentada percentual do CD107a em células NK, após estimulação com 721,221 células transfetadas com alelos HLA-C diferentes e bloqueio de todos os KIR com o mAc 1-7F9 anti-KIR. 0 mAc anti-KIR induziu o CD107 de uma maneira semelhante em (1) células NK que expressam KIR2DL2 e estimuladas com células transfetadas com HLA-Cw3 que em (2) células NK que expressam KIR2DL1 e foram desafiadas com células alvo transfetadas com HLA-Cw4 ou HLA-Cw6, ambas ligando-se a KIR2DL1. Igualmente, não foi encontrada diferença significativa entre indivíduos saudáveis (círculos) e pacientes infetados com HIV-1 (triângulos). É apresentada a mediana para cada grupo. (B) 0 bloqueio de todos os KIR nas células NK estimuladas com linha celular CEM não infetada (barras brancas) ou células CEM infetadas com HIV-1 em 70% (barras cinzentas) aumenta a expressão do CD107a. Não foi encontrada diferença entre células infetadas com HIV-1 e não infetadas nesta experiência realizada uma vez com o controlo PBMC saudável. (C) Células CD4+ autólogas, expandidas e ativadas com IL-2 e PHA, foram usadas como alvos e o bloqueio de KIR em células NK com mAc anti-KIR(l-7F9) conduziram a uma expressão do CD107a aumentada em 10% em duas experiências independentes com sangue de indivíduos saudáveis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção é baseada, em parte, na descoberta de que os pacientes com HIV tratados com HAART podem ser mais adequados para tratamento com anticorpos anti-KIR do que os pacientes com uma doença muito ativa (ver Exemplo 5) . A invenção também se baseia, em parte, na descoberta de que os anticorpos contra os receptores inibitórios da célula NK podem melhorar a eficácia dos anticorpos terapêuticos contra antígenos virais, particularmente anticorpos 9 terapêuticos que podem ser ligados pelo CD16, aumentando a resposta do ADCC contra tais anticorpos terapêuticos.

Com base nos dados do Exemplo 5, podem ser esboçadas duas conclusões importantes: 1) Existe um grupo de pacientes infetados com HIV, nomeadamente pacientes tratados com HAART, que albergam células NK funcionais, ativáveis que expressam KIR inibitórios funcionais, que regulam a atividade mortífera de ditas células NK, e estes KIR podem ser bloqueados por mAc's anti-KIR, induzindo assim a lise por aquelas células NK em direção a alvos que expressam HLA-C. Por oposição, uma característica previamente reportada das células infetadas com HIV é que elas regulam para baixo (ou anulam) a expressão de HLA-A e HLA-B para evitar a morte pelas células T, enquanto retêm a expressão de HLA-C, evitando assim a morte pelas células NK. 2) Infeção das células alvo pelo HIV não causa redução na expressão de ligandos activadores que são requeridos para despoletar os receptores ativadores nas células NK.

Em conjunto estas novas descobertas sugerem que as células NK endógenas em, pelo menos pacientes em HAART podem matar células infetadas com HIV quando o KIR ou outro receptor inibitório da célula NK é bloqueado usando, por exemplo, um anticorpo capaz de reduzir o bloqueio mediado pelo KIR da citotoxicidade da célula NK.

Num aspeto, é, por exemplo, considerado que os pacientes são tratados tão prontamente quanto possível com HAART até a carga virai estar abaixo de um nível pré-determinado ou abaixo de um nível de deteção para um período de tempo pré-determinado, por exemplo, pelo menos 1, 2, 4, 8, ou 20 semanas. O nível pré-determinado pode ser, por exemplo, uma carga virai inferior ao nível de deteção, uma carga virai inferior a cerca de 50 cópias/ml de ARN, uma carga virai inferior a cerca de 100 cópias/ml de ARN, ou uma carga virai inferior a cerca de 200 10 cópias/ml de ARN. Assim que a carga virai tenha diminuído abaixo do nível pré-determinado, ou assim que a carga virai tenha estado abaixo do nível pré-determinado para o período de tempo pré-determinado, o tratamento com um composto capaz de reduzir a atividade inibitória da célula NK de um receptor inibitório da célula NK é iniciado. Tais compostos são descritos aqui. A presente especificação também revela um meio para aumentar a eficiência dos anticorpos terapêuticos. A especificação mais especificamente revela que a utilização de um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK, pode aumentar significativamente a eficiência dos anticorpos terapêuticos. De facto, os inventores demonstraram que a morte mediada pela NK de células infetadas com vírus pode ser grandemente aumentada na presença de um anticorpo dirigido contra um receptor inibitório da célula NK.

Desta forma, a especificação revela um método de tratamento de uma doença num sujeito em necessidade do mesmo compreendendo: a) administrar ao sujeito um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia um ou mais receptores inibitórios de uma célula NK; e, b) administrar ao sujeito um anticorpo terapêutico, específico para um antígeno expresso em células infetadas com vírus. 0 anticorpo terapêutico pode ligar-se a CD16 em células NK, preferencialmente através da sua região Fc.

Preferencialmente, o anticorpo terapêutico tem uma porção Fc de uma IgGl ou de um IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, ainda preferencialmente um anticorpo humanizado, humano ou quimérico ou um fragmento do mesmo. O composto, preferencialmente um anticorpo ou um 11 fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK pode ser administrado ao sujeito antes, simultaneamente com, ou após, a administração do anticorpo terapêutico. 0 modo de administração dos diferentes anticorpos depende da sua biodisponibilidade e farmacocinética. Num aspeto da revelação o anticorpo terapêutico é administrado no intervalo entre 0 a quatro semanas da administração do composto, preferencialmente um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK, noutro aspeto dentro das duas semanas, ou dentro de uma semana, e num aspeto adicional dentro dos 5 ou 2 dias. Num aspeto, o anticorpo terapêutico é administrado antes ou simultaneamente com o composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK.

Num aspeto adicional, a especificação revela um método de aumentar o ADCC num sujeito que receba um tratamento com anticorpo terapêutico, o método compreendendo administrar ao sujeito antes de, simultaneamente, ou após a administração do anticorpo terapêutico, uma quantidade suficiente para aumentar o ADCC de um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK. 0 anticorpo terapêutico pode ser ligado pelo CD16 nas células NK, preferencialmente através da sua região Fc. Preferencialmente, o anticorpo terapêutico tem uma porção Fc de uma IgGl ou de uma IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, ainda preferencialmente um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou um fragmento do mesmo.

Num aspeto adicional, a especificação revela um método de aumentar a eficiência de um tratamento com anticorpo terapêutico num sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito antes de, simultaneamente ou após a administração do anticorpo terapêutico uma quantidade eficaz de um composto, tal como um anticorpo ou um 12 fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK suficientemente para aumentar a eficiência do anticorpo terapêutico. 0 anticorpo terapêutico pode ser ligado pelo CD16, preferencialmente através da sua região Fc. Preferencialmente, o anticorpo terapêutico tem uma porção Fc da IgGl ou da IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal, ainda preferencialmente um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.

No contexto da presente invenção, um sujeito ou paciente inclui qualquer sujeito ou paciente mamífero, mais preferencialmente um sujeito ou paciente humano.

Mais especificamente, a especificação revela métodos de tratamento de um sujeito no qual um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK são co-administrados com o anticorpo terapêutico ao sujeito. A especificação revela co-administração com os anticorpos terapêuticos dirigidos especificamente contra a infeção virai. A memória descritiva revela uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo terapêutico e um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK. A especificação também revela um kit que compreende um anticorpo terapêutico contra células infetadas com vírus e um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK. A memória descritiva revela a utilização de um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK para aumentar a eficiência de um tratamento com um anticorpo terapêutico dirigido contra células infetadas com vírus, ou para aumentar o ADCC num sujeito submetido a um tratamento com um anticorpo terapêutico. A memória descritiva também revela a utilização de um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, 13 que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK e de um anticorpo terapêutico para a preparação de um fármaco para tratar uma doença. Mais particularmente, o tratamento da doença requer um esgotamento das células alvo, e a doença é uma infeção virai.

Num aspeto particular, a memória descritiva revela um método de tratamento de um sujeito em necessidade do mesmo compreendendo: a) administrar ao sujeito um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK; e, b) administrar ao sujeito um anticorpo terapêutico que é especifico para infeção pelo HIV. 0 anticorpo terapêutico é capaz de formar um complexo imune. Preferencialmente, o anticorpo terapêutico pode ser ligado pelo receptor do CD16 presente nas células NK, preferencialmente através da sua região Fc. Num aspeto preferido, o anticorpo terapêutico tem uma porção Fc de uma IgGl ou IgG3 de um primata humano ou não humano. Preferencialmente, o anticorpo terapêutico é um anticorpo monoclonal ou um fragmento ou um derivado do mesmo, mais preferencialmente um anticorpo humanizado, humano ou quimérico ou um fragmento do mesmo.

As células NK retêm o CD16, o receptor de baixa afinidade para o IgG. A ligação simultânea do IgG a um antigeno numa célula alvo, e o CD16 nas células NK, resulta na ativação de células NK, e na morte da ligação alvo pelo anticorpo. A co-administração de mAc's anti-KIR junto com mAc' s específicos para receptores em alvos infetados com HIV, tais como um mAc anti-CD4, aumentará o ADCC mediado pela NK. Os mAc’s anti-CD4 exemplares para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam a, trx I (TolerRx) e HuMax CD4 (GenmAc). Outros mAc's CD4 podem ser produzidos de acordo com métodos conhecidos na arte, ou obtidos a partir de fontes comerciais. 14

Num aspeto da revelação, mAc's terapêuticos preferidos específicos para antígenos em células infetadas pelo HIV incluem mAc's específicos para moléculas de superfície em células T ou específicos para ligandos que são codificados pelo vírus do HIV e expressos seletivamente em células infetadas. Tais mAc's terapêuticos podem ser específicos para moléculas de superfície, tais como: CD3, CD28, CD4, CCR5, gpl20, gp41. Os mAc's anti-CD3, CD28, CD4, CCR5, gpl20, e gp41 exemplares para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam a, trx4 (TolerRx), anticorpo gpl20 anti-HIV-1 descrito na Science, 1994, vol 266, paginas 1024-1027; e anticorpo gp 41 anti-HIV-1 descrito na AIDS Res Hum Retroviruses 1994, vol 10, páginas 1651-1658. Outros anticorpos adequados podem ser produzidos de acordo com métodos conhecidos na arte, ou obtidos a partir de fontes comerciais.

Num outro aspeto da revelação anticorpos terapêuticos preferidos incluem aqueles que são específicos para antígenos codificados por outros vírus. Estes vírus incluem RSV (Vírus Sincicial Respiratório), CMV (Citomegalovírus) , vírus do Ébola, vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Hepatite C, vírus de Epstein-Barr, vírus da varicela-zóster (VZV), vírus Hantaan, vírus da influenza, herpesvírus simples (HSV), herpesvírus humano 6 (HHV-6), herpesvírus humano 8 (HHV-8), vírus do papiloma humano, e parvovírus.

Num outro aspeto da revelação anticorpos terapêuticos preferidos incluem aqueles que são específicos para antígenos celulares expressos por células infetadas com vírus. Para HCV estes incluem anticorpos que são específicos para antígenos celulares expressos por células do fígado infetadas com vírus. A proteína F e G do RSV, a proteína El e E2 do HCV, os antígenos gpl e gp2 do vírus do Ébola, a proteína LI do vírus do papiloma humano (HPV).

Num aspeto, a memória descritiva revela um método de 15 tratar HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana), RSV (Vírus Sincicial Respiratório), CMV (Citomegalovírus) , vírus do Ébola, vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Heptatite C, vírus de Epstein-Barr, vírus da varicela-zóster (VZV), vírus Hantaan, vírus da influenza, herpesvírus simples (HSV), herpesvírus humano 6 (HHV-6), herpesvírus humano 8 (HHV-8), vírus do papiloma humano, e parvovírus, compreendendo administrar a um paciente em necessidade da mesma uma quantidade terapeuticamente eficiente de um anticorpo, ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK.

Num aspeto, o método de tratar uma doença virai causada por um dos vírus mencionados anteriormente compreende administrar ainda ao mesmo paciente uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente anti-viral. Exemplos de tais agentes são contra infeção por Herpes simples, vírus da varicela-zóster (VSV): Aciclovir, famciclovir, valaciclovir, penciclovir. contra infeção por CMV: Ganciclovir, valganciclovir. contra infeção por retrovírus (por exemplo, HIV-1): Lamivudin, zidovudin, emtricitabin, abacavir, tenofovir, didanosin, stavudin, efavirenz, nevirapin, amprenavir, indinavir, saquinavir, ritonavir, lopinavir, atazanavir, nelfinavir, enfuvirtid. contra infeção pelo vírus da influenza: Oseltamivir. contra infeção Adefovir, lamivudin crónica pelo vírus da Hepatite B: contra infeção crónica pelo vírus da Hepatite C:

Ribavirin, interferão-alfa, interferão alfa PEGilado.

Num aspeto, o paciente foi tratado com HAART antes da administração de um anticorpo que bloqueia um receptor inibitório de uma célula NK. A terapêutica HAART consiste num cocktail de fármacos anti-virais. As classes incluem, por exemplo, inibidores nucleosídeos da transcriptase 16 reversa (NRTI), inibidores não nucleosídeos da transcriptase reversa (NNRTI) e inibidores da protease (PI) . Normalmente 2 a 4 fármacos de preferencialmente mais do que uma classe são combinados para reduzir a carga virai para níveis quase indetetáveis. As terapias HAART são, frequentemente, combinações ou "cocktails" de dois ou mais agentes antirretrovirais. R. M. Gulick, "Current antiretroviral therapy: an overview", Qual. Life Res. 6:471-474 (1997); K. Henry et al., "Antiretroviral therapy for HIV infection. Heartening Successes mixed with continuing challenges", Postgrad. Med. 102:100-107 (1997); C. B. Hicks, "Update on antiretroviral therapy", Radiol. Clin. North Am. 35:995-1005 (1997); R. H. Goldschmidt, "Antiretroviral drug treatment for HIV/AIDS", Am. Fam. Physician, 54:574-580 (1996). Os fármacos usados nos regimes de HAART incluem os análogos dos nucleosídeos AZT, estavudina (d4T), e 3TC; nevirapina (um inibidor não nucleosídeo da transcriptase reversa, que pode ser abreviado para NVP), e inibidores da protease tais como RTV, SQV, IDV, e nelfinavir. As HAART que usam estes tratamentos podem reduzir as cargas no plasma do vírus ativo do HIV em pacientes positivos ao HIV-1 para quantidades indetetáveis (inferiores a cerca de 50 cópias/ml), aparentemente sem a ameaça de desenvolver estirpes resistentes ao HIV. M. Balter, "HIV Survives Drug Onslaught by Hiding Out in T Células," Science 278:1227 (Nov. 14, 1997) . Os produtos da HAART, regimes de dosagem e efeitos secundários comuns também são dados nos Quadros I a III em anexo na publicação do pedido de patente U.S. 20050191702.

Numa forma de realização da invenção a indução de uma resposta do ADCC é feita pelas proteínas de fusão Fc do receptor, em que a parte Fc se liga ao CD16 e o receptor liga-se a um ligando nas células T. Este ligando poderia ser uma proteína CD-2-Fc que liga LFA-3 em células T. 17

Preferencialmente, o composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK liga, pelo menos, um dos receptores humanos KIR ou CD94 ou NKG2A/C e inibe a inibição mediada pelo KIR2DL, KIR3DL e/ou NKG2A/C relacionada da citotoxicidade da célula NK. Preferencialmente, o receptor humano KIR2DL é selecionado a partir do grupo que consiste nos receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 e o receptor humano KIR3DL é selecionado a partir do grupo que consiste em KIR3DL1 e KIR3DL2. Num aspeto preferido o composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK liga um determinante comum de dois ou mais receptores humanos KIR2DL e previne a inibição mediada pelo KIR2DL da citotoxicidade da célula NK. Mais preferencialmente, o anticorpo liga um determinante comum de receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 e previne a inibição mediada pelo KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 da citotoxicidade da célula NK. Num aspeto particular, o composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK inibe a ligação de uma molécula do alelo HLA-C que tem um resíduo de Lys na posição 80 a um receptor humano KIR2DL1, e a ligação de uma molécula do alelo HLA-C que tem um resíduo de Asn na posição 80 a receptores humanos KIR2DL2 e KIR2DL3. Num outro aspeto particular, o anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK liga-se ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. Opcionalmente, este anticorpo ou um fragmento do mesmo, compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 para ligação a um receptor KIR à superfície de uma célula NK humana. Num aspeto preferido, este anticorpo é o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. O hibridoma que produz o anticorpo DF200, 18 inscrição N.° CNCM 1-3224, registada no dia 10 de Junho de 2004, Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos, Instituto Pasteur, Rua do Docteur Roux, 25, F-75724 Paris Cedex 15, França.

Num outro aspeto particular, o anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK liga-se ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 1-7F9, um anticorpo monoclonal humano que liga KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e reduz ou bloqueia a inibição da citotoxicidade da célula NK mediada por KIR, como descrito em, por exemplo, W02005003168. As sequências VH e VL do 1-7F9 são descritas nas SEQ. ID N.°s 1 e 2, respetivamente. Opcionalmente, o anticorpo ou um fragmento do mesmo compete com 1-7F9 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências da cadeia leve (L) e pesada (H) do 1-7F9), para ligação a um receptor KIR à superfície de uma célula NK humana. Num aspeto preferido, este anticorpo é 1-7F9, isto é, um anticorpo monoclonal que compreende as sequências H e L do 1-7F9.

Num aspeto preferido, o anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK é um anticorpo monoclonal, um fragmento ou um derivado do mesmo. Mais preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo humanizado, humano ou quimérico ou um fragmento do mesmo. O fragmento ou um derivado do mesmo é preferencialmente selecionado a partir de um fragmento Fab, um fragmento Fab' 2, um CDR e um ScFv.

Anticorpo terapêutico

No contexto desta memória descritiva, o termo "anticorpo terapêutico ou anticorpos" designa mais especificamente qualquer anticorpo que funciona para esgotar as células alvo num paciente. Exemplos específicos de tais células alvo incluem células tumorais, células infetadas com vírus, células alogénicas, células patológicas imunocompetentes (por exemplo, linfócitos B, 19 linfócitos T, células apresentadoras de antígeno, etc.) envolvidas em alergias, doenças auto-imunes, reações alogénicas, etc., ou mesmo células saudáveis (por exemplo, células endoteliais numa estratégia terapêutica anti-angiogénica). As células alvo mais preferidas no contexto desta revelação são as células tumorais e as células infetadas com virus. Os anticorpos terapêuticos podem, por exemplo, mediar um efeito citotóxico ou uma lise celular, particularmente por citotoxicidade mediada pela célula dependente do anticorpo (ADCC). A ADCC requer receptores de leucócito para a porção Fc do IgG (FcyR) cuja função é ligar os antigenos sensibilizados ao IgG às células citotóxicas que transportam FcyR e despoletar a maquinaria de ativação celular. Desta forma, o anticorpo terapêutico é capaz de formar um complexo imune. Por exemplo, um complexo imune pode ser um alvo tumoral (isto é células) coberto por anticorpos terapêuticos. Mais particularmente, o anticorpo pode ser ligado pelo CD16, preferencialmente através da sua região Fc. Os anticorpos terapêuticos podem ser policlonais ou, preferencialmente, monoclonais. Podem ser produzidos por hibridomas ou por células recombinantes desenhadas para expressas os domínios variável e constante desejados. Os anticorpos podem ser anticorpos de cadeia simples ou outros derivados do anticorpo que retêm a especificidade do antígeno e a região da dobradiça inferior ou uma variante dos mesmos. Estes podem ser anticorpos polifuncionais, anticorpos recombinantes, anticorpos humanizados, fragmentos ou variantes dos mesmos. 0 fragmento ou um derivado dos mesmos é preferencialmente selecionado a partir de um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, um CDR e um ScFv. Anticorpos terapêuticos são específicos para antigenos de superfície, por exemplo, antigenos membranares. Na presente especificação, antigenos membranares preferidos são aqueles expressos para as células infetadas pelo HIV. Estes incluem CD4, CD3, e CD28. 20

Os anticorpos terapêuticos têm preferencialmente uma porção Fc da IgGl ou IgG3 de primata humana ou não humana, mais preferencialmente IgGl humana.

Anticorpo regulador da célula NK A atividade da célula NK é regulada por um mecanismo complexo que envolve ambos sinais estimuladores e inibitórios. Em conformidade, uma terapêutica mediada pela célula NK eficaz pode ser conseguida tanto por uma estimulação destas células como por uma neutralização dos sinais inibitórios.

As células NK são reguladas negativamente pelos receptores inibitórios específicos da classe I do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) (Kárre et al., 1986; Õhlén et al, 1989). Estes receptores específicos ligam-se a determinantes polimórficos das moléculas da classe I do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) ou HLA e inibem a lise da célula exterminadora natural (NK). Em humanos, uma família de receptores apelidada receptores exterminadores tipo Ig (KIR) reconhecem grupos de alelos dos HLA da classe I.

Existem vários grupos de receptores KIR, incluindo KIR2DL, KIR2DS, KIR3DL e KIR3DS. Os receptores KIR com dois domínios Ig (KIR2D) identificam alotipos HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente designado p58.1) ou o produto infimamente relacionado do gene do KIR2DL3 reconhece um epítopo partilhado pelo grupo de alotipos 2 HLA-C (Cwl, 3, 7, e 8), enquanto KIR2DL1 (p58.2) reconhece um epítopo partilhado pelo grupo recíproco de alotipos 1 HLA-C (Cw2, 4, 5, e 6). O reconhecimento pelo KIR2DL1 é ditado pela presença de um resíduo de Lys na posição 80 dos alelos HLA-C. O reconhecimento do KIR2DL2 e KIR2DL3 é ditado pela presença de um resíduo de Asn na posição 80. De maneira importante, a grande maioria dos alelos HLA-C tem ou um resíduo de Asn ou de Lys na posição 80. Um KIR com três domínios Ig, KIR3DL1 (p70), reconhece um epítopo partilhado por alelos 21 HLA-Bw4. Finalmente, um homodímero de moléculas KIR3DL2 com três domínios Ig (pl40) reconhece HLA-A3 e HLA-A11.

Apesar dos KIR e de outros receptores inibitórios da classe I (Moretta et al, 1997; Valiante et al, 1997; Lanier, 1998) puderem ser co-expressos por células NK, em qualquer repertório NK de um determinado indivíduo, existem células que expressam um único KIR e por isso, as células NK correspondentes são bloqueadas apenas por células expressando um grupo de alelos específicos da classe I.

Na presente revelação, o termo "um composto ou compostos, preferencialmente anticorpo ou anticorpos ou um fragmento dos mesmos, que bloqueia(m) o receptor inibitório de uma célula NK" refere-se a um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, específico para, pelo menos um receptor inibitório de células NK, isto é KIR ou NKG2A/C das células NK, e sinais inibitórios neutralizadores do KIR ou NKG2A/C. Preferencialmente, o composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, é capaz de bloquear a interação entre HLA e um receptor inibitório de uma célula NK. Os anticorpos podem ser policlonais or, preferencialmente, monoclonais. Podem ser produzidos por hibridomas ou por células recombinants desenhadas para expressas os domínios variável e constante desejados. Os anticorpos podem ser anticorpos de cadeia simples ou outros derivados de anticorpo que retêm a especificidade ao antígeno e a região de dobradiça inferior ou uma variante dos mesmos tal como um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, um CDR e um ScFv. Estes podem ser anticorpos polifuncionais, anticorpos recombinantes, anticorpos humanizados, ou variantes dos mesmos.

Preferencialmente, o composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK é um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que neutraliza o sinal inibitório de, pelo menos, um receptor inibitório 22 selecionado do grupo que consiste em KIR2DL2, KIR2DL 3, KIR2DL1, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A e NKG2C. Mais preferencialmente, o composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de células NK, um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que neutraliza o sinal inibitório de KIR2DL2, KIR2DL3 e/ou KIR2DL1 . A revelação também contempla a utilização de uma combinação de vários compostos, preferencialmente anticorpos ou um fragmento dos mesmos, que bloqueiam diferentes receptores inibitórios de células NK. Preferencialmente, compostos, preferencialmente anticorpos ou um fragmento dos mesmos, que bloqueiam os receptores inibitórios das células NK são específicos de um receptor inibitório selecionado a partir de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A e NKG2C e são capazes de inibir a inibição mediada por NKG2A/C ou por KIR relacionado da citotoxicidade da célula NK. Por exemplo, os compostos que bloqueiam os receptores inibitórios das células NK podem compreender um anticorpo que tem especificidade para KIR2DL1 e um outro que tem especificidade para KIR2DL2 e/ou KIR2DL3. Mais preferencialmente, a combinação de compostos que bloqueiam os receptores inibitórios das células NK é capaz de inibir a inibição mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 da citotoxicidade da célula NK.

Por exemplo, foi demonstrado que anticorpos monoclonais específicos para KIR2DL1 bloqueiam as interações entre KIR2DL1 e alotipos HLA-Cw4, bem como alotipos HLA-C semelhantes pertencentes ao mesmo grupo que os Cw4 (Moretta et al., J Exp Med. 1993; 178 (2) : 597-604; ) . Num outro exemplo, os anticorpos monoclonais contra KIR2DL2/3 também foram descritos como bloquedores de interações do KIR2DL2/3 com alotipos HLACw3 (ou afins) (Moretta et al., 1993, supra). Foi demonstrado que os 23 anticorpos anti NKG2A bloqueiam a interação inibitória entre NKG2A e HLA-E.

Opcionalmente, o anticorpo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em GL183 (especifico para KIR2DL2/3/S2, disponível a partir de Immunotech, França e Beckton Dickinson, USA); EB6 (específico para KIR2DLl/sl, disponível a partir de Immunotech, França e Beckton Dickinson, USA); AZ138 (específico para KIR3DL1, disponível a partir de Moretta et al, Univ. Génova, Itália); Q66 (específico para KIR3DL2, disponível a partir de Immunotech, França); Z270 (específico para NKG2A, disponível a partir de Immunotech, França); P25 (específico para NKG2A/C, disponível a partir de Moretta et al, Univ. Génova, Itália); e DX9, Z27 (específico para KIR3DL1, disponível a partir de Immunotech, França e Beckton Dickinson, USA).

Num aspeto preferido, a revelação usa anticorpos monoclonais, bem como fragmentos e derivados dos mesmos, em que o anticorpo, fragmento ou derivado faz uma reação cruzada com vários KIR ou receptores NKG2A/C à superfície das células NK e neutraliza aos seus sinais inibitórios. Mais preferencialmente, a revelação usa um anticorpo monoclonal que liga um determinante comum dos receptores humanos KIR2DL e inibe a via inibitória correspondente. Mais especificamente, a invenção usa um anticorpo monoclonal que liga os receptores KIR2DL1 e KIR2DL2/3 à superfície de células NK humanas e inibe a inibição mediada por KIR2DL1 e KIR2DL2/3 da citotoxicidade da célula NK. 0 anticorpo inibe especificamente a ligação das moléculas HLA-C aos receptores KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Mais preferencialmente, o anticorpo facilita a atividade da célula NK in vivo.

Porque o KIR2DL1 e KIR2DL3 (ou KIR2DL2) podem formar um complexo molecular com a maioria dos alotipos HLA-C, respetivamente grupo 1 alotipos HLA-C e grupo 2 alotipos 24 HLA-C, os anticorpos contra KIR2DL1 e KIR2DL3 podem ser usados para aumentar a eficiência de um anticorpo terapêutico na maior parte dos indivíduos humanos, tipicamente em cerca de 90% dos indivíduos humanos ou mais.

Num aspeto particular desta revelação, o anticorpo que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK é um anticorpo monoclonal, em que o anticorpo liqa um determinante comum dos receptores humanos KIR2DL e inibe a inibição mediada por KIR2DL da citotoxicidade da célula NK. O anticorpo liga-se mais especificamente ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 e/ou compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 para ligação a um receptor KIR à superfície de uma célula NK humana.

Num aspeto específico, o anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200.

No contexto desta revelação um "determinante comum" designa um determinante antigénico ou epítopo que é partilhado por vários membros do grupo de receptores KIR2DL humanos. 0 determinante ou epítopo pode representar um fragmento peptídico ou um epítopo conformacional partilhado pelos membros. Num aspeto específico, o determinante comum compreende um epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal DF200.

No contexto desta revelação, o termo anticorpo que "liga" um determinante comum designa um anticorpo que liga o determinante com especificidade e/ou afinidade, por exemplo, que essencialmente não liga com elevada afinidade ou com especificidade outros motivos não relacionados ou determinante ou estruturas à superfície de células NK humanas. Mais particularmente, a ligação de um anticorpo monoclonal de acordo com esta revelação ao determinante pode ser discriminada a partir da ligação do anticorpo a outro epítopo ou determinante.

Estes compostos, preferencialmente anticorpos, são, 25 assim, compostos "neutralizadores" ou "inibitórios", preferencialmente anticorpos, no sentido em que bloqueiam, pelo menos parcialmente, a via sinalizadora inibitória mediada por um receptor inibitório das células NK, isto é receptores KIR ou NKG2A/C. Ainda mais importante, esta atividade inibitória pode ser exibida com respeito aos vários tipos de receptores KIR ou NKG2A/C, de maneira que estes compostos, preferencialmente anticorpos, podem ser usados em vários sujeitos com elevada eficácia. A inibição da inibição mediada por KIR ou NKG2A/C da citotoxicidade da célula NK pode ser avaliada por vários ensaios ou testes, tais como ensaios celulares ou de ligação. Num aspeto especifico, a atividade inibitória é ilustrada pela capacidade do composto, tal como um anticorpo, para reconstituir a lise dos clones NK positivos a KIR ou NKG2A/C, respetivamente, em alvos positivos a HLA-C ou HLA-E. Num outro aspeto especifico, o composto, tal como um anticorpo, é definido como inibindo a ligação das moléculas de HLA-C aos receptores KIR2DL1 e KIR2DL3 (ou ao KIR2DL2 intimamente relacionado), ainda preferencialmente como a sua capacidade para alterar: a ligação de uma molécula de HLA-C selecionada a partir de Cwl, Cw3, Cw7, e Cw8 (ou de uma molécula de HLA-c contendo um residuo de Asn na posição 80) ao KIR2DL2/3; e a ligação de uma molécula de HLA-C selecionada a partir de Cw2, Cw4, Cw5 e Cw6 (ou de uma molécula de HLA-c contendo um residuo de Lys na posição 80) ao KIR2DL1.

Num outro aspeto, a atividade inibitória de um composto desta invenção, tal como um anticorpo, pode ser avaliada num ensaio de citotoxicidade baseado na célula, como revelado nos exemplos.

Num outro aspeto, a atividade inibitória de um composto desta invenção, tal como um anticorpo, pode ser avaliada num ensaio de libertação de citocina.

Os compostos desta invenção, preferencialmente 26 anticorpos, podem exibir atividade inibitória parcial, por exemplo, reduzir parcialmente a inibição mediada por KIR2DL da citotoxicidade da célula NK. A maioria dos compostos preferidos são capazes de inibir, pelo menos 20%, preferencialmente pelo menos 30%, 40% ou 50% ou mais da inibição mediada por KIR ou NKG2A/C da toxicidade da célula NK, preferencialmente da inibição mediada por KIR2DL da citotoxicidade da célula NK. Em alternativa, os compostos preferidos desta revelação, preferencialmente anticorpos, são capazes de induzir a lise de uma população de células alvo autólogas ou compatíveis com HLA ou emparelhadas, isto é, uma população de células que não seria lisada eficazmente por células NK na ausência do anticorpo. Em conformidade, compostos desta revelação também podem ser definidos como facilitadores da atividade da célula NK in vi vo. A invenção também contempla modalidades nas quais os compostos que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK são fragmentos e derivados de um tal anticorpo monoclonal contendo substancialmente a mesma especificidade ao antígeno, incluindo, sem limitação, um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, um CDR e um ScFv. Além disso, o anticorpo monoclonal pode ser humanizado, humano, ou quimérico (por exemplo um anticorpo funcionalizado ou bi-específico).

Os anticorpos que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK de acordo com a invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas conhecidas por si na arte. Tipicamente, são produzidos por imunização de um animal não humano com um imunogene compreendendo um polipeptídeo KIR ou NKG2A/C, e coleção de células do baço (para produzir hibridomas por fusão com linhas de células apropriadas). Os métodos de produzir os anticorpos monoclonais a partir de várias espécies podem ser encontrados em Harlow et al. (Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988). Mais especificamente, estes métodos compreendem imunizar um 27 animal não humano com o antígeno, seguido de uma recuperação das células do baço que são depois fundidas com as células imortalizadas, tais como células de mieloma. Os hibridomas resultantes produzem os anticorpos monoclonais e podem ser selecionados limitando as diluições para isolar clones individuais. Os anticorpos também podem ser produzidos por seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, como revelado por exemplo em Ward et al. (1989).

Os anticorpos preferidos que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK de acordo com a invenção são preparados por imunização com um imunogene compreendendo um polipeptideo KIR2DL, mais preferencialmente um polipeptídeo KIR2DL humano. 0 polipeptideo KIR2DL pode compreender a sequência de comprimento completo de um polipeptideo KIR2DL humano, ou um fragmento ou derivado do mesmo, tipicamente um fragmento imunogénico, isto é, uma porção do polipeptideo que compreende um epítopo, preferencialmente um epitopo de célula T ou B. Tais fragmentos tipicamente contêm, pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da sequência do polipeptideo maduro, ainda mais preferencialmente pelo menos 10 aminoácidos consecutivos do mesmo. São essencialmente derivados do domínio extracelular do receptor.

Num aspeto mais preferido, o imunogene compreende um polipeptídeo KIR2DL humano de tipo selvagem numa membrana lipídica, tipicamente à superfície de uma célula. Num aspeto específico, o imunogene compreende células NK intactas, particularmente células NK humanas intactas, opcionalmente tratadas ou lisadas.

Os anticorpos que bloqueiam os receptores KIR2DL das células NK podem ser produzidos por métodos compreendendo: imunizar um mamífero não humano com um imunogene compreendendo um polipeptídeo KIR2DL; preparar anticorpos monoclonais a partir do animal 28 imunizado, em que os anticorpos monoclonais ligam ao polipeptídeo KIR2DL, selecionar anticorpos monoclonais de (b) que fazem uma reação cruzada com, pelo menos dois serotipos diferentes de polipeptídeos KIR2DL, e selecionar anticorpos monoclonais de (c) que inibam a inibição mediada por KIR2DL das células NK.

Esta ordem de etapas (c) e (d) pode ser alterada. Opcionalmente, o método pode ainda compreender etapas adicionais de fabricar fragmentos ou derivados do anticorpo monoclonal, como revelado a seguir. Num aspeto preferido, o animal não humano é um mamífero, tal como um roedor (por exemplo, ratinho, rato, etc.), bovino, porcino, cavalo, coelho, cabra, ovelha, etc. Igualmente, o mamífero não humano pode ser geneticamente modificado ou desenhado por engenharia genética para produzir anticorpos "humanos".

Num outro aspeto, o método compreende: selecionar, a partir de uma biblioteca ou repertório, um anticorpo monoclonal ou um fragmento ou derivado do mesmo que faça uma reação cruzada com, pelo menos dois serotipos diferentes de polipeptídeos KIR2DL, e selecionar um anticorpo de (a) que iniba a inibição mediada por KIR2DL das células NK. 0 repertório pode ser qualquer repertório (recombinante) de anticorpos ou fragmentos dos mesmos, opcionalmente exibido por qualquer estrutura adequada (por exemplo, fago, bactéria, complexo sintético, etc.). A seleção de anticorpos inibitórios pode ser realizada como exposto a seguir e ilustrado ainda nos exemplos.

Podem ser usados métodos semelhantes para a preparação de anticorpos que bloqueiam um receptor NKG2A/C de células NK. receptor KIR3DL ou um Competição com anticorpos de neutralizadores reação cruzada e/ou

Num outro aspeto, a especificação revela anticorpos 29 que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK caracterizada pela capacidade em competir com anticorpos neutralizadores e/ou de reação cruzada que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK de acordo com a invenção para ligação ao cognato KIR's e/ou para ligar ao mesmo epítopo/região do determinante antigénico como tais anticorpos conhecidos, para utilização nos métodos da invenção. Por exemplo, num aspeto, a especificação revela um anticorpo anti-KIR caracterizado pela sua capacidade em competir com o anticorpo NKVSF1, 1-7F9, e/ou anticorpo DF200 . A frase "compete com" quando se refere a um anticorpo monoclonal particular (por exemplo, DF200, NKVSF1, etc.) significa que o anticorpo anti-KIR compete com o anticorpo referenciado ou outra molécula num ensaio de ligação usando ou as moléculas de KIR recombinantes ou moléculas de KIR expressas à superfície. Por exemplo, se um anticorpo anti-KIR reduz, de forma detetável, a ligação do DF200 a uma molécula de KIR normalmente ligada por DF200 num ensaio de ligação, pode-se dizer que o anticorpo anti-KIR "compete" com DF200. Um anticorpo anti-KIR que "compete" com DF200 pode competir com DF200 para ligação ao receptor humano KIR2DL1, ao receptor humano KIR2DL2/3, ou ambos receptores humanos KIR2DL1 e KIR2DL2/3.

Anticorpos que competem com DF200, 1-7F9, e/ou NKVSF1 podem ser identificados usando ensaios de classificação conhecidos. Um número de tais ensaios é praticado rotineiramente e são bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 660 827). Os protocolos baseados em, por exemplo, ELISA's, radio-imunoensaios, técnica de Western blotting, e a utilização de análise BIACORE são adequados para utilização em tais estudos de competição.

Alguém pode, por exemplo, pré-misturar o anticorpo de controlo (por exemplo, DF200, NKVSF1, ou 1-7F9) com 30 quantidades variadas do anticorpo teste (por exemplo, em razões de cerca de 1:1, 1:2, 1:10 ou cerca de 1:100) durante um periodo de tempo antes de o aplicar a uma amostra de antígeno KIR. Em alternativa, o controlo e as quantidades variadas de anticorpo teste podem simplesmente ser adicionados separadamente e misturados durante a exposição à amostra de antígeno KIR. Desde que alguém consiga distinguir anticorpos ligados dos livres (por exemplo, usando técnicas de separação ou lavagem para eliminar anticorpos não ligados) e o anticorpo de controlo do anticorpo teste (por exemplo, usando anticorpos secundários específicos de isotipos ou específicos de espécies ou rotulando especificamente o anticorpo de controlo com um rótulo detetável) será possível determinar se o anticorpo teste reduz a ligação do anticorpo de controlo aos diferentes antígenos KIR2DL, indicando que o anticorpo teste reconhece substancialmente o mesmo epítopo que o controlo. A ligação do anticorpo de controlo (rotulado) na presença de um anticorpo completamente irrelevante (que não liga o KIR) pode servir como o valor alto do controlo. O valor baixo do controlo pode ser obtido incubando o anticorpo de controlo rotulado com o mesmo anticorpo de controlo mas não rotulado, onde a competição ocorreria e reduziria a ligação do anticorpo rotulado. Num ensaio teste, uma redução significativa na reatividade do anticorpo rotulado na presença de um anticorpo teste é indicativa de um anticorpo teste que reconhece substancialmente o mesmo epítopo, isto é, um que compete com o anticorpo de controlo rotulado. Por exemplo, qualquer anticorpo teste que reduz a ligação do anticorpo de controlo e um ou ambos dos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL3 por, pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 70% (por exemplo, cerca de 65-100%), a qualquer razão de anticorpo de controlo: teste entre cerca de 1:1 ou 1:10 e cerca de 31 1:100 é considerado ser um anticorpo que compete com o controlo. A competição pode também ser avaliada por, por exemplo, citometria de fluxo. Em tal teste, as células que transportam um determinado KIR podem ser incubadas primeiro com um anticorpo de controlo, e depois com o anticorpo teste rotulado com um fluorocromo ou biotina. Diz-se que o anticorpo compete com o anticorpo de controlo se a ligação obtida sobre a pré-incubação com uma quantidade saturante do anticorpo de controlo é cerca de 80%, preferencialmente cerca de 50%, cerca de 40% ou menos (por exemplo, cerca de 30%) da ligação (como medida por meio de fluorescência) obtida pelo anticorpo teste sem pré-incubação com o anticorpo de controlo. Em alternativa, diz-se que um anticorpo compete com o anticorpo de controlo se a ligação obtida com um anticorpo de controlo rotulado (por um fluorocromo ou biotina) nas células pré-incubadas com uma quantidade saturante de anticorpo teste é cerca de 80%, preferencialmente cerca de 50%, cerca de 40%, ou menos (por exemplo, cerca de 30%) da ligação obtida sem pré-incubação com o anticorpo teste.

Um ensaio de competição simples no qual um anticorpo teste é pré-adsorvido e aplicado a uma concentração saturante a uma superfície na qual tanto o KIR2DL1 ou KIR2DL2/3, ou ambos, são imobilizados também pode ser empregue de forma vantajosa. A superfície no ensaio de competição simples é preferencialmente um chip BIACORE (ou outro meio adequado para a análise de ressonância de Plasmon de superfície). A ligação de um anticorpo de controlo à superfície revestida por KIR é medida. Esta ligação à superfície contendo KIR do anticorpo de controlo isolado é comparada com a ligação do anticorpo de controlo na presença de um anticorpo teste. Uma redução significativa na ligação à superfície contendo KIR2DL1 e KIR2DL2/3 pelo anticorpo de controlo na presença de um 32 anticorpo teste indica que o anticorpo teste reconhece substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo de controlo de tal maneira que o anticorpo teste "compete" com o anticorpo de controlo. Qualquer anticorpo teste que reduz a ligação do anticorpo de controlo a ambos antigenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 em, pelo menos cerca de 20% ou mais, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou mais, pode ser considerado como um anticorpo que compete com o anticorpo de controlo. Preferencialmente, tal anticorpo teste reduzirá a ligação do anticorpo de controlo a cada de, pelo menos os antigenos KIR2DL1, 2, e 3 em, pelo menos cerca de 50% (por exemplo, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, ou mais). Será apreciado que a ordem dos anticorpos controlo e teste pode ser revertida; isto é, o anticorpo de controlo pode ser ligado primeiro à superfície e depois o anticorpo teste é trazido em contacto com a superfície daí em diante num ensaio de competição. Preferencialmente, o anticorpo que tem maior afinidade para os antigenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 é ligado primeiro à superfície contendo KIR2DL1 e KIR2DL2/3, já que se esperará que a diminuição na ligação observada para o segundo anticorpo (assumindo que os anticorpos estão a competir) será de maior magnitude. Exemplos adicionais de tais ensaios são providenciados nos Exemplos aqui contidos, e em, por exemplo, Saunal e Regenmortel, (1995) J. Immunol. Métodos 183: 33-41. A determinação de se um anticorpo ou outro agente se liga ou não à mesma ou substancialmente à mesma região do epítopo como, por exemplo, DF200, NKVSF1, ou 1-7F9, pode ser reazaliada usando métodos conhecidos por alguém habilitado na arte. Num exemplo de métodos de caracterização/mapeamento do epítopo, uma região do epítopo para um anticorpo anti-KIR pode ser determinada por "pegada" do epítopo usando a modificação química dos aminas/carboxilos expostos na proteína KIR2DL1 ou 33 KIR2DL2/3. Um exemplo específico de tal técnica de pegada é a utilização de HXMS (intercâmbio de hidrogéno-deutério detetado por espectrometria de massa) em que um intercâmbio de hidrogéno-deutério dos protões amida da proteína do receptor e ligando, ligação, e ocorre intercâmbio inverso, em que os grupos amida determinantes participantes na ligação das proteínas são protegidos do intercâmbio inverso e por isso permanecerão deuteriados. As regiões relevantes podem ser identificadas nesta fase por proteólise péptica, separação rápida por cromatografia líquida de alta eficiência em colunas de microboro, e/ou espectrometria de massa com ionização por electrospray. Ver, por exemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) e/ou Engen, J.R. e Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Outro exemplo de uma técnica de identificação do epítopo adequada é o mapeamento de epítopo por ressonância magnética nuclear (NMR), onde tipicamente a posição dos sinais em espectros NMR bidimensionais do antígeno livre e do antígeno complexado com o péptido de ligação ao antígeno, tal como um anticorpo, são comparadas. O antígeno tipicamente é seletivamente rotulado isotopicamente com 15N de maneira que apenas sejam vistos no espectro NMR os sinais correspondentes ao antígeno e não os sinais do péptido de ligação ao antígeno. Os sinais do antígeno que se originam dos aminoácidos envolvidos na interação com o péptido de ligação ao antígeno tipicamente modificarão de posição nos espectros do complexo comparado com os espectros do antígeno livre, e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados dessa maneira. Ver, por exemplo, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004;(44):149-67; Huang et al, Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); e Saito e Patterson, Methods. 1996 Jun; 9(3):516-24. A caracterização/mapeamento do epítopo também pode ser realizada usando métodos de espectrometria de massa. Ver, 34 por exemplo, Downward, J Mass Spectrom. 2000 Apr;35(4):493-503 e Kiselar e Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9) :1792-801.

As ténicas de digestão com proteases também podem ser úteis no contexto do mapeamento e identificação do epítopo. Regiões/sequências relevantes do determinante antigénico podem ser determinadas por digestão com proteases, por exemplo usando tripsina numa razão de cerca de 1:50 para KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 na digestão a 37 °C e pH 7-8, seguida de análise por espectrometria de massa (MS) para a identificação do péptido. Os péptidos protegidos da clivagem por tripsina pelo anticorpo anti-KIR podem, subsequentemente, ser identificados por comparação das amostras sujeitas à digestão pela tripsina e amostras incubadas com anticorpo e depois sujeitas à digestão por, por exemplo, tripsina (revelando assim uma pegada para o anticorpo). Outras enzimas como quimotripsina, pepsina, etc., também ou em alternativa podem ser usadas em métodos de caracterização do epítopo semelhantes. Além disso, a digestão enzimática pode providenciar um método rápido para analizar se uma sequência de determinante antigénico potencial está dentro de uma região do KIR2DL1 no contexto de um agente de ligação ao KIR. Se o polipeptídeo não é exposto à superfície, muito provavelmente não será relevante em termos de imunogenicidade/antigenicidade. Ver, por exemplo, Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27(1):15-9 para uma discussão de técnicas semelhantes. A mutagénese sítio-dirigida é outra técnica útil para elucidação de um epítopo de ligação. Por exemplo, no "digitalização de alanina", cada resíduo dentro de um segmento de proteína é substituído com um resíduo de alanina, e medidas as consequências para a afinidade da ligação. Se a mutação conduz a uma re-sucção significativa na afinidade da ligação, é mais provavelmente envolvida na ligação. Os anticorpos monoclonais específicos para 35 epítopos estruturais (isto é, anticorpos que não ligam a proteína desdobrada) podem ser usados para verificar que a substituição da alanina não influencia a dobragem global da proteína. Ver, por exemplo, Clackson e Wells, Science 1995; 267:383-386; e Wells, Proc Natl Acad Sei USA 1996; 93:1-6. A microscopia eletrónica também pode ser usada para rastrear por "pegada" o epítopo. Por exemplo, Wang et al., Nature 1992;355: 275-278 usou a aplicação coordenada de microscopia crioeletrónica, reconstrução de imagem tridimensional, e cristalografia de raios-X para determinar a pegada física de um fragmento Fab na superfície da cápside de um vírus do mosaico do caupi nativo.

Outras formas de ensaio "livre de rótulo" para a avaliação do epítopo incluem ressonância de Plasmon de superfície (SPR, BIACORE) e espectroscopia de interferência reflectométrica (RifS). Ver, por exemplo, Fágerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990; 3:208-14; Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944.

Apesar de frequentemente relacionados, descrever uma proteína em termos de competição com uma proteína de ligação referência versus a capacidade da proteína se ligar ao mesmo epítopo ou epítopo substancialmente semelhante como proteína referência em alguns casos implica propriedades biológicas e físico-químicas significativamente diferentes. A competição entre proteínas de ligação implica que o anticorpo anti-KIR teste se liga a um epítopo que, pelo menos parcialmente, se sobrepõe com um epítopo ligado por um anticorpo anti-KIR ou está localizado próximo o suficiente a tal epítopo de tal maneira que tal anticorpo anti-KIR compete com anticorpos anti-KIR conhecidos devido ao impedimento estérico. Um grande anticorpo anti-KIR, tal como um anticorpo anti-KIR que consiste em ou compreende um anticorpo, pode competir com 36 um anticorpo anti-KIR referência, sem ligar ao mesmo epitopo ou a epítopos semelhantes devido ao grande tamanho dos anticorpos. Tal anticorpo anti-KIR competitivo pode ser útil para bloguear interações associadas à mesma região determinante antigénica como o anticorpo anti-KIR referência apesar de ligar um determinante antigénico diferente.

COMPOSIÇÃO E ADMINISTRAÇÃO A revelação diz respeito a uma composição que compreende, pelo menos um composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK e um anticorpo terapêutico, a utilização da composição para aumentar a eficiência do anticorpo terapêutico, para aumentar o ADCC num sujeito tratado com um anticorpo terapêutico, ou para tratar um sujeito tendo uma doença, mais particularmente uma doença que requer o esgotamento das células alvo, preferencialmente das células doentes tal como células infetadas com vírus, células tumorais ou outras células patogénicas. Preferencialmente, a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em cancro, uma doença auto-imune, uma doença inflamatória, uma doença virai. Uma doença também se refere a uma rejeição de enxerto, mais particularmente rejeição de aloenxertos, e doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD). 0 anticorpo terapêutico pode ser ligado pelo CD16, preferencialmente através da sua região Fc. Preferencialmente, o anticorpo terapêutico tem uma porção Fc da IgGl ou da IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, ainda preferencialmente um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou um fragmento do mesmo. 0 composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK liga, pelo menos um dos receptores humanos KIR ou NKG2A/C e 37 inibe a inibição mediada por KIR2DL, KIR3DL e/ou NKG2A/C relacionada da citotoxicidade da célula NK. Preferencialmente, o receptor humano KIR2DL é selecionado a partir do grupo que consiste nos receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 e o receptor humano KIR3DL é selecionado a partir do grupo que consiste em KIR3DL1 e KIR3DL2.

Num aspeto preferido, o composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK liga, pelo menos um dos receptores humanos KIR2DL e inibe a inibição mediada por KIR2DL relacionada da citotoxicidade da célula NK. Preferencialmente, o receptor humano KIR2DL é selecionado a partir do grupo que consiste nos receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3. Num aspeto preferido, o composto, tal como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK liga um determinante comum dos receptores humanos KIR2DL e inibe a inibição mediada por KIR2DL da citotoxicidade da célula NK. Mais preferencialmente, o composto, tal como um anticorpo, liga um determinante comum dos receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 e inibe a inibição mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 da citotoxicidade da célula NK. Num aspeto particular, o composto, tal como um anticorpo, inibe a ligação de uma molécula do alelo HLA-C contendo um resíduo de Lys na posição 80 a um receptor humano KIR2DL1, e a ligação de uma molécula do alelo HLA-C contendo um resíduo de Asn na posição 80 a receptores humanos KIR2DL2 e KIR2DL3. Noutro aspeto particular, este anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. Opcionalmente, este anticorpo compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 pela ligação a um receptor KIR na superfície de uma célula NK humana. Num aspeto preferido, o anticorpo é o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. 38 A composição de acordo com a presente revelação pode compreender uma combinação de vários compostos, preferencialmente anticorpos ou um fragmento dos mesmos, que bloqueia diferentes receptores inibitórios das células NK. Preferencialmente, compostos, preferencialmente anticorpos ou um fragmento dos mesmos, que bloqueiam os receptores inibitórios de células NK são específicos de um receptor inibitório selecionado a partir de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A e NKG2C e são capazes de inibir a inibição mediada por KIR ou NKG2A/C relacionada da citotoxicidade da célula NK. Mais preferencialmente, a combinação de compostos "neutralizadores" é capaz de inibir a inibição mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 da citotoxicidade da célula NK.

As composições desta revelação podem compreender qualquer veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, tipicamente um tampão, soluções isotónicas, suspensão aquosa, opcionalmente suplementada com agentes estabilizadores, conservantes, etc. As formulações típicas incluem uma solução salina e, opcionalmente, uma molécula protetora ou estabilizadora, tal como uma proteína de elevado peso molecular (por exemplo, albumina do soro humano).

De acordo com os métodos e composições da presente revelação, compostos, tais como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK e anticorpos terapêuticos são administrados numa quantidade eficiente. A quantidade eficiente de anticorpos terapêuticos administrada ao receptor pode ser de entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 20 mg/kg. A quantidade eficiente de anticorpo depende, contudo, da forma do anticorpo (Ig inteiro, ou fragmentos), afinidade do mAc e parâmetro f armacocinético que têm que ser determinados para cada anticorpo particular. 39 A quantidade eficiente de compostos, tais como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK administrada ao receptor pode ser de entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 20 mg/kg. A quantidade eficiente de anticorpo depende, contudo, da forma do anticorpo (Ig inteiro, ou fragmentos), afinidade do mAc e parâmetro farmacocinético que têm que ser determinados para o anticorpo particular. Tipicamente, um anticorpo de comprimento completo seria administrado uma vez cada duas semanas, uma vez cada três semanas, ou uma vez cada quatro semanas, enquanto um fragmento de anticorpo poderia tipicamente ser administrado mais frequentemente, por exemplo, mais do que uma vez por semana ou uma vez por semana.

Uma composição de acordo com a presente revelação pode ser dada por injeção diretamente a um sujeito, tipicamente por via intravenosa, intraperitoneal, intra-arterial, intramuscular ou transdérmica. Demonstrou-se que vários anticorpos monoclonais são eficientes em situações clínicas, tais como Rituxan (Rituximab) ou Xolair (Omalizumab), e regimes de administração semelhantes (isto é, formulações e/ou doses e/ou protocolos de administração) podem ser usados com a composição desta revelação.

Além disso, as composições desta revelação podem ainda compreender ou podem ser usadas em combinação com outros agentes ativos ou programas terapêuticos tais como quimioterapia ou outras imunoterapias, tanto simultaneamente como sequencialmente.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de um anticorpo pan-KIR2DL

Este exemplo descreve a geração de anticorpos monoclonais anti-KIR murinos e a identificação do DF200, um anticorpo monoclonal novo contra um determinante comum dos receptores NK humanos KIR2DL.

Purificação de PBL's e geração de linhas de células NK 40 policlonais ou clonais

Os PBL's foram derivados de dadores saudáveis por gradientes de Ficoll-Hypaque e esgotamento de células aderentes plásticas. Para obter células NK enriquecidas, os PBL' s foram incubados com mAc's anti CD3, anti CD4 e anti HLA-DR (30 minutos a 4°C), seguido de contas magnéticas de cabra anti-ratinho (Dynal) (30 minutos a 4°C) e seleção imunomagnética por métodos conhecidos na arte (Pende et al., J Exp Med. 1999; 190(10):1505-16. Células CD3 negativas, CD4 negativas, DR negativas são cultivadas em células alimentadoras irradiadas e 100 U/ml de Interleucina 2 (Proleucina, Chiron Corporation) e 1,5 ng/ml de Fitohemaglutinina A (Gibco BRL) para obter populações de células NK policlonais. As células NK são clonadas por diluição limite e os clones ds células NK são caracterizados por citometria de fluxo para expressão dos receptores de superfície das células.

Foram usados os clones seguintes neste estudo: CPU, CN5 e CN505 são clones KIR2DL1 positivos e são marcados por EB6 ou anticorpos XA-141. CN12 e CP502 são clones KIR2DL3 positivos e são marcados pelo anticorpo GL183.

Análise de citometria de fluxo

Os mAc's usados são produzidos no laboratório JT3A (IgG2a, anti CD3), EB6 e GL183 (IgGl anti KIR2DL1 e KIR2DL3 respetivamente), XA-141 igM anti KIR2DL1 (mesma especificidade quando comparado com EB6, anti CD4 (HP2.6), anti DR (Dl.12, IgG2a) . Em vez de JT3A, HP2.6, e DR1.12, podem ser usados mAc's comercialmente disponíveis das mesmas especificidades, por exemplo de Beckman coulter Inc, Fullerton, CA. EB6 e GL183 estão comercialmente disponíveis em Beckman Coulter Inc, Fullerton, CA. XA-141 não está comercialmente disponível mas EB6 pode ser usado para reconstituição controlo da lise como descrito em Moretta (1993, supra). 41

Citometria de fluxo

As células foram marcadas com os anticorpos apropriados (30 minutos a 4°C) seguido de anticorpos anti-ratinho policlonais conjugados com PE ou FITC (Southern Biotechnology Associates Inc). As amostras foram analisadas por análise citofluorométrica num aparelho FACSAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Experiências de citotoxicidade A atividade citolitica dos clones de NK foi avaliada usando um ensaio de libertação 4hr 51 Cr padrão, no qual as células NK efetoras foram testadas em linhas de células Cw3 ou Cw4 positivas conhecidas pela sua sensibilidade à lise das células NK. Todos os alvos são usados a 5000 células por poço numa placa de microtitulação e o efetor na razão alvo é normalmente 4 efetores por células alvo. O ensaio citolítico é realizado com ou sem sobrenadante dos anticorpos monoclonais indicados a uma diluição de ½. O procedimento é essencialmente o mesmo que o descrito em Moretta et al. (1993, supra).

Geração de novos mAc

Os mAc's foram gerados imunizando ratinhos Balb C com 5 semanas de idade com linhas de células NK policlonais ou monoclonais ativadas como descrito em Moretta et al. (J Exp Med. 1990; 171 (3):695-714 e 1990,- 172 (6): 1589-98, uma revelação e cada da qual é incorporada aqui por referência. Após diferentes fusões celulares, os mAc'^ foram primeiro selecionados pela sua capacidade de terem reações cruzadas com linhas e clones de células NK EB6 e GL183 positivas. Os anticorpos monoclonais positivos foram ainda classificados pela sua capacidade em reconstituir a lise por clones NK EB6 positivos ou GL183 positivos de alvos positivos a Cw4 ou Cw3, respetivamente.

Resultados

Observou-se que um dos anticorpos monoclonais, o mAc DF200, reagiu com vários membros da familia KIR incluindo 42 KIR2DL1, KIR2DL2/3. Em relação à marcação das células NK com mAc DF2 0 0 ambas células KIR2DL1+ e KIR2DL2/3+ foram marcadas claramente.

Foram usados os clones NK expressando um ou outro (ou mesmo ambos) destes receptores inibitórios específicos da classe I HLA como células efetoras contra células alvo expressando um ou mais alelos HLA-C. Como esperado, os clones NK KIR2DL1+ exibiram pouca, se alguma, atividade citolítica contra as células alvo expressando clones NK HLA-Cw4 e KIR2DL3+ exibiram pouca, ou nenhuma, atividade nos alvos Cw3 positivos. Contudo, na presença de mAc DF200 (usado para mascarar os seus receptores KIR2DL) , os clones NK ficaram incapazes de reconhecer os seus ligandos HLA-C e exibiram forte atividade citolítica em alvos HLA-Cw3 ou HLA-Cw4 positivos.

Por exemplo, a linha de células C1R (linha de células CW4+ EBV, ATCC N.° CRL 1993) não foi morta pelos clones KIR2DL1+ NK (CN5/CN505), mas a inibição podia ser eficientemente revertida através da utilização quer de DF200 ou de um mAc anti-KIR2DLl convencional. Por outro lado, os clones NK que expressam o fenótipo KIR2DL2/3+ KIR2DL1- (CN12) mataram eficientemente Cl R e esta morte não foi afetada pelo mAc DF200 . Podem ser obtidos resultados semelhantes com clones NK KIR2DL2 ou KIR2DL3 positivos em alvos Cw3 positivos.

Exemplo 2: Análise Biacore de interações mAc DF200/KIR2DL1 e mAc DF200/KIR2DL3

Este exemplo descreve uma avaliação das respetivas afinidades de DF200 para ligar a KIR2DL1 e KIR2DL3.

Produção e purificação de proteínas recombinantes

As proteínas recombinantes KIR 2DL1 e KIR 2DL3 foram produzidas em E. coli. Os ADNc que codificam o domínio extracelular completo de KIR 2DL1 e KIR 2DL3 foram amplificados por PCR a partir do clone pCDM8 vetor 47.11 (Biassoni et al, Eur J Immunol. 1993;23(5):1083-7) e clone 43 RSVS(gpt)183 vetor 6 (Wagtman et al., Immunity 1995 May;2(5):439-49) respetivamente, usandos os primers seguintes:

Sense: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3' (SEQ. ID N.0 3)

Anti-sense: 5'-CCCAAGCTTGGGTTATGTGACAGAAACAAGCAGTGG-3' (SEQ. ID N.0 4)

Estes foram clonados num vetor de expressão pMLl alinhado com uma sequência que codificava um sinal de biotinilação (Saulquin et al., 2003). A expressão das proteínas foi realizada na estirpe bacteriana BL21 (DE3) de E. coli obtida a partir de Invitrogen. As bactérias transfetadas foram crescidas para OD60o = 0,6 a 37°C em meio suplementado com ampicilina (100 pg/ml) e induzida com 1 mM IPTG.

As proteínas foram recuperadas a partir de corpos de inclusão em condições de desnaturação (8 M ureia). O redobramento das proteínas recombinantes foi realizado em Tris 20 mM, pH 7,8, tampão de NaCl 150 mM contendo L-arginina (400 mM, Sigma) e β-mercaptoetanol (1 mM) , à temperatura ambiente, diminuindo a concentração de ureia numa diálise em seis passos (4, 3, 2, 1, 0,5 e 0 M ureia, respetivamente). As glutationas reduzida e oxidada (5 mM e 0,5 mM respetivamente, Sigma) foram adicionadas durante os passos da diálise de 0,5 e 0 M. Finalmente, as proteínas foram dialisadas extensivamente contra Tris 10 mM, pH 7,5, tampão de NaCl 150 mM. As proteínas redobradas solúveis foram concentradas e depois purificadas numa coluna Superdex 200 com exclusão molecular (Pharmacia; sistema AKTA).

Análise Biacore

As medidas de ressonância de Plasmon de superfície foram realizadas num aparelho Biacore (Biacore).

Em todas as experiências Biacore o tampão HBS suplementado com 0,05% tensoativo P20 serviu como tampão de 44 corrida .

Imobilização da proteína. As proteínas recombinantes KIR 2DL1 e KIR 2DL3 foram imobilizadas covalentemente a grupos carboxilo na camada de dextrano num Sensor Chip CM5 (Biacore). A superífice do sensor chip foi ativada com EDC/NHS (Netil-N'-(3- dimetilaminopropilo)carbodiimidehidrocloreto e N- hidroxisuccinimida, Biacore). Foram injetadas proteínas, em tampão de união (10 mM acetato pH 4,5). A desativação dos restantes grupos ativados foi realizada usando 100 mM etanolamina pH8 (Biacore).

Medições de afinidade. Para medições cinéticas, foram aplicadas várias concentrações do anticorpo solúvel (10 7 a 4xlO~10 M) na amostra imobilizada. Foram realizadas medições a uma taxa de fluxo contínua de 20 μΐ/min. Por cada ciclo, a superfície do sensor chip foi regenerada com uma injeção de 5 μΐ de 10 mM NaOH pH 11.

Foi usado o Programa de Avaliação Cinético BIAlogue (BIAavaliação 3.1, Biacore) para análise dos dados.

Resultados Quadro I Análise BIAcore da ligaçao do mAc DF200 ao KIR 2DL1 e KIR 2DL3 imobilizado Antígeno KD (10“9 M) KIR 2DL1 10,9 +/- 3,8 KIR 2DL3 2,0 +/- 1,9 KD: Constante de dissociação O analito solúvel (40 μΐ a várias concentrações) foi injetado a uma taxa de fluxo de 20 μΐ/min em tampão HBS, em camadas de dextrano entendo 500 ou 540 unidades de reflectância (RU), e 1000 ou 700 RU de KIR 2DL1 e KIR 2DL3, respetivamente. Os dados são representativos de 6 experiências independentes. 45

Exemplo 3: Intensificação do ADCC usando uma combinação de Rituxan e mAc anti-KIR

Esta experiência mostra que o Rituxan sozinho medeia essencialmente no ADCC por um clone NK KIR2DL1 positivo em células alvo Cw4 positivas, enquanto o ADCC do clone KIR2DL1 positivo é grandemente melhorado na presença de um anticorpo antÍ-KIR2DL1.

Preparação de clones NK humanos

As células mononucleares sanguíneas esgotadas de células T por seleção imunomagnética anti-CD3 (Miltenyi) são colocadas em placas em condições de diluição limitante, ativadas com fitohemaglutinina (PHA) (Biochrom KG, Berlim, Alemanha), e cultivadas com interleucina (IL)-2 (Chiron B.V., Amsterdão, Holanda) e células alimentadoras irradiadas. As eficiências de clonagem são equivalentes em todos os dados e oscilam entre 1 em 5 e 1 em 10 células NK colocadas em placas. As células NK clonadas são classificadas por alorreatividade através de citotoxicidade de libertação 51 Cr padrão contra as linhas de células de linfoblastoides B do vírus transformado de Epstein-Barr de tipo HLA conhecido a uma razão efetor:alvo de 10:1. Os clones exibindo ^ 30% de lise foram classificados como alorreativos. Por norma, os clones ou exibiam < 5% ou > 40% de lise.

Intensificação de ADCC mediada por Rituxan por um clone da célula NK KIR2DL1 positivo A atividade citolítica do clone NK é avaliada através de um ensaio de libertação 4hr 51 Cr padrão, no qual as células NK efetoras foram testadas em linhas de células EBV HLA-Cw3 ou HLA-Cw4 positivas (CD20 positivas), conhecidas pela sua sensibilidade à lise das células NK. Todos os alvos são usados a 5000 células por poço numa placa de microtitulação e a uma dada razão efetor (clone da célula NK) no alvo. Em certas experiências, o rituximab anti CD20 terapêutico quimérico (Rituxan, Idec) é adicionado a 5 46 pg/ml é adicionado à mistura alvo efetora. Em certas experiências, o anticorpo EB6 (anti KIR2DL1) a 10 pg/ml é adicionado à mistura alvo efetora. Esta experiência mostrou gue o Rituxan sozinho medeia essencialmente no ADCC através do clone NK KIR2DL1 positivo no alvo Cw4 positivo. O ADCC do clone KIR2DL1 positivo é grandemente melhorado na presença de anticorpo anti KIR2DL1.

Exemplo 4: Intensificação da morte mediada pelas NK das células infetadas com virus

Os mAc's anti-KIR são testados pela sua capacidade de melhorar a morte mediada pelas NK de células infetadas com virus através de ensaios de libertação Crómio-51 (51Cr) padrão (ensaios de citotoxicidade).

Os ensaios 51 Cr são bem conhecidos na arte. No contexto da presente invenção, os ensaios de libertação de 51 Cr são geralmente realizados numa de duas configurações, dependendo de se o objetivo é testar se 1) os mAc's anti-KIR por si mesmos melhoram a morte mediada pelas NK de células infetadas com virus ou 2) se os mAc's anti-KIR melhoram a eficácia de outros mAc's terapêuticos para induzir a morte das células alvo expressando o ligando de outros mAc terapêuticos. A única diferença entre estas duas configurações gerais está relacionada com a escolha da população de células NK precisa e da população de células alvo. A titulo de exemplo, o método seguinte descreve como testar se um mAc anti-KIR pode melhorar a eficácia de outros mAc' s terapêuticos usados na terapêutica anti-viral, neste caso mA^s anti-CD4 sendo desenvolvidos para tratamento do HIV. Os mAc' s anti-CD4 ligam-se a CD4 nas células T, infetadas ou não pelo HIV, e ao mesmo tempo podem ligar-se a CD16, o receptor Fc ativador nas células NK, estimulando assim as células NK a matar as células alvo que expressam o CD4. Contudo, este efeito estimulatório é contra-balanceado pela sinalização inibitória via KIR, após compromisso do HLA-C. Quando ambos mAc anti-CD4 e anti-KIR 47 são adicionados ao ensaio 51 Cr ao mesmo tempo, o nivel de morte é mais elevado do que se o anti-CD4 for adicionado sozinho. A experiência é realizada com a linha das células NK designada YTS-2DL1 que não lisa a linha de células B 721.221 transfetadas com HLA-C e CD4, porque HLA-Cw4 providencia proteção entregando sinalização inibitória à célula NK, via KIR.

As células alvo são marcadas com 51Cr durante 1 hora a 37°C, lavadas, e colocadas numa placa a 5000 células/poço em placas de fundo com 96 poços, junto com vários números de células NK, para proporcionar razões efetortalvo de 0,3:1, 1:1, 3:1 e 9:1. Depois, um mAc anti-CD4 é adicionado por si só, a diferentes concentrações desde 1-50 ug/ml (concentração final), ou às mesmas concentrações junto com 1 ug/ml de um mAc anti-KIR. A placa é incubada a 37°C durante 4 horas, centrifugada, e o sobrenadante é colhido e contado. A quantidade de 51 Cr no sobrenadante é proporcional à quantidade de mortalidade de células alvo que ocorreu. Nesta experiência, o mesmo nível de mortalidade é obtido após incubação com 50 ug/ml de anti-CD4 que com 2 ug/ml de anti-CD4 mais 1 ug/ml de mAc anti-KIR, demonstrando que o mAc anti-KIR melhora significativamente a eficácia dos mAc's anti-CD4. Uma melhoria semelhante da capacidade dos mAc' s anti-CD4 induzirem a morte celular é esperada quando se usam células infetadas pelo HIV como alvos, uma vez que o mecanismo é o mesmo, mas devido a preocupações de segurança as experiências são preferencialmente realizadas com células não infetadas.

Exemplo 5: Morte promovida pelo anticorpo anti-KIR de células alvo infetadas pelo HIV

As células NK são importantes no controlo de infeções virais. Em pacientes infetados pelo HIV com SIDA, têm sido reportadas reduções nos números e função das células NK. Em estudos prévios, foi observada uma expressão aumentada de 48 receptores exterminadores tipo Ig (KIR) em pacientes com HIV com doença controlada. Os KIR são expressos em células NK e em células T e reconhecem as moléculas da classe I do MHC nas células alvo. A interação entre KIR e os seus ligandos nas células alvo pode conduzir tanto à inibição como à activação das células NK, dependendo do tipo de molécula KIR. Foi demonstrada previamente que a discordância entre ligando KIR e células NK pode matar alvos tumorais.

Neste exemplo, para testar se KIR inibitórios podem controlar a morte de NK de alvos infetados pelo HIV, e se a morte pode ser aumentada pelo bloqueio do KIR usando mAc's, a interação entre KIR e moléculas da classe I do MHC foram bloqueadas com um anticorpo anti-KIR. 0 efeito deste tratamento foi medido através da expressão nas células NK de um marcador de desgranulação chamado CD107a, cujo nível de expressão é proporcional à mortalidade provocada pelas células NK. Foi observada uma desgranulação aumentada nas células NK tanto de indivíduos saudáveis como de pacientes infetados pelo HIV quando a interação KIR entre células NK e HLA-C expressando linhas de células foi bloqueada usando o anticorpo l-7F9anti-KIR, demonstrando que as células NK desta população de pacientes são funcionais, e ativáveis quando o KIR é bloqueado. Estes resultados mostram que a ativação das células NK através do bloqueio de KIR inibitórios poderia potencialmente ser um novo tratamento imunoterapêutico para pacientes infetados pelo HIV.

Amostras de sangue 0 sangue foi recebido de 11 indivíduos saudáveis bem como de 10 pacientes infetados pelo HIV-1 de Venhálsan at Sõdersjukhuset em Estocolmo. Todos os pacientes eram do sexo masculino e dos controlos saudáveis três eram do sexo masculino e sete do feminino. Todos os pacientes estavam a ser tratados com terapêutica antirretroviral altamente ativa (HAART) e tinham uma viremia controlada, com seis dos 49 pacientes a apresentarem uma carga virai de <50 cópias/ml de ARN e o resto com uma carga virai entre 77 e 200 cópias/ml de ARN. A contagem mediana de CD4+ par os pacientes infetados pelo HIV-1 foi de 582 CD4+ células/μΐ (intervalo 248-1043). Os PBMC's foram purificados por centrifugação de densidade.

Anticorpos

Os seguintes anticorpos foram comprados da BD Biosciences e usados para marcação FACS, IgG2b anti-humana CD56 (NCAM 16.2) FITC, IgGl anti-humana CD3 (SK7) PerCP, IgGl anti-humana CD56 (B159) APC, anti-humana CD56 (leu-19) PE, anti-humana KIR (NKB1) FITC, IgGl de ratinho anti-humana CD107a (H4A3) purificada e IgGl de ratinho anti-humana CDl07a (H4A3) FITC. KIR2DL1 anti-humano (CDl58a) e KIR2DL2 anti-humano (CD158b) de Immunotech. O mAc anti-KIR(1-7F9) humano, específico para KIR2DL1, -2, e -3, bem como KIR2DS1 e -2 foi descrito nos documentos W02005003168 e W02005003172. IgG4 FITC anti-humana de Southern Biotech foi usada como anticorpo secundário para deteção de 1-7F9. Marcação do receptor NK

Foram marcados 500,000 PBMC's frescos durante 30 minutos a 4°C com anticorpos não rotulados. As células foram lavadas em PBS +1 % FCS e depois marcadas com o Ab secundário durante 10 minutos a 4°C. Após lavagem, as células foram blogueadas com PBS +1 % de de soro de ratinho. As células foram depois marcadas durante 10 minutos a 4°C com anticorpos conjugados contra vários receptores NK e CD56 e CD3. As células foram fixadas em PBS com 1 % de FCS e 1 % de paraformaldeído e guardadas a 4°C até serem analisadas num FACS Calibur de quatro cores. Os resultados foram analisados pelo Cell Quest Pro. O ensaio CD107a PBMC's frescos estimulados durante a noite com 200U/ml IL-2 (Peprotech) em meio RPMI suplementado com PEST e 10% de soro fetal de bezerro (FCS) foram adicionados a uma 50 placa com 96 poços. As células foram bloqueadas para a expressão de fundo do CD107a por adição de 5 pg/ml de mAc CD107a purificado não marcado (BD) . Após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente, as células foram lavadas três vezes com meio RPMI completo. Em algumas ocasiões, os PBMC's foram pré-incubados durante 30 minutos a RT com 100 pg/ml de anticorpo anti-KIR. As células alvo (K562, 721.221, 721.Cw3, 721.Cw4, 721.Cw6, CEM ou células CD4+ autólogas) foram adicionadas a uma razão efetor:alvo de 2:1, com 500.000 células efetoras e 250.000 células alvo por poço. Como um controlo negativo os PBMC's foram incubados com meio completo. Para um volume total de 250 μΐ, foi adicionado 4 μΐ de mAc CD107a anti-humana rotulado com FITC e GolgiStop (BD) . As células foram rapidamente giradas a 500 rpm durante 1 min para promover o contacto entre célula alvo e efetora. Após 4 horas de incubação a 37°C as células foram lavadas em PBS + 1 % de FCS e depois mrcadas para os marcadores de superfície CD56 e CD3 durante 10 minutos a 4°C. As células foram lavadas e fixadas com 1 % de paraformaldeído e depois analisadas no instrumento FACS Calibur. Células alvo

As células alvo usadas para o ensaio CD107a foram as linhas de células defeituosas K562 e 721.221 da classe I do MHC como controlos positivos, e as linhas de células 721.Cw3, 721.Cw4 e 721.Cw6 da classe I do MHC expressantes transfetadas com alelos HLA-C diferentes. A linha de células T CEM foi usada como uma célula alvo uma vez que é susceptível à infeção pelo HIV-1. Todas as linhas de células foram crescidas em meio RPMI suplementado com PEST e 10% FCS.

As células T CD4+ autólogas foram purificadas a partir de PBMC's frescos por Cocktail de Enriquecimento de células T CD4+ Humanas StemSep® e Coloides Magnéticos de acordo com a descrição do fabricante (StemCell Technologies). Foram 51 usadas colunas de separação LS e um íman MidiMACS de Miltenyi Biotec para a etapa de separação. As células T CD4+ foram estimuladas durante 3 dias em meio RPMI suplementado com 20 U/ml de IL-2 (Peprotech) e 5 pg/ml de PHA (Oxoid, Sollentuna, Suécia), PEST e 10% de FCS. As células foram lavadas em meio e depois estimuladas com 10 U/ml IL-2 durante 12 dias adicionais antes de utilização como células alvo no ensaio CD107a.

Infeção de células alvo pelo HIV-1

As células CEM foram infetadas com HIV-1 IIIB (LAI) a 1000xTCID50 por incubação de células e virus durante 4 horas a 37°C, agitando devagar a 100 rpm. As células foram suspensas em meio quente e centrifugadas durante 8 minutos a 1000 rpm, a lavagem foi repetida uma vez e depois as células foram mantidas em placas com 24 poços a 37°C durante 12 dias. Cada 3-4 dias era adicionado meio fresco às culturas. As células foram marcadas para expressão p24 intracelular de maneira a determinar se as células estavam infetadas. 500.000 células foram lavadas em PBS + 1 % de FCS e marcadas com CD4 APC anti-humano durante 10 minutos a 4°C. Após lavagem as células foram fixadas por incubação durante 20 minutos a 4°C com 100 μΐ de solução BD Citofix/Citoperm e depois as células foram lavadas duas vezes em solução BD Perm/Wash. Foram adicionados Ac da IgGl de ratinho anti-p24, KC57 FITC (Beckman Coulter) ou isotipo controlo, diluído 1/20 em solução BD Perm/Wash. Após 45 minutos de incubação a 4°C as células foram lavadas em solução BD Perm/Wash de novo e depois fixadas em PBS com 1 % de PFA e 1 % de FCS antes de analisadas no FACS Calibur. Estatísticas

Os resultados dos controlos saudáveis e pacientes infetados pelo HIV-1 foram comparados estatisticamente através do teste não paramétrico U de Mann-Whitney (teste de classificação de Wilcoxon). 52

Resultados

Expressão alterada de receptores de células NK em indivíduos infetados pelo HIV-1

Para investigar os efeitos da infeção pelo HIV-1 na expressão dos receptores das células NK, PBMC purificados de fresco foram marcados para CD56 e CD3 (Figura la) , bem como para vários receptores NK diferentes. A proporção de células NK CD56+CD3- não diferiu significativamente (P=0,06) entre pacientes infetados pelo HIV-1 tratados com HAART e controlos saudáveis, apesar da mediana ter sido diminuída nos pacientes infetados pelo HIV-1 (Figura lb) . As células NK podem ser divididas em células CD56 claras e CD56 escuras (Figura la) . Neste estudo era possível observar uma ligeira diminuição nas células CD56 escuras CD3- para os pacientes infetados pelo HIV-1 comparado com os controlos saudáveis, mas a diferença não foi significativa.

Foi analisada a expressão de um painel de receptores NK diferentes nas células NK CD56+CD3-. Apesar de não significativa, foi observada uma mediana aumentada na expressão de receptores KIR em pacientes infetados pelo HIV-1 (Figura 2). Foram usados quatro mAc's diferentes para KIR, dos quais três são específicos para KIR sozinhos (KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR3DL1) e um, 1-7F9, tem uma reação cruzada com KIR2DL/S1, KIR2DUS2 e KIR2DL3.

Atividade das células NK medida através da expressão de CD10 7a

Os PBMC's de pacientes infetados pelo HIV-1 e de controlos saudáveis foram estimulados com células alvo K562 sensíveis a NK, que conduziram a um aumento na densidade da superfície celular do marcador de desgranulação CD107a (Figuras 3 a,b), refletindo a morte das células alvo K562 pelas células NK. A percentagem mediana de células CD107a+ CD56+CD3- foi apenas marginalmente superior para os controlos saudáveis do que para os pacientes infetados pelo 53 HIV-1 após estimulação com células K562, (Figura 3c), indicando um função apenas ligeiramente diminuída das células NK em pacientes infetados pelo HIV-1, apesar da diferença não ter sido estatisticamente significativa. Bloqueio de KIR aumenta a expressão de CD107a

Para investigar se é possível usar o ensaio CD107 para detetar morte aumentada mediada pelas NK de células que expressam HLA-C em resposta ao bloqueio dos receptores inibitórios KIR, os receptores KIR foram bloqueados com 1-anticorpo 7F9 humano (IgG4) que se liga a todos os receptores inibitórios KIR2DL, e medida a regulação para cima de CD107a em resposta a linhas de células tumorais

HLA-C positivas. 0 ensaio foi realizado com ou sem bloqueio dos receptores KIR. Quando as células 721.221 transfetadas com diferentes moléculas HLA da classe I foram usadas como células alvo podia ser observada uma expressão aumentada de CD107a quando os receptores KIR eram bloqueados. A expressão aumentada de CD107a nas células NK não foi diferente entre os pacientes infetados pelo HIV-1 e os controlos saudáveis e oscilou entre 0,5-13,6 % (Figura 4a).

Uma vez que era possível que as células infetadas pelo HIV expressassem níveis baixos de ligandos para ativar os receptores NK, e serem menos sensíveis à morte mediada pelas NK do que células não infetadas, foi testado a seguir se era possível obter um efeito de bloquear os KIR quando as células alvo eram infetadas pelo HIV-1. A linha de células T designada CEM, que é susceptível à infeção pelo HIV-1, foi infetada com a estirpe IIIB do HIV-1. As células CEM não infetadas e infetadas 70% (como determinado pela marcação com p24 FACS) foram usadas como alvos no ensaio CD107a e os PBMC's de um indivíduo saudável foram usados como células efetoras. Como se pode observar na Figura 4b, o bloqueio dos KIR usando o anticorpo 1-7F9 induziu um aumento semelhante na expressão de CD107a em ambas células não infetadas e infetadas pelo HIV. Estes resultados 54 sugerem que as células infetadas pelo HIV retêm a expressão dos ligandos para ativar os receptores NK, e que a expressão de HLA-C providencia proteção da lise. Os mAc' s anti-KIR podem ser usados para interferir com esta proteção, tornando as células infetadas pelo HIV sensíveis à morte pelas NK.

Para descobrir se o bloqueio KIR das células NK também pode causar um efeito contra células CD4+ autólogas saudáveis usaram-se blastos de células CD4+ autólogas não infetadas, expandidos em IL-2 e ativados com PHA, como alvos. 0 bloqueio dos KIR pré-incubando as células NK com 1-7F9 aumentou a expressão de CD107a nas células NK com cerca de 10% em duas experiências independentes com linfócitos de indivíduos saudáveis (Figura 4c). Este baixo nível de citotoxicidade contra células alvo saudáveis é consistente com o requisito de compromisso dos receptores NK ativadores por ligandos de ativação induzível pelo stress nas células alvo, que não estão geralmente presentes nos alvos saudáveis. Contudo, é possível que a cultura de blastos CD4 em PHA plus IL-2 tenha conduzido a uma expressão de baixo nível de alguns ligandos de ativação nas mesmas células alvo.

Os resultados deste estudo mostram que as células NK dos pacientes com HIV tratados com HAART são largamente comparáveis com as células NK de dadores saudáveis em relação ao fenótipo e atividade. Ainda mais importante, as experiências descritas nesta invenção indicam que as células NK em pacientes tratados com HAART estão sob regulação negativa pelos KIR inibitórios, e a atividade de tais células NK pode ser melhorada bloqueando os KIR com mAc's anti-KIR. Em conformidade, este grupo de pacientes seria uma boa população alvo para tratamento com mAc's anti-KIR. Por oposição, os pacientes com doença muito ativa enfraqueceram as células NK, que podem não ser ativáveis mesmo se se "remover o travão KIR" com, por exemplo, um 55 anticorpo anti-KIR.

Os termos "um" e "uma" e "o" e referências semelhantes como usados no contexto de descrever a revelação são para serem interpretados de maneira a cobrir ambos o singular e o plural, a menos que indicado em contrário aqui ou claramente contradito por contexto. A recitação dos intervalos de valores aqui pretende meramente servir como um método estenográfico de se referir individualmente a cada valor por separado que cai dentro do intervalo, a menos que indicado em contrário aqui, e cada valor por separado é incorporado na especificação como se fosse individualmente recitado aqui. A menos que argumentado em contrário, todos os valores exatos providenciados aqui são representativos dos valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exatos exemplares providenciados em relação a um fator ou medição particular podem ser considerados para também providenciarem uma medição aproximada correspondente, modificada por "cerca de," onde apropriado).

Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que indicado em contrário aqui ou claramente contradito por contexto. A utilização de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") providenciado aqui, pretende meramente ilustrar melhor a invenção. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando que qualquer elemento é essencial para a prática da invenção a menos que tal seja argumentado explicitamente. A citação dos documentos de patente aqui é feita para conveniência apenas e não reflete qualquer visão da validade, patentabilidade e/ou aplicabilidade de tais documentos de patente. como A descrição aqui de qualquer aspeto ou forma de realização da revelação usando termos tais 56 "compreendendo", "tendo", "incluindo" ou "contendo" com referência a um elemento ou elementos pretende-se que providencie suporte a um aspeto ou forma de realização semelhante da invenção que "consiste em", "consiste essencialmente em", ou "compreende substancialmente" aquele elemento ou elementos particulares, a menos que argumentado em contrário ou claramente contradito por contexto (por exemplo, uma composição descrita aqui como compreendendo um elemento particular deve ser entendida como também descrevendo uma composição consistindo nesse elemento, a menos que argumentado em contrário ou claramente contradito por contexto).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> NOVO NORDISK A/S

<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE TRATAR INFEÇÃO VIRAL

<130> 6 8 74.204-WO <150> PA 2005 00027 <151> 2005-01-06 <160> 4 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 57

Gin vai Gin Leu Vai Gin ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Vai Lys vai Ser cys Lys Ala ser Gly Gly Th»' PHe ser Phe Tyr 20 25 30

Ala Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Phe Ile Pro lie Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu ser Thr ser Thr Ala Tgr 65 70 75

Met Glu Leu ser ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys 85 90 95

Ala Arg Ile Pro ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Asp Met Asp Vai

100 105 HO

Trp Gly Gin Gly Thr Thr vai Thr vai ser ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 pro ser vai Phe Pro Leu Ala Pro cys ser Arg ser Thr Ser Glu ser 130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai 145 150 155 160

Thr vai ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe ’nr va* *er ,rp 16S ' 170 175

Pro Ala vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu ser ser vai vai 180 18 s 190 58

Thr val Pro Ser Ser ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr cys Asn Val 195 200 205 ASP His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg val Glu Ser Lys 210 215 220 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 225 230 235 240 pro Ser val Phe Leu Phe Pro pro Lys Pro Lys A5p Thr Leu Met Ile 245 250 255 ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val val val Asp val Ser Gin Glu 260 265 270 Asp Pro Glu val Gin Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val HÍS 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn ser Thr Tyr Arg 290 295 300 val Val Ser Val Leu Thr val Leu Hi s Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys cys Lys val Ser Asn Lys Gly Leu Pro ser Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu pro Gin val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp Ile Ala val Glu Trp 370 375 330 Glu Ser Asn Gly Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys ser Arg Trp Gin GlU Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser val Met HiS 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu ser Leu 435 440 445

Gly & 59

<210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 2 60

Glu lie val Leu Thr Gin Ser Pro Val Thr Leu ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala ser Gin ser val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr ASp 50 Ala ser Asn Arg Ala 55 Thr Gly Ile Pro Ala 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Met Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser val Phe Ile Phe Pro Pro Ser ASp Glu Gin Leu Lys ser Gly 115 120 125 Thr Ala ser val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gl π Trp Lys val ASp Asn Ala Leu Gl n Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160 Glu Ser val Thr Glu Gin ASp ser Lys Asp ser Thr Tyr Ser Leu ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys val Tyr 180 185 190 Ala cys Glu 195 val Thr His Gin Gly 200 Leu ser ser Pro val 205 Thr Lys Ser Phe Asn 210 Arg Gly Glu Cys <210> 3 <211> 42 <212> ADN <213> Art if ic ^ial 61 <220> <223> Iniciador <400> 3 ggaattccag gaggaattta aaatgcatga gggagtccac ag 42 <210> 4 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador <400> 4 cccaagcttg ggttatgtga cagaaacaag cagtgg 36 62

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente Europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente citados na descrição • WO 2005003168 A [0005] [0050] [0137] • WO 2005003172 A [0005] [0137] • WO 2005009465 A [0005] • US 20050191702 A [0047] • US 5660827 A [0083] • WO PA200500027 A [0157]

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Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto que bloqueia um receptor inibitório de uma célula exterminadora natural para utilização no tratamento de uma doença virai causada por VIH num sujeito humano em necessidade do mesmo, em que o sujeito humano foi tratado com terapêutica antirretroviral altamente ativa, e em que o composto é um anticorpo que se liga ao receptor exterminador tipo Ig 2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, e bloqueia a inibição mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 da citotoxicidade da célula NK.

2. 0 composto da reivindicação 1, para a utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o anticorpo especificamente inibe a ligação de moléculas HLA-C aos receptores KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3.

3. 0 composto da reivindicação 1, para a utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o anticorpo compete com um anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como CNCM 1-3224, na ligação a, pelo menos, um dos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3.

4. 0 composto da reivindicação 1, para a utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o anticorpo compete com um anticorpo que compreende as sequências da cadeia leve (VL) variável e da cadeia pesada (VH) variável da SEQ. ID N.° 1 e SEQ, ID N.° 2, respetivamente, na ligação a, pelo menos, um dos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3.

5. 0 composto da reivindicação 4, para a utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o anticorpo compreende as sequências da cadeia leve (VL) variável e da cadeia pesada (VH) variável da SEQ. ID N.° 1 e SEQ. ID N.° 2, respetivamente.