CN117062844A - 与cd19和cd22结合的双特异性嵌合抗原受体 - Google Patents

与cd19和cd22结合的双特异性嵌合抗原受体 Download PDF

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Abstract

能够与CD19和CD22两者结合的双特异性嵌合抗原受体(CAR)和表达所述双特异性CAR的免疫细胞。本文还提供了此类免疫细胞(例如，CAR‑T细胞)用于消除如癌细胞等疾病细胞的治疗用途。

Description

与CD19和CD22结合的双特异性嵌合抗原受体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年1月22日提交的美国临时申请第63/140,752号的申请日的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR-T)T细胞是表达用于免疫疗法的人工T细胞受体的基因工程化T细胞。人工T细胞受体(称为嵌合抗原受体)可以与如癌症抗原等疾病细胞抗原特异性结合。一旦与疾病细胞结合，CAR-T细胞将被激活并清除疾病细胞。
虽然CAR-T细胞疗法已经在治疗一些血癌方面表现出功效，但治疗的功效可能受到各种因素影响，例如肿瘤抗原逃逸，例如，肿瘤抗原的表达水平可能降低至CAR-T细胞不能参与和介导细胞毒性活性的水平。在一些情况下，肿瘤细胞可以通过表达缺乏CAR的结合表位的靶抗原的替代性形式来逃避杀伤。在其它情况下，肿瘤细胞可以通过转换到遗传相关但表型上不同的疾病(所谓的谱系转换)来逃避杀伤。
因此，开发改进的CAR-T方法来应对这些挑战具有重大意义。
发明内容
本公开至少部分地基于如在动物模型中观察到的具有优越的抗原结合亲和力和特异性以及优越的抗肿瘤作用的抗CD19/CD22双特异性嵌合抗原受体(CAR)的开发。
因此，本文提供了抗CD19/CD22双特异性CAR、编码所述抗CD19/CD22双特异性CAR的核酸、表达所述双特异性CAR的如免疫细胞等宿主细胞及其治疗应用。
在一些方面，本公开的特征在于一种对CD19和CD22具有特异性的双特异性嵌合抗原受体(CAR)，所述双特异性CAR包括对CD19具有特异性的第一抗原结合部分、对CD22具有特异性的第二抗原结合部分、共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域。所述第一抗原结合部分可以包括与参考抗体EPC-001-1相同的重链互补决定区(CDR)和/或相同的轻链CDR，所述参考抗体与CD19结合。所述第二抗原结合部分可以包括与参考抗体EPC-001-2、EPC-001-3或EPC-001-4相同的重链CDR和/或相同的轻链CDR，所述参考抗体中的每个参考抗体与CD22结合。
在一些实施例中，所述第一抗原结合部分可以包括与所述参考抗体EPC-001-1相同的重链可变区(VH)和相同的轻链可变区(VL)。可替代地或另外，所述第二抗原结合部分包括与所述参考抗体EPC-001-2、EPC-001-2或EPC-001-3相同的重链可变区(VH)和相同的轻链可变区(VL)。
在一些实施例中，所述第一抗原结合部分、所述第二抗体结合部分或两者可以是单链可变片段(scFv)。例如，所述第一抗原结合部分是包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的scFv。可替代地或另外，所述第二抗原结合部分是包括SEQ ID NO:18、27或36的氨基酸序列的scFv。
在本文所公开的CAR构建体中的任何CAR构建体中，所述共刺激信号传导结构域可以来自选自以下的共刺激分子：CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40或CD40L。在一些实施例中，所述胞质信号传导结构域来自CD3ζ。本文所公开的CAR中的任何CAR可以进一步包括铰链结构域和跨膜结构域。在一些情况下，所述铰链结构域和所述跨膜结构域可以位于所述抗原结合部分和所述共刺激信号传导结构域。
在一些实例中，所述双特异性CAR包括融合多肽，所述融合多肽从N端至C端包括(i)所述第一抗原结合部分、(ii)所述第二抗原结合部分、(iii)所述共刺激信号传导结构域和(iv)所述胞质信号传导结构域。在其它实例中，所述双特异性CAR包括融合多肽，所述融合多肽从N端至C端包括(i)所述第二抗原结合部分、(ii)所述第一抗原结合部分、(iii)所述共刺激信号传导结构域和(iv)所述胞质信号传导结构域。
在一些情况下，所述双特异性CAR可以进一步包括肽连接子，所述肽连接子连接所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分。示例性肽连接子包含但不限于GGGGS(SEQID NO:38)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:40)或GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:41)。
在一些实施例中，此处所公开的双特异性CAR可以包括SEQ ID NO:48-53中的任一个的氨基酸序列。在一些实例中，本文所公开的双特异性CAR可以包括SEQ ID NO:55-60和63-66中的任一个的氨基酸序列。
在另一方面，本文提供了一种核酸或一组核酸，所述一种核酸或一组核酸共同编码本文所公开的双特异性CAR中的任何双特异性CAR。例如，所述核酸可以包括编码CAR的核苷酸序列，所述CAR包括SEQ ID NO:48-53中的任一个的氨基酸序列。在具体实例中，所述核酸可以包括编码CAR的核苷酸序列，所述CAR包括SEQ ID NO:55-60和63-67中的任一个的氨基酸序列。
在一些情况下，所述核酸或一组核酸可以进一步包括：(i)编码截短的上皮生长因子受体(EGFR)结构域的核苷酸序列，所述截短的EGFR结构域可以包括EGFR受体的胞外结构域和跨膜结构域；以及(ii)编码自切割肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于编码所述双特异性CAR的所述核苷酸序列与编码所述截短的EGFR结构域的所述核苷酸序列之间。在一些实例中，所述截短的EGFR结构域包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
所述核酸或一组核酸中的任何核酸或一组核酸可以是表达载体。在一些实例中，所述表达载体可以是病毒载体。
在又另一方面，本公开的特征在于一种基因工程化免疫细胞，所述基因工程化免疫细胞表达本文所公开的双特异性CAR中的任何双特异性CAR。此类基因工程化免疫细胞可以包括编码如本文所公开的双特异性CAR的核酸中的任何核酸。在一些实例中，所述基因工程化免疫细胞是T细胞。在一些实例中，所述基因工程化免疫细胞是NK细胞。在其它实例中，所述基因工程化免疫细胞可以是巨噬细胞。
抗CD19 CAR和抗CD22 CAR、编码所述抗CD19 CAR和抗CD22 CAR的核酸以及表达所述抗CD19 CAR和抗CD22 CAR的基因工程化免疫细胞(例如，T细胞)也在本公开的范围内。
在一些实施例中，所述抗CD19 CAR可以包括与CD19结合的胞外抗原结合结构域、共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域。所述胞外抗原结合结构域可以是抗CD19单链可变片段(scFv)，所述抗CD19 scFv包括与抗CD19抗体EPC-001-1相同的重链互补决定区(CDR)和相同的轻链CDR。在一些实例中，所述抗CD19 scFv包括与抗CD19抗体EPC-001-1相同的重链可变结构域和相同的轻链可变结构域。在一个实例中，所述抗CD19 scFv包括SEQID NO:9的氨基酸序列。在一个具体实例中，所述抗CD19 CAR可以包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗CD22嵌合抗原受体(CAR)可以包括与CD22结合的胞外抗原结合结构域、共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域。在一些实例中，所述胞外抗原结合结构域可以是抗CD22单链可变片段(scFv)，所述抗CD22 scFv包括与抗CD22抗体EPC-001-2相同的重链互补决定区(CDR)和/或相同的轻链CDR。例如，所述抗CD22 scFv可以包括与抗CD22抗体EPC-001-2相同的重链可变结构域和/或相同的轻链可变结构域。在一些实例中，所述胞外抗原结合结构域可以是抗CD22单链可变片段(scFv)，所述抗CD22 scFv包括与抗CD22抗体EPC-001-3相同的重链互补决定区(CDR)和/或相同的轻链CDR。例如，所述抗CD22 scFv可以包括与抗CD22抗体EPC-001-3相同的重链可变结构域和/或相同的轻链可变结构域。在一些实例中，所述胞外抗原结合结构域可以是抗CD22单链可变片段(scFv)，所述抗CD22 scFv包括与抗CD22抗体或EPC-001-4相同的重链互补决定区(CDR)和/或相同的轻链CDR。例如，所述抗CD22 scFv可以包括与抗CD22抗体EPC-001-4相同的重链可变结构域和/或相同的轻链可变结构域。在一些实例中，所述抗CD22 scFv包括SEQ ID NO:18、27或36的氨基酸序列。在具体实例中，所述抗CD22 CAR可以包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
另外，本公开的特征在于一种用于消除受试者的不期望细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所公开的基因工程化免疫细胞，所述基因工程化免疫细胞表达如本文所公开的那些的抗CD19 CAR、抗CD22 CAR或抗CD19/CD22 CAR，或包括所述抗CD19 CAR、抗CD22 CAR或抗CD19/CD22 CAR的药物组合物。在一些情况下，所述不期望细胞是癌细胞。
在一些实施例中，所述受试者是人类癌症患者。例如，所述受试者可以是包括CD19+和/或CD22+癌细胞的人类癌症患者。在一些情况下，所述人类癌症患者可能患有造血系统恶性病，例如，T细胞恶性病或B细胞恶性病。
在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点从以下附图和若干个实施例的详细说明以及还从所附权利要求中将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包含在内以进一步说明本公开的某些方面，通过参考附图与本文呈现的具体实施例的详细说明的组合可以更好地理解所述方面。
图1是示出了通过qFACS对K562细胞、Raji细胞和Nalm6细胞上的重组或内源性CD19、CD22或两者的表面表达的定量的图。
图2A-2B包含示出了用于表达scFv抗体和双特异性嵌合抗原受体(CAR)的表达盒的示意性设计的图。图2A是示出了双特异性抗体的示例性设计的图。图2B是展示了抗CD19/CD22双特异性嵌合抗原受体(CAR)的示例性设计的图。
图3是示出了如所指示的各种双特异性抗体与CD19+和/或CD22+细胞(包含K562细胞(CD19-和CD22-)、被工程化以表达CD19的K562细胞(CD19 K562)、被工程化以表达CD22的K562细胞(CD22 K562)、被工程化以表达CD19和CD22两者的K562细胞(CD19/CD22 K562)、Raji细胞(CD19+和CD22+)和Nalm6细胞(CD19+和CD22+))的结合活性的图。
图4A-4B包含示出了免疫细胞中的示例性抗CD19/CD22双特异性嵌合抗原受体(CAR)EPC-001-19的表达的照片，如通过荧光染料Alexa647标记的抗EGFR抗体(EGFR与双特异性CAR共表达)或荧光染料Alexa647标记的CD22-Fc融合多肽检测的。图4A：通过抗EGFR-AF647检测到。图4B：通过抗人CD22-AF647检测到。
图5A-5D包含示出了表达抗CD19/CD22双特异性CAR的免疫细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的图。图5A：杀伤百分比(E:T＝1:1)。左图：EPC-001-11；中图：EPC-001-12；右图：EPC-001-13。图5B：杀伤百分比(E:T＝1:1)。左图：EPC-001-14；中图：EPC-001-15；右图：EPC-001-16。图5C：干扰素γ(IFNγ)分泌(E:T＝1:1)。左图：EPC-001-11；中图：EPC-001-12；右图：EPC-001-13。图5D：干扰素γ(IFNγ)分泌(E:T＝1:1)。左图：EPC-001-14；中图：EPC-001-15；右图：EPC-001-16。
图6A-6C包含示出了在各种效应物与靶细胞(E:T)比率下，表达针对靶细胞的示例性抗CD19/CD22双特异性CAR的T细胞的CTL活性的图。图6A：示出了由供体1PBMC制备的CAR-T细胞在所指示的不同E:T比率下针对K562细胞、CD22 K562细胞、CD19 K562细胞和CD19/CD22 K562细胞的特异性细胞裂解水平的图。图6B：示出了由供体2和供体3PBMC制备的CAR-T细胞在所指示的不同E:T比率下针对K562细胞、CD22 K562细胞、CD19 K562细胞和CD19/CD22 K562细胞的CTL活性的图。图6C：示出了由供体2和供体3PBMC制备的CAR-T细胞在所指示的不同E:T比率下针对K562细胞、CD22 K562细胞、CD19 K562细胞和CD19/CD22 K562细胞的共培养物中的IFNγ水平的图。
图7包含示出了在所指示的不同E:T比率下表达针对K562细胞、CD22 K562细胞、CD19 K562细胞和CD19/CD22 K562细胞的各种抗CD19/CD22双特异性CAR或抗CD19、抗CD22单特异性CAR的T细胞的CTL时程的图。
图8包含示出了表达抗CD19/CD22双特异性CAR的T细胞的CTL活性的图，所述抗CD19/CD22双特异性CAR具有连接CAR构建体中的抗CD19和抗CD22结合部分的不同连接子。
图9包含示出了在与靶细胞接合时CAR-T细胞增殖的图(E:T＝1:1)。
图10A-10B包含示出了CAR-T细胞在多轮靶细胞攻击后的体外持久性的图。图10A：杀伤百分比(E:T＝1:1)。左图：48小时时的靶细胞攻击1；中图：120小时时的靶细胞再攻击2；右图：192小时时的靶细胞再攻击3。图10B：IFNγ分泌(E:T＝1:1)。左图：48小时时的靶细胞攻击1；中图：120小时时的靶细胞再攻击2；右图：192小时时的靶细胞再攻击3。
图11A-11E示出了在小鼠癌症模型中表达抗CD19/CD22双特异性CAR的T细胞的体内抗肿瘤作用。图11A：示出了在对照小鼠(未经处理)以及用CAR-T细胞以0.125x 106个和0.25x 106个细胞处理的小鼠中的癌细胞荧光素酶的图像。图11B：示出了在处理过程中通过定量肿瘤细胞中的荧光素酶来抑制用CAR-T细胞处理的小鼠中的肿瘤生长的图。图11C-11D：分别示出了在处理后第14天和第33天的肿瘤细胞荧光素酶定量的图。图11E：对照小鼠和用CAR-T细胞处理的小鼠的存活曲线。
图12A-12E包含示出了CAR-T细胞在体内的扩增、表型和持久性的图。图12A：示出了在处理后第10天、第19天和第33天的CAR-T细胞计数和表型的图。上图：用0.125x 106个CAR-T细胞处理的第2组小鼠；底图：用0.25x 106个CAR-T细胞处理的第3组小鼠。图12B-12C：分别在第2组和第3组小鼠中T细胞亚型的第33天/第19天比率。图12D-12E：分别在第2组和第3组小鼠的第33天的脾脏中的细胞计数。
图13A-13B示出了抗CD19或CD22 scFv-Fc的ELISA结合测定。图13A：抗CD22scFv-Fc、抗19scFv-Fc和抗CD19/CD22 scFv-Fc与CD19的结合。图13B：抗CD22scFv-Fc、抗19scFv-Fc和抗CD19/CD22 scFv-Fc与CD22的结合。
图14A-14B示出了经EPC-001-023转导的T细胞的耗氧量。图14A：EPC-001-023CART细胞在第5天的耗氧量。图14B：EPC-001-023CAR T细胞在第11天的耗氧量。
图15示出了CD19和CD22敲除细胞以及亲本Raji细胞中的CD19和CD22蛋白的蛋白质印迹分析。
图16A-16B示出了表面受体表达的定量FACS分析。图16A：所指示的细胞系中的CD19表面受体计数。图16B：所指示的细胞系中的CD22表面受体计数。
图17示出了EPC-001-23CAR-T细胞在植入有亲本和敲除Raji细胞的动物模型中的体内抗肿瘤作用。
图18A-18C示出了如通过荧光素酶生物发光确定的肿瘤负荷的定量评估。图18A：亲本Raji细胞中的荧光素酶信号。图18B：CD22敲除Raji细胞中的荧光素酶信号。图18C：CD19敲除Raji细胞中的荧光素酶信号。
图19A-19B示出了在第36天收集的PBMC和脾脏样品中进行的EPC-001-23CAR-T细胞的表型分析。图19A：针对PBMC中CD3+CAR+细胞的表型分析。图19B：针对脾脏中CD3+CAR+细胞的表型分析。
图20A-20C示出了在第36天收集的PBMC和脾脏样品中进行的EPC-001-23CAR-T细胞的表型分析。图20A：PBMC中的CD3+CAR+T细胞计数。图20B：PBMC中的PD1+、Tim3-CD3+CAR+表达的量。图20C：脾脏中的PD1+、Tim3-CD3+CAR+表达的量。
图21A-21C包含示出了与司利弗明对照相比，EPC-001-23双特异性CAR-T细胞体外扩增和激活的图。图21A：如CAR+T细胞计数指示的T细胞扩增；图21B：如颗粒酶B+CAR-T细胞在72小时时所指示的T细胞激活。图21C：CAR-T细胞细胞毒性。
图22A-22B包含示出了与司利弗明对照相比，EPC-001-23双特异性CAR-T细胞在移植有Raji细胞或CD22KO Raji细胞的小鼠中的体内细胞毒性的图。图22A：示出了用如所指示的CAR-T细胞处理的小鼠中的肿瘤成像的照片。图22B：示出了CAR-T细胞体内扩增和持久性的图。
图23A-23B包含示出了与司利弗明对照相比，EPC-001-23双特异性CAR-T细胞在移植有Raji细胞或CD19KO Raji细胞的小鼠中的体内细胞毒性的图。图23A：示出了用如所指示的CAR-T细胞处理的小鼠中的肿瘤成像的照片。图23B：示出了CAR-T细胞体内扩增和持久性的图。
具体实施方式
B淋巴细胞抗原CD19是主要在B谱系细胞和滤泡树突状细胞上表达的免疫球蛋白超家族的成员。据报道，CD19充当衔接子蛋白以募集胞质信号传导蛋白，并且充当调节剂(通过CD19/CD21复合物)以降低由B细胞受体介导的信号传导通路的阈值。
分化簇22(CD22)是凝集素的SIGLEC家族的成员。相对于未成熟的B细胞，这种分子在成熟的B细胞表面上以高水平表达。作为B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体，其在防止免疫系统过度激活中发挥调节作用。
CD19和CD22两者已被确立为用于治疗如白血病等某些疾病的有希望的靶标。然而，仅靶向CD19或仅靶向CD22的治疗的有效性可能由于例如肿瘤抗原逃逸而受到影响，从而导致治疗功效降低。
本文提供了能够与CD19和CD22两者结合的双特异性嵌合抗原受体(CAR)以及表达此类双特异性CAR的基因工程化免疫细胞。本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR显示出对表面表达性CD19和CD22两者的优异结合活性以及优异的细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞毒性。另外，抗CD19/CD22双特异性CAR显示出优异的体内抗肿瘤活性，如在小鼠模型中观察到的。此外，双特异性CAR-T细胞在杀死CD19/CD22双阳性或仅表达两种靶抗原之一的癌细胞中显示出有效性，这表明双特异性Car-T细胞在CD19逃逸或CD22逃逸的背景下将维持治疗功效。
因此，预期表达本文所公开的双特异性CAR的免疫细胞在治疗涉及CD19+/CD22+、CD19-/CD22+或CD19+/CD22-疾病细胞(例如，癌细胞)的疾病以及解决如与单特异性CAR-T疗法或靶向疗法相关的肿瘤抗原逃逸的问题方面发挥优异的治疗效果。CD19/CD22双特异性串联CAR具有二价靶标参与，并且因此可以锁定CD19和CD22靶标，并且防止或延迟靶标逃逸以及潜在更低的剂量。另外，每个CD19或CD22结合结构域可以独立地参与表达CD19或CD22的细胞，并且在任一个靶标逃逸时介导癌细胞杀伤。
因此，本公开的特征在于抗CD19/CD22双特异性CAR、编码所述抗CD19/CD22双特异性CAR的核酸、表达所述双特异性CAR的宿主细胞如免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或巨噬细胞)，以及此类免疫细胞在治疗与CD19+和/或CD22+疾病细胞相关的疾病中的治疗用途。
I.嵌合抗原受体
如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指能够与由不期望细胞表达的抗原(例如，肿瘤相关抗原(TAA)(例如，CD19或CD22))结合的人工免疫细胞受体。通常，CAR可以包括融合多肽，所述融合多肽包括胞外抗原结合结构域(例如，源自对靶抗原具有特异性的抗体的单链可变片段或scFv)、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。在一些情况下，融合多肽可以进一步包括位于胞外抗原结合结构域的C末端处的铰链结构域和跨膜结构域。在一些实施例中，本文所公开的CAR是T细胞受体。在其它实施例中，本文所公开的CAR可以是NK细胞受体。
典型的抗体分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们通常参与抗原结合。VH和VL区可以进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“CDR”)，其散布有更保守的被称为“框架区”(“FR”)的区。每个VH和VL通常由按以下顺序从氨基端至羧基端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。框架区和CDR的范围可以使用本领域已知的方法，例如通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义来精确地鉴定，所有所述定义在本领域中都是熟知的。参见例如，Kabat,E.A.等人,(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公开号91-3242；Chothia等人,(1989)《自然(Nature)》342:877；Chothia,C.等人(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917；Al-lazikani等人(1997)《分子生物学杂志》273:927-948；以及Almagro,《分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)》17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs。
在一些实施例中，本文所公开的抗体部分可以与参考抗体共享相同的重链和/或轻链互补决定区(CDR)或相同的VH和/或VL链。两种抗体具有相同的VH和/或VL CDR意味着当通过同一方法(例如，本领域已知的Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、接触方法或IMGT方法)确定时，它们的CDR是相同的。参见例如，bioinf.org.uk/abs/。与本文所述的示例性抗体相比，此类抗CD19抗体可以具有相同的VH、相同的VL或两者。
在一些实施例中，与参考序列相比，本文所公开的抗体部分可以共享一定水平的序列同一性。使用Karlin和Altschul《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:2264-68,1990的算法测定两个氨基酸序列的“同一性百分比”，所述算法如Karlin和Altschul《美国国家科学院院刊》90:5873-77,1993中那样进行修改。此类算法并入Altschul等人《分子生物学杂志》215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序(分值＝50，字长＝3)来执行BLAST蛋白质检索以获得与所关注蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在空位的情况下，可以利用如Altschul等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25(17):3389-3402,1997中描述的带空位的BLAST(GappedBLAST)。当利用BLAST程序和带空位的BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一些实施例中，本文所公开的抗体部分相对于参考抗体可以具有一种或多种氨基酸变异。本公开中所公开的氨基酸残基变异(例如，在框架区和/或在CDR中)可以是保守氨基酸残基取代。如本文所使用的，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特性的氨基酸取代。可以根据用于改变本领域普通技术人员已知的多肽序列的方法来制备变体，所述方法如编制此类方法的参考文献中发现的，所述参考文献例如，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,J.Sambrook等人编辑,第二版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港,纽约,1989或《分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,F.M.Ausubel等人编辑,纽约的约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.,NewYork)。氨基酸的保守取代包含在以下组中的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。
本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR各自在胞外抗原结合结构域中包括抗CD19部分和抗CD22部分。
(a)抗CD19结合部分
本文所公开的CAR中的任何CAR(例如，本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR)中的抗CD19结合部分可以呈scFv形式，其是包括由肽连接子连接的抗CD19抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合多肽。在scFv片段中，VH和VL片段可以处于任何朝向。在一些情况下，scFv可以从N端至C端包括VL片段、肽连接子和VH片段。可替代地，scFv可以从N端至C端包括VH片段、肽连接子和VL片段。在一些实例中，scFv可以进一步包括用于将包括scFv的CAR引导至细胞表面的N端信号肽。
在一些实施例中，抗CD19结合部分可以源自抗CD19抗体EPC-001-1(参见下表1)。表1中提供的重链和轻链互补决定区基于Kabat定义。还参见于2020年8月19日提交的PCT/US2020/047035，所述文献的相关公开内容出于其中引用的主题和目的通过引用并入本文。
表1：抗CD19抗体
源自参考抗体的抗CD19结合部分(以及下文所公开的抗CD22结合部分)是指具有与参考抗体基本上类似的结构特征和功能特征的结合部分。在结构上，结合部分可以具有与参考抗体相同的重链和/或轻链互补决定区或相同的VH和/或VL链。可替代地，结合部分可以在一个或多个框架区中和/或在一个或多个CDR中仅具有有限数量的氨基酸变异，而不会显著影响其相对于参考抗体的结合亲和力和结合特异性。参见下文描述。
在一些实例中，抗CD19结合部分可以包括与在上表1中提供的抗体EPC-001-1中的重链CDR相同的重链CDR。可替代地或另外，抗CD19结合部分可以具有与也在上表1中提供的抗体EPC-001-1中的轻链CDR相同的轻链CDR。此类抗CD19结合部分可以包括与EPC-001-1相同的VH和/或VL链。可替代地，相对于EPC-001-1中的对应框架区，抗CD19结合部分可以在一个或多个框架区中包括氨基酸变异。例如，相对于EPC-001-1中的对应框架区，抗CD19结合部分可以在一个或多个框架区中共同地包括至多15个氨基酸变异(例如，至多12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸变异)。
在一些实施例中，抗CD19部分可以相对于EPC-001-1中的CDR在一个或多个CDR中包括一定水平的变异。例如，抗CD19部分可以包括与EPC-001-1的VH CDR相比单独地或共同地具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可替代地或另外，抗CD19抗体可以包括与作为EPC-001-1的VL CDR相比单独地或共同地具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。如本文所使用的，“单独地”意指抗体的一个CDR相对于参考抗体(例如，EPC-001-1或下文所公开的抗CD22参考抗体中的任何抗CD22参考抗体)的对应CDR共享所指示的序列同一性。“共同地”意指组合的抗体的三个VH或VLCDR相对于组合的参考抗体的对应三个VH或VL CDR共享所指示的序列同一性。
在一些情况下，相对于EPC-001-1的CDR中的那些，抗CD19部分可以在重链和轻链CDR中的一个或多个重链和轻链CDR中共同地包括至多10个氨基酸变异(例如，至多9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸变异)。在一些情况下，抗CD19部分可以包括与EPC-001-1的重链CDR3相同的重链CDR3，并且在其它重链和轻链CDR中的一个或多个其它重链和轻链CDR中包括一个或多个氨基酸变异。
在一些实例中，本文所公开的抗CD19部分可以包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。可替代地，抗CD19部分可以包括与SEQ ID NO:9至少85％(例如，至少90％、至少95％、至少98％或以上)相同的氨基酸序列。在其它实例中，本文所公开的抗CD19部分可以包括与SEQID NO:9相同的VH和VL序列，但具有与SEQ ID NO:9相反的VH和VL片段取向。
本文所公开的抗CD19部分中的任何抗CD19部分(例如，SEQ ID NO:9或其具有相反VH和VL取向的对应物)可以用于构建如本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR。
(b)抗CD22结合部分
本文所公开的CAR中的任何CAR(例如，本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR)中的抗CD22结合部分可以呈scFv形式，其是包括由肽连接子连接的抗CD22抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合多肽。在scFv片段中，VH和VL片段可以处于任何朝向。在一些情况下，scFv可以从N端至C端包括VL片段、肽连接子和VH片段。可替代地，scFv可以从N端至C端包括VH片段、肽连接子和VL片段。在一些实例中，scFv可以进一步包括用于将包括scFv的CAR引导至细胞表面的N端信号肽。
在一些实施例中，抗CD22结合部分可以源自抗CD22抗体EPC-001-2、EPC-001-3或EPC-001-4(参见下表2)。表1中提供的重链和轻链互补决定区基于Kabat定义。还参见于2020年8月21日提交的PCT/US2020/047479，所述文献的相关公开内容出于其中引用的主题和目的通过引用并入本文。
表2：抗CD22抗体
在一些实例中，抗CD22结合部分可以包括与在上表2中提供的抗体EPC-001-2中的重链CDR相同的重链CDR。可替代地或另外，抗CD22结合部分可以具有与也在上表2中提供的抗体EPC-001-2中的轻链CDR相同的轻链CDR。此类抗CD22结合部分可以包括与EPC-001-2相同的VH和/或VL链。可替代地，相对于EPC-001-2中的对应框架区，抗CD22结合部分可以在一个或多个框架区中包括氨基酸变异。例如，相对于EPC-001-2中的对应框架区，抗CD22结合部分可以在一个或多个框架区中共同地包括至多15个氨基酸变异(例如，至多12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸变异)。
在一些实施例中，抗CD22部分可以相对于EPC-001-2中的CDR在一个或多个CDR中包括一定水平的变异。例如，抗CD22部分可以包括与EPC-001-2的VH CDR相比单独地或共同地具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可替代地或另外，抗CD22抗体可以包括与作为EPC-001-2的VL CDR相比单独地或共同地具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
在一些情况下，相对于EPC-001-2的CDR中的那些，抗CD22部分可以在重链和轻链CDR中的一个或多个重链和轻链CDR中共同地包括至多10个氨基酸变异(例如，至多9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸变异)。在一些情况下，抗CD22部分可以包括与EPC-001-2的重链CDR3相同的重链CDR3，并且在其它重链和轻链CDR中的一个或多个其它重链和轻链CDR中包括一个或多个氨基酸变异。
在一些实例中，本文所公开的抗CD22部分可以包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列。可替代地，抗CD22部分可以包括与SEQ ID NO:18至少85％(例如，至少90％、至少95％、至少98％或以上)相同的氨基酸序列。在其它实例中，本文所公开的抗CD22部分可以包括与SEQID NO:18相同的VH和VL序列，但具有与SEQ ID NO:18相反的VH和VL片段取向。
在一些实例中，抗CD22结合部分可以包括与在上表2中提供的抗体EPC-001-3中的重链CDR相同的重链CDR。可替代地或另外，抗CD22结合部分可以具有与也在上表2中提供的抗体EPC-001-3中的轻链CDR相同的轻链CDR。此类抗CD22结合部分可以包括与EPC-001-3相同的VH和/或VL链。可替代地，相对于EPC-001-3中的对应框架区，抗CD22结合部分可以在一个或多个框架区中包括氨基酸变异。例如，相对于EPC-001-3中的相应框架区，抗CD22结合部分可以在一个或多个框架区中共同地包括至多15个氨基酸变异(例如，至多12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸变异)。
在一些实施例中，抗CD22部分可以相对于EPC-001-3中的CDR在一个或多个CDR中包括一定水平的变异。例如，抗CD22部分可以包括与EPC-001-3的VH CDR相比单独地或共同地具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可替代地或另外，抗CD22抗体可以包括与作为EPC-001-3的VL CDR相比单独地或共同地具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
在一些情况下，相对于EPC-001-3的CDR中的那些，抗CD22部分可以在重链和轻链CDR中的一个或多个重链和轻链CDR中共同地包括至多10个氨基酸变异(例如，至多9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸变异)。在一些情况下，抗CD22部分可以包括与EPC-001-3的重链CDR3相同的重链CDR3，并且在其它重链和轻链CDR中的一个或多个其它重链和轻链CDR中包括一个或多个氨基酸变异。
在一些实例中，本文所公开的抗CD22部分可以包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列。可替代地，抗CD22部分可以包括与SEQ ID NO:27至少85％(例如，至少90％、至少95％、至少98％或以上)相同的氨基酸序列。在其它实例中，本文所公开的抗CD22部分可以包括与SEQID NO:27相同的VH和VL序列，但具有与SEQ ID NO:27相反的VH和VL片段取向。
在一些实例中，抗CD22结合部分可以包括与在上表2中提供的抗体EPC-001-4中的重链CDR相同的重链CDR。可替代地或另外，抗CD22结合部分可以具有与也在上表2中提供的抗体EPC-001-4中的轻链CDR相同的轻链CDR。此类抗CD22结合部分可以包括与EPC-001-4相同的VH和/或VL链。可替代地，相对于EPC-001-4中的对应框架区，抗CD22结合部分可以在一个或多个框架区中包括氨基酸变异。例如，相对于EPC-001-4中的对应框架区，抗CD22结合部分可以在一个或多个框架区中共同地包括至多15个氨基酸变异(例如，至多12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸变异)。
在一些实施例中，抗CD22部分可以相对于EPC-001-4中的CDR在一个或多个CDR中包括一定水平的变异。例如，抗CD22部分可以包括与EPC-001-4的VH CDR相比单独地或共同地具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可替代地或另外，抗CD22抗体可以包括与作为EPC-001-4的VL CDR相比单独地或共同地具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。
在一些情况下，相对于EPC-001-4的CDR中的那些，抗CD22部分可以在重链和轻链CDR中的一个或多个重链和轻链CDR中共同地包括至多10个氨基酸变异(例如，至多9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸变异)。在一些情况下，抗CD22部分可以包括与EPC-001-4的重链CDR3相同的重链CDR3，并且在其它重链和轻链CDR中的一个或多个其它重链和轻链CDR中包括一个或多个氨基酸变异。
在一些实例中，本文所公开的抗CD22部分可以包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列。可替代地，抗CD22部分可以包括与SEQ ID NO:36至少85％(例如，至少90％、至少95％、至少98％或以上)相同的氨基酸序列。在其它实例中，本文所公开的抗CD22部分可以包括与SEQID NO:36相同的VH和VL序列，但具有与SEQ ID NO:36相反的VH和VL片段取向。
本文所公开的抗CD22部分中的任何抗CD22部分可以用于构建如本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR。在一些实例中，抗CD22部分可以包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其具有相反VH和VL取向的对应物。在一些实例中，抗CD22部分可以包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其具有相反VH和VL取向的对应物。在一些实例中，抗CD22部分可以包括SEQ IDNO:36的氨基酸序列或其具有相反VH和VL取向的对应物。
(c)嵌合抗原受体构建体的其它组分
除了本文所公开的胞外抗原结合结构域之外，CAR中的任何CAR(包含抗CD19/CD22双特异性CAR)可以进一步包括一个或多个胞内信号传导结构域(例如，共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域)，以及任选地铰链结构域、跨膜结构域、N端信号肽或其组合。在一些情况下，CAR可以在宿主免疫细胞中与自杀基因(例如，截短的EGFR基因)共表达。例如，CAR编码序列和自杀基因可以被配置在双顺反子表达盒中，其中CAR编码序列和自杀基因可以通过自切割肽(例如，P2A或T2A)编码序列连接。下表3中提供了实例。
表3：嵌合抗原受体或与所述嵌合抗原受体共表达的组分的氨基酸序列
信号传导结构域
本文所公开的CAR构建体中的任何CAR构建体(包含抗CD19/CD22双特异性CAR)包括一个或多个胞内信号传导结构域，所述一个或多个胞内信号传导结构域通常含有共刺激结构域和胞质信号传导结构域。“共刺激信号传导结构域”是指介导细胞内的信号转导以诱导免疫应答如效应子功能(次级信号)的共刺激信号传导蛋白的至少一个片段。胞质信号传导结构域可以是参与触发导致免疫细胞增殖和/或激活的细胞信号传导(初级信号传导)的任何信号传导结构域。如本文所述的胞质信号传导结构域不是共刺激信号传导结构域，如在本领域中已知的，其传递共刺激或次级信号以完全激活免疫细胞。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域用于本文所公开的待引入T细胞中的CAR构建体。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域用于本文所公开的待引入NK细胞中的CAR构建体。
在一些情况下，共刺激信号传导结构域可以源自参与T细胞应答的共刺激蛋白，例如，B7/CD28家族的成员、TNF超家族的成员、SLAM家族的成员或任何其它共刺激分子。实例包含但不限于4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD40、CD40L、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1(CD11a)或CD2。在具体实例中，共刺激信号传导结构域是4-1BB信号传导结构域(例如，上表3中的SEQID NO:44)。
胞质信号传导结构域可以包括基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)结构域或可以不含ITAM。本文所使用的“ITAM”是通常存在于许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部的保守蛋白基序。示例性胞质信号传导结构域包含CD3ζ的信号传导结构域，例如，SEQID NO:45。
在一些情况下，共刺激信号传导结构域可以源自参与NK细胞应答的共刺激蛋白。实例包含但不限于DAP10、DAP12、2B4、NKG2D、FcRIγ、NKp30、NKp44或NKp46。用于NK细胞CAR的示例性胞质信号传导结构域包含但不限于CD3ζ，例如，SEQ ID NO:45。
铰链结构域和跨膜结构域
在一些情况下，本文所公开的CAR构建体(例如，抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR)可以含有跨膜结构域，其可以是跨越膜的疏水性α螺旋。“跨膜结构域”可以是在细胞膜，优选地真核细胞膜中热力学稳定的肽片段。跨膜结构域可以为含有此类结构域的CAR提供稳定性。示例性跨膜结构域可以是CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域。在一个实例中，跨膜结构域可以包括上表3中所示的SEQ ID NO:43。
可替代地或另外，本文所公开的CAR构建体还可以包括铰链结构域，其可以位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间或位于跨膜结构域与胞内信号传导结构域之间。铰链结构域可以用于为CAR或其结构域提供柔性，或用于防止CAR或其结构域的空间位阻。铰链结构域可以含有5-20个氨基酸残基。在一些实施例中，铰链结构域可以是CD8铰链结构域或IgG铰链。可以使用其它铰链结构域。在一个实例中，铰链结构域可以包括上表3中所示的SEQ ID NO:42。
(d)抗CD19/CD22双特异性CAR
在一些方面，本文提供了抗CD19/CD22双特异性CAR，其包括抗CD19部分(例如，抗CD19 scFv，如本文所公开的抗CD19 scFv)、抗CD22部分(例如，抗CD22 scFv，如本文所公开的抗CD22 scFv)、一个或多个胞内信号传导结构域(如共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域)以及任选地如本文所公开的铰链结构域和跨膜结构域。在一些情况下，抗CD19/CD22双特异性CAR可以是包括抗CD19部分和抗CD22部分两者的单一多肽。在其它情况下，抗CD19/CD22双特异性CAR可以是多链(例如，2链)分子。抗CD19部分和抗CD22部分可以位于分离的多肽上。
在一些实施例中，本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR可以包括源自EPC-001-1的抗CD19结合部分(例如，scFv)和源自EPC-001-2的抗CD22结合部分。在其它实施例中，本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR可以包括源自EPC-001-1的抗CD19结合部分(例如，scFv)和源自EPC-001-3的抗CD22结合部分。在仍其它实施例中，本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR可以包括源自EPC-001-1的抗CD19结合部分(例如，scFv)和源自EPC-001-2-4中的任一个的抗CD22结合部分。
研究了抗CD19和抗CD22抗体的各种组合，以进行抗CD19/CD22双特异性细胞接合。许多此类双特异性scFv显示出低表达水平或与CD19和/或CD22的低结合活性。出乎意料地，发现与单克隆抗CD19或抗CD22 scFv相比，由抗CD19亲本克隆EPC-001-1以及抗CD22亲本克隆EPC-001-2、EPC-001-3和EPC-001-4中的3个制备的抗CD19/CD22双特异性scFv显示出期望的双特异性scFv表达水平，并且维持强的和特异性的靶细胞接合。
源自EPC-001-1的抗CD19结合部分(例如，scFv)可以是上文所公开的与EPC-001-1相关的抗CD19部分中的任何抗CD19部分。在一些情况下，其可以包括与EPC-001-1相同的重链和/或轻链CDR。在具体实例中，scFv可以包括与EPC-001-1相同的VH和/或相同的VL。在一些情况下，scFv可以从N端至C端包括VL片段(例如，SEQ ID NO:8)、肽连接子(例如，SEQ IDNO:38-41中的任一个)和VH片段(例如，SEQ ID NO:4)。可替代地，scFv可以从N端至C端包括VH片段(例如，SEQ ID NO:4)、肽连接子(例如，SEQ ID NO:38-41中的任一个)和VL片段(例如，SEQ ID NO:8)。在一个具体实例中，抗CD19部分可以包括SEQ ID NO:9。
源自EPC-001-2的抗CD22结合部分(例如，scFv)可以是上文公开的与EPC-001-2相关的抗CD22部分中的任何抗CD22部分。在一些情况下，其包括与EPC-001-2相同的重链和/或轻链CDR。在具体实例中，scFv可以包括与EPC-001-2相同的VH和/或相同的VL。在一些情况下，scFv可以从N端至C端包括VL片段(例如，SEQ ID NO:17)、肽连接子(例如，SEQ ID NO:38-41中的任一个)和VH片段(例如，SEQ ID NO:13)。可替代地，scFv可以从N端至C端包括VH片段(例如，SEQ ID NO:14)、肽连接子(例如，SEQ ID NO:38-41中的任一个)和VL片段(例如，SEQ ID NO:17)。在一个具体实例中，抗CD19部分可以包括SEQ ID NO:18。
源自EPC-001-3的抗CD22结合部分(例如，scFv)可以是上文公开的与EPC-001-3相关的抗CD22部分中的任何抗CD22部分。在一些情况下，其包括与EPC-001-3相同的重链和/或轻链CDR。在具体实例中，scFv可以包括与EPC-001-3相同的VH和/或相同的VL。在一些情况下，scFv可以从N端至C端包括VL片段(例如，SEQ ID NO:26)、肽连接子(例如，SEQ ID NO:38-41中的任一个)和VH片段(例如，SEQ ID NO:22)。可替代地，scFv可以从N端至C端包括VH片段(例如，SEQ ID NO:22)、肽连接子(例如，SEQ ID NO:38-41中的任一个)和VL片段(例如，SEQ ID NO:26)。在一个具体实例中，抗CD19部分可以包括SEQ ID NO:27。
源自EPC-001-4的抗CD22结合部分(例如，scFv)可以是上文公开的与EPC-001-3相关的抗CD22部分中的任何抗CD22部分。在一些情况下，其包括与EPC-001-4相同的重链和/或轻链CDR。在具体实例中，scFv可以包括与EPC-001-4相同的VH和/或相同的VL。在一些情况下，scFv可以从N端至C端包括VL片段(例如，SEQ ID NO:35)、肽连接子(例如，SEQ ID NO:38-41中的任一个)和VH片段(例如，SEQ ID NO:31)。可替代地，scFv可以从N端至C端包括VH片段(例如，SEQ ID NO:31)、肽连接子(例如，SEQ ID NO:38-41中的任一个)和VL片段(例如，SEQ ID NO:35)。在一个具体实例中，抗CD19部分可以包括SEQ ID NO:36。
在一些实施例中，抗CD19/CD22双特异性CAR可以包括融合多肽，其包括如本文所公开的抗CD19部分和抗CD22部分两者，其可以通过柔性肽连接子连接，例如，SEQ ID NO:38-41中的任一个。在一些情况下，连接子可以是短的富含G/S的连接子(例如，具有至多5个氨基酸残基)，例如，GGGGS(SEQ ID NO:38)。抗CD19和抗CD22部分可以具有如图2A所展示的任何取向。例如，融合多肽可以从N端至C端包括抗CD19部分(例如，抗CD19 scFv)、肽连接子和抗CD22部分(例如，抗CD22 scFv)。可替代地，融合多肽可以从N端至C端包括抗CD22部分(例如，抗CD22 scFv)、肽连接子和抗CD19部分(例如，抗CD19 scFv)。
包括抗CD19和抗CD22部分的融合多肽中的任何融合多肽可以进一步包括共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域，如本文所公开的共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域。任选地，融合多肽可以进一步包括还如本文所公开的铰链结构域和跨膜结构域。图3提供了双特异性CAR的示例性设计的示意图。在一些实例中，双特异性CAR可以通过自切割肽连接子包含在具有自杀基因(例如，截短的EGFR)的多顺反子表达盒中，如图3所示。
下表4提供了示例性抗CD19/CD22双特异性scFv和CAR。
表4：示例性双特异性scFv和CAR构建体
同样在本公开的范围内的是双特异性抗CD19/CD22抗体，其包括源自在本文中在表1中提供的亲本抗CD19抗体的抗CD19结合部分和源自在表2中提供的亲本抗CD22抗体的抗CD22结合部分。此类双特异性抗体可以呈在本领域中已知的任何合适的形式。例如，双特异性抗体可以包括串联重复的抗CD19 scFv和抗CD22 scFv(例如，本文所公开的双特异性CAR中的任何双特异性CAR中的双特异性抗原结合部分)。在一些情况下，此类双特异性抗体可以进一步包括Fc片段以形成scFv-Fc融合多肽。
(e)抗CD19和抗CD22 CAR
同样在本发明范围内的是包括本文所公开的抗CD19结合部分和抗CD22结合部分中的任何抗CD19结合部分和抗CD22结合部分的抗CD19和抗CD22 CAR。
在一些方面，本文提供了抗CD19 CAR、编码所述抗CD19 CAR的核酸以及表达所述抗CD19 CAR的宿主细胞。抗CD19 CAR可以包括：(a)胞外结合结构域，所述胞外结合结构域可以是抗CD19结合部分中的任何抗CD19结合部分，例如，源自EPC-001-1的抗CD19 scFv；(b)共刺激信号传导结构域，如本文所公开的共刺激信号传导结构域；以及(c)胞质信号传导结构域，如本文所公开的胞质信号传导结构域。抗CD19 CAR可以进一步包括位于胞外抗原结合结构域的C端处的铰链结构域和跨膜结构域。在一个实例中，抗CD19 CAR包括SEQ IDNO:62的氨基酸序列。
在一些方面，本文提供了抗CD22 CAR、编码所述抗CD22 CAR的核酸以及表达所述抗CD22 CAR的宿主细胞。在一些实例中，抗CD22 CAR可以包括：(a)胞外结合结构域，所述胞外结合结构域可以是抗CD22结合部分中的任何抗CD22结合部分，例如，源自EPC-001-2、EPC-001-3或EPC-001-4的抗CD19 scFv；(b)共刺激信号传导结构域，如本文所公开的共刺激信号传导结构域；以及(c)胞质信号传导结构域，如本文所公开的胞质信号传导结构域。抗CD22 CAR可以进一步包括位于胞外抗原结合结构域的C端处的铰链结构域和跨膜结构域。在一个实例中，抗CD22 CAR包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
II.CAR表达性免疫细胞
在一些方面，本文提供了基因工程化免疫细胞，如T细胞、NK细胞或巨噬细胞，所述基因工程化免疫细胞具有本文所公开的抗CD19、抗CD22或抗CD19/CD22双特异性CAR构建体中的任何抗CD19、抗CD22或抗CD19/CD22双特异性CAR构建体的表面表达。在一些情况下，基因工程化免疫细胞是表达在上表4中提供的抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR(例如，SEQ ID NO:63)的T细胞。
本文所公开的CAR表达免疫细胞中的任何CAR表达免疫细胞可以用另外的机制工程化以重新编程CAR表达性细胞，以便增强它们的生物活性和/或持久性，由此增强总体治疗效果。例如，CAR表达性免疫细胞可以被进一步工程化以敲入一个或多个免疫调节基因、一个或多个免疫检查点抑制剂基因或其组合。可替代地，本文所公开的CAR表达性免疫细胞可以被进一步工程化以敲低或敲除一个或多个抑制基因。
(a)CAR表达性免疫细胞的制备
本文所公开的基因工程化免疫细胞可以通过以下方式来制备：将编码本文所公开的CAR构建体中的任何CAR构建体(例如，本文所公开抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR，如在表4中提供的双特异性CAR)的表达盒引入到合适的免疫细胞中，并且收集在细胞表面上表达CAR的所得工程化免疫细胞。
作为起始亲本细胞的免疫细胞群体可以从任何来源获得，如外周血单核细胞(PBMC)、骨髓或组织(如脾脏、淋巴结、胸腺、干细胞或肿瘤组织)。适用于获得所期望的宿主细胞类型的来源对于本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施例中，免疫细胞群体源自PBMC。所期望的宿主细胞类型(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞或其组合)可以在通过将细胞与刺激分子共温育而获得的细胞群体中扩增。作为非限制性实例，抗CD3和抗CD28抗体可以用于扩增T细胞。在一些实施例中，可以从免疫细胞群体中富集特定类型的细胞(例如，T细胞、NK细胞或巨噬细胞)。此类富集的细胞亚群可以在基因工程化引入编码CAR的表达盒之前在体外扩增和/或激活。
为了构建表达本文所述的CAR多肽中的任何CAR多肽(例如，本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR，如在表4中提供的双特异性CAR)的免疫细胞，可以通过常规方法产生用于稳定或瞬时表达CAR多肽的表达载体，并且将其引入到免疫宿主细胞中。例如，可以将编码CAR多肽的核酸克隆到合适的表达载体中，如与合适的启动子可操作地连接的病毒载体。本公开的有用载体的非限制性实例包含病毒载体，例如，逆转录病毒载体(包含γ逆转录病毒载体)、腺相关病毒载体(AAV载体)和慢病毒载体。可以在合适的条件下使核酸和载体与限制酶接触，以在每个分子上产生可以彼此配对并且用连接酶连接的互补末端。可替代地，可以将合成核酸连接子与编码CAR多肽的核酸的末端连接。合成连接子可以含有与载体中的特定限制性位点相对应的核酸序列。表达载体/质粒/病毒载体的选择将取决于表达CAR多肽的宿主细胞的类型，但应该适合在真核细胞中整合和复制。编码CAR的任何此类核酸和包括所述核酸的表达载体也在本公开的范围内。
可以使用各种启动子来表达本文所述的CAR多肽，所述启动子包含但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、如劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR等病毒LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子或单纯性疱疹tk病毒启动子。用于表达CAR多肽的另外的启动子包含免疫细胞中的任何组成型活性启动子。可替代地，可以使用任何可调节的启动子，使得可以在免疫细胞内调节其表达。在一些实施例中，启动子可以是pEF1α启动子。
另外，载体可以含有例如以下中的一些或全部：用于在宿主细胞中选择稳定或瞬时转染子的可选择标志物基因，如新霉素(neomycin)基因或卡那霉素(kanamycin)基因；来自人CMV的立即早期基因的用于高水平转录的增强子/启动子序列；来自SV40的用于mRNA稳定性的转录终止和RNA加工信号；SV40多瘤病毒复制起点和用于适当的附加型复制的ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)；通用多克隆位点；用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子；“自杀开关”或“自杀基因”，其在被触发时导致携带载体的细胞死亡(例如，HSV胸苷激酶或诱导型胱天蛋白酶，如iCasp9)；以及用于评估CAR多肽表达的报告基因。
在一个具体实施例中，此类载体还可以包含自杀基因。如本文所使用的，术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予表达基因的细胞对药剂(例如，药物)的敏感性并且当细胞接触或暴露于药剂时导致细胞死亡的基因。自杀基因在本领域中是已知的(参见例如，《自杀基因疗法：方法和综述(Suicide GeneTherapy:Methods and Reviews)》,Springer,Caroline J.(英国萨里郡萨顿的癌症研究所的英国癌症研究中心癌症治疗中心(Cancer Research UK Centre for CancerTherapeutics at the Institute of Cancer Research,Sutton,Surrey,UK)),胡玛纳出版社(Humana Press),2004)，并且包含例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、硝基还原酶和胱天蛋白酶，如胱天蛋白酶8。在具体实例中，自杀基因可以编码截短的EGFR，例如在上表3和表4中提供的截短的EGFR。
本文所公开的核酸可以包括两个编码序列，一个编码序列用于本文所公开的CAR构建体中的任何CAR构建体(例如，本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR，如在表4中提供的双特异性CAR)，并且另一个编码序列用于自杀基因产物。两个编码序列可以被配置成使得由两个编码序列编码的多肽可以被表达为独立的(且物理上分离的)多肽。为了实现这一目标，本文所述的核酸可以含有位于第一编码序列与第二编码序列之间的第三核苷酸序列。此第三核苷酸序列可以例如编码核糖体跳跃位点。核糖体跳跃位点是损害正常肽键形成的序列。这种机制导致从一个信使RNA翻译另外的开放阅读框。此第三核苷酸序列可以例如编码自切割肽，如P2A、T2A或F2A肽(参见例如，Kim等人,《公共科学图书馆综合(PLoS One.)》2011；6(4):e18556)。还参见图3。
包括编码本文所述的ACTR多肽的核酸序列的载体中的任何载体也在本公开的范围内。
此类载体或其中含有的编码CAR多肽的序列可以通过任何合适的方法被递送到宿主细胞中，如宿主免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或巨噬细胞)。将载体递送至免疫细胞的方法在本领域中是熟知的，并且可以包含DNA电穿孔、RNA电穿孔、使用如脂质体等试剂进行的转染或病毒转导(例如，逆转录病毒转导，如慢病毒转导)。
在将编码本文所提供的CAR多肽中的任何CAR多肽(例如，本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR，如在表4中提供的双特异性CAR)的载体引入到宿主细胞中后，可以在允许CAR多肽表达的条件下培养细胞。当CAR多肽的表达由可调节启动子调节时，宿主细胞可以在可调节启动子被激活的条件下培养。在一些实施例中，启动子是诱导型启动子，并且在存在诱导分子的情况下或在产生诱导分子的条件下培养免疫细胞。确定CAR多肽是否被表达对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且可以通过任何已知的方法来评估，例如，通过定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)检测编码CAR多肽的mRNA或者通过包含蛋白质印迹、荧光显微镜和流式细胞术在内的方法检测CAR多肽蛋白。可替代地，功能性CAR的表达可以通过针对表达靶抗原，例如CD19和/或CD22的细胞的结合活性和/或CTL活性来确定。
用于制备表达本文所述的CAR多肽中的任何CAR多肽的宿主细胞的方法还可以包括离体激活宿主细胞。激活宿主细胞意味着刺激宿主细胞进入激活状态，在所述激活状态下细胞可能能够执行效应子功能。激活宿主细胞的方法将取决于用于表达CAR多肽的宿主细胞的类型。例如，可以在存在一种或多种分子(包含但不限于：抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2和/或植物血凝集素)的情况下离体激活T细胞。在其它实例中，可以在存在一种或多种分子(如4-1BB配体、抗4-1BB抗体、IL-15、抗IL-15受体抗体、IL-2、IL12、IL-21和/或K562细胞)的情况下离体激活NK细胞。在一些实施例中，在施用于受试者之前，离体激活表达本文所述的CAR多肽中的任何CAR多肽的宿主细胞(CAR表达性细胞)。确定宿主细胞是否被激活对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且可以包含评估与细胞激活、细胞因子的表达或分泌以及细胞形态学相关的一种或多种细胞表面标志物的表达。
用于制备表达本文所述的CAR多肽中的任何CAR多肽的宿主细胞的方法可以包括离体扩增宿主细胞。扩增宿主细胞可能涉及引起表达CAR多肽的细胞的数量增加的任何方法，例如允许宿主细胞增殖或刺激宿主细胞增殖。用于刺激宿主细胞扩增的方法将取决于用于表达CAR多肽的宿主细胞的类型，并且对于本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施例中，在施用于受试者之前，离体扩增表达本文所述的CAR多肽中的任何CAR多肽的宿主细胞。
在一些实施例中，将细胞施用于受试者之前，离体扩增并激活表达CAR多肽的宿主细胞。宿主细胞激活和扩增可以用于允许将病毒载体整合到基因组中并表达编码本文所述的CAR多肽的基因。如果使用mRNA电穿孔，则可能不需要激活和/或扩增，尽管在经激活的细胞上进行电穿孔可能更加有效。
在一些情况下，CAR多肽在合适的宿主细胞中瞬时表达(例如，持续3-5天)。如果存在潜在毒性，则瞬时表达可能是有利的，并且应该有助于对可能的副作用进行临床测试的初始阶段。
(b)药物组合物
表达如本文所公开的CAR的基因工程化免疫细胞中的任何基因工程化免疫细胞(例如，抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR，如在上表4中提供的双特异性CAR)可以与药学上可接受的载体混合以形成药物组合物，所述药物组合物也在本公开的范围内。
如与本公开的组合物结合使用的短语“药学上可接受的”是指生理学上可耐受并且在施用于哺乳动物(例如，人类)时通常不会产生不良反应的分子实体和此类组合物的其它成分。优选地，如本文所使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其它普遍认可的药典中列出的可用于哺乳动物，并且更具体地用于人类。“可接受的”意指载体与组合物的活性成分(例如，核酸、载体、细胞或治疗性抗体)相容，并且不会对施用组合物的受试者产生负面影响。用于本发明方法的药物组合物中的任何药物组合物可以包括冻干形成物或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。
药学上可接受的载体(包含缓冲液)在本领域中是熟知的，并且可以包括磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸；疏水性聚合物；单糖；二糖；以及其它碳水化合物；金属络合物；和/或非离子表面活性剂。参见例如，《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》第20版(2000),利平科特·威廉姆斯和威尔金斯公司(Lippincott Williams and Wilkins),K.E.Hoover编辑。
关于另外的有用药剂的实例，还参见：《内科医生案头参考(Physician's DeskReference)》,补充第59版,(2005),Thomson P D R,Montvale N.J.；Gennaro等人编辑,《雷明顿药学科学与实践》,第20版,(2000),马里兰州巴尔的摩的利平科特·威廉姆斯和威尔金斯公司(Lippincott Williams and Wilkins,Baltimore Md.)；Braunwald等人编辑,《哈里森内科医学原理(Harrison's Principles of Internal Medicine)》,补充第15版,(2001),麦格劳·希尔公司(McGraw Hill),纽约；Berkow等人编辑,《默克诊断与疗法手册(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy)》,(1992),默克研究实验室(MerckResearch Laboratories),新泽西州拉威(Rahway N.J.)。
IV.治疗应用
表达如本文所公开的CAR的基因工程化免疫细胞中的任何基因工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或巨噬细胞)(例如，抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR，如在上表4中提供的双特异性CAR)可以用于治疗目的，例如，用于消除表达CD19和/或CD22的不期望细胞。在一些实例中，基因工程化免疫细胞是表达抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR(如在上表4中提供的双特异性CAR)的CAR-T细胞。
为了实践本文所述的方法，可以通过合适的途径(如静脉内施用)向需要治疗的受试者施用有效量的表达本文所述的CAR中的任何CAR(例如，抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR，如在上表4中提供的双特异性CAR)的免疫细胞(NK细胞、T淋巴细胞或巨噬细胞)或其药物组合物。如本文所使用的，有效量是指在施用时赋予受试者治疗效果的相应药剂(例如，表达CAR的NK细胞、T淋巴细胞或巨噬细胞)的量。确定本文所述的细胞或组合物的量是否达到治疗效果对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。如本领域的技术人员所认识到的，有效量有所不同，这取决于正在治疗的特定病状、病状的严重程度、包含年龄、身体状况、大小、性别(gender/sex)和体重在内的个体患者参数、治疗持续时间、同时疗法的性质(如果有的话)、具体施用途径以及在健康从业者的知识和专业技能内的相似因素。在一些实施例中，有效量缓解、减缓、减轻、改善、减少受试者的任何疾病或病症的症状或延缓其进展。在一些实施例中，受试者是人类。在一些实施例中，需要治疗的受试者是人类癌症患者。
如本文所使用的，应用于剂量或量的术语“治疗有效”是指足以在施用于有需要的受试者后产生期望活性的化合物或药物组合物的量。注意，当施用活性成分的组合时，组合的有效量可以包含或可以不包含如果单独施用将有效的每种成分的量。在本公开的上下文中，术语“治疗有效”是指足以延迟通过本公开的方法治疗的病症的表现、阻止其发展、减缓或缓解其至少一种症状的化合物或药物组合物的量。
在一些实施例中，本公开的方法可以用于消除或抑制表达CD19和/或CD22的疾病细胞。因此，本文所公开的免疫细胞中的任何免疫细胞可以用于治疗与CD19+和/或CD22+疾病细胞(如CD19+和/或CD22+癌细胞)相关的疾病。本文所公开的方法可以用于治疗涉及CD19+和/或CD22+癌细胞的癌症，例如造血系统癌症。在某些实施例中，癌症可以是实体瘤。
在一些实施例中，可以通过合适的途径(例如，静脉内输注)向需要治疗的受试者给予有效量的表达如本文所公开的CAR的基因工程化免疫细胞中的任何基因工程化免疫细胞(例如，抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR，如在上表4中提供的双特异性CAR)。受试者可以是患有与CD19+和/或CD22+疾病细胞(如CD19+和/或CD22+癌细胞)相关的疾病的人类患者。在一些情况下，人类患者患有涉及CD19+和/或CD22+癌细胞的癌症。在一些情况下，人类患者可能患有造血系统癌症。在其它情况下，人类患者可能患有实体瘤。
在一些实例中，人类患者可能患有涉及CD19+和/或CD22+疾病B细胞的B细胞恶性病。实例包含但不限于非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤和原发性眼内淋巴瘤。
在一些情况下，人类患者可能患有T细胞恶性病。实例包含但不限于T成淋巴细胞性淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤(例如，皮肤T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、肠病相关肠T细胞淋巴瘤(EATL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)或外周T细胞淋巴瘤，未另行指明(PTCL，NOS))。
在一些实施例中，用于本文所公开的治疗的免疫细胞(例如，NK和/或T细胞)对于受试者可以是自体的，即，免疫细胞可以从需要治疗的受试者获得，被基因工程化以表达CAR多肽，并且然后施用于同一受试者。在一个具体实施例中，在重新引入受试者之前，离体激活和/或扩增自体免疫细胞(例如，T淋巴细胞、NK细胞或巨噬细胞)。与施用非自体细胞相比，向受试者施用自体细胞可能导致宿主细胞的排斥减少。
可替代地，基因工程化免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或巨噬细胞)可以是同种异体细胞，即细胞是从第一受试者获得的，被基因工程化以表达CAR多肽，并且施用于不同于第一受试者但属于同一物种的第二受试者。例如，同种异体免疫细胞可以源自人类供体，并且施用于不同于供体的人类接受者。在具体实施例中，T淋巴细胞是同种异体T淋巴细胞，其中内源性T细胞受体的表达被抑制或消除。在一个具体实施例中，在引入受试者之前，离体激活和/或扩增同种异体T淋巴细胞。T淋巴细胞可以通过本领域已知的任何方法例如在存在抗CD3/CD28、IL-2和/或植物血凝集素的情况下激活。
NK细胞可以通过本领域已知的任何方法例如在存在一种或多种选自由以下组成的组的药剂的情况下激活：CD137配体蛋白、CD137抗体、IL-15蛋白、IL-15受体抗体、IL-2蛋白、IL-12蛋白、IL-21蛋白和K562细胞系。关于用于扩增NK细胞的有用方法的描述，参见例如美国专利第7,435,596号和第8,026,097号。例如，在本公开的方法中使用的NK细胞可以通过暴露于缺乏或不良表达主要组织相容性复合物I和/或II分子的细胞而优先扩增，并且所述细胞已经被基因修饰以表达膜结合的IL-15和4-1BB配体(CDI37L)。此类细胞系包含但不一定限于，K562[ATCC、CCL 243；Lozzio等人,《血液(Blood)》45(3):321-334(1975)；Klein等人,《国际癌症杂志(Int.J.Cancer)》18:421-431(1976)]，以及威尔姆斯肿瘤细胞系HFWT(Fehniger等人,《国际免疫学评论(Int Rev Immunol)》20(3-4):503-534(2001)；Harada H等人,《实验血液学(Exp Hematol)》32(7):614-621(2004))、子宫内膜肿瘤细胞系HHUA、黑色素瘤细胞系HMV-II、肝母细胞瘤细胞系HuH-6、肺小细胞癌细胞系Lu-130和Lu-134-A、成神经细胞瘤细胞系NB 19和N1369、来自睾丸的胚胎癌细胞系NEC 14、宫颈癌细胞系TCO-2和骨髓转移成神经细胞瘤细胞系TNB 1[Harada等人,《日本癌症研究杂志(Jpn.J.Cancer Res)》93:313-319(2002)]。优选地，所使用的细胞系缺乏或不良表达MHC I和II分子两者，如K562和HFWT细胞系。可以使用固体支持物代替细胞系。此类支持物应优选地在其表面附着至少一种能够与NK细胞结合并且诱导初级激活事件和/或增殖应答的分子，或者能够与具有这种作用的分子结合，由此充当支架。支持物可以具有附着于其表面的CD137配体蛋白、CD137抗体、IL-15蛋白或IL-15受体抗体。优选地，支持物将具有结合在其表面上的IL-15受体抗体和CD137抗体。
根据本公开，可以通过向患者输注在约105至109个CAR+细胞的范围内的治疗有效剂量的表达CAR多肽的免疫细胞(如T淋巴细胞或NK细胞)来治疗患者，如在上表4中列出的抗CD19/CD22双特异性CAR(例如，SEQ ID NO:23)。可以按照患者可以忍受的频率和次数重复输注，直到达到期望应答。适当的输注剂量和时间表将因患者而异，但可以由治疗医生针对特定患者来确定。在一些实例中，可以输注大约106个细胞/Kg的初始剂量，逐步增加至108个或更多个细胞/Kg。
在本文所述的方法中使用的具体给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于具体受试者和受试者的病史。所使用的CAR表达性免疫细胞的适当剂量将取决于待治疗的癌症类型、疾病的严重程度和病程、先前的疗法、患者的临床病史和对免疫细胞疗法的应答，以及主治医生的判断。
在一些实施例中，表达本文所公开的CAR构建体中的任何CAR构建体(例如，抗CD19CAR、抗CD22 CAR或抗CD19/CD22双特异性CAR)的基因工程化免疫细胞可以与用于癌症的其它类型的疗法(如化疗、外科手术、放射、基因疗法等)结合使用。此类疗法可以与根据本公开的免疫疗法同时地或顺序地(以任何顺序)施用。当与另外的治疗剂共同施用时，由于相加作用或协同作用，可以降低每种药剂的合适的治疗有效剂量。
V.用于治疗应用的试剂盒
本公开还提供了用于使用表达本文所述的抗CD19 CAR、抗CD22 CAR或抗CD19/CD22双特异性CAR的基因工程化免疫细胞(例如，T淋巴细胞、NK细胞或巨噬细胞)的试剂盒。此类试剂盒可以包含一个或多个容器，所述一个或多个容器包括基因工程化免疫细胞，所述基因工程化细胞可以被调配在进一步包括药学上可接受的载体的药物组合物中。
在一些实施例中，本文所述的试剂盒包括可以在体外扩增的基因工程化免疫细胞。免疫细胞可以表达本文所公开的CAR中的任何CAR，例如，抗CD19/CD22双特异性CAR中的任何抗CD19/CD22双特异性CAR，如在上表4中提供的双特异性CAR。
在一些实施例中，试剂盒可以另外包括用于本文所述的方法中的任何方法的说明书。所包含的说明书可以包括施用本文所公开的基因工程化免疫细胞以在受试者体内实现预期活性，例如消除靶疾病细胞(如表达CD19、CD22或两者的癌细胞)的描述。试剂盒可以进一步包括基于鉴定受试者是否需要治疗来选择适合于治疗的受试者的描述。
与使用本文所述的基因工程化免疫细胞相关的说明书通常包含关于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页上的书面说明。标签或包装插页指示基因工程化免疫细胞用于治疗受试者体内与CD19和/或CD22阳性疾病细胞相关的疾病或病症、延迟所述疾病或病症的发作和/或缓解所述疾病或病症。
本文中提供的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装等。还考虑了与特定装置(如吸入器、鼻腔施用装置或输注装置)组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器还可以具有无菌进口端口。
试剂盒任选地可以提供如缓冲液等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关的标签或包装插页。在一些实施例中，本公开提供了包括上述试剂盒的内容物的制品。
通用技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在如以下等文献中进行了充分解释：《分子克隆：实验室手册》,第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡玛纳出版社；《细胞生物学：实验室手册(CellBiology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis编辑,1989)学术出版社(AcademicPress)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,1987)；《细胞和组织培养导论(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998),普莱南出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；《实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)：《哺乳动物细胞基因转移载体(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编辑,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编辑,1994)；《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practicalapproach)》(D.Catty.编辑,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonalantibodies:a practical approach)》(P.Shepherd和C.Dean编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:alaboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999))；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A practical Approach)》,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑,1985)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,(1985))；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,(1984))；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编辑,(1986))；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》(lRL出版社,1986)；以及B.Perbal,《分子克隆实用指南(A practical Guide To Molecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人,(编辑)。
无需进一步详细阐述，据信本领域的技术人员可以基于以上描述在最大程度上利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。
实例1：CD19+和/或CD22+细胞系的产生及其表征
本实例描述了表达CD19和CD22表面抗原中的一者或两者的细胞系的产生
(a)CD19/CD22阳性重组细胞系的产生
将K562细胞(ATCC)用10ug的pCMV6-进入载体转染，所述载体携带编码全长人CD19或CD22的核苷酸序列，所述核苷酸序列在C端与flag或Myc标签融合。G418药物选择过程产生了表达CD19或CD22的细胞的多克隆耐药池。平行地，产生用空pCMV6-进入载体转染的亲本细胞系，用作阴性对照。通过FACS对表达CD19或CD22的细胞进行分选，以产生表达CD19或CD22的细胞的池。在G418药物选择下对池进行扩增。然后进行单细胞分选，随后进行进一步的药物选择以产生克隆细胞系。通过FACS筛选克隆系的CD19或CD22表达。
为了产生CD19/CD22双阳性细胞系，将10ug的CD22质粒转染到5M的表达CD19的细胞系中并且在G418下进行选择。进行CD19和CD22高的单细胞分选、G418选择和克隆FACS筛选，以获得高CD19/CD22/K562双阳性细胞系。
(b)靶细胞系中的重组和内源性CD19和CD22受体数量的定量
为了进一步表征靶细胞系中的重组和内源性CD19和CD22表达水平(如本文所指示)，使用邦斯实验室公司(Bangs Laboratories Inc)QUANTUM Alexa647(荧光dey)MESF微球珠进行定量FACS测定，用于根据制造商的方案进行标准校准。亲本K562细胞系显示出不可检测的CD19和CD22表达。在单或双阳性重组细胞系中，CD19的表达水平是CD22的表达水平的大约5倍。Raji细胞比Nalm 6细胞表现出更多的CD19和CD22表达。在Raji细胞和Nalm 6细胞两者中，CD19的表达水平是CD22的表达水平的约4-9倍。表5总结了CD19和CD22受体拷贝数量。还参见图1。
表5：靶细胞系中的CD19和CD22的拷贝数量
CD19受体数量 CD22受体数量
K562 0 0
CD19/K562 549231 0
CD22/K562 0 101030
CD19/CD22/K562 500923 95893
Raji 346462 37887
Nalm6 140154 3207
(c)CD19、CD22和CD19/CD22 GFP阳性细胞系的产生
K562、CD19 K562、CD22 K562、CD19/CD22 K562、Raji和Nalm 6细胞系已经被进一步工程化以使用Incucyte CytoLight绿色慢病毒转导引入GFP表达盒。对GFP阳性的细胞进行分选，并且在G418药物选择下建立稳定的细胞系。在5仪器(细胞成像多模读取器)上，将GFP阳性细胞系用于基于成像的细胞毒性测定。
实例2：CD19-CD22双特异性scFv表征
示例性抗CD19/CD22双特异性抗体被表征如下。
(a)CD19-CD22双特异性scFv制备
CD19/CD22双特异性scFv已经在CD19-CD22和CD22-CD19取向上被克隆到pET22b细菌周质载体中，并且在Rosetta II菌株中表达。图2A展示了CD19/CD22双特异性scFv的示例性设计。为了纯化在大肠杆菌(E.coli)细胞中表达的抗体片段，将3μl NiExcel树脂(GE)与1mL的经过滤的上清液混合，并且上样到10mL或20mL BioRad柱上。上样前，用至少20柱体积(CV)缓冲液A(1xPBS，pH7.4，添加额外的NaCl至500mM)平衡柱的树脂。通过在相同的填充树脂床上将流速控制为1毫升/分钟或倾倒两次利用重力流来对过滤灭菌的上清液进行纯化。然后，将柱用以下缓冲液洗涤：10CV缓冲液A、20CV缓冲液B(1xPBS，pH7.4，添加额外的NaCl至500mM，以及30mM咪唑)。如果需要，使用缓冲液来去除内毒素。
为了从250mL表达培养物中纯化抗体片段，将抗体结合的柱依次用20CV缓冲液C(1xPBS，pH7.4，添加额外的NaCl至500mM，1％ Tx114)、20CV缓冲液D(1x PBS，pH7.4，添加额外的NaCl至500mM，1％ Tx100+0.2％ TNBP)和40CV缓冲液E(1xPBS，pH7.4，添加额外的NaCl至500mM)洗涤。
将蛋白质用洗脱缓冲液F(1xPBS，pH7.4，额外的NaCl至500mM，以及500mM咪唑)以总共六个级分(0.5CV预洗脱，5x 1CV洗脱)洗脱。将级分在Bradford测定上运行(100ul稀释的Bradford溶液+10ul样品)。合并具有亮蓝色的级分，并且通过A280延伸系数测量其蛋白质浓度。进行SDS-PAGE凝胶测定以分析经纯化的抗体的纯度。
(b)通过FACS分析确定的抗CD19、抗CD22和抗CD19/CD22双特异性scFv抗体与细胞表面抗原的结合活性
为了确定转化成不同的双特异性scFv形式之后的特异性靶细胞结合活性，已经在FACS结合测定中用K562、CD19 K562、CD22 K562和CD19/CD22 K562重组细胞系对CD19、CD22单特异性scFv和CD19/CD22双特异性scFv进行了测试。简言之，将每个双特异性scFv稀释至200nM，并且与100,000个K562、CD19 K562、CD22 K562和CD19/CD22 K562细胞系在96孔板中在4℃下在振荡下一起温育1小时。将细胞在4℃下以1300rpm离心5分钟，以去除未结合的抗体。然后，将细胞用200μL PBS/孔洗涤一次。将样品与Alexa647(荧光染料)缀合的抗His抗体(次级抗体，100μL，1:1000稀释)混合，并且在4℃下在黑暗中在振荡下温育30分钟。然后，将样品在4℃下以1300rpm离心5分钟，并且用200uL 1x PBS/孔洗涤两次。将所得样品在200uL 1x PBS中重构，并且在AttuneTM NxT流式细胞仪上读数。通过仅计数Alexa647-(荧光染料)阳性细胞进行分析，并且然后在GraphPad8.1软件中绘图。
图3提供了抗CD19、抗CD22和抗CD19/CD22双特异性scFv与细胞表面抗原的结合活性。在所测试的双特异性scFv中，四个双特异性scFv保留了与CD19和CD22靶细胞系类似的结合活性，作为亲本单特异性scFv。与亲本单特异性scFv相比，两个双特异性scFv显示出对CD19靶细胞系的类似结合，并且降低了CD22靶细胞系的结合。
然后，通过FACS测定测试具有完全结合活性的四个双特异性scFv与表达内源性CD19和CD22的Raji细胞的结合活性；确定其EC50值。简言之，将每种经纯化的双特异性scFv蛋白在全培养基中用3倍连续稀释液从200nM开始滴定。将经稀释的样品与100,000个Raji细胞系在96孔板中在4℃下在振荡下一起温育1小时。如上所述，进行洗涤、检测和分析。下表6提供了这些示例性抗CD19/CD22双特异性scFv抗体的EC50值：
表6：示例性双特异性抗体的EC50值
EC50 nM EPC-001-7 EPC-001-8 EPC-001-9 EPC-001-10
Raji 1.923 1.713 2.235 2.522
实例3：抗CD19/CD22双特异性嵌合抗原受体的构建
本实例描述了示例性抗CD19/CD22双特异性嵌合抗原受体(CAR)的构建，以及将此类构建体引入宿主细胞以便通过病毒转导进行表达。
(a)示例性CAR形式和构建
将双特异性CD19/CD22 scFv转化成CD19-CD22或CD22-CD19取向。将scFv片段以串联形式连接，并且具有IgG4铰链、CD28跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3z胞内信号传导结构域的修饰形式(参见以下序列表)。在一些实例中，将双特异性CAR构建体进一步与截短的EGFR片段连接。示例性双特异性CAR构建体示出于图2B。将序列克隆到基于pEF1a的慢病毒载体中。下表7提供了示例性CAR构建体。
表7：示例性CAR构建体
(b)慢病毒的产生和表征
按照制造商的方案，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂将编码双特异性CAR的慢病毒载体与LV-MAX包装混合物共转染至Expi293TM(HEK293细胞)。使经转染的细胞在37℃下以8％ CO2水平振荡生长72小时。通过在室温下以3200rpm离心10分钟并且使用0.45um PES膜真空过滤来收集上清液。通过在4℃下以18000rpm超速离心(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))2小时来浓缩病毒。然后，将沉淀重悬于慢病毒稳定剂中，立即等分并且储存于-80℃下。
按照制造商的方案，使用p24 ELISA试剂盒(凯杰公司(Qiagen))测量病毒滴度，并且基于在每个测定中建立的标准曲线进行计算。通过基于P24 ELISA结果将不同的病毒量转导至固定数量的HEK293细胞来测量功能滴度TU/mL。在从24小时开始的不同时间点，在转染后通过流式细胞术检查CAR+表达细胞的百分比。
实例4：表达抗CD19/CD22双特异性CAR的免疫细胞的表征
使用密度梯度离心LymphoprepTM(一种密度梯度培养基)和来自干细胞技术公司(Stemcell Technology)的SepMateTM 50PBMC分离试剂盒，在LRS室中从新鲜健康供体中分离PBMC。然后，按照干细胞技术公司方案，使用EasySepTM(一种密度梯度培养基)人T细胞分离试剂盒从PBMC中分离CD3+Pan T细胞。将Pan T细胞用人T-激活剂CD3/CD28珠以1:1的珠与细胞比率激活24小时，并且然后在存在(与抗CD3/CD28抗体缀合的珠)和1mg/mL硫酸鱼精蛋白的情况下用慢病毒转导。在25℃下以300g进行旋转接种，持续2小时。将细胞和病毒在37℃下温育24小时。第二天，从珠和病毒中去除细胞。使细胞在X-VIVOTM 15(龙沙公司(Lonza))培养基中在含有重组人IL15和IL7(派普泰克公司(Peprotech))的5％人血清中生长2周。每2-3天更换一次培养基，添加新鲜的细胞因子。
使用与Mix-n-染色剂Alexa647或CF 640R抗体标记试剂盒(西格玛公司(Sigma))直接缀合的抗EGFR抗体或CD22-Fc，通过表面染色评估CAR在细胞表面上的表达。简言之，将100,000个慢病毒转导的T细胞与25nM的抗EGFR-Alexa647或重组人CD22/Fc-CF 640R在黑暗中在4℃振荡下一起温育1小时。将细胞以1,300rpm离心5分钟，去除上清液，并且用200uL 1x PBS洗涤。将所得样品在200uL 1x PBS中重构。通过在AttuneTM NxT流式细胞仪上读取经荧光染色的细胞来对表面表达百分比进行定量。还用Cy5立方体和DAPI立方体(伯腾公司(BioTek))以20x放大倍数在5仪器上对CAR表面表达进行成像。使用1:1000稀释度的Hoechst 34580来对细胞的细胞核进行染色。
在FACS测定中，通过缀合的抗EGFR或CD22-Fc重组蛋白检测的人T细胞上的不同CAR构建体的CAR表达水平在35％-85％的范围内。下表8总结了用所列出的CAR构建体转导的PMBC中的CAR+细胞的百分比。
表8：CAR+细胞的百分比
CAR构建体 阳性细胞％
EPC-001-11 54.577
EPC-001-12 36.180
EPC-001-13 62.423
EPC-001-14 66.784
EPC-001-15 67.659
EPC-001-16 84.042
不同的CAR显示出如通过5成像的T细胞上的均匀表面表达模式，使用Alexa647标记的抗EGFR抗体和Alexa647标记的CD22-Fc融合蛋白两者。参见图4A和4B，使用EPC-001-19作为实例。用不同的CAR观察到类似的模式。
实例5：表达抗CD19/CD22双特异性CAR的T细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性
上文描述了人PBMC和Pan T细胞分离、病毒转导和T细胞扩增。为了筛选不同的CAR活性，用GFP工程化的靶细胞进行基于实时图像的CTL活性测定。简言之，将20,000个经CAR转导的T细胞分别与20,000个K562-GFP、CD19/K562-GFP、CD22/K562-GFP、CD19/CD22/K562-GFP、Raji-GFP和Nalm-6-GFP细胞在含有10％ FBS的RPMI培养基中以1:1的效应物与靶细胞比率一起温育。不添加细胞因子。测定运行96小时，并且通过5扫描仪对靶细胞的GFP进行成像和定量。CTL测定后，用人IFNγELISA试剂盒(R&D系统公司(R&DSystem))检测IFNγ。简言之，在CTL测定在96小时终止后收集上清液。将重组IFNγ连续稀释并包含在测定中以产生标准曲线。按照所提供的制造商方案，测定上清液IFNγ和重组IFNγ。使用GraphPad8.0软件分析数据。
监测CAR表达性细胞针对不同靶细胞(包含K562、CD22 K562、CD19 K562、CD19/Cd22 K562、Raji细胞和Nalm6细胞)的实时CTL活性，并且计算不同的CAR构建体(参见以上实例)的CTL活性的终点。如图5A-5D所示，IFNγ分泌水平与CTL活性相关，如在所测试的不同CAR中观察到的。用不同的CAR对多个供体进行了筛选，并且显示出类似结果。
实例6：具有不同效应物与靶细胞比率的EPC-001-16的CTL测定
为了进一步评估CAR-T细胞的CTL活性，将多个供体用携带EPC-001-16(用作代表性抗CD19/CD22双特异性CAR)的慢病毒转导，并且如上所述扩增所得CAR-T细胞。对于源自供体1的细胞，将经转导或未经转导的T细胞与K562、CD19 K562、CD22 K562和CD19/CD22K562 GFP细胞以5:1、2.5:1和1:1的效应物与靶细胞比率共培养96小时。观察到剂量依赖性靶特异性CTL活性，如图6A所示。对于源自供体2和供体3的细胞，所测试的效应物与靶细胞比率为2.5:1和1:1。观察到类似结果，如图6B所示。CAR-T细胞针对CD22/K562-GFP细胞的CTL活性低于针对CD19/K562-GFP细胞的CTL活性。这可能是由于CD22 K562中CD22的拷贝数量较低，所述拷贝数量是CD19/K562和CD19/CD22 K562细胞中CD19的拷贝数量的1/5-1/10。单个靶细胞系中工程化GFP表达的差异也可以起作用。IFNγ分泌结果示出于图6C。
实例7：通过CTL测定进行的表达抗CD19/CD22双特异性CAR的CAR-T细胞的机制研究
为了研究单个基于scFv的CAR活性的机制，构建了CD19和CD22 scFv单特异性CAR以及对应双特异性CAR(参见下表9)。
表9：单特异性和双特异性CAR构建体
从2个供体中分离PBMC和Pan T细胞，并且用携带EPC-001-16、EPC-001-1-17或EPC-001-18的慢病毒转导。如上所述扩增所得经转导的细胞，并且然后与K562、CD19K562、CD22 K562或CD19/CD22 K562 GFP细胞以2.5:1和1:1的效应物与靶细胞比率共培养60小时，并且通过在5上每2小时成像来定量GFP。与CD19单特异性CAR和CD22单特异性CAR相比，EPC-001-16CD19/CD22双特异性CAR针对所有所测试的靶细胞系显示出类似的CTL活性。图7示出了各种抗CD19/CD22双特异性CAR或抗CD19、抗CD22单特异性CAR在不同的E:T比率下针对K562细胞、CD22 K562细胞、CD19 K562细胞和CD19/CD22 K562细胞的CTL细胞杀伤结果。
实例8：具有不同连接子的示例性双特异性CAR的CTL活性
为了进一步测试两个不同scFv之间的不同连接子是否将影响CAR活性，构建了具有与EPC-001-16相同的抗CD19和抗CD22 scFv片段以及不同连接子，即(G4S)1、(G4S)2和(G4S)3的CAR构建体。参见下表10。将它们的CTL活性与EPC-001-16进行比较。
表10：具有不同连接子的CAR构建体
将PBMC和Pan T细胞分离，并且用EPC-001-19、EPC-001-1-20、EPC-001-21和EPC-001-22慢病毒转导，并且如上所述进行扩增。将经转导的T细胞与K562、CD19/K562、CD22/K562和CD19/CD22/K562 GFP细胞以1:1的效应物与靶细胞比率共培养60小时。每2小时通过5上的靶细胞GFP水平对CTL活性进行成像。使用GraphPad 8.0分析CTL活性的百分比。与EPC-001-20、EPC-001-21和EPC-001-22相比，EPC-001-19显示出更好的CTL活性，如图8所示。
实例9：CTL测定后通过FACS对示例性双特异性CAR进行的细胞因子分析
为了进一步测试表达如本文所公开的抗CD19/CD22双特异性CAR的CAR-T细胞在靶细胞接合时的细胞因子谱，将EPC-001-19(作为代表性双特异性CAR)在Pan T细胞中转导并扩增。将经转导的T细胞与K562、CD19/K562、CD22/K562、CD19/CD22/K562、Raji或Nalm-6GFP细胞以5:1的效应物与靶细胞比率共培养96小时。通过FACS上的胞内染色检测IFNγ和颗粒酶。简言之，在收获样品前4小时，根据制造商的建议(百进生物公司(Biolegend))，使用含有Bredfeldin A的细胞激活混合物将细胞高尔基体封闭。将细胞在室温下以1,300rpm离心5分钟。将细胞用1x PBS洗涤一次，然后用Zombie AquaTM可固定的细胞活力染料(百进生物公司)在1x PBS中以1:1000的稀释度染色，在室温下温育5分钟。然后，将细胞用1x PBS洗涤两次。接下来，在室温下在黑暗中用抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD22、CD22-Fc对细胞进行染色，持续30分钟。然后，使用eBioscience Foxp3/转录因子固定/透化试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher scientific))将细胞在室温下在黑暗中固定20分钟。然后，将细胞用1x PBS洗涤两次，并且重悬于1x PBS中，用于在4C下储存过夜。第二天，使用透化缓冲液(赛默飞世尔科技公司)在室温下在黑暗中使细胞透化15分钟。然后，在黑暗中在室温下对细胞进行IFNγ和颗粒酶胞内蛋白染色，持续30分钟。将细胞用1x透化缓冲液洗涤两次，然后重悬于1x PBS中，并且在AttuneTM NxT流式细胞仪上读数。
在96小时，CD8+T细胞在与靶细胞一起温育时显示出IFNγ和颗粒酶两者的特异性分泌，占CD8+群体的40-80％。观察到IFNγ和颗粒酶阳性CD8 T细胞的良好相关性，如下表11所示。不受理论的束缚，在不同细胞系之间观察到的差异可能是由于不同细胞系中的靶标表达水平的变化而引起的。
表11：CAR-T细胞和靶细胞的共培养中的IFNγ和颗粒酶B的水平
实例10：在靶细胞接合时CAR-T细胞增殖
为了进一步测试在靶细胞接合时CAR-T细胞扩增，使用EPC-001-19作为实例进行7天增殖测定。将EPC-001-19在Pan T细胞中转导并扩增。将经转导的T细胞用最终浓度1uM的Cell Trace远红外标记。将20,000个经标记的T细胞分别与20,000个K562、CD19/K562、CD22/K562、CD19/CD22/K562和Raji细胞靶细胞以E:T比率1:1共培养。用含10％ FBS的RPMI培养基建立测定，并且每两天将新鲜培养基添加到细胞中。在测定期间，没有向培养基中添加细胞因子。在AttuneTM NxT流式细胞仪上分析CAR-T增殖。CAR-T细胞在参与超过7天时表现出靶细胞特异性扩增，并且与细胞上的靶标表达水平相关。图9示出了在与靶细胞以E:T比率1:1接合时CAR-T细胞增殖。
实例11：多轮靶细胞攻击后CAR-T细胞持久性
为了进一步检查CAR-T细胞持久性，使用EPC-001-19作为实例进行多轮靶细胞攻击实验。将EPC-001-19转导到Pan T细胞中并扩增。用20,000个K562、CD19/K562、CD22/K562或CD19/CD22/K562 GFP细胞攻击20,000个经转导的T细胞持续48小时，随后用新鲜的20,000个靶细胞再攻击经转导的T细胞持续另外72小时，然后用新鲜的20,000个靶细胞再攻击经转导的T细胞持续另外72小时，总共3次。用5每2小时对靶细胞GFPCTL进行成像，并且使用GraphPad 8.0软件分析定量。在每次再攻击之间，收集50ul的上清液用于细胞因子测量。
表达EPC-001-19的CAR-T细胞在超过8天的3轮靶攻击和再攻击实验中显示出持续的CTL活性。在所测量的所有时间点观察到类似的IFNγ分泌水平。图10A示出了响应于1轮、2轮或3轮靶细胞攻击的细胞杀伤百分比。图10B示出了CAR-T细胞的对应IFNγ分泌。
实例12：双特异性CAR转导的Pan T和未处理的T细胞表型分析
CAR-T细胞表型与体内T细胞持久性相关。将EPC-001-19转导至人Pan T和未处理的T细胞，并且使用FACS测定用一组检测T细胞分化标志物的抗体分析T细胞表型。简言之，如上所述，使用抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD45RO、抗CD62L、抗CCR7、抗EGFR来对经转导的T细胞进行染色。通过AttuneTM NxT软件进行分析。对CD4和CD8阳性Tcm和Tem细胞进行门控，并且结果显示相较于在Pan T细胞中，在经转导的未处理的T细胞中具有更多的Tcm群体和更少的Tem。
实例13：使用弥散性Raji荧光素酶模型的体内抗肿瘤作用
在NCG小鼠的弥散性Raji细胞模型中评估了EPC-001-23CAR-T的体内抗肿瘤功效。EPC-001-23CAR是通过从EPC-001-19中去除EGFRt而产生的。将EPC-001-23在未处理的PanT细胞中转导，并且在体外扩增4天。将1e6的Raji荧光素酶细胞接种到NCG小鼠中。在第3天，向小鼠给予PBS对照(第1组)、0.125e6(第2组)和0.25e6(第3组)EPC-001-23CAR-T细胞。每2-3天对小鼠进行成像，并测量体重。在第10天、第19天和第33天，从小鼠采集血液。在第33天也收集脾脏。在血液采集和组织收集之后，立即通过FACS测定分析CAR-T细胞表型。
如图11A-11B所示，在第6-14天观察到剂量依赖性肿瘤生长抑制。相较于对照组，第3组动物显示出显著的肿瘤生长抑制。在第31天，以两种剂量(第2组和第3组小鼠)根除来自用CAR-T细胞处理的小鼠的癌细胞。图11C-11D：分别示出了在处理后第14天和第33天的肿瘤细胞荧光素酶定量的图。
由于癌细胞的过度生长，在第14天对对照小鼠实施安乐死。由于GVHD，分别在第31天和第33天对来自低剂量和高剂量CAR-T处理组的一只小鼠实施安乐死，如图11E所示。在整个处理过程中，小鼠体重没有显著变化。
使用EPC-001-23构建体作为实例，CAR-T细胞扩增和持久性在整个处理过程中得到证明，如图12A-12C所示。CAR-T细胞在处理过程中从Tscm分化和扩增至Tcm和Tem。另外，发现EPC-001-23CAR-T细胞的CD4和CD8 Tcm和Tem都归巢到脾脏中。
图12D-12E分别示出了第2组和第3组小鼠在第33天的脾脏中的细胞计数。
实例14：抗CD22-CD19双特异性抗体的表征
本实例描述了scFv-Fc融合形式的示例性抗CD19/CD22双特异性抗体的表征。
(a)CD19-CD22双特异性scFv制备
根据标准方案，抗CD19scFv-Fc、抗CD22scFv-Fc和抗CD22scFv-CD19scFv-Fc抗体在游离形式系统(英杰公司(Invitrogen))中的Expi293FTM细胞中瞬时表达。在收获之前使细胞生长五天。通过离心收集上清液，并且通过0.2μm聚醚砜(PES)膜过滤。通过MabSelectTMPrismA蛋白A树脂(通用电气医疗集团(GE Health))对融合蛋白进行纯化。将蛋白质用100mM甘氨酸pH2.5+150mM NaCl洗脱，并且用20mM柠檬酸盐pH 5.0+300mM NaCl快速中和。然后，通过200 16/600柱进一步纯化抗体。将单体峰级分合并并浓缩。最终纯化的蛋白质具有低于10EU/mg的内毒素，并且保持在20mM组氨酸pH 6.0+150mM NaCl中。
(b)抗CD19、抗CD22和抗CD19/CD22双特异性抗体的结合活性
开发ELISA测定来确定抗CD19-Fc、抗CD22-Fc和抗CD22-CD19-Fc融合蛋白的EC50。简言之，将384孔板用总体积为25μL/孔的在1x PBS中的最终浓度为2μg/mL的HIS标记的人CD19或CD22重组蛋白固定。将板在4℃下温育过夜，随后用80μL的超级块(superblock)/孔封闭1小时。将经纯化的抗CD19、CD22或CD22-CD19 scFv Fc融合蛋白从25nM开始以2倍连续稀释，将25μL添加到人CD19或CD22固定的孔中，并且在振荡下温育1小时。通过添加25μL在1x PBST中以1:5000稀释的抗hFc HRP来检测CD19或CD22结合。在每个步骤之间，将板在板洗涤器中用1XPBST洗涤3次。然后，将板用20μL TMB底物显影5分钟，并且通过添加20μL 2N硫酸停止显影。在OD450 nm(BIOTEK酶标仪)处读取板，并且使用GraphPad8.1软件绘制数据。ELISA结合的结果示出于图13A-13B。针对CD19和CD22的抗CD19或CD22 scFv-Fc的EC50值示出于表12。
表12：通过ELISA确定的与CD19或CD22靶标结合的单特异性和双特异性scFv-Fc的EC50
EC50(nM) CD19结合 CD22结合
抗CD22，ScFv-Fc - 0.043
抗CD19，ScFv-Fc 0.0094 -
抗CD19/CD22，ScFv-Fc 0.052 0.189
(c)通过FACS分析确定的抗CD19/CD22 scFv双特异性抗体与内源性细胞系的结合
为了确定scFv形式和双特异性scFv-Fc融合形式的抗体的特异性靶细胞结合活性，在FACS结合测定中用表达CD19和CD22的细胞系Raji和Nalm-6以及阴性细胞系U87MG测试了抗CD19或抗CD22单特异性scFv和抗CD19/CD22双特异性scFv-Fc融合抗体。简言之，将每个scFv-Fc融合稀释至25nM，并且与100,000个Raji、Nalm 6和U87MG细胞在96孔板中在4℃下在振荡下一起温育1小时。将细胞在4℃下以1300rpm离心5分钟，以去除未结合的抗体。然后，将细胞用200μL PBS/孔洗涤一次。将样品与Alexa647缀合的抗hFc抗体(次级抗体，100μL，1:1000稀释)混合，并且在4℃下在黑暗中在振荡下温育30分钟。然后，将样品在4℃下以1300rpm离心5分钟，并且用200μL 1x PBS/孔洗涤两次。将所得样品在200μL 1xPBS中重构，并且在AttuneTM NxT流式细胞仪上读数。通过仅计数Alexa647阳性细胞并且然后使用GraphPad8.1软件绘图来进行分析。
如在FACS分析中观察到的，Fc融合形式的所有抗CD19、抗CD22和抗CD19/CD22抗体显示出与表达CD19和CD22的Raji和Nalm 6细胞系的特异性结合活性而不是与不表达CD19和CD22的U87MG和U251MG细胞的特异性结合活性。
(d)通过表面等离子体共振(SPR)确定的抗CD19/CD22双特异性抗体的结合动力学
使用BiacoreTM T200通过SPR技术评估抗CD19、抗CD22和抗CD22/CD19 scFv-Fc融合物的动力学分析。使用BiacoreTM T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，在蛋白A传感器芯片上的1xHBSP缓冲液中，在流动池2上以10微升/分钟的流速捕获1μg/mL的Fc融合蛋白，持续60秒。以30微升/分钟的流速将2倍连续的人CD19或CD22-HIS标记的蛋白注射到参考流动池1和Fc融合蛋白捕获的流动池2两者上，持续150秒，随后洗涤300秒。然后，用甘氨酸pH2以30微升/分钟的流速使流动池再生，持续60秒。在96孔板中对每个Fc融合物的100-0nM的8个浓度点进行测定。使用BiacoreTM T200评估软件3.0版分析抗CD19、CD22、CD22-CD19与CD19或CD22蛋白结合的动力学。特异性结合应答单位是从Fc融合蛋白捕获的流动池-2减去与参考流动池-1的结合而得到的。下表13示出了抗CD19、CD22和CD22-CD19scFv-Fc融合蛋白与CD19或CD22的结合动力学。
表13：针对CD19或CD22靶抗原的单特异性和双特异性抗体的动力学
实例15：从CAR-T产生评估CAR-T代谢。
为了预测体内CAR-T持久性，开发了评估线粒体耗氧量的CAR-T代谢测定。将EPC-001-23转导至经激活的人未处理的T细胞，并且扩增至多11天。在第5天和第11天，使用Agilent仪器在测定中对CAR-T细胞和未经转导的T细胞进行测试。
按照制造商的方案，将250,000个CAR-T细胞铺板在聚-D-赖氨酸处理的板上。首先，在端口A中添加1.5μM寡霉素以抑制线粒体ATP合酶。接下来，在端口B中添加1μM羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)。最后，为了阻断线粒体呼吸，在端口C中一起添加0.5μM鱼藤酮和抗霉素以抑制电子传递链的复合物I和III。在每次药物添加之间，将样品混合三次并读取三次。使用XF Mito应力程序在AgilentXFe96仪器上读取板。使用Agilent分析仪软件进行分析。图15A-15B显示CAR候选物EPC-001-023在第5天表现出高2-3倍的氧气消耗，其持续到第11天。
实例16：通过CRISPR技术产生的CD19或CD22 Raji-Luc KO细胞系
本实例评估了EPC-001-023CAR-T细胞克服表达CD19或CD22的靶标逃逸的能力的基础机制。
(a)CRISPR细胞系产生
为了鉴定EPC-001-023CAR-T介导的作用的机制，开发了通过CRISPR技术和动物模型产生的CD19或CD22敲除细胞系。简言之，使用来自布洛德研究所(Broad Institute)的CRISPick数据库设计CRISPR sgRNA序列。设计了靶向CD19和CD22的前5个选择性sgRNA序列(表14)。
表14：针对CD19和CD22靶标的sgRNA序列
靶标 sgRNA SEQ ID NO
CD19 CTAGGTCCGAAACATTCCAC 69
CD19 GGAAAGTATTATTGTCACCG 70
CD19 GCAATGACTTAGGCCCCTTG 71
CD19 AAGATGAAGAATGCCCACAA 72
CD19 ATGAAAAGCCAGATGGCCAG 73
CD22 ATTCATACCGGGTAACACTG 74
CD22 AAGACTCTATGAAAGCACAA 75
CD22 CTCTTCCAACAAATTACACG 76
CD22 AAACCTGCGCGAAGTGACCA 77
CD22 TTCCCATGGTGACTCCACTG 78
通过整合DNA技术合成sgRNA，并且使用酶消化方法将其克隆到lentiCRISPRv2载体中。确认质粒序列。使用用聚乙烯亚胺(PEI)转染的Expi293TM细胞制备这些构建体的慢病毒。使用超速离心方法浓缩病毒，并且然后直接转导到Raji荧光素酶细胞中，随后在室温下旋转接种2小时。2天后，用商业抗人CD19 Alexa647或抗人CD22Alexa647对细胞进行染色，随后进行针对CD19或CD22敲除表达的单细胞分选。将细胞在药物选择压力下在培养物中保持1个月。通过流式细胞仪和蛋白质印迹来表征细胞以实现CD19和CD22表达。
(b)通过FACS测定确认CD19或CD22敲除细胞系
通过FACS对CD19和CD22敲除的单克隆进行筛选。简言之，将每个克隆的100,000个细胞在4℃下在振荡下铺板于96孔板中，持续1小时。将25nM的抗人CD19-FITC或抗人CD22-Alexa647与最终体积为100μL的细胞在4C下一起温育1小时。将细胞在4℃下以1300rpm离心5分钟，以去除未结合的抗体。然后，将细胞用200μL PBS/孔洗涤两次。将所得样品在200μL 1x PBS中重构，并且在AttuneTM N NxT T流式细胞仪上读数。通过仅计数Alexa647阳性细胞或FITC阳性细胞进行分析，并且然后使用GraphPad8.1软件绘图。
如通过FACS分析确定的，与亲本Raji细胞相比，CD22敲除细胞显示出CD22表达完全丧失，但CD19完全表达。类似地，与亲本Raji细胞相比，CD19敲除细胞显示出CD19表达完全丧失，但CD22完全表达。
(c)通过蛋白质印迹测定确认CD19或CD22敲除细胞系
通过蛋白质印迹进一步确认CD19或CD22敲除细胞系。简言之，对于每个细胞系，用含有PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(细胞信号传导目录号5871)的100μL 1x细胞裂解缓冲液(细胞信号传导目录号9803)裂解1e6细胞。将样品在冰上温育20分钟，然后在4C下以13,000rpm离心20分钟。将上清液转移到新管中。将含有SDS上样缓冲液和β-巯基乙醇的25μL全细胞裂解物上样到12孔SDS-PAGE凝胶上，在恒定的200伏电压下运行22分钟。根据制造商的说明书，使用iBlotTM 2将蛋白质转移到PVDF膜上。将膜印迹在室温下用含5％奶粉的1xPBST(含0.05％聚山梨醇酯20的1x PBS)封闭1小时。然后，用1x PBST洗涤3次；在室温下每次洗涤10分钟。将初级物以1:1000稀释度添加到印迹中，并且在4℃下温育过夜。第二天，将印迹用1x PBST洗涤3次；(在室温下每次洗涤10分钟)。以1:1000稀释度添加次级抗体抗兔HRP，并且在室温下温育1小时。然后，将印迹用1x PBST洗涤三次(在室温下每次洗涤10分钟)，并且使用ECLTM试剂(细胞信号传导目录号6883)显影，随后在Fluorchem E凝胶成像仪上读数。如图15所示，在CD19和CD22敲除细胞系中未检测到CD19或CD22蛋白，而亲本Raji细胞系显示出丰富的CD19和CD22表达。
(d)敲除(KO)和敲低(KD)细胞系中的CD19和CD22受体数量的定量
为了进一步表征敲除细胞系中的CD19和CD22表达水平，使用QUANTUM Alexa647MESF微球珠(邦斯实验室公司)进行定量FACS测定，用于根据制造商的方案进行标准校准。亲本Raji细胞系显示出高水平的CD19和CD22表达。在亲本Raji细胞系中，CD19的表达水平是CD22的表达水平的大约5倍。CD19和CD22敲除细胞系显示出不可检测的CD19和CD22表达。CD19或CD22敲低细胞系显示出非常不可检测的CD19或非常低的CD22拷贝数量。表15总结了CD19和CD22受体拷贝数量。还参见图16A-16B。
表15：通过Q-FACS测定进行的CD19和CD22受体计数
CD19受体 CD22受体
Raji荧光素酶 543777 85644
CD19KO 0 95812
CD19KD ND 165024
CD22KO 481819 0
CD22KD 511181 5279
(e)CD19或CD22敲除细胞系上的EPC-001-023单特异性和双特异性scFv-Fc结合
如上所述，通过FACS对与EPC-001-23CAR-T细胞中的抗原结合部分相对应的单特异性和双特异性抗体片段(呈scFv-Fc融合形式)与Raji亲本、CD19敲除和CD22敲除细胞的结合进行测试。结果显示所有scFv都与所测试的细胞系结合，而未观察到CD19 scFv和CD22scFv与Raji CD19或CD22敲除细胞系结合。
实例17：植入有CD19或CD22敲除Raji细胞的小鼠模型中的EPC-001-23体内机制研究
本实例使用双特异性和单特异性靶向分析强调EPC-001-23的体内功能性的机制。
使用NCG小鼠模型来研究EPC-001-23CAR-T对弥散性亲本Raji细胞以及CD19KO或CD22 KO Raji细胞的作用。如上所述，生成EPC-001-23CAR。出于肿瘤负荷的成像和定量的目的，所有Raji细胞表达荧光素酶。
在第3天，向植入有0.3e6亲本Raji的小鼠给予PBS对照(第1组)、0.25e6 EPC-001-23CAR-T细胞和抗CD19对照CAR-T细胞(司利弗明(tisagenlecleucel))。向CD19敲除Raji细胞系和CD22敲除Raji细胞系给予1e6 EPC-001-23。每3-4天对小鼠进行成像，并测量体重。在第36天，收集血液，并且切除脾脏，以用于通过FACS分析CAR-T细胞表型。由于癌细胞的过度生长，在第14天对对照小鼠实施安乐死。
如图17所示，在所有CAR-T细胞处理组中都观察到肿瘤生长抑制。通过EPC-001-23CAR-T细胞通过CD19和CD22的双特异性靶向从用CAR-T细胞更稳健处理的小鼠中根除亲本Raji细胞。还通过EPC-001-23CAT细胞与靶细胞的单特异性接合，也观察到了CD19或CD22敲除Raji细胞的抗肿瘤活性。肿瘤负荷的定量评估示出于图18A-18C。对血液和脾脏进行的表型分析证明了EPC-001-23CAR-T细胞在处理过程中的扩增和持久性(图19A-19B)，其中CAR-T细胞在PBMC中分化并扩增至Tcm和Tem，并且归巢至脾脏。此外，在第36天，CD4+和CD8+CAR-T细胞以类似的比例存在于PBMC和脾脏中，并且没有耗尽被检测为PD1+、Tim3-CAR+T细胞(图20A-20C)。
总之，在本实例中提供的结果显示，抗CD19/CD22双特异性CAR-T细胞(使用EPC-001-23作为实例)不仅可以靶向表达CD19和CD22两者的癌细胞，而且可以靶向仅表达两种靶抗原之一的癌细胞。在单特异性CAR-T细胞疗法中，此种特征在解决潜在的靶标逃逸方面是期望的。
实例18：EPC-001-23针对CD19 KO或CD22 KO Raji细胞在体外和体内的作用
(a)体外细胞毒性
如上所述，已经产生了EPC-001-23和司利弗明(抗CD19 CAR-T细胞)。将CAR-T细胞与亲本Raji、CD19KO、CD22KO、CD19敲低(CD19KD)或CD22KD细胞以E:T比率5:1一起温育72小时。通过分别计数CAR+T细胞和颗粒酶B+CAR+T细胞，使用FACS测定来评估CAR-T细胞扩增和激活。与司利弗明(用作对照)相比，EPC-001-23在72小时显示出更稳健的CAR-T细胞扩增(图21A)和激活(图21B)。
还在如上所述的靶细胞再攻击测定中检查了靶细胞杀伤活性。简言之，在体外产生和扩增CAR-T细胞。在针对刺激1转导后第4天，将100,000个CAR+T细胞与5000个靶细胞在10％ FBS/RPMI中在96孔板中以20:1的比率一起温育。将样品在室温下以1,300rpm离心5分钟，然后在37C下在5％ CO2的情况下温育72小时。温育3天后，将板以1,300rpm离心5分钟。小心地，去除50uL上清液并丢弃。对于再攻击2，向含有CAR-T细胞的板中添加含新鲜的10,000个靶细胞的50ul 10％ FBS/RPMI。将板以1,300rpm离心5分钟，随后在37C下在5％ CO2的情况下温育72小时。如上所述重复再攻击3次。如上所述，在最终的72小时温育后，通过用5uL抗人CD19 AF647(百进生物公司，目录号SJ25C1)和5uL抗人CD22 AF647(百进生物公司，目录号HIB22)进行染色来计数靶细胞。将经染色的细胞重悬于200uL 1x PBS中，在AttuneTM3激光流式细胞仪(赛默飞世尔科技公司)上读数。在AttuneTM软件和GraphPad 8上进行分析。
如图21C中已知的，在存在低水平的活靶细胞(包含亲本Raji细胞和CD22 KO Raji细胞)的情况下，EPC-001-23和司利弗明显示出类似的靶细胞杀伤活性。另一方面，与司利弗明相比，EPC-001-23显示出针对CD19 KO Raji细胞更强的靶细胞杀伤活性。
(b)体内细胞毒性
还在植入有荧光素酶表达性Raji细胞和CD19 KO Raji细胞的NCG小鼠模型中检查了EPC-001-23双特异性CAR-T细胞和司利弗明(作为阳性对照)的体内细胞毒性。如上所述，产生CAR-T细胞。在第3天，向植入有0.3e6亲本Raji的小鼠给予PBS对照(第1组)、0.2e6EPC-001-23CAR-T细胞和司利弗明CAR-T细胞。每3-4天对小鼠进行成像，并测量体重。如图22A和22B所示，与司利弗明相比，双特异性EPC-001-23CAR-T细胞在移植有亲本Raji细胞的小鼠中显示出更强且更持久的抗肿瘤活性。图22B。类似地，与司利弗明相比，双特异性EPC-001-23CAR-T细胞在移植有CD19 KO亲本Raji细胞的小鼠中显示出更强且更持久的抗肿瘤活性。图23A和23B。
本实例的结果证实了双特异性CAR-T细胞对表达两种靶抗原的细胞和仅表达一种靶抗原的细胞的细胞毒性。如此，在靶标逃逸的背景下，预期双特异性CAR-T细胞维持治疗功效，这可能是与单特异性CAR-T疗法相关的问题。
其它实施例
本说明书中公开的特征中的所有特征可以以任何组合来组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代性特征替代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是通用系列的等效或类似特征的实例。
通过以上描述，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求范围内。
等效方案
尽管本文已经描述和展示了若干个本发明实施例，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行本文所述的功能和/或获得这些结果和/或这些优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变型和/或修改中的每个变型和/或修改被视为处于本文所述的本发明实施例的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构型意味着示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本发明教导所使用的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体本发明实施例的许多等效形式。因此，应理解，前述实施例仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求以及其等效形式的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践本发明实施例。本公开的本发明实施例涉及本文所述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合并不相互矛盾，则此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法被包含在本公开的本发明范围内。
本文中定义和使用的所有定义都应当被理解为对字典定义的控制、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题而通过引用并入，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。
除非明确表示相反的意思，否则如本文在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应当理解为意指“至少一个(种)”。
如本文在说明书中和权利要求中使用的，短语“和/或”应当理解为意指如此结合的要素中的“任一个或两个”，即在一些情况下共同存在而在其它情况下分开存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此结合的要素中的“一个或多个”。除了通过“和/或”从句具体标识的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与如“包括(comprising)”等开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施例中可以仅指A(任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施例中，仅指B(任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施例中，指A和B两者(任选地包含其它要素)；等。
如本文在本说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，在将列表中的项分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个要素，但还包含多于一个要素以及任选地另外的未列出的项。仅明确指出相反的术语如“仅一个”或“恰好一个”或当在权利要求中使用时，“由…组成”指包含许多元素或元素列表中的恰好一个元素。一般而言，当之前有排他性术语，如“任一个”、“…之一”、“…中的仅一个”、或“…中的恰好一个”时，本文所使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代方案(即，“一个或另一个而不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由…组成”应当具有如在专利法领域中所使用的普通含义。
如在本说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应被理解为是指选自要素列表中的要素中的任一个或多个要素中的至少一个要素、但不一定包含要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体标识的要素之外的要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，在一个实施例中，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可以指任选地包含多于一个A，不存在B(并且任选地包含除了B之外的要素)的至少一个；在另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个B，不存在A(并且任选地包含除了A之外的要素)的至少一个；在又另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个A的至少一个，以及任选地包含多于一个B(以及任选地包含其它元素)的至少一个；等。
还应当理解，除非明确指出相反，否则在本文所要求保护的包含多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述的方法的步骤或动作的顺序。
序列表
<110> 艾佩斯瑞生物制药公司(Elpis Biopharmaceuticals)
<120> 与CD19和CD22结合的双特异性嵌合抗原受体
<130> 112139-0027 (7004WO00)
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 63/140,752
<151> 2021-01-22
<160> 78
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Gly Tyr Tyr Trp Thr
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp
1 5 10 15
Ile
<210> 4
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val His
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile
1 5
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 9
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Asp Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Gln Gln Tyr His Thr Trp Thr Pro Val Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Thr Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr
180 185 190
Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Ser Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr His Thr Trp Thr Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Asp Gly Trp Thr Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 22
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr
1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr
1 5 10
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
130 135 140
Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser
195 200 205
Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His
210 215 220
Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr
1 5
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr
1 5 10
<210> 35
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
130 135 140
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
195 200 205
Ile Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 37
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 43
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 44
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 46
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 47
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 48
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
260 265 270
Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys
275 280 285
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg
290 295 300
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr
305 310 315 320
Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met
325 330 335
Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu
340 345 350
Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Gly Ile
355 360 365
Ala Val Ala Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
370 375 380
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
385 390 395 400
Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser
405 410 415
Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
420 425 430
Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
435 440 445
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Val
465 470 475 480
Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp
485 490 495
Thr Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Tyr
500 505 510
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly His His His His His His
515 520 525
<210> 49
<211> 524
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr
180 185 190
Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Ser Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr His Thr Trp Thr Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
245 250 255
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly
260 265 270
Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly
275 280 285
Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
290 295 300
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
325 330 335
Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
340 345 350
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr
355 360 365
Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
370 375 380
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
385 390 395 400
Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
405 410 415
Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg
420 425 430
Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
435 440 445
Val Tyr Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser
450 455 460
Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
465 470 475 480
Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser
485 490 495
Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp
500 505 510
Asp Asp Asp Lys Gly Gly His His His His His His
515 520
<210> 50
<211> 522
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys
275 280 285
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg
290 295 300
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp
305 310 315 320
Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
325 330 335
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
340 345 350
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Trp Thr
355 360 365
Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
385 390 395 400
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly
405 410 415
Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
420 425 430
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly
435 440 445
Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp
465 470 475 480
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr
485 490 495
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
500 505 510
Asp Lys Gly Gly His His His His His His
515 520
<210> 51
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
130 135 140
Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser
195 200 205
Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His
210 215 220
Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
245 250 255
Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro
260 265 270
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser
275 280 285
Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser
305 310 315 320
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe
325 330 335
Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
340 345 350
Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn
355 360 365
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro
385 390 395 400
Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala
405 410 415
Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val His Trp
420 425 430
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp
435 440 445
Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser
450 455 460
Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly Asp Glu
465 470 475 480
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile Phe Gly
485 490 495
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
500 505 510
Gly Gly His His His His His His
515 520
<210> 52
<211> 524
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
260 265 270
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys
275 280 285
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg
290 295 300
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr
305 310 315 320
Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met
325 330 335
Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu
340 345 350
Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp
355 360 365
Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
405 410 415
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
420 425 430
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
435 440 445
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser
465 470 475 480
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro
485 490 495
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp
500 505 510
Asp Asp Asp Lys Gly Gly His His His His His His
515 520
<210> 53
<211> 522
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
130 135 140
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
195 200 205
Ile Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
245 250 255
Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu
260 265 270
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser
275 280 285
Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
290 295 300
Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asn
305 310 315 320
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys
325 330 335
Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
340 345 350
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val
355 360 365
Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
405 410 415
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val
420 425 430
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
435 440 445
Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser
450 455 460
Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly
465 470 475 480
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile
485 490 495
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
500 505 510
Asp Lys Gly Gly His His His His His His
515 520
<210> 54
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu
20 25 30
Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys
35 40 45
Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile
50 55 60
Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly
65 70 75 80
Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His
85 90 95
Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys
100 105 110
Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr
115 120 125
Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys
130 135 140
Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser
145 150 155 160
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile
165 170 175
Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys
180 185 190
Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly
195 200 205
Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
210 215 220
Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg
225 230 235 240
Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu
245 250 255
Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His
260 265 270
Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly
275 280 285
Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys
290 295 300
Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val
305 310 315 320
Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn
325 330 335
Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn
340 345 350
Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu
355 360 365
Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
370 375 380
<210> 55
<211> 724
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly
35 40 45
Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn
65 70 75 80
Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr
115 120 125
Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
165 170 175
Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg
180 185 190
Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
195 200 205
Val Tyr Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser
210 215 220
Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser
245 250 255
Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
275 280 285
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala Ser Val
290 295 300
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile
305 310 315 320
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp
325 330 335
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly
340 345 350
Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
355 360 365
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
370 375 380
Asp Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
405 410 415
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr
420 425 430
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
435 440 445
Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
450 455 460
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val
465 470 475 480
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
485 490 495
Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
500 505 510
Tyr His Thr Trp Thr Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
515 520 525
Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe
530 535 540
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
545 550 555 560
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys
565 570 575
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
580 585 590
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
595 600 605
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
610 615 620
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
625 630 635 640
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
645 650 655
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
660 665 670
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
675 680 685
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
690 695 700
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
705 710 715 720
Leu Pro Pro Arg
<210> 56
<211> 724
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
65 70 75 80
Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly
115 120 125
Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
145 150 155 160
Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly
165 170 175
Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly
195 200 205
Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Thr Pro Val Thr
245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser
260 265 270
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu
275 280 285
Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
290 295 300
Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp
305 310 315 320
Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn
325 330 335
His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr
340 345 350
Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser
355 360 365
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly
370 375 380
Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly
385 390 395 400
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro
420 425 430
Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly
435 440 445
Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
450 455 460
Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly
465 470 475 480
Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu
485 490 495
Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
500 505 510
Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
515 520 525
Val Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe
530 535 540
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
545 550 555 560
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys
565 570 575
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
580 585 590
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
595 600 605
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
610 615 620
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
625 630 635 640
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
645 650 655
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
660 665 670
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
675 680 685
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
690 695 700
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
705 710 715 720
Leu Pro Pro Arg
<210> 57
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly
35 40 45
Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn
65 70 75 80
Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
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Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr
115 120 125
Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
165 170 175
Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg
180 185 190
Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
195 200 205
Val Tyr Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser
210 215 220
Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser
245 250 255
Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
275 280 285
Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu
290 295 300
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met
305 310 315 320
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val
325 330 335
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
340 345 350
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
355 360 365
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
370 375 380
Asp Gly Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
385 390 395 400
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser
420 425 430
Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
435 440 445
Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
450 455 460
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe
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Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu
485 490 495
Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp
500 505 510
Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Ser
515 520 525
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val
530 535 540
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
545 550 555 560
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
565 570 575
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
580 585 590
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
595 600 605
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
610 615 620
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
645 650 655
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
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675 680 685
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
690 695 700
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
705 710 715 720
<210> 58
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Trp Thr Gly Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys
195 200 205
Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly
260 265 270
Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly
275 280 285
Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val
290 295 300
Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro
305 310 315 320
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser
325 330 335
Ser Asn Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
340 345 350
Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala
355 360 365
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370 375 380
Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
385 390 395 400
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
405 410 415
Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val
420 425 430
Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu
435 440 445
Ser Arg Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
450 455 460
Leu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg
465 470 475 480
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485 490 495
Val Glu Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly
500 505 510
Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Ser
515 520 525
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val
530 535 540
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
545 550 555 560
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
565 570 575
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
580 585 590
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
595 600 605
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
610 615 620
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
625 630 635 640
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
645 650 655
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
660 665 670
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
675 680 685
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
690 695 700
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
705 710 715 720
<210> 59
<211> 722
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly
35 40 45
Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn
65 70 75 80
Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
85 90 95
Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr
115 120 125
Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
165 170 175
Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg
180 185 190
Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
195 200 205
Val Tyr Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser
210 215 220
Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser
245 250 255
Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser
260 265 270
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
275 280 285
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
290 295 300
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile
305 310 315 320
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp
325 330 335
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly
340 345 350
Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
355 360 365
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
370 375 380
Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
385 390 395 400
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
405 410 415
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
420 425 430
Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
435 440 445
Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro
450 455 460
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp
465 470 475 480
Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val
530 535 540
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
545 550 555 560
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
565 570 575
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
580 585 590
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
595 600 605
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
610 615 620
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Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
645 650 655
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660 665 670
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
675 680 685
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
690 695 700
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
705 710 715 720
Pro Arg
<210> 60
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
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Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr
165 170 175
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala
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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser
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340 345 350
Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp
355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
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675 680 685
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705 710 715
<210> 61
<211> 839
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
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Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
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595 600 605
Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu
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Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly
645 650 655
Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala
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Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe
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820 825 830
Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
835
<210> 62
<211> 843
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
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1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly
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Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
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Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
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Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg
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Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
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Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser
245 250 255
Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Ser Lys Tyr
260 265 270
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val
275 280 285
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
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Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
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Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
325 330 335
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
340 345 350
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
355 360 365
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
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Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
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Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
405 410 415
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420 425 430
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
435 440 445
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu
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Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
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Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu
485 490 495
Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys
500 505 510
Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala
515 520 525
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580 585 590
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Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly
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645 650 655
Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn
660 665 670
Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu
675 680 685
Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val
690 695 700
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Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu
725 730 735
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740 745 750
Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys
755 760 765
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770 775 780
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Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
835 840
<210> 63
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr
85 90 95
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100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
195 200 205
Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
260 265 270
Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
275 280 285
Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr
290 295 300
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
530 535 540
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565 570 575
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595 600 605
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610 615 620
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
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Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
645 650 655
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
660 665 670
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
675 680 685
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
690 695 700
Ala Leu Pro Pro Arg
705
<210> 64
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
65 70 75 80
Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
195 200 205
Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro
275 280 285
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser
290 295 300
Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
305 310 315 320
Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser
325 330 335
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe
340 345 350
Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
355 360 365
Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn
370 375 380
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro
405 410 415
Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala
420 425 430
Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val His Trp
435 440 445
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp
450 455 460
Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser
465 470 475 480
Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly Asp Glu
485 490 495
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile Phe Gly
500 505 510
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
515 520 525
Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
530 535 540
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
545 550 555 560
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
565 570 575
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
580 585 590
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
595 600 605
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
610 615 620
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
625 630 635 640
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
645 650 655
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
660 665 670
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
675 680 685
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
690 695 700
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
705 710
<210> 65
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
65 70 75 80
Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
195 200 205
Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala
275 280 285
Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr
290 295 300
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro
305 310 315 320
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Ser Ser
325 330 335
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
340 345 350
Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp
355 360 365
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Arg Ser Gly Trp
370 375 380
Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
385 390 395 400
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala
420 425 430
Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Glu Ser
435 440 445
Arg Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
450 455 460
Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Leu
465 470 475 480
Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val
485 490 495
Glu Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser
500 505 510
Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Ser Lys
515 520 525
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val
530 535 540
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
545 550 555 560
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
565 570 575
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
580 585 590
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
595 600 605
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
610 615 620
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
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Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
645 650 655
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
660 665 670
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
675 680 685
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
690 695 700
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
705 710 715
<210> 66
<211> 722
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
65 70 75 80
Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
195 200 205
Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys
260 265 270
Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln
275 280 285
Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
290 295 300
Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg
305 310 315 320
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly
325 330 335
Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
340 345 350
Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr
355 360 365
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Arg
370 375 380
Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
385 390 395 400
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
405 410 415
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val
420 425 430
Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys
435 440 445
Ile Glu Ser Arg Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
450 455 460
Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro
465 470 475 480
Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile
485 490 495
Ser Arg Val Glu Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp
500 505 510
Asp Gly Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
515 520 525
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val
530 535 540
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
545 550 555 560
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
565 570 575
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
580 585 590
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
595 600 605
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
610 615 620
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
625 630 635 640
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
645 650 655
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
660 665 670
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
675 680 685
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
690 695 700
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
705 710 715 720
Pro Arg
<210> 67
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
65 70 75 80
Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr
85 90 95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
195 200 205
Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
260 265 270
Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
275 280 285
Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr
290 295 300
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile
305 310 315 320
Asn His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
325 330 335
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu Asn Leu Asn
340 345 350
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355 360 365
Gly Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Glu Val Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp
370 375 380
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro
405 410 415
Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly
420 425 430
Gly Asn Lys Ile Glu Ser Arg Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
435 440 445
Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala Arg Pro Ser
450 455 460
Gly Ile Pro Glu Arg Leu Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr
465 470 475 480
Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
485 490 495
Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
500 505 510
Thr Val Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met
515 520 525
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
530 535 540
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys
545 550 555 560
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
565 570 575
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
580 585 590
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
595 600 605
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
610 615 620
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
675 680 685
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
690 695 700
Ala Leu Pro Pro Arg
705
<210> 68
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
ctaggtccga aacattccac 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
ggaaagtatt attgtcaccg 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
gcaatgactt aggccccttg 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
aagatgaaga atgcccacaa 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
atgaaaagcc agatggccag 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
attcataccg ggtaacactg 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
aagactctat gaaagcacaa 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
ctcttccaac aaattacacg 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
aaacctgcgc gaagtgacca 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
ttcccatggt gactccactg 20

Claims (39)

1.一种对CD19和CD22具有特异性的双特异性嵌合抗原受体(CAR)，所述双特异性CAR包括对CD19具有特异性的第一抗原结合部分、对CD22具有特异性的第二抗原结合部分、共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域；
其中所述第一抗原结合部分包括与参考抗体EPC-001-1相同的重链互补决定区(CDR)和相同的轻链CDR，所述参考抗体与CD19结合；并且
其中所述第二抗原结合部分包括与参考抗体EPC-001-2、EPC-001-3或EPC-001-4相同的重链CDR和相同的轻链CDR，所述参考抗体中的每个参考抗体与CD22结合。
2.根据权利要求1所述的双特异性CAR，其中所述第一抗原结合部分包括与所述参考抗体EPC-001-1相同的重链可变区(VH)和相同的轻链可变区(VL)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的双特异性CAR，其中所述第二抗原结合部分包括与所述参考抗体EPC-001-2、EPC-001-3或EPC-001-4相同的重链可变区(VH)和相同的轻链可变区(VL)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性CAR，其中所述第一抗原结合部分、所述第二抗体结合部分或两者是单链可变片段(scFv)。
5.根据权利要求4所述的双特异性CAR，其中所述第一抗原结合部分是包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的scFv。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的双特异性CAR，其中所述第二抗原结合部分是包括SEQ ID NO:18、27或36的氨基酸序列的scFv。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性CAR，其中所述共刺激信号传导结构域来自选自以下的共刺激分子：CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40或CD40L。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性CAR，其中所述胞质信号传导结构域来自CD3ζ。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的双特异性CAR，其中所述双特异性CAR包括：
(a)融合多肽，所述融合多肽从N端至C端包括(i)所述第一抗原结合部分、(ii)所述第二抗原结合部分、(iii)所述共刺激信号传导结构域和(iv)所述胞质信号传导结构域；或
(b)融合多肽，所述融合多肽从N端至C端包括(i)所述第二抗原结合部分、(ii)所述第一抗原结合部分、(iii)所述共刺激信号传导结构域和(iv)所述胞质信号传导结构域。
10.根据权利要求9所述的双特异性CAR，其进一步包括铰链结构域和跨膜结构域，所述铰链结构域和所述跨膜结构域位于(ii)与(iii)之间。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的双特异性CAR，其进一步包括肽连接子，所述肽连接子连接所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分。
12.根据权利要求11所述的双特异性CAR，其中所述肽连接子包括GGGGS(SEQ ID NO:38)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:40)或GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的双特异性CAR，其包括SEQ ID NO:48-53中的任一个的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的双特异性CAR，其包括SEQ ID NO:55-60和63-67中的任一个的氨基酸序列。
15.一种核酸或一组核酸，其共同编码根据权利要求1至14中任一项所述的双特异性CAR。
16.根据权利要求15所述的核酸或一组核酸，其包括编码根据权利要求9至15中任一项所述的双特异性CAR的核苷酸序列。
17.根据权利要求16所述的核酸或一组核酸，其进一步包括：编码截短的上皮生长因子受体(EGFR)结构域的核苷酸序列，所述截短的EGFR结构域包括EGFR受体的胞外结构域和跨膜结构域；以及编码自切割肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于编码所述双特异性CAR的所述核苷酸序列与编码所述截短的EGFR结构域的所述核苷酸序列之间。
18.根据权利要求17所述的核酸或一组核酸，其中所述截短的EGFR结构域包括SEQ IDNO:68的氨基酸序列。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的核酸或一组核酸，其中所述核酸是表达载体，所述表达载体任选地是病毒载体。
20.一种基因工程化免疫细胞，其表达根据权利要求1至14中任一项所述的双特异性CAR。
21.根据权利要求20所述的基因工程化免疫细胞，其包括编码所述双特异性CAR的根据权利要求15至19中任一项所述的核酸。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的基因工程化免疫细胞，其是T细胞、NK细胞或巨噬细胞，任选地其中所述免疫细胞是T细胞。
23.一种抗CD19嵌合抗原受体(CAR)，其包括与CD19结合的胞外抗原结合结构域、共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域；其中所述胞外抗原结合结构域是抗CD19单链可变片段(scFv)，所述抗CD19 scFv包括与抗CD19抗体EPC-001-1相同的重链互补决定区(CDR)和相同的轻链CDR。
24.根据权利要求23所述的抗CD19 CAR，其中所述抗CD19 scFv包括与抗CD19抗体EPC-001-1相同的重链可变结构域和相同的轻链可变结构域。
25.根据权利要求24所述的抗CD19 CAR，其中所述抗CD19 scFv包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
26.根据权利要求25所述的抗CD19 CAR，其包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
27.一种抗CD22嵌合抗原受体(CAR)，其包括与CD22结合的胞外抗原结合结构域、共刺激信号传导结构域和胞质信号传导结构域；其中所述胞外抗原结合结构域是抗CD22单链可变片段(scFv)，所述抗CD22 scFv包括与抗CD22抗体EPC-001-2、EPC-001-3或EPC-001-4相同的重链互补决定区(CDR)和相同的轻链CDR。
28.根据权利要求27所述的抗CD22 CAR，其中所述抗CD22 scFv包括与抗CD22抗体EPC-001-2、EPC-001-3或EPC-001-4相同的重链可变结构域和相同的轻链可变结构域。
29.根据权利要求28所述的抗CD22 CAR，其中所述抗CD22 scFv包括SEQ ID NO:18、27或36的氨基酸序列。
30.根据权利要求29所述的抗CD22 CAR，其包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
31.一种核酸，其编码根据权利要求23至26中任一项所述的抗CD19 CAR或编码根据权利要求27至30中任一项所述的抗CD22 CAR。
32.根据权利要求31所述的核酸，其是表达载体，任选地其中所述表达载体是病毒载体。
33.一种基因工程化免疫细胞，其表达根据权利要求23至26中任一项所述的抗CD19CAR或根据权利要求27至30中任一项所述的抗CD22 CAR。
34.根据权利要求33所述的基因工程化免疫细胞，其是T细胞。
35.一种用于消除受试者的不期望细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求18至20和33至34中任一项所述的基因工程化免疫细胞，或包括所述基因工程化免疫细胞的药物组合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述不期望细胞是癌细胞。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述受试者是人类癌症患者。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述人类癌症患者包括CD19+和/或CD22+癌细胞。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述人类癌症患者患有造血系统恶性病，所述造血系统恶性病任选地是T细胞恶性病或B细胞恶性病。
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