JP2024504162A - Ｃｄ１９及びｃｄ２２に結合する二重特異性キメラ抗原受容体 - Google Patents

Abstract

ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方に結合することができる二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、並びにそれを発現する免疫細胞。また、がん細胞などの疾患細胞を排除するためのかかる免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の治療的使用も本明細書に提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１４０，７５２号の出願日の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）Ｔ細胞は、免疫療法における使用のための人工Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子操作されたＴ細胞である。人工Ｔ細胞受容体（キメラ抗原受容体として知られる）は、がん抗原などの疾患細胞抗原に特異的に結合することができる。疾患細胞に結合すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞が活性化され、疾患細胞を排除する。

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、いくつかの血液がんの治療において有効性を実証しているが、治療の有効性は、様々な要因、例えば、腫瘍抗原回避によって影響される場合があり、例えば、腫瘍抗原の発現レベルが、ＣＡＲ－Ｔ細胞が細胞傷害活性に関与及び媒介することができないレベルに低減する場合がある。いくつかの場合では、腫瘍細胞は、ＣＡＲへの結合エピトープを欠く標的抗原の代替形態を発現することによって、殺傷を回避し得る。他の場合では、腫瘍細胞は、遺伝的に関連するが表現型的に異なる疾患（いわゆる系統スイッチ）に切り替えることによって殺傷を回避し得る。
したがって、そのような課題に対処するための改善されたＣＡＲ－Ｔアプローチを開発することは非常に興味深いことである。

本開示は、少なくとも部分的に、動物モデルで観察されるように、優れた抗原結合親和性及び特異性並びに優れた抗腫瘍効果を有する抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の開発に基づいている。

したがって、本明細書では、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ、それをコードする核酸、二重特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞などの宿主細胞、及びそれらの治療用途が提供される。

いくつかの態様では、本開示は、ＣＤ１９及びＣＤ２２に特異的な二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＣＤ１９に特異的な第１の抗原結合部分と、ＣＤ２２に特異的な第２の抗原結合部分と、共刺激シグナル伝達ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインと、を含む、二重特異性キメラ抗原受容体を特徴とする。第１の抗原結合部分は、ＣＤ１９に結合する参照抗体ＥＰＣ－００１－１と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／又は同じ軽鎖ＣＤＲを含み得る。第２の抗原結合部分は、各々がＣＤ２２に結合する参照抗体ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－３、又はＥＰＣ－００１－４と同じ重鎖ＣＤＲ及び／又は同じ軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、参照抗体ＥＰＣ－００１－１と同じ重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び同じ軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含み得る。代替的には、又は加えて、第２の抗原結合部分は、参照抗体ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－３と同じ重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び同じ軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分、第２の抗体結合部分、又はそれら両方は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。例えば、第１の抗原結合部分は、配列番号９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。代替的には、又は加えて、第２の抗原結合部分は、配列番号１８、２７、又は３６のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。

本明細書に開示されるＣＡＲ構築物のうちのいずれかでは、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、又はＣＤ４０Ｌから選択される共刺激分子由来であり得る。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ由来である。本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれかは、ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み得る。いくつかの場合では、ヒンジ及び膜貫通ドメインは、抗原結合部分及び共刺激シグナル伝達ドメインに位置され得る。

いくつかの例では、二重特異性ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）第１の抗原結合部分と、（ｉｉ）第２の抗原結合部分と、（ｉｉｉ）共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｉｖ）細胞質シグナル伝達ドメインと、を含む、融合ポリペプチドを含む。他の例では、二重特異性ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）第２の抗原結合部分と、（ｉｉ）第１の抗原結合部分と、（ｉｉｉ）共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｉｖ）細胞質シグナル伝達ドメインと、を含む、融合ポリペプチドを含む。

いくつかの場合では、二重特異性ＣＡＲは、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分とを接続するペプチドリンカーを更に含み得る。例示的なペプチドリンカーとしては、ＧＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、又はＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４１）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲは、配列番号４８～５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。いくつかの例では、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲは、配列番号５５～６０及び６３～６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。

別の態様では、本明細書では、本明細書で開示される二重特異性ＣＡＲのうちのいずれかを集合的にコードする、核酸又は核酸のセットが提供される。例えば、核酸は、配列番号４８～５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含み得る。特定の例では、核酸は、配列番号５５～６０及び６３～６７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含み得る。

いくつかの場合では、核酸又は核酸のセットは、（ｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含み得る短縮型ＥＧＦＲドメインをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）二重特異性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と短縮型ＥＧＦＲドメインをコードするヌクレオチド配列との間に位置する自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、を更に含み得る。いくつかの例では、短縮型ＥＧＦＲドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。

核酸又は核酸のセットのうちのいずれかは、発現ベクターであり得る。いくつかの例では、発現ベクターは、ウイルスベクターであり得る。

更に別の態様では、本開示は、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲのうちのいずれかを発現する遺伝子操作された免疫細胞を特徴とする。かかる遺伝子操作された免疫細胞は、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲをコードする核酸のうちのいずれかを含み得る。いくつかの例では、遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作された免疫細胞は、ＮＫ細胞である。他の例では、遺伝子操作された免疫細胞は、マクロファージであり得る。

また、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ及び抗ＣＤ２２ ＣＡＲ、それらをコードする核酸、並びにそれらを発現する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）も本開示の範囲内である。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインと、を含み得る。細胞外抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９抗体ＥＰＣ－００１－１と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖ＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。いくつかの例では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、抗ＣＤ１９抗体ＥＰＣ－００１－１と同じ重鎖可変ドメイン及び同じ軽鎖可変ドメインを含む。一例では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。一特定の例では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号６２のアミノ酸配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＤ２２に結合する細胞外抗原結合ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインと、を含み得る。いくつかの例では、細胞外抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２２抗体ＥＰＣ－００１－２と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／又は同じ軽鎖ＣＤＲを含む抗ＣＤ２２単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。例えば、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖは、抗ＣＤ２２抗体ＥＰＣ－００１－２と同じ重鎖可変ドメイン及び／又は同じ軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの例では、細胞外抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２２抗体ＥＰＣ－００１－３と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／又は同じ軽鎖ＣＤＲを含む抗ＣＤ２２単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。例えば、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖは、抗ＣＤ２２抗体ＥＰＣ－００１－３と同じ重鎖可変ドメイン及び／又は同じ軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの例では、細胞外抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２２抗体又はＥＰＣ－００１－４と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／又は同じ軽鎖ＣＤＲを含む抗ＣＤ２２単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。例えば、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖは、抗ＣＤ２２抗体ＥＰＣ－００１－４と同じ重鎖可変ドメイン及び／又は同じ軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖは、配列番号１８、２７、又は３６のアミノ酸配列を含む。特定の例では、抗ＣＤ２２ ＣＡＲは、配列番号６１のアミノ酸配列を含み得る。

加えて、本開示は、対象における望ましくない細胞を排除するための方法であって、その排除を必要とする対象に、本明細書に開示されるものとして、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ、若しくは抗ＣＤ１９／ＣＤ２２ ＣＡＲを発現する、有効量の本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞、又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を特徴とする。いくつかの場合では、望ましくない細胞は、がん細胞である。

いくつかの実施形態では、対象は、ヒトがん患者である。例えば、対象は、ＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋がん細胞を含むヒトがん患者であり得る。いくつかの場合では、ヒトがん患者は、造血悪性腫瘍、例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍又はＢ細胞悪性腫瘍を有し得る。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明から、並びに添付の特許請求の範囲からも明らかであろう。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様を更に実証するために含まれており、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによってよりよく理解することができる。

ｑＦＡＣＳによる、Ｋ５６２細胞、Ｒａｊｉ細胞、及びＮａｌｍ６細胞上の組換え又は内因性ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はそれら両方の表面発現の定量化を示す図である。 ｓｃＦｖ抗体及び二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するための発現カセットの概略設計を示す図を含む。図２Ａは、二重特異性抗体の例示的な設計を示す図である。図２Ｂは、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の例示的な設計を示す図である。 Ｋ５６２細胞（ＣＤ１９^－及びＣＤ２２^－）、ＣＤ１９を発現するように操作されたＫ５６２細胞（ＣＤ１９ Ｋ５６２）、ＣＤ２２を発現するように操作されたＫ５６２細胞（ＣＤ２２ Ｋ５６２）、ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方を発現するように操作されたＫ５６２細胞（ＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２）、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９^＋及びＣＤ２２^＋）、並びにＮａｌｍ６細胞（ＣＤ１９^＋及びＣＤ２２^＋）を含む、ＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋細胞に示される様々な二重特異性抗体の結合活性を示す図である。 蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＥＧＦＲ抗体（ＥＧＦＲは、二重特異性ＣＡＲと共発現される）又は蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ＣＤ２２－Ｆｃ融合ポリペプチドによって検出される免疫細胞における、例示的な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＥＰＣ－００１－１９の発現を示す写真を含む。図４Ａ：抗ＥＧＦＲ－ＡＦ６４７によって検出された。図４Ｂ：抗ヒトＣＤ２２－ＡＦ６４７によって検出された。 抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を示す図を含む。図５Ａ：殺傷のパーセンテージ（Ｅ：Ｔ＝１：１）。左パネル：ＥＰＣ－００１－１１、中央パネル：ＥＰＣ－００１－１２、右パネル：ＥＰＣ－００１－１３。図５Ｂ：殺傷のパーセンテージ（Ｅ：Ｔ＝１：１）。左パネル：ＥＰＣ－００１－１４、中央パネル：ＥＰＣ－００１－１５、右パネル：ＥＰＣ－００１－１６。図５Ｃ：インターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌（Ｅ：Ｔ＝１：１）。左パネル：ＥＰＣ－００１－１１、中央パネル：ＥＰＣ－００１－１２、右パネル：ＥＰＣ－００１－１３。図５Ｄ：インターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌（Ｅ：Ｔ＝１：１）。）。左パネル：ＥＰＣ－００１－１４、中央パネル：ＥＰＣ－００１－１５、右パネル：ＥＰＣ－００１－１６。 様々なエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で、標的細胞に対する例示的な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のＣＴＬ活性を示す図を含む。図６Ａ：示される種々のＥ：Ｔ比で、Ｋ５６２細胞、ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞、ＣＤ１９ Ｋ５６２細胞、及びＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞に対するドナー１のＰＢＭＣから調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的な細胞溶解のレベルを示す図。図６Ｂ：示される種々のＥ：Ｔ比で、Ｋ５６２細胞、ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞、ＣＤ１９ Ｋ５６２細胞、及びＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞に対するドナー２及びドナー３のＰＢＭＣから調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＴＬ活性を示す図。図６Ｃ：示される種々のＥ：Ｔ比で、Ｋ５６２細胞、ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞、ＣＤ１９ Ｋ５６２細胞、及びＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞に対するドナー２及びドナー３のＰＢＭＣから調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の共培養におけるＩＦＮγレベル示す図。 示される種々のＥ：Ｔ比で、Ｋ５６２細胞、ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞、ＣＤ１９ Ｋ５６２細胞、及びＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞に対する、様々な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ又は抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２単一特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のＣＴＬ時間経過を示す図を含む。 ＣＡＲ構築物中の抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２結合部分を接続する種々のリンカーを有する、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のＣＴＬ活性を示す図を含む。 標的細胞との係合時のＣＡＲ－Ｔ細胞増殖を示す図を含む（Ｅ：Ｔ＝１：１）。 複数ラウンドの標的細胞チャレンジ時のＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ持続性を示す図を含む。図１０Ａ：殺傷のパーセンテージ（Ｅ：Ｔ＝１：１）。左パネル：４８時間での標的細胞チャレンジ１、中央パネル：１２０時間での標的細胞再チャレンジ２、右パネル：１９２時間での標的細胞再チャレンジ３。図１０Ｂ：ＩＦＮγ分泌（Ｅ：Ｔ＝１：１）。左パネル：４８時間での標的細胞チャレンジ１、中央パネル：１２０時間での標的細胞再チャレンジ２、右パネル：１９２時間での標的細胞再チャレンジ３。 マウスがんモデルにおいて、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビボ抗腫瘍効果を示す。図１１Ａ：対照マウス（未処置）及び０．１２５×１０^６及び０．２５×１０^６個の細胞で、ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスにおけるがん細胞ルシフェラーゼを示す画像。図１１Ｂ：処置経過にわたる腫瘍細胞におけるルシフェラーゼの定量化によるＣＡＲ－Ｔ細胞で処置されたマウスの腫瘍増殖の阻害を示す図。図１１Ｃ～１１Ｄ：処置後のそれぞれ１４日目及び３３日目の腫瘍細胞ルシフェラーゼ定量化を示す図。図１１Ｅ：対照マウス及びＣＡＲ－Ｔ細胞で処置されたマウスの生存曲線。 インビボでのＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖、表現型、及び持続性を示す図を含む。図１２Ａ：処置後１０日目、１９日目、及び３３日目のＣＡＲ－Ｔ細胞数及び表現型を示す図。上部パネル：０．１２５×１０^６個のＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された群２のマウス、底部パネル：０．２５×１０^６個のＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された群３のマウス。図１２Ｂ～１２Ｃ：それぞれ、群２及び群３のマウスにおけるＴ細胞の亜型の３３日目／１９日目の比率。図１２Ｄ～図１２Ｅ：それぞれ、群２及び群３のマウスの３３日目の脾臓における細胞数。 抗ＣＤ１９又はＣＤ２２ ｓｃＦｖ－ＦｃのＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す。図１３Ａ：抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ、抗１９ ｓｃＦｖ－Ｆｃ、及び抗ＣＤ１９／ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－ＦｃのＣＤ１９への結合。図１３Ｂ：抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ、抗１９ ｓｃＦｖ－Ｆｃ、及び抗ＣＤ１９／ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－ＦｃのＣＤ２２への結合。 ＥＰＣ－００１－０２３形質導入Ｔ細胞の酸素消費量を示す。図１４Ａ：５日目のＥＰＣ－００１－０２３ ＣＡＲ Ｔ細胞における酸素消費量。図１４Ｂ：１１日目のＥＰＣ－００１－０２３ ＣＡＲ Ｔ細胞における酸素消費量。 ＣＤ１９及びＣＤ２２ノックアウト細胞及び親Ｒａｊｉ細胞におけるＣＤ１９及びＣＤ２２タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。 表面受容体発現の定量的ＦＡＣＳ分析を示す。図１６Ａ：示される細胞株におけるＣＤ１９表面受容体数。図１６Ｂ：示される細胞株におけるＣＤ２２表面受容体数。 親及びノックアウトＲａｊｉ細胞を移植された動物モデルにおけるＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果を示す。 ルシフェラーゼ生体発光によって決定される腫瘍担持の定量的評価を示す。図１８Ａ：親Ｒａｊｉ細胞におけるルシフェラーゼシグナル。図１８Ｂ：ＣＤ２２ノックアウトＲａｊｉ細胞におけるルシフェラーゼシグナル。図１８Ｃ：ＣＤ１９ノックアウトＲａｊｉ細胞におけるルシフェラーゼシグナル。 ３６日目に収集されたＰＢＭＣ及び脾臓試料において実施されたＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型分析を示す。図１９Ａ：ＰＢＭＣにおけるＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞の表現型分析。図１９Ｂ：脾臓におけるＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞の表現型分析。 ３６日目に収集されたＰＢＭＣ及び脾臓試料において実施されたＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型分析を示す。図２０Ａ：ＰＢＭＣにおけるＣＤ３＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞数。図２０Ｂ：ＰＢＭＣにおけるＰＤ１＋、Ｔｉｍ３－ＣＤ３＋ＣＡＲ＋発現の量。図２０Ｃ：脾臓におけるＰＤ１＋、Ｔｉｍ３－ＣＤ３＋ＣＡＲ＋発現の量。 チサゲンレクロイセル（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）対照と比較したインビトロでのＥＰＣ－００１－２３二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖及び活性化を示す図を含む。図２１Ａ：ＣＡＲ＋Ｔ細胞数によって示されるＴ細胞増殖、図２１Ｂ：７２時間でのグランザイムＢ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞によって示されるＴ細胞活性化。図２１Ｃ：ＣＡＲ－Ｔ細胞傷害性。 チサゲンレクロイセル対照と比較した、Ｒａｊｉ細胞又はＣＤ２２ ＫＯ Ｒａｊｉ細胞を移植されたマウスにおけるＥＰＣ－００１－２３二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ細胞傷害性を示す図を含む。図２２Ａ：示されＣＡＲ－Ｔ細胞で処置されたマウスにおける腫瘍画像化を示す写真。図２２Ｂ：インビボでのＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び持続性を示す図。 チサゲンレクロイセル対照と比較した、Ｒａｊｉ細胞又はＣＤ１９ ＫＯ Ｒａｊｉ細胞を移植されたマウスにおけるＥＰＣ－００１－２３二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ細胞傷害性を示す図を含む。図２３Ａ：示されＣＡＲ－Ｔ細胞で処置されたマウスにおける腫瘍画像化を示す写真。図２３Ｂ：インビボでのＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び持続性を示す図。

Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９は、主にＢ系統細胞及び濾胞樹状細胞上に発現される免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ１９は、細胞質シグナル伝達タンパク質を動員するためのアダプタータンパク質として、及び（ＣＤ１９／ＣＤ２１複合体を介して）Ｂ細胞受容体によって企てられるシグナル伝達経路の閾値を減少させるための調節因子として機能することが報告されている。

分化のクラスター２２（ＣＤ２２）は、レクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーのメンバーである。この分子は、未成熟Ｂ細胞に対して、成熟Ｂ細胞の表面上で高レベルで発現する。Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達の阻害性受容体として、免疫系の過剰活性化の防止において調節的役割を果たす。

ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方は、白血病などのある特定の疾患の治療のための有望な標的として確立されている。しかしながら、ＣＤ１９のみ又はＣＤ２２のみを標的とする治療の有効性は、例えば、腫瘍抗原回避による影響を受ける場合があり、治療の有効性の低下をもたらす。

本明細書では、ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方に結合することができる二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、並びにかかる二重特異性ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞が提供される。本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは、表面発現ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方に対して優れた結合活性、並びに優れた細胞傷害性Ｔリンパ球媒介性細胞傷害性を示した。更に、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは、マウスモデルで観察されるように、優れたインビボ抗腫瘍活性を示した。更に、二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９／ＣＤ２２二重陽性、又は２つの標的抗原のうちの１つのみを発現するいずれかのがん細胞を殺傷するのに有効であることが示され、二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＤ１９回避又はＣＤ２２回避のいずれかの状況において治療有効性を維持することを示した。

したがって、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞は、ＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^＋、ＣＤ１９^－／ＣＤ２２^＋、又はＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^－疾患細胞（例えば、がん細胞）を含む疾患の治療において、及び単一特異性ＣＡＲ－Ｔ療法又は標的化された療法に関連する腫瘍抗原回避などの問題への対処において、優れた治療効果を発揮することが期待される。ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性タンデムＣＡＲは、二価の標的係合を有し、したがって、ＣＤ１９及びＣＤ２２標的をロックし、標的の回避を防止又は遅延させ、潜在的に用量を低くすることができる。加えて、各ＣＤ１９又はＣＤ２２結合ドメインは、いずれかの標的が回避した場合に、独立して、ＣＤ１９又はＣＤ２２発現細胞に係合し、がん細胞死を媒介することができる。

したがって、本開示は、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ、それをコードする核酸、二重特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージ）などの宿主細胞、並びにＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋疾患細胞に関連する疾患の治療におけるかかる免疫細胞の治療的使用を特徴とする。

Ｉ．キメラ抗原受容体
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、望ましくない細胞によって発現される抗原、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（例えば、ＣＤ１９又はＣＤ２２）に結合することができる人工免疫細胞受容体を指す。概して、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、標的抗原に特異的な抗体に由来する単鎖可変断片又はｓｃＦｖ）と、共刺激ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む融合ポリペプチドを含み得る。いくつかの場合では、融合ポリペプチドは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端に位置するヒンジ及び膜貫通ドメインを更に含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、Ｔ細胞受容体である。他の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＮＫ細胞受容体であり得る。

典型的な抗体分子は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含み、それらは通常、抗原結合に関与する。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として知られるより保存された領域が点在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）としても知られる超可変領域に更に細分化され得る。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、典型的には、以下の順序ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシル末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、当該技術分野で既知の方法論を使用して、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、及び／又はｃｏｎｔａｃｔ定義によって、正確に同定され得、これら全てが当該技術分野で周知である。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８、及びＡｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）を参照されたい。またｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ及びｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ）も参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体部分は、参照抗体と同じ重鎖及び／若しくは軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）又は同じＶ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ鎖を共有し得る。同じＶ_Ｈ及び／又はＶ_ＬＣＤＲを有する２つの抗体は、同じ手法によって決定された場合にそれらのＣＤＲが同一であることを意味する（例えば、当該技術分野で既知のＫａｂａｔ手法、Ｃｈｏｔｈｉａ手法、ＡｂＭ手法、Ｃｏｎｔａｃｔ手法、又はＩＭＧＴ手法。例えば、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照されたい）。かかる抗ＣＤ１９抗体は、本明細書に記載の例示的な抗体と比較して、同じＶ_Ｈ、同じＶ_Ｌ、又はそれら両方を有し得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体部分は、参照配列と比較して、ある特定のレベルの配列同一性を共有し得る。２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３のように修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを使用して決定される。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施し、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の既定パラメータを使用することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体部分は、参照抗体に対して１つ以上のアミノ酸バリエーションを有し得る。本開示において（例えば、フレームワーク領域及び／又はＣＤＲにおいて）開示されるアミノ酸残基バリエーションは、保存的アミノ酸残基置換であり得る。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷又はサイズ特性を改変させないアミノ酸置換を指す。バリアントは、かかる方法をまとめた参考文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見られるような、当業者に既知のポリペプチド配列を改変するための方法によって調製され得る。アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。

本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは各々、細胞外抗原結合ドメインに、抗ＣＤ１９部分及び抗ＣＤ２２部分を含む。

（ａ）抗ＣＤ１９結合部分
本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれか（例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）における抗ＣＤ１９結合部分は、ペプチドリンカーによって接続された抗ＣＤ１９抗体の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む融合ポリペプチドであるｓｃＦｖ形式であり得る。ｓｃＦｖ断片では、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ断片は、任意の配向にあり得る。いくつかの場合では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｌ断片と、ペプチドリンカーと、Ｖ_Ｈ断片と、を含み得る。代替的には、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｈ断片と、ペプチドリンカーと、Ｖ_Ｌ断片と、を含み得る。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖを含むＣＡＲを細胞表面に指向するためのＮ末端シグナルペプチドを更に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９結合部分は、抗ＣＤ１９抗体ＥＰＣ－００１－１に由来し得る（以下の表１を参照されたい）。表１に提供される重鎖及び軽鎖相補性決定領域は、Ｋａｂａｔ定義に基づいている。また２０２０年８月１９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４７０３５も参照されたく、その関連する開示は、主題のため及び本明細書で参照されることを目的として、参照により組み込まれる。

参照抗体に由来する抗ＣＤ１９結合部分（及び以下に開示される抗ＣＤ２２結合部分）は、参照抗体と実質的に同様の構造的及び機能的特徴を有する結合部分を指す。構造的に、結合部分は、参照抗体と同じ重鎖及び／若しくは軽鎖相補性決定領域又は同じＶ_Ｈ鎖及び／若しくはＶ_Ｌ鎖を有し得る。代替的には、結合部分は、参照抗体に対して結合親和性及び結合特異性に顕著な影響を与えることなく、フレームワーク領域のうちの１つ以上及び／又はＣＤＲのうちの１つ以上において、限定された数のアミノ酸バリエーションのみを有し得る。以下の説明を参照されたい。

いくつかの例では、抗ＣＤ１９結合部分は、上記の表１に提供される抗体ＥＰＣ－００１－１のものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。代替的には、又は加えて、抗ＣＤ１９結合部分は、上記の表１にも提供される抗体ＥＰＣ－００１－１におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有し得る。かかる抗ＣＤ１９結合部分は、ＥＰＣ－００１－１と同じＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。代替的には、抗ＣＤ１９結合部分は、ＥＰＣ－００１－１の対応するフレームワーク領域に対して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸バリエーションを含み得る。例えば、抗ＣＤ１９結合部分は、ＥＰＣ－００１－１の対応するフレームワーク領域に対して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸バリエーション（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸バリエーション）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９部分は、ＥＰＣ－００１－１のＣＤＲに対して、１つ以上のＣＤＲにおけるある特定のレベルのバリエーションを含み得る。例えば、抗ＣＤ１９部分は、ＥＰＣ－００１－１のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。代替的には、又は加えて、抗ＣＤ１９抗体は、ＥＰＣ－００１－１のＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。本明細書で使用される場合、「個別に」は、抗体の１つのＣＤＲが、参照抗体（例えば、ＥＰＣ－００１－１又は以下に開示される抗ＣＤ２２参照抗体のうちのいずれか）の対応するＣＤＲに対して示される配列同一性を共有することを意味する。「集合的に」とは、組み合わせた抗体の３つのＶ_ＨＣＤＲ又はＶ_ＬＣＤＲが、組み合わせた参照抗体の対応する３つのＶ_ＨＣＤＲ又はＶ_ＬＣＤＲに対して、示された配列同一性を共有することを意味する。

いくつかの場合では、抗ＣＤ１９部分は、ＥＰＣ－００１－１のＣＤＲのものに対して、集合的に重鎖及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上において最大１０個のアミノ酸バリエーション（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノバリエーション）を含み得る。いくつかの場合では、抗ＣＤ１９部分は、ＥＰＣ－００１－１の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上において１つ以上のアミノ酸バリエーションを含み得る。

いくつかの例では、本明細書に開示される抗ＣＤ１９部分は、配列番号９のアミノ酸配列を含み得る。代替的には、抗ＣＤ１９部分は、配列番号９と少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又はそれ以上）同一のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、本明細書に開示される抗ＣＤ１９部分は、配列番号９と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列を含み得るが、配列番号９と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ断片の逆配向を有する。

本明細書に開示される抗ＣＤ１９部分のうちのいずれか（例えば、配列番号９又は逆のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配向を有するその対応物）は、本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを構築するために使用され得る。

（ｂ）抗ＣＤ２２結合部分
本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれか（例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）における抗ＣＤ２２結合部分は、ペプチドリンカーによって接続された抗ＣＤ２２抗体の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む融合ポリペプチドであるｓｃＦｖ形式であり得る。ｓｃＦｖ断片では、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ断片は、任意の配向にあり得る。いくつかの場合では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｌ断片と、ペプチドリンカーと、Ｖ_Ｈ断片と、を含み得る。代替的には、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｈ断片と、ペプチドリンカーと、Ｖ_Ｌ断片と、を含み得る。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖを含むＣＡＲを細胞表面に指向するためのＮ末端シグナルペプチドを更に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２２結合部分は、抗ＣＤ２２抗体ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－３、又はＥＰＣ－００１－４に由来し得る（以下の表２を参照されたい）。表１に提供される重鎖及び軽鎖相補性決定領域は、Ｋａｂａｔ定義に基づいている。また２０２０年８月２１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４７４７９も参照されたく、その関連する開示は、主題のため及び本明細書で参照されることを目的として、参照により組み込まれる。

いくつかの例では、抗ＣＤ２２結合部分は、上記の表２に提供される抗体ＥＰＣ－００１－２のものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。代替的には、又は加えて、抗ＣＤ２２結合部分は、上記の表２にも提供される抗体ＥＰＣ－００１－２におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有し得る。かかる抗ＣＤ２２結合部分は、ＥＰＣ－００１－２と同じＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。代替的には、抗ＣＤ２２結合部分は、ＥＰＣ－００１－２の対応するフレームワーク領域に対して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸バリエーションを含み得る。例えば、抗ＣＤ２２結合部分は、ＥＰＣ－００１－２の対応するフレームワーク領域に対して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸バリエーション（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸バリエーション）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－２のＣＤＲに対して、１つ以上のＣＤＲにおけるある特定のレベルのバリエーションを含み得る。例えば、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－２のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。代替的には、又は加えて、抗ＣＤ２２抗体は、ＥＰＣ－００１－２のＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの場合では、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－２のＣＤＲのものに対して、集合的に重鎖及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上において最大１０個のアミノ酸バリエーション（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノバリエーション）を含み得る。いくつかの場合では、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－２の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上において１つ以上のアミノ酸バリエーションを含み得る。

いくつかの例では、本明細書に開示される抗ＣＤ２２部分は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み得る。代替的には、抗ＣＤ２２部分は、配列番号１８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又はそれ以上）同一のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、本明細書に開示される抗ＣＤ２２部分は、配列番号１８と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列を含み得るが、配列番号１８と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ断片の逆配向を有する。

いくつかの例では、抗ＣＤ２２結合部分は、上記の表２に提供される抗体ＥＰＣ－００１－３のものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。代替的には、又は加えて、抗ＣＤ２２結合部分は、上記の表２にも提供される抗体ＥＰＣ－００１－３におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有し得る。かかる抗ＣＤ２２結合部分は、ＥＰＣ－００１－３と同じＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。代替的には、抗ＣＤ２２結合部分は、ＥＰＣ－００１－３の対応するフレームワーク領域に対して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸バリエーションを含み得る。例えば、抗ＣＤ２２結合部分は、ＥＰＣ－００１－３の対応するフレームワーク領域に対して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸バリエーション（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸バリエーション）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－３のＣＤＲに対して、１つ以上のＣＤＲにおけるある特定のレベルのバリエーションを含み得る。例えば、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－３のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。代替的には、又は加えて、抗ＣＤ２２抗体は、ＥＰＣ－００１－３のＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの場合では、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－３のＣＤＲのものに対して、集合的に重鎖及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上において最大１０個のアミノ酸バリエーション（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノバリエーション）を含み得る。いくつかの場合では、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－３の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上において１つ以上のアミノ酸バリエーションを含み得る。

いくつかの例では、本明細書に開示される抗ＣＤ２２部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み得る。代替的には、抗ＣＤ２２部分は、配列番号２７と少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又はそれ以上）同一のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、本明細書に開示される抗ＣＤ２２部分は、配列番号２７と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列を含み得るが、配列番号２７と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ断片の逆配向を有する。

いくつかの例では、抗ＣＤ２２結合部分は、上記の表２に提供される抗体ＥＰＣ－００１－４のものと同じ重鎖ＣＤＲを含み得る。代替的には、又は加えて、抗ＣＤ２２結合部分は、上記の表２にも提供される抗体ＥＰＣ－００１－４におけるものと同じ軽鎖ＣＤＲを有し得る。かかる抗ＣＤ２２結合部分は、ＥＰＣ－００１－４と同じＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ鎖を含み得る。代替的には、抗ＣＤ２２結合部分は、ＥＰＣ－００１－４の対応するフレームワーク領域に対して、フレームワーク領域のうちの１つ以上にアミノ酸バリエーションを含み得る。例えば、抗ＣＤ２２結合部分は、ＥＰＣ－００１－４の対応するフレームワーク領域に対して、１つ以上のフレームワーク領域に最大１５個のアミノ酸バリエーション（例えば、最大１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸バリエーション）を集合的に含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－４のＣＤＲに対して、１つ以上のＣＤＲにおけるある特定のレベルのバリエーションを含み得る。例えば、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－４のＶ_ＨＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。代替的には、又は加えて、抗ＣＤ２２抗体は、ＥＰＣ－００１－４のＶ_ＬＣＤＲと比較して、個別に又は集合的に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）の配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。

いくつかの場合では、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－４のＣＤＲのものに対して、集合的に重鎖及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上において最大１０個のアミノ酸バリエーション（例えば、最大９、８、７．６、５、４、３、２、又は１個のアミノバリエーション）を含み得る。いくつかの場合では、抗ＣＤ２２部分は、ＥＰＣ－００１－４の重鎖ＣＤＲ３と同じ重鎖ＣＤＲ３を含み得、他の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうちの１つ以上において１つ以上のアミノ酸バリエーションを含み得る。

いくつかの例では、本明細書に開示される抗ＣＤ２２部分は、配列番号３６のアミノ酸配列を含み得る。代替的には、抗ＣＤ２２部分は、配列番号３６と少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又はそれ以上）同一のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、本明細書に開示される抗ＣＤ２２部分は、配列番号３６と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列を含み得るが、配列番号３６と同じＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ断片の逆配向を有する。

本明細書に開示される抗ＣＤ２２部分のうちのいずれかは、本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを構築するために使用され得る。いくつかの例では、抗ＣＤ２２部分は、配列番号１８のアミノ酸配列、又は逆のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配向を有するその対応物を含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ２２部分は、配列番号２７のアミノ酸配列、又は逆のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配向を有するその対応物を含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ２２部分は、配列番号３６のアミノ酸配列、又は逆のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配向を有するその対応物を含み得る。

（ｃ）キメラ抗原受容体構築物の他の構成要素
本明細書に開示される細胞外抗原結合ドメインに加えて、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを含むＣＡＲのうちのいずれかは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激及び細胞質シグナル伝達ドメイン）、及び任意選択で、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、Ｎ末端シグナルペプチド、又はそれらの組み合わせを更に含み得る。いくつかの場合では、ＣＡＲは、宿主免疫細胞において自殺遺伝子（例えば、短縮型ＥＧＦＲ遺伝子）と共発現され得る。例えば、ＣＡＲコード配列及び自殺遺伝子は、２シストロン性発現カセットに構成され得、ＣＡＲコード配列及び自殺遺伝子は、自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａ）コード配列を介して連結され得る。例を以下の表３に提供する。

シグナル伝達ドメイン
抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを含む、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物のうちのいずれかは、典型的には共刺激ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインを含有する１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能（二次シグナル）などの免疫応答を誘導するために細胞内のシグナル伝達を媒介する共刺激シグナル伝達タンパク質の少なくとも断片を指す。細胞質シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の増殖及び／又は活性化をもたらす細胞シグナル伝達（一次シグナル伝達）の誘発に関与する任意のシグナル伝達ドメインであり得る。本明細書に記載の細胞質シグナル伝達ドメインは、当該技術分野で既知の、免疫細胞を完全に活性化するための共刺激又は二次シグナルを中継する共刺激シグナル伝達ドメインではない。

いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞に導入される本明細書に開示されるＣＡＲ構築物における使用のためのものである。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインは、ＮＫ細胞に導入される本明細書に開示されるＣＡＲ構築物における使用のためのものである。

いくつかの場合では、共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞応答に関与する共刺激タンパク質、例えば、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー、ＳＬＡＭファミリーのメンバー、又は任意の他の共刺激分子に由来し得る。例としては、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１（ＣＤ１１ａ）、又はＣＤ２が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン（例えば、上記の表３の配列番号４４）である。

細胞質シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）ドメインを含み得るか、又はＩＴＡＭフリーであり得る。「ＩＴＡＭ」は、本明細書で使用される場合、概して、多くの免疫細胞で発現されるシグナル伝達分子の尾部に存在する保存されたタンパク質モチーフである。例示的な細胞質シグナル伝達ドメインとしては、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号４５が挙げられる。

いくつかの場合では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＮＫ細胞応答に関与する共刺激タンパク質に由来し得る。例としては、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃＲＩγ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、又はＮＫｐ４６が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＫ細胞ＣＡＲにおける使用のための例示的な細胞質シグナル伝達ドメインとしては、ＣＤ３ζ、例えば、配列番号４５が挙げられるが、これらに限定されない。

ヒンジ及び膜貫通ドメイン
いくつかの場合では、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物（例えば、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）は、膜にまたがる疎水性αヘリックスであり得る膜貫通ドメインを含有し得る。「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは、真核細胞膜で熱力学的に安定なペプチド断片であり得る。膜貫通ドメインは、それを含有するＣＡＲの安定性を提供し得る。例示的な膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、又はＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。一例では、膜貫通ドメインは、上記の表３に示される配列番号４３を含み得る。

代替的には、又は加えて、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物はまた、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間、又は膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置され得るヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに柔軟性を提供するか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を防止するように機能し得る。ヒンジドメインは、５～２０個のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメイン又はＩｇＧヒンジであり得る。他のヒンジドメインが使用されてもよい。一例では、ヒンジドメインは、上記の表３に示される配列番号４２を含み得る。

（ｄ）抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ
いくつかの態様では、本明細書では、抗ＣＤ１９部分（例えば、本明細書に開示されるものなどの抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）と、抗ＣＤ２２部分（例えば、開示されるものなどの抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ）と、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインなどの１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインと、任意選択で、本明細書に開示されるヒンジドメイン及び膜貫通ドメインと、を含む抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲが提供される。いくつかの場合では、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは、抗ＣＤ１９部分及び抗ＣＤ２２部分の両方を含む単一のポリペプチドであり得る。他の場合では、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは、複数鎖（例えば、２鎖）分子であり得る。抗ＣＤ１９部分及び抗ＣＤ２２部分は、別個のポリペプチド上に位置され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは、ＥＰＣ－００１－１に由来する抗ＣＤ１９結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）及びＥＰＣ－００１－２に由来する抗ＣＤ２２結合部分を含み得る。他の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは、ＥＰＣ－００１－１に由来する抗ＣＤ１９結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）及びＥＰＣ－００１－３に由来する抗ＣＤ２２結合部分を含み得る。更に他の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは、ＥＰＣ－００１－１に由来する抗ＣＤ１９結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）及びＥＰＣ－００１－２－４のうちのいずれか１つに由来する抗ＣＤ２２結合部分を含み得る。

抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２抗体の様々な組み合わせを調査して、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性細胞の係合を作製する。かかる二重特異性ｓｃＦｖの多くは、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２に対する低発現レベル又は低結合活性を示した。予想外に、抗ＣＤ１９親クローンＥＰＣ－００１－１及び抗ＣＤ２２親クローン、ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－３、及びＥＰＣ－００１－４のうちの３つから作製された抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖは、所望のレベルの二重特異性ｓｃＦｖ発現を示し、モノクローナル抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖと比較して、強力で特異的な標的細胞係合を維持したことが見出された。

ＥＰＣ－００１－１に由来する抗ＣＤ１９結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）は、上で開示されたＥＰＣ－００１－１に関連する抗ＣＤ１９部分のうちのいずれかであり得る。いくつかの場合では、ＥＰＣ－００１－１と同じ重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲを含み得る。特定の例では、ｓｃＦｖは、ＥＰＣ－００１－１と同じＶ_Ｈ及び／又は同じＶ_Ｌを含み得る。いくつかの場合では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｌ断片（例えば、配列番号８）と、ペプチドリンカー（例えば、配列番号３８～４１のうちのいずれか１つ）と、Ｖ_Ｈ断片（例えば、配列番号４）と、を含み得る。代替的には、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｈ断片（例えば、配列番号４）と、ペプチドリンカー（例えば、配列番号３８～４１のうちのいずれか１つ）と、Ｖ_Ｌ断片（例えば、配列番号８）と、を含み得る。一特定の例では、抗ＣＤ１９部分は、配列番号９を含み得る。

ＥＰＣ－００１－２に由来する抗ＣＤ２２結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）は、上で開示されたＥＰＣ－００１－２に関連する抗ＣＤ２２部分のうちのいずれかであり得る。いくつかの場合では、ＥＰＣ－００１－２と同じ重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲを含む。特定の例では、ｓｃＦｖは、ＥＰＣ－００１－２と同じＶ_Ｈ及び／又は同じＶ_Ｌを含み得る。いくつかの場合では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｌ断片（例えば、配列番号１７）と、ペプチドリンカー（例えば、配列番号３８～４１のうちのいずれか１つ）と、Ｖ_Ｈ断片（例えば、配列番号１３）と、を含み得る。代替的には、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｈ断片（例えば、配列番号１４）と、ペプチドリンカー（例えば、配列番号３８～４１のうちのいずれか１つ）と、Ｖ_Ｌ断片（例えば、配列番号１７）と、を含み得る。一特定の例では、抗ＣＤ１９部分は、配列番号１８を含み得る。

ＥＰＣ－００１－３に由来する抗ＣＤ２２結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）は、上で開示されたＥＰＣ－００１－３に関連する抗ＣＤ２２部分のうちのいずれかであり得る。いくつかの場合では、ＥＰＣ－００１－３と同じ重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲを含む。特定の例では、ｓｃＦｖは、ＥＰＣ－００１－３と同じＶ_Ｈ及び／又は同じＶ_Ｌを含み得る。いくつかの場合では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｌ断片（例えば、配列番号２６）と、ペプチドリンカー（例えば、配列番号３８～４１のうちのいずれか１つ）と、Ｖ_Ｈ断片（例えば、配列番号２２）と、を含み得る。代替的には、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｈ断片（例えば、配列番号２２）と、ペプチドリンカー（例えば、配列番号３８～４１のうちのいずれか１つ）と、Ｖ_Ｌ断片（例えば、配列番号２６）と、を含み得る。一特定の例では、抗ＣＤ１９部分は、配列番号２７を含み得る。

ＥＰＣ－００１－４に由来する抗ＣＤ２２結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）は、上で開示されたＥＰＣ－００１－３に関連する抗ＣＤ２２部分のうちのいずれかであり得る。いくつかの場合では、ＥＰＣ－００１－４と同じ重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲを含む。特定の例では、ｓｃＦｖは、ＥＰＣ－００１－４と同じＶ_Ｈ及び／又は同じＶ_Ｌを含み得る。いくつかの場合では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｌ断片（例えば、配列番号３５）と、ペプチドリンカー（例えば、配列番号３８～４１のうちのいずれか１つ）と、Ｖ_Ｈ断片（例えば、配列番号３１）と、を含み得る。代替的には、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｈ断片（例えば、配列番号３１）と、ペプチドリンカー（例えば、配列番号３８～４１のうちのいずれか１つ）と、Ｖ_Ｌ断片（例えば、配列番号３５）と、を含み得る。一特定の例では、抗ＣＤ１９部分は、配列番号３６を含み得る。

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは、本明細書に開示される抗ＣＤ１９部分及び抗ＣＤ２２部分の両方を含む融合ポリペプチドを含み得、これは、可撓性ペプチドリンカー、例えば、配列番号３８～４１のうちのいずれか１つを介して接続され得る。いくつかの場合では、リンカーは、短いＧ／Ｓリッチリンカー（例えば、最大５個のアミノ酸残基を有する）、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号３８）であり得る。抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２部分は、図２Ａに示される任意の配向のものであり得る。例えば、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ１９部分（例えば、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）と、ペプチドリンカーと、抗ＣＤ２２部分（例えば、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ）と、を含み得る。代替的には、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＣＤ２２部分（例えば、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ）と、ペプチドリンカーと、抗ＣＤ１９部分（例えば、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）と、を含み得る。

抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２部分を含む融合ポリペプチドのうちのいずれかは、共刺激シグナル伝達ドメイン及び本明細書に開示されるものなどの細胞質シグナル伝達ドメインを更に含み得る。任意選択で、融合ポリペプチドは、本明細書にも開示されるヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み得る。二重特異性ＣＡＲの例示的な設計の概略図を図３に提供する。いくつかの例では、二重特異性ＣＡＲは、図３に示されるように、自己切断ペプチドリンカーを介して、自殺遺伝子（例えば、短縮型ＥＧＦＲ）を有する多シストロン性発現カセットに含まれ得る。

例示的な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖ及びＣＡＲを以下の表４に提供する。

また、表１に提供される親抗ＣＤ１９抗体に由来する抗ＣＤ１９結合部分及び本明細書の表２に提供される親抗ＣＤ２２抗体に由来する抗ＣＤ２２結合部分を含む二重特異性抗ＣＤ１９／ＣＤ２２抗体もまた本開示の範囲内である。かかる二重特異性抗体は、当該技術分野で既知の任意の好適な形態であり得る。例えば、二重特異性抗体は、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖをタンデム反復で含み得る（例えば、本明細書に開示される二重特異性ＣＡＲのうちのいずれかにおける二重特異性抗原結合部分）。いくつかの場合では、かかる二重特異性抗体は、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合ポリペプチドを形成するようにＦｃ断片を更に含み得る。

（ｅ）抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２ ＣＡＲ
また、本明細書に開示される抗ＣＤ１９結合部分及び抗ＣＤ２２結合部分のうちのいずれかを含む抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２ ＣＡＲも範囲内である。

いくつかの態様では、本明細書では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、それをコードする核酸、及びそれを発現する宿主細胞が提供される。抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、（ａ）抗ＣＤ１９結合部分のうちのいずれかであり得る細胞外結合ドメイン、例えば、ＥＰＣ－００１－１に由来する抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、（ｂ）本明細書に開示されるものなどの共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｃ）本明細書に開示されるものなどの細胞質シグナル伝達ドメインと、を含み得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端に位置するヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み得る。一例では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、本明細書では、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ、それをコードする核酸、及びそれを発現する宿主細胞が提供される。いくつかの例では、抗ＣＤ２２ ＣＡＲは、（ａ）抗ＣＤ２２結合部分のうちのいずれかであり得る細胞外結合ドメイン、例えば、ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－３、又はＥＰＣ－００１－４に由来する抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、（ｂ）本明細書に開示されるものなどの共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｃ）本明細書に開示されるものなどの細胞質シグナル伝達ドメインと、を含み得る。抗ＣＤ２２ ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端に位置するヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み得る。一例では、抗ＣＤ２２ ＣＡＲは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。

ＩＩ．ＣＡＲ発現免疫細胞
いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に開示される抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、又は抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ構築物のうちのいずれかの表面発現を有するＴ細胞ＮＫ細胞又はマクロファージなどの遺伝子操作された免疫細胞が提供される。いくつかの場合では、遺伝子操作された免疫細胞は、上記の表４に提供される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか（例えば、配列番号６３）を発現するＴ細胞である。

本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫細胞のうちのいずれかは、ＣＡＲ発現細胞の生体活性及び／又は持続性を増強し、それによって全体的な治療効果を増強するように、ＣＡＲ発現細胞を再プログラムする追加の機序で操作され得る。例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞は、１つ以上の免疫調節遺伝子、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤遺伝子、又はそれらの組み合わせをノックインするように更に操作され得る。代替的には、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫細胞は、１つ以上の阻害遺伝子をノックダウン又はノックアウトするように更に操作され得る。

（ａ）ＣＡＲ発現免疫細胞の調製
本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞は、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物のうちのいずれか（例えば、表４に提供されるものなどの本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）をコードする発現カセットを好適な免疫細胞に導入し、細胞表面上にＣＡＲを発現する得られた操作された免疫細胞を収集することによって調製され得る。

出発親細胞としての免疫細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、又は脾臓、リンパ節、胸腺、幹細胞、若しくは腫瘍組織などの組織などの任意の供給源から得られ得る。所望の型の宿主細胞を得るのに好適な供給源は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、免疫細胞の集団は、ＰＢＭＣに由来する。所望の型の宿主細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又はそれらの組み合わせ）は、細胞を刺激分子とともに共インキュベーションすることによって得られた細胞の集団内で増殖され得る。非限定的な例として、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞の増殖のために使用され得る。いくつかの実施形態では、特定の型の細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージ）は、免疫細胞集団から濃縮され得る。かかる濃縮された細胞亜集団は、ＣＡＲコード発現カセットの導入のために遺伝子操作される前に、インビトロで増殖及び／又は活性化され得る。

本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのうちのいずれか（例えば、表４に提供されるものなどの本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）を発現する免疫細胞を構築するために、ＣＡＲポリペプチドの安定的又は一過性発現のための発現ベクターは、従来の方法を介して作製され、免疫宿主細胞に導入され得る。例えば、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を、好適なプロモーターに作動可能に連結したウイルスベクターなどの好適な発現ベクターにクローン化し得る。本開示の有用なベクターの非限定的な例としては、例えば、ガンマレトロウイルスベクターを含むレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、及びレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。核酸及びベクターを、好適な条件下で、制限酵素と接触させて、互いに対になり得、リガーゼと結合し得る各分子上に相補的末端を作成し得る。代替的には、合成核酸リンカーをＣＡＲポリペプチドをコードする核酸の末端にライゲーションし得る。合成リンカーは、ベクターにおける特定の制限部位に対応する核酸配列を含有し得る。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、ＣＡＲポリペプチドの発現のための宿主細胞の型に依存するが、真核細胞における組み込み及び複製に好適である必要がある。ＣＡＲをコードするかかる核酸及びそれを含む発現ベクターのうちのいずれかもまた、本開示の範囲内である。

本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドの発現のために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ－ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ＬＴＲなどのウイルスＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、又は単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターを含むがこれらに限定されない、様々なプロモーターを使用し得る。ＣＡＲポリペプチドの発現のための追加のプロモーターとしては、免疫細胞において任意の構成的に活性なプロモーターが挙げられる。代替的には、その発現が免疫細胞内で調節され得るように、任意の調節可能なプロモーターを使用し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｐＥＦ１αプロモーターであり得る。

加えて、ベクターは、例えば、以下のうちのいくつか又は全てを含有し得る：宿主細胞における安定な又は一過性のトランスフェクタントを選択するためのネオマイシン遺伝子又はカナマイシン遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡの安定性のためのＳＶ４０由来の転写終結及びＲＮＡプロセシングシグナル；ＳＶ４０ポリオマウイルス複製起点及び適切なエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、多用途の複数のクローニング部位；センス及びアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７及びＳＰ６ ＲＮＡプロモーター；ベクターを担持する細胞の死亡させる原因を誘発する場合の「自殺スイッチ」又は「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ又はｉＣａｓｐ９などの誘導性カスパーゼ）、並びにＣＡＲポリペプチドの発現を評価するためのレポーター遺伝子。

一特定の実施形態では、かかるベクターはまた、自殺遺伝子も含み得る。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、その遺伝子が発現される細胞に対して薬剤、例えば、薬物に対する感受性を付与し、その細胞がその薬剤と接触するか、又はそれに曝露されるときにその細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照されたい）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ、及びカスパーゼ８などのカスパーゼを含む。特定の例では、自殺遺伝子は、短縮型ＥＧＦＲ、例えば、上記の表３及び表４に提供される短縮型ＥＧＦＲをコードし得る。

本明細書に開示される核酸は、２つのコード配列を含み得、一方は、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物のうちのいずれか（例えば、表４に提供されるものなどの本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）についてであり、他方は、自殺遺伝子産物についてである。２つのコード配列は、２つのコード配列によってコードされるポリペプチドが独立した（かつ物理的に別個の）ポリペプチドとして発現され得るように構成され得る。この目的を達成するために、本明細書に記載の核酸は、第１及び第２のコード配列の間に位置する第３のヌクレオチド配列を含有し得る。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、リボソームスキップ部位をコードし得る。リボソームスキップ部位は、正常なペプチド結合形成を損なう配列である。この機序は、１つのメッセンジャーＲＮＡからの追加のオープンリーディングフレームの翻訳をもたらす。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、又はＦ２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドをコードし得る（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（４）：ｅ１８５５６を参照されたい）。図３も参照されたい。

本明細書に記載のＡＣＴＲポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターのうちのいずれもまた、本開示の範囲内である。

かかるベクター、又はそれに含有されるＣＡＲポリペプチドをコードする配列は、任意の好適な方法によって、宿主免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージ）などの宿主細胞内に送達され得る。ベクターを免疫細胞に送達する方法は、当該技術分野で周知であり、ＤＮＡエレクトロポレーション、ＲＮＡエレクトロポレーション、リポソームなどの試薬を使用するトランスフェクション、又はウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入などのレトロウイルス形質導入）を含み得る。

本明細書で提供されるＣＡＲポリペプチドのうちのいずれか（例えば、表４に提供されるものなどの本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）をコードするベクターを宿主細胞内に導入した後、細胞は、ＣＡＲポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養され得る。ＣＡＲポリペプチドの発現が調節可能なプロモーターによって調節される場合、宿主細胞は、調節可能なプロモーターが活性化される条件下で培養され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり、免疫細胞は、誘導分子の存在下で、又は誘導分子が産生される条件下で培養される。ＣＡＲポリペプチドが発現されるかどうかの決定は、当業者には明らかであり、任意の既知の方法、例えば、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によるＣＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出、又はウエスタンブロッティング、蛍光顕微鏡法、及びフローサイトメトリーを含む方法によるＣＡＲポリペプチドタンパク質の検出によって評価され得る。代替的には、機能性ＣＡＲの発現は、標的抗原、例えば、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を発現する細胞に対する結合活性及び／又はＣＴＬ活性によって決定され得る。

本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかを発現する宿主細胞を調製するための方法はまた、宿主細胞をエクスビボで活性化することを含み得る。宿主細胞を活性化することは、エフェクター機能を実施することができ得る活性化状態に宿主細胞を刺激することを意味する。宿主細胞を活性化する方法は、ＣＡＲポリペプチドの発現に使用される宿主細胞の型に依存するであろう。例えば、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２、及び／又はフィトヘモアグルチニンを含むがこれらに限定されない、１つ以上の分子の存在下で、エクスビボで活性化され得る。他の例では、ＮＫ細胞は、４－１ＢＢリガンド、抗４－１ＢＢ抗体、ＩＬ－１５、抗ＩＬ－１５受容体抗体、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－２１、及び／又はＫ５６２細胞などの１つ以上の分子の存在下で、エクスビボで活性化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかを発現する宿主細胞（ＣＡＲ発現細胞）は、対象への投与前にエクスビボで活性化される。宿主細胞が活性化されるかどうかの決定は、当業者には明らかであり、細胞の活性化、サイトカインの発現又は分泌、及び細胞形態に関連する１つ以上の細胞表面マーカーの発現を評価することを含み得る。

本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかを発現する宿主細胞を調製するための方法は、宿主細胞をエクスビボで増殖させることを含み得る。宿主細胞を増殖させることは、ＣＡＲポリペプチドを発現する細胞の数の増加、例えば、宿主細胞が増殖することを可能にするか、又は宿主細胞が増殖することを刺激することをもたらす任意の方法を含み得る。宿主細胞の増殖を刺激するための方法は、ＣＡＲポリペプチドの発現に使用される宿主細胞の型に依存し、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのうちのいずれかを発現する宿主細胞は、対象への投与前にエクスビボで増殖される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチドを発現する宿主細胞は、細胞を対象に投与する前に、エクスビボで増殖及び活性化される。宿主細胞の活性化及び増殖を使用して、ウイルスベクターのゲノムへの組み込み及び本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にし得る。ｍＲＮＡエレクトロポレーションが使用される場合、エレクトロポレーションは、活性化された細胞に対して実施される場合により効果的である場合があるが、活性化及び／又は増幅を必要としない場合がある。

いくつかの場合では、ＣＡＲポリペプチドは、好適な宿主細胞において一過性に発現される（例えば、３～５日間）。一過性発現は、潜在的な毒性が存在する場合に有利である場合があり、可能性のある副作用についての臨床試験の初期段階において有用である必要がある。

（ｂ）医薬組成物
本明細書に開示されるＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞のうちのいずれか（例えば、上記の表４に提供されるものなどの抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）を薬学的に許容される担体と混合して医薬組成物を形成し得、これもまた、本開示の範囲内である。

「薬学的に許容される」という句は、本開示の組成物に関連して使用される場合、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に生理学的に許容され、典型的に有害な反応を産生しないそのような組成物の分子実体及び他の成分を指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、連邦又は州政府の規制機関によって承認されているか、又は哺乳動物、特にヒトにおける使用についてＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ若しくは他の一般に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。「許容される」とは、担体が組成物の活性成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、又は治療用抗体）と適合であり、組成物が投与される対象に悪影響を及ぼさないことを意味する。本方法で使用される医薬組成物のうちのいずれも、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を含み得る。

緩衝剤を含む薬学的に許容される担体は、当該技術分野で周知であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物；金属錯体；並びに／又は非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０^ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。

追加の有用な薬剤の例については、また、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｐ Ｄ Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ Ｎ．Ｊ．、Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ．、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ＮＹ、Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ Ｎ．Ｊ．を参照されたい。

ＩＶ．治療用途
本明細書に開示されるＣＡＲ（例えば、上記の表４に提供されるものなどの抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）を発現する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージ）のうちのいずれかを、治療目的のために、例えば、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を発現する望ましくない細胞を排除するために使用し得る。いくつかの例では、遺伝子操作された免疫細胞は、上記の表４に提供されるものなどの抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれかを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞である。

本明細書に記載の方法を実施するために、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか（例えば、上記の表４に提供されるものなどの抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）を発現する有効量の免疫細胞（ＮＫ細胞、Ｔリンパ球、又はマクロファージ）、又はその医薬組成物は、静脈内投与などの好適な経路を介して、治療を必要とする対象に投与され得る。本明細書で使用される場合、有効量は、投与時に対象に治療効果を与えるそれぞれの薬剤（例えば、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞、Ｔリンパ球又はマクロファージ）の量を指す。ある量の本明細書に記載の細胞又は組成物が治療効果を達成したかどうかの決定は、当業者には明らかであろう。有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ、性別、性、及び体重を含む個々の患者のパラメータ、治療の期間、併用療法の性質（もしあれば）、特定の投与経路、並びに医療従事者の知識及び専門知識内の同様の因子に応じて変化する。いくつかの実施形態では、有効量は、対象における任意の疾患又は障害の症状を緩和、軽減、改善、向上、低減するか、又はその進行を遅延する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、ヒトがん患者である。

本明細書で使用される場合、用量又は量に適用される「治療的に有効」という用語は、それを必要とする対象に投与すると所望の活性をもたらすのに十分な化合物又は医薬組成物のその量を指す。活性成分の組み合わせが投与される場合、組み合わせの有効量は、個別に投与された場合に有効であったであろう各成分の量を含んでも、含まなくてもよいことに留意されたい。本開示の文脈内で、「治療的に有効」という用語は、本開示の方法によって治療される障害の少なくとも１つの症状の発現を遅延させるか、進行を停止させるか、軽減するか、又は緩和するのに十分な化合物又は医薬組成物のその量を指す。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を発現する疾患細胞を排除又は阻害するために使用され得る。したがって、本明細書に開示される免疫細胞のうちのいずれかは、ＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋がん細胞などのＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋疾患細胞に関連する疾患を治療するために使用され得る。本明細書に開示される方法は、ＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋がん細胞を含むがん、例えば、造血がんを治療するために使用され得る。ある特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍であり得る。

いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に開示されるＣＡＲ（例えば、上記の表４に提供されるものなどの抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれか）を発現する遺伝子操作された免疫細胞のうちのいずれかを、好適な経路、例えば、静脈内注入を介して、治療を必要とする対象に与え得る。対象は、ＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋がん細胞などのＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋疾患細胞に関連する疾患を有するヒト患者であり得る。いくつかの場合では、ヒト患者は、ＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋がん細胞を含むがんを有する。いくつかの場合では、ヒト患者は、造血がんを有し得る。他の場合では、ヒト患者は、固形腫瘍を有し得る。

いくつかの例では、ヒト患者は、ＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋疾患Ｂ細胞を含むＢ細胞悪性腫瘍を有し得る。例には、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、及び原発性眼内リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの例では、ヒト患者は、Ｔ細胞悪性腫瘍を有し得る。例には、Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸疾患関連腸管Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、又は別途指定されていない末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ、ＮＯＳ））が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療における使用のための免疫細胞（例えば、ＮＫ及び／又はＴ細胞）は、対象に自家性であり得、すなわち、免疫細胞は、治療を必要とする対象から得られ、ＣＡＲポリペプチドの発現のために遺伝子操作され、次いで同じ対象に投与され得る。一特定の実施形態では、対象への再導入の前に、自家免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、又はマクロファージ）は、エクスビボで活性化及び／又は増殖される。対象への自家細胞の投与は、非自家細胞の投与と比較して宿主細胞の拒絶反応の低減をもたらし得る。

代替的には、遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージ）は、同種異系細胞であり得、すなわち、細胞は、第１の対象から得られ、ＣＡＲポリペプチドの発現のために遺伝子操作され、第１の対象とは異なるが同じ種の第２の対象に投与される。例えば、同種異系免疫細胞は、ヒトドナーに由来し、ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与され得る。特定の実施形態では、Ｔリンパ球は、内因性Ｔ細胞受容体の発現が阻害又は排除された同種異系Ｔリンパ球である。一特定の実施形態では、対象に導入される前に、同種異系Ｔリンパ球は、エクスビボで活性化及び／又は増殖される。Ｔリンパ球は、当該技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ－２、及び／又はフィトヘモアグルチニンの存在下で活性化され得る。

ＮＫ細胞は、当該技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ－１５タンパク質、ＩＬ－１５受容体抗体、ＩＬ－２タンパク質、ＩＬ－１２タンパク質、ＩＬ－２１タンパク質、及びＫ５６２細胞株からなる群から選択される１つ以上の薬剤の存在下で活性化され得る。例えば、ＮＫ細胞を増殖するための有用な方法の説明については、米国特許第７，４３５，５９６号及び同第８，０２６，０９７号を参照されたい。例えば、本開示の方法において使用されるＮＫ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ及び／又はＩＩ分子を欠くか、又は発現が不十分であり、膜結合ＩＬ－１５及び４－１ＢＢリガンド（ＣＤＩ３７Ｌ）を発現するように遺伝子改変された細胞への曝露によって優先的に増殖され得る。かかる細胞株には、Ｋ５６２［ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２４３、Ｌｏｚｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ４５（３）：３２１－３３４（１９７５）、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １８：４２１－４３１（１９７６）］、及びウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ（Ｆｅｈｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０（３－４）：５０３－５３４（２００１）、Ｈａｒａｄａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３２（７）：６１４－６２１（２００４））、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ－ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ－６、肺小細胞がん腫細胞株Ｌｕ－１３０及びＬｕ－１３４－Ａ、神経芽腫細胞株ＮＢ１９及びＮ１３６９、精巣由来の胚性がん腫細胞株ＮＥＣ１４、子宮頸がん腫細胞株ＴＣＯ－２、並びに骨髄転移神経芽腫細胞株ＴＮＢ１［Ｈａｒａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９３：３１３－３１９（２００２）］などが含まれるが、これらに限定される必要はない。好ましくは、使用される細胞株は、Ｋ５６２及びＨＦＷＴ細胞株など、ＭＨＣＩ及びＩＩ分子の両方を欠くか、又は発現が不十分である。細胞株の代わりに固体支持体を使用してもよい。かかる支持体は、好ましくは、ＮＫ細胞に結合し、一次活性化事象及び／若しくは増殖応答を誘導することができるか、又はそのような情動を有する分子を結合することができる少なくとも１つの分子がその表面に結合されており、それによって足場として機能する必要がある。支持体は、その表面にＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ－１５タンパク質、又はＩＬ－１５受容体抗体が結合されていてもよい。好ましくは、支持体は、その表面上に結合したＩＬ－１５受容体抗体及びＣＤ１３７抗体を有する。

本開示によれば、患者は、約１０^５～１０^９個のＣＡＲ＋細胞の範囲の治療有効量の、上記の表４に列挙される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ（例えば、配列番号２３）などのＣＡＲポリペプチドを発現するＴリンパ球又はＮＫ細胞などの免疫細胞を、患者に注入することによって治療され得る。注入は、所望の応答が達成されるまで、患者が耐えることができる頻度及び回数だけ繰り返され得る。適切な注入用量及びスケジュールは、患者ごとに異なるだろうが、特定の患者について治療する医師によって決定され得る。いくつかの例では、約１０^６細胞／Ｋｇの初回用量を注入し、１０^８以上の細胞／Ｋｇに漸増し得る。

本明細書に記載の方法で使用される特定の投薬量レジメン、すなわち、用量、タイミング、及び反復は、特定の対象及びその対象の病歴に依存するだろう。使用されるＣＡＲ発現免疫細胞の適切な投薬量は、治療されるがんの種類、疾患の重症度及び経過、以前の療法、患者の臨床歴及び免疫細胞療法に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物（例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ、又は抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ）のうちのいずれかを発現する遺伝子操作された免疫細胞は、化学療法、手術、放射線、遺伝子療法などのがんの他の種類の療法と組み合わせて利用され得る。かかる療法は、本開示による免疫療法と同時に又は連続して（任意の順序で）施され得る。追加の治療薬と同時投与される場合、各薬剤の好適な治療有効投薬量は、相加作用又は相乗効果により低下される場合がある。

Ｖ．治療用途のためのキット
本開示はまた、本明細書に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ、又は抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、又はマクロファージ）の使用のためのキットも提供する。かかるキットは、薬学的に許容される担体を更に含む医薬組成物に製剤化され得る遺伝子操作された免疫細胞を含む１つ以上の容器を含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキットは、インビトロで増殖され得る遺伝子操作された免疫細胞を含む。免疫細胞は、本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれか、例えば、上記の表４に提供されるものなどの抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲのうちのいずれかを発現し得る。

いくつかの実施形態では、キットは、追加的に、本明細書に記載の方法のうちのいずれかにおける使用のための説明書を含み得る。含まれる説明書は、対象において、意図された活性、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はそれら両方を発現するがん細胞などの標的疾患細胞を排除することを達成するための本明細書に開示される遺伝子操作された免疫細胞の投与についての説明を含み得る。キットは、対象が治療を必要としているかどうかの識別に基づいて、治療に好適な対象を選択する説明を更に含み得る。

本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞の使用に関する説明書には、概して、意図される治療のための投薬量、投薬スケジュール、及び投与経路に関する情報が含まれる。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）又はサブ単位用量であり得る。本開示のキットで提供される説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書に記載された説明書である。ラベル又は添付文書は、遺伝子操作された免疫細胞が、対象におけるＣＤ１９及び／又はＣＤ２２陽性疾患細胞に関連する疾患又は障害の治療、その発病の遅延、及び／又はその緩和に使用されることを示す。

本明細書で提供されるキットは、好適なパッケージに入っている。好適なパッケージには、バイアル、ボトル、ビン、柔軟なパッケージなどが含まれるが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与デバイス、又は注入デバイスなどの特定のデバイスと組み合わせての使用のためのパッケージも企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器は無菌アクセスポートを有し得る。

キットは、任意選択で緩衝剤及び解釈情報などの追加の構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器、及び容器上又は容器に関連するラベル又は添付文書を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のキットの内容物を含む製品を提供する。

一般的技術
本開示の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用い、これらは当該技術分野の技術の範囲内である。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５＞＞、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献で詳しく説明されている。

更なる詳細なく、当業者が、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法であれ、本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的又は主題のために参照により組み込まれる。

実施例１．ＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋細胞株の生成及びその特徴付け
この実施例では、ＣＤ１９及びＣＤ２２表面抗原の一方又は両方を発現する細胞株の生成について説明する。
（ａ）ＣＤ１９／ＣＤ２２陽性組換え細胞株の生成
Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ）を、Ｃ末端でｆｌａｇ又はＭｙｃタグと融合された完全長ヒトＣＤ１９又はＣＤ２２をコードするヌクレオチド配列を担持する１０ｕｇのｐＣＭＶ６－Ｅｎｔｒｙベクターでトランスフェクションした。Ｇ４１８薬物選択プロセスにより、ＣＤ１９又はＣＤ２２発現細胞のポリクローナル、薬物耐性プールを得た。並行して、陰性対照としての使用のために、空のｐＣＭＶ６－Ｅｎｔｒｙベクターでトランスフェクションされた親細胞株を作製した。ＣＤ１９又はＣＤ２２発現細胞をＦＡＣＳによって選別して、ＣＤ１９又はＣＤ２２発現細胞のプールを得た。プールをＧ４１８薬物選択下で増殖させた。次いで、単一細胞選別を行い、続いて更なる薬物選択を行い、クローン細胞株を生成した。クローン株をＦＡＣＳによってＣＤ１９又はＣＤ２２発現についてスクリーニングした。

ＣＤ１９／ＣＤ２２二重陽性細胞株を作製するために、１０ｕｇのＣＤ２２プラスミドを５ＭのＣＤ１９発現細胞株にトランスフェクションし、Ｇ４１８下で選択した。ＣＤ１９及びＣＤ２２高の両方について単一細胞選別を実施し、Ｇ４１８選択及びクローナルＦＡＣＳスクリーニングを実施して、高ＣＤ１９／ＣＤ２２／Ｋ５６２二重陽性細胞株を取得した。

（ｂ）標的細胞株における組換え及び内因性ＣＤ１９及びＣＤ２２受容体数の定量化
標的細胞株における組換え及び内因性ＣＤ１９及びＣＤ２２発現レベルを（本明細書に示されるように）更に特徴付けるために、製造業者のプロトコルに従って標準較正にＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ ＱＵＡＮＴＵＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（蛍光ｄｅｙ）ＭＥＳＦマイクロスフィアビーズを使用して、定量ＦＡＣＳアッセイを実施した。親Ｋ５６２細胞株は、検出不可能なＣＤ１９及びＣＤ２２発現を示した。単一又は二重陽性組換え細胞株において、ＣＤ１９の発現レベルは、ＣＤ２２の発現レベルよりも約５倍高かった。Ｒａｊｉ細胞は、Ｎａｌｍ６細胞よりも多くのＣＤ１９及びＣＤ２２発現を示した。Ｒａｊｉ細胞及びＮａｌｍ６細胞の両方では、ＣＤ１９の発現レベルは、ＣＤ２２の発現レベルよりも約４～９倍高かった。ＣＤ１９及びＣＤ２２受容体コピー数を表５に要約する。図１も参照されたい。

（ｃ）ＣＤ１９、ＣＤ２２、及びＣＤ１９／ＣＤ２２ＧＦＰ陽性細胞株の生成
Ｋ５６２、ＣＤ１９ Ｋ５６２、ＣＤ２２ Ｋ５６２、ＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２、Ｒａｊｉ、及びＮａｌｍ６細胞株は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ＣｙｔｏＬｉｇｈｔ緑色レンチウイルス形質導入を使用してＧＦＰ発現カセットを導入するように更に操作された。細胞をＧＦＰ陽性について選別し、Ｇ４１８薬物選択下で選別して、安定した細胞株を確立した。ＧＦＰ陽性細胞株を、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（登録商標）５機器（細胞画像化マルチモードリーダー）での画像化ベースの細胞傷害性アッセイに利用した。

実施例２．ＣＤ１９－ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖの特徴付け
例示的な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性抗体を以下のように特徴付けた。

（ａ）ＣＤ１９－ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖの調製
ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖを、ＣＤ１９－ＣＤ２２及びＣＤ２２－ＣＤ１９配向でｐＥＴ２２ｂ細菌ペリプラズムベクターにクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ ＩＩ株で発現した。図２Ａは、ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖの例示的な設計を示す。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で発現された抗体断片を精製するために、３μｌのＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ樹脂（ＧＥ）を１ｍＬの濾過上清と混合し、１０ｍＬ又は２０ｍＬのＢｉｏＲａｄ Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ（登録商標）カラムに充填した。充填前に、カラムの樹脂を、少なくとも２０カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａ（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５００ｍＭに添加した追加のＮａＣｌを含む）で平衡化した。濾過滅菌された上清を、流量を１ｍＬ／分に制御するか、又は同じ充填樹脂床上で２回にわたって注ぐことによって、重力流によって精製した。次いで、カラムを以下の緩衝液で洗浄した。１０ＣＶ緩衝液Ａ、２０ＣＶ緩衝液Ｂ（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４、５００ｍＭにした追加のＮａＣｌ及び３０ｍＭのイミダゾールを含む）。Ｄｅｔｏｘ（登録商標）緩衝液を使用して、必要に応じてエンドトキシンを除去した。

２５０ｍＬの発現培養物から抗体断片を精製するために、抗体結合カラムを、２０ＣＶ緩衝液Ｃ（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４ ５００ｍＭにした追加のＮａＣｌ、１％のＴｘ１１４を含む）、２０ＣＶ緩衝液Ｄ（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４ ５００ｍＭにした追加のＮａＣｌ、１％Ｔｘ１００＋０．２％ＴＮＢＰを含む）及び４０ＣＶ緩衝液Ｅ（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４ ５００ｍＭにした追加のＮａＣｌを含む）で順次洗浄した。

タンパク質を溶出緩衝液Ｆ（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４ ５００ｍＭにした追加のＮａＣｌ、及び５００ｍＭのイミダゾールを含む）で合計６つの画分（０．５ＣＶ事前溶出、５×１ＣＶ溶出）で溶出した。画分を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（１００ｕｌの希釈したＢｒａｄｆｏｒｄ溶液＋１０ｕｌ試料）を実行した。鮮やかな青色を有する画分をプールし、そのタンパク質濃度をＡ２８０伸長係数によって測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルアッセイを実施して、精製された抗体の純度を分析した。

（ｂ）ＦＡＣＳ分析による細胞表面抗原に対する抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、及び抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖ抗体の結合活性
異なる二重特異性ｓｃＦｖ形式に変換した後の特異的な標的細胞結合活性を決定するために、ＣＤ１９、ＣＤ２２単一特異性ｓｃＦｖ及びＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖを、Ｋ５６２、ＣＤ１９ Ｋ５６２、ＣＤ２２ Ｋ５６２、及びＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２組換え細胞株を用いたＦＡＣＳ結合アッセイで試験した。簡潔に述べると、各二重特異性ｓｃＦｖを２００ｎＭに希釈し、９６ウェルプレート中で１００，０００個のＫ５６２、ＣＤ１９ Ｋ５６２、ＣＤ２２ Ｋ５６２、及びＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞株とともに、４℃で１時間振盪しながらインキュベーションした。細胞を１３００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンダウンして、非結合抗体を除去した。次いで、細胞を、ウェル当たり２００μＬのＰＢＳで１回洗浄した。試料をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（蛍光色素）コンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体（二次抗体、１００μＬ、１：１０００希釈）と混合し、振盪しながら暗所で、４℃で３０分間インキュベーションした。次いで、試料を１３００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンダウンし、ウェル当たり２００ｕＬの１×ＰＢＳで２回洗浄した。得られた試料を、２００ｕＬの１×ＰＢＳ中に再構成し、Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターで読み取った。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７－（蛍光色素）陽性細胞のみを計数することによって分析を行い、次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）８．１ソフトウェアでプロットした。

抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、及び抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖの細胞表面抗原への結合活性を図３に提供する。試験した二重特異性ｓｃＦｖのうち、４つの二重特異性ｓｃＦｖは、ＣＤ１９及びＣＤ２２標的細胞株の両方に対して親単一特異性ｓｃＦｖと同様の結合活性を保持した。２つの二重特異性ｓｃＦｖは、親単一特異性ｓｃＦｖと比較して、ＣＤ１９標的細胞株に対して同様の結合を示し、ＣＤ２２標的細胞株への結合の減少を示した。

次いで、完全な結合活性を有する４つの二重特異性ｓｃＦｖを、ＦＡＣＳアッセイによって内因性ＣＤ１９及びＣＤ２２を発現するＲａｊｉ細胞への結合活性について試験し、それらのＥＣ_５０値を決定した。簡潔に述べると、各精製された二重特異性ｓｃＦｖタンパク質を、完全培地で３倍段階希釈して２００ｎＭから滴定した。希釈した試料を、振盪しながら１時間、４℃で９６ウェルプレート中で１００，０００個のＲａｊｉ細胞株とともにインキュベーションした。洗浄、検出、及び分析を上記のように行った。これらの例示的な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖ抗体のＥＣ_５０値を以下の表６に提供する。

実施例３：抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性キメラ抗原受容体の構築
この実施例では、例示的な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築、及びウイルス形質導入を介した発現のためのかかる構築物の宿主細胞への導入について説明する。

（ａ）例示的なＣＡＲの形式及び構造
二重特異性ＣＤ１９／ＣＤ２２ ｓｃＦｖを、ＣＤ１９－ＣＤ２２又はＣＤ２２－ＣＤ１９配向に変換した。ｓｃＦｖ断片を、タンデム形式で、改変型のＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメインと連結した（以下の配列表を参照されたい）。いくつかの例では、二重特異性ＣＡＲ構築物を、短縮型ＥＧＦＲ断片に更に連結した。例示的な二重特異性ＣＡＲ構築物を図２Ｂに示す。配列を、ｐＥＦ１ａベースのレンチビアルベクターにクローニングした。以下の表７は、例示的なＣＡＲ構築物を提供する。

（ｂ）レンチウイルスの産生及び特徴付け
製造業者のプロトコルに従って、二重特異性ＣＡＲコードレンチウイルスベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション試薬を使用して、Ｅｘｐｉ２９３（商標）（ＨＥＫ２９３細胞）にＬＶ－ＭＡＸパッケージングミックスで共トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、８％のＣＯ２レベルで、３７℃の振盪で７２時間増殖させた。上清を室温で３２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．４５ｕｍのＰＥＳ膜を使用した真空濾過によって採取した。ウイルスを超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって、４℃で２時間、１８０００ｒｐｍで濃縮した。次いで、ペレットをレンチウイルス安定剤に再懸濁し、直ちに等分し、－８０℃で保存した。

ウイルス力価を、製造業者のプロトコルに従ってｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して測定し、各アッセイに設定された標準曲線に基づいて計算した。Ｐ２４ ＥＬＩＳＡの結果に基づいて、種々のウイルス量を固定数のＨＥＫ２９３細胞に形質導入することによって、機能的力価ＴＵ／ｍＬを測定した。ＣＡＲ＋発現細胞のパーセンテージを、２４時間から開始する種々の時点でのトランスフェクション後のフローサイトメトリーによってチェックした。

実施例４．抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞の特徴付け
密度勾配遠心分離Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（密度勾配培地）及びＳｔｅｍｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＳｅｐＭａｔｅ（商標）５０ＰＢＭＣ単離キットを使用して、ＬＲＳチャンバ中の新鮮な健康なドナーからＰＢＭＣを単離した。次いで、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）（密度勾配培地）ヒトＴ細胞単離キットを使用して、ＰＢＭＣからＣＤ３^＋Ｐａｎ Ｔ細胞を単離した。Ｐａｎ Ｔ細胞を、１：１のビーズ対細胞比で、ヒトＴ活性化剤ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ビーズで２４時間活性化し、次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコンジュゲートされたビーズ）及び１ｍｇ／ｍＬのプロタミン硫酸塩の存在下でレンチウイルスで形質導入した。スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）を３００ｇで２時間、２５℃で行った。細胞及びウイルスを３７℃で２４時間インキュベーションした。翌日、ビーズ及びウイルスから細胞を取り出した。細胞を、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ）培地中の組換えヒトＩＬ１５及びＩＬ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有する５％ヒト血清中で２週間増殖させた。２～３日ごとに培地を交換し、新鮮なサイトカインを添加した。

細胞表面上のＣＡＲの発現を、Ｍｉｘ－ｎ－ｓｔａｉｎ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７又はＣＦ ６４０Ｒ抗体標識キット（Ｓｉｇｍａ）で直接コンジュゲートされた抗ＥＧＦＲ抗体又はＣＤ２２－Ｆｃを使用した表面染色によって評価した。簡潔に述べると、１００，０００個のレンチウイルス形質導入Ｔ細胞を、２５ｎＭの抗ＥＧＦＲ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７又は組換えヒトＣＤ２２／Ｆｃ－ＣＦ ６４０Ｒと、４℃の振盪で暗所で１時間インキュベーションした。細胞を１，３００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、上清を除去し、２００ｕＬ１ｘＰＢＳで洗浄した。得られた試料を、２００ｕＬの１×ＰＢＳ中に再構成した。Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターで蛍光染色細胞を読み取ることによって、表面発現パーセンテージを定量化した。ＣＡＲ表面発現を、Ｃｙ５ ｃｕｂｅ及びＤＡＰＩ ｃｕｂｅ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いてＣｙｔａｔｉｏｎ（登録商標）５機器で２０倍の倍率で画像化した。１：１０００希釈Ｈｏｅｃｈｓｔ３４５８０を使用して、細胞の核を染色した。

ＦＡＣＳアッセイにおいてコンジュゲート抗ＥＧＦＲ又はＣＤ２２－Ｆｃ組換えタンパク質によって検出されたヒトＴ細胞上の種々のＣＡＲ構築物のＣＡＲ発現レベルは、３５～８５％の範囲にある。以下の表８は、列挙されたＣＡＲ構築物で形質導入されたＰＭＢＣにおけるＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを要約する。

様々なＣＡＲは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＥＧＦＲ抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ＣＤ２２－Ｆｃ融合タンパク質の両方を使用して、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（登録商標）５によって画像化されたＴ細胞上で均一な表面発現パターンを示した。例としてＥＰＣ－００１－１９を使用した図４Ａ及び図４Ｂを参照されたい。種々のＣＡＲで同様のパターンが観察された。

実施例５：抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性
ヒトＰＢＭＣ及びＰａｎ Ｔ細胞の単離、ウイルス形質導入，及びＴ細胞の増殖は、上に記載した。種々のＣＡＲ活性をスクリーニングするために、ＧＦＰで操作された標的細胞を用いて、リアルタイム画像ベースＣＴＬ活性アッセイを行った。簡潔に述べると、２０，０００個のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、それぞれ２０，０００個のＫ５６２－ＧＦＰ、ＣＤ１９／Ｋ５６２－ＧＦＰ、ＣＤ２２／Ｋ５６２－ＧＦＰ、ＣＤ１９／ＣＤ２２／Ｋ５６２－ＧＦＰ、Ｒａｊｉ－ＧＦＰ、及びＮａｌｍ－６－ＧＦＰ細胞とともにインキュベーションし、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で１：１のエフェクター対標的細胞の比率でインキュベーションした。サイトカインは添加されなかった。アッセイを９６時間実行し、標的細胞のＧＦＰを画像化し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（登録商標）５スキャナーによって定量化した。ＩＦＮγは、ＣＴＬアッセイ後、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）で検出した。簡潔に述べると、ＣＴＬアッセイが９６時間で終了した後、上清を収集した。組換えＩＦＮγを連続希釈し、アッセイに含めて、標準曲線を作製した。上清ＩＦＮγ及び組換えＩＦＮγを、提供された製造業者のプロトコルに従ってアッセイした。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）８．０ソフトウェアを使用して分析した。

種々の標的細胞（Ｋ５６２、ＣＤ２２ Ｋ５６２、ＣＤ１９ Ｋ５６２、ＣＤ１９／Ｃｄ２２ Ｋ５６２、Ｒａｊｉ細胞、及びＮａｌｍ６細胞を含む）に対するＣＡＲ発現細胞のリアルタイムＣＴＬ活性を監視し、種々のＣＡＲ構築物（上記の実施例を参照）のＣＴＬ活性の終点を計算した。図５Ａ～図５Ｄに示されるように、ＩＦＮγ分泌のレベルは、試験された様々なＣＡＲで観察されたように、ＣＴＬ活性と相関した。複数のドナーを種々のＣＡＲでスクリーニングし、同様の結果を示した。

実施例６：種々のエフェクター対標的細胞比でのＥＰＣ－００１－１６のＣＴＬアッセイ
ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＴＬ活性を更に評価するために、複数のドナーを、ＥＰＣ－００１－１６（代表的な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲとして使用される）を担持するレンチウイルスで形質導入し、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を上記のように増殖させた。ドナー１に由来する細胞について、形質導入Ｔ細胞又は非形質導入Ｔ細胞を、５：１、２．５：１、及び１：１のエフェクター対標的細胞比で、Ｋ５６２、ＣＤ１９ Ｋ５６２、ＣＤ２２ Ｋ５６２、及びＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２ ＧＦＰ細胞とともに９６時間共培養した。用量依存性の標的特異的なＣＴＬ活性を図６Ａに示されるように観察した。ドナー２及びドナー３に由来する細胞について、試験したエフェクター対標的細胞の比は、２．５：１及び１：１であった。図６Ｂに示されるように同様の結果が観察された。ＣＤ２２／Ｋ５６２－ＧＦＰ細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＴＬ活性は、ＣＤ１９／Ｋ５６２－ＧＦＰ細胞に対するものよりも低かった。これは、ＣＤ１９／Ｋ５６２及びＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞におけるＣＤ１９のコピー数よりも５～１０倍低いＣＤ２２ Ｋ５６２細胞におけるＣＤ２２の低いコピー数に起因し得る。個々の標的細胞株における操作されたＧＦＰ発現の差も、役割を果たし得る。ＩＦＮγ分泌の結果を図６Ｃに示す。

実施例７：ＣＴＬアッセイによる抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の機序研究
個々のｓｃＦｖベースのＣＡＲ活性の機序を研究するために、ＣＤ１９及びＣＤ２２ ｓｃＦｖ単一特異性ＣＡＲ並びに対応する二重特異性ＣＡＲを構築した（以下の表９を参照されたい）。

ＰＢＭＣ及びＰａｎ Ｔ細胞を２つのドナーから単離し、ＥＰＣ－００１－１６、ＥＰＣ－００１－１－１７、又はＥＰＣ－００１－１８を担持するレンチウイルスで形質導入した。得られた形質導入細胞を、記載のように増殖させ、次いで、２．５：１及び１：１のエフェクター対標的細胞比で、Ｋ５６２、ＣＤ１９ Ｋ５６２、ＣＤ２２ Ｋ５６２、又はＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２ ＧＦＰ細胞とともに６０時間共培養し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（登録商標）５で２時間ごとに画像化することによってＧＦＰを定量化した。ＥＰＣ－００１－１６ ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲは、全ての試験した標的細胞株に対して、ＣＤ１９単一特異性ＣＡＲ及びＣＤ２２単一特異性ＣＡＲと比較して同様のＣＴＬ活性を示した。図７は、種々のＥ：Ｔ比での、Ｋ５６２細胞、ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞、ＣＤ１９ Ｋ５６２細胞、及びＣＤ１９／ＣＤ２２ Ｋ５６２細胞に対する、様々な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ又は抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２単一特異性ＣＡＲのＣＴＬ細胞殺傷結果を示した。

実施例８：種々のリンカーを有する例示的な二重特異性ＣＡＲのＣＴＬ活性
２つの異なるｓｃＦｖ間の種々のるリンカーがＣＡＲ活性に影響を与えるかどうかを更に試験するために、ＥＰＣ－００１－１６と同じ抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ断片、並びに種々のリンカー、すなわち、（Ｇ_４Ｓ）１、（Ｇ_４Ｓ）_２、及び（Ｇ_４Ｓ）_３を有するＣＡＲ構築物を構築した。以下の表１０を参照されたい。ＣＴＬ活性をＥＰＣ－００１－１６と比較した。

ＰＢＭＣ及びＰａｎ Ｔ細胞を単離し、ＥＰＣ－００１－１９、ＥＰＣ－００１－１－２０、ＥＰＣ－００１－２１、及びＥＰＣ－００１－２２レンチウイルスで形質導入し、記載のように増殖させた。形質導入Ｔ細胞を、１：１のエフェクター対標的細胞比で、Ｋ５６２、ＣＤ１９／Ｋ５６２、ＣＤ２２／Ｋ５６２、及びＣＤ１９／ＣＤ２２／Ｋ５６２ ＧＦＰ細胞とともに６０時間共培養した。ＣＴＬ活性は、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（登録商標）５での標的細胞ＧＦＰレベルによって２時間ごとに画像化した。ＣＴＬ活性のパーセンテージを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）８．０を使用して分析した。図８に示されるように、ＥＰＣ－００１－１９は、ＥＰＣ－００１－２０、ＥＰＣ－００１－２１、及びＥＰＣ－００１－２２と比較して良好なＣＴＬ活性を示した。

実施例９：ＣＴＬアッセイ後のＦＡＣＳによる例示的な二重特異性ＣＡＲのサイトカイン分析
標的細胞との係合時に本明細書に開示される抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを更に試験するために、ＥＰＣ－００１－１９（代表的な二重特異性ＣＡＲとして）をＰａｎ Ｔ細胞に形質導入し、増殖させた。形質導入Ｔ細胞を、５：１のエフェクター対標的細胞比で、Ｋ５６２、ＣＤ１９／Ｋ５６２、ＣＤ２２／Ｋ５６２、ＣＤ１９／ＣＤ２２／Ｋ５６２、Ｒａｊｉ、又はＮａｌｍ－６ＧＦＰ細胞とともに９６時間共培養した。ＩＦＮγ及びグランザイムを、ＦＡＣＳで、細胞内染色によって検出した。簡潔に述べると、試料を採取する４時間前に、製造業者の推奨に従って（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｂｒｅｄｆｅｌｄｉｎ Ａを含む細胞活性化カクテルを使用して、細胞をゴルジ遮断した。細胞を１，３００ｒｐｍで５分間、室温でスピンダウンした。細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、室温で５分間インキュベーションしながら、１×ＰＢＳ中で１：１０００に希釈したＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）固定細胞生存率色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。次いで、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を、暗所で、室温で３０分間、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、ＣＤ２２－Ｆｃで染色した。次いで、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、暗所で、室温で２０分間細胞を固定した。次いで、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、１×ＰＢＳ中に再懸濁して、４Ｃで一晩保存した。翌日、透過化緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、暗所で、室温で１５分間細胞を透過化した。次いで、細胞を、ＩＦＮγ及びグランザイム細胞内タンパク質について、暗所で、室温で３０分間染色した。細胞を１×透過化緩衝液で２回洗浄した後、１×ＰＢＳ中に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターで読み取った。

９６時間で、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋集団の４０～８０％の範囲で、標的細胞とインキュベーションすると、ＩＦＮγ及びグランザイムの両方の特異的な分泌を示す。以下の表１１に示されるように、ＩＦＮγ及びグランザイム陽性ＣＤ８ Ｔ細胞と良好な相関が観察された。理論に拘束されることなく、異なる細胞株間で観察される差は、異なる細胞株における標的発現レベルの変動に起因する可能性がある。

実施例１０：標的細胞係合時のＣＡＲ－Ｔ細胞増殖
標的細胞係合時のＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を更に試験するために、実施例としてＥＰＣ－００１－１９を使用して７日の増殖アッセイを実施した。ＥＰＣ－００１－１９をＰａｎ Ｔ細胞に形質導入し、増殖させた。形質導入Ｔ細胞を、１ｕＭの最終濃度でＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄで標識した。２０，０００個の標的Ｔ細胞を、それぞれＥ：Ｔ比１：１で、２０，０００個のＫ５６２、ＣＤ１９／Ｋ５６２、ＣＤ２２／Ｋ５６２、ＣＤ１９／ＣＤ２２／Ｋ５６２、及びＲａｊｉ細胞とともに共培養した。アッセイを、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地で設定し、２日ごとに新鮮な培地を細胞に添加した。アッセイ中、培地にサイトカインは添加しなかった。ＣＡＲ－Ｔ増殖をＡｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターで分析した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、７日にわたって係合時に標的細胞特異的な増殖を示し、細胞上の標的発現レベルと相関する。図９は、１：１のＥ：Ｔ比での標的細胞との係合時のＣＡＲ－Ｔ細胞増殖を示した。

実施例１１：標的細胞チャレンジの複数ラウンド時のＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性
ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性を更に調べるために、実施例としてＥＰＣ－００１－１９を使用して、複数ラウンドの標的細胞チャレンジ実験を実施した。ＥＰＣ－００１－１９をＰａｎ Ｔ細胞に形質導入し、増殖させた。２０，０００個の形質導入Ｔ細胞を、２０，０００個のＫ５６２、ＣＤ１９／Ｋ５６２、ＣＤ２２／Ｋ５６２又はＣＤ１９／ＣＤ２２／Ｋ５６２ ＧＦＰ細胞で４８時間チャレンジし、続いて、形質導入Ｔ細胞を新鮮な２０，０００個の標的細胞で更に７２時間再チャレンジし、その後、形質導入Ｔ細胞を新鮮な２０，０００個の標的細胞で更に７２時間再チャレンジし、合計３回チャレンジした。ｔａｇｅｔ細胞細胞ＧＦＰ ＣＴＬを、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（登録商標）５で２時間ごとに画像化し、定量を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）８．０ソフトウェアを使用して分析した。各再チャレンジの間に、サイトカイン測定のために５０ｕｌの上清を収集した。

ＥＰＣ－００１－１９を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、８日にわたる３ラウンドの標的チャレンジ及び再チャレンジ実験で持続的なＣＴＬ活性を示した。同様のレベルのＩＦＮγ分泌が、測定された全ての時点で観察された。図１０Ａは、標的細胞チャレンジの１、２、又は３ラウンドに応答した細胞殺傷のパーセンテージを示した。図１０Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の対応するＩＦＮγ分泌を示した。

実施例１２：二重特異性ＣＡＲ形質導入Ｐａｎ Ｔ及びナイーブＴ細胞表現型
ＣＡＲ－Ｔ細胞表現型は、インビボＴ細胞持続性と関連する。ＥＰＣ－００１－１９を、ヒトＰａｎ Ｔ及びナイーブＴ細胞に形質導入し、Ｔ細胞分化マーカーを検出する抗体のパネルを用いて、ＦＡＣＳアッセイを使用して、Ｔ細胞表現型を分析した。簡潔に述べると、上記のように、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５ＲＯ、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＣＲ７、抗ＥＧＦＲを使用して形質導入Ｔ細胞を染色した。分析は、Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴソフトウェアによって行った。ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔｃｍ及びＴｅｍ細胞をゲーティングし、結果は、Ｐａｎ Ｔ細胞よりも形質導入ナイーブＴ細胞において、より多くのＴｃｍ集団及びより少ないＴｅｍを示した。

実施例１３：播種性Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼモデルを使用したインビボ抗腫瘍効果
ＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔのインビボ抗腫瘍効果を、ＮＣＧマウスにおける播種性Ｒａｊｉ細胞モデルで評価した。ＥＰＣ－００１－１９からＥＧＦＲｔを除去することによってＥＰＣ－００１－２３ＣＡＲを生成した。ＥＰＣ－００１－２３をナイーブＰａｎ Ｔ細胞に形質導入し、４日間インビトロで増殖させた。１ｅ６個のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞をＮＣＧマウスに接種した。３日目に、ＰＢＳ対照（群１）、０．１２５ｅ６（群２）及び０．２５ｅ６（群３）個のＥＰＣ－００１－２３ＣＡＲ－Ｔ細胞をマウスに投与した。マウスを２～３日ごとに画像化し、体重を測定した。１０、１９、及び３３日目に、マウスから血液を採取した。３３日目に脾臓も採取した。ＣＡＲ－Ｔ細胞表現型を、採血及び組織採取の直後にＦＡＣＳアッセイによって分析した。

図１１Ａ～１１Ｂに示されるように、用量依存的な腫瘍増殖阻害が６～１４日目に観察された。群３の動物は、対照群よりも有意な腫瘍増殖阻害を示した。３１日目に、両方の用量でＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウス（群２及び群３マウス）から、がん細胞が根絶した。図１１Ｃ～１１Ｄ：処置後のそれぞれ１４日目及び３３日目の腫瘍細胞ルシフェラーゼ定量化を示す図。

がん細胞の過剰増殖のため、対照マウスを１４日目に安楽死させた。図１１Ｅに示されるように、それぞれＧＶＨＤのため、低用量及び高用量のＣＡＲ－Ｔ処置群からの１匹のマウスを３１日目及び３３日目に安楽死させた。治療過程にわたってマウス体重の著しい変化はなかった。

図１２Ａ～１２Ｃに示すように、ＥＰＣ－００１－２３構築物を実施例として使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び持続性を治療経過にわたって実証した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、治療経過にわたってＴｓｃｍからＴｃｍ及びＴｅｍに分化及び増殖した。加えて、ＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ４及びＣＤ８のＴｃｍ及びＴｅｍの両方が脾臓にホーミングされていることが見出された。
図１２Ｄ～図１２Ｅは、それぞれ、群２及び群３のマウスの３３日目の脾臓における細胞数を示した。

実施例１４：抗ＣＤ２２－ＣＤ１９二重特異性抗体の特徴付け
この実施例は、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合形式の例示的な抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性抗体の特徴付けを説明する。

（ａ）ＣＤ１９－ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖの調製
標準プロトコルに従って、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－Ｆｃ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ、及び抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体を、フリースタイルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞において一過性に発現させた。細胞を、採取前に５日間増殖させた。上清を遠心分離によって収集し、０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を通して濾過した。融合タンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＰｒｉｓｍＡタンパク質Ａ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ）によって精製した。タンパク質を１００ｍＭのグリシンｐＨ２．５＋１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し、２０ｍＭのシトレートｐＨ５．０＋３００ｍＭのＮａＣｌで迅速に中和した。次いで、抗体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ １６／６００カラムによって更に精製した。単量体ピーク画分をプールし、濃縮した。最終的に精製されたタンパク質は、１０ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンを有し、２０ｍＭのヒスチジンｐＨ６．０＋１５０ｍＭのＮａＣｌ中に保持された。

（ｂ）抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、及び抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性抗体の結合活性
抗ＣＤ１９－Ｆｃ、抗ＣＤ２２－Ｆｃ、及び抗ＣＤ２２－ＣＤ１９－Ｆｃ融合タンパク質のＥＣ５０を決定するためにＥＬＩＳＡアッセイが開発された。簡潔に述べると、３８４ウェルプレートを、ウェル当たり２５μＬの総体積の１ｘＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬの最濃度で、ＨＩＳタグ付けされたヒトＣＤ１９又はＣＤ２２組換えタンパク質で固定化した。プレートを４℃で一晩インキュベーションし、続いてウェル当たり８０μＬのスーパーブロックで１時間ブロッキングした。精製された抗ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＣＤ２２－ＣＤ１９ ｓｃＦｖＦｃ融合タンパク質を２５ｎＭで開始して２倍の連続希釈し、２５μＬをヒトＣＤ１９又はＣＤ２２固定化ウェルに添加し、振盪しながら１時間インキュベーションした。ＣＤ１９又はＣＤ２２結合を、１×ＰＢＳＴ中に１：５０００で希釈された２５μＬの抗ｈＦｃＨＲＰを添加することによって検出された。各ステップの間に、プレートをプレートウォッシャー中で１ＸＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、プレートを２０μＬのＴＭＢ基質で５分間現像し、２０μＬの２Ｎの硫酸を添加することによって停止した。プレートをＯＤ４５０ｎｍ（ＢＩＯＴＥＫプレートリーダー）で読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）８．１ソフトウェアを使用してデータをプロットした。ＥＬＩＳＡ結合の結果を図１３Ａ～１３Ｂに示す。抗ＣＤ１９又はＣＤ２２ ｓｃＦｖ－ＦｃのＣＤ１９及びＣＤ２２に対するＥＣ_５０値を表１２に示す。

（ｃ）ＦＡＣＳ分析による内因性細胞株への抗ＣＤ１９／ＣＤ２２ ｓｃＦｖ二重特異性抗体の結合
ｓｃＦｖ形式及び二重特異性ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合形式での抗体の特異的な標的細胞結合活性を決定するために、抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ２２単一特異性ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合抗体を、ＣＤ１９及びＣＤ２２発現細胞株Ｒａｊｉ及びＮａｌｍ－６、並びに陰性細胞株Ｕ８７ＭＧを用いたＦＡＣＳ結合アッセイで試験した。簡潔に述べると、各ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合を２５ｎＭに希釈し、９６ウェルプレート中で、１００，０００個のＲａｊｉ、Ｎａｌｍ６、及びＵ８７ＭＧの細胞とともに、振盪しながら４℃で１時間インキュベーションした。細胞を１３００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンダウンして、非結合抗体を除去した。次いで、細胞を、ウェル当たり２００μＬのＰＢＳで１回洗浄した。試料をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート抗ｈＦｃ抗体（二次抗体、１００μＬ、１：１０００希釈）と混合し、振盪しながら暗所で、４℃で３０分間インキュベーションした。次いで、試料を１３００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンダウンし、ウェル当たり２００μＬの１×ＰＢＳで２回洗浄した。得られた試料を、２００μＬの１×ＰＢＳに再構成し、Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターで読み取った。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７陽性細胞のみを計数し、次いでＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）８．１ソフトウェアを使用してプロットすることによって分析を行った。

ＦＡＣＳ分析で観察されるように、Ｆｃ融合形式の全ての抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、及び抗ＣＤ１９／ＣＤ２２抗体は、ＣＤ１９及びＣＤ２２発現Ｒａｊｉ及びＮａｌｍ６細胞株に対して特異的な結合活性を示したが、ＣＤ１９及びＣＤ２２を発現しないＵ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞に対しては特異的な結合活性を示さなかった。

（ｄ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性抗体の結合動力学
抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２２、及び抗ＣＤ２２／ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合の動力学分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００を用いたＳＰＲ技術によって評価した。アッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００対照ソフトウェアバージョン２．０を使用して実施した。各サイクルについて、１μｇ／ｍＬのＦｃ融合タンパク質を、プロテインＡセンサーチップ上の１×ＨＢＳＰ緩衝液中のフローセル２上で１０ｕｌ／分の流量で６０秒間捕捉した。２倍の連続ヒトＣＤ１９又はＣＤ２２－ＨＩＳタグ付きタンパク質を、３０μｌ／分の流量で１５０秒間、参照フローセル１及びＦｃ融合タンパク質捕捉フローセル２の両方に注射し、続いて３００秒間洗浄した。次いで、フローセルを、３０ｕｌ／分の流量で６０秒間、グリシンｐＨ２で再生成した。９６ウェルプレート中でＦｃ融合ごとに、１００～０ｎＭの８個の濃度ポイントをアッセイした。ＣＤ１９又はＣＤ２２タンパク質への抗ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２２－ＣＤ１９結合の動力学を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０を使用して分析した。特異的な結合応答単位は、Ｆｃ融合タンパク質捕捉フローセル－２から参照フローセル－１への結合の減算に由来した。以下の表１３は、抗ＣＤ１９、ＣＤ２２、及びＣＤ２２－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のＣＤ１９又はＣＤ２２への結合動力学を示す。

実施例１５：ＣＡＲ－Ｔ産生からのＣＡＲ－Ｔ代謝の評価。
インビボでのＣＡＲ－Ｔの持続性を予測するために、ミトコンドリアの酸素消費を評価するＣＡＲ－Ｔ代謝アッセイを開発した。ＥＰＣ－００１－２３を、活性化されたヒトナイーブＴ細胞に形質導入し、最大１１日間増殖させた。５日目及び１１日目に、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び非形質導入Ｔ細胞を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）機器を使用するアッセイにおいて試験した。

製造業者のプロトコルに従って、２５０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞をポリＤ－リジン処理プレート上に播種した。まず、１．５μＭのオリゴマイシンを添加して、ポートＡのミトコンドリアＡＴＰ合成酵素を阻害した。次いで、１μＭのカルボニルシアニド－４（トリフルオロメチオキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）をポートＢに添加した。最後に、ミトコンドリア呼吸を遮断するために、０．５μＭのロテノン及びアンチマイシンをポートＣに一緒に添加して、電子輸送鎖の複合体Ｉ及びＩＩＩを阻害した。各薬物添加の間に、試料を３回混合し、３回読み取った。プレートを、ＸＦ Ｍｉｔｏストレスプログラムを使用してＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）ＸＦｅ９６機器で読み取った。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）分析器ソフトウェアを使用して行った。図１５Ａ～１５Ｂは、ＣＡＲ候補ＥＰＣ－００１－０２３が、５日目に２～３倍多い酸素消費量を示し、それが１１日目まで継続したことを示す。

実施例１６：ＣＲＩＳＰＲ技術によって生成されたＣＤ１９又はＣＤ２２ Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ ＫＯ細胞株
この実施例は、ＣＤ１９又はＣＤ２２発現標的の回避を克服するＥＰＣ－００１－０２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の能力の根底にある機序を評価する。

（ａ）ＣＲＩＳＰＲ細胞株の生成
ＥＰＣ－００１－０２３ ＣＡＲ－Ｔ媒介効果の機序を特定するために、ＣＲＩＳＰＲ技術及び動物モデルによって産生されたＣＤ１９又はＣＤ２２ノックアウト細胞株を開発した。簡潔に述べると、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ配列は、Ｂｒｏａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣＲＩＳＰｉｃｋデータベースを使用して設計された。ＣＤ１９及びＣＤ２２を標的とする上位５つの選択的ｓｇＲＮＡ配列を設計した（表１４）。

ｓｇＲＮＡはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが合成したものであり、酵素消化法を使用してｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２ベクターにクローニングした。プラスミド配列を確認した。これらの構築物のレンチウイルスは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でトランスフェクションされたＥｘｐｉ２９３（商標）細胞を使用して作製した。ウイルスを超遠心分離法を使用して濃縮し、次いで、Ｒａｊｉルシフェラーゼ細胞に直接形質導入し、続いて室温で２時間スピノキュレーションした。２日後、細胞を市販の抗ヒトＣＤ１９ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７又は抗ヒトＣＤ２２ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で染色し、続いてＣＤ１９又はＣＤ２２ノックアウト発現のための単一細胞選別を行った。細胞を、薬物選択圧力下で１ヶ月間培養中に維持した。細胞を、ＣＤ１９及びＣＤ２２発現のフローサイトメトリー及びウエスタンブロットによって特徴付けた。

（ｂ）ＦＡＣＳアッセイによるＣＤ１９又はＣＤ２２ノックアウト細胞株の確認
ＣＤ１９及びＣＤ２２ノックアウト単一クローンをＦＡＣＳによってスクリーニングした。簡潔に述べると、各クローンの１００，０００個の細胞を、振盪しながら４℃で１時間９６ウェルプレートに播種した。２５ｎＭの抗ヒトＣＤ１９－ＦＩＴＣ又は抗ヒトＣＤ２２－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を細胞とともに終体積１００μＬで、４Ｃで１時間インキュベーションした。細胞を１３００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンダウンして、非結合抗体を除去した。次いで、細胞を、ウェル当たり２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。得られた試料を、２００μＬの１×ＰＢＳに再構成し、Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮＮｘＴＴフローサイトメーターで読み取った。分析を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７陽性細胞又はＦＩＴＣ陽性細胞のみを計数することによって行い、次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）８．１ソフトウェアを使用してプロットした。

ＦＡＣＳ分析によって決定されるように、ＣＤ２２ノックアウト細胞は、親Ｒａｊｉ細胞と比較して、ＣＤ２２発現の完全な喪失を示したが、ＣＤ１９の完全な発現を示した。同様に、ＣＤ１９ノックアウト細胞は、親Ｒａｊｉ細胞と比較して、ＣＤ１９発現の完全な喪失を示したが、ＣＤ２２の完全な発現を示した。

（ｃ）ウエスタンブロットアッセイによるＣＤ１９又はＣＤ２２ノックアウト細胞株の確認
ＣＤ１９又はＣＤ２２ノックアウト細胞株を、ウエスタンブロットによって更に確認した。簡潔に述べると、各細胞株について、１ｅ６個の細胞を、ＰＭＳＦ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号５８７１）を含有する１００μＬの１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号９８０３）で溶解した。試料を氷上で２０分間インキュベーションし、次いで、４Ｃで２０分間、１３，０００ｒｐｍでスピンダウンした。上清を新しいチューブに移した。ＳＤＳ充填緩衝液及びβ－メルカプトエタノールに含有された２５μＬの全細胞溶解物を１２ウェルのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに充填し、２２分間、一定の２００電圧で実行した。タンパク質を、製造業者の指示に従ってｉＢｌｏｔ（商標）２を使用してＰＶＤＦ膜上に移した。膜ブロットを、１ｘＰＢＳＴ（１ｘＰＢＳ中０．０５％ポリソルベート２０）中の５％の乳粉末で室温で１時間ブロッキングした。次いで、１ｘＰＢＳＴで３回洗浄し、各洗浄は室温で１０分間であった。一次を１：１０００希釈でブロットに添加し、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、ブロットを１ｘＰＢＳＴで３回洗浄した（各々室温で１０分）。二次抗体を１：１０００希釈抗ウサギＨＲＰで添加し、室温で１時間インキュベーションした。次いで、ブロットを１ｘＰＢＳＴで３回洗浄し（各々室温で１０分）、ＥＣＬ（商標）試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号６８８３）を使用して現像し、続いてＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ Ｅゲル画像化装置で読み取った。図１５に示されるように、ＣＤ１９及びＣＤ２２ノックアウト細胞株において、ＣＤ１９又はＣＤ２２タンパク質は検出されなかったが、親Ｒａｊｉ細胞株は、豊富なＣＤ１９及びＣＤ２２発現を示した。

（ｄ）ノックアウト（ＫＯ）及びノックダウン（ＫＤ）細胞株におけるＣＤ１９及びＣＤ２２受容体数の定量化
ノックアウト細胞株におけるＣＤ１９及びＣＤ２２発現レベルを更に特徴付けるために、製造業者のプロトコルに従って標準較正のために、ＱＵＡＮＴＵＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ＭＥＳＦマイクロスフィアビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）を使用して、定量ＦＡＣＳアッセイを実施した。親Ｒａｊｉ細胞株は、高レベルのＣＤ１９及びＣＤ２２発現を示した。親Ｒａｊｉ細胞株において、ＣＤ１９の発現レベルは、ＣＤ２２の発現レベルよりも約５倍高かった。ＣＤ１９及びＣＤ２２ノックアウト細胞株は、検出不能なＣＤ１９又はＣＤ２２発現を示した。ＣＤ１９又はＣＤ２２ノックダウン細胞株は、非常に検出不能なＣＤ１９又は非常に低いＣＤ２２コピー数を示した。ＣＤ１９及びＣＤ２２受容体コピー数を表１５に要約する。図１６Ａ～１６Ｂも参照されたい。

（ｅ）ＣＤ１９又はＣＤ２２ノックアウト細胞株に対するＥＰＣ－００１－０２３単一及び二重特異性ｓｃＦｖ－Ｆｃ結合
ＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞における抗原結合部分に対応する単一及び二重特異性抗体断片（ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合形式で）の、Ｒａｊｉ親細胞、ＣＤ１９ノックアウト及びＣＤ２２ノックアウト細胞への結合を、上記のようにＦＡＣＳによって試験した。結果は、全てのｓｃＦｖが試験した細胞株に結合したが、一方でＣＤ１９ ｓｃＦｖ及びＣＤ２２ ｓｃＦｖのＲａｊｉ ＣＤ１９又はＣＤ２２ノックアウト細胞株への結合は観察されなかったことを示す。

実施例１７：ＣＤ１９又はＣＤ２２ノックアウトＲａｊｉ細胞を移植されたマウスモデルにおけるＥＰＣ－００１－２３インビボ機序研究
この実施例は、二重特異性及び単一特異性標的化を使用して、ＥＰＣ－００１－２３のインビボ機能性を強調する機序を分析する。

ＮＣＧマウスモデルを使用して、播種した親Ｒａｊｉ細胞、及びＣＤ１９ ＫＯ又はＣＤ２２ ＫＯ Ｒａｊｉ細胞に対するＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔの効果を研究した。ＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲを上記のように生成した。全てのＲａｊｉ細胞は、腫瘍担持の画像化及び定量の目的のためにルシフェラーゼを発現した。

３日目に、ＰＢＳ対照（群１）、０．２５ｅ６個のＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及び抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞（チサゲンレクロイセル）をマウスに投薬し、これらに０．３ｅ６個 の親Ｒａｊｉを移植した。１ｅ６のＥＰＣ－００１－２３を、ＣＤ１９ノックアウトＲａｊｉ及びＣＤ２２ノックＲａｊｉ細胞株に投薬した。マウスを３～４日ごとに画像化し、体重を測定した。３６日目に、血液を採取し、ＦＡＣＳによるＣＡＲ－Ｔ細胞表現型の分析のために脾臓を切除した。がん細胞の過剰増殖のため、対照マウスを１４日目に安楽死させた。

図１７に示すように、腫瘍増殖阻害は、全てのＣＡＲ－Ｔ細胞処置群で観察された。親Ｒａｊｉ細胞は、ＣＤ１９及びＣＤ２２の二重特異性標的化を介して、ＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって、より堅牢にＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスから除去された。抗腫瘍活性は、標的細胞へのＥＰＣ－００１－２３ＣＡＴ細胞の単一特異性係合を通して、ＣＤ１９又はＣＤ２２ノックアウトＲａｊｉ細胞でも観察された。腫瘍担持の定量的評価を図１８Ａ～１８Ｃに示す。血液及び脾臓に対して実施された表現型分析は、ＰＢＭＣにおいてＣＡＲ－Ｔ細胞がＴｃｍ及びＴｅｍに分化し、増殖し、脾臓にホーミングして、処置の過程にわたってＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び持続を実証した（図１９Ａ～１９Ｂ）。更に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方は、３６日目にＰＢＭＣ及び脾臓に同様の割合で存在し、枯渇なく、ＰＤ１＋、Ｔｉｍ３－ＣＡＲ＋Ｔ細胞として検出された（図２０Ａ～２０Ｃ）。

要約すると、この実施例で提供される結果は、（例としてＥＰＣ－００１－２３を使用して）抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方を発現するがん細胞だけでなく、２つの標的抗原のうちの１つのみを発現するがん細胞も標的とすることができることを示している。そのような特徴は、単一特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞療法における潜在的なｔａｒｇｅ回避に対処する際に所望される。

実施例１８．インビトロ及びインビボでのＣＤ１９ ＫＯ又はＣＤ２２ ＫＯ Ｒａｊｉ細胞に対するＥＰＣ－００１－２３の効果
（ａ）インビトロ細胞傷害性
ＥＰＣ－００１－２３及びチサゲンレクロイセル（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞）を上記のように産生した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、５：１のＥ：Ｔ比で、親Ｒａｊｉ、ＣＤ１９ ＫＯ、ＣＤ２２ ＫＯ、ＣＤ１９ノックダウン（ＣＤ１９ＫＤ）、又はＣＤ２２ ＫＤ細胞とともに、７２時間インキュベーションした。ＦＡＣＳアッセイを使用して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞及びグランザイムＢ＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞をそれぞれ計数することによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び活性化を評価した。ＥＰＣ－００１－２３は、チサゲンレクロイセル（対照として使用）と比較して、７２時間でより堅牢なＣＡＲ－Ｔ細胞増殖（図２１Ａ）及び活性化（図２１Ｂ）を示した。

標的細胞殺傷活性も、上記に開示される標的細胞再チャレンジアッセイで調べた。簡潔に述べると、ＣＡＲ－Ｔｓ細胞をインビトロで産生及び増殖させた。１０％のＦＢＳ／ＲＰＭＩ中、９６ウェルプレート中で、刺激１で、１００，０００個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を、形質導入後４日目に２０：１の比率で、５０００個の標的細胞とともにインキュベーションした。試料を１３００ｒｐｍで５分間、室温でスピンダウンし、次いで、５％ＣＯ２で、３７Ｃで７２時間インキュベーションした。３日間のインキュベーションの後、プレートを１，３００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。慎重に５０ｕＬの上清を取り出して廃棄した。再チャレンジ２の場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含有するプレートに、５０ｕｌの１０％のＦＢＳ／ＲＰＭＩ中の新鮮な１０，０００個の標的細胞を添加した。プレートを１，３００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、続いて５％ＣＯ２で、３７Ｃで７２時間インキュベーションする。記載のとおり再チャレンジを３回繰り返す。最終的な７２時間のインキュベーションの後、標的細胞を、上記のように、５ｕＬの抗ヒトＣＤ１９ ＡＦ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号ＳＪ２５Ｃ１）及び５ｕＬの抗ヒトＣＤ２２ ＡＦ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号ＨＩＢ２２）で染色することによって計数した。染色された細胞を１ｘＰＢＳの２００ｕＬに再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ（商標）３レーザーフローサイトメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で読み取った。分析を、Ａｔｔｕｎｅ（商標）ソフトウェア及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）８で行った。

図２１Ｃで知られているように、ＥＰＣ－００１－２３及びチサゲンレクロイセルは、親Ｒａｊｉ細胞及びＣＤ２２ ＫＯ Ｒａｊｉ細胞を含む低レベルの生存標的細胞の存在下で同様の標的細胞殺傷活性を示した。一方、ＥＰＣ－００１－２３は、チサゲンレクロイセルと比較して、ＣＤ１９ ＫＯ Ｒａｊｉ細胞に対するはるかに強い標的細胞殺傷活性を示した。

（ｂ）インビボ細胞傷害性
ＥＰＣ－００１－２３二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞及びチサゲンレクロイセル（陽性対照として）のインビボ細胞傷害性もまた、ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞及びＣＤ１９ ＫＯ Ｒａｊｉ細胞を移植されたＮＣＧマウスモデルにおいて調べた。ＣＡＲ－Ｔ細胞を上記のように生成した。３日目に、ＰＢＳ対照（群１）、０．２ｅ６個のＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びチサゲンレクロイセルＣＡＲ－Ｔ細胞を、０．３ｅ６個の親Ｒａｊｉが移植されたマウスに投薬した。マウスを３～４日ごとに画像化し、体重を測定した。図２２Ａ及び２２Ｂに示されるように、二重特異性ＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、親Ｒａｊｉ細胞を移植されたマウスにおいて、チサゲンレクロイセルと比較して、より強く、より持続的な抗腫瘍活性を示した。図２２Ｂ。同様に、二重特異性ＥＰＣ－００１－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９ ＫＯ親Ｒａｊｉ細胞を移植されたマウスにおいて、チサゲンレクロイセルと比較して、より強く、より持続的な抗腫瘍活性を示した。図２３Ａ及び２３Ｂ。

この実施例からの結果は、両方の標的抗原を発現する細胞及び１つの標的抗原のみを発現する細胞に対する二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を裏付ける。したがって、二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞は、単一特異性ＣＡＲ－Ｔ療法に関連する問題であり得る、標的回避の状況において治療有効性を維持することが予想される。

他の実施形態
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせ得る。本明細書で開示されている各特徴は、同じ、同等、又は類似の目的を果たす代替的特徴に置き換えられ得る。したがって、特に明記しない限り、開示される各特徴は、同等又は類似の特徴の一般的なシリーズの例に過ぎない。

上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な使用法及び条件に適合させるために本発明の様々な変更及び修正を行うことができる。したがって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲内にある。

同等物
いくつかの本発明の実施形態が本明細書に記載及び図示されてきたが、当業者であれば、機能を実施するため、並びに／又は本明細書に記載の結果及び／若しくは利点のうちの１つ以上を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定し、そのような変形及び／又は修正の各々は、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より概して、当業者であれば、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存するであろうことを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の特定の本発明の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲及びそれの等価物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載及び請求されたものとは別の方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の各々を対象とする。更に、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせが、本開示の発明の範囲内に含まれる。

本明細書で定義及び使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、及び／又は定義された用語の通常の意味に対して優先するように理解される必要がある。

本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、文書全体を包含し得る。

不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書及び特許請求の範囲で本明細書で使用される場合、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解される必要がある。

「及び／又は」という句は、本明細書及び特許請求の範囲で本明細書で使用される場合、そのように結合された要素、すなわち、場合によっては結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解される必要がある。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」と解釈される必要がある。「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素は、具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などの制限のない言語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）、更に別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意選択で他の要素を含む）などを指し得る。

本明細書及び特許請求の範囲で本明細書で使用される場合、「又は」は、上記で定義された「及び／又は」と同じ意味を有すると理解される必要がある。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「又は」又は「及び／又は」は包括的であると解釈され、すなわち、要素の数又はリスト、及び任意選択で追加のリストされていない項目のうちの少なくとも１つを含むが、１つより多くも含むと解釈されるものとする。「のうちのただ１つ」若しくは「のうちの正確に１つ」、又は特許請求の範囲で使用される場合は「からなる」など、反対に明確に示される用語のみが、要素の数又はリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指すだろう。概して、本明細書で使用される「又は」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの正確に１つ」などの排他的な用語が先行する場合、排他的な選択肢（すなわち、「両方ではなく一方又は他方」）を示すものとしてのみ解釈される必要がある。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

本明細書の明細書及び特許請求の範囲で本明細書で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリストの要素のうちの任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解される必要があるが、要素のリスト内に具体的に列挙されたありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを含む必要はなく、要素のリストの要素の任意の組み合わせを除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意選択で存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は、同等に、「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は同等に「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在しない、任意選択で１つより多くを含む少なくとも１つのＡ（かつ任意選択でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ａが存在しない、任意選択で１つより多くを含む少なくとも１つのＢ（かつ任意選択でＡ以外の要素を含む）、更に別の実施形態では、任意選択で１つより多くを含む少なくとも１つのＡ及び任意選択で１つより多くを含む少なくとも１つのＢ（かつ任意選択で他の要素を含む）などを指し得る。

反対に明確に示されない限り、１つより多くのステップ又は行為を含む本明細書で請求される方法において、本方法のステップ又は行為の順序は、必ずしも、本方法のステップ又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解される必要がある。

Claims (39)

1. ＣＤ１９及びＣＤ２２に特異的な二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＣＤ１９に特異的な第１の抗原結合部分と、ＣＤ２２に特異的な第２の抗原結合部分と、共刺激シグナル伝達ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインと、を含み、
   前記第１の抗原結合部分が、ＣＤ１９に結合する参照抗体ＥＰＣ－００１－１と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖ＣＤＲを含み、
   前記第２の抗原結合部分は、各々がＣＤ２２に結合する参照抗体ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－３、又はＥＰＣ－００１－４と同じ重鎖ＣＤＲ及び同じ軽鎖ＣＤＲを含む、二重特異性ＣＡＲ。
2. 前記第１の抗原結合部分が、前記参照抗体ＥＰＣ－００１－１と同じ重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び同じ軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む、請求項１に記載の二重特異性ＣＡＲ。
3. 前記第２の抗原結合部分が、前記参照抗体ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－３、ＥＰＣ－００１－４と同じ重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び同じ軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性ＣＡＲ。
4. 前記第１の抗原結合部分、前記第２の抗体結合部分、又はそれら両方が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲ。
5. 前記第１の抗原結合部分が、配列番号９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項４に記載の二重特異性ＣＡＲ。
6. 前記第２の抗原結合部分が、配列番号１８、２７、又は３６のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項４又は５に記載の二重特異性ＣＡＲ。
7. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、又はＣＤ４０Ｌから選択される共刺激分子由来である、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲ。
8. 前記細胞質シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ由来である、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲ。
9. 前記二重特異性ＣＡＲが、
   （ａ）Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）前記第１の抗原結合部分と、（ｉｉ）前記第２の抗原結合部分と、（ｉｉｉ）前記共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｉｖ）前記細胞質シグナル伝達ドメインと、を含む、融合ポリペプチド、又は
   （ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ、（ｉ）前記第２の抗原結合部分と、（ｉｉ）前記第１の抗原結合部分と、（ｉｉｉ）前記共刺激シグナル伝達ドメインと、（ｉｖ）前記細胞質シグナル伝達ドメインと、を含む、融合ポリペプチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲ。
10. （ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に位置するヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを更に含む、請求項９に記載の二重特異性ＣＡＲ。
11. 前記第１の抗原結合部分と前記第２の抗原結合部分とを接続するペプチドリンカーを更に含む、請求項９又は１０に記載の二重特異性ＣＡＲ。
12. 前記ペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、又はＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性ＣＡＲ。
13. 配列番号４８～５３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の二重特異性ＣＡＲ。
14. 配列番号５５～６０及び６３～６７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の二重特異性ＣＡＲ。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲを集合的にコードする、核酸又は核酸のセット。
16. 請求項９～１５のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸又は核酸のセット。
17. 上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む短縮型ＥＧＦＲドメインをコードするヌクレオチド配列と、前記二重特異性ＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列と前記短縮型ＥＧＦＲドメインをコードする前記ヌクレオチド配列との間に位置する自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列と、を更に含む、請求項１６に記載の核酸又は核酸のセット。
18. 前記短縮型ＥＧＦＲドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の核酸又は核酸のセット。
19. 前記核酸が、発現ベクターであり、前記発現ベクターが、任意選択で、ウイルスベクターである、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の核酸又は核酸のセット。
20. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲを発現する、遺伝子操作された免疫細胞。
21. 前記二重特異性ＣＡＲをコードする、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の核酸を含む、請求項２０に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
22. Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージであり、任意選択で、前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項２０又は２１に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
23. 抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインと、を含み、前記細胞外抗原結合ドメインが、抗ＣＤ１９抗体ＥＰＣ－００１－１と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖ＣＤＲを含む抗ＣＤ１９単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ。
24. 前記抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖが、抗ＣＤ１９抗体ＥＰＣ－００１－１と同じ重鎖可変ドメイン及び同じ軽鎖可変ドメインを含む、請求項２３に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ。
25. 前記抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ。
26. 配列番号６２のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ。
27. 抗ＣＤ２２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＣＤ２２に結合する細胞外抗原結合ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインと、を含み、前記細胞外抗原結合ドメインが、抗ＣＤ２２抗体ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－３、又はＥＰＣ－００１－４と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖ＣＤＲを含む抗ＣＤ２２単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ。
28. 前記抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖが、抗ＣＤ２２抗体ＥＰＣ－００１－２、ＥＰＣ－００１－３、又はＥＰＣ－００１－４と同じ重鎖可変ドメイン及び同じ軽鎖可変ドメインを含む、請求項２７に記載の抗ＣＤ２２ ＣＡＲ。
29. 前記抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖが、配列番号１８、２７、又は３６のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の抗ＣＤ２２ ＣＡＲ。
30. 配列番号６１のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の抗ＣＤ２２ ＣＡＲ。
31. 請求項２３～２６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするか、又は請求項２７～３０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２２ ＣＡＲをコードする、核酸。
32. 発現ベクターであり、任意選択で、前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３１に記載の核酸。
33. 請求項２３～２６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、又は請求項２７～３０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２２ ＣＡＲを発現する、遺伝子操作された免疫細胞。
34. Ｔ細胞である、請求項３３に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
35. 対象における望ましくない細胞を排除するための方法であって、その排除を必要とする対象に、有効量の請求項１８～２０及び３３～３４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞、又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
36. 前記望ましくない細胞が、がん細胞である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記対象が、ヒトがん患者である、請求項３５又は３６に記載の方法。
38. 前記ヒトがん患者が、ＣＤ１９^＋及び／又はＣＤ２２^＋がん細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記ヒトがん患者が、造血性悪性腫瘍を有し、前記造血性悪性腫瘍が、任意選択で、Ｔ細胞悪性腫瘍又はＢ細胞悪性腫瘍である、請求項３７又は３８に記載の方法。