TW201837175A - 用於黑色素瘤之嵌合抗原受體及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於包括特異性結合黑色素瘤細胞之抗原結合域之嵌合抗原受體(CAR)、編碼該等CAR之多核苷酸，及包括該等多核苷酸之載體。本發明另外關於包括該等多核苷酸及/或經該等病毒載體轉導之改造細胞，及包含複數個改造T細胞之組合物。本發明亦關於製造該等改造T細胞及組合物之方法，及該等改造T細胞及組合物在治療黑色素瘤中之用途。

Description

用於黑色素瘤之嵌合抗原受體及其用途

黑色素瘤係一類自含色素細胞(稱為黑色素細胞)發生之皮膚癌。據美國癌症協會(American Cancer Society)估計，2017年，在美國將診斷出87,110個新黑色素瘤病例且約9,730個人將死於黑色素瘤。若不能在早期識別並治療黑色素瘤，則該癌症可得以發展且自皮膚表面擴散出並蔓延至患者全身，其中其變得較難治療並可致死。 用於黑色素瘤之當前療法包含手術、化學療法、輻射療法及癌症免疫療法，其使用患者之自有免疫系統來幫助抵抗癌症。最後之治療方式之一實例係使用經基因改造之T細胞受體(TCR)，該等受體識別癌症相關蛋白並激活殺死癌細胞之機制。然而，該等TCR依賴於癌細胞處理及癌細胞表面上由特異性主要組織相容性複合物(MHC)分子呈遞之腫瘤抗原之展現。若所處理及展現之腫瘤抗原之量不足以激活殺死癌細胞之TCR相關機制或若患者缺乏所需MHC等位基因，則可能不能殺死癌細胞。 因此，需要用於治療黑色素瘤之新穎及改良療法，該等療法不依賴於在癌細胞中經由MHC複合物來處理及展現腫瘤抗原。

本發明藉由提供包括獨立於MHC呈遞特異性靶向且殺死黑色素瘤細胞之經基因改造之免疫細胞之組合物及方法來解決此需要及其他需要。本發明部分地係基於以下觀察：MART-1抗原(已知其高度表現於黑色素瘤細胞中)擁有細胞外域；此細胞外域獨立於黑色素瘤細胞表面上之抗原之處理及展現進行呈現。獨立於細胞之抗原展現係本發明之顯著優點，此乃因MART-1當前僅展示由僅常見於一部分高加索人群中之一種MHC等位基因(亦即HLA-A2)展現，而約95%之黑色素瘤患者具有MART-1之細胞外呈遞。例如參見Busam等人，Am. J. Surg. Pathol. 22(8): 976-82 (1998)。 如下文(包含實例部分)中更詳細所闡述，已測得某些抗MART-1抗體可識別且結合MART-1之細胞外表位且該等抗體之衍生物可用於嵌合抗原受體(CAR)中之抗原結合域中。可轉導編碼該等CAR之多核苷酸且使CAR表現於T細胞(例如患者之自有T細胞)中。在將經轉導T細胞移植回患者中時，CAR引導T細胞識別且結合高度呈現於黑色素瘤細胞表面上之MART-1之細胞外表位；由此使得結合黑色素瘤細胞而非非癌性含黑色素細胞，其中MART-1表位之表面呈遞似乎較不充分。此結合使得激活T細胞中特異性殺死所結合黑色素瘤細胞之細胞溶解機制。在本發明之前，MART-1之細胞外域尚未視為能夠特異性殺死黑色素瘤細胞之CAR之有用靶。因此，本發明滿足了對於治療黑色素瘤之新穎及改良之療法之未滿足需要。 本發明之一態樣係編碼嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸，其中CAR至少包括抗原結合域、活化域及共刺激域，其中抗原結合域對MART-1具有特異性。 在一些實施例中，抗原結合域對MART-1之細胞外表位具有特異性。 在一些實施例中，抗原結合域包括抗體或其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段可選自由以下組成之群：IgG、Fab、Fab′、F(ab′)₂ 、Fv、scFv及單域抗體(dAB)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段係scFv。 在一些實施例中，scFv包括至少輕鏈可變(VL)區及至少重鏈可變(VH)區。在一些實施例中，VH區係N-末端連接至VL區。在其他實施例中，VL區係N-末端連接至VH區。 在一些實施例中，VL區包括VL互補決定區(CDR) 1 (VL CDR1)、VL CDR2及VL CDR3且VH區包括VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。 在一些實施例中，VL CDR1與SEQ ID NO: 1至少90%一致，VL CDR2與SEQ ID NO: 2至少90%一致，且VL CDR3與SEQ ID NO: 3至少90%一致。 在一些實施例中，VH CDR1與SEQ ID NO: 7或10至少90%一致，VH CDR2與SEQ ID NO: 8或11至少90%一致，且VH CDR3與SEQ ID NO: 9至少90%一致。 在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 18至少85%一致。 在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 19至少85%一致。 在一些實施例中，抗原結合域與SEQ ID NO: 20至少80%一致。 在一些實施例中，抗原結合域與SEQ ID NO: 21至少80%一致。 在一些實施例中，VL係由與SEQ ID NO: 26至少85%一致之多核苷酸編碼。 在一些實施例中，VH係由與SEQ ID NO: 27至少85%一致之多核苷酸編碼。 在一些實施例中，抗原結合域係由與SEQ ID NO: 28至少80%一致之多核苷酸編碼。 在一些實施例中，抗原結合域係由與SEQ ID NO: 29至少80%一致之多核苷酸編碼。 在一些實施例中，VL CDR1與SEQ ID NO: 4至少90%一致，VL CDR2與SEQ ID NO: 5至少90%一致，且VL CDR3與SEQ ID NO: 6至少90%一致。 在一些實施例中，VH CDR1與SEQ ID NO: 12、15或17至少90%一致，VH CDR2與SEQ ID NO: 13或16至少90%一致，且VH CDR3與SEQ ID NO: 14至少90%一致。 在一些實施例中，VL與SEQ ID NO: 22至少85%一致。 在一些實施例中，VH與SEQ ID NO: 23至少85%一致。 在一些實施例中，抗原結合域與SEQ ID NO: 24至少80%一致。 在一些實施例中，抗原結合域與SEQ ID NO: 25至少80%一致。 在一些實施例中，VL係由與SEQ ID NO: 30至少85%一致之多核苷酸編碼。 在一些實施例中，VH係由與SEQ ID NO: 31至少85%一致之多核苷酸編碼。 在一些實施例中，抗原結合域係由與SEQ ID NO: 32至少80%一致之多核苷酸編碼。 在一些實施例中，抗原結合域係由與SEQ ID NO: 33至少80%一致之多核苷酸編碼。 在一些實施例中，CAR在域之間包括連接體。在一些實施例中，連接體係GGGGS、GSG或AAA。在一些實施例中，連接體包括GGGGS、GSG或AAA之連續重複單元。在一些實施例中，連接體包括GGGGS、GSG或AAA之兩個或更多個連續重複單元。在一些實施例中，連接體包括GGGGS、GSG或AAA三個、四個或五個連續重複單元。可用於各個實施例中之代表性連接體序列之表格如下： 在一些實施例中，在活化域與共刺激域之間存在鉸鏈域。在一些實施例中，CAR包括位於抗原結合域與鉸鏈域之間之連接體。 在一些實施例中，共刺激域及鉸鏈域包括單一鄰接域。 本發明之另一態樣係包括上述實施例之多核苷酸之載體。 在一些實施例中，載體係腺病毒載體、腺病毒相關載體、DNA載體、慢病毒載體、質體、逆轉錄病毒載體或RNA載體。 在一些實施例中，載體係逆轉錄病毒載體(例如慢病毒載體)。 本發明之又一態樣係由上述實施例之多核苷酸或上述實施例之載體編碼之嵌合抗原受體(CAR)。 在另一態樣中，本發明係包括上述實施例之多核苷酸、上述實施例之載體或上述實施例嵌合抗原受體(CAR)之細胞。 在一些實施例中，細胞係T細胞，例如同種異體T細胞、自體T細胞、經改造自體T細胞(eACT™)或腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。在一些實施例中，T細胞係CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。 在一些實施例中，細胞係活體外細胞。 在一些實施例中，T細胞係自體T細胞。 在一些實施例中，細胞在由MART-1活化時至少產生干擾素γ (IFNγ)。 本發明之一態樣係包括上述實施例之複數個細胞之組合物。 在一些實施例中，組合物包括CD4+或CD8+細胞(例如CD4+及CD8+細胞)。 在一些實施例中，複數個細胞中之每一細胞係自體T細胞。 在一些實施例中，組合物包括至少一種醫藥上可接受之賦形劑。 本發明之另一態樣係包括上述實施例之多核苷酸、上述實施例之載體或上述實施例之嵌合抗原受體(CAR)之組合物。 本發明之又一態樣係製造表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞之方法，其包括使用上述實施例之多核苷酸或上述實施例之載體轉導細胞之步驟。 在一些實施例中，細胞係自需要治療之患者分離之淋巴球，例如天然殺手細胞、T細胞或B細胞。 在一些實施例中，該方法進一步包括在促進細胞增殖及/或T細胞活化之條件下培養細胞之步驟。 在一些實施例中，該方法進一步包括(例如)在培養約6天之後分離期望T細胞之步驟。 在一些實施例中，期望T細胞表現CD4+及/或CD8+。 在另一態樣中，本發明係治療黑色素瘤之方法，其包括向有需要之個體投與上述實施例之細胞或上述實施例之組合物。 在又一態樣中，本發明係治療黑色素瘤之方法，其包括向有需要之個體投與表現特異性靶向MART-1之嵌合抗原受體(CAR)之細胞。 在一些實施例中，CAR包括至少抗原結合域、活化域及共刺激域，其中該抗原結合域特異性結合至MART-1。 在一些實施例中，抗原結合域特異性結合至MART-1之細胞外表位。 在一些實施例中，抗原結合域係IgG、Fab、Fab′、F(ab′)₂ 、Fv、scFv或單域抗體(dAB)、自其獲得或衍生。 在一些實施例中，抗原結合域係scFv、自其獲得或衍生。 在一些實施例中，scFv包括至少輕鏈可變(VL)區及至少重鏈可變(VH)區。 在一些實施例中，VH區係N-末端連接至VL區或VL區係N-末端連接至VH區。 在一些實施例中，CAR在域之間包括連接體。在一些實施例中，連接體係GGGGS、GSG或AAA。在一些實施例中，連接體包括GGGGS、GSG或AAA之連續重複單元。在一些實施例中，連接體包括GGGGS、GSG或AAA之兩個或更多個連續重複單元。在一些實施例中，連接體包括GGGGS、GSG或AAA之三個、四個或五個連續重複單元及表1中所揭示之其他實施例。在一些實施例中，可在活化域與共刺激域之間存在鉸鏈域。在一些實施例中，CAR包括位於抗原結合域與鉸鏈域之間之連接體。 在一些實施例中，共刺激域及鉸鏈域包括單一鄰接域。 在一些實施例中，細胞係T細胞，例如同種異體T細胞、自體T細胞、經改造自體T細胞(eACT)或腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。 在一些實施例中，T細胞係CD4+ T細胞。 在一些實施例中，T細胞係CD8+ T細胞。 在一些實施例中，細胞係活體外細胞。 在一些實施例中，T細胞係自體T細胞。 在一些實施例中，T細胞在由MART-1活化時至少產生干擾素γ (IFNγ)。 通常，本發明係關於經改造自體細胞療法(縮寫為「eACT™」，亦稱為接受性細胞轉移)。eACT™係收集患者之自有T細胞且隨後基因改造以識別且靶向一或多種表現於一或多種特異性腫瘤細胞或惡性腫瘤之細胞表面上之抗原的過程。參見圖1A、圖1B及圖2。可改造T細胞以表現(例如)嵌合抗原受體(CAR)。CAR陽性(CAR+) T細胞經改造以表現CAR。CAR可包括(例如)對特定腫瘤抗原具有特異性之細胞外單鏈可變片段(scFv)，該片段直接或間接連接至包括至少一個共刺激域之細胞內信號傳導部分，該共刺激域直接或間接連接至至少一個活化域；該等組分可以任何順序進行配置。共刺激域可衍生自(例如) CD28，且活化域可衍生自(例如)任何形式之CD3-ζ。在一些實施例中，CAR經設計以具有兩種、三個、四個或更多個共刺激域。在一些實施例中，改造CAR，從而使共刺激域表現為單獨多肽鏈。CAR T細胞療法及構築體之實例闡述於以下文獻中：美國專利公開案第2013/0287748號、第2014/0227237號、第2014/0099309號及第2014/0050708號；國際專利公開案第WO2012033885號、第WO2012079000號、第WO2014127261號、第WO2014186469號、第WO2015080981號、第WO2015142675號、第WO2016044745號及第WO2016090369號；及Sadelain等人，Cancer Discovery , 3: 388-398 (2013)，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。 本文所闡述之任一態樣或實施例可與如本文所揭示之任一其他態樣或實施例進行組合。儘管已結合詳細說明闡述本發明，但前述說明意欲闡釋本發明且不限制本發明範圍，本發明範圍係藉由隨附申請專利範圍來界定。其他態樣、優點及修改皆在下列申請專利範圍之範圍內。 本文所提及之專利及科學文獻確立了熟習此項技術者可利用之知識。本文所引用之所有美國專利及公開或未公開美國專利申請案皆以引用方式併入本文中。本文所引用之所有公開外來專利及專利申請案皆以引用方式併入本文中。本文所引用之所有其他公開參考文獻、字典、文件、原稿及科學文獻皆以引用方式併入本文中。 自圖式及下文實施方式(包含實例)及申請專利範圍可明瞭本發明之其他特徵及優點。

相關申請案之交叉參考 本申請案主張2017年3月13日提出申請之美國臨時專利申請案第62/470,703號及2018年2月16日提出申請之美國臨時專利申請案第62/710,561號之優先權，該等美國臨時專利申請案中之每一者之全部內容皆以引用方式併入本文中。序列表 本申請案含有以紙印式提交之序列表且其全部內容以引用方式併入本文中。定義 為更容易地理解本發明，首先在下文定義某些術語。下列術語及其他術語之其他定義陳述於整個說明書中。 除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a、an)」及「該」包含複數個指示物。 除非上下文明確陳述或自上下文可明瞭，否則如本文中所使用，術語「或」應理解為具有囊括性且涵蓋「或」及「及」。 本文所用之術語「及/或」應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中之每一者且含有或不含另一者。因此，如本文在片語(例如「A及/或B」)中所使用，術語「及/或」意欲包含A及B；A或B；A (單獨)；及B (單獨)。同樣，如在片語(例如「A、B及/或C」)中所使用，術語「及/或」意欲涵蓋下列態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。 如本文中所使用，術語「例如」及「亦即」僅用於舉例而並不意欲加以限制，且不應解釋為僅提及彼等明確列舉於說明書中之項目。 術語「或更多」、「至少」、「多於」及諸如此類(例如「至少一種」)應理解為包含(但不限於)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000個或更多個所陳述值。亦包含其間之任一較大數值或分數。 與之相反，術語「不大於」包含每一小於所陳述值之值。舉例而言，「不大於100種核苷酸」包含100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1及0種核苷酸。亦包含其間之任一較小數值或分數。 術語「複數個」、「至少兩個」、「兩個或更多個」、「至少第二」及諸如此類應理解為包含(但不限於)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000個或更多個。亦包含其間之任一較大數值或分數。 在說明書通篇中，詞語「包括(comprising)」或其變化形式(例如「包括(comprises)」或「包括(comprising)」)應理解為暗示納入所陳述要素、整數或步驟或要素、整數或步驟之群，但並不排除任何其他要素、整數或步驟或要素、整數或步驟之群。應理解，不論本文中在哪裡以言語「包括」闡述態樣，亦提供以「由……組成」及/或「基本上由……組成」闡述之其他類似態樣。 除非具體陳述或自上下文可明瞭，否則如本文中所使用，術語「約」係指在特定值或組成之可接受誤差範圍(如由熟習此項技術者所確定)內之值或組成，其部分地取決於如何量測或測定該值或組成(亦即量測系統之限制)。舉例而言，「約」或「基本上包括」可意指根據業內實踐在一或多個標准偏差內。「約」或「基本上包括」可意指最高10%之範圍(亦即±10%)。因此，「約」可理解為在大於或小於所陳述值10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或0.001%內。舉例而言，約5 mg可包含介於4.5 mg與5.5 mg之間之任一量。另外，尤其對於生物系統或製程而言，該等術語可意指最高一個數量級或最高為某一值之5倍。在本發明中提供特定值或組成時，除非另外陳述，否則「約」或「基本上包括」之含義應假設在該特定值或組成之可接受誤差範圍內。 如本文所闡述，除非另外指示，否則任一濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包含於所列舉範圍及(在適當時)其分數部分(例如整數之十分之一及百分之一)內之任一整數值。 本文所用之單位、前綴及符號係以其國際單位製(Système International de Unites，SI)接受形式來提供。數值範圍包含界定該範圍之數字。 除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本揭示內容所屬領域技術者通常所理解相同之意義。舉例而言，「The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology」，第2版，(2001), CRC Press；「The Dictionary of Cell & Molecular Biology」，第5版，(2013), Academic Press；及「The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology」, Cammack等人編輯，第2版，(2006), Oxford University Press向熟習此項技術者提供本發明中所使用許多術語之一般性字典。 「抗原」係指激起免疫反應或能夠由抗體、其抗體片段或抗原結合域結合之任何分子。熟習此項技術者將易於理解，包含幾乎所有蛋白質或肽之任何大分子皆可用作抗原。通常，抗原可內源性表現(亦即由基因體DNA表現)，或其可以重組方式表現，或其可以化學方式合成。抗原可對某些組織(例如癌細胞，例如黑色素瘤)具有特異性，或其可廣泛表現。另外，較大分子之片段可用作抗原。在一些實施例中，抗原係腫瘤抗原。在一些實施例中，抗原係MART-1。 如本文中所使用，術語「MART-1」 (其係「由T細胞識別之黑色素瘤抗原1」之首字母縮略詞)係由MLANA 或MELAN-A 基因(「黑色素細胞抗原」之縮寫)編碼之人類蛋白質。MART-1亦稱為MLANA、MART1、黑色素-A、MLANA、抗原LB39-AA、抗原SK29-AA及蛋白質Melan-A。MART-1係由118個胺基酸組成且具有單一跨膜域之假定18 kDa蛋白質。MART-1表現對色素產生細胞具有特異性，該等細胞發現於正常皮膚及視網膜內之黑色素細胞中，但並未發現於其他正常組織中。其係黑色素細胞腫瘤(例如黑色素瘤)之有用標記。MART-1包括跨膜域(包含胺基酸殘基編號27至編號47)及胞質域(包含胺基酸殘基編號48至118)。先前已提出MART-1在黑色素體生物合成期間輸送穿過血漿膜(例如參見Chen等人，JBC , 287(29): 24082-91 (2012))；然而，在文獻中尚未表徵呈現於細胞表面上之表位。 術語「抗體」 (Ab)包含(但不限於)特異性結合至抗原之醣蛋白免疫球蛋白。一般而言，抗體可包括藉由二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈或其抗原結合域。每一H鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括以下三個恆定域：CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個恆定域CL。可將VH及VL區進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及更保守之區域(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。VH及VL各自包括3個CDR及4個FR，該等區域自胺基末端至羧基末端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。Ab之恆定區可調介免疫球蛋白至宿主組織或因子(包含免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q))之結合。 抗體可包含(例如)天然及非天然(重組產生)抗體、人類、人類化及非人類抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包含雙特異性抗體)、免疫球蛋白、合成抗體、包括兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚體抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、胞內抗體(例如參見Stocks, (2004)Drug Discovery Today 9(22):960-66)、異源偶聯抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈FV (scFv)、駱駝化抗體、親和抗體、Fab片段、F(ab’)₂ 片段、二硫化物連接之FV (sdFV)、抗獨特型(抗Id)抗體(例如包含抗抗Id抗體)、微小抗體、域抗體、合成抗體(有時在本文中稱為「抗體模擬物」)及其抗原結合片段。術語「抗體」包含單株抗體及多株抗體。 任一抗體、其片段或衍生自抗體且能夠識別並結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之胺基酸序列可用於本發明中。抗體可並非自市面購得或自市面購得。市售抗MART-1之實例抗體包含(但不限於) 「A103」小鼠單株抗體(如US 5674749中所闡述)；「M2-72C10」小鼠單株抗體(例如Covance目錄編號：SIG-38160)；「M2-9E3」小鼠單株抗體(例如Covance目錄編號：SIG-38165)；及「EP1422Y」兔單株抗體(例如Epitomics目錄編號：1989-1)。其他市售MART-1抗體亦可用於本發明中。例如參見全球資訊網(World Wide Web，www)之antibodies-online.com。 「衍生自抗體之胺基酸序列」可以物理方式衍生(例如表現)自編碼抗體之多核苷酸之片段，或可以電腦方式衍生，舉例而言，使用經測定編碼抗體(或其片段)之核苷酸序列合成人工多核苷酸序列(或片段)且使人工多核苷酸序列表現為抗體或其片段。 術語「MART-1之細胞外域」係指MART-1多肽中呈現於細胞外部之部分，該部分能夠由本發明之嵌合抗原受體(CAR)識別且結合。在一些實施例中，「MART-1之細胞外域」可為MART-1多肽之N-末端部分。在一些實施例中，「MART-1之細胞外域」可為MART-1多肽之C-末端部分。類似地，「在細胞外表面上表現MART-1」之細胞包括MART-1多肽中呈現於細胞外部表面上之部分，該部分能夠由本發明之嵌合抗原受體(CAR)識別且結合，不論呈遞由本文所闡述CAR靶向之特異性表位之輸送方式如何。 如本文中所使用，「M1」及「M2」包括自藉由「EP1422Y」雜交瘤合成之兔單株抗體獲得或修飾之抗原結合域序列或其片段。 如本文中所使用，「M7」、「M8」及「M9」包括自藉由「A103」雜交瘤合成之小鼠單株抗體獲得或修飾之抗原結合域序列或其片段。「M7」及「M8」 CAR具有scFv作為其抗原結合域，而「M9」 CAR具有Fab作為其抗原結合域。 「抗原結合域」、「抗原結合分子」、「抗原結合部分」、「抗體」、「抗體片段」、「抗原結合片段(關於抗體)」係指包括自其衍生分子(或胺基酸序列)之抗體之抗原結合部分(例如CDR)之任何分子。抗原結合域可包含抗原性互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包含(但不限於) Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、scFv抗體及自抗原結合片段形成之多特異性抗體。肽體(亦即包括肽結合域之Fc融合分子)係適宜抗原結合域之另一實例。在一些實施例中，抗原結合域結合至腫瘤細胞上之抗原。在一些實施例中，抗原結合域結合至涉及過度增殖性疾病之細胞上之抗原或結合至病毒或細菌抗原。在一些實施例中，抗原結合域結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)。在一些實施例中，抗原結合域係其抗體片段(包含其一或多個互補決定區(CDR))。 在一些實施例中，抗原結合域可為抗原之天然結合配偶體或天然結合配偶體之片段。此結構包含Pmel17，其係需要結合MART-1以達成適當輸送及功能之黑色素體蛋白。舉例而言，在自然界中，CD27結合CD70 (亦稱為CD27L)；因此，靶向CD70之CAR可包含CD27或其片段作為結合CD70之抗原結合域。 在一些實施例中，抗原結合域包括單鏈可變片段(scFv)。scFv係免疫球蛋白之重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變區之融合蛋白，其由連接體肽(例如約10至約25個胺基酸)連結。連接體通常富含甘胺酸(以獲得撓性)以及絲胺酸或蘇胺酸(以獲得溶解性)。連接體可連結VH之N-末端與VL之C-末端或連結VH之C-末端與VL之N-末端。儘管去除恆定區且引入連接體，但此蛋白質仍保留原始免疫球蛋白之特異性。scFv亦可包含N-末端肽序列，該序列有時稱為「信號肽」或「前導序列」。 抗原結合域係CAR中識別所關注靶(例如在漿膜上表現MART-1之細胞)之組分。如本文中所使用，在本發明CAR之背景中，抗原結合域意指CAR中將CAR引導至期望靶並與該靶締合之任一組分。CAR之抗原結合域組分可包括至少包含由連接體接合之重鏈可變區及輕鏈可變區之scFv。重鏈可變區及輕鏈可變區可衍生自相同抗體或兩種不同抗體。在一些實施例中，CAR中所用之抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 18及19之胺基酸序列之序列對(例如SEQ ID NO: 20及21)或含有SEQ ID NO: 22及23之胺基酸序列之序列對(例如SEQ ID NO: 24及25)。 如本文中所使用，術語「識別」、「結合」、「免疫特異性結合」、「免疫特異性識別」、「特異性結合」及「特異性識別」在抗體及其片段之背景中係類似術語，且係指分子結合至抗原，該結合為熟習此項技術者所理解。 在一些實施例中，特異性結合至抗原(例如MART-1)之抗原結合域以約1 × 10^-7 M之解離常數(K_d )進行結合。在一些實施例中，在K_d 為約1 × 10^-9 M至約5 × 10^-9 M時，抗原結合域以「高親和力」特異性結合抗原(例如MART-1)。在一些實施例中，在K_d 為1 × 10^-10 M至約5 × 10^-10 M時，抗原結合域以「極高親和力」特異性結合抗原(例如MART-1)。 術語「VL」、「VL區」及「VL域」可互換使用且係指抗原結合域(例如抗體或其抗原結合片段)之輕鏈可變區，且包括一個、兩個或所有三個CDR。 術語「VH」、「VH區」及「VH域」可互換使用且係指抗原結合域(例如抗體或其抗原結合片段)之重鏈可變區，且包括一個、兩個或所有三個CDR。 通常使用CDR之以下諸多定義：Kabat編號、Chothia編號、接觸編號、AbM編號或IMGT編號。Kabat編號最為常用，Chothia編號係基於結構且根據環位置來定義CDR，且IMGT編號最外廣泛地覆蓋二個方向上超出環之CDR。 術語「Kabat編號」及類似術語在業內已眾所周知且係指對抗體或其抗原結合域之重鏈及輕鏈可變區中之胺基酸殘基進行編號之系統。在一些態樣中，可根據Kabat編號系統來確定抗體之CDR(例如參見Kabat等人，「Sequences of Proteins of lmmunological Interest」，第5版，NIH公開案91-3242, Bethesda MD 1991)。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置31至35 (其視情況可在位置35後包含一或兩個其他胺基酸，在Kabat編號方案中稱為35A及35B) (CDR1)、胺基酸位置50至65 (CDR2)及胺基酸位置95至102 (CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常存在於胺基酸位置24至34 (CDR1)、胺基酸位置50至56 (CDR2)及胺基酸位置89至97 (CDR3)。 在一些實施例中，可根據Kabat編號方案來闡述本文所闡述抗體之CDR (但其可易於以其他編號系統來解釋)。表1及2提供使用Kabat編號方案之兩種實例性MART-1抗原結合域之CDR：表 1.CDR 表 (Kabat) 表 2.CDR 表 (Kabat) 在一些態樣中，可根據Chothia編號方案來確定抗體之CDR，該方案提及免疫球蛋白結構環之位置(例如參見Chothia C & Lesk AM, (1987),J Mol Biol 196: 901-917；Al-Lazikani B等人(1997)J Mol Biol 273: 927-948；Chothia C等人(1992)J Mol Biol 227: 799-817；Tramontano A等人(1990)J Mol Biol 215(1): 175-82；及美國專利第7,709,226號)。在使用Kabat編號慣例，Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34，Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56，且Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34，Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56，且Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97。在使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-HI環之末端端視環長度在H32與H34之間有所變化(此乃因Kabat編號方案在H35A及H35B處納入插入；若35A及35B皆不存在，則該環止於32；若僅存在35A，則該環止於33；若存在35A及35B，則該環止於34)。 下表3及4提供根據Chothia編號方案確定之兩種實例性MART-1抗原結合域之CDR：表 3.CDR 表 (Chothia) 表 4.CDR 表 (Chothia) IMGT編號方案依賴於可變區結構在物種之間之高度保守性。此編號係在比對5,000個以上之序列之後所確定。其考慮且組合框架(FR)及互補決定區(CDR)之定義、來自X射線繞射研究之結構數據及超變環之表徵。例如參見Lefranc, M.-P.等人，Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)。 下表5及6提供根據IMGT編號方案確定之兩種實例性MART-1抗原結合域之CDR：表 5.CDR 表 (IMGT) 表 6.CDR 表 (IMGT) 使用分子操作環境(Molecular Operating Environment)來鑑別表1至6中所列示之CDR (參見全球資訊網(www )之chemcomp.com/MOE-Molecular_Operating_Environment.htm。 如本文中所使用，術語「淋巴球」意指發現於脊椎動物之免疫系統中之白血細胞。淋巴球包含天然殺手(NK)細胞、T細胞及B細胞。NK細胞係一類細胞毒性(cytotoxic、cell toxic)淋巴球，其代表固有免疫系統之主要組分。NK細胞經由細胞凋亡或程式化細胞死亡過程來抑制腫瘤及由病毒感染之細胞。其稱為「天然殺手」，此乃因其無需活化即可殺死細胞。 T細胞在細胞調介之免疫性中發揮主要作用(不涉及抗體)。T細胞之類型包含：(1)輔助T細胞(例如CD4+細胞)；(2)細胞毒性T細胞(亦稱為TC、細胞毒性T淋巴球、CTL、T-殺手細胞、細胞溶解T細胞、CD8+ T細胞或殺手T細胞)；(3)記憶T細胞，包含：(i)幹細胞樣記憶T_SCM 細胞，如幼稚細胞，其係CD45RO−、CCR7+、CD45RA+、CD62L+ (L-選擇素)、CD27+、CD28+及IL-7Rα+，但其亦表現大量CD95、IL-2Rβ、CXCR3及LFA-1，且展示區別於記憶細胞之諸多功能)；(ii)中央記憶T_CM 細胞，其表現L-選擇素及CCR7，其分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4；及(iii)效應記憶T_EM 細胞，然而，其不表現L-選擇素或CCR7，但產生效應細胞介素(如IFNγ及IL-4))；(4)調控型T細胞(Treg、阻抑T細胞或CD4+CD25+調控型T細胞)；(5)天然殺手T細胞(NKT)； (6) γδ (伽馬德爾塔) T細胞；及(7)黏膜相關非多樣性T細胞(MAIT)。 如本文中所使用，術語「細胞介素」意指由一種細胞因應於接觸特定抗原所釋放之非抗體蛋白，其中該細胞介素與第二細胞相互作用以調介第二細胞中之反應。細胞介素可由細胞內源性表現或投與個體。細胞介素可由免疫細胞(包含巨噬球、B細胞、T細胞及肥大細胞)釋放以傳播免疫反應。細胞介素可誘導接受者細胞中之各種反應。細胞介素可包含穩態細胞介素、趨化介素、促發炎性細胞介素、效應物及急性期蛋白。舉例而言，穩態細胞介素(包含介白素7 (IL-7)及介白素15 (IL-15))可促進免疫細胞存活及增殖，且促發炎性細胞介素可促進發炎性反應。穩態細胞介素之實例包含(但不限於) IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15及干擾素(IFN)γ。促發炎性細胞介素之實例包含(但不限於) IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(FGF) 2、顆粒球巨噬球群落刺激因子(GM-CSF)、可溶性細胞間黏附分子1 (sICAM-1)、可溶性血管黏附分子1 (sVCAM-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長因子(PLGF)。效應物之實例包含(但不限於)顆粒酶A、顆粒酶B、可溶性Fas配體(sFasL)及穿孔素。急性期蛋白之實例包含(但不限於) C-反應蛋白(CRP)及血清類澱粉A (SAA)。 如本文中所使用，術語「基因改造」或「改造」可互換使用且意指修飾細胞基因體之方法，包含(但不限於)缺失編碼或非編碼區或其部分或插入編碼區或其部分。在一些實施例中，經修飾細胞係可自患者或供體獲得之淋巴球(例如T細胞)。細胞可經修飾以表現納入細胞基因體中之外源性構築體，例如嵌合抗原受體(CAR)。 如本文中所使用，術語「轉導(transduction及transduced)」意指經由病毒載體將外來DNA引入細胞中之過程(參見Hartl及Jones (1997)Genetics: Principles and Analysis ，第4版，Jones & Bartlett)。在一些實施例中，載體係逆轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾伯斯坦-巴爾病毒載體(Epstein Barr viral vector)、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體或其任一組合。 如本文中所使用，術語「自體」意指衍生自隨後擬再引入之同一個體之任何材料。舉例而言，經改造自體細胞療法(eACT™，亦稱為接受性細胞轉移)係如下：收集患者之自有T細胞且隨後基因改造以表現多核苷酸(例如編碼識別且靶向一或多種表現於一或多種特異性腫瘤細胞或惡性腫瘤之細胞表面上之抗原之CAR的多核苷酸)，且然後投與回同一患者。涉及eACT™之步驟之簡單匯總可參見圖2。如本文中所使用，術語「同種異體」意指衍生自一個個體且然後引入相同物種之另一個體中之任何材料，例如同種異體T細胞移植。 「投與」係指使用熟習此項技術者已知之各種方法及遞送系統中之任一者將藥劑物理引入至個體中。本發明調配物之實例性投與途徑包含靜脈內、肌內、皮下、腹膜腔內、脊柱或其他非經腸投與途徑(例如藉由注射或輸注)。本文所用之片語「非經腸投與」意指除經腸及局部投與外之投與模式，通常藉由注射，且包含(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜腔內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注，以及活體內電穿孔。投與亦可(例如)實施一次、複數次及/或在一或多個延長時段內實施。 投與本發明組合物或本發明之複數個細胞(其表現經改造CAR)將產生「抗腫瘤效應」或「抗癌效應」。如本文中所使用，術語「抗腫瘤效應」或「抗癌效應」意指可呈現為以下各項生物效應：減小腫瘤體積，減小腫瘤或癌細胞之數量，減小腫瘤細胞或癌細胞增殖，減小轉移數量，延長整體或無進展存活，延長預期壽命，或改善與腫瘤或癌症有關之各種生理學症狀。 如本文中所使用，術語治療劑(例如本發明組合物或本發明之複數個細胞(其表現經改造CAR))之「治療有效量」、「有效劑量」、「有效量」及「治療有效劑量」可互換使用且意指在單獨或與另一治療劑組合使用時會提供「抗腫瘤效應」或「抗癌效應」之任何量。 可使用熟練從業者已知之各種方法(例如在臨床試驗期間於人類個體中、在預測於人類中之效能之動物模型系統中或藉由在活體外分析中分析藥劑之活性)來評估本文所用之治療劑提供「抗腫瘤效應」或「抗癌效應」之能力。「抗腫瘤效應」或「抗癌效應」與術語「治療(treatment)」個體及「治療(treating)」個體同義。 如本文中所使用，術語「免疫反應」意指免疫系統之細胞(例如T淋巴球、B淋巴球、天然殺手(NK)細胞、巨噬球、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性球)及由該等細胞中之任一者或肝臟產生之可溶性大分子(包含抗體、細胞介素及補體)之作用，該作用導致選擇性靶向、結合、損傷、破壞及/或自脊椎動物身體消除侵襲性病原體、感染病原體之細胞或組織、癌性或其他異常細胞或(在自體免疫性或病理性發炎之情形下)正常人類細胞或組織。 如本文中所使用，術語「免疫療法」意指藉由包括誘導、增強、阻抑或以其他方式改良免疫反應之方法治療患有疾病或處於感染或患有疾病之復發之風險的個體。免疫療法之實例包含(但不限於) T細胞療法。T細胞療法可包含接受性T細胞療法、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)免疫療法、自體細胞療法、經改造自體細胞療法(eACT™)及同種異體T細胞移植。熟習此項技術者將認識到，本發明之處理方法將增強任何經移植T細胞療法之有效性。T細胞療法之實例闡述於以下文獻中：美國專利公開案第2014/0154228號、美國專利第5,728,388號、第6,406,699號及第8,119,772號、國際公開案第WO 2008/081035號；Chodon等人，Clinical Cancer Research , 20(9): 2457-65 (2014)；及Johnson等人，Blood , 114(2): 535-46 (2009)，每一者之全部內容以引用方式併入本文中。 免疫療法之T細胞可來自任何來源。舉例而言，可在活體外自幹細胞群體分化T細胞，或可自個體獲得T細胞。T細胞亦可自(例如)外周血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜滲出液、脾組織及腫瘤獲得。另外，T細胞可衍生自一或多種可用T細胞系。亦可自使用熟習此項技術者已知之任何技術(例如FICOLL™分離及/或血球分離)自個體收集之血液單元來獲得T細胞。分離用於T細胞療法之T細胞之其他方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號中，該公開案之全部內容以引用方式併入本文中。 如本文中所使用，「表位」係業內術語且係指抗原中抗原結合蛋白、抗原結合域、scFv或抗體可特異性結合之局部化區域。表位可為(例如)多肽之鄰接胺基酸(線性或鄰接表位)或表位可(例如)一起來自一或多個多肽之兩個或更多個非鄰接區域(構形、非線性、非連續或非鄰接表位)。在某些實施例中，抗原結合蛋白、抗原結合域、scFv或抗體所結合之表位可藉由(例如)以下技術來測定：NMR光譜術、X射線繞射結晶學研究、ELISA分析、氫/氘交換+質譜(例如液相層析電噴霧質譜)、基於陣列之寡肽掃描分析及/或誘變定位(例如定點誘變定位)。對於X射線結晶學而言，可使用業內已知之任一方法來達成結晶(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350；McPherson, (1990)Eur J Biochem 189: 1-23；Chayen, (1997)Structure 5: 1269-1274；McPherson, (1976)J Biol Chem 251: 6300-6303)。可使用熟知X射線繞射技術研究抗體:抗原晶體且可使用諸如以下等電腦軟體細化：X-PLOR (Yale University, 1992，由Molecular Simulations, Inc.分發；例如參見Meth Enzymol (1985)，第114及115卷，Wyckoff等人編輯)及BUSTER (Bricogne, (1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60；Bricogne, (1997)Meth Enzymol 276A: 361-423，Carter編輯；Roversi等人(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)。可使用熟習此項技術者已知之任何方法來達成誘變定位研究。例如參見Champe等人(1995)J Biol Chem 270: 1388-94及Cunningham & Wells, (1989)Science 244: 1081-85，其闡述誘變技術，包含丙胺酸及精胺酸掃描誘變技術。 本發明提供包括特異性結合MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域之嵌合抗原受體(CAR)。本發明另外提供編碼該等CAR之多核苷酸。本發明亦提供包括該等多核苷酸之載體(例如病毒載體)。本發明另外提供包括該等多核苷酸及/或經該等病毒載體轉導之經改造細胞(例如T細胞)。本發明提供包含複數個經改造T細胞之組合物(例如醫藥組合物)。另外，本發明提供製造該等經改造T細胞及組合物之方法及該等經改造T細胞及組合物之用途(例如用於治療黑色素瘤)。I. 嵌合抗原受體 (CAR) 本發明係關於包括特異性結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域(例如scFv)之嵌合抗原受體(CAR)及包括特異性結合至MART-1之抗原結合域的經改造T細胞。在一些實施例中，本發明之抗原結合域係衍生自抗體(例如A103雜交瘤及EP1422Y雜交瘤之抗體)之scFv。可使用針對MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之其他抗體。 在製造表現CAR之細胞中所實施之步驟展示於圖1A中且CAR殺死其靶細胞之步驟展示於圖1B中。 本發明抗MART-1 CAR包括特異性結合至MART-1之抗原結合域。在一些實施例中，抗MART-1 CAR進一步包括共刺激域及/或細胞外域(亦即「鉸鏈」區或「間隔」區)及/或跨膜域及/或細胞內(信號轉導)域及/或CD3ζ活化域。在一些實施例中，抗MART-1 CAR包括特異性結合MART-1之scFv抗原結合域、共刺激域、細胞外域、跨膜域及CD3ζ活化域。 進一步應瞭解，若期望，則本文所闡述之各種域及區域可表現於來自抗原結合域(例如scFv)及活化域之各別鏈中，呈所謂「反式」構形。因此，在一個實施例中，活化域可表現於一條鏈上，而抗原結合域及/或細胞外域及/或跨膜域及/或共刺激域(視CAR之期望構造而定)可表現於各別鏈上。 如本文中較完整闡述，進一步應瞭解，自N端至C端，或自細胞外至細胞內,本發明CAR之組分順序可視需要變化。抗原結合域(scFv)位於細胞外以與靶抗原締合，且可在scFv中最遠離細胞膜之N端包含前導肽或信號肽。 本發明CAR之實例性定向及排序係：可選「信號肽」或「前導序列」 (例如CD8a之前導序列)--抗MART-1 scFv--可選微連接體(例如GGGGS、GSG或AAA)-鉸鏈--可選微連接體(例如GGGGS、GSG或AAA)-跨膜區(例如CD8a跨膜區)--可選微連接體(例如GGGGS、GSG或AAA)-共刺激區(例如CD28或4-1BB之子序列)--可選微連接體(例如GGGGS、GSG或AAA)-活化域(例如CD3ζ域，例如本文所提供域中之一者)。在一些實施例中，CAR包括短多肽微連接體之連續重複單元。在一些實施例中，CAR包括微連接體之2、3、4或5個連續重複單元。 本發明CAR之另一實例性定向及排序包括兩個共刺激域且係：可選前導序列(例如CD8a之前導序列)--抗MART-1 scFv--可選微連接體(例如GGGGS、GSG、EAAAK或AAA)-鉸鏈--可選微連接體(例如GGGGS、GSG或AAA)-跨膜區(例如CD8a跨膜區)--可選微連接體(例如GGGGS、GSG、EAAK或AAA)-共刺激區(例如CD28或4-1BB之子序列)--共刺激區(例如CD28或4-1BB之子序列)--可選微連接體(例如GGGGS、GSG或AAA)-活化域(例如CD3ζ域，例如本文所提供域中之一者)。在一些實施例中，CAR包括短多肽微連接體之連續重複單元。在一些實施例中，CAR包括微連接體之2、3、4或5個連續重複單元。II. M7 及 M8 CAR 如上文所提及，「M7」及「M8」序列包括自衍生自「A103」雜交瘤之小鼠單株抗體獲得或修飾之抗原結合域序列或其片段。用於A103雜交瘤之CDR展示於上表1、3及5中。M7及M8 CAR胺基酸序列各自包括類似於scFv (其中其包含由連接體分隔之VH及VL域)之抗原結合域。在M7 CAR胺基酸序列中，VH胺基酸序列位於VL胺基酸序列之前(N-末端連接)。與之相反，在M8 CAR胺基酸序列中，VL胺基酸序列位於VH胺基酸序列之前(N-末端連接)。 本發明之抗原結合域包括由下列可變(VL及VH) DNA序列中之一者編碼之下列可變(VL及VH)胺基酸序列中之一者；本發明CAR包括由下列CAR DNA序列中之一者編碼之下列CAR胺基酸序列中之一者： A103雜交瘤M7/M8 VL胺基酸序列： DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGIHNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 18) A103雜交瘤M7/M8 VH胺基酸序列： QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMNVGWIRQPSGKGLDWLAHIWWNDDKYYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVVTADTATYYCVRSYFGDYVWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 19) A103雜交瘤M7 CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMNVGWIRQPSGKGLDWLAHIWWNDDKYYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVVTADTATYYCVRSYFGDYVWYFDVWGAGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGIHNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKRAAALDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 20) A103雜交瘤M8 CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGIHNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMNVGWIRQPSGKGLDWLAHIWWNDDKYYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVVTADTATYYCVRSYFGDYVWYFDVWGAGTTVTVSSAAALDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 21) M7a CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMNVGWIRQPSGKGLDWLAHIWWNDDKYYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVVTADTATYYCVRSYFGDYVWYFDVWGAGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGIHNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKRGGGGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 61) M7b CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMNVGWIRQPSGKGLDWLAHIWWNDDKYYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVVTADTATYYCVRSYFGDYVWYFDVWGAGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGIHNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 63) M7c CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMNVGWIRQPSGKGLDWLAHIWWNDDKYYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVVTADTATYYCVRSYFGDYVWYFDVWGAGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGIHNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 65) M8a CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGIHNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMNVGWIRQPSGKGLDWLAHIWWNDDKYYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVVTADTATYYCVRSYFGDYVWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 67) M8b CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGIHNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMNVGWIRQPSGKGLDWLAHIWWNDDKYYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVVTADTATYYCVRSYFGDYVWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 69) M8c CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGIHNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYFCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMNVGWIRQPSGKGLDWLAHIWWNDDKYYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVVTADTATYYCVRSYFGDYVWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 71) A103雜交瘤M7/M8 VL DNA序列： GACATACAAATGACCCAGACAACGTCAAGTCTGTCTGCGTCCTTGGGGGACAGGGTCACTATTTCTTGCTCCGCGAGTCAAGGGATACACAATTATCTTAATTGGTACCAACAGAAGCCGGACGGCACTGTCAAATTGTTGATATACTACACCAGCAGCCTTCACTCAGGAGTTCCCTCCCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACGGATTACAGCCTTACAATCTCTAATCTGGAGCCTGAGGACATTGCAACATATTTTTGCCAGCAATATAGTAAGCTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGG (SEQ ID NO: 26) A103雜交瘤M7/M8 VH DNA序列： CAGGTTACCTTGAAGGAAAGCGGTCCTGGTATCCTTCAGCCATCCCAGACTCTCAGCTTGACGTGCTCTTTTTCCGGATTCTCCTTGAACACGAGCGGTATGAATGTTGGATGGATTAGACAGCCTTCCGGTAAAGGGCTGGACTGGTTGGCGCACATATGGTGGAATGACGATAAGTATTACAATCCTGCGCTGAAAAGTAGGTTGACTATATCTAAGGACACATCTAATAACCAGGTATTCCTGAAAATAGCATCAGTCGTAACGGCCGATACTGCGACTTATTACTGTGTCCGATCTTATTTTGGGGATTATGTCTGGTATTTTGATGTTTGGGGAGCTGGGACCACGGTCACAGTGTCAAGC (SEQ ID NO: 27) A103雜交瘤M8 DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGGACATACAAATGACCCAGACAACGTCAAGTCTGTCTGCGTCCTTGGGGGACAGGGTCACTATTTCTTGCTCCGCGAGTCAAGGGATACACAATTATCTTAATTGGTACCAACAGAAGCCGGACGGCACTGTCAAATTGTTGATATACTACACCAGCAGCCTTCACTCAGGAGTTCCCTCCCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACGGATTACAGCCTTACAATCTCTAATCTGGAGCCTGAGGACATTGCAACATATTTTTGCCAGCAATATAGTAAGCTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGGGGGAGTACGTCCGGCTCAGGTAAACCTGGAAGTGGGGAAGGATCAACGAAAGGCCAGGTTACCTTGAAGGAAAGCGGTCCTGGTATCCTTCAGCCATCCCAGACTCTCAGCTTGACGTGCTCTTTTTCCGGATTCTCCTTGAACACGAGCGGTATGAATGTTGGATGGATTAGACAGCCTTCCGGTAAAGGGCTGGACTGGTTGGCGCACATATGGTGGAATGACGATAAGTATTACAATCCTGCGCTGAAAAGTAGGTTGACTATATCTAAGGACACATCTAATAACCAGGTATTCCTGAAAATAGCATCAGTCGTAACGGCCGATACTGCGACTTATTACTGTGTCCGATCTTATTTTGGGGATTATGTCTGGTATTTTGATGTTTGGGGAGCTGGGACCACGGTCACAGTGTCAAGCGCCGCTGCCCTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG (SEQ ID NO: 29) A103雜交瘤M7 DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGCAGGTTACCTTGAAGGAAAGCGGTCCTGGTATCCTTCAGCCATCCCAGACTCTCAGCTTGACGTGCTCTTTTTCCGGATTCTCCTTGAACACGAGCGGTATGAATGTTGGATGGATTAGACAGCCTTCCGGTAAAGGGCTGGACTGGTTGGCGCACATATGGTGGAATGACGATAAGTATTACAATCCTGCGCTGAAAAGTAGGTTGACTATATCTAAGGACACATCTAATAACCAGGTATTCCTGAAAATAGCATCAGTCGTAACGGCCGATACTGCGACTTATTACTGTGTCCGATCTTATTTTGGGGATTATGTCTGGTATTTTGATGTTTGGGGAGCTGGGACCACGGTCACAGTGTCAAGCGGGAGTACGTCCGGCTCAGGTAAACCTGGAAGTGGGGAAGGATCAACGAAAGGCGACATACAAATGACCCAGACAACGTCAAGTCTGTCTGCGTCCTTGGGGGACAGGGTCACTATTTCTTGCTCCGCGAGTCAAGGGATACACAATTATCTTAATTGGTACCAACAGAAGCCGGACGGCACTGTCAAATTGTTGATATACTACACCAGCAGCCTTCACTCAGGAGTTCCCTCCCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACGGATTACAGCCTTACAATCTCTAATCTGGAGCCTGAGGACATTGCAACATATTTTTGCCAGCAATATAGTAAGCTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGGGCCGCTGCCCTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG (SEQ ID NO: 28) M7a DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGCAGGTTACCTTGAAGGAAAGCGGTCCTGGTATCCTTCAGCCATCCCAGACTCTCAGCTTGACGTGCTCTTTTTCCGGATTCTCCTTGAACACGAGCGGTATGAATGTTGGATGGATTAGACAGCCTTCCGGTAAAGGGCTGGACTGGTTGGCGCACATATGGTGGAATGACGATAAGTATTACAATCCTGCGCTGAAAAGTAGGTTGACTATATCTAAGGACACATCTAATAACCAGGTATTCCTGAAAATAGCATCAGTCGTAACGGCCGATACTGCGACTTATTACTGTGTCCGATCTTATTTTGGGGATTATGTCTGGTATTTTGATGTTTGGGGAGCTGGGACCACGGTCACAGTGTCAAGCGGGAGTACGTCCGGCTCAGGTAAACCTGGAAGTGGGGAAGGATCAACGAAAGGCGACATACAAATGACCCAGACAACGTCAAGTCTGTCTGCGTCCTTGGGGGACAGGGTCACTATTTCTTGCTCCGCGAGTCAAGGGATACACAATTATCTTAATTGGTACCAACAGAAGCCGGACGGCACTGTCAAATTGTTGATATACTACACCAGCAGCCTTCACTCAGGAGTTCCCTCCCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACGGATTACAGCCTTACAATCTCTAATCTGGAGCCTGAGGACATTGCAACATATTTTTGCCAGCAATATAGTAAGCTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGGGGAGGGGGTGGAAGTCTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGGTAA (SEQ ID NO: 60) M7b DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGCAGGTTACCTTGAAGGAAAGCGGTCCTGGTATCCTTCAGCCATCCCAGACTCTCAGCTTGACGTGCTCTTTTTCCGGATTCTCCTTGAACACGAGCGGTATGAATGTTGGATGGATTAGACAGCCTTCCGGTAAAGGGCTGGACTGGTTGGCGCACATATGGTGGAATGACGATAAGTATTACAATCCTGCGCTGAAAAGTAGGTTGACTATATCTAAGGACACATCTAATAACCAGGTATTCCTGAAAATAGCATCAGTCGTAACGGCCGATACTGCGACTTATTACTGTGTCCGATCTTATTTTGGGGATTATGTCTGGTATTTTGATGTTTGGGGAGCTGGGACCACGGTCACAGTGTCAAGCGGGAGTACGTCCGGCTCAGGTAAACCTGGAAGTGGGGAAGGATCAACGAAAGGCGACATACAAATGACCCAGACAACGTCAAGTCTGTCTGCGTCCTTGGGGGACAGGGTCACTATTTCTTGCTCCGCGAGTCAAGGGATACACAATTATCTTAATTGGTACCAACAGAAGCCGGACGGCACTGTCAAATTGTTGATATACTACACCAGCAGCCTTCACTCAGGAGTTCCCTCCCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACGGATTACAGCCTTACAATCTCTAATCTGGAGCCTGAGGACATTGCAACATATTTTTGCCAGCAATATAGTAAGCTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGGGGAGGGGGTGGAAGTGGGGGCGGTGGCAGCCTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGGTAA (SEQ ID NO: 62) M7c DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGCAGGTTACCTTGAAGGAAAGCGGTCCTGGTATCCTTCAGCCATCCCAGACTCTCAGCTTGACGTGCTCTTTTTCCGGATTCTCCTTGAACACGAGCGGTATGAATGTTGGATGGATTAGACAGCCTTCCGGTAAAGGGCTGGACTGGTTGGCGCACATATGGTGGAATGACGATAAGTATTACAATCCTGCGCTGAAAAGTAGGTTGACTATATCTAAGGACACATCTAATAACCAGGTATTCCTGAAAATAGCATCAGTCGTAACGGCCGATACTGCGACTTATTACTGTGTCCGATCTTATTTTGGGGATTATGTCTGGTATTTTGATGTTTGGGGAGCTGGGACCACGGTCACAGTGTCAAGCGGGAGTACGTCCGGCTCAGGTAAACCTGGAAGTGGGGAAGGATCAACGAAAGGCGACATACAAATGACCCAGACAACGTCAAGTCTGTCTGCGTCCTTGGGGGACAGGGTCACTATTTCTTGCTCCGCGAGTCAAGGGATACACAATTATCTTAATTGGTACCAACAGAAGCCGGACGGCACTGTCAAATTGTTGATATACTACACCAGCAGCCTTCACTCAGGAGTTCCCTCCCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACGGATTACAGCCTTACAATCTCTAATCTGGAGCCTGAGGACATTGCAACATATTTTTGCCAGCAATATAGTAAGCTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGGGGAGGGGGTGGAAGTGGGGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGCAGTCTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGGTAA (SEQ ID NO: 64) M8a DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGGACATACAAATGACCCAGACAACGTCAAGTCTGTCTGCGTCCTTGGGGGACAGGGTCACTATTTCTTGCTCCGCGAGTCAAGGGATACACAATTATCTTAATTGGTACCAACAGAAGCCGGACGGCACTGTCAAATTGTTGATATACTACACCAGCAGCCTTCACTCAGGAGTTCCCTCCCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACGGATTACAGCCTTACAATCTCTAATCTGGAGCCTGAGGACATTGCAACATATTTTTGCCAGCAATATAGTAAGCTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGGGGGAGTACGTCCGGCTCAGGTAAACCTGGAAGTGGGGAAGGATCAACGAAAGGCCAGGTTACCTTGAAGGAAAGCGGTCCTGGTATCCTTCAGCCATCCCAGACTCTCAGCTTGACGTGCTCTTTTTCCGGATTCTCCTTGAACACGAGCGGTATGAATGTTGGATGGATTAGACAGCCTTCCGGTAAAGGGCTGGACTGGTTGGCGCACATATGGTGGAATGACGATAAGTATTACAATCCTGCGCTGAAAAGTAGGTTGACTATATCTAAGGACACATCTAATAACCAGGTATTCCTGAAAATAGCATCAGTCGTAACGGCCGATACTGCGACTTATTACTGTGTCCGATCTTATTTTGGGGATTATGTCTGGTATTTTGATGTTTGGGGAGCTGGGACCACGGTCACAGTGTCAAGCGGAGGGGGTGGAAGTCTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGGTAA (SEQ ID NO: 66) M8b DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGGACATACAAATGACCCAGACAACGTCAAGTCTGTCTGCGTCCTTGGGGGACAGGGTCACTATTTCTTGCTCCGCGAGTCAAGGGATACACAATTATCTTAATTGGTACCAACAGAAGCCGGACGGCACTGTCAAATTGTTGATATACTACACCAGCAGCCTTCACTCAGGAGTTCCCTCCCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACGGATTACAGCCTTACAATCTCTAATCTGGAGCCTGAGGACATTGCAACATATTTTTGCCAGCAATATAGTAAGCTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGGGGGAGTACGTCCGGCTCAGGTAAACCTGGAAGTGGGGAAGGATCAACGAAAGGCCAGGTTACCTTGAAGGAAAGCGGTCCTGGTATCCTTCAGCCATCCCAGACTCTCAGCTTGACGTGCTCTTTTTCCGGATTCTCCTTGAACACGAGCGGTATGAATGTTGGATGGATTAGACAGCCTTCCGGTAAAGGGCTGGACTGGTTGGCGCACATATGGTGGAATGACGATAAGTATTACAATCCTGCGCTGAAAAGTAGGTTGACTATATCTAAGGACACATCTAATAACCAGGTATTCCTGAAAATAGCATCAGTCGTAACGGCCGATACTGCGACTTATTACTGTGTCCGATCTTATTTTGGGGATTATGTCTGGTATTTTGATGTTTGGGGAGCTGGGACCACGGTCACAGTGTCAAGCGGAGGGGGTGGAAGTGGGGGCGGTGGCAGCCTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGGTAA (SEQ ID NO: 68) M8c DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGGACATACAAATGACCCAGACAACGTCAAGTCTGTCTGCGTCCTTGGGGGACAGGGTCACTATTTCTTGCTCCGCGAGTCAAGGGATACACAATTATCTTAATTGGTACCAACAGAAGCCGGACGGCACTGTCAAATTGTTGATATACTACACCAGCAGCCTTCACTCAGGAGTTCCCTCCCGCTTTAGCGGATCCGGATCTGGCACGGATTACAGCCTTACAATCTCTAATCTGGAGCCTGAGGACATTGCAACATATTTTTGCCAGCAATATAGTAAGCTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGGGGGAGTACGTCCGGCTCAGGTAAACCTGGAAGTGGGGAAGGATCAACGAAAGGCCAGGTTACCTTGAAGGAAAGCGGTCCTGGTATCCTTCAGCCATCCCAGACTCTCAGCTTGACGTGCTCTTTTTCCGGATTCTCCTTGAACACGAGCGGTATGAATGTTGGATGGATTAGACAGCCTTCCGGTAAAGGGCTGGACTGGTTGGCGCACATATGGTGGAATGACGATAAGTATTACAATCCTGCGCTGAAAAGTAGGTTGACTATATCTAAGGACACATCTAATAACCAGGTATTCCTGAAAATAGCATCAGTCGTAACGGCCGATACTGCGACTTATTACTGTGTCCGATCTTATTTTGGGGATTATGTCTGGTATTTTGATGTTTGGGGAGCTGGGACCACGGTCACAGTGTCAAGCGGAGGGGGTGGAAGTGGGGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGCAGTCTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGGTAA (SEQ ID NO: 70) 在一些實施例中，胺基酸序列可與上文所提及之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。在一些實施例中，DNA序列可與上文所提及之DNA序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。III. M1 及 M2 CAR 如上文所提及，「M1」及「M2」序列包括自衍生自「EP1422Y」雜交瘤之兔單株抗體獲得或修飾之抗原結合域序列或其片段。用於EP1422Y雜交瘤之CDR展示於上表2、4及6中。M1及M2 CAR胺基酸序列各自包括類似於scFv (其中其包含由連接體分隔之VH及VL域)之抗原結合域。在M1 CAR胺基酸序列中，VH胺基酸序列位於VL胺基酸序列之前(N-末端連接)。與之相反，在M2 CAR胺基酸序列中，VL胺基酸序列位於VH胺基酸序列之前(N-末端連接)。 本發明之抗原結合域包括由下列可變(VL及VH) DNA序列中之一者編碼之下列可變(VL及VH)胺基酸序列中之一者；本發明CAR包括由下列CAR DNA序列中之一者編碼之下列CAR胺基酸序列中之一者： EP1422Y雜交瘤M1/M2 VL胺基酸序列： QIVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASQSVYKNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGEYNNMLYPFGGGTVVVVKG (SEQ ID NO: 22) EP1422Y雜交瘤M1/M2 VH胺基酸序列： QSVEEPGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSISSPVMIWVRQAPEKGLEYIGIISISGNTGYASWAKGRFTISKTTTTVDLKITSPTTEDTATYFCARMGYDSSSGYAWNLWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23) EP1422Y雜交瘤M1 CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPQSVEEPGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSISSPVMIWVRQAPEKGLEYIGIISISGNTGYASWAKGRFTISKTTTTVDLKITSPTTEDTATYFCARMGYDSSSGYAWNLWGPGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASQSVYKNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGEYNNMLYPFGGGTVVVVKGAAALDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 24) EP1422Y雜交瘤M2 CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPQIVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASQSVYKNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGEYNNMLYPFGGGTVVVVKGGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSVEEPGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSISSPVMIWVRQAPEKGLEYIGIISISGNTGYASWAKGRFTISKTTTTVDLKITSPTTEDTATYFCARMGYDSSSGYAWNLWGPGTLVTVSSAAALDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 25) M2a CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPQIVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASQSVYKNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGEYNNMLYPFGGGTVVVVKGGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSVEEPGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSISSPVMIWVRQAPEKGLEYIGIISISGNTGYASWAKGRFTISKTTTTVDLKITSPTTEDTATYFCARMGYDSSSGYAWNLWGPGTLVTVSSGGGGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 55) M2b CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPQIVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASQSVYKNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGEYNNMLYPFGGGTVVVVKGGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSVEEPGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSISSPVMIWVRQAPEKGLEYIGIISISGNTGYASWAKGRFTISKTTTTVDLKITSPTTEDTATYFCARMGYDSSSGYAWNLWGPGTLVTVSSGGGGSGGGGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 57) M2c CAR胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARPQIVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASQSVYKNNRLSWFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGEYNNMLYPFGGGTVVVVKGGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSVEEPGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSISSPVMIWVRQAPEKGLEYIGIISISGNTGYASWAKGRFTISKTTTTVDLKITSPTTEDTATYFCARMGYDSSSGYAWNLWGPGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 59) EP1422Y雜交瘤M1/M2 VL DNA序列： CAGATTGTGATGACTCAAACACCCGCCTCTGTTTCCGCCGCCGTTGGCGGCACCGTCACCATTAACTGCCAGGCAAGTCAATCCGTTTATAAAAACAACAGACTGAGTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGACAGCCACCTAAACTTCTGATTTACGGCGCTTCAACTCTGGCATCCGGGGTCCCCAGCAGATTCAAGGGCTCTGGCTCCGGGACGCAGTTCACTCTGACTATATCTGATGTCCAGTGCGATGACGCCGCTACATACTACTGTGCCGGCGAATACAATAATATGCTCTATCCTTTCGGCGGCGGGACAGTGGTCGTGGTCAAAGGC (SEQ ID NO: 30) EP1422Y雜交瘤M1/M2 VH DNA序列： CAGAGTGTCGAAGAACCTGGTGGGAGGCTGGTGACCCCTGGAACTCCACTGACACTGACGTGTACAGTGAGCGGTTTTAGCATTTCTTCCCCTGTCATGATTTGGGTTAGACAGGCGCCCGAAAAGGGACTGGAATACATCGGTATAATCAGTATCTCCGGAAATACCGGTTACGCCTCATGGGCGAAGGGTCGATTTACCATTAGCAAAACAACTACCACCGTAGATCTTAAGATCACAAGCCCCACTACAGAGGATACAGCCACTTACTTTTGCGCACGAATGGGCTATGATTCCAGCTCAGGCTATGCATGGAACCTCTGGGGTCCGGGGACGCTGGTCACCGTGTCCTCA (SEQ ID NO: 31) EP1422Y雜交瘤M1 CAR DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGCAGAGTGTCGAAGAACCTGGTGGGAGGCTGGTGACCCCTGGAACTCCACTGACACTGACGTGTACAGTGAGCGGTTTTAGCATTTCTTCCCCTGTCATGATTTGGGTTAGACAGGCGCCCGAAAAGGGACTGGAATACATCGGTATAATCAGTATCTCCGGAAATACCGGTTACGCCTCATGGGCGAAGGGTCGATTTACCATTAGCAAAACAACTACCACCGTAGATCTTAAGATCACAAGCCCCACTACAGAGGATACAGCCACTTACTTTTGCGCACGAATGGGCTATGATTCCAGCTCAGGCTATGCATGGAACCTCTGGGGTCCGGGGACGCTGGTCACCGTGTCCTCAGGTTCCACTAGTGGATCTGGTAAACCTGGATCAGGTGAAGGCTCAACCAAGGGTCAGATTGTGATGACTCAAACACCCGCCTCTGTTTCCGCCGCCGTTGGCGGCACCGTCACCATTAACTGCCAGGCAAGTCAATCCGTTTATAAAAACAACAGACTGAGTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGACAGCCACCTAAACTTCTGATTTACGGCGCTTCAACTCTGGCATCCGGGGTCCCCAGCAGATTCAAGGGCTCTGGCTCCGGGACGCAGTTCACTCTGACTATATCTGATGTCCAGTGCGATGACGCCGCTACATACTACTGTGCCGGCGAATACAATAATATGCTCTATCCTTTCGGCGGCGGGACAGTGGTCGTGGTCAAAGGCGCCGCTGCTCTTGACAACGAGAAATCTAACGGGACCATTATCCATGTGAAAGGAAAGCACCTTTGTCCGTCACCGTTGTTCCCCGGGCCTAGCAAGCCATTTTGGGTGCTCGTCGTGGTGGGAGGCGTGCTGGCTTGCTACTCATTGTTGGTTACCGTTGCGTTTATCATCTTCTGGGTCAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCCGAGTGAAATTTTCTAGATCAGCTGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGACAGAATCAACTTTACAATGAGCTGAACCTGGGTCGCAGAGAAGAGTACGACGTTTTGGACAAACGCCGGGGCCGAGATCCTGAGATGGGGGGGAAGCCGAGAAGGAAGAATCCTCAAGAAGGCCTGTACAACGAGCTTCAAAAAGACAAAATGGCTGAGGCGTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGACGAGGCAAGGGTCACGATGGCTTGTATCAGGGCCTGAGTACAGCCACAAAGGACACCTATGACGCCCTCCACATGCAGGCACTGCCCCCACGC (SEQ ID NO: 32) EP1422Y雜交瘤M2 CAR DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGCAGATCGTGATGACACAGACCCCCGCATCCGTAAGCGCTGCTGTTGGTGGCACAGTGACTATTAACTGCCAGGCGTCTCAATCTGTTTATAAAAACAACCGCCTTAGTTGGTTTCAGCAGAAGCCTGGGCAGCCACCTAAACTGCTGATTTACGGGGCCAGCACGTTGGCAAGCGGGGTACCATCTCGGTTTAAAGGCTCCGGTTCAGGGACTCAATTCACCTTGACAATCTCCGATGTGCAGTGCGACGATGCAGCAACATACTATTGCGCAGGGGAGTATAATAATATGCTGTACCCATTTGGAGGCGGGACTGTGGTGGTTGTTAAAGGCGGCTCTACCTCCGGGTCCGGAAAGCCTGGATCAGGTGAGGGGAGCACAAAAGGCCAATCTGTCGAGGAGCCCGGTGGCCGCCTGGTGACTCCCGGGACTCCTCTCACCCTGACTTGTACCGTCAGCGGCTTCAGCATTAGCTCCCCGGTGATGATTTGGGTGCGGCAGGCACCCGAAAAGGGCCTGGAATACATCGGGATAATCAGCATTTCTGGCAATACGGGCTACGCCAGTTGGGCCAAAGGCAGATTTACTATCTCTAAAACCACAACCACAGTTGATTTGAAGATCACCAGTCCTACAACCGAGGATACAGCCACGTATTTTTGCGCACGCATGGGCTACGACTCTAGCTCTGGTTATGCCTGGAACCTGTGGGGACCTGGTACCCTTGTTACAGTCTCTAGTGCTGCAGCGCTCGATAATGAGAAGTCCAATGGTACAATCATTCACGTGAAGGGTAAACATCTTTGTCCTTCACCCCTCTTCCCGGGACCTAGCAAGCCGTTCTGGGTTCTCGTCGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCCTGCTATAGCCTGCTCGTTACGGTAGCGTTCATTATCTTTTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCCGAGTGAAATTTTCTAGATCAGCTGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGACAGAATCAACTTTACAATGAGCTGAACCTGGGTCGCAGAGAAGAGTACGACGTTTTGGACAAACGCCGGGGCCGAGATCCTGAGATGGGGGGGAAGCCGAGAAGGAAGAATCCTCAAGAAGGCCTGTACAACGAGCTTCAAAAAGACAAAATGGCTGAGGCGTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGACGAGGCAAGGGTCACGATGGCTTGTATCAGGGCCTGAGTACAGCCACAAAGGACACCTATGACGCCCTCCACATGCAGGCACTGCCCCCACGC (SEQ ID NO: 33) M2a CAR DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGCAGATCGTGATGACACAGACCCCCGCATCCGTAAGCGCTGCTGTTGGTGGCACAGTGACTATTAACTGCCAGGCGTCTCAATCTGTTTATAAAAACAACCGCCTTAGTTGGTTTCAGCAGAAGCCTGGGCAGCCACCTAAACTGCTGATTTACGGGGCCAGCACGTTGGCAAGCGGGGTACCATCTCGGTTTAAAGGCTCCGGTTCAGGGACTCAATTCACCTTGACAATCTCCGATGTGCAGTGCGACGATGCAGCAACATACTATTGCGCAGGGGAGTATAATAATATGCTGTACCCATTTGGAGGCGGGACTGTGGTGGTTGTTAAAGGCGGCTCTACCTCCGGGTCCGGAAAGCCTGGATCAGGTGAGGGGAGCACAAAAGGCCAATCTGTCGAGGAGCCCGGTGGCCGCCTGGTGACTCCCGGGACTCCTCTCACCCTGACTTGTACCGTCAGCGGCTTCAGCATTAGCTCCCCGGTGATGATTTGGGTGCGGCAGGCACCCGAAAAGGGCCTGGAATACATCGGGATAATCAGCATTTCTGGCAATACGGGCTACGCCAGTTGGGCCAAAGGCAGATTTACTATCTCTAAAACCACAACCACAGTTGATTTGAAGATCACCAGTCCTACAACCGAGGATACAGCCACGTATTTTTGCGCACGCATGGGCTACGACTCTAGCTCTGGTTATGCCTGGAACCTGTGGGGACCTGGTACCCTTGTTACAGTCTCTAGTGGAGGGGGTGGAAGTCTCGATAATGAGAAGTCCAATGGTACAATCATTCACGTGAAGGGTAAACATCTTTGTCCTTCACCCCTCTTCCCGGGACCTAGCAAGCCGTTCTGGGTTCTCGTCGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCCTGCTATAGCCTGCTCGTTACGGTAGCGTTCATTATCTTTTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCCGAGTGAAATTTTCTAGATCAGCTGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGACAGAATCAACTTTACAATGAGCTGAACCTGGGTCGCAGAGAAGAGTACGACGTTTTGGACAAACGCCGGGGCCGAGATCCTGAGATGGGGGGGAAGCCGAGAAGGAAGAATCCTCAAGAAGGCCTGTACAACGAGCTTCAAAAAGACAAAATGGCTGAGGCGTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGACGAGGCAAGGGTCACGATGGCTTGTATCAGGGCCTGAGTACAGCCACAAAGGACACCTATGACGCCCTCCACATGCAGGCACTGCCCCCACGCTAG (SEQ ID NO: 54) M2b CAR DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGCAGATCGTGATGACACAGACCCCCGCATCCGTAAGCGCTGCTGTTGGTGGCACAGTGACTATTAACTGCCAGGCGTCTCAATCTGTTTATAAAAACAACCGCCTTAGTTGGTTTCAGCAGAAGCCTGGGCAGCCACCTAAACTGCTGATTTACGGGGCCAGCACGTTGGCAAGCGGGGTACCATCTCGGTTTAAAGGCTCCGGTTCAGGGACTCAATTCACCTTGACAATCTCCGATGTGCAGTGCGACGATGCAGCAACATACTATTGCGCAGGGGAGTATAATAATATGCTGTACCCATTTGGAGGCGGGACTGTGGTGGTTGTTAAAGGCGGCTCTACCTCCGGGTCCGGAAAGCCTGGATCAGGTGAGGGGAGCACAAAAGGCCAATCTGTCGAGGAGCCCGGTGGCCGCCTGGTGACTCCCGGGACTCCTCTCACCCTGACTTGTACCGTCAGCGGCTTCAGCATTAGCTCCCCGGTGATGATTTGGGTGCGGCAGGCACCCGAAAAGGGCCTGGAATACATCGGGATAATCAGCATTTCTGGCAATACGGGCTACGCCAGTTGGGCCAAAGGCAGATTTACTATCTCTAAAACCACAACCACAGTTGATTTGAAGATCACCAGTCCTACAACCGAGGATACAGCCACGTATTTTTGCGCACGCATGGGCTACGACTCTAGCTCTGGTTATGCCTGGAACCTGTGGGGACCTGGTACCCTTGTTACAGTCTCTAGTGGAGGGGGTGGAAGTGGGGGCGGTGGCAGCCTCGATAATGAGAAGTCCAATGGTACAATCATTCACGTGAAGGGTAAACATCTTTGTCCTTCACCCCTCTTCCCGGGACCTAGCAAGCCGTTCTGGGTTCTCGTCGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCCTGCTATAGCCTGCTCGTTACGGTAGCGTTCATTATCTTTTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCCGAGTGAAATTTTCTAGATCAGCTGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGACAGAATCAACTTTACAATGAGCTGAACCTGGGTCGCAGAGAAGAGTACGACGTTTTGGACAAACGCCGGGGCCGAGATCCTGAGATGGGGGGGAAGCCGAGAAGGAAGAATCCTCAAGAAGGCCTGTACAACGAGCTTCAAAAAGACAAAATGGCTGAGGCGTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGACGAGGCAAGGGTCACGATGGCTTGTATCAGGGCCTGAGTACAGCCACAAAGGACACCTATGACGCCCTCCACATGCAGGCACTGCCCCCACGCTAG (SEQ ID NO: 56) M2c CAR DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCGCAGATCGTGATGACACAGACCCCCGCATCCGTAAGCGCTGCTGTTGGTGGCACAGTGACTATTAACTGCCAGGCGTCTCAATCTGTTTATAAAAACAACCGCCTTAGTTGGTTTCAGCAGAAGCCTGGGCAGCCACCTAAACTGCTGATTTACGGGGCCAGCACGTTGGCAAGCGGGGTACCATCTCGGTTTAAAGGCTCCGGTTCAGGGACTCAATTCACCTTGACAATCTCCGATGTGCAGTGCGACGATGCAGCAACATACTATTGCGCAGGGGAGTATAATAATATGCTGTACCCATTTGGAGGCGGGACTGTGGTGGTTGTTAAAGGCGGCTCTACCTCCGGGTCCGGAAAGCCTGGATCAGGTGAGGGGAGCACAAAAGGCCAATCTGTCGAGGAGCCCGGTGGCCGCCTGGTGACTCCCGGGACTCCTCTCACCCTGACTTGTACCGTCAGCGGCTTCAGCATTAGCTCCCCGGTGATGATTTGGGTGCGGCAGGCACCCGAAAAGGGCCTGGAATACATCGGGATAATCAGCATTTCTGGCAATACGGGCTACGCCAGTTGGGCCAAAGGCAGATTTACTATCTCTAAAACCACAACCACAGTTGATTTGAAGATCACCAGTCCTACAACCGAGGATACAGCCACGTATTTTTGCGCACGCATGGGCTACGACTCTAGCTCTGGTTATGCCTGGAACCTGTGGGGACCTGGTACCCTTGTTACAGTCTCTAGTGGAGGGGGTGGAAGTGGGGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGCAGTCTCGATAATGAGAAGTCCAATGGTACAATCATTCACGTGAAGGGTAAACATCTTTGTCCTTCACCCCTCTTCCCGGGACCTAGCAAGCCGTTCTGGGTTCTCGTCGTGGTGGGCGGCGTTCTGGCCTGCTATAGCCTGCTCGTTACGGTAGCGTTCATTATCTTTTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCCGAGTGAAATTTTCTAGATCAGCTGATGCTCCCGCCTATCAGCAGGGACAGAATCAACTTTACAATGAGCTGAACCTGGGTCGCAGAGAAGAGTACGACGTTTTGGACAAACGCCGGGGCCGAGATCCTGAGATGGGGGGGAAGCCGAGAAGGAAGAATCCTCAAGAAGGCCTGTACAACGAGCTTCAAAAAGACAAAATGGCTGAGGCGTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGACGAGGCAAGGGTCACGATGGCTTGTATCAGGGCCTGAGTACAGCCACAAAGGACACCTATGACGCCCTCCACATGCAGGCACTGCCCCCACGCTAG (SEQ ID NO: 58) 在一些實施例中，胺基酸序列可與上文所提及之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。在一些實施例中，DNA序列可與上文所提及之DNA序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。Ⅳ . CAR 常用元件序列及變體 a) 連接體肽 CAR包括含有由連接體域(例如具有10至約25個胺基酸)分隔之VH及VL域之抗原結合域(例如scFv)。實例性連接體域具有下列胺基酸及DNA序列： 連接體肽胺基酸序列： GSTSGSGKPGSGEGSTKG( SEQ ID NO: 37) 連接體肽DNA序列： GGGAGTACGTCCGGCTCAGGTAAACCTGGAAGTGGGGAAGGATCAACGAAAGGC (SEQ ID NO: 36) 其他連接體序列提供於上文所提供代表性連接體之表格中。 在一些實施例中，胺基酸序列可與上文所提及之胺基酸序列至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%一致。在一些實施例中，DNA序列可與上文所提及之DNA序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。 b) 信號肽 在一些實施例中，本發明多核苷酸編碼CAR，其中CAR包括特異性結合至MART-1之抗原結合域，且其中CAR進一步包括信號肽(亦在本文中稱為「前導序列」或「信號序列」)。視情況將信號肽納入本發明CAR中。若信號肽包含於CAR中，則其可表現於CAR之N末端。因此，信號肽可與CAR之抗原結合域之VH或VL域鄰接，此取決於哪一可變域位於其他可變域之N末端。 若期望包含信號肽，則可合成此一信號肽或其可衍生自天然分子。舉例而言，可採用CD8之天然21殘基信號肽(例如參見Littman等人(1985)Cell 40:237-46)作為本發明CAR多核苷酸中之信號肽。 實例性「信號肽」或「前導序列」具有下列胺基酸及DNA序列： 信號肽胺基酸序列： MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 35) 信號肽DNA序列： ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCG (SEQ ID NO: 34) 在一些實施例中，胺基酸序列可與上文所提及之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。在一些實施例中，DNA序列可與上文所提及之DNA序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。 c) 細胞外或鉸鏈域 在一些實施例中，本發明CAR包括「細胞外域」、「鉸鏈域」、「間隔域」或「間隔區」，該等術語可在本文中互換使用。該域可來自或衍生自(例如包括全部或片段) CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導T細胞共刺激因子(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、活化NK細胞受體、Toll配體受體及其片段或組合。鉸鏈域可衍生自天然或合成來源。 在一些實施例中，鉸鏈域位於抗原結合域(例如scFv)與跨膜域之間。在此定向中，鉸鏈域在抗原結合域與表現CAR之細胞膜表面之間提供一定間距。在一些實施例中，鉸鏈域係來自或衍生自免疫球蛋白。在一些實施例中，鉸鏈域係選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE及IgM之鉸鏈區或其片段。在其他實施例中，鉸鏈域包括、來自或衍生自CD8α之鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈域包括、來自或衍生自CD28之鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈域包括CD8α之鉸鏈區之片段或CD28之鉸鏈區之片段，其中該片段係小於整個鉸鏈區之任何片段。在一些實施例中，CD8α鉸鏈區之片段或CD28鉸鏈區之片段包括在CD8α鉸鏈區或CD28鉸鏈區之N-末端或C-末端或此兩端去除至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個胺基酸之胺基酸序列。 實例性鉸鏈域具有下列胺基酸及DNA序列： CD28鉸鏈域(1號變體)胺基酸序列，其亦包括CD28 TM (加下劃線)及細胞內區域(粗體)： LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 39) CD28鉸鏈域(1號變體) DNA序列： CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGC (SEQ ID NO: 38) CD28鉸鏈域(2號變體)胺基酸序列： IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 51) CD28鉸鏈域(2號變體) DNA序列： ATTGAGGTGATGTATCCACCGCCTTACCTGGATAACGAAAAGAGTAACGGTACCATCATTCACGTGAAAGGTAAACACCTGTGTCCTTCTCCCCTCTTCCCCGGGCCATCAAAGCCC (SEQ ID NO: 50) CD28鉸鏈域(細胞外)胺基酸序列： LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 41) CD28鉸鏈域(細胞外) DNA序列： CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCA (SEQ ID NO: 40) 在一些實施例中，胺基酸序列可與上文所提及之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。在一些實施例中，DNA序列可與上文所提及之DNA序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。 上文所提及之CD28鉸鏈域1號變體代表至少包括鉸鏈及跨膜域或鉸鏈、跨膜及信號傳導域之單一序列(如下文進一步所闡述)。 視情況，CAR可進一步包括短肽或多肽連接體(例如長度介於2個胺基酸與10個胺基酸之間)，該連接體在CAR之鉸鏈域與抗原結合域之間或在鉸鏈域與跨膜域之間形成鍵聯。在實例中，甘胺酸-絲胺酸雙聯體(GS)、甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸三聯體(GSG)、丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸三聯體(AAA)、EAAAK或G4S肽(GGGGS)提供適宜連接體。在一些實施例中，CAR包括短多肽連接體之連續重複單元。在一些實施例中，CAR包括連接體之2、3、4或5個連續重複單元。上文所提供代表性連接體之表格展示可用於接合VH及VL域之其他可能連接體。 d) 跨膜 (TM) 域 本發明CAR可進一步包括跨膜(TM)域。跨膜域可經設計以融合至鉸鏈域。其可類似地融合至細胞內域(例如共刺激域)。在一些實施例中，可使用與CAR中之一個域天然締合之跨膜域。舉例而言，跨膜域可包括共刺激域之天然跨膜區(例如用作共刺激域之CD28或4-1BB之TM區)或鉸鏈區之天然跨膜域(例如用作鉸鏈域之CD8α或CD28之TM區)。 在一些實施例中，跨膜域可根據胺基酸取代來選擇或修飾以避免該等域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域，從而最小化與受體複合物之其他成員之相互作用。跨膜域可衍生自天然或合成來源。在跨膜域係衍生自天然來源時，該域可衍生自任何膜結合或跨膜蛋白。在一些實施例中，跨膜域係衍生自CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導T細胞共刺激因子(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、活化NK細胞受體、Toll配體受體及其組合。 在一些實施例中，跨膜域可包括跨越細胞膜但延伸至細胞之細胞質中及/或延伸至細胞外空間中之序列。舉例而言，跨膜可包括跨膜序列，該跨膜序列本身可進一步包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個延伸至細胞之細胞質及/或細胞外空間中之胺基酸。因此，跨膜域可包括跨膜區，且可進一步包括延伸超出膜本身之內部或外部表面之胺基酸；該等序列仍可視為「跨膜域」。 跨膜(TM)域可不同於鉸鏈域(例如如上文所闡述)或鉸鏈及TM域可包括單一域(亦即鉸鏈/TM域)。實例性TM域及實例性鉸鏈/TM域具有下列胺基酸及DNA序列： CD28 TM域胺基酸序列： FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 43) CD28 TM域DNA序列： TTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTT (SEQ ID NO: 42) CD8鉸鏈/TM域胺基酸序列： AAALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 53) CD8鉸鏈/TM域DNA序列： GCTGCAGCATTGAGCAACTCAATAATGTATTTTAGTCACTTTGTACCAGTGTTCTTGCCGGCTAAGCCTACTACCACACCCGCTCCACGGCCACCTACCCCAGCTCCTACCATCGCTTCACAGCCTCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCTTGCCGACCGGCCGCAGGGGGCGCTGTTCATACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGATATCTATATCTGGGCACCCCTGGCCGGAACCTGCGGCGTACTCCTGCTGTCCCTGGTCATCACGCTCTATTGTAATCACAGGAAC (SEQ ID NO: 52) 在一些實施例中，胺基酸序列可與上文所提及之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。在一些實施例中，DNA序列可與上文所提及之DNA序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。 視情況，CAR可進一步包括短肽或多肽連接體(例如長度介於2個胺基酸與10個胺基酸之間)，該連接體在跨膜域與CAR之近端細胞質信號傳導域(例如共刺激或活化域)或抗原結合域(例如抗MART-1 scFv)之間形成鍵聯。在實例中，甘胺酸-絲胺酸雙聯體(GS)、甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸三聯體(GSG)、丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸三聯體(AAA)或G4S肽(GGGGS)提供適宜連接體。在一些實施例中，CAR包括短多肽連接體之連續重複單元。在一些實施例中，CAR包括連接體之2、3、4或5個連續重複單元。 e) 共刺激或信號傳導域 在一些實施例中，本發明包括CAR，該CAR進一步包括共刺激域(亦稱為「信號傳導域」)。在一些實施例中，共刺激域位於抗原結合域(例如scFv)與活化域之間。在一些實施例中，除細胞內信號傳導域外，共刺激域亦可包括細胞外域及/或跨膜域。在一些實施例中，共刺激域可包括跨膜域及細胞內信號傳導域。在一些實施例中，共刺激域可包括細胞外域及跨膜域。在一些實施例中，共刺激域可包括細胞內信號傳導域。本發明之CAR或經改造T細胞可包括一個、兩個或三個共刺激域，該等域可串聯構形或側接CAR之一或多種其他組分。 本發明之CAR及經改造T細胞之共刺激域可向活化域提供信號傳導，該活化域然後活化免疫細胞之至少一種正常效應物功能。舉例而言，T細胞之效應物功能可為細胞溶解活性或輔助活性，包含分泌細胞介素。在一些實施例中，適宜共刺激域包含(亦即包括) (但不限於) CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A (B細胞抗原受體複合物相關α鏈)、CD79B (B細胞抗原受體複合物相關β鏈)、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3-ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導T細胞共刺激因子(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、活化NK細胞受體、Toll配體受體及其片段或組合。 實例性共刺激域(亦稱為信號傳導域)具有下列胺基酸及DNA序列： CD28信號傳導域(細胞內) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 45) CD28信號傳導域DNA (細胞內) AGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGC (SEQ ID NO: 44) 在一些實施例中，胺基酸序列可與上文所提及之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。在一些實施例中，DNA序列可與上文所提及之DNA序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。 本發明CAR之共刺激信號傳導序列可以隨機或指定順序直接連接至另一共刺激域、活化域、跨膜域或其他CAR組分。 視情況，CAR可進一步包括短肽或多肽連接體(例如長度介於2個胺基酸與10個胺基酸之間)。在實例中，甘胺酸-絲胺酸雙聯體(GS)、甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸三聯體(GSG)、丙胺酸-丙胺酸-丙胺酸三聯體(AAA)、EAAAK或G4S肽(GGGGS)提供適宜連接體。在一些實施例中，CAR包括短多肽連接體之連續重複單元。在一些實施例中，CAR包括連接體之2、3、4或5個連續重複單元。上文所提供代表性連接體之表格展示可用於接合VH及VL域之其他可能連接體。另外應注意，可將多個共刺激域納入本發明CAR中。舉例而言，可將CD28共刺激域及4-1BB共刺激域納入本發明CAR中且藉助CAR之抗原結合組分CAR仍指向MART-1及在表面上表現MART-1之細胞。 f) 活化域 在一些實施例中，用於本發明之CAR及/或經改造T細胞中之細胞內域包含T細胞受體(TCR)及在抗原/受體接合後協同起引發信號轉導之共受體之細胞質序列，以及該等序列之任何衍生物或變體及具有相同功能能力之任何合成序列。CD3係天然T細胞上之T細胞受體之元件，且已展示為CAR中之重要細胞內活化元件。 實例性活化域具有下列胺基酸及DNA序列： CD3z活化域(1號變體) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 47) CD3z活化域DNA (1號變體) AGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG (SEQ ID NO: 46) CD3z活化域(2號變體) RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 49) CD3z活化域DNA (2號變體) AGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATAAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG (SEQ ID NO: 48) 在一些實施例中，胺基酸序列可與上文所提及之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。在一些實施例中，DNA序列可與上文所提及之DNA序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致。 在一些實施例中，本發明多核苷酸編碼CAR，其中CAR包括信號肽(P)、與人類MART-1締合之抗原結合域(例如scFv) (B)、鉸鏈域(H)、跨膜域(T)、一或多個共刺激區(C)及活化域(A)，其中CAR根據下列形式來構形：P-B-H-T-C-A。 在一些實施例中，CAR之組分視情況經由連接體序列(例如AAA、GSG或GGGGS)進行接合。在一些實施例中，抗原結合域包括VH及VL，其中CAR根據下列形式進行構形：P-VH-VL-H-T-C-A或P-VL-VH-H-T-C-A。在一些實施例中，VH及VL藉由連接體(L)連結，其中CAR自N-末端至C-末端根據下列形式進行構形：P-VH-L-VL-H-T-C-A或P-VH-L-VL-H-T-C-A。在一些實施例中，CAR包括短多肽連接體之連續重複單元。在一些實施例中，CAR包括連接體之2、3、4或5個連續重複單元。 在一些實施例中，CAR可進一步包括指示抗原結合域與MART-1 (若存在)發生結合之機構。該機構可附接至CAR或納入胺基酸序列本身中。可使用指示存在抗原之各種機構。舉例而言，螢光團、其他分子探針或酶連接至抗原結合域且可以各種方式觀察抗原結合域之存在。螢光團之實例包含螢光黃、玫瑰紅、四甲基玫瑰紅、曙紅(eosin)、赤蘚紅(erythrosin)、香豆素(coumarin)、甲基香豆素、芘、孔雀綠(Malachite green)、均二苯乙烯、螢光黃(Lucifer Yellow)、瀑布藍(Cascade Blue)、德克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy 5、Cy 5.5、LC紅705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布藍、瀑布黃及R-藻紅素(PE) (Molecular Probes)、FITC、玫瑰紅及德克薩斯紅(Pierce)、Cy5、Cy5.5及Cy7 (Amersham Life Science)。V. 載體、細胞及組合物 本發明之態樣包含含有本發明多核苷酸之載體(例如病毒載體)。在一些實施例中，本發明係關於包括如本文所闡述編碼CAR之多核苷酸之載體或載體組。在一些實施例中，本發明係關於包括多核苷酸之載體或載體組，該多核苷酸編碼包括特異性結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域之CAR。 業內已知之任一載體可適用於本發明。在一些實施例中，載體係病毒載體。在一些實施例中，載體係逆轉錄病毒載體、DNA載體、鼠類白血病病毒載體、SFG載體、質體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾伯斯坦-巴爾病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒相關載體(AAV)、慢病毒載體或其任一組合。在本發明之一些實施例中，可採用一種、兩種或更多種載體。舉例而言，在一實施例中，CAR之一或多種組分可佈置於一種載體上，而CAR之一或多種不同組分可佈置於不同載體上。 「慢病毒」係指能夠感染分裂細胞及非分裂細胞之逆轉錄病毒屬。慢病毒之若干實例包含人類免疫缺陷病毒(HIV)；維斯那-梅迪病毒(visna-maedi)，其在綿羊中引起腦炎 (維斯那病毒)或肺炎(梅迪病毒)；山羊類關節炎-腦炎病毒，其在山羊中引起免疫缺陷、關節炎及腦病；馬感染性貧血病毒，其在馬中引起自體免疫溶血性貧血及腦病；貓免疫缺陷病毒(FIV)，其在貓中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其在牛中引起淋巴結病、淋巴細胞增多及可能中樞神經系統感染；及猿免疫缺陷病毒(SIV)，其在亞人類靈長類動物中引起免疫缺陷及腦病。 慢病毒基因體通常組織成5′長末端重複序列(LTR)、gag 基因、pol 基因、env 基因、輔助基因(nef 、 vif 、 vpr 、 vpu )及3′ LTR。病毒LTR分成三個區域，稱為U3、R及U5。U3區含有增強子及啟動子元件。U5區含有多腺苷酸化信號。R (重複)區將U3區及U5區隔開且R區之轉錄序列出現於病毒RNA之5′端及3′端。參見例如「RNA Viruses: A Practical Approach」 (Alan J. Cann編輯，Oxford University Press, (2000))；O Narayan及Clements. 1989.J. Gen. Virology 70:1617-1639 (1989)；Fields等人，「Fundamental Virology」 Raven Press. (1990)；Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, Gage F H, Verma I M. 1998.J. Virol . 72(10):8150-7；及美國專利第6,013,516號。 本發明之態樣包括含有本發明之多核苷酸或載體之細胞。在一些實施例中，本發明係關於包括如本文所闡述編碼CAR之多核苷酸之宿主細胞(例如活體外細胞)。在一些實施例中，本發明係關於包括編碼包括特異性結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域之CAR的多核苷酸之宿主細胞(例如活體外細胞)。任何細胞可用作本發明之多核苷酸、載體或多肽之宿主細胞。在一些實施例中，細胞可為原核細胞、真菌細胞、酵母細胞或高等真核細胞(例如哺乳動物細胞)。適宜原核細胞包含(但不限於)真細菌，例如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性(Gram-positive)生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae )，例如艾氏菌屬(Escherichia ) ，例如大腸桿菌(E. coli )；腸桿菌屬(Enterobacter )；伊文氏桿菌屬(Erwinia )；克雷伯氏菌屬(Klebsiella )；變形桿菌屬(Proteus )；沙門氏菌屬(Salmonella )，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium )；沙雷氏菌屬(Serratia )，例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans) ；及志賀桿菌屬(Shigella )；桿菌屬(Bacilli )，例如枯草桿菌(B. subtilis )及地衣桿菌(B. licheniformis )；假單胞菌屬(Pseudomonas )，例如綠膿桿菌(P. aeruginosa )；及鏈黴菌屬(Streptomyces )。在一些實施例中，宿主細胞係人類細胞。在一些實施例中，細胞係免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞係選自由以下組成之群：T細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、TCR表現細胞、天然殺手(NK)細胞、樹突狀細胞、顆粒球、先天性淋巴樣細胞、巨核細胞、單核球、巨噬球、血小板、胸腺細胞及骨髓細胞。在一個實施例中，免疫細胞係T細胞。在另一實施例中，免疫細胞係NK細胞。在一些實施例中，T細胞係腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、自體T細胞、經改造自體T細胞(eACT™)、同種異體T細胞、異源T細胞，或其任何組合。可經由業內已知之任何來源來獲得本發明細胞。舉例而言，可在活體外自造血幹細胞群體來分化T細胞，或可自個體獲得T細胞。可自(例如)外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜滲出液、脾組織及腫瘤來獲得T細胞。另外，T細胞可衍生自業內可獲得之一或多種T細胞系。亦可自使用熟習此項技術者已知之任何技術(例如FICOLL™分離及/或血球分離)自個體收集之血液單元來獲得T細胞。在一些實施例中，洗滌藉由血球分離收集之細胞以去除血漿部分，並置於適當緩衝液或培養基中用於後續處理。在一些實施例中，使用PBS洗滌細胞。如所瞭解，可使用洗滌步驟，例如藉由使用半自動化直流離心機，例如COBE™ 2991細胞處理器、Baxter CYTOMATE™或諸如此類。在一些實施例中，將經洗滌細胞再懸浮於一或多種生物相容緩衝液或其他含有或不含緩衝液之鹽水溶液中。在一些實施例中，去除血球分離試樣之不期望組分。分離用於T細胞療法之T細胞之其他方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號中，該公開案之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，藉由裂解紅血細胞並消耗單核球(例如藉由使用離心經由PERCOLL^TM 梯度)自PBMC分離T細胞。在一些實施例中，可進一步藉由業內已知之陽性或陰性選擇技術來分離T細胞之特定亞群體(例如CD28⁺ 、CD4⁺ 、CD8⁺ 、CD45RA⁺ 及CD45RO⁺ T細胞)。舉例而言，可使用針對陰性選擇細胞之獨特表面標記物之抗體組合藉由陰性選擇來富集T細胞群體。在一些實施例中，可經由負磁免疫黏附或流式細胞術使用針對存在於陰性選擇細胞上之細胞表面標記物之單株抗體之混合劑來進行細胞分選及/或選擇。舉例而言，為藉由陰性選擇來富集CD4⁺ 細胞，單株抗體混合劑通常包含CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在一些實施例中，使用流式細胞術及細胞分選來分離用於本發明中之所關注細胞群體。使用該等標準技術，在實施本文所提供方法時投與患者之經改造T細胞可包括任何期望比例之細胞。舉例而言，可期望以僅向患者提供經改造CD8⁺ 細胞，僅向患者提供經改造CD4⁺ 細胞，或提供期望比率之CD4⁺ 與CD8⁺ 細胞(例如相等數量之CD4⁺ 及CD8⁺ 細胞)。 在一些實施例中，將PBMC直接用於利用免疫細胞(例如CAR)使用如本文所闡述之方法進行基因修飾。在一些實施例中，在分離PBMC之後，進一步分離T淋巴球，且在基因修飾及/或擴增之前或之後將細胞毒性及輔助T淋巴球分選成幼稚細胞、記憶細胞及效應T細胞亞群體。 在一些實施例中，藉由鑑別與該等類型之CD8⁺ 細胞中之每一者締合之細胞表面抗原來將CD8⁺ 細胞進一步分選成幼稚細胞、中央記憶細胞及效應細胞。在一些實施例中，中央記憶T細胞之所表現表型標記物包含CD3、CD28、CD44、CD45RO、CD45RA及CD127且對顆粒酶B呈陰性。在一些實施例中，中央記憶T細胞係CD3⁺ 、CD28⁺ 、CD44^hi 、CD45RO^hi 、CD45RA^low 及CD127^hi CD8⁺ T細胞。在一些實施例中，效應T細胞對CD62L、CCR7、CD28及CD127呈陰性且對顆粒酶B及穿孔素呈陽性。在一些實施例中，將CD4⁺ T細胞進一步分選成亞群體。舉例而言，可藉由鑑別具有細胞表面抗原之細胞群體來將CD4⁺ T輔助細胞分選成幼稚細胞、中央記憶細胞及效應細胞。 在一些實施例中，在分離後使用已知方法對免疫細胞(例如T細胞)進行基因修飾，或於基因修飾之前在活體外活化免疫細胞並擴增(或在祖細胞之情形下分化)。在另一實施例中，使用本文所闡述之嵌合抗原受體對免疫細胞(例如T細胞)進行基因修飾(例如使用包括一或多種編碼CAR之核苷酸序列之病毒載體進行轉導)且然後在活體外活化及/或擴增。業內已知活化及擴增T細胞之方法並闡述於(例如)美國專利第6,905,874號、第6,867,041號及第6,797,514號及PCT公開案第WO 2012/079000號中，該等案件之全部內容之內容以引用方式併入本文中。通常，該等方法包含使PBMC或經分離T細胞與刺激劑及共刺激劑(例如抗CD3及抗CD28抗體，其通常附接至珠粒、組織培養袋、板、燒瓶或其他表面上)在含有適當細胞介素(例如IL-2、IL-7及/或IL-15)之培養基中接觸。附接至相同珠粒之抗CD3及抗CD28抗體用作「替代」抗原呈遞細胞(APC)。一個實例係Dynabeads^® 系統，其係用於生理活化人類T細胞之CD3/CD28活化劑/刺激劑系統。在其他實施例中，利用飼養細胞及適當抗體及細胞介素使用諸如美國專利第6,040,177號及第5,827,642號及PCT公開案第WO 2012/129514號(其全部內容之內容以引用方式併入本文中)中所闡述之方法等方法來活化T細胞並刺激以使其增殖。 在一些實施例中，自供體個體獲得T細胞。在一些實施例中，供體個體係患有黑色素瘤之人類患者。在一些實施例中，T細胞係衍生自維持於有益於使幹細胞分化成T細胞之條件下之多潛能幹細胞。本發明之其他態樣係關於包括本文所提供之多核苷酸、本文所提供之載體、本文所提供之多肽或本文所提供之活體外細胞之組合物。 在一些實施例中，組合物係進一步包括醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、增溶劑、乳化劑、賦形劑、防腐劑及/或佐劑之醫藥組合物。 在一些實施例中，選擇非經腸遞送組合物。熟習此項技術者熟知該等醫藥上可接受之組合物之製備。在一些實施例中，使用緩衝液將組合物維持於生理學pH或略低pH下(通常在約5至約8之pH範圍內)。在一些實施例中，在預計非經腸投與時，組合物係呈於醫藥上可接受之媒劑中之無熱原、非經腸可接受之水溶液形式，其包括含有特異性結合至MART-1之抗原結合域之期望CAR且含有或不含其他治療劑。 在一些實施例中，用於非經腸注射之媒劑係無菌蒸餾水，其中將CAR與至少一種其他治療劑調配為無菌、等滲溶液，並以適當方式保存。 在一些實施例中，製備涉及調配期望CAR與可使產物受控或持續釋放之聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體，該產物然後可經由儲積注射來遞送。在一些實施例中，使用可植入藥物遞送裝置來引入期望分子。 在一些實施例中，組合物包含一種以上CAR，例如針對不同抗原之CAR及針對相同抗原(例如MART-1)但針對該抗原之不同區域之CAR。後一情形之一實例包含衍生自不同抗體之CAR。VI. 製造 CAR 表現細胞之方法 本發明之另一態樣係關於製備(製造)表現CAR之細胞之方法。該方法包括使用本發明多核苷酸在適宜條件下轉導細胞。在一些實施例中，該方法包括使用編碼CAR之多核苷酸轉導細胞，其中該CAR包括特異性結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域。在一些實施例中，該方法包括使用包括編碼CAR之多核苷酸之載體轉導細胞，其中該CAR包括特異性結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域。在一些實施例中，該方法進一步包括分離細胞。 該等製造方法無需選擇及/或分離用於表現CD4或CD8之經轉導T細胞。而是，可使用流動特性來檢測組合物中CD4+細胞及CD8+細胞之百分比；然而，無需選擇。因此，無需約21天來製造經轉導T細胞之組合物，本發明僅需約6天。因此，在約一週內而非在約三週之後，可向患者轉輸經改造以表現抗MART-1 CAR之T細胞。CAR T細胞製造方法之實例闡述於美國專利公開案第2015/0344844號中，該公開案之全部內容以引用方式併入本文中。VII. 癌症治療 可使用本發明方法來治療個體之癌症，減小腫瘤大小，殺死腫瘤細胞，預防腫瘤細胞增殖，預防腫瘤生長，消除患者之腫瘤，預防腫瘤復發，預防腫瘤轉移，誘導患者之緩解，或其任一組合。在一些實施例中，該方法誘導完整反應。在其他實施例中，該方法誘導部分反應。 在一些實施例中，該方法包括向個體投與有效量之包括編碼CAR之多核苷酸之細胞，其中該CAR包括特異性結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域。在一些實施例中，該方法包括向個體投與有效量之包括含有編碼CAR之多核苷酸之載體之細胞，其中該CAR包括特異性結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域。在一些實施例中，該方法包括向個體投與有效量之包括由本發明多核苷酸編碼之CAR之細胞，其中該CAR包括特異性結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域。 一些實施例係關於誘導個體中之免疫反應之方法，其包括投與有效量之本申請案之經改造免疫細胞。在一些實施例中，免疫反應係T細胞調介之免疫反應。在一些實施例中，T細胞調介之免疫反應係針對一或多種靶細胞。在一些實施例中，經改造免疫細胞包括CAR，例如本文所提供者。在一些實施例中，靶細胞係腫瘤細胞，例如黑色素瘤細胞。一些實施例係關於治療或預防黑色素瘤之方法，該方法包括向有需要之個體投與有效量之一種經改造細胞類型(例如T細胞)或包括複數個該細胞之組合物，其中經改造細胞包括至少一種包括特異性結合至MART-1 (例如MART-1之細胞外表位)之抗原結合域之CAR。在一些實施例中，治療有需要之個體之癌症之方法包括T細胞療法。在一實施例中，本發明之T細胞療法係經改造自體細胞療法(eACT™)。根據此實施例，該方法可包含自患者收集血細胞。然後可改造經分離血細胞(例如T細胞)以表現本發明之抗MART-1 CAR (「抗MART-1 CAR T細胞」)。在一些實施例中，將抗MART-1 CAR T細胞投與患者。在一些實施例中，抗MART-1 CAR T細胞治療患者之腫瘤或癌症(例如黑色素瘤)。在一實施例中，抗MART-1 CAR T細胞減小腫瘤或癌症(例如黑色素瘤)之大小。在一些實施例中，自患者獲得用於T細胞療法中之供體T細胞(例如用於自體T細胞療法)。在其他實施例中，自非患者個體獲得用於T細胞療法中之供體T細胞(例如同種異體T細胞療法)。可以治療有效量來投與T細胞。舉例而言，治療有效量之T細胞可為至少約10⁴ 個細胞、至少約10⁵ 個細胞、至少約10⁶ 個細胞、至少約10⁷ 個細胞、至少約10⁸ 個細胞、至少約10⁹ 個細胞、至少約10¹⁰ 個細胞或至少約10¹¹ 個細胞。在另一實施例中，治療有效量之T細胞為約10⁴ 個細胞、約10⁵ 個細胞、約10⁶ 個細胞、約10⁷ 個細胞或約10⁸ 個細胞。在一些實施例中，治療有效量之抗MART-1 CAR T個細胞為約1 × 10⁵ 個細胞/kg、2 × 10⁵ 個細胞/kg、3 × 10⁵ 個細胞/kg、4 × 10⁵ 個細胞/kg、5 × 10⁵ 個細胞/kg、1 × 10⁶ 個細胞/kg、2 × 10⁶ 個細胞/kg、約3 × 10⁶ 個細胞/kg、約4 × 10⁶ 個細胞/kg、約5 × 10⁶ 個細胞/kg、約6 × 10⁶ 個細胞/kg、約7 × 10⁶ 個細胞/kg、約8 × 10⁶ 個細胞/kg、約9 × 10⁶ 個細胞/kg、約1 × 10⁷ 個細胞/kg、約2 × 10⁷ 個細胞/kg、約3 × 10⁷ 個細胞/kg、約4 × 10⁷ 個細胞/kg、約5 × 10⁷ 個細胞/kg、約6 × 10⁷ 個細胞/kg、約7 × 10⁷ 個細胞/kg、約8 × 10⁷ 個細胞/kg或約9 × 10⁷ 個細胞/kg。 在一些實施例中，該方法進一步包括投與(單獨或與本發明之細胞或組合物一起)化學治療劑。在一些實施例中，化學治療劑係選自達卡巴嗪(Dacarbazine) (亦稱為DTIC)、替莫唑胺(Temozolomide)、Nab-太平洋紫杉醇(paclitaxel)、太平洋紫杉醇、順鉑(Cisplatin)、卡鉑(Carboplatin)及長春鹼(Vinblastine)。在一些實施例中，與投與經改造細胞或組合物同時或在之後一週內來投與化學治療劑。在其他實施例中，在投與經改造細胞或組合物之後1至4週或1週至1個月、1週至2個月、1週至3個月、1週至6個月、1週至9個月或1週至12個月投與化學治療劑。在一些實施例中，在投與細胞或核酸之前至少1個月投與化學治療劑。在一些實施例中，該方法進一步包括投與兩種或更多種化學治療劑(例如檢查點抑制劑)。 治療方法之實例揭示於美國專利第9,855,298號及第WO2016019755號中，該等專利中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。 儘管本發明之實踐或測試中可使用類似或等效於本文所闡述之方法及材料的方法及材料，但下文闡述適宜方法及材料。本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中。並不認為本文所引用之參考文獻係所主張發明之先前技術。另外，材料、方法及實例僅為闡釋性且並不意欲具有限制性。實例 實例 1 ： MART-1 CAR 表現原代 T 細胞 CAR-T 慢病毒產生 將293個T細胞(ATCC)平鋪於10-cm盤中並使用聚乙烯亞胺(PEI；(Polysciences))及第三代慢病毒載體組分以及4種質體(包含一種轉移質體(包括編碼M7-、M8-或M9之多核苷酸或模擬多核苷酸中之一者)及三種包裝質體(分別含有gag/pol 、rev 及vsv-g ))進行轉染。在37℃下48小時之後，收集上清液並濃縮10倍。 CAR-T 細胞產生 在第0天，將經純化T細胞(所有細胞)在補充有10% FBS、1X青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)/麩醯胺酸及IL-2 (R10+IL-2)之RPMI 1640培養基中解凍。藉由與偶聯至dynabeads之抗CD3及抗CD28抗體在37℃下於R10 + IL-2培養基中一起培育48小時來刺激細胞。在第二天，將含有M7、M8、M9或模擬構築體之慢病毒添加至T細胞中且使細胞在R10+IL-2培養基(經補充以保持T細胞之濃度大約為0.5×10⁶ 個細胞/mL至4×10⁶ 個細胞/ml)中生長最長2週。 嵌合抗原受體表徵 在T細胞表面上藉由將模擬細胞及CAR-T細胞與PE偶聯抗CAR抗體在4℃下於BD染色緩衝液中一起培育30分鐘並在染色緩衝液中洗滌三次來檢測CAR。藉由流式細胞術在BD Fortessa上量測CAR陽性百分比及螢光強度。 圖3展示，並無CAR表現於經模擬轉導之T細胞中。經M8多核苷酸(其中VL胺基酸序列位於VH胺基酸序列之前(N-末端連接))轉導之T細胞所表現之CAR多於經M7多核苷酸(其中VH胺基酸序列位於VL胺基酸序列之前(N-末端連接))轉導之T細胞。實例 2 ： MART-1 CAR M7 及 M8 選擇性殺死腫瘤細胞 將於RPMI 1640培養基(補充有10% FBS及1X青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸(Gibco) (R10培養基))中之25,000個表現螢光素酶之SKMEL28 (MART-1陽性)及293T (MART-1陰性)細胞平鋪於黑色、透明底96孔板(Thermo)中。以1:1及4:1之效應物對靶比率添加經CAR-或模擬轉導之T細胞以使最終體積達到200 µL。在37℃下共培養16小時之後，將50 µL於R10培養基中之穩態Glo螢光素試劑添加至每一孔中且將板在37℃下培育10分鐘。使用螢光素酶活性作為細胞存活率之量度。在Varioskan急速讀板儀中讀取螢光。 圖4A展示針對與抗MART-1 CAR構築體一起培育之293T細胞所量測之發光。並無構築體展示殺死293T細胞(其不表現MART-1)。因此，不存在脫靶殺死活性，亦即並不殺死不在細胞外表面上表現MART-1之細胞。另一方面，圖4B展示針對與抗MART-1 CAR構築體一起培育之SKMEL28細胞(其在其細胞外表面上表現MART-1)所量測之發光。M7及M8各自相對於模擬-T細胞展示殺死活性，如藉由自兩種不同供體所獲得之細胞中之發光有所降低所證實。相對於模擬-T細胞，M9轉導之T細胞不能展示顯著殺死活性。 因此，本發明特異性靶向且殺死細胞外呈遞MART-1之細胞且不靶向或殺死不在漿膜上表現MART-1之細胞。實例 3 ： 在與抗原陽性 SKMEL28 細胞而非抗原陰性 293T 細胞一起共培養時 ， M7 及 M8 相對於模擬細胞展示細胞溶解活性。 將於RPMI 1640培養基(補充有10% FBS及1X青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸(Gibco) (R10培養基))中之25,000個、50,000個或100,000個SKMEL28 (MART-1陽性)或抗原陰性293T細胞平鋪於黑色、透明底96孔板(Thermo)中。將20,000個抗MART-1 CAR轉導T細胞或模擬轉導T細胞添加至SKMEL28細胞及293T細胞中直至最終體積為200 µL。在37℃下共培養16小時之後，將50 µL於R10培養基中之穩態Glo螢光素試劑添加至每一孔中且將板在37℃下培育10分鐘。使用螢光素酶活性作為細胞存活率之量度。在Varioskan急速讀板儀中讀取螢光。 圖5A及圖5B展示針對與包括抗MART-1 CAR構築體或模擬構築體之T細胞一起培育之293T細胞所量測之發光。並無抗MART-1 CAR構築體以高於模擬轉導T細胞之速率展示殺死293T細胞(靶陰性)。因此，不存在脫靶殺死活性，亦即並不殺死不在細胞外表面上表現MART-1之細胞。圖5C及圖5D展示與經抗MART-1 CAR構築體或模擬構築體轉導之T細胞一起培育之抗原陽性SKMEL28細胞之所量測發光變化。每一抗MART-1 CAR構築體(M7及M8)相對於模擬-T細胞展示殺死活性，如藉由自兩種不同供體所獲得之細胞中之發光有所降低所證實；此明確見於使用100,000個靶細胞之條件中。 因此，本發明特異性靶向且殺死MART-1表現細胞且不靶向或殺死不表現MART-1之細胞。實例 4 ： M1 及 M2 CAR T 細胞選擇性殺死腫瘤細胞。 將於RPMI 1640培養基(補充有10% FBS及1X青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸(Gibco) (R10培養基))中之25,000個表現螢光素酶之SKMEL28 (MART-1陽性)及293T (MART-1陰性)細胞平鋪於黑色、透明底96孔板(Thermo)中。以4:1之效應物對靶比率添加經CAR-或模擬轉導之T細胞以使最終體積達到200 µL。在37℃下共培養16小時之後，將50 µL於R10培養基中之穩態Glo螢光素試劑添加至每一孔中且將板在37℃下培育10分鐘。使用螢光素酶活性作為細胞存活率之量度。在Varioskan急速讀板儀中讀取螢光。 圖6A展示針對與抗MART-1 CAR構築體一起培育之293T細胞所量測之發光。並無構築體展示殺死293T細胞(其不表現MART-1)。因此，不存在脫靶殺死活性，亦即並不殺死不在細胞外表面上表現 MART-1 之細胞 。與之相反，圖6B展示在與抗MART-1 CAR構築體一起培育之後針對SKMEL28細胞(MART-1陽性)所量測之發光。M1及M2各自相對於模擬-T細胞展示殺死活性，如藉由自兩種不同供體所獲得之細胞中之發光有所降低所證實。

結合附圖，自下文實施方式將更為明瞭上述及其他特徵。然而，圖式僅用於闡釋目的而並不加以限制。 圖1A及圖1B係繪示嵌合抗原受體(CAR)製造及使用之特徵之卡通圖。圖1A展示編碼CAR之實例性多核苷酸、包括編碼CAR之多核苷酸之病毒載體、病毒載體在患者T細胞中之轉導、宿主基因體中之整合及CAR在經轉導(「經CAR改造」) T細胞之表面上之表現。圖1B展示經CAR改造之T細胞，該細胞識別位於癌細胞表面上之靶抗原。識別且結合靶抗原可激活T細胞中包含細胞溶解活性、細胞介素釋放及T細胞增殖之機制；該等機制促進了癌細胞之殺死。 圖2係展示在經改造自體細胞療法(eACT™)期間實施之主要步驟之卡通圖。 圖3包含一系列展示表現於T細胞表面上之本發明CAR之檢測之繪圖，該等T細胞係自兩種供體個體獲得。「模擬」繪圖係使用缺乏編碼CAR之多核苷酸之載體進行轉導。「M7」及「M8」 T細胞係使用如本文所闡述分別包括M7及M8多核苷酸之載體進行轉導。 圖4A及圖4B包含一系列顯示本發明CAR之細胞溶解活性之條形圖。在圖4A中，分析中所靶向之細胞類型(293T)缺乏由CAR識別之腫瘤抗原，從而例示該等CAR設計之特異性。在圖4B中，分析中所靶向之細胞類型(SKMEL28)在表面上表現由CAR識別之MART-1。藉由螢光素酶活性之減小來鑑別靶細胞之細胞死亡。模擬、M7及M8繪圖係如上文在圖3中所闡述。「M9」 T細胞係如本文所闡述包括M9多核苷酸之載體進行轉導。 圖5A至圖5D包含一系列展示與增加數量之靶細胞接觸之表現CAR之T細胞(本發明)之細胞溶解活性的條形圖。在圖5A及圖5B中，分析中所靶向之細胞類型(293T)缺乏由CAR識別之腫瘤抗原，從而例示該等CAR設計之特異性。在圖5C及圖5D中，分析中所靶向之細胞類型(SKMEL28)在表面上表現由CAR識別之MART-1。藉由螢光素酶活性之減小來鑑別靶細胞之細胞死亡。「M7」及「M8」 T細胞係使用如本文所闡述分別包括M7及M8多核苷酸之載體進行轉導。「模擬」 T細胞係使用缺乏編碼CAR之多核苷酸之載體進行轉導。使用兩種T細胞供體5244及5273重複實驗。 圖6A及圖6B包含一系列顯示本發明CAR之細胞溶解活性之條形圖。在圖6A中，分析中所靶向之細胞類型(293T)缺乏由CAR識別之腫瘤抗原，從而例示該等CAR設計之特異性。在圖6B中，分析中所靶向之細胞類型(SKMEL28)在表面上表現由CAR識別之MART-1。藉由螢光素酶活性之減小來鑑別靶細胞之細胞死亡。模擬、M1及M2繪圖展示使用與293T及SKMEL28細胞一起以4:1之效應物對靶比率培育之CAR構築體轉導之T細胞的數據。量測活細胞之螢光。

Claims (75)

1. 一種編碼嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸，其中該CAR包括至少一個抗原結合域、活化域及共刺激域，其中該抗原結合域對MART-1具有特異性。
2. 如請求項1之多核苷酸，其中該抗原結合域對MART-1之細胞外表位(epitope)具有特異性。
3. 如請求項1或2之多核苷酸，其中該抗原結合域包括抗體或其抗原結合片段。
4. 如請求項1至3中任一項之多核苷酸，其中該抗體或該其抗原結合片段係選自由以下組成之群：IgG、Fab、Fab′、F(ab′)₂ 、Fv、scFv及單域抗體(dAB)。
5. 如請求項1至4中任一項之多核苷酸，其中該抗體或其抗原結合片段係scFv。
6. 如請求項5之多核苷酸，其中該scFv包括至少一個輕鏈可變(VL)區及至少一個重鏈可變(VH)區。
7. 如請求項6之多核苷酸，其中該VH區係N端連接至該VL區。
8. 如請求項6之多核苷酸，其中該VL區係N端連接至該VH區。
9. 如請求項6至8中任一項之多核苷酸，其中該VL區包括VL互補決定區(CDR) 1 (VL CDR1)、VL CDR2及VL CDR3，且該VH區包括VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。
10. 如請求項9之多核苷酸，其中該VL CDR1與SEQ ID NO: 1至少90%一致，該VL CDR2與SEQ ID NO: 2至少90%一致，且該VL CDR3與SEQ ID NO: 3至少90%一致。
11. 如請求項9或10之多核苷酸，其中該VH CDR1與SEQ ID NO: 7或10至少90%一致，該VH CDR2與SEQ ID NO: 8或11至少90%一致，且該VH CDR3與SEQ ID NO: 9至少90%一致。
12. 如請求項9至11中任一項之多核苷酸，其中該VL與SEQ ID NO: 18至少85%一致。
13. 如請求項9至12中任一項之多核苷酸，其中該VH與SEQ ID NO: 19至少85%一致。
14. 如請求項1至7或9至13中任一項之多核苷酸，其中該抗原結合域與SEQ ID NO: 20至少80%一致。
15. 如請求項1至6或8至13中任一項之多核苷酸，其中該抗原結合域與SEQ ID NO: 21至少80%一致。
16. 如請求項6至13中任一項之多核苷酸，其中該VL係由與SEQ ID NO: 26至少85%一致之多核苷酸編碼。
17. 如請求項6至13或16中任一項之多核苷酸，其中該VH係由與SEQ ID NO: 27至少85%一致之多核苷酸編碼。
18. 如請求項1至7或9至15中任一項之多核苷酸，其中該抗原結合域係由與SEQ ID NO: 28至少80%一致之多核苷酸編碼。
19. 如請求項1至6或8至15中任一項之多核苷酸，其中該抗原結合域係由與SEQ ID NO: 29至少80%一致之多核苷酸編碼。
20. 如請求項6至9中任一項之多核苷酸，其中該VL CDR1與SEQ ID NO: 4至少90%一致，該VL CDR2與SEQ ID NO: 5至少90%一致，且該VL CDR3與SEQ ID NO: 6至少90%一致。
21. 如請求項6至9或20之多核苷酸，其中該VH CDR1與SEQ ID NO: 12、15或17至少90%一致，該VH CDR2與SEQ ID NO: 13或16至少90%一致，且該VH CDR3與SEQ ID NO: 14至少90%一致。
22. 如請求項6至9、20或21中任一項之多核苷酸，其中該VL與SEQ ID NO: 22至少85%一致。
23. 如請求項6至9及20至22中任一項之多核苷酸，其中該VH與SEQ ID NO: 23至少85%一致。
24. 如請求項1至7、9或20至23中任一項之多核苷酸，其中該抗原結合域與SEQ ID NO: 24至少80%一致。
25. 如請求項1至6、8、9或20至23中任一項之多核苷酸，該抗原結合域與SEQ ID NO: 25至少80%一致。
26. 如請求項6至9或20至23中任一項之多核苷酸，其中該VL係由與SEQ ID NO: 30至少85%一致之多核苷酸編碼。
27. 如請求項6至9、20至23或26中任一項之多核苷酸，其中該VH係由與SEQ ID NO: 31至少85%一致之多核苷酸編碼。
28. 如請求項1至7、9或20至27中任一項之多核苷酸，其中該抗原結合域係由與SEQ ID NO: 32至少80%一致之多核苷酸編碼。
29. 如請求項1至6、8、9或20至27中任一項之多核苷酸，其中該抗原結合域係由與SEQ ID NO: 33至少80%一致之多核苷酸編碼。
30. 如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中在該活化域與該共刺激域之間存在鉸鏈域。
31. 如請求項30之多核苷酸，其中該共刺激域及該鉸鏈域包括單一鄰接域。
32. 一種載體，其包括如請求項1至31中任一項之多核苷酸。
33. 如請求項32之載體，其中該載體係腺病毒載體、腺病毒相關載體、DNA載體、慢病毒載體、質體、逆轉錄病毒載體或RNA載體。
34. 如請求項33之載體，其中該載體係逆轉錄病毒載體。
35. 如請求項34之載體，其中該逆轉錄病毒載體係慢病毒載體。
36. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其係由如請求項1至31中任一項之多核苷酸或如請求項32至35中任一項之載體編碼。
37. 一種細胞，其包括如請求項1至31中任一項之多核苷酸、如請求項32至35中任一項之載體或如請求項36之嵌合抗原受體(CAR)。
38. 如請求項37之細胞，其中該細胞係T細胞。
39. 如請求項37或38之細胞，其中該T細胞係同種異體T細胞、自體T細胞、經改造自體T細胞(eACT)或腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
40. 如請求項39之細胞，其中該T細胞係CD4+ T細胞。
41. 如請求項39之細胞，其中該T細胞係CD8+ T細胞。
42. 如請求項37至41中任一項之細胞，其中該細胞係活體外細胞。
43. 如請求項38至42中任一項之細胞，其中該T細胞係自體T細胞。
44. 如請求項37至43中任一項之細胞，其中該細胞在由MART-1活化時至少產生干擾素γ (IFNγ)。
45. 一種組合物，其包括複數個如請求項37至44中任一項之細胞。
46. 如請求項45之組合物，其中該組合物包括CD4+或CD8+細胞。
47. 如請求項45之組合物，其中該組合物包括CD4+及CD8+細胞。
48. 如請求項45至47中任一項之組合物，其中該複數個細胞中之每一細胞係自體T細胞。
49. 如請求項45至48中任一項之組合物，其中該組合物包括至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
50. 一種組合物，其包括如請求項1至31中任一項之多核苷酸、如請求項32至35中任一項之載體或如請求項36之嵌合抗原受體(CAR)。
51. 一種製造表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞之方法，其包括使用如請求項1至31中任一項之多核苷酸或如請求項32至35中任一項之載體轉導細胞之步驟。
52. 如請求項51之方法，其中該細胞係自需要治療之患者所分離之淋巴球。
53. 如請求項52之方法，其中該淋巴球係天然殺手細胞、T細胞或B細胞。
54. 如請求項51至53中任一項之方法，其進一步包括在促進細胞增殖及/或T細胞活化之條件下培養該細胞之步驟。
55. 如請求項51至54中任一項之方法，其進一步包括分離期望T細胞之步驟。
56. 如請求項55之方法，其中分離該等期望T細胞之步驟發生於培養約6天之後。
57. 如請求項56之方法，其中該等期望T細胞表現CD4+及/或CD8+。
58. 一種治療黑色素瘤之方法，其包括向有需要之個體投與如請求項37至44中任一項之細胞或如請求項45至50中任一項之組合物。
59. 一種治療黑色素瘤之方法，其包括向有需要之個體投與表現特異性靶向MART-1之嵌合抗原受體(CAR)之細胞。
60. 如請求項59之方法，其中該CAR包括至少一個抗原結合域、活化域及共刺激域，其中該抗原結合域特異性結合至MART-1。
61. 如請求項59或60之方法，其中該抗原結合域特異性結合至MART-1之細胞外表位。
62. 如請求項59至61中任一項之方法，其中該抗原結合域係、係獲自或衍生自IgG、Fab、Fab′、F(ab′)₂ 、Fv、scFv或單域抗體(dAB)。
63. 如請求項59至62中任一項之方法，其中該抗原結合域係、係獲自或衍生自scFv。
64. 如請求項63之方法，其中該scFv包括至少一個輕鏈可變(VL)區及至少一個重鏈可變(VH)區。
65. 如請求項64之方法，其中該VH區係N端連接至VL區。
66. 如請求項64之方法，其中該VL區係N端連接至VH區。
67. 如請求項60至66中任一項之方法，其中在該活化域與該共刺激域之間存在鉸鏈域。
68. 如請求項60至66中任一項之方法，其中該共刺激域及該鉸鏈域包括單一鄰接域。
69. 如請求項59至68中任一項之方法，其中該細胞係T細胞。
70. 如請求項69之方法，其中該T細胞係同種異體T細胞、自體T細胞、經改造自體T細胞(eACT)或腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
71. 如請求項69或70之方法，其中該T細胞係CD4+ T細胞。
72. 如請求項69或70之方法，其中該T細胞係CD8+ T細胞。
73. 如請求項59至72中任一項之方法，其中該細胞係活體外細胞。
74. 如請求項69至73中任一項之方法，其中該T細胞係自體T細胞。
75. 如請求項69至74中任一項之方法，其中該T細胞在由MART-1活化時至少產生干擾素γ (IFNγ)。