CN116997564A - 改善免疫细胞功能 - Google Patents

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CN116997564A CN202280019565.7A CN202280019565A CN116997564A CN 116997564 A CN116997564 A CN 116997564A CN 202280019565 A CN202280019565 A CN 202280019565A CN 116997564 A CN116997564 A CN 116997564A
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R·E·温特
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Abstract

本公开涉及细胞疗法领域，并且更具体地，涉及通过细胞因子信号传导的改善来改善CAR和/或TCR功能。

Description

改善免疫细胞功能
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月11日提交的美国临时申请63/159,610号和2021年6月14日提交的美国临时申请63/210,300号的优先权，这些申请出于所有目的全文并入本文。
技术领域
本公开涉及免疫学和细胞疗法领域，并且更具体地，涉及通过调节细胞因子信号传导来改善包含嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)的基于T细胞和自然杀伤(NK)细胞的免疫疗法。
背景技术
免疫系统通过其在全身搜索、寻找和破坏恶性细胞的能力提供了针对癌症的先天防御。然而，这种防御机制需要注意的是，某些癌症可能会诱导免疫抑制微环境，它会降低抗肿瘤免疫应答的稳健性。(Beatty等人，Clin Cancer Res,(21)(4):687-632(2015))。这些免疫逃逸机制对细胞免疫疗法的实施和有效性提出了挑战，包括使用工程化细胞疗法技术，诸如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和T细胞受体(TCR)T细胞疗法和/或基于自然杀伤细胞的免疫疗法。
由于总体T细胞功能和增殖依赖于细胞因子信号传导，因此理论上认为使用细胞因子可以提高基于T细胞的疗法的总体质量和效力。过去的研究已经证明IL-2作为一种基于T细胞的治疗扩增手段是成功的，尽管缺点包括T-细胞耗竭和T-细胞持久性降低。(Gattinoni等人，J Clin Invest,(115):1616-1626(2005))。其他研究表明，CAR-T细胞与IL-7和IL-15一起使用可提高效力(Xu等人，Blood,(123):3750-3759(2014))。还报道了CAR-T效力随着IL-21的使用得到了改善(Singh等人，Cancer Res,(71)3516-3527(2011))。类似地，已经发现IL-2可增强NK细胞的细胞毒性(Hu等人,Front.Immunol.,(20)1205(2019))。
因此，需要开发细胞因子信号传导作为用于改善基于免疫细胞的免疫疗法的功效的手段的用途。
发明内容
公开了膜结合白介素15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体。在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体包含IL-15多肽，该IL-15多肽包含根据SEQ IDNO:6的氨基酸序列；第一接头，该第一接头将IL-15结构域连结到根据SEQ ID NO:7或SEQID NO:95的IL-15Rαsushi结构域多肽；和跨膜结构域，该跨膜结构域包含FAS跨膜结构域或二聚化结构域，诸如IL-7跨膜结构域。
在实施方案中，连结IL-15多肽和IL-15Rαsushi结构域的第一接头包含根据SEQID NO:8的氨基酸序列。在实施方案中，第一接头包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在实施方案中，IL-15Rαsushi结构域多肽通过第二接头连结到跨膜结构域。在实施方案中，第二接头包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在实施方案中，第二接头包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在实施方案中，跨膜结构域是包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列的FAS跨膜结构域。在实施方案中，跨膜结构域是包含根据SEQ ID NO:42的氨基酸序列的FAS跨膜结构域。在实施方案中，IL-7跨膜结构域包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体包含选自由SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28和94组成的组的氨基酸序列。在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体包含根据SEQ ID NO:30的氨基酸。
在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体还包含信号传导序列。在一些实施方案中，信号传导序列包含根据SEQ ID NO:12-20中的一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号传导序列包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
公开了编码本文所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的核酸。在实施方案中，编码膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的核酸包含根据选自由SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:100组成的组的序列的核酸序列。
公开了包含编码本文所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的核酸的重组载体。
在实施方案中，重组载体或核酸还包含编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的核酸。在实施方案中，CAR或TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：2B4(CD244)、4-1BB、5T4、A33抗原、腺癌抗原、肾上腺素受体β3(ADRB3)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、甲胎蛋白(AFP)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、雄激素受体、B7H3(CD276)、β2-整合素、BAFF、B淋巴瘤细胞、B细胞成熟抗原(BCMA)、bcr-abl(由断裂点簇集区(BCR)和阿伯森鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白)、BhCG、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节物兄弟)、BST2、C242抗原、9-0-乙酰基-CA19-9标记物、CA-125、CAEX、钙网蛋白、碳酸酐酶9(CAIX)、C-MET、CCR4、CCR5、CCR8、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD7、CD10、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD51、CD52、CD56、CD63、CD70、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD96、CD97、CD100、CD123、CD125、CD133、CD137、CD138、CD150、CD152(CTLA-4)、CD160、CD171、CD179a、CD200、CD221、CD229、CD244、CD272(BTLA)、CD274(PD-L1、B7H1)、CD279(PD-1)、CD352、CD358、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、癌胚抗原(CEA)、闭合蛋白(claudin)6(CLDN6)、C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞抗原、CNT0888、CRTAM(CD355)、CS-1(也称为CD2亚类1、CRACC、CD319和19A24)、CTLA-4、细胞周期蛋白B l、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、细胞色素P450 1B 1(CYP1B1)、DNAM-1(CD226)、桥粒芯糖蛋白4、DR3、DR5、E-钙粘蛋白新表位、表皮生长因子受体(EGFR)、EGF1R、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)、延长因子2突变(ELF2M)、内皮唾液酸蛋白、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、肝配蛋白B2、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2,3,4(erb-B2,3,4)、ERBB、ERBB2(Her2/neu)、ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、ETA、位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、FBP、Fc受体样5(FcRL5)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、纤连蛋白额外结构域-B、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体1、叶酸受体β、叶酸受体γ、Fos-相关抗原1、岩藻糖基、岩藻糖基GM1；GM2、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、GITR(TNFRSF 18)、GM1、神经节苷脂GM3、globoH糖神经酰胺(glycoceramide)的己糖部分(GloboH)、糖蛋白75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、糖蛋白100(gpl00)、GPNMB、G蛋白-偶联受体20(GPR20)、G蛋白偶联受体C类组5成员D(GPRC5D)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、高分子量黑素瘤相关联抗原(HMWMAA)、人乳头瘤病毒E6(HPV E6)、人乳头瘤病毒E7(HPV E7)、热休克蛋白70-2突变(mut hsp70-2)、人分散因子受体激酶、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、HVEM、ICOS、胰岛素样生长因子受体1(IGF-1受体)、IGF-I、IgGl、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、IL-6、白介素11受体α(IL-llRα)、IL-13、白介素13受体亚基α-2(IL-13Rα2或CD213A2)、胰岛素样生长因子I受体(IGF1-R)、整合素α5β1、整合素ανβ3、肠羧基酯酶、κ-轻链、KCS1、激酶插入结构域受体(KDR)、KIR、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、KIR-L、KG2D配体、KIT(CD117)、KLRGI、LAGE-la、LAG3、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、豆荚蛋白、白细胞相关联免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、路易斯(Y)抗原、LeY、LG、LI细胞粘附分子(LI-CAM)、LIGHT、LMP2、淋巴细胞抗原6复合物、LTBR、基因座K 9(LY6K)、Ly-6、淋巴细胞抗原75(LY75)、黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)、MAGE、黑素瘤相关联抗原1(MAGE-A1)、由T细胞识别的MAGE-A3黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)、MelanA/MARTl、间皮素、MAGE A3、黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)、黑素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSCP)、MORAb-009、MS4A1、粘蛋白1(MUCl)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、MUC16、粘蛋白CanAg、苗勒氏抑制物质(MIS)II型受体、v-myc禽髓细胞瘤病毒癌基因成神经细胞瘤衍生同源物(MYCN)、N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)、神经细胞粘附分子(NCAM)、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E配体、NKR-P IA、NPC-1C、NTB-A、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、OX40、浆细胞抗原、聚SA、顶体蛋白酶结合蛋白sp32(OY-TES l)、p53、p53突变体、泛连接蛋白3(PANX3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)、PD-1H、血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α)、PDGFR-β、PDL192、PEN-5、磷脂酰丝氨酸、胎盘特异性1(PLAC1)、聚唾液酸、前列腺酶(Prostase)、前列腺癌细胞、前列腺素(prostein)、蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)、蛋白酶3(PR1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、蛋白酶体(前体、巨蛋白因子)亚基β型、晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)、RANKL、Ras突变体、Ras同源物家族成员C(RhoC)、RON、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、肾泛素1(RU1)、肾泛素2(RU2)、肉瘤易位断点、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)、SAS、SDC1、SLAMF7、唾液酰路易斯粘附分子(sLe)、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、音猬因子(SHH)、精子蛋白17(SPA17)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、STEAP、sTn抗原、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、存活素、肿瘤相关联糖蛋白72(TAG72)、TCR5β、TCRα、TCRβ、TCRδ、TCRγ，交替阅读框蛋白(TARP)、端粒酶、TIGIT、TNF-α前体、肿瘤内皮标记物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标记物7相关(TEM7R)、生腱蛋白C、TGF-β1、TGF-β2、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)、TIM1、TIM2、TIM3、Tn Ag、TRAIL-R1、TRAIL-R2、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、肿瘤抗原CTAA16.88、酪氨酸酶、尿溶蛋白2(UPK2)、VEGF-A、VEGFR-1、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和波形蛋白、TACI、Wilms肿瘤蛋白(WT1)或X抗原家族成员1A(XAGE1)。
公开了包含本文所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体、重组载体或核酸的免疫细胞。在实施方案中，免疫细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。公开了包含本文所述的免疫细胞的药物组合物。
公开了治疗受试者中与肿瘤抗原的表达相关联的癌症的方法，包括：向受试者施用本文公开的有效量的免疫细胞或药物组合物。
公开了在受试者中诱导免疫应答或使受试者针对癌症免疫的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的有效量的免疫细胞或药物组合物。
公开了用于改善免疫细胞功能的方法，包括对免疫细胞进行工程化以表达膜结合白介素15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体。
具体实施方式
术语
为了更容易理解本公开，下面首先定义某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其他术语的附加定义。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”被理解为包含性的并且涵盖“或”和“和”两者。
本文所使用的术语“和/或”应被视为两个指定特征或部件中的每一者连同或不连同另一者的具体公开。因此，如在本文中诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；以及B(单独)。同样，如诸如“A、B和/或C”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
如本文所用，术语“例如”仅以举例的方式使用，并非旨在进行限制，并且不应被解释为仅指代说明书中明确列举的那些项目。
术语“或更多”、“至少”、“超过”等例如“至少一个”被理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。
相反，术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二”等被理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。
在整个说明书中，词语“包括”或诸如“包含”或“具有”之类的变型形式将被理解为暗示包含所述元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组。应当理解，无论本文在何处用语言“包括”描述各方面，还提供了按照“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面。
除非特别说明或从上下文明显看出，术语“约”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，这将部分地取决于如何测量或确定该值或组成，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由……组成”可意指在一个或超过一个标准偏差内。“约”或“基本上由……组成”可意指至多10％(即，±10％)的范围。因此，“约”可被理解为在比所述值大或小10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内。例如，约5mg可包括4.5mg与5.5mg之间的任何量。此外，特别是对于生物系统或过程而言，这些术语可意指某个值的至多一个数量级或至多5倍。当在本公开中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“基本上由……组成”的含义应被假定在该特定值或组成的可接受误差范围内。
如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包括在所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。
本文使用的单位、前缀和符号使用它们的国际单位制(SI)接受的形式提供。数字范围包括定义该范围的数字。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Juo，“生物医学与分子生物学简明词典(TheConcise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)”，第2版，2001年，CRC出版社(CRC Press)；“细胞与分子生物学词典(The Dictionary of Cell&MolecularBiology)”，第5版，2013年，学术出版社(Academic Press)；以及“牛津生物化学与分子生物学词典(The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)”,Cammack等人编辑，第2版，2006年,Oxford University Press)为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将药剂物理引入受试者，诸如本文公开的经修饰的T细胞或NK细胞。用于本文所公开的制剂的示例性施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径(例如，通过注射或输注)。短语“肠胃外施用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式(通常通过注射)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。在一些实施方案中，经由非肠胃外途径(例如，口服)施用制剂。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部。施用也可以例如进行一次、进行多次，以及/或者在一个或多个延长的时段内进行。
术语“活化的”和“活化”是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞或NK细胞的状态。在一个实施方案中，活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”主要是指正在增殖的T细胞。术语“活化的NK细胞”主要是指正在增殖的NK细胞。单独通过TCR产生的信号可能不足以完全活化T细胞，并且可能还需要一种或多种次级或共刺激信号。因此，T细胞活化包括通过TCR/CD3复合物产生的初级刺激信号，以及一种或多种次级共刺激信号。共刺激可以通过已接受初级活化信号(诸如通过TCR/CD3复合物进行刺激)的T细胞引起的增殖和/或细胞因子产生来证明。
术语“药剂”可以指任何种类的分子或实体，或多个分子或实体，其中任一者可以是例如多肽、核酸、糖、脂质、小分子、金属、细胞(诸如T细胞或NK细胞或此类细胞的祖细胞)或生物体(例如，其级分或提取物)或它们的组分。在一些实施方案中，药剂可以以分离的或纯的形式使用。在一些实施方案中，药剂可以以粗制或不纯的形式使用。在一些实施方案中，药剂可以作为群体、集合或文库提供，例如可以对其进行筛选以识别或表征其中存在的成员。
术语“同种异体”是指来源于一个个体并且随后引入相同物种的另一个个体的任何材料，例如同种异体T细胞移植。
术语“抗体”(Ab)包括但不限于特异性结合抗原的糖蛋白免疫球蛋白。一般来讲，抗体可以包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或者其抗原结合分子。每条H链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH区和VL区可以进一步细分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布更保守的区域(称为框架区(FR))。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，其从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。Ab的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。一般来讲，人抗体是大约150kD的四聚体作用剂，其由两个相同的重(H)链多肽(各约50kD)和两个相同的轻(L)链多肽(各约25kD)组成，这些多肽彼此缔合成通常称为“Y形”结构的结构。重链和轻链通过单个二硫键彼此连结或连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接，使得二聚体彼此连接并且形成四聚体。天然产生的抗体也是糖基化的，例如在CH2结构域上糖基化。
术语“人抗体”旨在包括具有由人免疫球蛋白序列产生、装配或衍生的可变结构域序列和恒定结构域序列、或者与其不可区分的序列的抗体。在一些实施方案中，抗体(或抗体组分)可以被认为是“人的”，即使它们的氨基酸序列包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的残基或元件(例如，通过体外随机或位点特异性诱变引入的变异或者通过体内体细胞突变引入的变异)。术语“人源化”旨在包括具有以下可变结构域的抗体：该可变结构域具有来源于非人物种(例如，小鼠)的可变结构域的序列，其被修饰为与人种系编码序列更相似。在一些实施方案中，“人源化”抗体包含一个或多个基本上具有人框架结构域的氨基酸序列的框架结构域，以及一个或多个基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区。在一些实施方案中，人源化抗体包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白恒定结构域的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体可以包含人重链恒定结构域的CH1、铰链、CH2、CH3，以及任选地，CH4区。
抗体可以包括例如单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、工程化的抗体、人源化的抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、内体、抗体融合体(有时在本文中称为“抗体缀合物”)、异源缀合物抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、亲和体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗抗Id抗体)、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)，以及上述任一种抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群体。抗体还可以包括例如Fab′片段、Fd′片段、Fd片段、分离的CDR、单链Fv、多肽-Fc融合体、单结构域抗体(例如，鲨鱼单结构域抗体，诸如IgNAR或其片段)、骆驼科动物抗体、单链双抗体或串联双抗体微型抗体、锚蛋白重复蛋白或/>DART、TCR样抗体、微量蛋白抗体、和/>
免疫球蛋白可以来源于任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG、IgE和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab类或亚类(例如，IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。非人抗体可以通过重组方法人源化，以降低其在人体内的免疫原性。在未明确说明的情况下，并且除非上下文另外指示，否则术语“抗体”还包括前述免疫球蛋白中的任一种免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价的片段或部分，以及单链抗体。
“抗原结合分子”、“抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗体片段”或“抗原结合结构域”是指包含衍生该分子的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)的任何分子。抗原结合分子可以包含抗原互补决定区(CDR)。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、dAb、线性抗体、scFv抗体以及由抗原结合分子形成的多特异性抗体。肽体(即，包含肽结合结构域的Fc融合分子)是合适的抗原结合分子的另一个示例。在一些实施方案中，抗原结合分子结合肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合参与过度增殖性疾病的细胞上的抗原或者病毒或细菌抗原。在某些实施方案中，抗原结合分子为嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在某些实施方案中，抗原结合分子或结构域为特异性结合抗原的抗体片段，包括其互补决定区(CDR)中的一者或多者。在另外的实施方案中，抗原结合分子是单链可变区片段(scFv)。在一些实施方案中，抗原结合分子或结构域包含高亲合性多聚体(avimer)或由其组成。
在一些情况下，CDR与参考抗体(例如，本公开的抗体)中发现的CDR和/或本公开中提供的CDR的序列基本上相同。在一些实施方案中，CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，其序列相同或者含有1、2、3、4或5个(例如，1至5个)氨基酸取代。在一些实施方案中，CDR与参考CDR基本上相同，因为其显示与参考CDR具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的序列同一性。在一些实施方案中，CDR与参考CDR基本上相同，因为其显示与参考CDR具有至少96％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，该CDR内缺失、添加或取代了一个氨基酸，而该CDR的氨基酸序列在其他方面与参考CDR的氨基酸序列相同。在一些实施方案中，CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，该CDR内缺失、添加或取代了2、3、4或5(例如2至5个)氨基酸，而该CDR的氨基酸序列在其他方面与参考CDR的氨基酸序列相同。在各种实施方案中，抗原结合片段与参考抗体结合相同的抗原。在各种实施方案中，抗原结合片段与参考抗体交叉竞争，例如，与参考抗体结合基本上相同或相同的表位
抗原结合片段可以通过任何方式产生。例如，在一些实施方案中，抗原结合片段可以通过完整抗体的片段化来以酶促方式或化学方式产生。在一些实施方案中，抗原结合片段可以重组产生(诸如通过表达工程化核酸序列)。在一些实施方案中，抗原结合片段可以是完全或部分合成产生的。在一些实施方案中，抗原结合片段可以具有至少约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190个或更多个氨基酸的长度；在一些实施方案中，至少约200个氨基酸(例如，50-100个、50-150个、50-200个或100-200个氨基酸)的长度。
术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用。可变区通常是指抗体的一部分，一般指轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中的氨基末端的约110至120个氨基酸和成熟轻链中的约90至115个氨基酸，其在抗体之间在序列中存在广泛差异并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中的更高度保守的区域称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施方案中，可变区是人可变区。在某些实施方案中，可变区包括啮齿动物或鼠CDR和人框架区(FR)。在实施方案中，可变区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在某些实施方案中，可变区包括啮齿动物或鼠CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)框架区(FR)。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用，以指代抗体或其抗原结合分子的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用，以指代抗体或其抗原结合分子的重链可变区。
通常使用CDR的许多定义：Kabat编号、Chothia编号、AbM编号或Contact编号。AbM定义是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用的两种定义之间的折衷。Contact定义基于对可获得的复杂晶体结构的分析。
表1：CDR编号
术语“Kabat编号”和类似术语是本领域公认的，是指对抗体或其抗原结合分子的重链可变区和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在某些方面，抗体的CDR可以根据Kabat编号系统来确定(参见例如，Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391，以及Kabat EA等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生与公众服务部，NIH公开号91-3242)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于以下氨基酸位置处：氨基酸位置31至35，其在35(在Kabat编号方案中称为35A和35B)之后任选地可以包括一个或两个附加的氨基酸(CDR1)；氨基酸位置50至65(CDR2)；以及氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于以下氨基酸位置处：氨基酸位置24至34(CDR1)，氨基酸位置50至56(CDR2)，以及氨基酸位置89至97(CDR3)。在一个具体的实施方案中，已根据Kabat编号方案确定本文所述抗体的CDR。
在某些方面，抗体的CDR可根据Chothia编号方案确定，其是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如Chothia C&Lesk AM,(1987),J Mol Biol196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)J Mol Biol 273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol215(1):175-82；以及美国专利7,709,226号)。通常，当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，ChothiaCDR-H2环存在于重链氨基酸52至56，并且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102处，而Chothia CDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR–HI环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅存在35A，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束。在一个具体的实施方案中，已根据Chothia编号方案确定本文所述抗体的CDR。
术语“恒定区”和“恒定结构域”可互换使用并且具有本领域的普通含义。恒定区是抗体部分，例如，轻链和/或重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是可以表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体相互作用。免疫球蛋白分子的恒定区通常具有相对于免疫球蛋白可变结构域更保守的氨基酸序列。
术语“重链”在参考抗体使用时，可以指基于恒定结构域的氨基酸序列的任何不同类型，例如α、δ、ε、γ和μ，其分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包括IgG亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
术语“轻链”在参考抗体使用时，可以指基于恒定结构域的氨基酸序列的任何不同类型，例如κ或λ。轻链氨基酸序列在本领域中是众所周知的。在具体实施方案中，轻链是人轻链。
“抗原”是指可以刺激人或动物中的抗体产生或T细胞响应的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到人或动物中的组合物(诸如包含肿瘤特异性蛋白质的组合物)。抗原与特异性体液免疫或细胞免疫的产物反应，该免疫包括由异源性抗原(诸如本发明所公开的抗原)诱导的那些。“靶标抗原”或“感兴趣的靶标抗原”是基本上未在其他正常(所需)细胞的表面上发现并且本文设想的TCR或CAR的结合结构域被设计成与之结合的抗原。本领域技术人员将容易理解，任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)都可以充当抗原。抗原可以内源性表达，即由基因组DNA表达，或者可以重组表达。抗原可以对于某种组织(诸如癌细胞)具有特异性，或者可以广泛表达。此外，较大分子的片段可以充当抗原。“靶标”是由结合基序、CAR、TCR或抗原结合剂(例如，抗体)结合的任何分子。
“抗原特异性靶向区域”(ASTR)是指靶向特异性抗原的CAR或TCR区域。CAR或TCR上的靶向区域是细胞外的。在一些实施方案中，抗原特异性靶向区域包含抗体或其功能等同物或其片段或其衍生物，并且每个靶向区域靶向不同的抗原。靶向区域可包含全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体，它们中的每一者对靶标抗原是特异性的。然而，存在许多替代物，诸如连接的细胞因子(其导致识别携带细胞因子受体的细胞)、亲和体、来自天然存在的受体的配体结合结构域、受体(例如在肿瘤细胞上)的可溶性蛋白质/肽配体、肽以及促进免疫应答的疫苗，它们各自可用于本公开的各种实施方案中。事实上，如本领域技术人员所理解的，几乎任何以高亲和力结合给定抗原的分子都可用作抗原特异性靶向区域。
“抗原递呈细胞”或“APC”是指处理抗原并且将抗原递呈给T细胞的细胞。示例性APC包括树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、某些活化的上皮细胞，以及能够进行TCR刺激和适当的T细胞共刺激的其他细胞类型。
“抗肿瘤作用”是指可以表现为肿瘤体积减小、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少、转移瘤数目减少、总生存期或无进展生存期延长、预期寿命延长，或者与肿瘤相关的各种生理症状改善的生物学作用。抗肿瘤作用还可以指预防肿瘤的发生。
如果一个事件或实体的存在、级别和/或形式与另一个事件或实体的存在、级别和/或形式相关，则两个事件或实体彼此“关联”。例如，如果实体(例如，多肽、遗传标记、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与疾病、障碍或病症的发病率和/或对疾病、障碍或病症的易感性关联(例如，跨越相关群体)，则认为该实体与疾病、障碍或病症相关联。例如，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，则它们在物理上彼此“关联”，使得它们彼此在物理上接近和/或保持彼此接近(例如，结合)。在另外的示例中，彼此物理缔合的两个或更多个实体彼此共价连接或连接，或非共价缔合，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性以及它们的组合。
术语“自体”是指来源于相同个体并且稍后再次引入该个体的任何材料。例如，本文所述的工程化自体细胞疗法(eACTTM)方法涉及从患者收集淋巴细胞，然后将其工程化以表达例如CAR构建体，随后施用回同一患者。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。可以以本领域已知的多种方式测量和/或表达亲和力，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD由koff/kon的商计算，而KA由kon/koff的商计算。kon是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，并且koff是指例如抗体与抗原的解离。kon和koff可以通过本领域普通技术人员已知的技术确定，诸如或KinExA。
术语“KD”(M)指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，或抗体或抗体结合片段与抗原结合的解离平衡常数。KD与结合亲和力之间存在反比关系，因此KD值越小，亲和力越高，即越强。因此，术语“较高亲和力”或“较强亲和力”涉及形成相互作用的较高能力并且因此涉及较小的KD值，并且相反地，术语“较低亲和力”或“较弱亲和力”涉及形成相互作用的较低能力并且因此涉及较大的KD值。在一些情况下，特定分子(例如抗体)对其相互作用配偶体分子(例如抗原X)的结合亲和力(或KD)相比于该分子(例如抗体)对另一相互作用配偶体分子(例如抗原Y)的结合亲和力较高，可表示为通过将较大的KD值(较低或较弱的亲和力)除以较小的KD值(较高或较强的亲和力)所确定的结合比率，例如表示为5倍或10倍大的结合亲和力，视情况而定。
术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数，或抗体或抗体结合片段的解离速率常数。所述值也被称为k0ir值。
术语“ka”(M-1×sec-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数，或抗体或抗体结合片段的缔合速率常数。
术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数，或抗体或抗体结合片段的缔合平衡常数。通过将ka除以kd获得缔合平衡常数。
术语“结合”通常是指两个或更多个实体之间的非共价结合。直接结合涉及实体或部分之间的物理接触。“间接”结合涉及通过与一个或多个中间实体物理接触的方式的物理交互。两个或更多个实体之间的结合可以在多种背景中的任一种中评估，例如，其中相互作用的实体或部分在分离中或在更复杂系统的背景中研究(例如，当与载体实体共价地或以其他方式缔合时和/或在生物系统诸如细胞中)。
术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”在抗体的情境下是类似的术语，并且是指结合抗原(例如，表位或免疫复合物)的分子，因为这种结合是本领域技术人员所理解的。例如，与抗原特异性结合的分子可与其他肽或多肽结合，通常具有较低的亲和力，如通过例如免疫测定法、KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或本领域已知的其他测定法所测定的。在一个具体的实施方案中，与抗原特异性结合的分子与具有一定KA的抗原结合，当分子与另一种抗原结合时，KA为至少2log、2.5log、3log、4log或更大。与结合基序、抗体或抗原结合系统与不是靶标(即非靶标)的实体的缔合相比，结合可包括结合基序、抗体或抗原结合系统与结合基序、抗体或抗原结合系统的靶标的优先缔合。在一些实施方案中，如果与结合基序、抗体或抗原结合系统与非靶标的结合相比，结合基序、抗体或抗原结合系统与靶标之间的结合大于2倍、大于5倍、大于10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或大于100倍，则结合基序、抗体或抗原结合系统选择性地结合靶标。在一些实施方案中，如果结合亲和力小于约10-5M、小于约10-6M、小于约10-7M、小于约10-8M或小于约10-9M，则结合基序、抗体或抗原结合系统选择性地结合靶标。
在另一个实施方案中，与抗原特异性结合的分子以约1×10-7M的离解常数(Kd)结合。在一些实施方案中，当Kd为1×10-9M至约5×10-9M时，抗原结合分子以“高亲和力”与抗原特异性结合。在一些实施方案中，当Kd为1×10-10M至约5×10-10M时，抗原结合分子以“非常高的亲和力”与抗原特异性结合。在一个实施方案中，抗原结合分子具有10-9M的Kd。在一个实施方案中，解离速率小于约1×10-5。
在某些实施方案中，本文提供了与靶标人抗原结合的抗体或其抗原结合分子，例如，在某些实施方案中，抗原结合分子以比对另一种靶标抗原高5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更高的亲和力与靶标抗原结合，如通过例如放射免疫测定、表面等离子体共振或动力学排阻测定所测量的。在一个具体的实施方案中，本文所述的结合人靶标抗原的抗体或其抗原结合分子将以小于10％、15％或20％的抗体或其抗原结合分子与人抗原的结合与另一种靶标抗原结合，如通过例如放射免疫测定、表面等离子体共振或动力学排阻测定所测量的。
术语“癌症”整体涉及其中异常细胞不受控制地分裂并且可能侵入附近组织的一类疾病或病症。可以通过本公开的方法治疗的癌症的示例包括但不限于免疫系统的癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和其他白细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，本公开的方法可以用于减小来源于例如以下癌症的肿瘤的肿瘤大小：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、多发性骨髓瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、转化滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)(包括非T细胞ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌，肾脏或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境引起的癌症(包括石棉引起的那些癌症)、其他B细胞恶性肿瘤，以及所述癌症的组合。在一个具体实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。特定癌症可能对化疗或放疗有应答，或者癌症可能是难治性的。难治性癌症是指不适于外科手术干预的癌症，并且该癌症最初对化疗或放疗无应答，或者该癌症随时间推移而变得无应答。癌症还包括二线或更多线全身疗法之后的复发或难治性大B细胞淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)非特指型、二线或更多线全身疗法之后的原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、高级别B细胞淋巴瘤，以及由滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL。
术语“癌性细胞”、“癌细胞”、“肿瘤细胞”或其变型是指癌性生长物或组织的各个细胞。肿瘤通常是指通过细胞的异常生长形成的肿胀或病变，该细胞可以是良性细胞、恶化前细胞或恶性细胞。大多数癌症形成肿瘤，但其中一些(例如白血病)不一定形成肿瘤。对于形成肿瘤的那些癌症，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换使用。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，其可测量为肿瘤的数量、体积或重量。
“趋化因子”是一种介导细胞趋化性或定向运动的细胞因子。趋化因子的示例包括但不限于IL-8、IL-16、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3、巨噬细胞源趋化因子(MDC或CCL22)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1或CCL2)、MCP-4、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α、MIP-1a)、MIP-1β(MIP-1b)、γ诱导蛋白10(IP-10)和胸腺活化调节趋化因子(TARC或CCL17)。
“嵌合抗原受体”或“CAR”是指被工程化为包含结合基序以及在抗原结合后活化免疫细胞(例如T细胞，诸如幼稚T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、NK细胞或它们的组合)的手段的分子。CAR也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。在一些实施方案中，CAR包含结合基序、细胞外结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域，以及细胞内信号传导结构域。已经被基因工程化以表达嵌合抗原受体的T细胞可以称为CAR T细胞。类似地，已经被基因工程化以表达嵌合抗原受体的NK细胞可以称为CAR NK细胞。
所谓“减少”或“降低”或“减小”，通常是指与由单独的媒介物(即，活性部分)或对照分子/组合物引起的生理响应相比，本文所设想的组合物产生、引发或引起较小的生理响应(即，下游效应)的能力。“减少的”或“降低的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包括为媒介物即对照组合物所产生的响应(参考响应)的1/1.1、1/1.2、1/1.5、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/5.5、1/6、1/6.5、1/7、1/7.5、1/8、1/8.5、1/9、1/9.5、1/10、1/15、1/20、1/30或更少(例如，1/500、1/1000)(就分母而言，包括在前述数字之间且大于1的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减少。
“细胞外结构域”(或“ECD”)是指多肽的一部分，当多肽存在于细胞膜中时，该部分被理解为位于细胞膜的外部、在细胞外空间中。
如本文所用，术语“细胞外配体结合结构域”是指能够结合配体(例如，细胞表面分子)的寡肽或多肽。例如，可选择细胞外配体结合结构域来识别在与特定疾病状态(例如，癌症)相关的靶标细胞上充当细胞表面标志物的配体。可作为配体的细胞表面标志物的示例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
CAR的结合结构域之后可以是“间隔区”或“铰链”，其是指移动抗原结合结构域远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化的区域(Patel等人，GeneTherapy,1999；6:412-419)。CAR中的铰链区通常在跨膜结构域(TM)与结合结构域之间。在某些实施方案中，铰链区是免疫球蛋白铰链区并且可以是野生型免疫球蛋白铰链区或改变的野生型免疫球蛋白铰链区。本文所述的CAR中使用的其他示例性铰链区包括来源于1型膜蛋白质(诸如CD8alpha、CD4、CD28和CD7)的细胞外区域的铰链区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区，或者可以改变。
“跨膜”区或结构域是CAR的部分，其将细胞外结合部分锚定到免疫效应细胞的质膜上，并促进结合结构域与靶标抗原的结合。跨膜结构域可以是CD3ζ跨膜结构域，然而可使用的其他跨膜结构域包括从CD8α、CD4、CD28、CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154获得的那些。在一个实施方案中，跨膜结构域是CD137的跨膜结构域。在某些实施方案中，跨膜结构域是合成的，在这种情况下，其将主要包含疏水性残基诸如亮氨酸和缬氨酸。
“细胞内信号传导结构域”或“信号传导结构域”是指嵌合抗原受体蛋白的以下部分：其参与将结合靶标抗原的有效CAR的消息转导进免疫效应细胞的内部中，以引发效应细胞功能，例如活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括将细胞毒性因子释放到CAR结合的靶标细胞，或者用抗原结合至细胞外CAR结构域引发的其他细胞响应。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或者有助于活性(包括细胞因子分泌)。因此，术语“细胞内信号传导结构域”或“信号传导结构域”在本文中可互换使用，是指转导效应子功能信号并且引导细胞执行特化功能的蛋白质部分。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，不必使用整个结构域。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的情况下，可以使用此类截短部分替代整个结构域，只要其转导效应子功能信号即可。术语“细胞内信号传导结构域”意在包括该细胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。细胞内信号传导结构域也称为“信号转导结构域”，并且通常来源于人CD3或FcRy链的部分。
已知单独通过T细胞受体产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可被称为由以下两个不同类别的细胞质信号传导序列介导：通过T细胞受体启动抗原依赖性初级活化的那些(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。以共刺激方式起作用的细胞质信号传导序列可含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
在本公开中特别有用的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列的示例包括来源于DAP10、DAP12、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指CAR的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是不同于抗原受体或Fc受体的细胞表面分子，其在与抗原结合时提供T淋巴细胞有效活化和功能所需的第二信号。此类共刺激分子的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、0X40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKD2C、B7-H2和特异性结合CD83的配体。因此，虽然本公开提供了来源于4-1BB的示例性共刺激结构域，但也设想了其他共刺激结构域。包含一个或多个共刺激信号传导结构域可增强表达CAR受体的T细胞的功效和扩增。细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以任何串联顺序连接到跨膜结构域的羧基末端。
尽管工程化以含有来自CD3或FcRγ的信号传导结构域的基于scFv的CAR已显示递送用于T细胞活化和效应子功能的有效信号，但它们不足以在不存在伴随共刺激信号的情况下引发促进T细胞存活和扩增的信号。含有结合结构域、铰链、跨膜和来源于CD3ζ或FcRγ的信号传导结构域以及一个或多个共刺激信号传导结构域(例如，来源于4-1BB、CD28、CD137、CD134和CD278的细胞内共刺激结构域)的其他CAR可更有效地指导体外表达CAR的T细胞中以及动物模型和癌症患者中的抗肿瘤活性以及增加的细胞因子分泌、溶解活性、存活和增殖(Milone等人，Molecular Therapy,2009；17:1453-1464；Zhong等人，MolecularTherapy,2010；18:413-420；Carpenito等人，PNAS,2009；106:3360-3365)。
“共刺激信号”是指与诸如TCR/CD3连接之类的初级信号联合引起T细胞应答(诸如但不限于增殖和/或对关键分子的上调或下调)的信号。
“共刺激配体”包括抗原递呈细胞上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子。共刺激配体的结合提供了介导T细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的信号。共刺激配体诱导除了刺激分子提供的初级信号之外的信号，例如，通过T细胞受体(TCR)/CD3复合物与装载有肽的主要组织相容性复合物(MHC)分子的结合。共刺激配体可包括但不限于3/TR6、4-1BB配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD30配体、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒侵入介体(HVEM)、人白细胞抗原G(HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白样转录物(ILT)3、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、与B7-H3特异性结合的配体、淋巴毒素β受体、MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白B(MICB)、OX40配体、PD-L2或程序性死亡(PD)L1。共刺激配体包括但不限于与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、与CD83特异性结合的配体、淋巴细胞功能相关联抗原1(LFA-1)、自然杀伤细胞受体C(NKG2C)、OX40、PD-1或肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14或LIGHT)。
“共刺激分子”是T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于，“共刺激分子”是T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD33、CD 45、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3(α；β；δ；ε；γ；ζ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配体、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96(Tactile)、CDl-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Igα(CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关联抗原-1(LFA-1(CDl la/CD18)、MHC I类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或者它们的片段、截短形式或组合。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。具有侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在某些实施方案中，可以用具有相似侧链的氨基酸残基替换CDR内或者抗体或其抗原结合分子的框架区内的一个或多个氨基酸残基。一般来讲，如果两个序列在对应位置含有保守氨基酸取代，则通常被认为是“基本上类似的”。例如，某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，并且/或者具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸被取代为相同类型的另一个氨基酸可以被认为是保守取代。示例性的氨基酸分类汇总在以下的表2和表3中：
表2
氨基酸 三字母 单字母 特性 特性 亲水性指数
丙氨酸 Ala A 无极性 中性 1.8
精氨酸 Arg R 极性 阳性 -4.5
天冬酰胺 Asn N 极性 中性 -3.5
天冬氨酸 Asp D 极性 阴性 -3.5
半胱氨酸 Cys C 无极性 中性 2.5
谷氨酸 Glu E 极性 阴性 -3.5
谷氨酰胺 Gln Q 极性 中性 -3.5
甘氨酸 Gly G 无极性 中性 -0.4
组氨酸 His H 极性 阳性 -3.2
异亮氨酸 Ile I 无极性 中性 4.5
亮氨酸 Leu L 无极性 中性 3.8
赖氨酸 Lys K 极性 阳性 -3.9
甲硫氨酸 Met M 无极性 中性 1.9
苯丙氨酸 Phe F 无极性 中性 2.8
脯氨酸 Pro P 无极性 中性 -1.6
丝氨酸 Ser S 极性 中性 -0.8
苏氨酸 Thr T 极性 中性 -0.7
色氨酸 Trp W 无极性 中性 -0.9
酪氨酸 Tyr Y 极性 中性 -1.3
缬氨酸 Val V 无极性 中性 4.2
表3
不明确的氨基酸 三字母 单字母
天冬酰胺或天冬氨酸 Asx B
谷氨酰胺或谷氨酸 Glx Z
亮氨酸或异亮氨酸 Xle J
未指定或未知的氨基酸 Xaa X
“组合疗法”是指个体同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两个或更多个治疗部分)的那些情况。在一些实施方案中，两个或更多个方案可以同时施用；在一些实施方案中，此类方案可以相继施用(例如，第一方案的所有“剂量”在施用任何剂量的第二方案之前施用)；在一些实施方案中，此类作用剂以重叠给药方案施用。在一些实施方案中，“施用”组合疗法可以涉及将一种或多种作用剂或者模式施用于接受该组合中的其他作用剂或者模式的受试者。为清楚起见，组合疗法不需要将各作用剂在单个组合物中一起施用(或甚至不必同时施用)，然而在一些实施方案中，两种或更多种作用剂或者它们的活性部分可以在组合的组合物中、或者甚至在组合的化合物(例如，作为单一化学复合物或共价实体的一部分)中一起施用。
“对应于”可用于通过与适当的参考分子或组合物比较来指定分子或组合物中结构元素的位置/身份。例如，在一些实施方案中，聚合物中的单体残基(例如，多肽中的氨基酸残基或多核苷酸中的核酸残基)可被鉴定为“对应于”适当参考聚合物中的残基。例如，为了简单起见，多肽中的残基可以使用基于参考相关多肽的规范编号系统来指定，使得例如“对应于”位置100处残基的氨基酸实际上不必是氨基酸链中的第100个氨基酸，条件是它对应于参考多肽中位置100处发现的残基。可使用多种序列比对策略，包括软件程序，例如BLAST、CS-BLAST、CUDASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE，其可用于例如鉴定根据本公开的多肽和/或核酸中的“相应”残基。
如果抗原与第一抗原结合分子之间的相互作用阻断、限制、抑制或以其他方式降低参考结合分子与抗原相互作用的能力，则该抗原结合分子(诸如抗体、其抗原结合片段、CAR或TCR)与参考结合分子(诸如抗体或其抗原结合片段)“交叉竞争”。交叉竞争可以是完全的，例如，抗原结合分子与抗原的结合完全阻断参考结合分子结合抗原的能力，或者其可以是部分的，例如，抗原结合分子与抗原的结合降低参考抗原结合分子结合抗原的能力。在某些实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子结合与参考抗原结合分子相同或重叠的表位。在其他实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子结合与参考抗原结合分子不同的表位。许多类型的竞争结合测定可用于确定一种抗原结合分子是否与另一种竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)；夹心竞争测定(Stahli等人，1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(Kirkland等人，1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(Harlow和Lane，1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125标记的固相直接标记RIA(Morel等人，1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人，1990,Virology 176:546-552)；以及直接标记的RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。
“细胞因子”是指对与特异性抗原接触作出应答而由一个细胞释放的非抗体蛋白，其中细胞因子与第二细胞相互作用以介导第二细胞中的应答。细胞因子可以由细胞内源性表达或者被施用于受试者。细胞因子可由免疫细胞(包括巨噬细胞、B细胞、T细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可以在受体细胞中诱导各种应答。细胞因子可以包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎细胞因子、效应子和急性期蛋白。例如，包括白介素(IL)7和IL-15在内的稳态细胞因子促进免疫细胞存活和增殖，并且促炎细胞因子可以促进炎性应答。稳态细胞因子的示例包括但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15和干扰素(IFN)γ。促炎细胞因子的示例包括但不限于IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)、可溶性血管细胞粘附分子1(sVCAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PLGF)。效应子的示例包括但不限于颗粒酶A、颗粒酶B、可溶性Fas配体(sFasL)和穿孔素。急性期蛋白的示例包括但不限于C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)。
所谓“减少”或“降低”或“减小”，通常是指与由单独的媒介物(即，活性部分)或对照分子/组合物引起的生理响应相比，本文所设想的组合物产生、引发或引起较小的生理响应(即，下游效应)的能力。“减少的”或“降低的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包括为媒介物即对照组合物所产生的响应(参考响应)的1/1.1、1/1.2、1/1.5、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/5.5、1/6、1/6.5、1/7、1/7.5、1/8、1/8.5、1/9、1/9.5、1/10、1/15、1/20、1/30或更少(例如，1/500、1/1000)(就分母而言，包括在前述数字之间且大于1的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减少。
术语“结构域”是指实体的一部分。在一些实施方案中，“结构域”与实体的结构和/或功能特征相关联，例如，使得当结构域与其亲本实体的其余部分在物理上分离时，它基本上或完全保留结构和/或功能特征。在一些实施方案中，结构域可以包括实体的一部分，当与该(亲本)实体分离并与不同的(接收者)实体链接或连接时，该部分基本上保留和/或在接收者实体上赋予一种或多种结构和/或功能特征，例如在亲本实体中表征的。在一些实施方案中，结构域是分子(例如，小分子、碳水化合物、脂质、核酸或多肽)的一部分。在一些实施方案中，结构域是多肽的区段；在一些这样的实施方案中，结构域的特征在于结构元素(例如，氨基酸序列或序列基序、α-螺旋特征、β-折叠特征、卷曲螺旋特征、无规卷曲特征等)和/或功能特征(例如，结合活性、酶活性、折叠活性、信号传导活性等)。
术语“剂型”可以用于指施用于受试者的活性剂(例如，抗原结合系统或抗体)的物理离散单元。一般来讲，每个这种单元均含有预定数量的活性剂。在一些实施方案中，这种数量是适用于根据已经被确定为当施用于相关群体时与期望或有益结果相关的给药方案施用的单位剂量(或其整个部分)。施用于受试者的治疗组合物或治疗剂的总量由一个或多个执业医生确定，并且可以涉及施用多于一种剂型。
术语“给药方案”可以用于指单独地施用于受试者的一组一个或多个单位剂量。在一些实施方案中，给定治疗剂具有推荐的给药方案，其可以涉及一个或多个剂量。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，其中每个剂量在时间上与其他剂量分开。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，并且连续剂量彼此分开相等长度的时间段；在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，并且连续剂量彼此分开至少两种不同长度的时间段。在一些实施方案中，给药方案内的所有剂量具有相同的单位剂量。在一些实施方案中，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施方案中，给药方案包括第一量的第一剂量，之后是与第一量不同的第二量的一个或多个附加剂量。在一些实施方案中，周期性地调整给药方案以实现期望或有益的结果。
“效应细胞”是指表达一种或多种Fc受体并且介导一种或多种效应子功能的免疫系统细胞。在一些实施方案中，效应细胞可以包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中的一种或多种。效应细胞可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
“效应子功能”是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用的生物学结果。效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体介导的细胞毒性(CMC)。效应子功能可以是抗原结合依赖性的、抗原结合非依赖性的或两者兼有。ADCC是指通过免疫效应细胞裂解抗体结合的靶标细胞。不希望受任何理论的束缚，ADCC通常被理解为涉及携带Fc受体(FcR)的效应细胞识别并随后杀死抗体包被的靶标细胞(例如，在它们的表面上表达抗体与之结合的抗原的细胞)。介导ADCC的效应细胞可以包括免疫细胞，包括但不限于自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞中的一种或多种。
术语“工程化的自体细胞疗法”(可缩写为“eACTTM”，也称为过继细胞转移)是通过其收集患者自身的T细胞并随后对这些细胞进行基因改造以识别和靶向在一种或多种特异性肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的一种或多种抗原的过程。可以将T细胞工程化以表达例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。对CAR阳性(+)T细胞进行工程改造以表达对特定肿瘤抗原具有特异性的细胞外单链可变区片段(scFv)，其连结到包含至少一个共刺激结构域和至少一个活化结构域的细胞内信号传导部分。共刺激结构域可以来源于天然存在的共刺激结构域或其变体，例如具有截短的铰链结构域的变体(“THD”)，并且活化结构域可以来源于例如CD3-ζ。在某些实施方案中，该CAR被设计成具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。CAR scFv可被设计成靶向。
在一些实施方案中，该CAR被工程化以使得共刺激结构域被表达为单独的多肽链。示例性CAR T细胞疗法和构建体描述于美国专利公布2013/0287748号、2014/0227237号、2014/0099309号和2014/0050708号中，这些专利公布全文以引用方式并入。“过继性细胞疗法”或“ACT”涉及将免疫细胞与抗肿瘤活性转移到受试者(例如，癌症患者)中。在一些实施方案中，ACT是涉及使用具有抗肿瘤活性的淋巴细胞(例如，工程化淋巴细胞)的治疗方法。
术语“增强”或“促进”，或者“增加”或“扩增”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的生理响应相比，本文所设想的组合物产生、引发或引起较大的生理响应(例如，下游效应)的能力。可测量的生理响应可以包括T细胞扩增、活化、持久性的增加，和/或癌细胞死亡杀伤能力的增加，以及根据本领域的理解和本文的描述显而易见的其他方面的增加。“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包括为媒介物或对照组合物所产生的响应的1.1、1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括在前述数字之间且大于1的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。
“表位”是指抗体可特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性表位或连续表位)，或者表位可以例如一同来自一个或多个多肽的两个或更多个非连续区域(构象表位、非线性表位、不连续表位或非连续表位)。在某些实施方案中，抗体与之结合的表位可以通过以下方式来确定：例如，NMR光谱、X射线衍射结晶学研究、ELISA测定、与质谱联用的氢/氘交换(例如，液相色谱电喷雾质谱)、基于阵列的寡肽扫描测定，和/或诱变映射(例如，定点诱变映射)。对于X射线晶体学，结晶可以使用本领域已知的任何方法完成(例如，GiegéR等人,(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；Chayen NE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。抗体:抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术来研究，并且可以使用以下计算机软件进行精制：诸如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations,Inc.传播；参见例如Meth Enzymol(1985)第114卷和第115卷，Wyckoff HW等人编辑；U.S.2004/0014194和BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr DBiol Crystallogr 49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)MethEnzymol 276A:361-423,Carter CW编辑；Roversi P等人,(2000)Acta Crystallogr DBiol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)。可以使用本领域技术人员已知的任何方法来完成诱变映射研究。参见例如Champe M等人，(1995)J Biol Chem 270:1388–1394以及Cunningham BC和Wells JA(1989)Science 244:1081–1085，获得诱变技术(包括丙氨酸扫描诱变技术)的描述。
关于基因、蛋白质和/或核酸的“内源”是指该基因、蛋白质和/或核酸天然存在于细胞诸如免疫细胞中。
“外源”是指将剂诸如核酸、基因或蛋白质例如从外部来源引入细胞中。引入细胞的核酸是外源的，即使它编码天然存在于细胞中的蛋白质。此类编码蛋白质的核酸的外源引入可用于增加蛋白质的表达，使其水平超过在类似条件下，例如不引入外源核酸的细胞中天然存在的水平。
术语“赋形剂”是指可以包含在组合物中例如以提供或有助于所需的稠度或稳定效应的作用剂。在一些实施方案中，合适的赋形剂可以包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。
如本文所用，“扩增”是指将转导的免疫细胞群扩增特定时间以产生工程化的免疫细胞群。扩增的预定时间可以是任何合适的时间，该任何合适的时间允许(i)在工程化的免疫细胞群中产生足够数量的细胞，用于施用于患者的至少一个剂量，(ii)与典型的较长过程相比产生具有有利比例的幼态细胞的工程化的免疫细胞群，或(iii)(i)和(ii)两者。该时间将取决于由免疫细胞表达的细胞表面受体、所使用的载体、具有治疗效果所需的剂量和其他变量。因此，在一些实施方案中，扩增的预定时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或多于21天。
如本文所述的材料或实体的“片段”或“部分”具有包括(例如，物理实体或抽象实体的)整体的离散部分的结构。在一些实施方案中，片段缺少存在于整体中的一个或多个部分。在一些实施方案中，片段由存在于整体中的特征结构元件、结构域或部分组成，或者包含存在于整体中的特征结构元件、结构域或部分。在一些实施方案中，聚合物片段包含存在于整体聚合物中的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或更多个单体单元(例如，残基)或者由其组成。在一些实施方案中，聚合物片段包含存在于整体聚合物中的单体单元(例如，残基)的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、25％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)或者由其组成。在一些实施方案中，整体材料或实体可以被称为片段的“亲本”。
术语“融合多肽”或“融合蛋白”通常是指包含至少两个区段的多肽。一般来讲，含有至少两个此类区段的多肽在这两个区段为以下部分的情况下被认为是融合多肽：(1)在自然界中不包含在相同的肽中，以及/或者(2)之前没有在单个多肽中彼此连结或连接，以及/或者(3)已经通过人工的操作彼此连结或连接。在实施方案中，CAR是融合蛋白。在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽是融合蛋白。
术语“基因产物”或“表达产物”通常是指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由从基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。
术语“基因工程改造的”或“工程改造的”是指修饰细胞的基因组的方法，包括但不限于删除编码区或非编码区或者其一部分，或者插入编码区或其一部分。在一些实施方案中，经修饰的细胞是淋巴细胞，例如T细胞或NK细胞，其可以从患者或供体获得。可以对细胞进行修饰以表达掺入该细胞的基因组中的外源性构建体，诸如例如膜结合白介素15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。工程化通常包括由人工来操纵。例如，当在自然界中未以该顺序连结或连接在一起的两个或更多个序列通过人工操纵以在工程化多核苷酸中直接彼此连结或连接时，多核苷酸被认为是“工程化的”。在通过分子生物学技术操纵细胞的情况下，如果细胞或生物体已经被操纵以使得其遗传信息被改变(例如，之前不存在的新遗传物质已经例如通过转化、体细胞杂交、转染、转导或其他机制被引入，或者之前存在的遗传物质例如通过取代或缺失突变、或通过其他方案被改变或去除)，则认为该细胞或生物体是“工程化的”。可以对工程化细胞进行修饰以表达掺入该细胞的基因组中的外源性构建体，诸如例如膜结合白介素15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。工程化多核苷酸或结合剂的子代通常被称为“工程化的”，即使实际操纵是在先前的实体上进行的。在一些实施方案中，“工程化的”是指已经设计和生产的实体。术语“设计的”是指以下作用剂：(i)其结构是由人工选择的；(ii)其通过需要人工的方法产生；和/或(iii)其不同于天然物质和其他已知作用剂。
“T细胞受体”或“TCR”是指存在于T细胞表面上的抗原识别分子。在正常T细胞发育期间，四个TCR基因即α、β、γ和δ中的每一者可以重新排列，从而导致高度多样化的TCR蛋白质。
术语“异源的”是指来自除天然存在的序列以外的任何来源。例如，作为共刺激蛋白的一部分包含的异源序列是不天然存在的氨基酸，即不与野生型人共刺激蛋白一致。例如，异源核苷酸序列是指不同于野生型人共刺激蛋白编码序列的核苷酸序列。
术语“同一性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。用于计算两个所提供的多肽序列之间的百分比同一性的方法是已知的。例如，可以通过出于最佳比较目的比对两个核酸或多肽序列来进行这两个序列的百分比同一性的计算(例如，可以在第一序列和第二序列中的一者或两者中引入空位以用于最佳比对，并且可以出于比较目的而忽略不相同的序列)。然后比较对应位置处的核苷酸或氨基酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的残基(例如，核苷酸或氨基酸)占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是这些序列共享的相同位置的数目的函数，任选地考虑空位的数目和每个空位的长度，可能需要引入空位来用于最佳比对这两个序列。序列的比较或比对以及两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法诸如BLAST(基本局部比对搜索工具)来实现。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％相同)，则认为它们是彼此“同源的”。
为了计算百分比同一性，进行比较的序列通常以给出这些序列之间的最大匹配的方式比对。可以用于确定百分比同一性的计算机程序的一个示例为GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res.12:387；Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,Wis.)。计算机算法GAP用于比对要确定其百分比序列同一性的两个多肽或多核苷酸。将序列进行比对以最佳匹配它们各自的氨基酸或核苷酸(“匹配的跨度”，如通过该算法确定的)。在某些实施方案中，该算法还使用标准比较矩阵(参见Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352中的PAM 250比较矩阵；Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919中的BLOSUM 62比较矩阵)。其他算法也可用于比较氨基酸序列或核酸序列，包括在商业计算机程序中可用的那些，诸如用于核苷酸序列的BLASTN，以及用于氨基酸序列的BLASTP、带空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于以下文献中：Altschul等人，Basic local alignmentsearch tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等人，Methods inEnzymology；Altschul等人，“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofprotein database search programs,”Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Baxevanis等人，Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes andProteins,Wiley,1998；以及Misener等人(编辑)，Bioinformatics Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132),Humana Press,1999。除了识别相似的序列之外，上文提到的程序还通常提供相似性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应残基中的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多在相关残基延伸段(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)上是相似和/或相同的，则认为这两个序列是基本上相似的。在一些实施方案中，相关延伸段是完整序列。在一些实施方案中，相关延伸段为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少325个、至少350个、至少375个、至少400个、至少425个、至少450个、至少475个、至少500个或更多个残基。具有显著的序列相似性的序列可以是彼此的同源物。
当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上相同”表示当用合适的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，在至少约95％、诸如至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，如通过任何公知的序列同一性算法诸如FASTA、BLAST或Gap所测量的，如下文所讨论。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本同一性的核酸分子可编码与参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本上相似氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似”意指两个肽序列在最佳比对时，诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重，共享至少95％序列同一性、甚至至少98％或99％序列同一性。通常，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。
术语“改善”、“增加”、“抑制”和“减少”表示相对于基线或其他参考测量的值。在一些实施方案中，适当的参比测量可以包括在某些系统中(例如，在单个个体中)在不存在(例如，之前和/或之后)药剂或治疗的在其他方面可比较的条件下，或在存在适当的可比较的参比药剂的情况下的测量。在一些实施方案中，适当的参比测量可以包括在已知或预期在相关药剂或治疗存在下以可比较的方式响应的可比较系统中的测量。
“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和中性粒细胞)和这些细胞中的任何细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括Ab、细胞因子和补体)的作用，导致选择性地靶向、结合、损害、破坏和/或清除来自脊椎动物身体的侵入病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞、或在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。
术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法来治疗罹患疾病或者有患上疾病或复发的风险的受试者。免疫疗法的示例包括但不限于NK细胞和T细胞疗法。T细胞疗法可包括过继性T细胞疗法、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)免疫疗法、自体细胞疗法、工程化的自体细胞疗法(eACTTM)和同种异体T细胞移植。然而，本领域技术人员将认识到本文所公开的调理方法将增强任何移植的T细胞疗法的功效。T细胞疗法的示例描述于美国专利公布2014/0154228号和2002/0006409号、美国专利号5,728,388号和国际公布号WO 2008/081035号中。
免疫疗法的T细胞或NK细胞可以来自本领域已知的任何来源。例如，T细胞和NK细胞可在体外从造血干细胞群中分化，或者可从受试者获得。T细胞和NK细胞可获自例如外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。此外，T细胞可以来源于本领域中可用的一种或多种T细胞系。还可使用技术人员已知的多种技术(诸如FICOLLTM分离和/或血液单采术)从收集自受试者的血液单位中获得T细胞。分离T细胞疗法用T细胞的附加方法公开于美国专利公布2013/0287748号中，该专利公布全文以引用方式并入本文。
术语“体外”是指在人工环境中发生的事件，例如在试管、反应容器、细胞培养物等中，而不是在多细胞生物体内。术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。体外细胞可包括T细胞或NK细胞。术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人或非人动物体内发生的事件。
术语“分离的”是指以下物质：(1)已经与该物质在较早时间与其缔合或者该物质原本会与其缔合的至少一些组分分离，以及/或者(2)存在于包含有限或限定的量或浓度的一种或多种已知或未知污染物的组合物中。在一些实施方案中，分离的物质可以与该物质在较早时间与其缔合的其他非物质组分(例如，该物质之前与其缔合或者原本会与其缔合的其他组分或污染物)的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)分离。在某些情况下，如果物质存在于含有量或浓度有限或减少的相同或相似类型的分子的组合物中，则该物质是分离的。例如，在某些情况下，如果核酸、DNA或RNA物质存在于含有量或浓度有限或减少的非物质核酸、DNA或RNA分子的组合物中，则该核酸、DNA或RNA物质是分离的。例如，在某些情况下，如果多肽物质存在于含有量或浓度有限或减少的非物质多肽分子的组合物中，则该多肽物质是分离的。在某些实施方案中，量可以是例如相对于存在于组合物中的期望物质的量测量的量。在某些实施方案中，有限的量可以是不超过组合物中的物质的量的100％(例如，不超过组合物中的物质的量的1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％))的量。在某些情况下，组合物就所选择的物质而言是纯的或基本上纯的。在一些实施方案中，分离的物质的纯度为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)。如果物质基本上不含其他组分或污染物，则该物质是“纯的”。在一些实施方案中，在已经与某些其他组分诸如一种或多种载剂或赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)混合后，物质仍可以被认为是“分离的”或甚至“纯的”；在此类实施方案中，在不包含此类载剂或赋形剂的情况下计算该物质的分离度或纯度百分比。
“接头”(L)或“接头结构域”或“接头区域”是指长度为约1至100个氨基酸的寡肽区或多肽区，其例如将膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽、嵌合抗原受体和/或scFv的结构域/区中的任一者连结在一起，或甚至将这些多肽中的一者或多者连结在一起。接头可以由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸组成，使得相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。当需要确保两个相邻结构域在空间上不相互干扰时，可以使用更长的接头。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割接头的示例包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等同物以及它们的组合。在一些实施方案中，接头包括小核糖核酸病毒2A样接头、猪捷申病毒(P2A)的CHYSEL(SEQ ID NO:1)序列、病毒(T2A)，或者它们的组合、变体和功能等同物。在其他实施方案中，接头序列可包含Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-Pro(2B)基序(SEQ IDNO:2)，其导致2A甘氨酸与2B脯氨酸之间的切割。其他接头包括不可切割接头。许多接头被用于实现本公开，包括“柔性接头”。后者富含甘氨酸。Klein等人，Protein Engineering,Design&Selection第27卷，第10期，第325–330页，2014；Priyanka等人，Protein Sci.，2013年2月；22(2):153–167。在一些实施方案中，接头是合成接头。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头富含甘氨酸(Gly或G)残基。在一些实施方案中，接头富含丝氨酸(Ser或S)残基。在一些实施方案中，接头富含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头具有一个或多个甘氨酸-丝氨酸残基对(GS)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GS对。在实施方案中，接头具有氨基酸序列AGS(SEQ ID NO:3)。在实施方案中，接头具有氨基酸序列GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGS(SEQ ID NO:4)。在实施方案中，接头具有氨基酸序列ggggsggggs(SEQ ID NO:5)。
接头可以是将不同元件彼此连接的多元件剂的一部分。例如，包含两个或更多个功能或结构结构域的多肽可在此类结构域之间包含将它们彼此连接的一段氨基酸。在一些实施方案中，包含接头元件的多肽具有一般形式S1-L-S2的总体结构，其中S1和S2可相同或不同并且表示通过接头彼此关联的两个结构域。接头可以将膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽、嵌合抗原受体和/或scFv的结构域/区中的任一者连接或连结在一起。在一些实施方案中，多肽接头的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个氨基酸(例如，长度为1至10、1至20、1至30、1至40、1至50、1至60、1至70、1至80、1至90、1至100、10至20、10至30、10至40、10至50、10至60、10至70、10至80、10至90或10至100个氨基酸)。在一个示例中，使用接头将IL-15多肽的C末端连接或连结到IL-15Rαsushi结构域多肽的N末端。在另一个示例中，使用接头将IL-15Rαsushi结构域多肽的C末端连结到跨膜结构域。在一些实施方案中，接头的特征在于它倾向于不采用刚性三维结构，而是为多肽提供柔性。在另一个示例中，其可用于连接待表达的一种或多种多肽，诸如本文所公开的CAR、TCR和/或膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽。在一些示例中，CAR或TCR和膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽通过可切割接头连接，例如使得它们可以作为单个肽表达，然后在细胞中切割。
术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。NK细胞是一种细胞毒性(对细胞有毒的)淋巴细胞，其代表固有免疫系统的组分。NK细胞排斥肿瘤和被病毒感染的细胞。它通过细胞凋亡或程序性细胞死亡的过程起作用。它们被称为“自然杀手”，因为它们不需要活化即可杀死细胞。T细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中起作用。其T细胞受体(TCR)将它们自己与其他淋巴细胞类型区分开。胸腺是免疫系统的专门器官，主要负责T细胞的成熟。T细胞有六种类型，即：辅助T细胞(例如，CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤性T细胞)、记忆T细胞((i)干记忆TSCM细胞(如幼稚细胞)是CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+，但它们还表达大量的CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并显示出许多记忆细胞特有的功能属性)；(ii)中枢记忆TCM细胞表达L-选择素和CCR7，它们分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，以及(iii)然而，效应记忆TEM细胞不表达L-选择素或CCR7，但产生效应细胞因子(如IFNγ和IL-4))、调节性T细胞(Treg、抑制性T细胞或CD4+CD25+调节性T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT)和γδT细胞。另一方面，B细胞在体液免疫(有抗体参与)中起作用。其制造抗体和抗原并发挥抗原递呈细胞(APC)的作用，并在通过抗原相互作用活化后转变为记忆B细胞。在哺乳动物中，未成熟B细胞在其名称所来源的骨髓中形成。
术语“中和”是指结合配体并防止或降低该配体的生物学作用的抗原结合分子、scFv、抗体或其片段。在一些实施方案中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段直接阻断配体上的结合位点，或通过间接方式(例如，配体中的结构或能量改变)改变配体的结合能力。在一些实施方案中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段防止与其结合的蛋白质执行生物学功能。
“核酸”是指核苷酸的任何聚合链。核酸可以是DNA、RNA或它们的组合。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个天然核酸残基。在一些实施方案中，核酸包含一种或多种核酸类似物。在一些实施方案中，核酸通过以下方式中的一种或多种来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板进行聚合来酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中繁殖，以及化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基(例如，20至100个、20至500个、20至1000个、20至2000个，或者20至5000个或更多个残基)。在一些实施方案中，核酸是部分或全部单链的；在一些实施方案中，核酸是部分或全部双链的。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个编码多肽的元件的核苷酸序列，或者是编码多肽的序列的补体序列。
“可操作地连接”是指所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并置关系。例如，“可操作地连接”至功能元件的控制元件以使得在与控制元件相容的条件下实现功能元件的表达和/或活性的方式缔合。在实施方案中，启动子可操作地连结到核酸
“患者”包括罹患癌症的任何人。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽的序列的最大氨基酸数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)和长链(其在本领域中通常称为蛋白质，蛋白质有很多类型)。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
术语“药学上可接受的”是指当施用于接受者时对其接受者无害、或者任何有害作用被对其接受者的有益效果胜过的分子或组合物。就用于配制如本文所公开的组合物的载剂、稀释剂或赋形剂而言，药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂必须与该组合物的其他成分相容，并且对其接受者无害，或者任何有害作用必须被对接受者的有益效果胜过。术语“药学上可接受的载剂”意指涉及将作用剂从身体的一部分携带或运输到另一部分(例如，从一个器官到另一个器官)的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。存在于药物组合物中的每种载剂从以下意义上说必须是“可接受的”：与制剂的其他成分相容并且对患者无害，或者任何有害作用必须被对接受者的有益效果胜过。可以充当药学上可接受的载剂的材料的一些示例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可油和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及药物制剂中所采用的其他无毒相容物质。
术语“药物组合物”是指其中活性剂与一种或多种药学上可接受的载剂一起配制的组合物。在一些实施方案中，活性剂以适用于在治疗方案中施用的单位剂量存在，当施用于相关受试者或群体时，该治疗方案示出实现预定治疗效果的统计上显著的概率。在一些实施方案中，药物组合物可以被配制用于以固体或液体形式施用，包括但不限于适合于以下各项的形式：口服施用，例如灌服剂(水性或非水性溶液剂或混悬剂)、片剂(例如，靶向颊面、舌下和全身吸收的那些)、大丸药、散剂、颗粒剂、施用于舌的糊剂；肠胃外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液剂或混悬剂，或者缓释制剂；局部施加，例如作为霜剂、软膏剂或控释贴剂，或者施加于皮肤、肺部或口腔的喷雾剂；阴道内或直肠内施用，例如，作为阴道栓剂、霜剂或泡沫；舌下施用；眼部施用；经皮施用；或经鼻、经肺施用和经其他粘膜表面施用。
术语“增殖”是指细胞分裂(对称或非对称的细胞分裂)的增加。在一些实施方案中，“增殖”是指T细胞的对称或非对称分裂。当经处理样品中的细胞数量与未经处理样品中的细胞相比增加时，发生“增殖增加”。
术语“参考”描述了相对于其进行比较的标准物或对照物。例如，在一些实施方案中，将感兴趣的作用剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与作为作用剂、动物、个体、群体、样品、序列或值的参考物或对照物进行比较。在一些实施方案中，参考物或对照物与感兴趣的测试、测量或测定基本上同时进行测试、测量和/或测定。在一些实施方案中，参考物或对照物是历史参考物或对照物，其任选地体现在有形介质中。一般来讲，在与评估的条件或情况相当的条件或情况下测定或表征参考物或对照物。当存在足够的相似性以证明对所选择的参考物或对照物的依赖和/或比较是正确的时。
“调节性T细胞”(“Treg”、“Treg细胞”或“Tregs”)是指参与控制某些免疫活动例如自身免疫、过敏和对感染的应答的CD4+T淋巴细胞谱系。调节性T细胞可以调节T细胞群的活动，并且还可以影响某些先天免疫系统细胞类型。Treg可以通过生物标志物CD4、CD25和Foxp3的表达以及CD127的低表达来鉴定。天然存在的Treg细胞通常占外周CD4+T淋巴细胞的约5％-10％。然而，肿瘤微环境中的Treg细胞(即肿瘤浸润性Treg细胞)，Treg细胞可占总CD4+T淋巴细胞群的多达20％-30％。
术语“样品”通常是指从感兴趣的来源获得或衍生的材料的等分试样。在一些实施方案中，感兴趣的来源是生物或环境来源。在一些实施方案中，感兴趣的来源可以包括细胞或生物体，诸如细胞群、组织或动物(例如，人)。在一些实施方案中，感兴趣的来源包括生物组织或流体。在一些实施方案中，生物组织或流体可包括羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、母乳、脑脊液、耳垢、乳糜、食糜、射精、内淋巴、渗出液、粪便、胃酸、胃液、淋巴液、粘液、心包液、外淋巴液、腹膜液、胸膜液、脓液、发炎性分泌物、唾液、皮脂、精液、血清、包皮垢、痰、滑液、汗液、泪液、尿液、阴道分泌物、玻璃体液、呕吐物和/或它们的组合或组分。在一些实施方案中，生物流体可以包括细胞内液、细胞外液、血管内液(血浆)、间质液、淋巴液和/或跨细胞液。在一些实施方案中，生物流体可包括植物渗出物。在一些实施方案中，生物组织或样品可以例如通过抽吸、活组织检查(例如，细针或组织活组织检查)、拭子(例如，口腔、鼻腔、皮肤或阴道拭子)、刮擦、手术、洗涤或灌洗(例如，支气管肺泡、导管、鼻腔、眼部、口腔、子宫、阴道或其他洗涤或灌洗)来获得。在一些实施方案中，生物样品包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何合适的方式直接从感兴趣的来源获得的“原始样品”。在一些实施方案中，如从上下文将清楚的，术语“样品”是指通过处理原始样品(例如，通过除去一种或多种药剂的一种或多种组分和/或通过向其中添加一种或多种药剂)获得的制剂。这样的“经处理的样品”可以包括例如从样品中提取的核酸或蛋白质或通过使原始样品经受一种或多种技术诸如核酸的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等而获得的核酸或蛋白质。
“单链可变片段”、“单链抗体可变片段”或“scFv”抗体是指包含通过接头肽连接的仅重链和轻链的可变区的抗体形式。
术语“癌症的分期”是指对癌症进展水平的定性或定量评估。在一些实施方案中，用于确定癌症分期的标准可包括但不限于以下中的一者或多者：癌症位于身体中何处、肿瘤大小、癌症是否已扩散到淋巴结、癌症是否已扩散到身体的一个或多个不同部分等。在一些实施方案中，可使用所谓的TNM系统对癌症进行分期，根据TNM系统，T是指通常称为原发性肿瘤的主要肿瘤的大小和程度；N是指患有癌症的附近淋巴结的数目；并且M是指癌症是否已经转移。在一些实施方案中，癌症可被称为0期(存在未扩散至附近组织的异常细胞，也称为原位癌，或CIS；CIS不是癌症，尽管可能变成癌症)，I-III期(存在癌症；数目越高，肿瘤越大并且其扩散到附近组织中越多)，或IV期(癌症已扩散到身体的远端部分)。在一些实施方案中，癌症可被指定为选自由以下项组成的组的分期：原位；局部化的(癌症限于其开始的地方，没有其已扩散的迹象)；区域性的(癌症已扩散到附近的淋巴结、组织或器官)：远端(癌症已扩散到身体的远端部分)；以及未知的(没有足够的信息来确定分期)。
“刺激”是指通过刺激分子与其同源配体的结合而诱导的初级应答，其中该结合介导信号转导事件。“刺激分子”是T细胞上的分子(例如，T细胞受体(TCR)/CD3复合物)，其与抗原递呈细胞上递呈的同源刺激配体特异性结合。“刺激配体”是当在抗原递呈细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上递呈时可与T细胞上的刺激分子特异性结合，从而介导T细胞的初级应答(包括但不限于活化、起始免疫应答、增殖等)的配体。刺激配体包括但不限于抗CD3抗体(诸如OKT3)、装载有肽的MHC I类分子、超激动剂抗CD2抗体和超激动剂抗CD28抗体。
短语“治疗剂”可指当施用于生物体时引起所需药理学作用的任何药剂。在一些实施方案中，如果药剂在适当群体中表现出统计上显著的作用，则该药剂被视为治疗剂。在一些实施方案中，合适的群体可以是模型生物或人类受试者的群体。在一些实施方案中，可根据生物标志物的存在或不存在等，通过各种标准，诸如特定年龄组、性别、遗传背景、预先存在的临床状况来定义适当的群体。在一些实施方案中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发生率的物质。在一些实施方案中，治疗剂是在其可以上市销售以施用于人之前已经或需要被政府机构批准的药剂。在一些实施方案中，治疗剂是需要医学处方才能施用于人的药剂。
治疗剂(例如，工程改造的CAR T细胞或NK细胞)的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一种治疗剂联合使用时，保护受试者免受疾病发作或促进疾病消退(通过疾病症状的严重程度的减轻、无症状疾病期的频率和持续时间的增加或因患病导致的障碍或残疾的预防来证实)的任何量。可使用技术人员已知的多种方法来评估治疗剂促进疾病消退的能力，诸如在临床试验期间的人类受试者中，在预测对人的功效的动物模型系统中，或通过在体外测定法中测定药剂的活性。
术语“转导”和“转导的”是指经由病毒载体将外源DNA引入细胞中的过程(参见Jones等人，“Genetics:principles and analysis,”Boston:Jones&Bartlett Publ.(1998))。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein-Barr病毒载体、乳头病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关联载体、慢病毒载体或它们的任何组合。
“转化”是指将外源性DNA引入宿主细胞中的任何过程。转化可以使用各种方法在自然条件或人工条件下进行。转化可以使用用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞中的任何已知方法来实现。在一些实施方案中，基于正在被转化的宿主细胞和/或将要被插入的核酸来选择一些转化方法。转化方法可以包括但不限于病毒感染、电穿孔和脂质转染。在一些实施方案中，“转化的”细胞稳定地转化，原因是插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分进行复制。在一些实施方案中，转化的细胞可以表达引入的核酸。
受试者的“治疗”或“处理”是指在受试者上执行的任何类型的干预或过程，或对受试者施用活性剂，目的是逆转、缓解、改善、抑制、减慢或预防与疾病相关联的症状、并发症或病症或者生化指标的发作、进展、发展、严重程度或复发。在一个实施方案中，“治疗”包括部分缓解。在另一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括完全缓解。在一些实施方案中，治疗可以是对未表现出相关疾病、障碍和/或病症的体征的受试者和/或仅表现出疾病、障碍和/或病症的早期体征的受试者的治疗。在一些实施方案中，这样的治疗可以是对表现出相关疾病、障碍和/或病症的一种或多种已确定体征的受试者的治疗。在一些实施方案中，治疗可以是对已被诊断为患有相关疾病、障碍和/或病症的受试者的治疗。在一些实施方案中，治疗可以是已知具有一种或多种易感性因子的受试者，这些易感性因子在统计学上与相关疾病、障碍和/或病症发展的增加的风险相关。
术语“载体”是指经修饰以包含或掺入所提供的核酸序列的受体核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，是指附加的DNA可以连接到其中的环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将附加的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体，以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体包含引导与它们可操作地连接的插入基因表达的序列。此类载体在本文中可以被称为“表达载体”。标准技术可以用于将载体工程化，例如，如存在于Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))中的标准技术，该文献以引用方式并入本文。
“结合蛋白”是能够非共价结合另一分子的蛋白。结合蛋白可与例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)结合。在蛋白结合蛋白的情况下，其可与自身结合(以形成同源二聚体、同源三聚体等)和/或其可与一种或多种不同蛋白的一个或多个分子结合。结合蛋白可具有多于一种类型的结合活性。
“跨膜结构域”是包含至少一个连续氨基酸序列的多肽的结构域，当存在于在哺乳动物细胞中表达的对应内源多肽中时，该连续氨基酸序列穿过脂质双层。例如，跨膜结构域可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个连续的氨基酸序列，当存在于在哺乳动物细胞中表达的对应内源多肽中时，每个氨基酸序列穿过脂质双层。跨膜结构域可例如包括在脂质双层中具有α-螺旋二级结构的至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)连续的氨基酸序列(当存在于在哺乳动物细胞中表达的对应内源多肽中时，其穿过脂质双层)。在一些实施方案中，跨膜结构域可包括在脂质双层中形成β-桶二级结构的两个或更多个连续的氨基酸序列(当存在于在哺乳动物细胞中表达的对应内源多肽中时，每个氨基酸序列穿过脂质双层)。本文描述了跨膜结构域的非限制性示例。跨膜结构域的附加示例是本领域已知的。
当用于描述多肽的位置时，短语“质膜的细胞外侧”意指多肽包括至少一个穿过质膜的跨膜结构域和至少一个位于细胞外空间的结构域(例如，至少一个抗原结合结构域)。在一个示例中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的IL-15和IL-15Rα部分展示在质膜的细胞外侧。
“信号序列”是指通常存在于新合成的蛋白质的N-末端的肽序列，其指导它们进入分泌途径。
所谓“膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽”是指IL-15多肽连结到IL-15Rαsushi结构域。膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽通过连结到如本文所述的跨膜结构域而进一步拴系到细胞膜(并且不是分泌的)。
术语“持久性”是指例如一种或多种施用于受试者的移植免疫细胞或它们的祖细胞(例如，NK细胞或分化或成熟的T细胞)以可检测的水平在该受试者中保留一段时间的能力。如本文所用，增加一种或多种移植免疫细胞或它们的祖细胞(例如，NK细胞或分化或成熟的T细胞)的持久性是指增加施用后在受试者中可检测到移植免疫细胞的时间量。例如，一种或多种移植免疫细胞的体内持久性可以增加至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。此外，与未通过本文所公开的本发明方法制备的一种或多种移植免疫细胞相比，一种或多种移植免疫细胞的体内持久性可以增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
除非特别地指出相反的情况，否则本公开可以采用在本领域的技术范围内的化学方法、生物化学方法、有机化学方法、分子生物学方法、微生物学方法、重组DNA技术、遗传学方法、免疫学方法和细胞生物学方法，其中许多方法在下文出于说明的目的进行描述。此类技术在文献中有完整的解释。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第3版，2001)；Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，2008年7月更新)；Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley–Interscience；Glover,DNA Cloning:A Practical Approach，第I和第II卷(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(AcademicPress,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames和S.Higgins编辑，1984)；Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane，Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach和W.Strober编辑，1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊中的专题著作，诸如Advances in Immunology。
本公开的其他特征、目的和优点在下面的详细描述中是显而易见的。然而，应当理解，详细描述尽管指示了本公开的实施方案，但仅以说明而非限制的方式给出。
公开了膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽。在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽包括信号肽，使得当从其对应核酸表达时，认为通过其信号序列而导向细胞膜。在实施方案中，信号序列被切除，使得展示的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽不包括信号序列。在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽包括作为跨膜结构域以将膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽锚定到细胞膜。
白介素15(IL-15)是与白介素-2(IL-2)具有结构相似性的细胞因子。类似于IL-2，IL-15结合到由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同γ链(γ-C，CD132)组成的复合物，并且通过该复合物传导信号。IL-15在被病毒感染后由单核吞噬细胞(和一些其他细胞)分泌。这种细胞因子诱导自然杀伤细胞(即，先天免疫系统的细胞，其主要作用是杀死病毒感染的细胞)的增殖。由该基因编码的蛋白质是调节T细胞和自然杀伤细胞活化和增殖的细胞因子。这种细胞因子和白介素2共享许多生物活性。发现它们结合常见的红细胞生成素受体亚基，并可能竞争相同受体，并且因此负调节彼此的活性。CD8+记忆细胞的数量被显示为受该细胞因子和IL2之间的平衡控制。该细胞因子诱导JAK激酶的活化以及转录激活因子STAT3、STAT5和STAT6的磷酸化和活化。如本文所用，除非另有明确说明，否则术语“IL-15”是指成熟形式的IL-15(即，没有信号肽)或其活性片段。IL-15的蛋白产物可具有本领域已知的任何氨基酸序列，例如可在NCBI基因ID：3600(更新于2021年2月6日)中获得，其以引用方式特别并入本文。
在某些实施方案中，IL-15多肽是指与成熟形式的IL-15，或其具有与全长成熟形式相似的活性的片段具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的多肽。在实施方案中，IL-15多肽具有与SEQ ID NO:6具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVI SLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQS FVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:6)
白介素15受体亚基α(也称为CD125或IL-15Rα)白介素是以高亲和力特异性结合白介素15(IL-15)的细胞因子受体。IL-15和IL-2的受体共享两个亚基，IL2Rβ和IL2Rγ。IL-15Rα在结构上与IL2Rα相关，该IL2Rα是用于高亲和力IL2结合的附加IL2特异性α亚基。与IL2RA不同，IL-15Rα能够以不依赖于其他亚基的高亲和力结合IL-15，这表明IL-15和IL2之间的不同作用。据报道，该受体增强细胞增殖以及凋亡抑制剂BCL2L1/BCL2-XL和BCL2的表达。如本文所用，除非另有明确说明，否则术语“IL-15Rα”是指成熟形式的IL-15Rα(即，没有信号肽)。IL-15Rα的蛋白产物可具有本领域已知的任何氨基酸序列，例如可在NCBI基因ID：3601(更新于2021年2月3日)中获得，其以引用方式特别并入本文。此外，除非另有说明，否则IL-15Rαsushi结构域是指IL-15Rα的sushi结构域，例如该结构域包含全长IL-15Rα多肽的氨基酸残基49至162或由它们组成。
在某些实施方案中，IL-15Rα多肽是指与成熟形式的IL-15Rα，或其具有与全长成熟形式相似的活性的片段具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的多肽。在实施方案中，IL-15Rα多肽包含氨基酸49至162的活性形式的IL-15Rα多肽。在实施方案中，IL-15Rαsushi结构域亚基具有与以下SEQ ID NO:7具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列：ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKAT NVAHWTTPSLKCIRD(SEQ ID NO:7)。在另外的实施方案中，IL-15Rαsushi结构域亚基具有与以下SEQ ID NO:95具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列：ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPG(SEQ ID NO:95)。
在某些实施方案中，IL-15和IL-15Rαsushi结构域亚基可如本文所述连结。在具体的实施方案中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复，诸如Ser(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:8)，其中n是等于或大于1并且小于10的正整数。在一个实施方案中，接头包含Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:9)或Ser(Gly3Ser)1(Gly4Ser)n(Gly3Ser)1(SEQ ID NO:10)。在实施方案中，接头序列包含SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGS(SEQ ID NO:11)或由其组成。其他序列可用作接头序列。
在实施方案中，本文所公开的多肽包含信号序列，诸如异源信号序列，例如IgE信号序列、κ信号序列、CD8信号序列或具有基本上等同活性的任何肽。
示例性信号序列提供于下表4中。
表4：代表性信号序列
在实施方案中，信号序列通过接头连结到IL-15亚基，诸如本文所述的接头。在一个实施方案中，接头是AGS(SEQ ID NO:4)接头。在实施方案中，Myc序列单独使用或与上述任一接头组合使用。在一些实施方案中，Myc序列的氨基酸序列是EQKLISEEDL(SEQ ID NO:21)。
在实施方案中，本文公开的多肽包含跨膜结构域序列，诸如异源跨膜结构域，例如FAS跨膜结构域序列或IL-7跨膜结构域序列，或具有基本上等同活性的肽。
在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽包含FAS跨膜结构域序列。认为该序列导致单体膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的表面表达。在实施方案中，FAS跨膜结构域序列包含与以下SEQ ID NO:22具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列：LGWLCLLLLPIPLIVWV(SEQ ID NO:22)。
在实施方案中，FAS跨膜结构域序列包含与以下SEQ ID NO:42具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列：RSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKT(SEQ ID NO:42)。
在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽包含异源二聚化结构域，使得当表达时膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽形成同源二聚体。在实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽包含IL-7跨膜结构域序列。在实施方案中，IL-7跨膜结构域序列包含CPT序列基序。认为该序列导致同源二聚体膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的表面表达，该多肽通过二硫化物形成而形成稳定的同源二聚体。在实施方案中，IL-7跨膜结构域序列包含与以下SEQ ID NO:23具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列：pilltCPTisilsffsvallvilacvlw(SEQ ID NO:23)。
在某些实施方案中，IL-15Rαsushi结构域亚基可连结到如本文所述的跨膜锚定结构域。在具体的实施方案中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复，诸如(Gly4Ser)n(SEQID NO:24)，其中n是等于或大于1并且小于10的正整数。在一个实施方案中，接头可以是(Gly4Ser)1(SEQ ID NO:25)或(Gly4Ser)2(SEQ ID NO:26)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:27)。在实施方案中，接头序列包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:26)或由其组成。
在一个实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽具有与SEQ IDNO:27具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。MDWTWILFLVAAATRVHSEQKLISEEDLAGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGGGSGGGGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKT(SEQ ID NO:27)。
在一个实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽具有与SEQ IDNO:43具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。MDWTWILFLVAAATRVHSAGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGGGSGGGGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKT(SEQ ID NO:43)。
在一个实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽具有与SEQ IDNO:28具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGGGSGGGGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKT(SEQ ID NO:28)。
在一个实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽具有与SEQ IDNO:44具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。MDWTWILFLVAAATRVHSAGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGGGSGGGGSPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:44)。
在一个实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽具有与SEQ IDNO:29具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。MDWTWILFLVAAATRVHSEQKLISEEDLAGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGGGSGGGGSPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:29)。
在一个实施方案中，膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽具有与SEQ ID NO:30具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGGGSGGGGSPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:30)。
在一个实施方案中，膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽具有与SEQ ID NO:94具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。MDWTWILFLVAAATRVHSEQKLISEEDLAGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGGGGGSGGGGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKT(SEQ ID NO:94)。
本公开提供了编码本文所述的膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:6具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:7具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:8具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:9具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:10具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:11具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ IDNO:12具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:13具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:14具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:15具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:16具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:17具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:18具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:19具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:20具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ IDNO:21具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:22具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:23具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:24具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:25具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:26具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:27具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:28具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:29具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ IDNO:30具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含编码与SEQ ID NO:94具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列的核酸。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与以下SEQ ID NO:31具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：GCTGGAAGCAATTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTCAAGAAGATCGAGGATCTGATCCAGTCCATGCACATCGATGCCACACTCTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTTACAGCCATGAAATGCTTTCTGCTGGAGCTGCAAGTGATCTCTCTGGAGTCCGGAGATGCTTCCATCCACGACACAGTGGAGAATCTGATCATTCTGGCTAACAACTCCCTCTCCAGCAACGGCAATGTCACAGAGTCCGGCTGCAAAGAGTGTGAAGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTCCAGATGTTCATCAACACCTCCTCC(SEQ ID NO:31)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与以下SEQ ID NO:32具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：GCCGGCAGCAACTGGGTCAACGTGATCTCCGATCTGAAGAAGATCGAAGATCTGATCCAGTCCATGCACATCGATGCCACACTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAAGTTACAGCCATGAAGTGCTTTCTGCTCGAACTGCAAGTGATTTCTCTGGAGAGCGGAGATGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAATCTGATCATTCTGGCCAACAACTCTCTGAGCAGCAACGGCAATGTGACAGAGTCCGGCTGTAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATTGTCCAAATGTTCATCAACACCAGCAGC(SEQ ID NO:32)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与以下SEQ ID NO:33具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：ATTACATGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACATGCCGACATCTGGGTGAAGTCCTACTCTCTGTACTCGCGTGAACGTTATATCTGCAACAGCGGCTTTAAGAGGAAGGCCGGAACCTCCTCTCTGACCGAATGTGTGCTGAACAAGGCCACCAATGTGGCTCACTGGACCACACCTAGCCTCAAGTGTATTAGGGAC(SEQ ID NO:33)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与SEQ ID NO:34具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列。AGAAGCAATCTGGGCTGGCTGTGTCTGCTGCTGCTCCCCATCCCTCTG ATTGTGTGGGTCAAGAGGAAGGAGGTCCAGAAAACC(SEQ ID NO:34)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与SEQ ID NO:35具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列。CCTATTCTGCTGACATGCCCCACCATCTCCATCCTGTCTTTTTTTTCTGT TGCTCTGCTGGTGATTCTGGCTTGCGTGCTGTGG(SEQ ID NO:35)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与SEQ ID NO:36具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列。GGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGAGGAGGCAGCGGAG GAGGAGGAAGCGGAGGAGGCTCC(SEQ ID NO:36)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与以下SEQ ID NO:37具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：GGCGGCGGCTCCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGGCGG CGGCGGATCCGGCGGAGGATCC(SEQ ID NO:37)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与以下SEQ ID NO:38具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：GGCGGCGGAGGATCCGGAGGAGGCGGATCT(SEQ ID NO:38)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与以下SEQ ID NO:39具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：GGCGGCGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGC(SEQ ID NO:39)。单体
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与以下SEQ ID NO:40具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：GCTGGAAGCAATTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTCAAGAAGATCGAGGATCTGATCCAGTCCATGCACATCGATGCCACACTCTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTTACAGCCATGAAATGCTTTCTGCTGGAGCTGCAAGTGATCTCTCTGGAGTCCGGAGATGCTTCCATCCACGACACAGTGGAGAATCTGATCATTCTGGCTAACAACTCCCTCTCCAGCAACGGCAATGTCACAGAGTCCGGCTGCAAAGAGTGTGAAGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTCCAGATGTTCATCAACACCTCCTCCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCTCCATTACATGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACATGCCGACATCTGGGTGAAGTCCTACTCTCTGTACTCGCGTGAACGTTATATCTGCAACAGCGGCTTTAAGAGGAAGGCCGGAACCTCCTCTCTGACCGAATGTGTGCTGAACAAGGCCACCAATGTGGCTCACTGGACCACACCTAGCCTCAAGTGTATTAGGGACGGCGGCGGAGGATCCGGAGGAGGCGGATCTAGAAGCAATCTGGGCTGGCTGTGTCTGCTGCTGCTCCCCATCCCTCTGATTGTGTGGGTCAAGAGGAAGGAGGTCCAGAAAACC(SEQ ID NO:40)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与以下SEQ ID NO:42具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：GCTGGAAGCAATTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTCAAAAAGATCGAGGATCTGATCCAGTCCATGCACATCGATGCCACACTCTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTTACAGCAATGAAATGCTTTCTGCTGGAGTTGCAAGTAATCTCCCTGGAGTCCGGAGATGCTTCCATCCACGACACAGTGGAGAATTTAATCATTCTGGCTAACAATTCCCTCTCGTCTAATGGCAATGTCACTGAGAGCGGCTGTAAAGAGTGTGAAGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTCCAAATGTTCATCAACACCTCGTCCGGGGGCGGCTCCGGGGGAGGAGGATCGGGGGGAGGAGGAAGCGGAGGTGGAGGAAGCGGTGGAGGGTCCATTACATGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACATGCCGACATATGGGTAAAGTCCTACTCTCTGTACTCGCGGGAACGTTATATCTGCAACAGCGGCTTTAAGAGAAAGGCCGGAACATCtTCTCTGACCGAATGTGTGCTGAACAAGGCCACAAATGTGGCTCACTGGACCACGCCTAGCCTCAAGTGTATTAGGGACGGCGGCGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGCTCTAGATCGAATCTGGGCTGGCTGTGTCTGCTGCTGCTCCCCATCCCTCTGATTGTGTGGGTTAAGCGAAAAGAGGTCCAGAAAACCTAA(SEQ ID NO:42)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽的核酸包含与以下SEQ ID NO:41具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：GCCGGCAGCAACTGGGTCAACGTGATCTCCGATCTGAAGAAGATCGAAGATCTGATCCAGTCCATGCACATCGATGCCACACTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAAGTTACAGCCATGAAGTGCTTTCTGCTCGAACTGCAAGTGATTTCTCTGGAGAGCGGAGATGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAATCTGATCATTCTGGCCAACAACTCTCTGAGCAGCAACGGCAATGTGACAGAGTCCGGCTGTAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATTGTCCAAATGTTCATCAACACCAGCAGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGAGGATCCATTACATGCCCCCCTCCCATGTCCGTGGAACACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTACTCTCTGTACAGCAGAGAGCGTTACATCTGCAACAGCGGCTTTAAGAGGAAAGCCGGCACCAGCAGCCTCACAGAGTGCGTGCTCAACAAGGCCACCAACGTCGCCCATTGGACCACCCCCTCTCTGAAGTGTATTAGGGACGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCCCTATTCTGCTGACATGCCCCACCATCTCCATCCTGTCTTTTTTTTCTGTTGCTCTGCTGGTGATTCTGGCTTGCGTGCTGTGGTGA(SEQ ID NO:41)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽(包含FAS跨膜结构域且无myc标签)的核酸包含与以下SEQ ID NO:96具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：ATGGACTGGACATGGATTCTGTTTCTGGTGGCCGCCGCCACAAGAGTGCACAGCAATTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTCAAGAAGATCGAGGATCTGATCCAGTCCATGCACATCGATGCCACACTCTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTTACAGCCATGAAATGCTTTCTGCTGGAGCTGCAAGTGATCTCTCTGGAGTCCGGAGATGCTTCCATCCACGACACAGTGGAGAATCTGATCATTCTGGCTAACAACTCCCTCTCCAGCAACGGCAATGTCACAGAGTCCGGCTGCAAAGAGTGTGAAGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTCCAGATGTTCATCAACACCTCCTCCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCTCCATTACATGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACATGCCGACATCTGGGTGAAGTCCTACTCTCTGTACTCGCGTGAACGTTATATCTGCAACAGCGGCTTTAAGAGGAAGGCCGGAACCTCCTCTCTGACCGAATGTGTGCTGAACAAGGCCACCAATGTGGCTCACTGGACCACACCTAGCCTCAAGTGTATTAGGGACGGCGGCGGAGGATCCGGAGGAGGCGGATCTAGAAGCAATCTGGGCTGGCTGTGTCTGCTGCTGCTCCCCATCCCTCTGATTGTGTGGGTCAAGAGGAAGGAGGTCCAGAAAACCTAA(SEQ ID NO:96)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽(包含IL-7跨膜结构域且无myc标签)的核酸包含与以下SEQ ID NO:97具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：ATGGACTGGACATGGATTCTGTTTCTGGTGGCCGCCGCCACAAGAGTGCACTCCAACTGGGTCAACGTGATCTCCGATCTGAAGAAGATCGAAGATCTGATCCAGTCCATGCACATCGATGCCACACTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAAGTTACAGCCATGAAGTGCTTTCTGCTCGAACTGCAAGTGATTTCTCTGGAGAGCGGAGATGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAATCTGATCATTCTGGCCAACAACTCTCTGAGCAGCAACGGCAATGTGACAGAGTCCGGCTGTAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATTGTCCAAATGTTCATCAACACCAGCAGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGAGGATCCATTACATGCCCCCCTCCCATGTCCGTGGAACACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTACTCTCTGTACAGCAGAGAGCGTTACATCTGCAACAGCGGCTTTAAGAGGAAAGCCGGCACCAGCAGCCTCACAGAGTGCGTGCTCAACAAGGCCACCAACGTCGCCCATTGGACCACCCCCTCTCTGAAGTGTATTAGGGACGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCCCTATTCTGCTGACATGCCCCACCATCTCCATCCTGTCTTTTTTTTCTGTTGCTCTGCTGGTGATTCTGGCTTGCGTGCTGTGGTGA(SEQ ID NO:97)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽(在抗CD19 CAR的情境下，包含FAS跨膜结构域且无myc标签)的核酸包含与以下SEQ ID NO:98具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTA
TGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACAGTCTCCTCAGCGGCC
GCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGC
AATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCC
CTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGG
GGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTT
TCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATG
AACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCC
CTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTT
CAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGC
TCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTG
GACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAA
GGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAG
ATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGA
GGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACC
AAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGC
TCTGGAGAGGGCAGAGGCTCTCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGA
GAACCCAGGCCCCATGGACTGGACATGGATTCTGTTTCTGGTGGCCGC
CGCCACAAGAGTGCACAGCAATTGGGTGAACGTGATCTCCGACCTCA
AGAAGATCGAGGATCTGATCCAGTCCATGCACATCGATGCCACACTCT
ACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCAAAGTTACAGCCATGAAA
TGCTTTCTGCTGGAGCTGCAAGTGATCTCTCTGGAGTCCGGAGATGCT
TCCATCCACGACACAGTGGAGAATCTGATCATTCTGGCTAACAACTCC
CTCTCCAGCAACGGCAATGTCACAGAGTCCGGCTGCAAAGAGTGTGA
AGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCC
ACATCGTCCAGATGTTCATCAACACCTCCTCCGGCGGCGGCAGCGGCG
GCGGCGGATCCGGCGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGG
AGGCTCCATTACATGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACATGCCGACAT
CTGGGTGAAGTCCTACTCTCTGTACTCGCGTGAACGTTATATCTGCAA
CAGCGGCTTTAAGAGGAAGGCCGGAACCTCCTCTCTGACCGAATGTG
TGCTGAACAAGGCCACCAATGTGGCTCACTGGACCACACCTAGCCTC
AAGTGTATTAGGGACGGCGGCGGAGGATCCGGAGGAGGCGGATCTAG
AAGCAATCTGGGCTGGCTGTGTCTGCTGCTGCTCCCCATCCCTCTGATTGTGTGGGTCAAGAGGAAGGAGGTCCAGAAAACCTAA(SEQ ID NO:98)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽(在抗CD19 CAR的情境下，包含IL-7跨膜结构域且无myc标签)的核酸包含与以下SEQ ID NO:99具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACAGTCTCCTCAGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCTCTGGAGAGGGCAGAGGCTCTCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCAGGCCCCATGGACTGGACATGGATTCTGTTTCTGGTGGCCGCCGCCACAAGAGTGCACTCCAACTGGGTCAACGTGATCTCCGATCTGAAGAAGATCGAAGATCTGATCCAGTCCATGCACATCGATGCCACACTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAAGTTACAGCCATGAAGTGCTTTCTGCTCGAACTGCAAGTGATTTCTCTGGAGAGCGGAGATGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAATCTGATCATTCTGGCCAACAACTCTCTGAGCAGCAACGGCAATGTGACAGAGTCCGGCTGTAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTCCACATTGTCCAAATGTTCATCAACACCAGCAGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGAGGATCCATTACATGCCCCCCTCCCATGTCCGTGGAACACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTACTCTCTGTACAGCAGAGAGCGTTACATCTGCAACAGCGGCTTTAAGAGGAAAGCCGGCACCAGCAGCCTCACAGAGTGCGTGCTCAACAAGGCCACCAACGTCGCCCATTGGACCACCCCCTCTCTGAAGTGTATTAGGGACGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCCCTATTCTGCTGACATGCCCCACCATCTCCATCCTGTCTTTTTTTTCTGTTGCTCTGCTGGTGATTCTGGCTTGCGTGCTGTGGAAGAAGAGGATCAAGCCGATAGTTTGA(SEQ ID NO:99)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽(包含FAS跨膜结构域且无myc标签)的核酸包含与以下SEQ ID NO:100具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：ATGGACTGGACCTGGATACTTTTCCTGGTGGCCGCCGCTACCAGAGTTCACTCAAATTGGGTCAATGTAATTTCAGACTTGAAGAAGATCGAAGATCTGATCCAGTCTATGCATATAGATGCTACTCTGTACACTGAGTCCGATGTGCATCCGTCCTGTAAAGTGACAGCCATGAAGTGTTTCCTGCTTGAGCTCCAAGTTATCAGTCTCGAATCCGGCGATGCCTCAATACATGATACTGTAGAGAACCTCATCATTCTCGCAAACAATTCCCTGTCAAGCAATGGAAATGTTACGGAGTCAGGTTGTAAAGAATGTGAGGAATTGGAAGAAAAGAACATAAAAGAGTTCTTGCAGAGTTTCGTGCACATCGTACAAATGTTCATCAATACGAGTAGTGGTGGTGGTTCCGGAGGAGGAGGATCTGGCGGAGGCGGTAGTGGTGGAGGAGGATCCGGAGGTGGGAGTATAACTTGTCCGCCGCCCATGAGTGTGGAACATGCTGATATATGGGTAAAGTCTTATTCACTTTATAGCAGAGAACGCTATATTTGTAATTCTGGCTTCAAGCGAAAAGCTGGCACGAGCAGTCTCACGGAGTGCGTCCTGAACAAGGCAACCAACGTCGCGCATTGGACAACTCCTAGCCTCAAATGCATAAGGGACCCTGCACTGGTGCACCAACGCCCTGCGCCACCGTCAACGGTCACTACAGCTGGCGTTACACCGCAGCCAGAATCTTTGAGTCCATCAGGCAAGGAACCCGCGGCGTCTTCCCCGTCTTCTAACAATACCGCCGCAACGACGGCGGCAATCGTGCCGGGATCACAACTCATGCCTTCCAAAAGTCCCTCAACGGGCACGACAGAGATTAGCAGCCACGAAAGCTCCCATGGCACTCCCTCACAAACGACCGCGAAGAACTGGGAGCTGACTGCAAGTGCATCTCACCAGCCACCGGGTGGCGGGGGTGGATCAGGTGGCGGTGGCTCTCGCTCCAACCTCGGTTGGCTTTGCCTTCTTTTGCTGCCCATACCGTTGATCGTCTGGGTTAAGCGCAAAGAAGTCCAGAAAACTTAA(SEQ ID NO:100)。
在实施方案中，编码膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽(在抗CD19 CAR的情境下，包含FAS跨膜结构域且无myc标签)的核酸包含与以下SEQ ID NO:101具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列：ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACAGTCTCCTCAGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCAGAGCCAAGAGAGGCTCCGGAGAGGGCAGAGGCTCTCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAATCCAGGGCCCATGGACTGGACCTGGATACTTTTCCTGGTGGCCGCCGCTACCAGAGTTCACTCAAATTGGGTCAATGTAATTTCAGACTTGAAGAAGATCGAAGATCTGATCCAGTCTATGCATATAGATGCTACTCTGTACACTGAGTCCGATGTGCATCCGTCCTGTAAAGTGACAGCCATGAAGTGTTTCCTGCTTGAGCTCCAAGTTATCAGTCTCGAATCCGGCGATGCCTCAATACATGATACTGTAGAGAACCTCATCATTCTCGCAAACAATTCCCTGTCAAGCAATGGAAATGTTACGGAGTCAGGTTGTAAAGAATGTGAGGAATTGGAAGAAAAGAACATAAAAGAGTTCTTGCAGAGTTTCGTGCACATCGTACAAATGTTCATCAATACGAGTAGTGGTGGTGGTTCCGGAGGAGGAGGATCTGGCGGAGGCGGTAGTGGTGGAGGAGGATCCGGAGGTGGGAGTATAACTTGTCCGCCGCCCATGAGTGTGGAACATGCTGATATATGGGTAAAGTCTTATTCACTTTATAGCAGAGAACGCTATATTTGTAATTCTGGCTTCAAGCGAAAAGCTGGCACGAGCAGTCTCACGGAGTGCGTCCTGAACAAGGCAACCAACGTCGCGCATTGGACAACTCCTAGCCTCAAATGCATAAGGGACCCTGCACTGGTGCACCAACGCCCTGCGCCACCGTCAACGGTCACTACAGCTGGCGTTACACCGCAGCCAGAATCTTTGAGTCCATCAGGCAAGGAACCCGCGGCGTCTTCCCCGTCTTCTAACAATACCGCCGCAACGACGGCGGCAATCGTGCCGGGATCACAACTCATGCCTTCCAAAAGTCCCTCAACGGGCACGACAGAGATTAGCAGCCACGAAAGCTCCCATGGCACTCCCTCACAAACGACCGCGAAGAACTGGGAGCTGACTGCAAGTGCATCTCACCAGCCACCGGGTGGCGGGGGTGGATCAGGTGGCGGTGGCTCTCGCTCCAACCTCGGTTGGCTTTGCCTTCTTTTGCTGCCCATACCGTTGATCGTCTGGGTTAAGCGCAAAGAAGTCCAGAAAACTTAA(SEQ ID NO:101)。
本公开提供了用于提高抗原结合系统(例如CAR和TCR)的功效的方法和组合物，该抗原结合系统包含结合目标抗原(例如，肿瘤抗原)的结合基序。在某些实施方案中，抗原结合系统是嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，抗原结合系统是T细胞受体(TCR)。抗原结合系统可以结合肿瘤抗原或病原体抗原。
嵌合抗原受体(CAR)是可以引导或重定向T细胞(例如，患者或供体T细胞)以靶向选定抗原的工程化受体。CAR可以被工程化以识别抗原，并且当与该抗原结合时，活化免疫细胞以攻击和破坏携带该抗原的细胞。当这些抗原存在于肿瘤细胞上时，表达CAR的免疫细胞可靶向并杀死肿瘤细胞。CAR通常包含介导抗原结合的细胞外结合基序、当抗原结合系统存在于细胞表面或细胞膜时跨越或被理解为跨越细胞膜的跨膜结构域，以及细胞内(或细胞质)信号传导结构域。
根据至少一种非限制性观点，已经存在至少三“代”CAR组合物。在第一代CAR中，结合基序(例如，单链片段可变区、结合基序)经由跨膜结构域连接或连接至信号结构域(例如，CD3ζ)，该跨膜结构域任选地包含铰链结构域和一个或多个间隔区。在第二代CAR中，共刺激结构域(诸如CD28、4-1BB或OX-40)与信号传导结构域(例如，CD3ζ)一起引入。在第三代CAR中，包括第二共刺激结构域。
TCR是由α链和β链组成的异二聚体。TCR信号传导需要募集产生免疫突触的信号传导蛋白。另外，TCR在质膜上的定位取决于在T细胞中表达的CD3复合物。工程化单链TCR可以例如使用CAR构建体的跨膜和信号传导结构域、已知的方法和构建体(例如，sTCR和TCR-CAR分子，例如，TCRβ链与CD28 TM和CD28和CD3ζ信号传导模块的融合)产生。
抗原结合系统可包含VH和VL。在一些实施方案中，VH和VL通过接头(L)连接。
在一些实施方案中，抗原结合系统还包含共刺激结构域、和/或细胞外结构域(例如，“铰链”或“间隔”区)、和/或跨膜结构域、和/或细胞内(信号传导)结构域、和/或CD3-ζ或CD3-ε活化结构域。
一个或多个抗原结合基序决定抗原结合系统的靶标。抗原结合系统的结合基序可包含任何结合基序。结合基序至少部分用于嵌合抗原受体中，因为它们可以被工程化以表达为单链的一部分以及其他CAR组分。关于CAR中的结合基序结构域，参见例如美国专利7,741,465号和6,319,494号以及Eshhar等人，Cancer Immunol Immunotherapy(1997)45:131-136；Krause等人，J.Exp.Med.，第188卷，第4期，1998(619-626)；Finney等人，Journalof Immunology,1998,161:2791-2797，它们中的每一者以引用方式并入本文。结合基序或scFv是包含重链可变结构域和轻链可变结构域的单链抗原结合片段，其中重链可变结构域和轻链可变结构域连接或连接在一起。关于结合基序结构域，参见例如美国专利7,741,465号和6,319,494号以及Eshhar等人，Cancer Immunol Immunotherapy(1997)45:131-136，它们中的每一者以引用方式并入本文。当衍生自亲本抗体时，结合基序可以保留亲本抗体中的一些、保留全部或基本上保留亲本抗体与靶标抗原的结合。
在各种实施方案中，结合基序与肿瘤抗原结合。在某些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：2B4(CD244)、4-1BB、5T4、A33抗原、腺癌抗原、肾上腺素受体β3(ADRB3)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、甲胎蛋白(AFP)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、雄激素受体、B7H3(CD276)、β2-整合素、BAFF、B淋巴瘤细胞、B细胞成熟抗原(BCMA)、bcr-abl(由断裂点簇集区(BCR)和阿伯森鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白)、BhCG、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节物兄弟)、BST2、C242抗原、9-0-乙酰基-CA19-9标记物、CA-125、CAEX、钙网蛋白、碳酸酐酶9(CAIX)、C-MET、CCR4、CCR5、CCR8、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD7、CD10、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD51、CD52、CD56、CD63、CD70、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD96、CD97、CD100、CD123、CD125、CD133、CD137、CD138、CD150、CD152(CTLA-4)、CD160、CD171、CD179a、CD200、CD221、CD229、CD244、CD272(BTLA)、CD274(PDL-1、B7H1)、CD279(PD-1)、CD352、CD358、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、癌胚抗原(CEA)、闭合蛋白6(CLDN6)、TACI、C型凝集素样分子1(CLL-1或CLECL1)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞抗原、CNT0888、CRTAM(CD355)、CS-1(也称为CD2亚类1、CRACC、CD319和19A24)、CTLA-4、细胞周期蛋白B l、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、细胞色素P450 1B 1(CYP1B1)、DNAM-1(CD226)、桥粒芯糖蛋白4、DR3、DR5、E-钙粘蛋白新表位、表皮生长因子受体(EGFR)、EGF1R、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)、延长因子2突变(ELF2M)、内皮唾液酸蛋白、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、肝配蛋白B2、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2,3,4(erb-B2,3,4)、ERBB、ERBB2(Her2/neu)、ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、ETA、位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、FBP、Fc受体样5(FCRL5)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、纤连蛋白额外结构域-B、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体1、叶酸受体α、叶酸受体β、Fos-相关抗原1、岩藻糖基、岩藻糖基GM1；GM2、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、GITR(TNFRSF 18)、GM1、神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、GP 100、globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)、糖蛋白75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、糖蛋白100(gpl00)、GPNMB、G蛋白-偶联受体20(GPR20)、G蛋白偶联受体C类组5成员D(GPRC5D)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、高分子量黑素瘤相关联抗原(HMWMAA)、人乳头瘤病毒E6(HPV E6)、人乳头瘤病毒E7(HPV E7)、热休克蛋白70-2突变(muthsp70-2)、人分散因子受体激酶、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、HVEM、ICOS、胰岛素样生长因子受体1(IGF-1受体)、IGF-I、IgGl、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、IL-6、白介素11受体α(IL-l lRa)、IL-13、白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)、胰岛素样生长因子I受体(IGF1-R)、整合素α5β1、整合素ανβ3、肠羧基酯酶、κ-轻链、KCS1、激酶插入结构域受体(KDR)、KIR、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、KIR-L、KG2D配体、KIT(CD117)、KLRGI、LAGE-la、LAG3、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、豆荚蛋白、白细胞相关联免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、路易斯(Y)抗原、LeY、LG、LI细胞粘附分子(LI-CAM)、LIGHT、LMP2、淋巴细胞抗原6复合物、LTBR、基因座K 9(LY6K)、Ly-6、淋巴细胞抗原75(LY75)、黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)、MAGE、黑素瘤相关联抗原1(MAGE-A1)、由T细胞识别的MAGE-A3黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)、MelanA/MARTl、间皮素、MAGE A3、黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)、黑素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSCP)、MORAb-009、MS4A1、粘蛋白1(MUCl)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、MUC16、粘蛋白CanAg、苗勒氏抑制物质(MIS)II型受体、v-myc禽髓细胞瘤病毒癌基因成神经细胞瘤衍生同源物(MYCN)、N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)、神经细胞粘附分子(NCAM)、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E配体、NKR-P IA、NPC-1C、NTB-A、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、OX40、浆细胞抗原、聚SA、顶体蛋白酶结合蛋白sp32(OY-TES l)、p53、p53突变体、泛连接蛋白3(PANX3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)、PD-1H、血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α)、PDGFR-β、PDL192、PEN-5、磷脂酰丝氨酸、胎盘特异性1(PLAC1)、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌细胞、前列腺素、蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)、蛋白酶3(PR1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、蛋白酶体(前体、巨蛋白因子)亚基β型、晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)、RANKL、Ras突变体、Ras同源物家族成员C(RhoC)、RON、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、肾泛素1(RU1)、肾泛素2(RU2)、肉瘤易位断点、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)、SAS、SDC1、SLAMF7、唾液酰路易斯粘附分子(sLe)、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、音猬因子(SHH)、精子蛋白17(SPA17)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、STEAP、sTn抗原、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、存活素、肿瘤相关联糖蛋白72(TAG72)、TCRa、TCRb、TCR5γ、TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)、端粒酶、TIGIT、TNF-α前体、肿瘤内皮标记物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标记物7相关(TEM7R)、生腱蛋白C、TGFβ2、TGF-β、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)、TIM1、TIM2、TIM3、Tn Ag、TRAIL-R1、TRAIL-R2、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、肿瘤抗原CTAA16.88、酪氨酸酶、ROR1、TAG-72、尿溶蛋白2(UPK2)、VEGF-A、VEGFR-1、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和波形蛋白、Wilms肿瘤蛋白(WT1)或X抗原家族成员1A(XAGE1)。还参见国际专利申请公开WO2015/142675号。
CAR可包含结合靶标抗原的一个或多个抗原结合结构域。在某些实施方案中，抗原结合结构域结合CD19。在某些实施方案中，抗原结合结构域结合CD20。在一些实施方案中，CAR还包含共刺激结构域、和/或细胞外结构域(例如，“铰链”或“间隔”区)、和/或跨膜结构域、和/或细胞内(信号传导)结构域、和/或CD3活化结构域。在一些实施方案中，CAR至少包含结合靶标抗原的结合结构域、共刺激结构域、细胞外结构域、跨膜结构域和CD3-ζ或CD3-ε活化结构域。
在某些实施方案中，本文设想的CAR可以包含介于各种结构域之间(例如，介于VH结构域与VL结构域之间)的接头残基，其被添加用于获得分子的适当间隔构象。本文设想的CAR可以包含一个、两个、三个、四个或五个或者更多个接头。在一些实施方案中，接头的长度为约1个至约25个氨基酸、约5个至约20个氨基酸或者约10个至约20个氨基酸，或者任何中间长度的氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个氨基酸。
接头的说明性示例包括甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸–丝氨酸聚合物(G1–5S1–5)n，其中n是至少为1、2、3、4或5的整数；甘氨酸–丙氨酸聚合物；丙氨酸–丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以能够充当融合蛋白的结构域之间的中性系链，诸如本文所述的CAR。甘氨酸甚至比丙氨酸进入更多的phi–psi空间，并且受到的限制比具有较长侧链的残基小得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173–142(1992))。本文设想的其他接头包括Whitlow接头(参见Whitlow,Protein Eng.6(8):989–95(1993))。普通技术人员将认识到，在一些实施方案中，CAR的设计可以包括全部或部分柔性的接头，使得该接头可以包括柔性接头以及一个或多个赋予较小柔性结构的部分，以提供所需的CAR结构。在一个实施方案中，本文所述的任何构建体可以包含“GS”接头。在另一个实施方案中，本文所述的任何构建体包含“GSG”接头。在示例中，甘氨酸-丝氨酸接头包含氨基酸序列GS(SEQ ID NO:43)或由其组成。在示例中，甘氨酸-丝氨酸接头包含氨基酸序列GGGSGGGS(SEQ ID NO:44)或由其组成。在另一个实施方案中，本文所述的CAR包含与以下SEQ ID NO:45具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:45)。在实施方案中，接头由与具有根据以下的核酸序列具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的核酸序列编码：GGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCAC CAAGGGC(SEQ ID NO:46)，GGGAGCACTAGCGGCTCTGGCAAACCTGGATCTGGCGAGGGATCTAC CAAGGGC(SEQ ID NO:47)，GGCTCCACCAGCGGAAGCGGCAAGCCAGGCTCAGGCGAAGGATCTAC AAAAGGC(SEQ ID NO:48)或GGGAGCACAAGCGGCTCTGGCAAACCTGGATCCGGCGAGGGATCTAC CAAGGGC(SEQ ID NO:49)。
在实施方案中，CAR包含scFv，该scFv还包含可变区连接序列。“可变区连接序列”是以下氨基酸序列：其将重链可变区连接到轻链可变区并且提供与两个亚结合结构域的相互作用相容的间隔区功能，使得所得的多肽与包含相同的轻链可变区和重链可变区的抗体相比，保留了对相同靶标分子的特异性结合亲和力。在一个实施方案中，可变区连接序列的长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个氨基酸。
在实施方案中，CAR的结合结构域之后是一个或多个“间隔区结构域”，间隔区结构域是指移动抗原结合结构域远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化的区域(Patel等人，Gene Therapy,1999；6:412–419)。该间隔区结构域可以来源于天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。在某些实施方案中，间隔区结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。该间隔区结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
CAR的结合结构域之后通常可以是一个或多个“铰链结构域”，该铰链结构域在将抗原结合结构域远离效应细胞表面定位中起作用，以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化。铰链可以是位于结合基序与跨膜结构域之间的抗原结合系统的细胞外结构域。铰链也可称为细胞外结构域或“间隔区”。铰链可有助于受体表达、活性和/或稳定性。在一些实施方案中，铰链结构域位于结合基序与跨膜结构域之间。铰链还可以提供进入靶抗原的灵活性。铰链包含免疫球蛋白样铰链结构域。CAR通常包含介于结合结构域与跨膜结构域之间的一个或多个铰链结构域。该铰链结构域可以来源于天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。该铰链结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合系统可包含铰链，该铰链是、来自或来源于免疫球蛋白样铰链结构域(例如，包含其全部或片段)。在一些实施方案中，铰链结构域来自或衍生自免疫球蛋白。在一些实施方案中，铰链结构域选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE或IgM的铰链或其片段。
铰链可以来源于天然来源或合成来源。在一些实施方案中，抗原结合系统可以包含铰链，该铰链是、来自或来源于下列各项(例如，包含下列各项的全部或片段)：CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关联α链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关联β链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fcγ受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、活化NK细胞受体，或Toll配体受体，或它们的片段或组合。
在一些实施方案中，CAR可包含铰链，该铰链是、来自或来源于CD8α的铰链(例如，包含其全部或片段)。在一些实施方案中，CAR可包含铰链，该铰链是、来自或来源于CD28的铰链(例如，包含其全部或片段)。在一些实施方案中，铰链是、来自或来源于CD8α铰链的片段或CD28铰链的片段，其中该片段是小于整体的任何片段。在一些实施方案中，CD8α铰链的片段或CD28铰链的片段包含在CD8α铰链或CD28铰链的N-末端或C-末端或两者处排除至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个氨基酸的氨基酸序列。
在实施方案中，该铰链结构域包含CD28铰链区。在实施方案中，CD28铰链结构域具有与SEQ ID NO:230具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列(IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:50))。在实施方案中，CD28铰链结构域由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacc tttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccc(SEQ ID NO:51)。
在实施方案中，铰链结构域包含截短的CD28铰链区(CD28T)铰链区，诸如在2017年3月31日提交的国际专利申请号PCT/US2017/025351中所公开的，该申请全文以引用方式并入本文。在实施方案中，CAR包含CD28T铰链结构域，该铰链结构域具有与以下SEQ ID NO:52具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列：(LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:52))。在实施方案中，CD28T铰链结构域由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：ctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccgga ccttctaagccc(SEQ ID NO:53)。
在实施方案中，该铰链结构域包含CD8α铰链区。在实施方案中，本文所述的CAR包含来自CD8α的铰链结构域，该铰链结构域具有与SEQ ID NO:54(FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACD(SEQ ID NO:54))具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。在实施方案中，来自CD8α的铰链结构域由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：TTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGAC(SEQ ID NO:55)。
这些铰链结构域的多核苷酸和多肽序列是已知的。在一些实施方案中，编码铰链结构域的多核苷酸包含与已知核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域的多肽序列包含与已知多肽序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)相同的多肽序列。
一般来讲，“跨膜结构域”(例如，抗原结合系统的跨膜结构域)是指当存在于细胞表面或细胞膜(例如，跨越细胞膜的一部分或全部)的分子中时，具有存在于膜中的属性的结构域。本公开的抗原结合系统的共刺激结构域还可以包含跨膜结构域和/或细胞内信号传导结构域。不需要跨膜结构域中的每个氨基酸都存在于膜中。例如，在一些实施方案中，跨膜结构域的特征在于蛋白质的指定片段或部分基本上位于膜中。可以使用多种算法分析氨基酸或核酸序列以预测蛋白质亚细胞定位(例如，跨膜定位)。程序psort(PSORT.org)和Prosite(prosite.expasy.org)是这种程序的示例。
本文所述的抗原结合系统中包含的跨膜结构域的类型不限于任何类型。在一些实施方案中，选择与结合基序和/或细胞内结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域包含一个或多个氨基酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)，例如，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。在来源是天然来源的情况下，结构域可以来源于任何膜结合蛋白质或跨膜蛋白质。示例性跨膜结构域可以来源于(例如，可以至少包括以下各项的跨膜结构域)T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD8α、CD8β、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、TNFSFR25、CD154、4-1BB/CD137、活化NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD276(B7-H3)、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1，与CD83结合的配体、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关联抗原-1(LFA-1；CD1-1a/CD18)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或者它们的片段、截短形式或组合。在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的(并且可以例如主要包括疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸)。在一些实施方案中，在合成跨膜结构域的每个端部处均包含苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，跨膜结构域直接连结或连接到细胞质结构域。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度介于2个氨基酸与10个氨基酸之间)可以形成介于跨膜结构域与细胞内结构域之间的连接部。在一些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
在实施方案中，本文所述的CAR包含来自CD28的TM结构域，该TM结构域具有与SEQID NO:56(FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:56))具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。在实施方案中，来自CD28的TM结构域由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：ttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg(SEQ ID NO:57)。
在实施方案中，本文所述的CAR包含来自CD8α的TM和细胞间结构域，该TM和细胞间结构域具有与SEQ ID NO:58(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(SEQ ID NO:58))具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。在实施方案中，来自CD8α的TM结构域由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：ATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTT AGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAAC(SEQ ID NO:59)。
本文提供的跨膜结构域的多核苷酸和多肽序列是已知的。在一些实施方案中，编码跨膜结构域的多核苷酸包含与已知核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域的多肽序列包含与已知多肽序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)相同的多肽序列。任选地，短间隔区可以在CAR的任何或一些细胞外、跨膜和细胞内结构域之间形成连接。
细胞内结构域(或细胞质结构域)包含一个或多个信号传导结构域，该一个或多个信号传导结构域在靶标抗原与结合基序结合后引起和/或介导细胞内信号，例如活化一种或多种免疫细胞效应子功能(例如，天然免疫细胞效应子功能)的细胞内信号。在一些实施方案中，细胞内结构域的信号传导结构域介导免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化。T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。在一些实施方案中，细胞内结构域的信号传导结构域介导T细胞活化、增殖、存活和/或其他T细胞功能。细胞内结构域可以包含作为活化结构域的信号传导结构域。细胞内结构域可包含信号传导结构域，其为共刺激信号传导结构域。
可以在抗原与免疫细胞结合时转导信号的细胞内信号传导结构域是已知的，它们中的任一个可以包含在本公开的抗原结合系统中。例如，已知T细胞受体(TCR)的细胞质序列在TCR与抗原结合后引发信号转导(参见例如Brownlie等人，Nature Rev.Immunol.13:257-269(2013))。
在一些实施方案中，本文设想的CAR包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR的以下部分：其参与将结合靶标抗原的有效CAR的消息转导进免疫效应细胞的内部中，以引发效应细胞功能，例如活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括将细胞毒性因子释放到CAR结合的靶标细胞，或者用抗原结合至细胞外CAR结构域引发的其他细胞响应。在一些实施方案中，信号传导结构域和/或活化结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化结构域(ITAM)。含有细胞质信号传导序列的ITAM的示例包括来源于以下各项的那些：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d(参见例如，Love等人，Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2:a002485(2010)；Smith-Garvin等人，Annu.Rev.Immunol.27:591-619(2009))。在某些实施方案中，合适的信号传导结构域包括但不限于：4-1BB/CD137、活化NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96(Tactile)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、与CD83结合的配体、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、Ly108、淋巴细胞功能相关联抗原-1(LFA-1；CD1-1a/CD18)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或它们的片段、截短形式或组合。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或者有助于活性(包括细胞因子分泌)。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的该部分：其转导效应子功能信号并且引导细胞执行特化功能。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，不必使用整个结构域。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的情况下，可以使用此类截短部分替代整个结构域，只要其转导效应子功能信号即可。术语“细胞内信号传导结构域”意在包括该细胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
已知单独通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且可能还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被称为由以下两个不同类别的细胞内信号传导结构域介导：通过TCR(例如，TCR/CD3复合物)启动抗原依赖性初级活化的初级信号传导结构域，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，本文设想的CAR包含细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包括一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“初级信号传导结构域”。
在一些实施方案中，信号传导结构域和/或活化结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。含有细胞质信号传导序列的ITAM的示例包括来源于以下各项的那些：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d(参见例如Love等人，Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2:a002485(2010)；Smith-Garvin等人，Annu.Rev.Immunol.27:591-619(2009))。在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ初级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内的初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以以任何串联顺序连接到跨膜结构域的羧基末端。在一个实施方案中，CAR具有CD3ζ结构域，该结构域具有与SEQ ID NO:60具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。VKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:60)。在实施方案中，CD3ζ结构域由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:61)。在实施方案中，CD3ζ结构域由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：AGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGA(SEQID NO:61)。
本文设想的CAR包含一个或多个共刺激信号传导结构域，以增强表达CAR受体的T细胞的功效和扩增。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中，合适的信号传导结构域包括但不限于：4-1BB/CD137、活化NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96(Tactile)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DAP-12、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、与CD83结合的配体、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、Ly108、淋巴细胞功能相关联抗原-1(LFA-1；CD1-1a/CD18)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或它们的片段、截短形式或组合。
CAR可以包括共刺激信号传导结构域，例如以增加信号传导效能。参见美国专利7,741,465号和6,319,494号，以及Krause等人和Finney等人(出处同上)，Song等人，Blood119:696-706(2012)；Kalos等人，Sci Transl.Med.3:95(2011)；Porter等人，N.Engl.J.Med.365:725-33(2011)，以及Gross等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.56:59-83(2016)。单独通过TCR产生的信号可能不足以完全活化T细胞，并且次级或共刺激信号可以增加活化。因此，在一些实施方案中，信号传导结构域还包括一个或多个附加的信号传导结构域(例如，共刺激信号传导结构域)，其活化一种或多种免疫细胞效应子功能(例如，本文所述的天然免疫细胞效应子功能)。在一些实施方案中，可以使用此类共刺激信号传导结构域的一部分，只要该部分转导效应子功能信号即可。在一些实施方案中，本文所述的细胞质结构域包含T细胞共受体(或其片段)的一个或多个细胞质序列。共刺激结构域的非限制性示例包括但不限于4-1BB(也称为TNFRSF9、CD137、CDw137、ILA和肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、4-1BBL/CD137、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、活化NK受体、BTLA(也称为CD272和BTLA1)、CARD1l、CD2(也称为LFA-2、SRBC、T11和CD2分子)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD7(也称为GP40、LEU-9、TP41、Tp40和CD7分子)、CD8α、CD8β、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27(也称为S152、S152.LPFS2、T14、TNFRSF7和Tp55)、CD28(也称为Tp44)、CD29、CD30(也称为TNFRSF8、D1S166E和Ki-1)、CD40L(也称为CD40LG、CD154、HIGM1、IGM、IMD3、T-BAM、TNFSF5、TRAP、gp39、hCD40L和CD40配体)、CD40(也称为Bp50、CDW40、TNFRSF5、p50、CD40(蛋白质)和CD40分子)、CD49a、CD49D、CD49f、CD54(ICAM)、CD69、CD80(也称为B7、B7-1、B7.1、BB1、CD28LG、CD28LG1、LAB7和CD80分子)、CD83(和与CD83特异性结合的配体)、CD84、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(也称为BY55、NK1、NK28和CD160分子)、CD244(也称为2B4、NAIL、NKR2B4、Nmrk、SLAMF4和CD244分子)、CD247、CD276(也称为B7-H3、4Ig-B7-H3、B7H3、B7RP-2)、CD366、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357和GITR-D)、GITRL、HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR和TR2)、ICAM-1、ICOS(也称为诱导型T细胞共刺激、AILIM、CD278和CVID1)、Igα(CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、免疫球蛋白样蛋白、整合素、ITGA4、IA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB 1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG3(也称为CD223和淋巴细胞活化3)、LAT、LFA-1(也称为淋巴细胞功能相关联抗原1和CDl la/CD18)、LIGHT(也称为TNFSF14、CD258、HVEML、LTg、TR2、TNLG1D和肿瘤坏死因子超家族成员14)、LTBR、Ly9(CD229)、MHC I类分子、NKG2C(也称为CD314、D12S2489E、KLR、NKG2-D、NKG2D和杀伤细胞凝集素样受体K1)、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40(也称为TNFRSF4、ACT35、RP5-902P8.3、IMD16、CD134、TXGP1L和肿瘤坏死因子受体超家族成员4)、PAG/Cbp、PD-1(也称为PDCD1、CD279、PD-1、SLEB2、hPD-1、hPD-l、hSLE1和程序性细胞死亡1)、PD-L1(也称为CD274、B7-H、B7H1、PD-L1、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDL1、CD274分子和程序性细胞死亡1配体1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白诸如SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAMF4(CD244、2B4)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)和SLAMF7)、SLP76、TIM3(也称为HAVCR2、HAVcr-2、KIM-3、TIM3、TIMD-3、TIMD3、Tim-3和甲型肝炎病毒细胞受体2)、TNF受体蛋白、TNFR2、Toll配体受体、TLRl、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TNFR2、TRANCE/RANKL、TRIM、VLAl、VLA-6和ZAP70。示例性共刺激蛋白具有在T细胞上天然发现的共刺激蛋白的氨基酸序列，该共刺激蛋白的完整天然氨基酸序列描述于NCBI参考序列：NP_006130.1。在某些情况下，CAR包含4-1BB共刺激结构域。
在实施方案中，CAR包含CD28共刺激结构域，该共刺激结构域具有与SEQ ID NO:62具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:62)。在实施方案中，CD28共刺激结构域由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaa gcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc(SEQ ID NO:63)。
在实施方案中，CAR包含4-1BB共刺激结构域，该共刺激结构域具有与SEQ ID NO:62具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:64)。在实施方案中，4–IBB共刺激结构域由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：AGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTG(SEQ ID NO:65)。
本文所述的工程化CAR还可以在scFv或抗原结合结构域的N-末端处包含N-末端信号肽或标签。在一个实施方案中，可以使用异源性信号肽。该抗原结合结构域或scFV可以融合至前导肽或信号肽，该前导肽或信号肽引导新生蛋白质进入内质网并且随后易位至细胞表面。应当理解，一旦含有信号肽的多肽在细胞表面处表达，在内质网中加工该多肽和易位至细胞表面的过程中，该信号肽通常以蛋白水解方式去除。因此，多肽(诸如本文所述的CAR构建体)通常在细胞表面处表达为缺少信号肽的成熟蛋白质，而该多肽的前体形式包括信号肽。可以使用本领域已知的任何合适的信号序列。类似地，还可以使用本领域已知的任何已知标签序列。在一个实施方案中，信号序列是CSF2RA信号序列。在实施方案中，包含CSF2RA信号序列，该信号序列具有与以下各项具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:66)、SEQ ID MEWTWVFLFLLSVTAGVHS(SEQ ID NO:67)或MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:68)。
本文提供的信号结构域的多核苷酸和多肽序列是已知的。在一些实施方案中，编码信号传导结构域的多核苷酸包含与已知核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，信号传导结构域的多肽序列包含与已知多肽序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％(例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)相同的多肽序列。
CAR的组分可使用生物技术的常规技术交换或“交换”为等效组分。为了仅提供几个非限制性和部分示例，本公开的CAR可以包含如本文提供的结合基序与本文提供的铰链和本文提供的共刺激结构域的组合。在某些示例中，本公开的CAR可以包含前导序列连同如本文提供的结合基序与本文提供的铰链和本文提供的共刺激结构域的组合。
各种CAR序列、组分和/或框架是已知的，包括但不限于铰链序列、间隔区、跨膜结构域、共刺激结构域、刺激结构域、结合基序和每种的变体，并且如果提供例如重链可变结构域序列或CDR序列和轻链可变结构域序列或CDR序列，则可以容易地构建具有所需结合和组分或结构的CAR。
除非有相反的规定，否则“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”根据的是常规含义，即作为氨基酸序列。多肽不限于特定长度，例如，其可以包括全长蛋白质序列或全长蛋白质的片段，并且可以包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其他修饰(既有天然存在的，也有非天然存在的)。在各种实施方案中，本文设想的多肽包括蛋白质的N-末端处的信号(或前导)序列，其在翻译时或翻译后引导蛋白质的转移。
多肽包括“多肽变体”。多肽变体可以与天然存在的多肽在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入方面有所不同。此类变体可以是天然存在的，或者可以例如通过修饰上述多肽序列中的一个或多个多肽序列来合成产生。例如，在一些实施方案中，可能期望通过引入一个或多个取代、缺失、添加和/或插入来改善工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体、以及CAR和TCR的结合亲和力和/或其他生物特性。优选地，本公开的多肽包括与其具有至少约50％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性的多肽。本公开的多肽包括与本文所述的任何参考序列(参见例如序列表)具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的变体，通常其中该变体保持参考序列的至少一种生物活性。多肽包括“多肽片段”。多肽片段是指以下多肽：其可以是相比天然存在的或重组产生的多肽具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失或取代的单体多肽或多聚多肽。在某些实施方案中，多肽片段可以包含长度为至少5个至约500个氨基酸的氨基酸链。应当理解，在某些实施方案中，片段的长度至少为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个或450个氨基酸。
该多肽也可以框内融合至或缀合至接头或其他序列，以便于合成、纯化或鉴定该多肽(例如，聚组氨酸)，或者增强该多肽与固体支持物的结合。如上所述，本公开的多肽可以以各种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操纵的方法在本领域中是公知的。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变来制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是众所周知的。参见例如，Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488–492)、Kunkel等人(1987,Methods in Enzymol,154:367–382)、美国专利4,873,192号、Watson,J.D.等人(Molecular Biology of the Gene，第四版，Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)，以及其中引用的参考文献。关于不影响感兴趣蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人,(1978)Atlasof Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到。
在某些实施方案中，变体将含有保守取代。“保守取代”是指下述取代：其中氨基酸用具有相似特性的另一个氨基酸替代，使得肽化学领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。可以在本公开的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰，并且仍获得编码具有期望特性的变体或衍生多肽的功能分子。
多肽变体还包括糖基化形式、与其他分子的聚集缀合物，以及与不相关的化学部分(例如，聚乙二醇化分子)的共价缀合物。共价变体可以通过将官能团连接到在氨基酸链中或者在N-末端残基或C-末端残基处发现的基团来制备，如本领域已知的。变体还包括等位基因变体、物种变体和突变蛋白质。不影响蛋白质功能活性的区域的截短或缺失也是变体。
在期望表达两种或更多种多肽的情况下，编码这些多肽的多核苷酸序列可以由IRES序列隔开。在另一个实施方案中，两种或更多种多肽可以表示为包含一种或多种自切割多肽序列(诸如T2A多肽)的融合蛋白。在其他实施方案中，它们由不同的启动子表达，并且可在两个或更多个载体中表达。在一些实施方案中，抗CD19 CAR在与工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体相同的载体中编码，并且可操作地连结到与工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体相同的启动子，其中序列被IRES序列分开。在一些实施方案中，抗CD19 CAR或TCR在与工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体相同的载体中编码，可操作地连结到与工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的启动子不同的启动子。在某些实施方案中，抗CD19和/或抗CD20 CAR或TCR在细胞上表达，该细胞也已被工程化以表达工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体。在一些实施方案中，抗CD19和/或抗CD20 CAR或TCR在与工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体相同的载体中编码，并且可操作地连结到与工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体相同的启动子，其中序列被IRES序列或可切割接头分开。在一些实施方案中，抗CD19和/或抗CD20 CAR或TCR在与工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体相同的载体中编码，可操作地连结到与工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的启动子不同的启动子。在一些实施方案中，抗CD19和/或抗CD20 CAR结合CAR在与工程化膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体不同的载体中编码。
抗CD19 CAR可包含如本文所述抗体中发现的抗原结合序列(参见例如表5)。在一些实施方案中，本公开的抗CD19 CAR包含本文提供的抗原结合片段。
在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含表5中公开的至少一个HCDR。在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含表5中公开的至少两个HCDR。在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含表5中公开的三个HCDR。
在各种实施方案中，抗CD19结合基序包含表5中公开的至少一个LCDR。在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含表5中公开的至少两个LCDR。在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含表5中公开的三个LCDR。
在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含表5中公开的至少一个HCDR和表5中公开的至少一个LCDR。在各种实施方案中，抗CD19结合基序包含表5中公开的至少两个HCDR和表5中公开的至少两个LCDR。在各种实施方案中，抗CD19结合基序包含表5中公开的三个HCDR和表5中公开的三个LCDR。
在各种实施方案中，抗CD19结合基序包含表5中公开的重链可变结构域的至少一个重链框架区(重链FR)。在各种实施方案中，抗CD19结合基序包含表5中公开的重链可变结构域的至少两个重链FR。在各种实施方案中，抗CD19结合基序包含表5中公开的重链可变结构域的三个重链FR。
在各种实施方案中，抗CD19结合基序包含表5中公开的轻链可变结构域的至少一个轻链FR。在各种实施方案中，抗CD19结合基序包含表5中公开的轻链可变结构域的至少两个轻链FR。在各种实施方案中，抗CD19结合基序包含表5中公开的轻链可变结构域的三个轻链FR。
在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含表5中公开的重链可变结构域的至少一个重链FR，以及表5中公开的轻链可变结构域的至少一个轻链FR。在各种实施方案中，抗CD19CAR包含表5中公开的重链可变结构域的至少两个重链FR，以及表5中公开的轻链可变结构域的至少两个轻链FR。在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含表5中公开的重链可变结构域的三个重链FR，以及表5中公开的轻链可变结构域的三个轻链FR。
在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含一个、两个或三个FR，其一起或各自单独地与表5中公开的重链可变结构域的重链可变结构域的对应FR具有至少75％同一性(例如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)。在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含一个、两个或三个FR，其一起或各自单独地与表5中公开的轻链可变结构域的轻链可变结构域的对应FR具有至少75％同一性(例如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)。
在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含至少一个与表5中公开的重链可变结构域具有至少75％的序列同一性(例如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的重链可变结构域。在各种实施方案中，抗CD19 CAR包含至少一个与表5中公开的轻链可变结构域具有至少75％的序列同一性(例如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的轻链可变结构域。
在各种实施方案中，抗CD19 CARc包含至少一个与表5中公开的重链可变结构域具有至少75％的序列同一性(例如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的重链可变结构域，以及至少一个与表5中公开的轻链可变结构域具有至少75％的序列同一性(例如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗CD19 CAR包含结合基序，该结合基序包含本公开的重链可变结构域、本公开的轻链可变结构域以及与SEQ ID NO:45具有至少75％的序列同一性(例如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的接头。在某些实施方案中，抗CD19CAR包含结合基序，该结合基序包含本公开的重链可变结构域、本公开的轻链可变结构域以及与SEQ ID NO:66具有至少75％的序列同一性(例如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的前导序列。
表5：示例性抗CD19序列
在实施方案中，抗CD19 CAR具有与SEQ ID NO:90具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:90)。在实施方案中，抗CD19 CAR由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：GACATTCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCTTAGGAGATAGAGTTACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAATACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGACGGCACTGTGAAACTGCTTATTTACCACACCTCCAGACTGCACAGCGGCGTTCCCAGCAGATTCTCTGGCAGCGGATCTGGAACCGACTACAGCCTCACCATCTCCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCCTACACCTTCGGAGGAGGAACCAAGCTGGAGATCACCGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTTAAGCTGCAGGAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCTCCTAGCCAATCTTTATCTGTGACCTGCACTGTGTCCGGCGTTAGCCTGCCCGATTATGGCGTTTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTTATCTGGGGCAGCGAGACCACATACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGACTTACGATTATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTTTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCTAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACAAGCGTTACCGTTAGCAGCGCTGCTGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTTAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGACCTTCTAAGCCTTTCTGGGTTCTGGTGGTGGTCGGCGGCGTTTTAGCCTGTTACAGCCTTCTGGTGACTGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTTAGAAGCAAGAGAAGCAGACTGCTCCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCTGGCCCCACCAGAAAGCATTACCAGCCCTACGCTCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGGAGCAGAGTTAAATTCAGCAGATCCGCCGATGCCCCCGCTTACCAACAGGGACAAAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTGGGGAGAAGAGAAGAATACGACGTTCTGGATAAGAGAAGGGGCAGAGATCCCGAAATGGGGGGCAAGCCCAGACGCAAGAACCCTCAGGAGGGGCTTTACAACGAACTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCGGAGATTGGGATGAAGGGGGAGAGAAGGCGGGGCAAGGGACACGATGGCTTATACCAGGGGCTGAGCACCGCCACCAAGGACACATACGACGCTCTTCATATGCAGGCTCTGCCCCCAAGA(SEQ ID NO:91)。
在实施方案中，连结到膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的抗CD19 CAR具有与SEQ ID NO:92具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSEQKLISEEDLAGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGGGSGGGGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKT(SEQ ID NO:92)。在实施方案中，连结到膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的抗CD19 CAR由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGG
CAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCA
AGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTA
CACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTG
GATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTG
AAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCT
GTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGT
AAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAG
TAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCA
GACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAA
ATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAA
CATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGA
ACCTCAGTCACAGTCTCCTCAGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCT
CCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTG
AAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAG
CCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGC
TTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGG
AGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCC
GGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTC
GCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCC
CGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAG
GACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGAC
CCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCC
TGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAG
ATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCC
TTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTC
ACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCTCTGGCGAAGGCAGAGGCTCT
CTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCAGGCCCCATGGACTG
GACATGGATTCTGTTTCTTGTGGCTGCCGCCACAAGAGTGCACAGCGA
GCAGAAGCTGATCAGCGAGGAAGACCTCGCTGGAAGCAATTGGGTGA
ACGTGATCTCCGACCTCAAAAAGATCGAGGATCTGATCCAGTCCATGC
ACATCGATGCCACACTCTACACCGAGTCCGATGTGCACCCTAGCTGCA
AAGTTACAGCAATGAAATGCTTTCTGCTGGAGTTGCAAGTAATCTCCC
TGGAGTCCGGAGATGCTTCCATCCACGACACAGTGGAGAATTTAATC
ATTCTGGCTAACAATTCCCTCTCGTCTAATGGCAATGTCACTGAGAGC
GGCTGTAAAGAGTGTGAAGAGCTGGAGGAGAAAAACATCAAAGAGT
TTCTGCAGAGCTTCGTCCACATCGTCCAAATGTTCATCAACACCTCGT
CCGGGGGCGGCTCCGGGGGAGGAGGATCGGGGGGAGGAGGAAGCGG
AGGTGGAGGAAGCGGTGGAGGGTCCATTACATGCCCTCCCCCCATGT
CCGTGGAACATGCCGACATATGGGTAAAGTCCTACTCTCTGTACTCGC
GGGAACGTTATATCTGCAACAGCGGCTTTAAGAGAAAGGCCGGAACA
TCTTCTCTGACCGAATGTGTGCTGAACAAGGCCACAAATGTGGCTCAC
TGGACCACGCCTAGCCTCAAGTGTATTAGGGACGGCGGCGGAGGTTC
CGGTGGCGGGGGCTCTAGATCGAATCTGGGCTGGCTGTGTCTGCTGCT
GCTCCCCATCCCTCTGATTGTGTGGGTTAAGCGAAAAGAGGTCCAGAAAACCTAA(SEQ ID NO:93)。
适用于本文公开的CAR、载体、细胞和方法的示例性抗CD20抗体及其片段可见于2020年6月18日公布的国际专利公布WO/2020/123691号，该专利公布全文以引用方式特别并入本文。在实施方案中，抗CD20 CAR具有与SEQ ID NO:90具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85％-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％，或95％-100％)的氨基酸序列。QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKEYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYSGHTYYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGPHYDDWSGFIIWFDPWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRFPPTFGQGTKVEIKAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:90)。在实施方案中，抗CD20 CAR由与具有根据以下的序列的核酸具有至少75％的序列同一性(诸如，至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性；例如，85％-90％、85-95％、85％-100％、90％-95％、90％-100％或95％-100％)的核酸编码：CAGGTTCAGCTTGTGCAGAGCGGAGCTGAAGTTAAGAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGGTTAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACATTCAAGGAATATGGCATCTCCTGGGTTAGGCAGGCTCCCGGCCAAGGCTTAGAATGGATGGGCTGGATCTCCGCCTACTCCGGCCACACCTACTACGCCCAGAAGCTTCAGGGCAGGGTTACCATGACCACCGACACCAGCACCTCTACCGCCTATATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCGGACGACACAGCTGTGTATTACTGCGCCAGAGGCCCCCACTACGACGACTGGTCTGGATTTATCATCTGGTTCGACCCCTGGGGGCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCTGGCTCCACCAGCGGAAGCGGCAAGCCAGGCTCAGGCGAAGGATCTACAAAAGGCGACATCCAAATGACACAGAGCCCCAGCAGCTTGAGCGCCTCCGTTGGCGACAGAGTTACAATCACCTGCAGGGCCTCTCAGAGCATCAGCAGCTATTTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTCATCTACGCTGCCAGCTCGCTCCAATCTGGCGTTCCTAGCAGATTTAGCGGCTCCGGCAGCGGCACAGACTTTACTCTTACCATTAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCTACCTACTATTGCCAGCAAAGCTACAGATTCCCTCCCACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTTGAGATCAAGGCAGCTGCTTTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCTAAGCCCACCACCACTCCTGCTCCAAGACCTCCTACCCCCGCTCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCGGAGGCATGCAGACCTGCGGCAGGGGGAGCAGTTCACACAAGAGGCTTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGCGGAGTTCTTCTTCTTAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAGATTCAGCGTTGTGAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGA(SEQ ID NO:91)。
本公开还提供了编码本文所述的多种膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽中的任一种或CAR或TCR中的任一种的核酸。在一个实施方案中，重组核酸构建体包含编码膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽的核酸分子，任选具有一个或多个CAR或TRC。
本公开包括载体，该载体包含本公开的核酸和/或编码本公开的膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽，任选地与编码本文所述的任何CAR或TCR的核酸组合。任何载体均适用于本公开。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、EpsteinBarr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关联载体(AAV)、慢病毒载体或它们的任何组合。合适的示例性载体包括例如pGAR、pBABE-puro、pBABE-neo largeTcDNA、pBABE-hygro-hTERT、pMKO.1GFP、MSCV-IRES-GFP、pMSCV PIG(PuroIRES GFP空质粒)、pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE、MSCV IRES荧光素酶、pMIG、MDH1-PGK-GFP_2.0、TtRMPVIR、pMSCV-IRES-mCherry FP、pRetroX GFP T2A Cre、pRXTN、pLncEXP和pLXIN-Luc。
重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括那些设计用于增殖和扩增或用于表达或两者的载体，诸如质粒和病毒。例如，载体可以选自pUC系列(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。也可以使用噬菌体载体，例如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在本公开的上下文中有用的植物表达载体的示例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在本公开的上下文中有用的动物表达载体的示例包括pcDNA、pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，双顺反子IRES载体(例如，来自Clontech)用于包含编码抗原结合系统的核酸和本文所述的诱导型表达构建体。
重组表达载体可以使用例如Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratoryManual，第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates andJohn Wiley&Sons,NY,1994中描述的标准重组DNA技术来制备。环状或线性表达载体的构建体可被制备成含有在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统。复制系统可以源自例如ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
重组表达载体可以包含一个或多个标记基因，其允许选择转化的或转染的宿主。标记基因包括杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中的互补以提供原养等。用于重组表达载体的合适的标记基因包括例如新霉素/G418抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
在本公开的上下文中有用的载体可以是“裸”核酸载体(即，具有很少或不具有包裹它们的蛋白质、糖和/或脂质的载体)，或与其他分子复合的载体。可与载体适当地结合的其他分子包括但不限于病毒外壳、阳离子脂质、脂质体、多胺、金颗粒和靶向部分诸如配体、受体或靶向细胞分子的抗体。
在某些实施方案中，膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽和CAR或TCR可构建在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中。在一个实施方案中，本公开提供了多组载体，其包括第一载体和第二载体，该第一载体包括编码本文所述的任何膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽的序列，并且第二载体包括编码CAR或TCR的序列。在一些实施方案中，第一载体和第二载体中的一者或两者是慢病毒、逆转录病毒或腺病毒载体。在一些实施方案中，第二载体还包括与编码CAR或TCR的序列可操作地连结的启动子序列和/或增强子序列。在一些实施方案中，第二载体还包括与编码CAR或TCR的序列可操作地连结的poly(A)序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种多顺反子表达盒。产生多顺反子表达盒的元件的示例包括但不限于各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES，例如，FGF-1IRES、FGF-2IRES、VEGF IRES、IGF-II IRES、NF-KB IRES、RUNX1IRES、p53 IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、口疮病毒IRES、小核糖核酸病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可切割接头(例如，2A肽，例如，P2A、T2A、E2A和F2A肽)。逆转录病毒载体和合适的包装线的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人类细胞的功能。已知多种产生双嗜性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller等人，1985,Mol.Cell.Biol.5:431-437)；PA317(Miller等人，1986,Mol.Cell.Biol.6:2895-2902)；以及CRIP(Danos等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464)。非两性颗粒也是合适的，例如，用VSVG、RD114或GALV包膜和本领域已知的任何其他假型化的颗粒。
载体DNA可经由常规转化、转染或转导技术引入细胞例如免疫细胞中。术语“转化”和“转染”涵盖多种本领域公认的用于将外来核酸(例如，DNA)引入细胞中的技术，诸如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、基因枪、纳米颗粒介导的递送或电穿孔。转导包括载体向细胞的病毒递送，例如通过本文公开的载体，包括但不限于逆转录病毒、慢病毒和AAV。
本公开包括包含、表达或被工程化(例如，转化或转导)以包含或表达本公开的至少一种载体或核酸的细胞。在一个实施方案中，本公开提供了包含(a)CAR或TCR和(b)膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽的细胞(1)。可用CAR或TCR和膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽转导免疫细胞，使得细胞表达CAR或TCR和膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽。
嵌合抗原受体(CAR或CAR-T)和工程化T细胞受体(TCR)可以容易地插入免疫细胞例如T细胞中并由其表达。在某些实施方案中，细胞(例如免疫细胞，诸如T细胞、NK细胞或诱导多能干细胞(iPSC))获自供体受试者。在一些实施方案中，供体受试者是罹患癌或肿瘤的人类患者。在其他实施方案中，供体受试者是未患有癌症或肿瘤的人类患者。在一些实施方案中，工程化细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，工程化细胞对于受试者是同种异体的。
在某些实施方案中，本发明公开的免疫细胞(例如，具有增加的抗肿瘤细胞因子的分泌，该抗肿瘤细胞因子包括但不限于IL-18、IL-2、IFN-γ和TNF-α)。在某些实施方案中，免疫细胞具有减少的与细胞因子释放综合征(CRS)相关联的细胞因子(例如，IL-6)的分泌。
任何细胞均可以用作本公开的多核苷酸、载体或多肽的宿主细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞(诸如哺乳动物细胞)。合适的原核细胞包括但不限于：真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobactehaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，以及志贺氏菌属(Shigella)；杆菌(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；以及链霉菌属(Streptomyces)。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。在一些实施方案中，该细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，该免疫细胞选自由以下项组成的组：T细胞、B细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、TCR表达细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、粒细胞、先天淋巴样细胞、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、胸腺细胞和骨髓细胞。在一个实施方案中，该免疫细胞是T细胞。在另一个实施方案中，该免疫细胞是NK细胞。在某些实施方案中，T细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、自体T细胞、工程化自体T细胞(eACTTM)、同种异体T细胞、异源性T细胞、iPSC细胞，或它们的任何组合。
在一个实施方案中，将本文提供的膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽和/或CAR或TCR引入T细胞中。T细胞可以来自本领域已知的任何来源。例如，可在体外从造血干细胞群中分化出T细胞，或者可从受试者获得T细胞。T细胞可获自例如外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。另外，T细胞可衍生自本领域中可用的一种或多种T细胞系。还可使用技术人员已知的多种技术(诸如FICOLLTM分离和/或血液单采术)从收集自受试者的血液单位中获得T细胞。在一些实施方案中，洗涤通过血液单采术收集的细胞以去除血浆级分，并将其置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理。在一些实施方案中，用PBS洗涤细胞。应当理解，可使用洗涤步骤，诸如通过使用半自动流通式离心机，例如CobeTM 2991细胞处理器、Baxter CytoMateTM等。在一些实施方案中，将洗涤的细胞重悬于一种或多种生物相容性缓冲液或者具有或不具有缓冲液的其他盐溶液中。在一些实施方案中，去除血液单采术样本的不需要的组分。分离T细胞疗法用T细胞的附加方法公开于美国专利公布2013/0287748号以及国际专利申请公布WO2015/120096号和WO2017/070395号中，所有这些专利公布全体以引用方式全文并入本文以用于描述这些方法的目的。
在一些实施方案中，通过裂解红血细胞并耗竭单核细胞(例如通过使用通过PERCOLLTM梯度的离心)来从PBMC分离T细胞。在一些实施方案中，通过本领域已知的阳性或阴性选择技术来进一步分离T细胞的特定亚群，诸如CD4+、CD8+、CD28+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，可使用针对阴性选择的细胞特有的表面标记物的抗体组合来完成通过阴性选择的T细胞群的富集。在一些实施方案中，可使用经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20和HLA-DR的抗体。在一些实施方案中，使用流式细胞术和细胞分选来分离用于本公开中的感兴趣的细胞群。
在一些实施方案中，使用如本文所述的方法将PBMC直接用于免疫细胞的基因修饰。在一些实施方案中，在分离PBMC之后，进一步分离T淋巴细胞，并且在基因修饰和/或扩增之前或之后，将细胞毒性和辅助T淋巴细胞分选为幼稚、记忆和效应T细胞亚群。在一些实施方案中，通过鉴定与这些类型的CD8+细胞的每一种相关联的细胞表面抗原，将CD8+细胞进一步分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。在一些实施方案中，中央记忆T细胞的表型标记物的表达包括CCR7、CD3、CD28、CD45RO、CD62L和CD127并且对颗粒酶B是阴性的。在一些实施方案中，中央记忆T细胞是CD8+、CD45RO+和CD62L+T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞对CCR7、CD28、CD62L和CD127是阴性的并且对颗粒酶B和穿孔素是阳性的。在一些实施方案中，将CD4+T细胞进一步分选为亚群。例如，可通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群来将CD4+T辅助细胞分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。
在一些实施方案中，使用已知方法在分离后对免疫细胞(例如，NK细胞或T细胞)进行基因修饰，或者在对免疫细胞进行基因修饰之前使其在体外活化和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在另一个实施方案中，免疫细胞，例如NK细胞或T细胞，用如本文所述的CAR或TCR遗传修饰(例如，用包含一种或多种编码CAR或TCR的核苷酸序列的病毒载体转导)，任选地用膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽遗传修饰(例如，用包含一种或多种编码膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽的核苷酸序列的病毒载体转导)，然后体外活化和/或扩增。用于活化和扩增T细胞的方法是本领域已知的，并且描述于例如美国专利6,905,874号、6,867,041号和6,797,514号以及国际专利申请公开WO 2012/079000号中，它们的内容全文据此以引用方式并入。一般来讲，此类方法包括在具有适当的细胞因子(诸如IL-2)的培养基中使PBMC或分离的T细胞与通常附着于珠粒或其他表面的刺激剂和共刺激剂(诸如抗CD3和抗CD28抗体)接触。附着在同一珠粒上的抗CD3抗体和抗CD28抗体充当“替代”抗原递呈细胞(APC)。一个示例是系统，这是一种用于人T细胞的生理活化的CD3/CD28激活剂/刺激剂系统。在其他实施方案中，使用诸如美国专利6,040,177号和5,827,642号以及国际专利申请公布WO 2012/129514号(这些专利的内容据此全文以引用方式并入)中描述的那些的方法，用饲养细胞以及适当的抗体和细胞因子活化并刺激T细胞以增殖。
本文所述的方法还可包括富集从供体获得的淋巴细胞群。富集淋巴细胞(例如，一种或多种T细胞)群可以通过任何合适的分离方法完成，该分离方法包括但不限于使用分离介质(例如，FICOLL-PAQUETM、ROSETTESEPTM HLA总淋巴细胞富集混合物、淋巴细胞分离培养基(LSA)(MP生物医疗公司(MP Biomedical)目录号0850494X)等)、通过过滤或淘选进行细胞大小、形状或密度分离、免疫磁性分离(例如，磁性激活细胞分选系统，MACS)、荧光分离(例如，荧光激活细胞分选系统，FACS)或基于珠粒的柱分离。
本文所述的方法还可包括在合适的条件下用一种或多种T细胞刺激剂刺激淋巴细胞群以产生活化的T细胞群。一种或多种合适的T细胞刺激剂的任何组合都可以用于产生活化的T细胞群，该合适的T细胞刺激剂包括但不限于靶向T细胞刺激或共刺激分子的抗体或其功能片段(例如，抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体或其功能片段)或任何其他合适的丝裂原(例如，十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)、植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(conA)、脂多糖(LPS)、美洲商陆丝裂原(PWM)或T细胞刺激或共刺激分子的天然配体。
用于刺激如本文所述的淋巴细胞群的合适条件可包括温度、时间量和/或存在的CO2水平。在某些实施方案中，用于刺激的温度为约34℃、约35℃、约36℃、约37℃或约38℃。在某些实施方案中，用于刺激的温度为约34℃-38℃。在某些实施方案中，用于刺激的温度为约35℃-37℃。在某些实施方案中，用于刺激的温度为约36℃-38℃。在某些实施方案中，用于刺激的温度为约36℃-37℃或约37℃。
如本文所述的用于刺激淋巴细胞群的另一条件可包括用于刺激的时间。在一些实施方案中，用于刺激的时间为约24小时-72小时。在一些实施方案中，用于刺激的时间为约24小时-36小时、约30小时-42小时、约36小时-48小时、约40小时-52小时、约42小时-54小时、约44小时-56小时、约46小时-58小时、约48小时-60小时、约54小时-66小时或约60小时-72小时。在一个具体的实施方案中，用于刺激的时间为约48小时或至少约48小时。在其他实施方案中，用于刺激的时间为约44小时-52小时。在某些实施方案中，用于刺激的时间为约40小时-44小时、约40小时-48小时、约40小时-52小时或约40小时-56小时。
如本文所述的刺激淋巴细胞群的其他条件可包括CO2水平。在一些实施方案中，用于刺激的CO2水平为约1.0％-10％ CO2。在一些实施方案中，用于刺激的CO2水平为约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％或约10.0％CO2。在一个实施方案中，用于刺激的CO2水平为约3％-7％ CO2。在其他实施方案中，用于刺激的CO2水平为约4％-6％ CO2。在其他实施方案中，用于刺激的CO2水平为约4.5％-5.5％CO2。在一个具体的实施方案中，用于刺激的CO2水平为约5％CO2。
用于刺激淋巴细胞群的条件可以包括温度、刺激时间量和/或存在的CO2水平的任何组合。例如，刺激淋巴细胞群的步骤可以包括在约36℃-38℃的温度处，对于约44小时-52小时的时间量，以及在约4.5％-5.5％ CO2的CO2水平的存在下用一种或多种T细胞刺激剂刺激淋巴细胞群。
可用于本文方法的淋巴细胞的浓度为约1.0-10.0×106个细胞/mL。在某些实施方案中，淋巴细胞的浓度为约1.0-2.0×106个细胞/mL、约1.0-3.0×106个细胞/mL、约1.0-4.0×106个细胞/mL、约1.0-5.0×106个细胞/mL、约1.0-6.0×106个细胞/mL、约1.0-7.0×106个细胞/mL、约1.0-8.0×106个细胞/mL、1.0-9.0×106个细胞/mL或约1.0-10.0×106个细胞/mL。在某些实施方案中，淋巴细胞的浓度为约1.0-2.0×106个细胞/mL。在某些实施方案中，淋巴细胞的浓度为约1.0-1.2×106个细胞/mL、约1.0-1.4×106个细胞/mL、约1.0-1.6×106个细胞/mL、约1.0-1.8×106个细胞/mL或约1.0-2.0×106个细胞/mL。在某些实施方案中，淋巴细胞的浓度为至少约1.0×106个细胞/mL、至少约1.1×106个细胞/mL、至少约1.2×106个细胞/mL、至少约1.3×106个细胞/mL、至少约1.4×106个细胞/mL、至少约1.5×106个细胞/mL、至少约1.6×106个细胞/mL、至少约1.7×106个细胞/mL、至少约1.8×106个细胞/mL、至少约1.9×106个细胞/mL、至少约2.0×106个细胞/mL、至少约4.0×106个细胞/mL、至少约6.0×106个细胞/mL、至少约8.0×106个细胞/mL或至少约10.0×106个细胞/mL。
抗CD3抗体(或其功能片段)、抗CD28抗体(或其功能片段)或抗CD3和抗CD28抗体的组合可以根据刺激淋巴细胞群的步骤使用。可以使用任何可溶性或固定的抗CD2抗体、抗CD3抗体和/或抗CD28抗体或它们的功能片段(例如，克隆OKT3(抗CD3)、克隆145-2C11(抗CD3)、克隆UCHT1(抗CD3)、克隆L293(抗CD28)、克隆15E8(抗CD28))。在一些方面，抗体可以从本领域已知的供应商商业购买，该已知的供应商包括但不限于德国天美旎生物技术公司、BD生物科学公司(BD Biosciences)(例如，1mg/mL纯的MACS GMP CD3，部件号170-076-116)和eBioscience公司。此外，本领域技术人员将理解如何通过标准方法产生抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些实施方案中，根据刺激淋巴细胞群的步骤使用的一种或多种T细胞刺激剂包括在T细胞细胞因子的存在下靶向T细胞刺激或共刺激分子的抗体或其功能片段。在一个方面，一种或多种T细胞刺激剂包括抗CD3抗体和IL-2。在某些实施方案中，T细胞刺激剂包括浓度为约20ng/mL-100ng/mL的抗CD3抗体。在某些实施方案中，抗CD3抗体的浓度为约20ng/mL、约30ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL或约100ng/mL。在一个具体的实施方案中，抗CD3抗体的浓度为约50ng/mL。在一个另选的实施方案中，不需要T细胞活化。在这样的实施方案中，该方法省略了刺激淋巴细胞群以产生活化的T细胞群的步骤，并且根据以下步骤转导可以富集T淋巴细胞的淋巴细胞群。
本文所述方法可包括用包含编码膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽和/或CAR或TCR的核酸分子的病毒载体转导活化的T细胞群，使用单循环转导产生转导的T细胞群。在利用带有膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽的病毒载体的实施方案中，病毒载体可与编码CAR或TCR的病毒载体分开，或者病毒载体可编码膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽和CAR或TCR。转导如本文所述的活化的免疫细胞群可以在一定时间段、在某个温度下和/或在特定CO2水平的存在下以任何组合进行：温度为约36℃-38℃，持续约16小时-24小时的时间量，以及在约4.5％-5.5％ CO2的CO2水平的存在下。免疫细胞可以通过本申请方法中的任何一种方法与制备用于免疫疗法的T细胞的任何制造方法的组合来制备，该任何制造方法包括但不限于国际专利申请公布WO2015/120096号和WO2017/070395号中所述的那些，这些专利出于描述这些方法的目的全文以引用方式并入本文；用于制备阿基仑赛、布奥仑赛、Liso-cel的任何和所有方法；用于制备替沙仑赛的任何和所有方法；用于制备免疫疗法用“现成”T细胞的任何和所有方法；以及制备向人施用的淋巴细胞的任何其他方法。该制造方法可以适于从获自患者的细胞去除循环肿瘤细胞。
已经将几种重组病毒用作病毒载体以将遗传物质递送到细胞。可以根据转导步骤使用的病毒载体可以是任何同向性或双向性病毒载体，包括但不限于重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体、重组腺病毒载体和重组腺相关联病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，该方法还包括用逆转录病毒转导一种或多种NK细胞或T细胞。在一个实施方案中，用于转导NK细胞或活化的T细胞群的病毒载体是MSGV1γ逆转录病毒载体。在某些实施方案中，用于转导NK细胞或活化的T细胞群的病毒载体是Kochenderfer，J.Immunother.32(7):689-702(2009)描述的PG13-CD19-H3载体。根据该实施方案的一个方面，病毒载体在对病毒载体制造具有特异性的培养基(在本文中称为“病毒载体接种物”)中的悬浮培养物中生长。根据本文所述的方法，可以在病毒载体接种物中使用用于生长病毒载体的任何合适的生长培养基和/或补充剂。根据一些方面，然后在转导步骤期间将病毒载体接种物添加到下文所述的无血清培养基中。
如本文所述的用于转导NK细胞或活化的T细胞群的条件可以包括特定时间、特定温度和/或存在的特定CO2水平。在某些实施方案中，用于转导的温度为约34℃、约35℃、约36℃、约37℃或约38℃。在一个实施方案中，用于转导的温度为约34℃-38℃。在另一个实施方案中，用于转导的温度为约35℃-37℃。在另一个实施方案中，用于转导的温度为约36℃-38℃。在又一个实施方案中，用于转导的温度为约36℃-37℃。在一个实施方案中，转导温度为约37℃。
在某些实施方案中，用于转导的时间为约12小时-36小时。在一些实施方案中，用于转导的时间为约12小时-16小时、约12小时-20小时、约12小时-24小时、约12小时-28小时或约12小时-32小时。在其他实施方案中，用于转导的时间为约20小时或至少约20小时。在一个实施方案中，用于转导的时间为约16小时-24小时。在其他实施方案中，用于转导的时间为至少约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约22小时、至少约24小时或至少约26小时。
在某些实施方案中，用于转导的CO2水平为约1.0％-10％ CO2。在其他实施方案中，用于转导的CO2水平为约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％或约10.0％ CO2。在一个实施方案中，用于转导的CO2水平为约3％-7％ CO2。在另一个实施方案中，用于转导的CO2水平可以是约4％-6％ CO2。在另一个实施方案中，用于转导的CO2水平为约4.5％-5.5％ CO2。在一个实施方案中，用于转导的CO2水平为约5％CO2。
在一些实施方案中，转导如本文所述的活化的T细胞群可以在特定时间、在特定温度下和/或在特定CO2水平的存在下以任何组合进行：温度为约36℃-38℃，持续约16小时-24小时的时间量，以及在约4.5％-5.5％ CO2的CO2水平的存在下。
本文所述的方法可包括将转导的一种或多种NK细胞或T细胞群扩增特定时间以产生工程化NK细胞或T细胞群。扩增的预定时间可以是任何合适的时间，该任何合适的时间允许(i)在工程化NK细胞或T细胞群中产生足够数量的细胞，用于施用于患者的至少一个剂量，(ii)与典型的较长过程相比产生具有有利比例的幼态细胞的工程化T细胞群，或(iii)(i)和(ii)两者。该时间将取决于由NK细胞或T细胞表达的细胞表面受体、所使用的载体、具有治疗效果所需的剂量和其他变量。因此，在一些实施方案中，扩增的预定时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或多于21天。在一些方面，扩增时间比本领域已知的扩增方法短。例如，预定的扩增时间可以更短至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或者可以更短75％。在一个方面，扩增时间为约3天，并且从富集产生工程改造的NK细胞或T细胞的淋巴细胞群开始的时间为约6天。
用于扩增转导的NK细胞或T细胞群的条件可以包括温度和/或存在的CO2水平。在某些实施方案中，温度为约34℃、约35℃、约36℃、约37℃或约38℃。在一个实施方案中，温度为约34℃-38℃。在另一个实施方案中，温度为约35℃-37℃。在另一个实施方案中，温度为约36℃-38℃。在又一个实施方案中，温度为约36℃-37℃。在一个实施方案中，温度为约37℃。在某些实施方案中，CO2水平为1.0％-10％ CO2。在其他实施方案中，CO2水平为约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％或约10.0％ CO2。在一个实施方案中，CO2水平为约4.5％-5.5％ CO2。在另一个实施方案中，CO2水平为约5％CO2。在其他实施方案中，CO2水平为约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5.0％、约5.5％或约6.5％ CO2。在一些实施方案中，用于扩增转导的NK细胞或T细胞群的条件包括温度和/或存在的CO2水平的任何组合。例如，用于扩增转导的T细胞群的条件包括约36℃-38℃的温度和存在的约4.5％-5.5％ CO2的CO2水平。
本文所述的制造的每个步骤可以在封闭系统中进行。在某些实施方案中，密闭系统是使用任何合适的细胞培养袋(例如，德国天美旎生物技术公司GMP细胞分化袋、奥利金生物医学公司(Origen Biomedical)透气性生命细胞培养袋(PermaLife CellCulture bags))的密闭袋培养系统。在一些实施方案中，在密闭袋培养系统中使用的细胞培养袋在转导步骤期间用重组人纤连蛋白片段涂覆。重组人纤连蛋白片段可以包括三个功能结构域：中央细胞结合结构域、肝素结合结构域II和CS1序列。重组人纤连蛋白片段可以通过辅助靶细胞和病毒载体的共定位来增加逆转录病毒转导免疫细胞的基因转移效率。在某些实施方案中，重组人纤连蛋白片段是/>(日本宝生物工程株式会社(Takara Bio,Japan))。在某些实施方案中，细胞培养袋涂覆有浓度为约1μg/mL-60μg/mL或约1μg/mL-40μg/mL的重组人纤连蛋白片段。在其他实施方案中，细胞培养袋涂覆有浓度为约1μg/mL-20μg/mL、20μg/mL-40μg/mL或40μg/mL-60μg/mL的重组人纤连蛋白片段。在一些实施方案中，细胞培养袋涂覆有约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/mL、约10μg/mL、约11μg/mL、约12μg/mL、约13μg/mL、约14μg/mL、约15μg/mL、约16μg/mL、约17μg/mL、约18μg/mL、约19μg/mL或约20μg/mL重组人纤连蛋白片段。在其他实施方案中，细胞培养袋涂覆有约2μg/mL-5μg/mL、约2μg/mL-10μg/mL、约2μg/mL-20μg/mL、约2μg/mL-25μg/mL、约2μg/mL-30μg/mL、约2μg/mL-35μg/mL、约2μg/mL-40μg/mL、约2μg/mL-50μg/mL或约2μg/mL-60μg/mL重组人纤连蛋白片段。在某些实施方案中，细胞培养袋涂覆有至少约2μg/mL、至少约5μg/mL、至少约10μg/mL、至少约15μg/mL、至少约20μg/mL、至少约25μg/mL、至少约30μg/mL、至少约40μg/mL、至少约50μg/mL或至少约60μg/mL重组人纤连蛋白片段。在一个具体的实施方案中，细胞培养袋涂覆有至少约10μg/mL重组人纤连蛋白片段。在密闭袋培养系统中使用的细胞培养袋可以任选地在转导步骤期间用人白蛋白血清(HSA)封闭。在一个另选的实施方案中，在转导步骤期间，细胞培养袋不用HSA封闭。
通过上述方法产生的工程改造的免疫细胞群可以任选地冷冻保存，使得以后可以使用该细胞。本文还提供了一种用于冷冻保存工程改造的免疫细胞群的方法。这种方法可以包括用稀释剂溶液洗涤和浓缩工程改造的免疫细胞群的步骤。例如，稀释剂溶液是生理盐水、0.9％盐水、PlasmaLyte A(PL)、5％葡萄糖/0.45％ NaCl盐水溶液(D5)、人血清白蛋白(HSA)或其组合。另外，可以将HSA添加到经洗涤和浓缩的细胞中，以在解冻后改善细胞活力和细胞恢复。在另一个方面，洗涤溶液是生理盐水，并且向经洗涤和浓缩的细胞补充HSA(5％)。该方法还可以包括产生冷冻保存混合物的步骤，其中该冷冻保存混合物包括稀释剂溶液中的稀释细胞群和合适的冷冻保存溶液。冷冻保存溶液可以是任何合适的冷冻保存溶液，包括但不限于CryoStor10(生物生命溶液公司(BioLife Solution))，其以1:1或2:1的比率与工程改造的免疫细胞的稀释剂溶液混合。可以添加HSA以提供在冷冻保存混合物中的最终浓度为约1.0-10％、约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10.0％、约1％-3％HSA、约1％-4％HSA、约1％-5％HSA、约1％-7％HSA、约2％-4％HSA、约2％-5％HSA、约2％-6％HSA、约2％-7％HSA或约2.5％HSA。工程化的免疫细胞群的冷冻保存可以包括用0.9％生理盐水洗涤细胞，将最终浓度为5％的HSA添加到经洗涤的细胞中，并且用CryoStorTM CS10将细胞1:1稀释(对于在最终冷冻保存混合物中2.5％HSA的最终浓度)。在一些方面，该方法还包括将冷冻保存混合物冷冻的步骤。另外，冷冻保存混合物在受控速率冷冻机中使用限定的冷冻循环以介于约1×106至约1.5×107个细胞/mL冷冻保存混合物之间的细胞浓度进行冷冻。该方法还可以包括将冷冻保存混合物储存在气相液氮中的步骤。
可以将通过本文所述的方法产生的工程改造的免疫细胞群以预定剂量冷冻保存。预定剂量可以是治疗有效剂量，其可以是如下文所提供的任何治疗有效剂量。预定剂量的工程改造的免疫细胞可以取决于由免疫细胞表达的结合基序(例如，细胞上表达的结合基序的亲和力和密度)、靶细胞的类型、疾病的性质或被治疗的病理病症或它们的组合。工程化免疫细胞表达的结合基序可以是CAR或TCR靶向的任何抗原或分子。在某些方面，表达CAR或TCR的工程化免疫细胞的预定剂量可以是大于约1百万至小于约3百万转导的工程化NK细胞或T细胞/kg。在一个实施方案中，表达CAR或TCR的工程化NK细胞或T细胞的预定剂量可以是每千克体重超过约1百万至约2百万转导的工程化NK细胞或T细胞(细胞数/kg)。表达CAR或TCR的工程化NK细胞或T细胞的预定剂量可以是每千克体重超过1百万至约2百万，至少约2百万至小于约3百万转导的工程化NK细胞或T细胞(细胞数/kg)。在一个实施方案中，表达CAR或TCR的工程化NK细胞或T细胞的预定剂量可以是约2百万转导的工程化T细胞/kg。在另一个实施方案中，表达CAR或TCR的工程化NK细胞或T细胞的预定剂量可以是至少约2百万转导的工程化NK细胞或T细胞/kg。表达CAR或TCR的工程化NK细胞或T细胞的预定剂量的示例可以是约2.0百万、约2.1百万、约2.2百万、约2.3百万、约2.4百万、约2.5百万、约2.6百万、约2.7百万、约2.8百万或约2.9百万转导的工程化NK细胞或T细胞/kg。在一个实施方案中，可以将工程改造的T细胞群以约1百万个工程改造的NK细胞或T细胞/千克体重(细胞数/kg)的预定剂量冷冻保存。在某些实施方案中，可以将工程化NK细胞或T细胞群以约500,000至约1百万工程化NK细胞或T细胞/kg的预定剂量冷冻保存。在某些实施方案中，可以将工程化NK细胞或T细胞群以至少约1百万、至少约2百万、至少约3百万、至少约4百万、至少约5百万、至少约6百万、至少约7百万、至少约8百万、至少约9百万、至少约10百万工程化NK细胞或T细胞/kg的预定剂量冷冻保存。在其他方面，可以将工程化NK细胞或T细胞群以小于1百万个细胞/kg、1百万个细胞/kg、2百万个细胞/kg、3百万个细胞/kg、4百万个细胞/kg、5百万个细胞/kg、6百万个细胞/kg、7百万个细胞/kg、8百万个细胞/kg、9百万个细胞/kg、1千个细胞/kg、超过1千万个细胞/kg、超过2千万个细胞/kg、超过3千万个细胞/kg、超过4千万个细胞/kg、超过6千万个细胞/kg、超过7千万个细胞/kg、超过8千万个细胞/kg、超过9千万个细胞/kg或超过1亿个细胞/kg的预定剂量冷冻保存。在某些方面，可以将工程化NK细胞或T细胞群以约1百万至约2百万工程化NK细胞或T细胞/kg的预定剂量冷冻保存。可以将工程化NK细胞或T细胞群以约1百万个细胞至约2百万个细胞/kg、约1百万个细胞至约3百万个细胞/kg、约1百万个细胞至约4百万个细胞/kg、约1百万个细胞至约5百万个细胞/kg、约1百万个细胞至约6百万个细胞/kg、约1百万个细胞至约7百万个细胞/kg、约1百万个细胞至约8百万个细胞/kg、约1百万个细胞至约9百万个细胞/kg、约1百万个细胞至约1千万个细胞/kg的预定剂量冷冻保存。可以基于受试者的体重计算工程化NK细胞或T细胞群的预定剂量。在一个示例中，可以将工程化NK细胞或T细胞群在约0.5mL-200mL的冷冻保存培养基中冷冻保存。此外，可以将工程改造的T细胞群在约0.5mL、约1.0mL、约5.0mL、约10.0mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70mL、约80mL、约90mL或约100mL、约10mL-30mL、约10mL-50mL、约10mL-70mL、约10mL-90mL、约50mL-70mL、约50mL-90mL、约50mL-110mL、约50mL-150mL或约100mL-200mL的冷冻保存培养基中冷冻保存。在某些方面，可以将工程化NK细胞或T细胞群在约50mL-70mL冷冻保存培养基中冷冻保存。
本公开还提供了包含本文所述的任何核酸、载体、核酸组、载体组或细胞的组合物(例如，药物组合物)。例如，本文提供了一种组合物，其包含本文所述的任何核酸或核酸组，或本文提供的任何载体或载体组，以及药学上可接受的溶剂或载体。本文还提供了药物组合物，其包含本文提供的多种载体组(例如，包括第一载体和第二载体的载体组，该第一载体包括编码膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽的任何核酸，并且该第二载体包括编码CAR或TCR的核酸序列)和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂。在一些实施方案中，组合物包含赋形剂。在另一个实施方案中，组合物包含含有CAR或TCR和膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽的NK细胞或T细胞。
在其他实施方案中，选择组合物以用于肠胃外递送、用于吸入或用于通过消化道递送，诸如口服。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。在某些实施方案中，使用缓冲剂将组合物保持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。在某些实施方案中，当考虑肠胃外施用时，组合物呈药学上可接受的溶媒中的无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式，该水溶液包含本文所述的组合物，有或没有附加治疗剂。在某些实施方案中，用于肠胃外注射的溶媒是无菌蒸馏水，在其中将本文所述的组合物与或不与至少一种附加治疗剂一起配制为适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施方案中，制备涉及将所需分子与聚合物化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体一起配制，以提供产品的受控或持续释放，然后将其经由积存注射进行递送。在某些实施方案中，可植入药物递送装置用于引入所需的分子。
在一些实施方案中，组合物可以是本文所述的任何细胞(例如，先前从受试者(例如，鉴定或诊断为患有癌症的受试者)获得的本文所述的任何细胞)。在一个实施方案中，细胞包含编码膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽和/或本文所述的任何CAR或TCR的核酸。在包含本文所述的任何细胞的组合物中，组合物还可包含细胞培养基或药学上可接受的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水)。
药物组合物可包含如本文所述的CAR-或TCR-表达细胞，例如多种TCR-或CAR-表达细胞，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；助剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
本公开的药物组合物可以配制用于根据本文阐述的任何实施方案施用，其至少一个非限制性示例是静脉内施用。组合物可以配制用于静脉内、瘤内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、硬膜外和/或皮下施用途径。在实施方案中，组合物被配制用于肠胃外施用途径。适用于肠胃外施用的组合物可以是水性或非水性等渗无菌注射溶液，其可含有例如使组合物与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质。水性或非水性无菌悬浮液可含有一种或多种助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。本公开的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。
在各种实施方案中，本文所述的工程化NK或T细胞可掺入药物组合物中。如本文所公开的，包含工程化T细胞的药物组合物可以是任何形式。此类形式包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。
包含本公开的结合剂的药物组合物可以通过已知方法配制(诸如在Remington’sPharmaceutical Sciences，第17版，编辑Alfonso R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1985)中描述的)。在各种情况下，可以将包含本公开的结合剂的药物组合物配制成包含药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体的示例包括但不限于生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。包含工程化T细胞的组合物可包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐。
用于注射的无菌组合物可根据常规药学实践使用注射用蒸馏水作为媒介物来配制。例如，生理盐水或含有葡萄糖和其他补充剂诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠的等渗溶液可用作注射用水溶液，任选地与合适的增溶剂组合，该合适的增溶剂例如醇诸如乙醇和多元醇诸如丙二醇或聚乙二醇，以及非离子表面活性剂诸如聚山梨醇酯80TM、HCO-50等。
油性液体的非限制性示例包括芝麻油和大豆油，并且可以与苯甲酸苄酯或苯甲醇组合作为增溶剂。可包含在组合物中的其他物质是缓冲剂诸如磷酸盐缓冲剂或乙酸钠缓冲剂、舒缓剂诸如普鲁卡因盐酸盐、稳定剂诸如苯甲醇或苯酚，以及抗氧化剂。配制的注射剂可以包装在合适的安瓿中。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含可检测水平的污染物，例如内毒素、支原体、具有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是选自由粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和/或化脓性链球菌A组组成的组中的至少一种。
在一些实施方案中，工程化细胞在输注到癌症患者之前用白介素-2(IL-2)离体处理，并且在输注后用IL-2治疗癌症患者。此外，在一些实施方案中，癌症患者可以在施用结合剂之前经历制备性淋巴细胞清除—免疫系统的临时消融。IL-2治疗和制备性淋巴细胞清除的组合可以增强结合剂的持久性。在一些实施方案中，用编码细胞因子(例如，膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽)的核酸转导或转染工程化细胞，该核酸可被工程化以提供细胞因子的组成型、可调节的或时间控制的表达。合适的细胞因子包括，例如，在收缩期期间起到增强T淋巴细胞存活作用的细胞因子，这可以促进记忆T淋巴细胞的形成和存活。
在一些实施方案中，施用于受试者的剂量可随实施方案、所采用的组合物、施用方法以及所治疗的部位和受试者而变化。然而，剂量应足以提供治疗反应。临床医生可以确定为了治疗或预防医学病症而施用于人或其他受试者的组合物的治疗有效量。治疗有效所需的组合物的精确量可取决于多种因素，例如结合剂的活性和施用途径。
可将适当数量的包含CAR或TCR的工程化细胞施用于受试者。虽然本文所述的单个工程化细胞能够扩增并提供治疗益处，但在一些实施方案中，施用102个或更多个，例如103个或更多个、104个或更多个、105个或更多个、或108个或更多个工程化细胞。在一些实施方案中，将1012个或更少，例如1011个或更少、109个或更少、107个或更少、或105个或更少的本文所述的工程化细胞施用于受试者。在一些实施方案中，施用本文所述的102-105、104-107、103-109或105-1010个工程化细胞。包含含有CAR或TCR的细胞的药物组合物可以以例如104至109个细胞/kg体重(例如，105至106个细胞/kg体重)的剂量施用。在另一个实施方案中，治疗有效量的T细胞是约104个细胞、约105个细胞、约106个细胞、约107个细胞或约108个细胞。药物组合物可以以例如约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg、约1×107个细胞/kg、约2×107个细胞/kg、约3×107个细胞/kg、约4×107个细胞/kg、约5×107个细胞/kg、约6×107个细胞/kg、约7×107个细胞/kg、约8×107个细胞/kg或约9×107个细胞/kg的剂量施用。
根据需要，可以将一定剂量的如本文所述的工程化T细胞或NK细胞在合适的时间段内一次或以一系列亚剂量施用于哺乳动物，例如以每日一次、半周一次、每周一次、两周一次、半月一次、两月一次、半年一次或一年一次基础。根据需要，包含有效量的结合剂的剂量单位可以以单日剂量施用，或总日剂量可以以每日施用的两个、三个、四个或更多个分剂量施用。
合适的施用方式可由医师选择。施用途径可以是肠胃外施用，例如通过注射施用、经鼻施用、经肺施用或经皮施用。可以通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射进行全身或局部施用。在一些实施方案中，选择组合物以用于肠胃外递送、用于吸入或用于通过消化道递送，诸如口服。施用的剂量和方法可以根据受试者的体重、年龄、状况等而变化，并且可以适当地选择。
任何形式的选择或使用可以部分地取决于预期的施用方式和治疗应用。例如，旨在用于全身或局部递送的包含本公开的工程化细胞的组合物可以是可注射或可输注溶液的形式。因此，包含本公开的工程化组合物可配制用于通过肠胃外模式(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射)施用。肠胃外施用是指除肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、鼻内、眼内、肺部、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、肺内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、脑内、颅内、颈动脉内和胸骨内注射和输注。
在各种实施方案中，包含本公开的工程化细胞的药物组合物可以配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或适合于以高浓度稳定储存的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过将包含所需量的本公开的工程化细胞的组合物与上文列举的成分中的一种或组合根据需要掺入在适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将包含本公开的工程化细胞的组合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物包含基础分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分。例如，可以通过使用包衣诸如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持溶液的适当流动性。包含本公开的结合剂的可注射组合物的延长吸收可以通过在包含本公开的结合剂的组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来实现。
包含本公开的工程化细胞的药物组合物可以以包含在水或另一种药学上可接受的液体中的无菌溶液或悬浮液的可注射制剂的形式肠胃外施用。例如，包含抗原结合系统的药物组合物可以通过适当地将工程化细胞与药学上可接受的媒介物或介质(诸如无菌水和生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味赋形剂、稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂)组合，然后混合成普遍接受的药学实践所需的单位剂型来配制。药物制剂中包含的活性成分的量使得提供指定范围内的合适剂量。油性液体的非限制性示例包括芝麻油和大豆油，并且可以与苯甲酸苄酯或苯甲醇组合作为增溶剂。可包含的其他物质是缓冲剂诸如磷酸盐缓冲剂或乙酸钠缓冲剂、舒缓剂诸如普鲁卡因盐酸盐、稳定剂诸如苯甲醇或苯酚，以及抗氧化剂。配制的注射剂可以包装在合适的安瓿中。
在一些实施方案中，可以配制包含抗原结合系统的组合物用于在低于0℃的温度(例如，-20℃或-80℃)处储存。在一些实施方案中，包含本公开的工程化细胞的组合物可被配制用于在2℃-8℃(例如，4℃)储存长达2年(例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、10个月、11个月、1年、11/2年或2年)。因此，在一些实施方案中，包含抗原结合系统的组合物在2℃-8℃(例如，4℃)处稳定储存至少1年。
在一些情况下，包含本公开的工程化药物组合物可以配制为溶液。在一些实施方案中，包含本公开的工程化细胞的组合物可以配制为例如合适浓度并且适合于在2℃-8℃(例如，4℃)储存的缓冲溶液。包含本文所述的工程化细胞的药物组合物可以配制在免疫脂质体组合物中。循环时间延长的脂质体公开于例如美国专利5,013,556号中。
在某些实施方案中，包含本公开的工程化细胞的组合物可以与将保护组合物免于快速释放的载体一起配制，诸如包含植入物和微囊化递送系统的控释制剂。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的许多方法是已知的。参见例如J.R.Robinson(1978)“Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,”Marcel Dekker,Inc.,New York。
在各种实施方案中，皮下给药可以通过装置实现，例如注射器、预填充注射器、自动注射器(例如，一次性或可重复使用的)、笔式注射器、贴片注射器、可穿戴注射器、具有皮下输注装置的移动注射器输注泵，或用于与用于皮下注射的粘合剂药物组合的其他装置。
本公开的注射系统可采用如美国专利5,308,341号中所述的递送笔。笔式装置通常用于向糖尿病患者自行输送胰岛素。此类装置可包括至少一个注射针(例如，长度为约5mm至8mm的31号针)，通常预填充有一个或多个治疗单位剂量的治疗溶液，并且可用于将溶液快速递送至受试者而疼痛尽可能小。一种药物递送笔包括小瓶保持器，治疗药物或其他药物的小瓶可以容纳在该小瓶保持器中。笔可以是完全机械的装置，或者它可以与电路系统结合以精确地设定和/或指示注射到使用者中的药物剂量。参见例如美国专利6,192,891号。在一些实施方案中，笔式装置的针头是一次性的，并且套件包括一个或多个一次性替换针头。适用于递送本公开的包含结合剂的本发明特征组合物中的任一种的笔式装置还描述于例如美国专利6,277,099号、6,200,296号和6,146,361号中，其中每一者的公开内容全文以引用方式并入本文。基于微针的笔式装置描述于例如美国专利7,556,615号中，其公开内容全文以引用方式并入本文。还可参见Scandinavian Health Ltd制造的精密笔式注射器(PPI)装置MOLLYTM。
在一些实施方案中，包含本公开的工程化细胞的组合物可以通过不依赖于工程化细胞经由血管系统转运至其预期靶组织或部位的局部施用的方式递送至受试者。例如，包含本公开的工程化细胞的组合物可以通过注射或植入包含本公开的工程化细胞的组合物或通过注射或植入含有包含本公开的工程化细胞的组合物的装置来递送。在某些实施方案中，在靶组织或部位附近局部施用后，包含本公开的工程化细胞或其一种或多种组分的组合物可以扩散到不是施用部位的预期靶组织或部位。
药物溶液可包含治疗有效量的包含本公开的工程化细胞的组合物。这样的有效量可以部分地基于所施用的包含本公开的工程化细胞的组合物的效果，或包含本公开的工程化细胞的组合物和一种或多种另外的活性剂的组合效果来容易地确定。包含本公开的工程化T细胞的组合物的治疗有效量还可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及组合物(和一种或多种另外的活性剂)在个体中引起期望的反应的能力，例如，至少一种病症参数的改善，例如，补体介导的病症的至少一种症状的改善等因素而变化。例如，治疗有效量的包含本公开的工程化细胞的组合物可以抑制(减轻其严重性或消除其发生)和/或预防病症和/或病症的任何一种症状。治疗有效量也是这样的量，其中包含本公开的工程化细胞的组合物的任何毒性或有害效果被治疗有益效果所抵消。
包含本公开的工程化细胞的组合物可以固定剂量或以毫克每千克(mg/kg)剂量施用。在一些实施方案中，还可以选择剂量以减少或避免针对包含本公开的工程化细胞的组合物中的一种或多种结合基序分子的抗体或其他宿主免疫应答的产生。虽然决不旨在限制，但结合剂(诸如包含本公开的工程化细胞的组合物)的示例性剂量包括例如1mg/kg-1000mg/kg、1mg/kg-100mg/kg、0.5mg/kg-50mg/kg、0.1mg/kg-100mg/kg、0.5mg/kg-25mg/kg、1mg/kg-20mg/kg和1mg/kg-10mg/kg。包含本公开的工程化细胞的组合物的示例性剂量包括但不限于0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4mg/kg、8mg/kg或20mg/kg。
包含本公开的结合剂的任何组合物的合适的人剂量可以在例如I期剂量递增研究中进一步评估。参见例如van Gurp等人，(2008)Am JTransplantation 8(8):1711-1718；Hanouska等人，(2007)Clin Cancer Res 13(2，第1部分)；523-531；以及Hetherington等人，(2006)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10):3499-3500。
本公开提供了用于在有需要的受试者中增加对靶标抗原的免疫应答的方法和用途，包括向受试者施用有效量的本文公开的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽和CAR或TCR。本公开还提供了用于治疗和/或预防受试者中癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽和CAR或TCR。本公开还提供了一种在受试者中增加响应于癌症或病原体的细胞因子产生的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的免疫细胞，其中免疫细胞包含膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽和CAR或TCR。本公开还提供增加磷酸化-STAT 5(pSTAT5)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的免疫细胞，其中免疫细胞包含膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽，以及任选CAR或TCR。本文公开的主题还提供了一种减少受试者的肿瘤负荷的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的免疫细胞，其中免疫细胞包含膜结合IL-15-IL-15Rα嵌合多肽和CAR或TCR。包括施用药学有效量的本公开的工程化细胞的本公开的方法和用途还可用于增加T细胞介导的靶标细胞的细胞毒性(与不含膜结合IL-15-IL-15Rα的对照相比)、增加IFN-γ和/或TNFα的产生(与不含膜结合IL-15-IL-15Rα的对照相比)、减小肿瘤的大小、杀死肿瘤细胞、防止肿瘤细胞增殖、防止肿瘤生长、消除患者的肿瘤、防止肿瘤复发、防止肿瘤转移、诱导患者缓解或它们的任何组合。在某些实施方案中，本文提供的方法诱导完全应答。在一些实施方案中，本文提供的方法诱导部分应答。
可治疗的癌症包括未血管化、尚未充分血管化或血管化的肿瘤。癌症还可包括实体瘤或非实体瘤。在一些实施方案中，癌症是血液癌。在一些实施方案中，癌症是白血细胞的癌。在其他实施方案中，癌症是浆细胞的癌。在一些实施方案中，癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在某些实施方案中，癌症是急性淋巴细胞性白血病(ALL)(包括非T细胞ALL)、急性淋巴性白血病(ALL)和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH))、B细胞幼淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴性白血病(“BALL”)、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性或急性肉芽肿病、慢性或急性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病、噬血细胞综合征(巨噬细胞活化综合征(MAS)、霍奇金病、大细胞肉芽肿、白细胞粘附缺陷、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征(MDS)、髓性疾病(包括但不限于急性髓性白血病(AML))、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞增生性疾病(例如，无症状性骨髓瘤(郁积型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶液质；孤立性骨髓瘤；孤立性浆细胞瘤；髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、POEMS综合征(Crow-Fukase综合征；Takatsuki病；PEP综合征)、原发纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、系统性淀粉样蛋白轻链型淀粉样变性、T细胞急性淋巴性白血病(“TALL”)、T细胞淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症或它们的组合。在其他实施方案中，癌症可以是任何肉瘤(例如，滑膜肉瘤、成骨肉瘤、子宫平滑肌肉瘤和肺泡横纹肌肉瘤)、肝细胞癌、神经胶质瘤、头癌(例如，鳞状细胞癌)、颈癌(例如，鳞状细胞癌)、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、结肠癌(例如，结肠癌)、食道癌、宫颈癌、胃癌、胃肠道类癌、下咽癌、喉癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、恶性间皮瘤、黑素瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、腹膜、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌(例如，肾细胞癌)、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和尿路上皮癌(例如，输尿管癌和膀胱癌)。
在各种情况下，使用包含如本文所提供的CAR或TCR的工程化细胞来治疗癌症的方法是自体细胞疗法。在各种情况下，使用包含如本文所提供的CAR或TCR的工程化细胞来治疗癌症的方法是同种异体细胞疗法。
在各种实施方案中，本文提供的用于本公开的细胞疗法可以在治疗过程中施用于受试者，该治疗过程还包括施用不是本文提供的细胞疗法的一种或多种另外的治疗剂或疗法。在某些实施方案中，本公开提供了用于治疗癌症的组合疗法，该治疗包括向接受和/或需要本文提供的细胞疗法的受试者施用抗癌剂。
在某些实施方式中，包含如本文所提供的CAR或TCR的工程化细胞的施用可以是对先前接受过、计划接受或正在接受包含另外的抗癌疗法的治疗方案的受试者。在各种实施方案中，与工程化细胞组合施用的另外的药剂或疗法可与工程化细胞同时施用、与工程化细胞在同一天施用、或与工程化细胞在同一周施用。在各种实施方案中，可投予与包含如本文所提供的CAR或TCR的工程化细胞组合施用的另外的药剂或疗法，使得工程化细胞和另外的药剂或疗法的施用在施用工程化细胞之前或之后一个或多个小时、之前或之后一天或多天、之前或之后一周或多周或之前或之后一个或多个月。在各种实施方案中，一种或多种另外的药剂的施用频率可以与工程化细胞的施用频率相同、相似或不同。
与包含如本文所提供的CAR或TCR的工程化细胞组合使用的药剂或疗法可与工程化细胞一起以单一治疗组合物或剂量施用，与工程化细胞以单独组合物的形式同时施用，或以与工程化细胞的施用在时间上不同的方式施用。当包含如本文所提供的CAR或TCR的工程化细胞与另外的药剂组合使用时，工程化细胞可以与另外的药剂共同配制，或者工程化细胞可以与另外的药剂制剂分开配制。
在一些实施方案中，方法还包括施用化疗药。在某些实施方案中，所选择的化疗药是淋巴细胞清除性(预调理)化疗药。有益的预调理治疗方案连同相关的有益生物标记物一起描述于美国临时专利申请62/262,143和62/167,750中，这些临时专利申请据此全文以引用方式并入本文。这些临时专利申请描述了例如调理需要T细胞疗法的患者的方法，该方法包括向患者施用指定有益剂量的环磷酰胺(200mg/m2/天与2000mg/m2/天之间)和指定剂量的氟达拉滨(20mg/m2/天与900mg/m2/天之间)。一种这样的剂量方案涉及治疗患者，包括在向患者施用治疗有效量的工程化的T细胞之前，持续三天每天向患者施用约500mg/m2/天的环磷酰胺和约60mg/m2/天的氟达拉滨。在其他实施方案中，含有CAR或TCR的工程化细胞和化疗剂各自以有效治疗受试者的疾病或病症的量施用。
在某些实施方案中，包含本文公开的表达CAR和/或TCR的免疫细胞的组合物可以与任何数量的化疗剂联合施用。化学疗法剂的实例包括烷化剂，诸如噻替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，诸如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine resume)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如阿克拉霉素、放线菌素、蒽霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄性激素，诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；布沙莫司汀；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOLTM，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))和多西他赛(罗纳普朗克乐安公司(Rhone-Poulenc Rorer))；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，诸如TargretinTM(蓓萨罗丁)、PanretinTM(阿利维A酸)；ONTAKTM(地尼白介素)；埃斯帕米霉素(esperamicin)；卡培他滨；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，包含本文所公开的表达CAR和/或TCR的免疫细胞的组合物可与用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂联合施用，该抗激素剂诸如为抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬、LY117018、奥那司通和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在适当的情况下，还施用化学疗法剂的组合，包括但不限于CHOP，即环磷酰胺多柔比星(羟基多柔比星)、长春新碱/>和泼尼松。
在一些实施方案中，化疗剂在施用含有CAR或TCR的工程化细胞或编码CAR或TCR的核酸的同时或施用后一周内施用。在其他实施方案中，化疗剂在工程改造的细胞或核酸施用后1至4周或1周至1个月、1周至2个月、1周至3个月、1周至6个月、1周至9个月或1周至12个月施用。在一些实施方案中，化疗剂在施用工程化细胞或核酸之前至少1个月施用。在一些实施方案中，方法还包括施用两种或更多种化疗剂。
多种另外的治疗剂可以与本文所述的组合物联合使用。例如，潜在有用的附加治疗剂包括PD-1抑制剂，诸如纳武利尤单抗帕博利珠单抗/>帕博利珠单抗、匹地利珠单抗(CureTech)和阿替利珠单抗(罗氏公司(Roche))。适于与本公开组合使用的其他治疗剂包括但不限于依鲁替尼/>奥法木单抗利妥昔单抗/>贝伐珠单抗/>曲妥珠单抗恩美曲妥珠单抗/>伊马替尼/>西妥昔单抗/>帕尼单抗/>卡妥索单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、托西莫单抗、本妥昔单抗、阿仑单抗、吉妥珠单抗、厄洛替尼、吉非替尼、凡德他尼、阿法替尼、拉帕替尼、来那替尼、阿西替尼、马赛替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、妥拉尼布、来他替尼、阿西替尼、西地尼布、乐伐替尼、尼达尼布、帕唑帕尼、瑞格非尼、司马沙尼、索拉非尼、舒尼替尼、替沃扎尼、妥拉尼布、凡德他尼、恩曲替尼、卡博替尼、伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼、普纳替尼、拉多替尼、博舒替尼、来他替尼、鲁索替尼、帕克替尼、考比替尼、司美替尼、曲美替尼、比美替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、克唑替尼、阿柏西普、阿地伯肽(adipotide)、地尼白介素、mTOR抑制剂诸如依维莫司和替西罗莫司、hedgehog抑制剂诸如索尼德吉和维莫德吉、CDK抑制剂诸如CDK抑制剂(帕博西尼)。
在另外的实施方案中，包含含有CAR和/或TCR的免疫细胞的组合物与抗炎剂一起施用。抗炎剂或抗炎药可包括但不限于类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙)；非甾体抗炎药(NSAIDS)，包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。示例性NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂和唾液酸化剂(sialylate)。示例性镇痛药包括对乙酰氨基酚、羟考酮、曲马朵或盐酸丙氧芬。示例性糖皮质激素包括可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物应答调节剂包括针对细胞表面标记物(例如，CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂诸如TNF拮抗剂(例如，依那西普阿达木单抗和英夫利昔单抗/>趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包括单克隆抗体以及分子的重组形式。示例性DMARD包括硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺吡啶、羟氯喹、金制剂(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素。
在某些实施方案中，本文所述的组合物与细胞因子联合施用。“细胞因子”是指由一个细胞群释放的作为细胞间介体作用于另一个细胞的蛋白质。细胞因子的示例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如促滤泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子(HGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳素；苗勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关联肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物学活性等同物。如本文所用，“细胞因子”也是指对与特异性抗原接触作出应答而由一个细胞释放的非抗体蛋白，其中细胞因子与第二细胞相互作用以介导第二细胞中的应答。细胞因子可以由细胞内源性表达或者被施用于受试者。细胞因子可由免疫细胞(包括巨噬细胞、B细胞、T细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可以在受体细胞中诱导各种应答。细胞因子可以包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎细胞因子、效应子和急性期蛋白。例如，包括白介素(IL)7和IL–15在内的稳态细胞因子促进免疫细胞存活和增殖，并且促炎细胞因子可以促进炎性应答。稳态细胞因子的示例包括但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12(例如IL-12p40和IL-12p35)、IL-15和干扰素(IFN)γ。促炎细胞因子的示例包括但不限于IL–1a、IL–1b、IL–6、IL–13、IL–17a、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF–β、成纤维细胞生长因子(FGF)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM–CSF)、可溶性细胞间粘附分子1(sICAM–1)、可溶性血管细胞粘附分子1(sVCAM–1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF–C、VEGF–D和胎盘生长因子(PLGF)。效应子的示例包括但不限于颗粒酶A、颗粒酶B、可溶性Fas配体(sFasL)和穿孔素。急性期蛋白的示例包括但不限于C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请都具体且单独地指明以引用方式并入一般。然而，本文引用的参考文献不应被解释为承认这种参考文献是本公开的现有技术。就以引用方式并入的参考文献中提供的任何定义或术语与本文提供的术语和讨论不同而言，以本术语和定义为准。在本申请中引用的所有参考文献的内容均以引用方式明确地并入本文。
实施例
实施例1
设计了拴系到IL-15Rα激动剂受体构建体的工程化膜结合IL-15(膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽)，如SEQ ID NO:27的序列所示。该构建体长度为273个氨基酸并且包括来自IgE的氨基酸1-18的信号肽结构域、myc表位标签、AGS接头、来自氨基酸49至162的活性形式的IL-15、GS接头、来自IL-15Rα的氨基酸31至96的sushi结构域、GS接头、来自FAS的氨基酸171至190的跨膜结构域以及包含8个氨基酸的FAS的截短的细胞内结构域。拴系到IL-15Rα的膜结合IL-15显示为T细胞表面上的单体。该受体的氨基酸序列如下所示：MDWTWILFLVAAATRVHSEQKLISEEDLAGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDggggsggggsRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKT(SEQ ID NO:27)。
另外，还设计了拴系到IL-15Rα激动剂构建体的第二工程化膜结合IL-15(膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽)并且其根据SEQ ID NO:29的序列来合成，SEQ IDNO:29的序列如下所示：MDWTWILFLVAAATRVHSEQKLISEEDLAGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDGGGGSGGGGSPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:29)。
该构建体长度也是273个氨基酸并且包括来自IgE的氨基酸1-18的信号肽结构域、myc表位标签、和AGS接头、来自氨基酸49至162的活性形式的IL-15、GS接头、来自IL-15Rα的氨基酸31至96的sushi结构域、GS接头、来自IL-7CPT突变蛋白的氨基酸237至264的跨膜结构域。由于跨膜结构域中的半胱氨酸残基形成二硫键的能力，该拴系到IL-15Rα的膜结合IL-15被认为显示为二聚体。在该实施例和其他实施例中，两种膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽可被称为IL15 Sushi单体和IL15 Sushi二聚体，分别指具有FAS和IL-7衍生的跨膜结构域的构建体。
实施例2
如实施例1中所述，具有N-末端Myc表位标签的两种膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽最初在T细胞中测试，然后与两种不同的CAR配对。利用两个不同共刺激结构域(CD28和4-1BB)的两种CAR构建体如下所示：
a.CD19：(FMC63 scFv+CD28细胞内结构域+CD3ζ细胞内结构域)
b.GPC3：(YP7 scFv+4-1BB细胞内结构域+CD3ζ细胞内结构域)。
将慢病毒载体用于所有T细胞转导。EF1A启动子用于单独在T细胞中测试的受体和与GPC CAR配对一起测试的受体。CD19 CAR利用mSCV启动子。
从获自健康供体的外周血单核细胞分离获自STEMCELLTMTechnologies(Vancouver,Canada)的CD3+细胞，并且在细胞冷冻保存培养基(Sigma)中冷冻。在慢病毒转导之前，将CD3泛T细胞解冻，使用CD3/CD28/>(ThermoFisher Scientific)根据制造商的建议进行活化，然后静置过夜。第二天，用含有如本文所述的膜结合IL-15-IL-15Sushi结构域受体的慢病毒转导细胞。
细胞在具有5％人血清的TC培养基(X–VIVOTM,Lonza)中生长12天，每周补充三次100个国际单位/ml的白介素-2(IL–2)。在第12天，将细胞离心并重新悬浮于含有5％人血清但不含IL-2补充剂的TC培养基(X–VIVOTM，Lonza)中。在第6、15、20、23天，使用19CAR+的Myc-Tag AF 647缀合物、DL650-抗FMC63，通过流式细胞术测量转基因阳性细胞。AnttiWhitlow-APC用于GPC3 CAR，BUV737用于CD3，BUV563用于CD4以及BUV395用于CD8。
在BD LSRFortessaTM(BD and Company)上用BD FACSDivaTM软件(BD andCompany)收集所有流式细胞术数据，并且使用FlowJo(BD and Company)分析数据。所有抗体染色均在含有1％ BSA的PBS中在4℃下进行。在23天内评价细胞的活力和转基因表达。第12天后，用不含补充IL-2的TC培养基培养的转导和非转导T细胞的表达水平和细胞活力在表6中示出。
表6
膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的表达通过用针对Myc标签的抗体对细胞进行染色来确认。与未转导的T细胞相比，用任一膜结合的IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体(单体或二聚体)转导的T细胞显示出更高的活力，表明含有膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的转导T细胞的增殖增强。
实施例3
为了测量膜结合的IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体对IL-15途径的活化，将相等数量的转导和未转导的第六天T细胞在无血清的RPMI培养基中培养过夜。然后通过离心收集细胞，并在对pSTAT5水平进行MSD分析之前，使用MSD裂解缓冲液+蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Meso Scale Discovery)裂解细胞。pSTAT5信号传导是来自膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的IL-15途径活化的指示剂。结果在下表7中示出：
表7
实验组 pSTAT5 MSD信号
未转导T细胞 215
IL-15-IL-15RαSushi单体 2239
IL-15-IL-15RαSushi二聚体 2091
用两种IL-15-IL-15Rαsushi结构域受体转导的T细胞的pSTAT5信号传导水平是未转导T细胞的10倍左右，如表7所示。
实施例4
为了研究是否表达膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体可以增强使用嵌合抗原受体(CAR)的基于T细胞的免疫疗法的持久性和有效性，构建体被设计成编码膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体单体和膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体二聚体：用具有对CD19或GPC3特异的scFvs的CAR，随后是T2A自切割肽。没有IL-膜结合的IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体的CAR构建体用作阳性对照。通过加入膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，增强的CAR T细胞刺激IL-15Rβ/γ信号传导途径以用于IL-15Rβ/γ阳性T细胞的活化和/或增殖。
为了确定本文描述的IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体是否可增强持久性和有效性，将CD3+细胞从原代人外周血单核细胞(PBMC)分离，并且用以下构建体转导：其仅包含CD19 CAR(FMC63 scFv+CD28细胞内结构域+CD3ζ细胞内结构域)，CD19 CAR+IL-15-IL-15RαSushi结构域单体或CD19 CAR+IL-15-IL-15RαSushi结构域二聚体。
评估19CAR、CD19 CAR+IL-15-IL-15RαSushi结构域单体和CD19CAR+IL-15-IL-15Rαsushi结构域二聚体T细胞的表达和平均荧光强度(MFI)，结果示于下表8中。
表8
接下来，第十一天，将T细胞在RPMI培养基中培养，制备全细胞裂解物，并获得pSTAT5信号传导。结果描述于表9中。
表9
所有工程化T细胞中的pSTAT5信号传导的背景水平在表9中示出。
未转导T细胞或表达CD19 CAR的T细胞不诱导pSTAT5信号传导，而用任一1IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体工程化的T细胞诱导pSTAT5信号传导增加约6倍。该数据证实了IL-15-IL-15RαSushi单体和IL-15-IL-15RαSushi二聚体受体在19CAR的情境下可以反式信号传导。
实施例5
在长期体外杀伤测定法中用靶标重复刺激通常与体内实验结果相关。因此，使用系列刺激测定法来测量CD19 CAR T细胞扩增，并在该测定法中测试IL-15-IL-15RαSushi结构域单体和IL-15-IL-15RαSushi结构域二聚体的作用。所有CAR组的表达水平如上表8中所示。
将CD19 CAR阳性T细胞与来自American Type Culture Company(ATCC，Manassas,VA)的表达CD19的Nalm6靶标细胞以1:1的比例共培养十八天。基于通过计数珠粒和流式细胞术测量的CAR+T细胞的数目，每三天至四天以1:1的比率添加靶标细胞。
为了确定IL-15-IL-15RαSushi结构域单体和IL-15-IL-15RαSushi结构域二聚体对CD19 CAR T细胞功能的效果，用CD19+Nalm6靶标细胞刺激CD19 CAR T细胞六次，持续18天。测量靶介导的CAR T细胞倍数扩增以及Nalm6％细胞溶解。结果描述于表10中。
表10
结果表明19CAR+IL15-IL-15RαSushi单体和19CAR+IL15-IL-15RαSushi二聚体在第十八天比单独的19CAR具有更大的CAR+倍数扩增。19CAR+IL15-IL-15RαSushi二聚体扩增在第14天和第18天分别是19CAR的124倍和593倍，在第14天收缩。IL-15-IL-15RαSushi二聚体扩增在第14天是19CAR的5倍，在第十天后收缩。测量CAR T细胞Nalm6细胞杀伤。结果描述于表11中。
表11
系列杀伤结果表明，19CAR+IL15-IL-15RαSushi单体和19CAR+IL15-IL-15RαSushi二聚体以1:1E:T比率优于19CAR D18。19CAR在第18天不杀伤Nalm6细胞。
实施例6
IL-15主要作用于CD8+亚类。评估来自系列杀伤的CD8+比率，并且结果在表12中。结果表明，与单独的19CAR相比，第十四天的CD8+T细胞比率更高。
表12
实施例7
CD19 CAR、CD19 CAR+19CAR+IL15-IL-15RαSushi单体和CD19CAR+19CAR+IL15-IL-15Rα二聚体在Nalm6散布小鼠模型中进行体内测试。
含有生物发光报道子的CD19+Nalm6细胞在90％ RPMI、10％ FBS、1％L-谷氨酰胺中生长。来自Jackson Laboratory的NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)用于研究。在第0天，使用BD U-100胰岛素注射器1/2cc，28G，通过经尾侧静脉静脉注射0.1ml的5.0×105CD19+Nalm6细胞，对8周龄小鼠进行移植。如前所述制造和编辑CAR-T细胞。在CD19+Nalm6植入后的第7天，通过静脉内注射给予小鼠100ul的来自制造第10天的CAR-T细胞。
使用IVIS Lumina S5进行体内生物发光成像。在约2％-3％异氟烷气体麻醉下，一次对动物成像三次。每只小鼠IP注射150mg/kg D-荧光素，并在注射后15分钟内俯卧成像。使用CCD芯片的大分箱，并且将暴露时间调节至30秒以从在图像中在每只小鼠中可观察到的转移性肿瘤获得至少几百个计数并且避免CCD芯片的饱和。在第5、7、12、19、23、26、29、33、43天收集BLI图像。使用Living Image 4.5.4版软件分析图像。将全身固定体积ROI放置在每只动物的俯卧图像上，并基于动物标识进行标记。计算并输出所有ROI的总通量(光子/秒)。
对于不同的治疗组给出了对应于小鼠中CD19+Nalm6肿瘤负荷的BLI(生物发光成像)值(示出为平均值±SEM)(表13)。较高的值指示较高的肿瘤负荷。CD19 CAR+19CAR+IL15-IL-15RαSushi单体和CD19CAR+IL15-IL-15Rα二聚体相对于规范的CD19CAR表现得更好，如通过在研究过程中减少的BLI所确定的。19CAR+IL15-IL-15Rα二聚体表现得最好，随后是19CAR+IL15-IL-15Rα单体。体内研究的结果示于表13中。
表13
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实施例8
GPC CAR，GPC CAR+1L15-IL-15RαSushi单体和GPC CAR+IL-15-IL-15Rα二聚体在实体肿瘤Hep3b小鼠模型中测试。
CAR T细胞如下制造。将CD3+细胞从原代人外周血单核细胞(PBMC)分离，并且用以下构建体转导：其仅包含GPC3 CAR(YP7 scFv+4–1BB细胞内结构域+CD3ζ细胞内结构域)，GPC3 CAR+IL-15-IL-15RαSushi结构域单体或GPC3 CAR+IL-15-IL-15RαSushi结构域二聚体。
评估GPC3 CAR、GPC3 CAR+IL-15-IL-15RαSushi结构域单体和GPC3 CAR+IL-15-IL-15RαSushi结构域二聚体T细胞的GPC3 CAR和mbIL-15_-IL-15RαSushi结构域受体表达和MFI，结果示于下表14中。
表14
使人肝细胞癌细胞(Hep 3B2.1-7)生长并皮下植入6周龄-8周龄雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)的胁腹。将动物分类为5个研究组。T细胞在第18天以2e6剂量注射。植入后，每3至4天用数字卡尺测量肿瘤，并计算肿瘤体积。
对于不同治疗组给出了对应于小鼠中GPC3+肿瘤负荷的肿瘤体积值(表14)。较高的值指示较高的肿瘤负荷。CD19 CAR+19CAR+IL15-IL-15RαSushi单体和CD19 CAR+IL15-IL-15Rα二聚体相对于规范的CD19CAR表现得更好，如通过在研究过程中减少的肿瘤体积所确定的。19CAR+IL15-IL-15Rα单体表现得最好，随后是19CAR+IL15-IL-15Rα二聚体。
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实施例9
NK-92 CD16+(ATCC PTA-8836)是白介素-2(IL-2)依赖性自然杀伤细胞系。这些细胞在补充有200IU/mL IL-2的hTCM中培养，然后用IL-15-IL-15RαSushi结构域单体和IL-15-IL-15RαSushi结构域二聚体受体转导慢病毒。
在转导当天，在转导前用IL-2(100U/mL)和人IL-12(100ng/mL Miltenyi)刺激细胞2小时。细胞因子刺激后，将细胞接种到12孔板的每个孔中。添加病毒上清液使感染复数为20，50和100，并且添加聚凝胺(终浓度8μg/mL)，将细胞温育过夜。第二天，通过离心除去培养基，将细胞沉淀重悬于不含补充IL-2的hTCM中。包括含有未转导NK-92CD16+细胞的对照孔，该细胞在有和没有补充IL-2的情况下生长。
将细胞温育八天。每2天向未转导对照细胞中添加补充IL-2(200Iu/mL)。通过流式细胞术确定Ki-67和Myc MFI。通过Meso Scale Discovery确定分泌的IFN-g和TNFa的上清液水平。
IL-15-IL-15RαSushi结构域单体和IL-15-IL-15RαSushi结构域二聚体转导的NK-92CD16+的增殖示于表16中。
表16
结果显示，在转导后8天，表达IL-15-IL-15RαSushi结构域单体和IL-15-IL-15RαSushi结构域二聚体的NK-92CD16+细胞在不存在补充IL-2的情况下增殖，如通过Ki-67细胞增殖标记流式细胞术分析所确定的。
当比较Myc+亚类和Myc-亚类时，也观察到旁观者效应，表明IL-15正被反式呈递给未被转导的NK-92CD16+细胞。Myc+和myc-亚类的细胞计数在表17中示出。
表17
结果表明，IL-15正被反式呈递给转导样品组的未转导细胞，如通过Ki-67染色所确定的。
分泌的IFN-g和TNFa的上清液水平示于表18中。
表18
当活化时，NK-92CD16+分泌IFN-g和TNF-a。结果表明IL-15-IL-15RαSushi结构域单体和IL-15-IL-15RαSushi结构域二聚体转导的细胞与未转导的未补充IL-2的细胞相比，上清液中IFN-g的水平增加。当与IL-2+对照相比时，所有转导的mb15细胞的TNF-α水平是其两倍左右。
实施例10
设计了拴系到IL-15Rα激动剂受体构建体的第三工程化膜结合IL-15(膜结合白介素-15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合多肽)(命名为IL-15Sushi杂合体)，如SEQ ID NO:94的序列所示。该构建体长度为372个氨基酸并且包括来自IgE的氨基酸1-18的信号肽结构域、myc表位标签、AGS接头、来自氨基酸49至162的活性形式的IL-15、GS接头、来自IL-15Rα的氨基酸31至195的IL-15Ra的细胞外结构域、GS接头、来自FAS的氨基酸171至190的跨膜结构域以及包含8个氨基酸的FAS的截短的细胞内结构域。该拴系到IL-15Rα的膜结合IL-15也显示为T细胞表面上的单体。该受体的氨基酸序列如下所示：
MDWTWILFLVAAATRVHSEQKLISEEDLAGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGGGGGSGGGGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKT(SEQ ID NO:94)
该构建体构建在CD19 CAR(FMC63 scFv+CD28细胞内结构域+CD3ζ细胞内结构域)的下游，随后是T2A自切割肽。将该构建体与作为对照的CD19 CAR构建体进行比较。使用mSCV启动子表达两种构建体，并使用慢病毒载体递送。
使用(ProdigyTM)从获自AllCellsTM(Alameda,CA)健康供体的白细胞中内部分离CD4+/CD8+细胞，并在细胞低温保存介质(Sigma/>)中冷冻。将冷冻的CD4+/CD8+ T细胞解冻，根据制造商的推荐，用平板结合的MACS GMP CD3纯(OKT3)(MiltenylBiotec)和可溶性人抗CD 28(BD Biosciences)活化，并在白介素-2(IL-2)(Prometheus)中静置过夜。第二天，用慢病毒载体转导细胞。细胞在T细胞培养基(OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增基础培养基)中生长8天，该培养基具有在解冻、转导期间、转导后第2天和第4天用白介素-2(IL-2)补充的扩增补充剂、CTS免疫细胞SR、CTS Glutamax(GibcoTM)。在第8天，将细胞在/>CS5Media(BioLife/>)中离心并冷冻。将细胞解冻并在含有补充有白介素-2(IL-2)的5％人血清的TC培养基(X–VIVOTM，Lonza)中静置过夜。在测定法开始后的第二天，使用Myc-Tag PE缀合物、针对19CAR+的DL650-抗FMC63和用于CD3的BUV395，通过流式细胞术测量细胞。所有抗体染色均在室温下在含BD PharmingenTM叠氮化物的染色缓冲液(FBS)中进行。在BD FACSymphonyTM A5细胞分析仪(BD and Company)上用BD FACSDivaTM软件(BD and Company)收集所有流式细胞术数据，并且使用FlowJo(BD and Company)分析数据。如下表19所示，该构建体表达良好。
表19
如先前实施例中所述，使用基于MSD的pSTAT5测定法来测量由IL-15Sushi杂交体诱导的IL-15信号传导。简言之，将相等数量的CAR+细胞在无血清培养基(Lonza X-VIVOTM)中静置过夜。然后将细胞离心并使用裂解缓冲液+蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Meso ScaleDiscoveryTM)裂解，然后对pSTAT5水平进行MSD分析。结果示于下表20中：
表20
表达CD19 CAR的T细胞不诱导pSTAT5信号传导，而表达CD19 CAR下游的IL-15Sushi杂交体的T细胞诱导更高的pSTAT5信号传导。该数据证实IL-15-IL-15RαSushi杂交体在CD19 CAR的情境下是有功能的。
一般来讲，在以下权利要求书中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求书中所公开的具体实施方案，而是应被解释为包括所有可能的实施方案，连同此类权利要求所授权的等同方案的完整范围。因此，权利要求不受本公开的限制。

Claims (26)

1.一种膜结合白介素15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，包含IL-15多肽，所述IL-15多肽包含根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列；第一接头，所述第一接头将IL-15结构域连结到根据SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:95的IL-15Rαsushi结构域多肽；和跨膜结构域，所述跨膜结构域包含IL-7跨膜结构域或FAS跨膜结构域。
2.根据权利要求1所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，其中所述第一接头包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，其中所述第一接头包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，其中所述IL-15Rαsushi结构域多肽通过作为第二接头连结到所述跨膜结构域。
5.根据权利要求4所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，其中所述第二接头包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，其中所述第二接头包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，其中所述跨膜结构域是包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列的FAS跨膜结构域。
8.根据权利要求7所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，包含选自由SEQID NO:27、28和94组成的组的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，其中所述跨膜结构域是包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列的IL-7跨膜结构域。
10.根据权利要求9所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，包含根据SEQID NO:30的氨基酸。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，还包含信号传导序列。
12.根据权利要求11所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，其中所述信号传导序列包含根据SEQ ID NO:12-20中的一者的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体，其中所述信号传导序列包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
14.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1至13中任一项所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体。
15.根据权利要求14所述的核酸，其中所述核酸包含根据选自由SEQID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:100组成的组的序列的核酸序列。
16.一种重组载体，包含根据权利要求14所述的核酸。
17.根据权利要求14或15所述的重组载体或核酸，其中所述重组载体或核酸还包含编码嵌合抗原受体或T细胞受体的核酸。
18.根据权利要求14或15所述的重组载体或核酸，其中所述嵌合抗原受体或T细胞受体结合肿瘤抗原。
19.根据权利要求14或15所述的重组载体或核酸，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：2B4(CD244)、4-1BB、5T4、A33抗原、腺癌抗原、肾上腺素受体β3(ADRB3)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、甲胎蛋白(AFP)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、雄激素受体、B7H3(CD276)、β2-整合素、BAFF、B淋巴瘤细胞、B细胞成熟抗原(BCMA)、bcr-abl(由断裂点簇集区(BCR)和阿伯森鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白)、BhCG、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节物兄弟)、BST2、C242抗原、9-0-乙酰基-CA19-9标记物、CA-125、CAEX、钙网蛋白、碳酸酐酶9(CAIX)、C-MET、CCR4、CCR5、CCR8、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD7、CD10、CD16、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD51、CD52、CD56、CD63、CD70、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD96、CD97、CD100、CD123、CD125、CD133、CD137、CD138、CD150、CD152(CTLA-4)、CD160、CD171、CD179a、CD200、CD221、CD229、CD244、CD272(BTLA)、CD274(PD-L1、B7H1)、CD279(PD-1)、CD352、CD358、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、癌胚抗原(CEA)、闭合蛋白6(CLDN6)、C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞抗原、CNT0888、CRTAM(CD355)、CS-1(也称为CD2亚类1、CRACC、CD319和19A24)、CTLA-4、细胞周期蛋白B l、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、细胞色素P450 1B 1(CYP1B1)、DNAM-1(CD226)、桥粒芯糖蛋白4、DR3、DR5、E-钙粘蛋白新表位、表皮生长因子受体(EGFR)、EGF1R、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)、延长因子2突变(ELF2M)、内皮唾液酸蛋白、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、肝配蛋白B2、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2,3,4(erb-B2,3,4)、ERBB、ERBB2(Her2/neu)、ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、ETA、位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、FBP、Fc受体样5(FcRL5)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、纤连蛋白额外结构域-B、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体1、叶酸受体α、叶酸受体β、Fos-相关抗原1、岩藻糖基、岩藻糖基GM1；GM2、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、GITR(TNFRSF 18)、GM1、神经节苷脂GM3、globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)、糖蛋白75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、糖蛋白100(gpl00)、GPNMB、G蛋白-偶联受体20(GPR20)、G蛋白偶联受体C类组5成员D(GPRC5D)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、高分子量黑素瘤相关联抗原(HMWMAA)、人乳头瘤病毒E6(HPV E6)、人乳头瘤病毒E7(HPV E7)、热休克蛋白70-2突变(mut hsp70-2)、人分散因子受体激酶、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、HVEM、ICOS、胰岛素样生长因子受体1(IGF-1受体)、IGF-I、IgGl、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、IL-6、白介素11受体α(IL-llRα)、IL-13、白介素13受体亚基α-2(IL-13Rα2或CD213A2)、胰岛素样生长因子I受体(IGF1-R)、整合素α5β1、整合素ανβ3、肠羧基酯酶、κ-轻链、KCS1、激酶插入结构域受体(KDR)、KIR、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、KIR-L、KG2D配体、KIT(CD117)、KLRGI、LAGE-la、LAG3、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、豆荚蛋白、白细胞相关联免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、路易斯(Y)抗原、LeY、LG、LI细胞粘附分子(LI-CAM)、LIGHT、LMP2、淋巴细胞抗原6复合物、LTBR、基因座K 9(LY6K)、Ly-6、淋巴细胞抗原75(LY75)、黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)、MAGE、黑素瘤相关联抗原1(MAGE-A1)、由T细胞识别的MAGE-A3黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)、MelanA/MARTl、间皮素、MAGE A3、黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)、黑素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSCP)、MORAb-009、MS4A1、粘蛋白1(MUCl)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、MUC16、粘蛋白CanAg、苗勒氏抑制物质(MIS)II型受体、v-myc禽髓细胞瘤病毒癌基因成神经细胞瘤衍生同源物(MYCN)、N-羟乙酰神经氨酸、N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)、神经细胞粘附分子(NCAM)、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E配体、NKR-P IA、NPC-1C、NTB-A、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、OX40、浆细胞抗原、聚SA、顶体蛋白酶结合蛋白sp32(OY-TES l)、p53、p53突变体、泛连接蛋白3(PANX3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)、PD-1H、血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α)、PDGFR-β、PDL192、PEN-5、磷脂酰丝氨酸、胎盘特异性1(PLAC1)、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌细胞、前列腺素、蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)、蛋白酶3(PR1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、蛋白酶体(前体、巨蛋白因子)亚基β型、晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)、RANKL、Ras突变体、Ras同源物家族成员C(RhoC)、RON、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、肾泛素1(RU1)、肾泛素2(RU2)、肉瘤易位断点、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)、SAS、SDC1、SLAMF7、唾液酰路易斯粘附分子(sLe)、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、音猬因子(SHH)、精子蛋白17(SPA17)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、STEAP、sTn抗原、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、存活素、肿瘤相关联糖蛋白72(TAG72)、TCR5γ、TCRα、TCRβ、TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)、端粒酶、TIGIT、TNF-α前体、肿瘤内皮标记物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标记物7相关(TEM7R)、生腱蛋白C、TGF-β1、TGF-β2、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)、TACI、TIM1、TIM2、TIM3、Tn Ag、TRAIL-R1、TRAIL-R2、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、肿瘤抗原CTAA16.88、酪氨酸酶、尿溶蛋白2(UPK2)、VEGF-A、VEGFR-1、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和波形蛋白、Wilms肿瘤蛋白(WT1)或X抗原家族成员1A(XAGE1)。
20.一种免疫细胞，包含根据权利要求1至19中任一项所述的膜结合IL-15-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体、重组载体或核酸。
21.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
22.一种药物组合物，包含根据权利要求20或21所述的免疫细胞。
23.一种治疗受试者中与肿瘤抗原的表达相关联的癌症的方法，包括：
向所述受试者施用有效量的根据权利要求20或21所述的免疫细胞或根据权利要求22所述的药物组合物。
24.一种在受试者中诱导免疫应答或使受试者针对癌症免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求20或21所述的免疫细胞或根据权利要求22所述的药物组合物。
25.一种用于改善免疫细胞功能的方法，包括对所述免疫细胞进行工程化以表达根据权利要求1至13中任一项所述的膜结合白介素15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体。
26.一种用于增加免疫细胞中磷酸化-STAT5水平的方法，包括对所述免疫细胞进行工程化以表达根据权利要求1至13中任一项所述的膜结合白介素15(IL-15)-IL-15Rαsushi结构域嵌合受体。
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