CN102459343A

CN102459343A - 用于治疗hiv的抗cxcr4抗体

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Publication number: CN102459343A
Application number: CN201080028221XA
Authority: CN
Inventors: C·克林格-汉默
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2009-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2030-04-29
Also published as: CL2011002664A1; MX2011011285A; PL2424897T3; KR20120039525A; EP2246364A1; UA107929C2; RU2011148077A; ZA201108330B; US20160031995A1; BRPI1011540A2; JP2012525129A; MY155400A; IL215919A0; CO6390114A2; ES2534313T3; CA2759989A1; AU2010243526B2; WO2010125162A1; HK1165813A1; JP5800802B2

Abstract

本发明涉及新分离的抗体，或衍生的化合物或其功能性片段，能够结合于CXCR4及诱导CXCR4同型二聚体的构象变化，并且能够抑制HIV-1在PBMC中的原发隔离群复制。更特别的是，本发明涉及特异于CXCR4蛋白质的515H7和301aE5单克隆抗体，以及其治疗HIV感染的用途。本发明还涵盖了由此抗体构成的药物组合物及用于选择此抗体的方法。

Description

用于治疗HIV的抗CXCR4抗体

技术领域

本发明涉及能够特异性结合于趋化因子受体(CXCR)的新抗体，特别是嵌合和人源化的小鼠单克隆抗体，以及编码此抗体的氨基酸和核酸序列。从一方面讲，本发明涉及能够特异性结合于CXCR4并具有对抗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的强活性的新抗体、功能性片段或衍生物。本发明还包括此抗体、功能性片段或衍生物作为预防和/或治疗HIV感染的药剂的用途。

背景技术

趋化因子是小的分泌肽，其控制着(特别是免疫反应期间)白细胞沿配体化学梯度(被称为趋化因子梯度)的迁移(Zlotnick A.等，2000)。基于其NH₂-端半胱氨酸残基的位置、及与G蛋白偶联受体(其两个主要亚家族被命名为CCR和CXCR)的结合，人们将趋化因子分为两个主要的亚家族，CC和CXC。到目前为止人们已发现了超过50个人趋化因子和18个趋化因子受体。

趋化因子受体家族的若干成员作为主要受体CD4的共受体发挥作用，使得HIV 1型的不同株能够进入细胞，主要的共受体是CCR5和CXCR4。T细胞向性X4 HIV-1使用CD4和CXCR4进入细胞，而巨噬细胞向性R5HIV-1使用CD4和CCR5。双向性的毒株能使用CXCR4和CCR5作为共受体。其他趋化因子受体中的CCR3、CCR2、CCR8、CXCR6、CXCR7、CX3CR1能作为更限制亚群的HIV株的共受体发挥作用。

SDF-1(CXCR4的天然配体)以及CCR5的CCL3、CCL4、CCL4-L1和CCL5配体能够抑制不同株HIV-1引起的细胞融合和感染。这些发现促进了针对趋化因子受体的抗HIV治疗的发展，导致CCR5小分子拮抗剂马拉维诺(maraviroc)

获准与其他抗HIV-1试剂组合用于CCR5向性HIV-1感染的患者。然而，马拉维诺不能用于被双向性HIV-1感染的患者或者被CXCR4向性HIV-1感染的患者(VIDAL 2009)。因此，对于通过鉴定能抑制X4-向性HIV复制的CXCR4拮抗剂在X4-向性和双向性HIV感染的患者中扩展此类治疗有明确的医学需求。

趋化因子受体4(也被称为融合素、CD184、LESTR或HUMSTR)以包括352个或360个氨基酸的两种异构体形式存在。残基Asn11被糖基化，残基Tyr21被加入硫酸盐基团所修饰，而Cys109和186在受体的细胞外部分以二硫键桥相结合(Juarez J.等，2004)。

不同种正常组织、幼稚、非记忆性T细胞、调节性T细胞、B细胞、中性粒细胞、内皮细胞、原发性单核细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、CD34+造血干细胞均表达此受体，而且在心脏、结肠、肝、肾和脑中有低水平表达。CXCR4在白细胞运输、B细胞淋巴细胞生成和髓细胞生成中起关键作用。

到目前为止所描述的CXCR4受体的唯一配体是间质细胞衍生因子1(SDF-1)或CXCL12。SDF-1在淋巴结、骨髓、肝脏、肺中大量分泌，而肾、脑和皮肤分泌相对较少。CXCR4还被拮抗性趋化因子人单纯疱疹病毒III型所编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白II(vMIP-II)所识别。

如前面所提及的，CXCR4受体是T细胞向性HIV-I隔离群(X4病毒)的主要共受体。干扰此受体将以很有效的方式抑制X4病毒复制。

发明内容

本发明的一个发明性方面是生成抑制HIV复制的小鼠单克隆抗体(Mab)。本发明包括能结合于CXCR4同源二聚体并具有抵抗HIV感染的强活性的CXCR4Mab 515H7(或其片段)。发明还包括能结合于CXCR4同源二聚体并具有抵抗HIV感染的强活性的CXCR4 Mab 301aE5(或其片段)。

令人吃惊的是，发明者已设法生成单克隆抗体，该抗体能够结合于CXCR4，并且能够诱导CXCR4同源二聚体的构象变化，而且能抑制原发隔离群X4-HIV-1在PBMC中的复制。更特别的是，本发明的抗体还能够抑制原发隔离群X4/R5-HIV-1在PBMC中的复制。

优选地，CXCR4化合物是人CXCR4的两个异构体之一，选自由下列构成的群：

-趋化因子(C-X-C基序)受体4异构体b【智人】，具有Genbank登录号NP_003458所描绘的序列SEQ ID No.27：MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS；

-趋化因子(C-X-C基序)受体4异构体a【智人】，具有Genbank登录号NP_001008540所描绘的序列SEQ ID No.28：MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS；

-可选的转录拼接变体或其天然变体，其与具有SEQ ID No.27or 28的这些b或a异构体的一个具有至少95％的同源性；及

-其片段，其能够被它的天然配体间质细胞衍生因子1(SDF-1)所特异性识别，并且具有优选至少100、150和200个氨基酸长度。

CXCR2选自由下列构成的群：

-白介素8受体β【智人】，具有Genbank登录号NP_001548所描绘的序列SEQ ID No.29：MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL；

-可选的转录拼接变体或其天然变体，与具有SEQ ID No.29的此白介素8受体β具有至少95％的同源性；及

-其片段，能够为IL-8所特异性识别，并且具有优选至少100、150和200个氨基酸长度。

发明还包括用于选择具抗HIV活性的化合物的方法或能用于制备治疗HIV感染用的组合物的方法，特征在于所述方法包括步骤：

首先一方面，本发明的主题是用于生成和选择根据发明所述的抗体的方法。

更特别的是，本发明涉及用于选择能够抑制HIV复制的抗CXCR4抗体或其功能性片段或衍生物的一个的方法，包括下列步骤：

i)筛选生成的抗体及选择能特异结合于CXCR4的抗体；

ii)检验步骤i)所选的抗体并选择能结合外周血单核细胞(PBMC)的抗体，

iii)检验步骤ii)所选的抗体并选择能结合于CXCR4同源二聚体的抗体，并且随后

iv)检验步骤iii)所选的抗体并选择能抑制PBMC中原发隔离群X4-向性HIV-1复制的抗体。

在另一实施方案中，发明涉及用于选择能抑制HIV复制的抗CXCR4抗体或其功能性片段或衍生物的一个的方法，包括下列步骤：

i)筛选生成的抗体及选择能特异结合于CXCR4的抗体；

ii)检验步骤i)所选的抗体并选择能结合外周血单核细胞(PBMC)的抗体，iii)检验步骤ii)所选的抗体并选择能结合于CXCR4同源二聚体的抗体，并且随后iv)检验步骤iii)所选的抗体并选择能抑制PBMC中原发隔离群X4-向性HIV-1复制和/或能抑制PBMC中原发隔离群X4/R5-向性HIV-1复制的抗体。

抗体的生成可以通过本领域技术人员所知的任意方法实现，例如，将骨髓瘤细胞与来自免疫小鼠或与所选骨髓瘤细胞兼容的其他种群的脾细胞相融合【Kohler&Milstein，1975，Nature，256：495-497】。免疫动物可包括带有人类免疫球蛋白座位从而直接生产人类抗体的转基因小鼠。另一可能的实施方案在于使用噬菌体展示技术来筛选文库。

筛选步骤i)和ii)可以通过本领域技术人员所知的任意方法或过程来实现。作为非限制性例子，可以提到ELISA、BIAcore、免疫组化、使用CXCR4表达细胞膜抽提物或纯化CXCR4的蛋白印迹分析、FACS分析及功能筛选。优选的方法在于以FACS分析CXCR4转染物(步骤1)和至少PBMC(步骤2)以确定生产的抗体也能识别靶标细胞表面的天然CXCR4受体构象来进行筛选。此方法在下列实施例中有更精确的描述。

筛选步骤iii)可以通过本领域技术人员所知的任意方法或过程来实现。作为非限制性但优选的例子，可以提及在CXCR4转染细胞或PBMC的膜抽提物上使用相关抗体的蛋白印迹和/或免疫沉淀技术。

筛选步骤iv)可以通过本领域技术人员所知的任意方法或过程来实现。作为非限制性但优选的例子，可以提及筛选抗体的方法，通过使用Holl等所述的步骤(J.Immunol.2004，173，6274-83)筛选有抑制X4原发性HIV-1和/或X4/R5原发性HIV-1隔离群在PBMC中复制能力的抗体。

在本发明方法的优选步骤iii)的优选实施方案中，所述步骤iii)在于通过BRET分析表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP的细胞来评估抗体并且选择能抑制至少40％、优选45％、50％、55％和最优选60％的BRET信号的抗体。

BRET技术是被称为蛋白质二聚体化的代表的技术【Angers等，PNAS，2000，97：3684-89】。

在方法的步骤iii)中所用的BRET技术，为本领域技术人员所熟知，并在下列实施例中有详细描述。更特别的是，BRET(生物荧光共振能量转移)是在生物荧光供体(海肾荧光素酶(Rluc))和荧光受体GFP(绿色荧光蛋白)或YFP(黄色荧光蛋白))突变间发生的非辐射性能量转移。在本案例中使用EYFP(增强型黄色荧光蛋白)。转移效率取决于供体和受体之间的方向和距离。因而，只有当两个分子靠近(1-10nm)时才能发生能量转移。此性质被用于生成蛋白质-蛋白质相互作用分析。事实上，为了研究两个配偶体间的相互作用，一般第一个融合于海肾荧光素酶而第二个融合于GFP的黄色突变体。融合蛋白一般(但不一定)表达于哺乳动物细胞。在其膜渗透性底物(腔肠素(coelenterazine))存在时，Rluc发射蓝光。如果GFP突变体距离Rluc不足10nm，会发生能量转移并能检测到额外的黄色信号。BRET信号被测定为受体所发出的光与供体所发的光的比例。因此，当两个融合蛋白被拉近或构象变化使得Rluc和GFP突变体更靠近的时候，BRET信号将会增强。

如果在优选实施方案中包括BRET分析，可以使用本领域技术人员所知的任意方法测定CXCR4二聚体的构象变化。可提及下列技术，不做限制：FRET(荧光共振能量转移)、HTRF(同质时间分辨荧光)、FLIM(荧光寿命成像显微镜)或SW-FCCS单波长荧光交叉相关光谱)。

也可使用其他经典技术，如共免疫沉淀、α筛选、化学交联、双杂交、亲和层析、ELISA或Far蛋白印迹。

在根据发明所述方法的特殊方面，步骤iii)在于以BRET分析表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP两者的细胞来评估抗体并且选择能抑制至少40％的BRET信号的抗体。

第二方面，本发明的主题是通过所述方法获得分离的抗体或其功能性片段或衍生物的一个。所述抗体或其所述片段或衍生物的一个，能够特异结合于人CXCR4，所述抗体也能诱导CXCR4同源二聚体构象变化。

从文献中可知CXCR4Mabs之类(例如克隆A120)能够抑制HIV-1实验株(X4HIV-1_NL4-3)进入PBMC(Tanaka R.等，J.Virol.2001，75，11534-11543)。而且，也知道CXCR4Mabs能抑制HIV-1X4原发隔离群进入表达CXCR4的细胞系。反过来而言，从未公布过能抑制在其自然环境中的此类病毒(即不只是实验室病毒或细胞系)的抗体。然而本发明的新颖且非显而易见的方面是CXCR4 Mabs能抑制HIV-1X4原发隔离群进入PBMC。

表达“功能性片段及衍生物”将随后在本说明中详细定义。

此处应理解的是本发明不涉及天然形式的抗体，那就是说抗体并不在其天然环境中，但能够通过自天然来源纯化而将其分离或获得，或者另外通过基因重组、或者通过化学合成获得，并且因此抗体能包含进一步所描述的非天然氨基酸。

更特别的是，根据发明的另一方面，要求保护分离的抗体或其功能性片段或衍生物的一个，所述抗体特征在于：它们包括至少一个互补决定域CDR，该CDR选自包括如IMGT编号系统所定义的氨基酸序列SEQ ID No.1至6和30至33的CDR。

根据第一方面，本发明涉及分离的抗体或其功能性片段或衍生物，包括选自根据IMGT编号系统所定义的序列SEQ ID No.1至6的CDR的至少一个CDR，或者其序列与序列SEQ ID No.1至6进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％同源性的至少一个CDR。

根据第二方面，本发明涉及分离的抗体或其功能性片段或衍生物，包括选自根据IMGT编号系统所定义的序列SEQ ID No.1、2和30至33的CDR的至少一个CDR，或者其序列与序列SEQ ID No.1、2和30至33进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％同源性的至少一个CDR。

抗体的“功能性片段”意指(特别是)抗体片段，如片段Fv、scFv(sc＝单链)、Fab、F(ab’)₂、Fab’、scFv-Fc或双特异抗体、或其半衰期被延长的任意片段。此功能性片段将在随后的本说明中详细描述。

抗体的“衍生化合物”或“衍生物”意指(特别是)为保持其识别CXCR4的活性、由肽支架和最初抗体的至少一个CDR构成的结合蛋白质。此衍生化合物，为本领域技术人员所熟知，将在随后的本说明中更详细描述。

更优选的是，根据本发明所述，本发明包括通过基因重组或化学合成获得的特别是嵌合型或人源化的抗体、其衍生化合物或其功能性片段。

根据优选的实施方案，根据本发明所述的抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于它由单克隆抗体组成。

应了解“单克隆抗体”意指来自于几乎同源抗体群的抗体。更特别指，群中的单独抗体(除一些可能以最小比例发现的天然产生突变以外)是相同的。换句话说，单克隆抗体由来自于单个细胞克隆(例如杂交瘤、以编码同源抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、以编码同源抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等)生长的同源抗体构成，并且一般以一类且仅一类和亚类的重链、及仅一个类型的轻链为特征。单克隆抗体是高度特异的并定向针对单个抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体制备物相对比，每个单克隆抗体是针对单一的抗原表位。

更特别的是，根据发明的第一优选实施方案，抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括含有选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的至少一个CDR的轻链，其中：

-CDR-L1包括氨基酸序列SEQ ID No.1，

-CDR-L2包括氨基酸序列SEQ ID No.2。

-CDR-L3包括氨基酸序列SEQ ID No.3。

根据另一实施方案，发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有序列SEQ ID No.1、2或3的三个CDR的至少一个、或在与序列SEQ ID No.1、2或3进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％或98％同源性的至少一个序列的轻链。

发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征还在于其包括含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链，其中CDR-L1包括氨基酸序列SEQ ID No.1，CDR-L2包括氨基酸序列SEQ ID No.2而且CDR-L3包括氨基酸序列SEQ IDNo.3。

在另一实施方案中，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No.7或在与序列SEQ ID No.7进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％或98％同源性的至少一个序列的轻链序列。

根据发明的第二个优选实施方案，抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括含有选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的至少一个CDR的轻链，其中：

-CDR-L1包括氨基酸序列SEQ ID No.1，

-CDR-L2包括氨基酸序列SEQ ID No.2，

-CDR-L3包括氨基酸序列SEQ ID No.30。

根据另一实施方案，发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于它们包括含有序列SEQ ID No.1、2或30的三个CDR的至少一个、或在与序列SEQ ID No.1、2或30进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％或98％同源性的至少一个序列的轻链。

本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征还在于其包括含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链，其中CDR-L1包括氨基酸序列SEQ ID No.1，CDR-L2包括氨基酸序列SEQ ID No.2而且CDR-L3包括氨基酸序列SEQ IDNo.30。

在另一实施方案中，发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No.34或在与序列SEQ ID No.34进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％或98％同源性的至少一个序列的轻链序列。

更特别的是，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的至少一个CDR的重链，其中：

-CDR-H1包括氨基酸序列SEQ ID No.4，

-CDR-H2包括氨基酸序列SEQ ID No.5，

-CDR-H3包括氨基酸序列SEQ ID No.6。

根据另一实施方案，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有序列SEQ ID No.4、5或6的三个CDR的至少一个、或在与序列SEQ ID No.4、5或6进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％或98％同源性的至少一个序列的重链。

根据另一特别的实施方案，抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链，其中CDR-H1包括氨基酸序列SEQ ID No.4，CDR-H2包括氨基酸序列SEQ ID No.5而且CDR-H3包括氨基酸序列SEQ ID No.6。

在另一实施方案中，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No.8、或在与序列SEQ ID No.8进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％或98％同源性的至少一个序列的重链。

更特别的是，本发明的抗体、其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的至少一个CDR的重链，其中：

-CDR-H1包括氨基酸序列SEQ ID No.31，

-CDR-H2包括氨基酸序列SEQ ID No.32，

-CDR-H3包括氨基酸序列SEQ ID No.33。

根据另一实施方案，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有序列SEQ ID No.31、32或33三个CDR的至少一个、或在与序列SEQ ID No.31、32或33进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％或98％同源性的至少一个序列的重链。

根据另一特别实施方案，抗体、其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链，其中CDR-H1包括氨基酸序列SEQ ID No.31，CDR-H2包括氨基酸序列SEQ ID No.32而且CDR-H3包括氨基酸序列SEQ ID No.33。

在另一实施方案中，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No.35、或在与序列SEQ ID No.35进行最佳比对后具有至少80％、优选85％、90％、95％或98％同源性的至少一个序列的重链序列。

发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括一条轻链(该轻链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID No.1、2和3的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)和一条重链(该重链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID No.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。

最后，发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征还在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No.7的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID No.8的重链。

本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括一条轻链(该轻链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID No.1、2和30的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)和一条重链(该重链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID No.31、32和33的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。

最后，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征还在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No.34的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID No.35的重链。

在本说明书中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“连接于抗体化合物或其序列的蛋白质”可互换。

在此必须理解本发明不涉及天然形式的抗体，即抗体并不自其天然环境中得来，但能够通过从天然来源纯化而将其分离或获得，或者通过基因重组或化学合成获得，并且因此抗体能携带下面所描述的非天然氨基酸。

在第一个实施方案中，互补决定区或CDR，意指Kabat等所定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高可变区(Kabat等，Sequences of proteins of immunologicalinterest，第五编，U.S.Department of Health and Human Services，NIH，1991，及以后的版本)。有三个重链CDR和三个轻链CDR。此处，取决于情况，术语“CDR”和“CDRs”用于指示一个或多个、或甚至全部的包含多数决定对其识别的抗原或表位的抗体结合亲和性的氨基酸残基的区域。

在第二个实施方案中，通过CDR区域或CDR(s)，意为指示如IMGT所定义的免疫球蛋白重链和轻链的高可变区。

IMGT唯一编号被规定用于比较任何抗原受体、链类型或种类的可变区【Lefranc M.-P.，Immunology Today 18，509(1997)/Lefranc M.-P.，TheImmunologist，7，132-136(1999)/Lefranc，M.-P.，Pommie，C.，Ruiz，M.，Giudicelli，V.，Foulquier，E，Truong，L.，Thouvenin-Contet，V.和Lefranc，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)】。在IMGT唯一编号中，保守氨基酸通常具有同样位点，例如半胱氨酸23(第一CYS)、色氨酸41(保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(第二CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT唯一编号提供了框架区域(FR1-IMGT：1至26位，FR2-IMGT：39至55位，FR3-IMGT：66至104位和FR4-IMGT：118至128位)和互补决定区(CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117)的标准化划界。因为空隙代表空置的位点，CDR-IMGT长度(显示在括号之间并以点分开，例如【8.8.13】)成为重要的信息。IMGT唯一编号被用于2D图呈现，指定为IMGT Colliers de Perles【Ruiz，M.和Lefranc，M.-P.，Immunogenetics，53，857-883(2002)/Kaas，Q.和Lefranc，M.-P.，CurrentBioinformatics，2，21-30(2007)】，及IMGT/3D结构-DB的3D结构中【Kaas，Q.，Ruiz，M.和Lefranc，M.-P.，T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.，32，D208-D210(2004)】。

存在三个重链CDR和三个轻链CDR。根据情况，在此使用的术语CDR或CDR目的在于指示这些区域的一个或这些区域的几个、或甚至全部，其包含决定抗体对于其识别的抗原或表位的亲和性结合的多数氨基酸残基。

为了更清晰，应该理解下列说明中及更特别在表2和3中，以IMGT编号系统和Kabat编号系统定义CDR。

根据如上定义的IMGT系统，以IMGT编号系统定义CDR，而根据如上定义的Kabat系统，以Kabat编号系统定义CDR。

更特别的是，关于被指作515H7的抗体，CDR-L1由IMGT编号系统中的SEQ ID No.1和Kabat编号系统中的SEQ ID No.9构成。关于CDR-L2，它由IMGT编号系统中的SEQ ID No.2和Kabat编号系统中的SEQ ID No.10构成。CDR-L3由两种编号系统中的每个的SEQ ID No.3构成。对于重链，CDR-H1由IMGT编号系统中的SEQ ID No.4和Kabat编号系统中的SEQ ID No.11构成。CDR-H2由IMGT编号系统中的SEQ ID No.5和Kabat编号系统中的SEQ ID No.12构成。最后，CDR-H3存在于IMGT编号系统中的SEQ ID No.6，而其由Kabat编号系统中的SEQ ID No.13构成。

然后，关于被指作301aE5的抗体，CDR-L1由IMGT编号系统中的SEQ IDNo.1和Kabat编号系统中的SEQ ID No.9构成。关于CDR-L2，它由IMGT编号系统中的SEQ ID No.2和Kabat编号系统中的SEQ ID No.36构成。CDR-L3由IMGT编号系统中的SEQ ID No.30和Kabat编号系统中的SEQ ID No.37构成。对于重链，CDR-H1由IMGT编号系统中的SEQ ID No.31和Kabat编号系统中的SEQ ID No.38构成。CDR-H2由IMGT编号系统中的SEQ ID No.32和Kabat编号系统中的SEQ ID No.39构成。最后，CDR-H3存在于IMGT编号系统中的SEQID No.33，而其由Kabat编号系统中的SEQ ID No.40构成。

在本发明的含义中，两个核酸或氨基酸序列之间的“百分比同源性”意指待比较的两条序列间相同核苷酸或氨基酸残基的百分数，其在最佳比对后获得，此百分数是纯粹的统计，而两条序列间的差异沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列的比较传统上通过在对其最佳比对后比较序列来进行，所述比较能通过分部或通过使用“对比窗口”来执行。除了手动比较之外，用Smith和Waterman的本地同源性算法(1981)[Ad.App.Math.2：482]、用Neddleman和Wunsch的本地同源性算法(1970)[J Mol.Biol.48：443]、用Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444]或用使用这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算组，575Science Dr.，麦迪逊，威斯康辛州，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)的计算机软件可以执行比较的序列的最佳比对。

通过比较两个最佳比对的序列确定两个核酸或氨基酸序列之间的百分比同源性，其中在最佳比对的两个序列中待比较的核酸或氨基酸序列相对于参照序列可以有插入或删除。通过确定两条序列间(优选两条完整序列间)氨基酸核苷酸或残基相同的位点的数目计算百分比同源性，将相同位点数除以比对窗口的总位点数并将结果乘以100以获得两条序列间的百分比同源性。

例如，可以用缺省参数使用(特别是参数“开放空隙罚分”：5，和“延伸空隙罚分”：2；所选矩阵是例如程序提出的“BLOSUM 62”矩阵)在网页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可用的BLAST程序，“BLAST 2序列”(Tatusova等，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”，FEMS Microbiol.，1999，Lett.174：247-250)；直接用程序计算待比较的两条序列的百分比同源性。

对于显示出与参照氨基酸序列有至少80％、优选85％、90％、95％和98％同源性的氨基酸序列，优选的例子包括包含参比序列、某些修改(特别是删除、插入或替换至少一个氨基酸、截短或延长)的那些。在一个或多个连续或不连续的氨基酸被替换的情况下，优选在替换中所换的氨基酸为“等价”氨基酸所代替。在此，表达“等价氨基酸”意指可能替代一个结构氨基酸、然而不改变相应抗体和下面定义的那些特定实施例的抗体的生物学活性的任意氨基酸。

基于其与它们所替代的氨基酸的结构同源性、或者基于可能生成的不同抗体间生物活性比较检验的结果来确定等价氨基酸。

作为非限制性例子，下面表1总结了可能执行而不导致相应修改抗体的生物活性显著变化的可能的替代；在同一条件下自然可以做相反的替代。

表1

起始残基	替代
		Ala(A)	Val，Gly，Pro
Arg(R)	Lys，His
		Asn(N)	Gln
Asp(D)	Glu
		Cys(C)	Ser
Gln(Q)	Asn
		Glu(G)	Asp
Gly(G)	Ala
		His(H)	Arg
Ile(I)	Leu
		Leu(L)	Ile，Val，Met
Lys(K)	Arg
		Met(M)	Leu
Phe(F)	Tyr
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr，Cys

Thr(T)	Ser
		Trp(W)	Tyr
Tyr(Y)	Phe，Trp
		Val(V)	Leu，Ala

在特定的实施方案中，本发明涉及小鼠抗体、或其衍生化合物或相同的功能性片段。

如上所见，本发明还涉及衍生自本发明所述抗体的任意化合物。

更特别的是，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于，所述衍生化合物由含有其上嫁接有至少一个CDR的肽支架的结合蛋白质构成，以此方式保持最初抗体的全部或部分互补位识别属性。

本发明所述CDR序列中的一个或多个序列还可出现在不同免疫球蛋白支架上。在此情况下，蛋白质序列使其能够重新建立有利于嫁接的CDR折叠的肽骨架，使CDR能保持其互补位抗原识别属性。

通常，本领域技术人员知道怎样确定来自起始抗体的至少一个CDR嫁接于其上的蛋白质支架的类型。更特别的是，已知要选择的此类支架必须满足最大数目的如下标准(Skerra A.，J.Mol.Recogn.，2000，13：167-187)：

-系统发育的保守性好；

-已知三维结构(如本领域技术人员所知的，例如，通过晶体学、核磁共振光谱或任何其他技术)；

-尺寸小；

-少有或没有转录后修饰；和/或

-容易生产、表达和纯化

此类蛋白质支架的起源可以是(但不限于)选自：纤维连接蛋白并优选纤维连接蛋白III型结构域10、载脂蛋白、anticalin(Skerra A.，J.Biotechnol.，2001，74(4)：257-75)、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A结构域B的蛋白质Z、硫氧还蛋白A或带重复基序如“锚蛋白重复序列”(Kohl等，PNAS，2003，vol.100，No.4，1700-1705)、“犰狳重复”，“富含亮氨酸重复”和“三十四肽重复序列”的蛋白质的结构。

(发明)还提及了衍生自毒素(如(例如)来自蝎子、昆虫、植物、软体动物等的毒素)及神经一氧化氮合成酶(PIN)的蛋白质抑制子的支架。

此类杂合构建体的例子(无意于限制)是在PIN的一个环中插入抗CD4抗体的CDR-H1(重链)(即13B8.2)，新结合的蛋白质因而获得保持与起始抗体同样的结合性质(Bes等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2006，343(1)，334-344)。在单纯说明的基础上，也提及了在新制癌菌素的一个环上嫁接抗溶菌酶VHH抗体的CDR-H3(重链)(Nicaise等，Protein Science，2004，13(7)：1882-1891)。

最后，如上所述，此类肽支架可包括至少一个来自起始抗体的CDR。优选地，但不是必需地，本领域技术人员会从重链选择至少一个CDR，已知重链是决定抗体特异性的主要因素。对于本领域技术人员来说选择一个或多个相关CDR是显而易见的，因此他们将选择适当的已知技术(Bes等，FEBS letters 508，2001，67-74)。

本发明的特殊方面涉及用于选择衍生自根据发明所述的抗体的化合物的方法，所述衍生化合物能够体外和/或体内抑制HIV细胞进入，并且所述衍生化合物包括其上嫁接了至少一个抗体CDR的肽支架，该方法特征在于其包括下列步骤：

a)体外将由(其上嫁接至少一个抗体CDR的)肽支架构成的化合物与包含HIV1型和PBMC的生物样品接触放置；及

b)如果所述化合物能够抑制HIV-1复制，选择所述化合物，

并且，特征在于所述至少一个嫁接的CDR选自下列CDR：序列SEQ ID No.1至6和30至33、或者(与序列SEQ ID No.1至6和30至33进行最佳比对后)具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％同源性的序列。

根据优选模式，方法可包括在步骤a)中将含有其上嫁接至少两个或三个抗体CDR的肽支架的化合物体外放置接触。

根据此方法的甚至更优选模式，肽支架选自如上提及其结构的支架或结合蛋白质。

显而易见，这些实施例无意于限制，而且应认为对于本领域技术人员为已知或显而易见的任意其他结构被涵盖于本专利申请所赋予的保护范围内。

本发明因而涉及抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于肽支架选自蛋白质，该蛋白质a)系统发育上非常保守，b)有强壮的体系结构，c)有人们熟知的3D分子组织，d)尺寸小和/或e)含有可通过删除和/或插入修改、但不改变稳定性性质的区域。

根据优选的实施方案，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于所述肽支架选自i)来自纤维连接蛋白(优选纤维连接蛋白3型结构域10)、载脂蛋白、anticalin、来自金黄色葡萄球菌蛋白A结构域B的蛋白质Z、硫氧还蛋白A或带重复基序如“锚蛋白重复序列”(Kohl等，PNAS，2003，vol.100，No.4，1700-1705)、“犰狳重复”，“富含亮氨酸重复”和“三十四肽重复序列”的蛋白质的支架或iii)神经一氧化氮合成酶(PIN)蛋白质抑制子。

发明的另一方面涉及上述抗体的功能性片段。

更特别的是，本发明针对抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于所述功能性片段是选自片段Fv、Fab、(Fab’)₂、Fab’、scFv、scFv-Fc和双特异抗体、或其半衰期被提高的任意片段如聚乙二醇化片段。

根据发明的抗体的此类功能性片段包括(例如)片段Fv、scFv(sc＝单链)、Fab、(Fab’)₂、Fab’、、scFv-Fc或双特异抗体、或通过化学修饰，如添加聚亚烷基二醇如聚乙二醇(聚乙二醇化)，(聚乙二醇化片段被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)₂-PEG和Fab’-PEG)，或通过并入脂质体、微球或PLGA提高其半衰期的任意片段，所述片段具有至少一个发明的特征性CDR(特别是其能够发挥所来自的抗体的一般、甚至部分活性)。

优选地，所述功能性片段包含或包括来源抗体的可变重链或轻链部分序列，所述部分序列足以保留和产生其的抗体相同的结合特异性和产生其的抗体的(优选至少等于1/100、更优选至少1/10的)足够的亲和性。

此类功能性片段含有产生其的抗体序列的至少五个氨基酸、优选6、7、8、10、15、25、50或100个连续的氨基酸。

优选地，这些功能性片段为Fv、scFv、Fab、F(ab’)₂、F(ab’)、scFv-Fc或双特异抗体的类型，其通常具有和产生它们的抗体相同的结合特异性。根据本发明，发明的抗体的片段可以通过如酶消化(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过以化学还原切割二硫键的方法从上述抗体中获得。抗体片段还能通过本领域技术人员也知道的重组基因技术或通过以(例如)自动肽合成仪(如AppliedBioSystems所卖的那些等)做肽合成来获得。

为了更清晰，下面表2总结了对应于本发明的抗体的不同氨基酸序列。

表2(其中Mu.＝小鼠)

本发明的抗体对象的另一特别重要的方面在于，它们不发挥效应物功能，如抗体依赖性细胞细胞毒效应(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。

更特别的是，作为例子，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，没有对于FcγR(I、II或III)或对于C1q、或对于两者的亲和性。

对于本领域技术人员来说这意味着，在结构上，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个没有Fc部分或者其Fc部分没有能够行使效应物功能的正常糖基化。

此后果是本发明的抗体优选选自IgG4或IgG2同型，更优选Ig4。

类似地，优选片段是没有ADCC的片段，例如Fv、scFv(sc即单链)、Fab、(Fab’)₂、Fab’、、scFv-Fc片段或双特异抗体、或通过化学修饰如添加聚亚烷基二醇如聚(乙烯)乙二醇(聚乙二醇化)(聚乙二醇化片段被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)₂-PEG或Fab’-PEG)(“PEG”即聚(乙烯)乙二醇)、或通过并入脂质体提高了其半衰期的任意片段。

更特别的是，来自于抗体515H7的本发明的优选功能性片段是scFv，在此称为515H7 scFv-Ck片段，包括氨基酸序列SEQ ID No.54。

对应于所述scFv的核苷酸序列包括序列SEQ ID No.55。

本发明的另一特别方面涉及嵌合抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于所述抗体也包括来自于与小鼠、特别是人类异源种群抗体的轻链和重链恒定区。

然而本发明另一特殊方面涉及人源化抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于来自人类抗体的轻链和重链的恒定区分别为λ或κ区及γ2或优选γ4区。

本发明的抗体还包括嵌合或人源化抗体。

嵌合抗体是一种抗体，其包含来自于给定种群抗体的天然可变区(轻链和重链)与和所述给定种群异源的种群抗体轻链和重链的恒定区的结合。

可以通过使用重组遗传技术制备抗体或其嵌合片段。例如，可以通过克隆含有启动子和编码本发明非人类(特别是小鼠)单克隆抗体可变区的序列、及编码人类抗体恒定区的序列的重组DNA来生产嵌合抗体。根据发明所述、以一个此类重组基因编码的嵌合抗体能够是(例如)小鼠-人嵌合体，此抗体的特异性决定于来自小鼠DNA的可变区，而其同型决定于来自人DNA的恒定区。参考Verhoeyn等(BioEssays，8：74，1988)的用于制备嵌合抗体的方法。

在此处下面表3中总结了根据发明所述的嵌合抗体515H7(被称为c515H7或C515H7)的不同重链和轻链的氨基酸序列。

表3(其中c＝嵌合)

对应于所述抗体c515H7重链SEQ ID No.56至58和轻链SEQ ID No.59的核苷酸序列分别与序列SEQ ID No.60至63(重链)和SEQ ID No.64(轻链)相对应。

在优选实施方案中，重链序列被删除了其C端赖氨酸残基(如在最初的Lonza的pConPlus载体系列中所见：pConPlusγ4ΔK、pConPlusγ4PROΔK&pConPlusγ2ΔK)。

而且，G4PRO重链对应于人类IgG4同型，其在铰链区携带一个突变以避免半抗体的形成。在来自Lonza的亲本pConPlusγ4PROΔK中发现有此突变【AngalS，King DJ，Bodmer MW，Turner A，Lawson AD，Roberts G，Pedley B，AdairJR.A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimericmouse/human(IgG4)antibody.Mol Immunol.(1993)；30(1)：105-108】。

更特别的是，本发明涉及嵌合抗体重链，特征在于其包括同源于来自于不同哺乳动物种群的抗体相应CDR的CDR，其中所述CDR，根据IMGT，由分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3构成。

更特别的是，本发明涉及嵌合抗体轻链，特征在于其包括同源于来自于不同哺乳动物种群的抗体相应CDR的CDR，其中所述CDR，根据IMGT，由分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3构成。

更特别的是，本发明涉及嵌合抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括重链和轻链，每条链含有同源于来自于不同哺乳动物种群的抗体相应CDR的CDR，其中所述CDR，根据IMGT，由分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3、和分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3构成。

在另一实施方案中，本发明涉及嵌合抗体、或其衍生化合物或功能性片段，包括由SEQ ID No.8构成的重链可变区序列和轻链可变区序列SEQ ID No.7。

还在另一实施方案中，本发明涉及嵌合抗体、或其衍生化合物或功能性片段，包括选自由SEQ ID No.56、57或58构成的重链序列、和轻链序列SEQ IDNo.59。

在优选实施方案中，嵌合抗体c515H7VH(G4wt)/VL-Ck、或其衍生化合物或功能性片段，根据发明所述，包括重链可变区序列SEQ ID No.56和轻链可变区序列SEQ ID No.59。

在优选实施方案中，嵌合抗体c515H7VH(G4PRO)/VL-Ck、或其衍生化合物或功能性片段，根据发明所述，包括重链可变区序列SEQ ID No.57和轻链可变区序列SEQ IDNo.59。

在优选实施方案中，嵌合抗体c515H7VH(G2wt)/VL-Ck、或其衍生化合物或功能性片段，根据发明所述，包括重链可变区序列SEQ ID No.58和轻链可变区序列SEQ ID No.59。

“人源化抗体”意指含有来自于非人类来源的抗体的CDR区域的抗体，抗体分子的其他部分来源于一个(或几个)人类抗体。此外，某些骨架区段残基(称作FR)能被修改以保持结合亲和性(Jones等，Nature，321：522-525，1986；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536，1988；Riechmann等，Nature，332：323-327，1988)。

本发明的人源化抗体或其片段能够以本领域技术人员已知的技术(如，例如在文献Singer等，J.Immun.，150：2844-2857，1992；Mountain等，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10：1-142，1992；和Bebbington等，Bio/Technology，10：169-175，1992中所述的那些)制备。优选此类人源化抗体用于包括体外诊断或体内预防和/或治疗性治疗的方法。本领域技术人员还知道的其他人源化技术如，例如，PDL在专利EP 0 451 261、EP 0 682 040、EP 0 939 127、EP 0 566 647或US 5,530,101、US 6,180,370、US 5,585,089和US 5,693,761中所述的通过PDL的“CDR嫁接”技术。还能引用美国专利5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293。

此外，发明还涉及由上述小鼠抗体产生的人源化抗体。

以优选的方式，来自人类抗体的轻链和重链恒定区分别是λ或κ及γ2或优选γ4区域。

更特别的是，本发明涉及人源化抗体重链，特征在于其包括i)与人类抗体重链相应框架区同源的框架区，及ii)与来自于不同哺乳动物种群的抗体相应CDR同源的CDR，其中所述CDR，根据IMGT，由分别包含序列SEQ ID No.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3构成。

在另一实施方案中，本发明涉及人源化抗体重链，其包括由SEQ ID No.64构成的可变区序列。

还有在另一实施方案中，本发明涉及人源化抗体重链，其包括选自SEQ IDNo.67、68和69的完整序列。

更特别的是，发明涉及人源化抗体轻链，特征在于其包括i)与人类抗体轻链相应框架区同源的框架区，及ii)与来自于不同哺乳动物种群的抗体相应CDR同源的CDR，其中所述CDR，根据IMGT，由分别包含序列SEQ ID No.1、2和3的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3构成。

在另一实施方案中，本发明涉及人源化抗体轻链，其包括选自SEQ ID No.65、66、82或83的可变区序列。

还有在另一实施方案中，发明涉及人源化抗体轻链，其包括选自SEQ ID No.70、71、84或85的完整序列。

更特别的是，本发明涉及人源化抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括重链和轻链，每条链具有i)与人类抗体相应框架区同源的框架区，及ii)与来自于不同哺乳动物种群的抗体相应CDR同源的CDR，其中所述CDR，根据IMGT，由分别包含序列SEQ ID No.4、5和6的重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3、和分别包含序列SEQ ID No.1、2和3的轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3构成。

在另一实施方案中，本发明涉及人源化抗体、或其衍生化合物或功能性片段，其包括由SEQ ID No.64构成的重链可变区序列、及选自SEQ ID No.65、66、82或83的轻链可变区序列。

还有在另一实施方案中，发明涉及人源化抗体、或其衍生化合物或功能性片段，其包括选自SEQ ID No.67、68或69的重链序列、及选自SEQ ID No.70、71、84或85的轻链序列。

在优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G4wt)/VL2-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.67和轻链序列SEQ ID No.70。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G4PRO)/VL2-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.68和轻链序列SEQ ID No.70。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G2wt)/VL2-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.69和轻链序列SEQ ID No.70。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G4wt)/VL2.1-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.67和轻链序列SEQ ID No.71。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G4PRO)/VL2.1-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.68和轻链序列SEQ ID No.71。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G2wt)/VL2.1-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.69和轻链序列SEQ ID No.71。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G4wt)/VL2.2-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.67和轻链序列SEQ ID No.84。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G4PRO)/VL2.2-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.68和轻链序列SEQ ID No.84。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G2wt)/VL2.2-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.69和轻链序列SEQ ID No.84。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G4wt)/VL2.3-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.67和轻链序列SEQ ID No.85。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G4PRO)/VL2.3-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.68和轻链序列SEQ ID No.85。

在另一优选实施方案中，根据发明所述，人源化抗体Hz515H7 VH1 D76N(G2wt)/VL2.3-Ck或其衍生化合物或功能性片段，包括重链序列SEQ ID No.69和轻链序列SEQ ID No.85。

此处下方表4总结了根据发明所述的(分别为)人源化抗体515H7不同重链和轻链可变区及全长(或完整)的氨基酸序列。

表4(其中Hz＝人源化)

在优选实施方案中，重链序列从其C端赖氨酸残基被删除(如Lonza的原始pConPlus载体系列中所见：pConPlusγ4ΔK、pConPlusγ4PROΔK&pConPlusγ2ΔK)。

而且，G4PRO重链对应于人类IgG4同型，其在铰链区携带一个突变以避免形成半抗体。此突变在Lonza的亲本pConPlusγ4PROΔK中发现【Angal S，KingDJ，Bodmer MW，Turner A，Lawson AD，Roberts G，Pedley B，Adair JR.Asingle amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody.Mol Immunol.(1993)；30(1)：105-108】。

为避免疑问，作为例子，表达“VH1”类似于表达“VH可变1”、“VH可变1”、“VH Var 1”或“VH var 1)。

必须理解上述例证VH/VL组合不是限制。当然，本领域技术人员能够重排本说明中公布的所有VH和VL(而无需过度负担并无需使用创造性技巧)。

本发明的一个新方面涉及分离的核酸，特征在于其选自下列核酸(包括任意简并遗传密码)：

a)核酸(DNA或RNA)，其编码根据发明的抗体或其功能性片段或衍生物的一个；

b)核酸，其包括选自序列SEQ ID No.14至19及41至45的DNA序列；

c)核酸，其包括选自序列SEQ ID No.20、21、46和47的DNA序列；

d)如b)或c)中定义的核酸的相应RNA核酸；

e)如a)、b)及c)中定义的核酸的互补核酸；

f)至少18个核苷酸的核酸，其能够在高严谨度条件下与序列SEQ ID No.14至19和41至45的至少一个CDR杂交。

下面表5总结了关于发明抗体的不同核苷酸序列。

表5(其中Mu.＝小鼠)

在本说明中互换使用的术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列”、“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”，意指核苷酸精确序列，无论修改与否，其定义核酸的片段或区域、包含或不含非天然核苷酸、并且是双链DNA、单链DNA、或是所述DNA的转录产物。

此处还包括本发明不涉及在其天然染色体环境(即处于天然状态)中的核苷酸序列。本发明的序列已经分离和/或纯化，即它们(例如以一个拷贝)直接或间接取样，其环境已经至少部分被改变。在此还应提及以重组遗传学(例如以宿主细胞的方式)获得、或以化学合成获得的分离核酸。

“在与优选序列最佳比对后显示有至少80％、优选85％、90％、95％和98％百分比同源性的核酸序列”意指核酸序列(参考对照核酸序列)显示特别准确的某些修改，例如(特别是)删除、截短、延长、嵌合融合和/或替换。优选的是，这些序列编码与对照序列相同的氨基酸序列(这涉及遗传密码的简并)、或是优选在高度严谨条件下有可能与对照序列特异杂交的互补序列，特别是下面定义的那些。

在高度严谨条件下杂交意指，在此方式下选择涉及温度和离子强度的条件以使其能保证两条互补DNA片段间维持杂交。在单纯说明的基础上，上述用于限定多核苷酸片段目的的杂交步骤的高度严谨条件是有利的，如下。

在两个步骤中进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交：(1)在42℃、在磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.5，包含5X SSC(1X SSC对应于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠的溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基磺酸钠(SDS)、10X Denhardt’s、5％硫酸葡聚糖和1％的鲑精DNA)中预杂交三个小时；(2)在取决于探针长度的温度(即，对于大于100核苷酸长的探针是42℃)下进行初始杂交20小时，然后在20℃、在2X SSC+2％SDS中进行两次20分钟洗涤，在20℃、在0.1XSSC+0.1％SDS中进行一次20分钟洗涤。最后对于大于100核苷酸长的探针，在60℃、在0.1X SSC+0.1％SDS中进行洗涤30分钟。对于长些或短些的寡核苷酸，本领域技术人员能依据Sambrook等所述的方法(Molecular cloning：alaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory；第三编，2001)改动上述对于限定长度的多核苷酸的高度严谨杂交条件。

本发明还包括分离的核酸分子，特征在于其选自下列核酸：

a)核酸(DNA或RNA)，根据发明所述，编码人源化抗体重链、或其衍生化合物或功能性片段；

b)核酸(DNA或RNA)，根据发明所述，编码人源化抗体轻链、或其衍生化合物或功能性片段；

c)核酸(DNA或RNA)，根据发明所述，编码人源化抗体、或其衍生化合物或功能性片段；

d)互补于如a)、b)或c)所限定的核酸的核酸；

e)至少18个核苷酸的核酸，能够在高度严谨条件下与包括核酸序列SEQ IDNo.72或75至77的至少一条重链杂交；

f)至少18个核苷酸的核酸，能够在高度严谨条件下与包括核酸序列SEQ IDNo.73、74、86、87或78、79、88、89的至少一条轻链杂交。

其后表6分别总结了根据发明所述的人源化抗体515H7的不同重链和轻链可变区和全长(或完整)的核苷酸序列。

表6(其中Hz＝人源化)

此处下面的表7总结了根据发明所述的嵌合抗体515H7的不同重链和轻链的核苷酸序列。

表7(其中c＝嵌合)

换句话讲，本发明涉及分离的核酸，特征在于其选自下列核酸：

a)核酸(DNA或RNA)，根据发明所述，编码抗体或其功能性片段或衍生物的一个；

b)核酸，包括选自由序列SEQ ID No.14至19及41至45构成的CDR序列的DNA序列；

c)核酸，包括选自由SEQ ID No.20、21、46、47、72、73、74、86和87构成的重链和轻链可变区序列的DNA序列；

d)核酸，包括选自由SEQ ID No.60至63、75至79、88和89构成的重链和轻链序列的DNA序列；

e)核酸，包括由SEQ ID No.55构成的DNA序列；

f)b)、c)、d)或e)中限定核酸的相应RNA核酸；

g)a)、b)、c)、d)和e)中限定核酸的互补核酸；及

h)至少18个核苷酸的核酸，能够在高严谨度条件下与序列SEQ ID No.14至19和41至45的至少一个CDR杂交。

本发明还涉及包括发明所述的核酸的载体。

本发明特别靶标于包含此类核苷酸序列的克隆和/或表达载体。

本发明的载体优选包含在给定宿主细胞中保证核苷酸序列表达和/或分泌的元素。因而载体必须包含启动子、翻译起始和终止信号、还有适当的转录调控区。它必须能够在宿主细胞中以稳定的方式维持，并且可以优选具有特定翻译蛋白质分泌的特异信号。根据所用的宿主细胞，本领域技术人员能选择和优化这些不同元素。为了此目的，核苷酸序列能被插入至所选宿主内的自主复制载体，或者是所选宿主的整合性载体。

此类载体以本领域技术人员通常使用的方法制备，而且产生的克隆能以如脂质转染、电穿孔、热激或化学方法的标准方法引入至适当的宿主。

载体是(例如)质粒或病毒来源的载体。它们被用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明的核苷酸序列。

本发明还包括以本发明所述载体转化或包括本发明所述载体的宿主细胞。

宿主细胞能选自原核或真核系统，如(例如)细菌细胞、还有酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。还能使用昆虫或植物细胞。

除了人类，本发明还涉及根据发明所述的具有转化细胞的动物。

本发明的另一方面涉及用于生产根据发明所述的抗体、或其功能性片段的一个的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：

a)在培养基中及在适当培养条件下培养根据发明所述的宿主细胞；及

b)回收如此从培养基或从所述培养细胞中生产的所述抗体、或其一个功能性片段。

根据发明所述的转化细胞可用于制备根据发明所述的重组多肽的方法。本发明还包括制备根据发明所述重组形式的多肽的方法，特征在于所述方法使用载体和/或以根据发明所述的载体转化的细胞。优选地，以根据发明所述的载体转化的细胞在使前述多肽得以表达和所述重组肽得以回收的条件下培养。

如已提及的，宿主细胞能选自原核或真核系统。特别是，可能鉴定到有利于在此原核或真核系统中分泌的本发明的核苷酸序列。携带这样序列的根据发明所述的载体因此能有益用于生产分泌的重组蛋白质。事实上，蛋白质在细胞培养的上清中存在而非在宿主细胞内的事实将有利于这些相关重组蛋白质的纯化。

本发明的多肽还能以化学合成制备。一种此类制备方法也是发明的对象。本领域技术人员知道用于化学合成的方法，如以浓集片段或以传统溶液中合成的固相技术(特别见Steward等，1984，Solid phase peptides synthesis，Pierce Chem.Company，Rockford，111，第二版)或部分固相技术。发明也包括以化学合成获得并能够包含相应非天然氨基酸的多肽。

本发明还包括以发明的方法可能获得的抗体、或其衍生化合物或功能性片段。

依据另一方面，本发明涉及如上所述的抗体，特征在于此外抗体能特异结合于人趋化因子家族受体和/或能特异抑制X4-向性HIV复制。

依据另一方面，本发明涉及如上所述的抗体，特征在于此外抗体能特异结合于人趋化因子家族受体和/或能特异抑制X4/R5-向性HIV复制。

根据新实施方案，本发明涉及抗体、或其衍生化合物或功能性片段，由双特异性的抗体构成，意思是抗体包括第二个基序，其能够与HIV细胞进入相关的任何受体(如，例如，CCR5、CD4、CXCR4(除本发明抗体外，即靶标另一表位)或CCR3、CCR2、CCR8、CXCR6、CXCR7、CX3CR1)相互作用。

双特异性或双功能抗体组成了第二代单克隆抗体，其中在同一分子中组合了两种不同的可变区(Hollinger和Bohlen，1999，Cancer and metastasis，rev.18：411-419)。关于其靶标细胞表面若干分子的能力，在诊断和治疗领域中均阐明了抗体的效用；此类抗体可以化学方法(Glennie MJ等，1987，J.Immunol.139，2367-2375；Repp R.等，1995，J.Hemat.，377-382)或体细胞的方法(Staerz U.D.和Bevan M.J.，1986，PNAS 83，1453-1457；Suresh M.R.等，1986，MethodEnzymol.，121：210-228)、而且优选以基因工程技术(该技术能迫使抗体异源二聚体化并因此有利于所得抗体的纯化(Merchand等，1998，Nature Biotech.，16：677-681)获得。

这些双特异性抗体能被构建成为整个IgG、双特异性Fab’2、Fab’PEG、双特异抗体或双特异性scFv，也可以成为四价双特异性抗体(其中对于每个靶标的抗原存在着两个结合位点(Park等，2000，Mol.Immunol.，37(18)：1123-30))或如上所述的其片段。

除了保证双特异性抗体生产和施用比生产两个特异性抗体更便宜的经济利益之外，此类双特异性抗体的使用具有降低治疗毒性的优势。事实上，双特异性抗体的使用使得降低循环抗体的总量及由此产生的可能的毒性成为可能。

在本发明的优选实施方案中，双特异性抗体是二价或四价抗体。

最后，本发明涉及作为药剂的上述抗体或其功能性片段或衍生物的一个。

本发明还涉及一药物组合物，其包括由发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个构成的化合物作为活性组分。优选地，所述抗体辅以辅料和/或药学上可接受的载体。

发明还涉及作为药剂的如上所述组合物。

在发明的一特殊方面，抗体、或其功能性片段或衍生物，抑制HIV-1 KON原发隔离群在PBMC中的复制，具有IC₉₀为至少5μg/ml、优选至少10μg/ml。

本发明还包括根据发明所述的抗体或组合物的使用，其用于制备预防或治疗HIV感染的药物和/或药剂。

更特别的是，作为非限制性例子，所述HIV感染为X4-向性HIV感染。

在另一实施方案中，作为非限制性例子，所述HIV感染为X4/R5-向性HIV感染。

本发明还涉及根据发明所述的(优选人源化的)抗体、或功能性片段或同一衍生物、和/或组合物的使用，用于制备抑制HIV复制的药物。通常，本发明涉及(优选人源化的)抗体、或功能性片段或同一衍生物、和/或组合物的使用，用于制备HIV疾病预防或治疗的药物。

在本说明中，“药物媒介”意指参与药物组合物的化合物、或化合物组合，该物质不导致二级反应，并且该物质(例如)有利于活性化合物的施用、增加其在有机体中的寿命和/或效果、提高其在溶液中的溶解度或改善其储存。此类药物载体众所周知，并且根据所选活性化合物的性质和施用方式，本领域技术人员可对其进行改动。

优选的是，此化合物将以系统方式、特别是以静脉注射、肌肉注射、皮内、腹腔内、皮下、阴道内或口服方式施用。更优选的是，由根据发明所述的抗体组成的组合物以一定时间内同样间隔的几个剂量施用。

其施用方式、剂量规划和最佳植物制剂形式(galenic forms)能根据建立适合于患者的治疗时通常要考虑的标准(如，例如患者的年龄或体重、他的总体状况的严重性、他的治疗耐受性和所经历的副作用)来确定。

本发明还涉及组合物，其作为组合产物以同时、分开或延伸的方式使用，另外包括抗HIV抗体、或抗HIV细胞进入抗体、或抗HIV复制抗体、其他针对CXCR4的抗体。

根据另一实施方案，本发明还涉及如上所述的药物组合物，其包括至少第二个抗HIV化合物，该化合物选自能特异抑制HIV进入和/或复制的化合物(如本发明描述的那些以外的抗CCR5、抗CD4化合物和抗CXCR4化合物，或本领域技术人员已知的任意其他抗HIV化合物)。

另外互补于发明的另一实施方案由如上所述的组合物构成，该组合物作为同时、分开或延伸使用的组合或偶联产物，由抗HIV化合物组成。

“同时使用”意指施用以单一剂型形式组成的两种化合物的组合物。

“分开使用”意指同时施用以不同剂型形式组成的两种化合物的组合物。

“延伸使用”意指连续施用两种化合物组合物，每种由不同剂型形式组成。

通常，根据发明所述的组合物大大提高了HIV治疗的有效性。换句话说，以意想不到的方式通过施用抗HIV试剂增强了发明抗体的治疗效果。发明组合物产生的另一主要后期优势在于，有可能使用更低有效剂量的活性组分，从而有可能避免或降低副作用(特别是抗HIV试剂的作用)出现的风险。而且，此组合物使得更快地实现期望的治疗效果成为可能。

“治疗性抗HIV试剂”意指一种物质，当其施用于患者时，它治疗或预防了患者体内HIV复制。此类试剂的非限制性例子包括“抗逆转录病毒药物如HIV蛋白酶抑制剂(PI)、核苷/核苷酸HIV逆转录酶抑制剂(NRTI/NtRTI)非核苷类HIV逆转录酶抑制剂(NNRTI)、HIV进入抑制剂、HIV整合酶抑制剂”。

在(例如)VIDAL中、在关于“抗HIV化合物”的化合物所在的页上引用了此类试剂；参考此文献引用的抗HIV化合物在此引用作为非限制性优选抗HIV试剂。

HIV蛋白酶抑制剂意指能抑制HIV蛋白酶活性的任意物质。此类HIV蛋白酶抑制剂的例子包括，但不限于，甲磺酸沙奎那韦或SQV

茚地那韦或IDV

利托那韦或RTV

奈非那韦或NFV

安普那韦

洛匹那韦/利托那韦或LPV/r

阿扎那韦或ATV

福沙那韦或FPV

替拉那韦或TPV

达芦那韦或DRV

HIV核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)意指一种物质，它是阻断HIVRNA逆转录的核苷或核苷酸类似物。NRTI的例子包括，但不限于，齐多夫定或AZT、ZDV(Retrovir/combivir/

)、地达诺新或ddi

扎西他滨

司他夫定或d4T

拉米夫定或3TC(Epivir/combivir/epzicom/

)、阿巴卡韦或ABC(Ziagen/trixivir/

)、替诺福韦(Tenofovir disoproxil fumarate)或TDF(Viread/atripla/

)、恩曲他滨或FTC(Emtriva/atripla/)。

非核苷HIV逆转录酶抑制剂(NNRTI)意指一种物质，它能阻断HIV RNA逆转录但不是核苷或核苷酸类似物。NNRTI的例子包括，但不限于，奈韦拉平或NVP依非韦伦或EFV(Sustiva/)、地拉韦啶或DLV

和依曲韦林(Etravirine)或ETR

HIV进入抑制剂意指阻断HIV细胞进入的一种物质。HIV进入抑制剂的例子包括，但不限于，恩夫韦或T20马拉维诺或MVC

HIV整合酶抑制剂意指抑制HIV整合酶活性的一种物质。整合酶抑制剂的例子包括，但不限于，雷特格韦或RAL

此类试剂也是(例如)属于VIDAL中所述的同一类药物的化合物，现今在临床病例中的同一类药物例如(但不限于)苹果酸(Vicriviroc)、PRO140、TNX-355、AMD070、拉米夫定(Racivir)、阿力他滨(Apricitabine)、艾夫他滨(Elvucitabine)、弗洛维啶(Flosalvudine)、利匹维林(Rilpivirine)、雷格特维(Elvitegravir)。

此类试剂也是(例如)属于其他潜在类药物的化合物，如(但不限于)成熟抑制剂(Bevirimat)、β-半乳糖神经酰胺配糖类类似物、碳水化合物结合试剂、RNaseH抑制剂、HIV基因表达抑制剂、潜伏性T细胞的HIV释放的刺激物(丙戊酸...)。

在特别优选的实施方案中，作为组合产物的所述发明组合物特征在于，所述抗HIV试剂化学结合于用于同时使用的所述抗体。

为了有利于所述抗HIV试剂和根据发明所述的抗体间的结合，可以在要结合的两个化合物之间引入间隔物分子，如聚亚烷基二醇聚乙二醇或氨基酸；或者，在另一实施方案中，能使用所述抗HIV试剂的活性衍生物(其中已引入能与所述抗体反应的功能)。这些结合技术为本领域研究人员所熟知，并且将不在本说明中更详细讨论。

还优选的是，形成所述偶联物的发明所述抗体选自其功能性片段、特别是丢失其Fc组分的片段(如scFV片段)。

根据发明所述，本发明还涉及用作药物的作为组合产物的组合物或抗CXCR4Mab/抗HIV药物偶联物。

优选的是，所述作为组合产物的组合物或所述偶联物将辅以赋形剂和/或药品载体。

因而，本发明涉及抗体、或其功能性片段或衍生物的一个的使用，用于制备药物来特异性靶标对于HIV复制具有生物活性的化合物。

如前面所说明的，CXCR4 Mabs 515H7和301aE5具有对抗HIV-1在PBMC中复制的强活性，所以此类抗体能被用于筛选分析以鉴定治疗HIV-1感染的CXCR4拮抗物抗病毒试剂。在这些分析的第一步，表达CXCR4的细胞与Mabs515H7和/或301aE5孵育，并且随后评估分子的抑制Mabs 515H7和/或301aE5结合的潜力。在此类型分析中使用的细胞能够是转染的细胞系如CHO-CXCR4、NIH3T3-CXCR4或CXCR4转染的人细胞系如U373-MAGI-CXCR4、表达CXCR4的人细胞系如NALM6或原代细胞如PBMC。用以筛选抑制Mabs515H7和/或301a5在CXCR4表达细胞上结合的CXCR4拮抗剂的方法能够是Zhao Q等描述的基于细胞的竞争性酶联免疫吸收分析(ELISA)(AIDS Research And HumanRetroviruses，2003，19，pp947-955)或使用如Juarez J.等描述的荧光激活细胞分选(FACS)的方法(Leukemia 2003，17，pp1294-1300)。

因此，在发明的一特殊方面，涉及用于筛选和/或鉴定作为CXCR4拮抗剂抗病毒试剂的分子的方法，包括步骤：

a)选择表达CXCR4的细胞，

b)所述细胞与发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个孵育，并且

c)评估检验分子对于抗体、或其功能性片段或衍生物的一个与CXCR4结合的潜在抑制，并且

d)选择能产生所述抑制的分子。

在另一特殊实施方案中，能加入下列步骤e)：

e)在HIV-1复制分析中检验这些分子。

发明的其他特征和优势在说明中以实施例和图进一步呈现，图注显示如下。

附图说明

图1A和1B显示单核细胞和淋巴细胞上CXCR4表达的设门策略。

图1A：T细胞以CD3-PE抗体染色。

图1B：单核细胞以CD14-PE抗体染色。

图2A和2B显示抗CXCR4 Mabs 515H7和301aE5在单核细胞和T淋巴细胞上的结合。

图3A和3B经由在HEK293细胞中的生物荧光共振能量转移(BRET)法，显示分别以SDF-1和以抗CXCR4 Mabs 515H7和301aE5调节CXCR4受体二聚体。

图4A和4B和图5显示了抗CXCR4 Mab 515H7和301aE5抑制HIV-1隔离群KON(X4病毒)在人PBMC中复制的能力。

图6A、6B和6C显示了在CHO-CXCR4细胞中以Mabs 515H7(图6A)、301aE5(图6B)和c515H7(图6C)抑制SDF-1诱导的钙释放。

图7和8显示了抗CXCR4 Mab 515H7、c515H7和301aE5抑制HIV-1X4病毒原发隔离群MN(图7)和92UG024(图8)在人PBMC中复制的能力。

图9显示了抗CXCR4 Mab 515H7、c515H7和301aE5抑制HIV-1X4病毒原发隔离群KON、MN和92UGO24在人PBMC中复制的能力。

图10和11显示了抗CXCR4 Mab 515H7、c515H7和301aE5抑制双向性HIV-1X4/R5病毒原发隔离群89.6在人PBMC中复制的能力。

图12显示了Mab c515H7与马拉维诺组合抑制HIV-1原发隔离群89.6(双向性X4/R5病毒)在人PBMC中复制的有益效果。

图13显示了Mab c515H7与马拉维诺组合抑制HIV-1原发隔离群UG93067(双向性X4/R5病毒)在人PBMC中复制的有益效果。

图14显示了抗CXCR4Mab 515H7、c515H7和301aE5抑制HIV-1X4病毒原发隔离群KON在人PBMC中复制的能力。

图15以FACS分析阐明了c515H7Mab的结合特异性。

图16通过生物荧光共振能量转移(BRET)法阐明了c515H7 Mab对于CXCR4同源二聚体的效果。

图17：515H7重链可变区与人生殖细胞系IGHV3-49*04和IGHJ4*01的氨基酸序列比对。515H7 VH氨基酸序列与所选人受体框架序列相比对。VH Var1(VH1)序列对应于515H7VH结构域的人源化变体。在76位的单回复突变以粗体显示。

图18：515H7轻链与人生殖细胞系IGKV4-1*01和IGKJ1*01的氨基酸序列比对。515H7VL氨基酸序列与所选人受体框架序列相比对。VL Var2.1、Var2.2和Var2.3序列对应于人源化515H7 VL Var2(带粗体显示的突变残基)的实施人源化变体。Var2.1和Var2.2携带另外4个人源化残基，而Var2.3包含另外5个人类残基。

图19：以嵌合515H7和人源化515H7的不同变体交叉阻断生物素化小鼠抗体515H7。以流式细胞仪使用CXCR4转染的NIH3T3细胞评估515H7人源化变体(hz515H7)交叉阻断亲本小鼠抗体515H7的活性。将人源化变体的活性与嵌合515H7相比。变体VH1与嵌合VL(cVL)组合的交叉阻断活性与嵌合的活性非常类似(A)。当与VL的变体2组合时，确定VH变体1(VH1，无回复突变的变体)的活性没有降低(B)。

图20：以嵌合515H7和人源化515H7的不同变体抑制生物素化SDF-1结合。以流式细胞仪使用细胞系RAMOS评估515H7人源化变体(hz515H7)抑制SDF-1结合的能力。将人源化变体的抑制能力与嵌合515H7相比。人源化变体hz515H7VH1 D76N VL2具有和嵌合抗体类似的抑制SDF-1结合的能力。人源化抗体片段hz515 VH1 VL2在抑制SDF-1结合于RAMOS细胞中有完全活性。

图21显示了人源化515H7 Mabs(hz515H7 VH1 D76N VL2，hz515H7 VH1D76N VL2.1，hz515H7 VH1 D76N VL2.2和hz515H7 VH1 D76N VL2.3)特异结合于NIH3T3-CXCR4上的CXCR4。

图22通过生物荧光共振能量转移(BRET)法，显示了人源化515H7 Mabs(hz515H7 VH1 D76N VL2，hz515H7 VH1 D76N VL2.1，hz515H7 VH1 D76NVL2.2和hz515H7 VH1 D76N VL2.3)对CXCR4同源二聚体的效果。

具体实施方式

实施例1：生成针对人CXCR4的单克隆抗体(Mabs)

为了生成CXCR4的单克隆抗体，以重组NIH3T3-CXCR4细胞和/或对应于CXCR4胞外N端和环的肽免疫Balb/c小鼠。以在完全弗氏佐剂中的抗原对6-16周龄的小鼠皮下(s.c.)免疫一次，然后以在不完全弗氏佐剂中的抗原皮下免疫2至6次。以眼眶后取血监测免疫反应。以ELISA(如下所述)筛选血清，并且具有更高滴度抗CXCR4抗体的小鼠被用于融合。小鼠在被杀死之前两天以抗原静脉注射刺激，然后摘除脾脏。

-ELISA

为选择生产抗CXCR4抗体的小鼠，以ELISA检验来自免疫小鼠的血清。简单讲，以5μg等量肽/mL的偶联BSA的纯化【1-41】N末端肽包被微孔板，100μL/孔，在4℃孵育过夜，然后以250μL/孔的PBS中的0.5％明胶封闭。向每孔中加入CXCR4免疫小鼠的血浆稀释物并在37℃孵育2小时。以PBS洗涤平板并随后以偶联于HRP的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson Laboratories)在37℃孵育1小时。洗涤后，以TMB底物呈现平板，5分钟后以添加100μL/孔1M H₂SO₄终止反应。生成最高滴度抗CXCR4抗体的小鼠被用于抗体生成。

-生产CXCR4Mabs的杂交瘤的生成

产生最高滴度抗CXCR4抗体的Balb/c小鼠分离出的小鼠脾细胞以PEG融合至小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O。以大约1x10⁵/孔铺被细胞于微孔板，然后在包括ultra培养基(ultra culture medium)+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+1XHAT的选择培养基中孵育两周。然后以ELISA筛选孔中的抗CXCR4单克隆IgG抗体。然后至少两次以限制性稀释亚克隆分泌抗体的杂交瘤，体外培养以生成抗体用于进一步分析。

实施例2：以FACS分析鉴定抗CXCR4 Mab 515H7和301aE5的(NIH3T3-CXCR4转染物)结合特异性

在此实验中，以FACS分析检查抗CXCR4 Mab 515H7和301aE5与人CXCR4(hCXCR4)的特异性结合。

以10μg/ml单克隆抗体515H7和301aE5孵育NIH3T3和NIH3T3-hCXCR4转染细胞。然后以1％BSA/PBS/0.01％NaN3洗涤细胞。接着，向细胞中加入Alexa-标记的二抗并使其在4℃孵育20分钟。然后再洗涤细胞两次。在第二次洗涤之后，进行FACS分析。在下面表8中提供了这些结合研究结果，【以FACS获得的平均荧光强度(MFI)】显示出抗CXCR4Mabs 515H7和301aE5特异性结合于人CXCR4-NIH3T3转染细胞系，而对于亲本NIH3T3细胞无识别。

表8

实施例3：以FACS分析鉴定抗CXCR4 Mab 515H7和301aE5与外周血单核细胞(PBMC)的结合

从健康供体中收集血块黄层的血液。100μl全血与以标明的浓度的抗人CXCR4抗体(克隆515H7和301aE5)在4℃孵育20分钟。在PBS-BSA 1％-NaN30.01％中洗涤血液三次，并与1∶500稀释的山羊抗人Alexa 488 IgG(Invitrogen)在4℃孵育20分钟。然后洗涤细胞并以CD14-PE(Caltag)或CD3-PE(Caltag)在4℃孵育10分钟，并且洗涤三次。室温下以高产量裂解溶液(Caltag)裂解红细胞10分钟。立即用Facscalibur(Becton-Dickinson)分析细胞。于CD14阳性细胞上进行单核细胞的CXCR4表达及在CD3阳性的细胞上进行T细胞的CXCR4表达分析(图1)。结果表示为抗原结合能力(ABC)。

如图2A和2B中所显示，抗人CXCR4克隆515H7和301aE5染色的T淋巴细胞(图2A)和单核细胞(图2B)，说明了515H7和301aE5Mabs能够识别单核细胞和T淋巴细胞细胞表面表达的天然形式的CXCR4。

实施例4：通过生物荧光共振能量转移(BRET)法，515H7和301aE5Mabs对于CXCR4同源二聚体的效果

此功能分析允许评估SDF-1和/或515H7Mab结合于CXCR4同源二聚体水平的CXCR4受体引起的构象变化。

通过用传统分子生物学技术，将用于调查相互作用配偶体的表达载体构建为与相应染料(海肾荧光素酶，Rluc和黄色荧光蛋白，YFP)的融合蛋白质。在进行BRET实验之前两天，以编码相应BRET配偶体：【CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP】的表达载体瞬时转染HEK293细胞以研究CXCR4同源二聚体化。一天后，分散细胞于多聚赖氨酸预包被的白色96MW平板的完全培养基【添加10％FBS的DMEM】中。先在37℃以5％CO₂培养细胞以使得细胞粘附于平板。然后以200μl DMEM/孔过夜饥饿细胞。恰在BRET实验之前，去除DMEM并且快速以PBS洗涤细胞。然后在加入终体积50μl的5μM腔肠素H(有或无300nM SDF-1)之前，在含或不含抗体的PBS中、在37℃下孵育细胞10分钟。在37℃又孵育10分钟后，使用Mithras LB940多标记阅读仪(Berthold)起始485nm和530nm处的光发射获取(1s/波长/孔，室温下重复15次)。

如前所述进行BRET比例的计算(Angers等，2000)：【(发光值530nm)-(发光值485nm)X Cf】/(发光值485nm)，此处对于同样实验条件下的只表达Rluc融合蛋白质的细胞，Cf＝(发光值530nm)/(发光值485nm)。简化此方程，显示BRET比例相当于(以同样实验条件下分析中只有融合于Rluc的配偶体存在时得到的530/485nm比例校正的)两个BRET配偶体存在时得到的530/485nm比例。为可读性起见，结果表示为milliBRET单位(mBU)；mBU相当于BRET比例乘以1000。

接头蛋白与融合于CXCR4受体的受体蛋白质的空间接近性导致SDF-1(300nM)提高了约20％的BRET信号，可能表明CXCR4/CXCR4同源二聚体的形成或事先存在的二聚体的构象变化(图3A和B)。515H7和301aE5Mabs能够调节SDF-1诱导的CXCR4同源二聚体的构象变化(对于515H7和301aE5，抑制了69％的SDF-1诱导的BRET升高，图3A和B)。515H7和301aE5Mabs还能够亲自调节CXCR4/CXCR4的空间接近性，表明515H7和301aE5Mabs对于CXCR4/CXCR4同源二聚体构象的影响(图3A和3B)。

实施例5：以抗CXCR4 Mabs 515H7和301aE5抑制HIV-1原发隔离群KON(X4病毒)在人PBMC中的复制

HIV-1血清阴性的正常供体的PBMC以Ficoll-Hypaque梯度离心分离自血块黄层或细胞单采法。PBMC以含PHA的RPMI 1640细胞培养基(含25mMHEPES、5ml青霉素(10000U/ml)-链霉素(10000μg/ml)、2mM L-谷氨酰胺、添加10％热灭活FCS)活化，并用作单周期中和试验中的细胞靶标。通过以FACS实验分析病毒p24抗原的细胞内染色，完成原代人PBMC中的HIV-1复制检测。简单讲，25μl每孔的不同稀释度的Mabs 515H7、301aE5和12G5(R&DSystems)或培养基作为对照(RPMI 1640，10％FCS，0.1％IL-2)，在37℃与25μl每孔的HIV-1 KON X4原发隔离群稀释物孵育1小时，一式两份。PHA-活化的人PBMC(25μl/孔)以20x10⁶细胞/孔加入到96孔板(U-底，Costar3599)中的Mab/病毒混合物中，并在RPMI 1640 10％ FCS和0.1％IL-2中、在37℃下培养24至36小时。引入由不含Mab的培养基中未感染PBMC构成的对照。为检测HIV感染的PBMC，以流式细胞仪进行病毒p24抗原的细胞内染色和分析。根据厂商的方法使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(Becton Dickinson)固定细胞并使其渗透，并以1/160稀释使用的荧光抗p24Mab(克隆KC57-CoulterBeckman)在黑暗中、4℃下孵育10分钟染色。在PBS-3％FCS介质中洗涤之后，在流式细胞仪分析前在PBS中稀释PBMC。通过活细胞群中设门20,000个确定不同样品中的p24阳性细胞百分数。分析活细胞亚群相对于未感染细胞背景染色的p24表达。在减去模拟感染细胞背景值之后得到p24阳性值。中和百分数被定义为与不含Mab的对照感染孔相比p24阳性细胞的减少。中和滴度被定义为保证感染细胞百分数有90％降低的Mab稀释度。将抗CXCR4 Mabs 515H7和301aE5与已知作为HIV复制的抗CXCR4Mab参照的12G5Mab相比较。如图4A和B和5所示，抗CXCR4 Mabs 515H7和301aE5分别能以IC₉₀为10μg/ml(66nM)和150μg/ml(1μM)抑制HIV-1KON原发隔离群在PBMC中的复制，而12G5Mab不能抑制HIV-1KON原发隔离群在PBMC中的复制(图4A)。

实施例6：CXCR4受体介导的细胞内钙库的流动

此功能分析被设计用于监控经由刺激磷酸酯酶C通路的CXCR4受体信号，该信号诱导内质网的细胞内储存钙的释放。

通过以携带有人CXCR4受体整个编码序列(RefSeq NM_003467)的哺乳动物表达载体转染原初CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)，获得了稳定和组成型表达人CXCR4受体的CHO-K1细胞。在完全培养基【添加有5％胎牛血清(FCS)和500μg/ml遗传霉素的DMEM-Ham’s F12】中繁殖细胞。以100,000细胞/孔的密度在合适培养基中铺被细胞于黑色96MW平板。在进行实验之前将细胞饥饿过夜。在上样缓冲液【HBSS 1x，HEPES 20mM，丙磺舒酸25mM】中、以荧光钙染料(Fluo-4 No Wash，Invitrogen美国)在37℃装载细胞30分钟然后在25℃装载细胞30分钟。通过直接注射进每个细胞完成SDF-1刺激。对于拮抗实验，在SDF-1之前至少10分钟直接将10μl Mab溶液加入至上样缓冲液。在多重模式荧光微孔板阅读仪Mithras LB940(Berthold)上用下列设置完成动力学荧光测定：在485nm处激发，在535nm处发射，10000任意单位的激发能量。每秒中0.1秒间记录每孔的荧光并记录在SDF-1注射之前的20秒的时间(本底信号)。然后注射20μl SDF-1，并随后记录2分钟的时长的数据。每个实验情况一式两份进行。首先通过减去本底荧光及没有细胞的对照孔所发出的荧光校正每孔的值。相对数据表达为SDF-1(100nM)所得的最大刺激的百分数。

SDF-1(100nM)在重组CHO/CXCR4中诱导了细胞内钙的快速而强烈的释放，而在原初CHO-K1细胞中未检测到荧光信号。在以SDF-1刺激时最大强度达到本底荧光以上的大于140％并在大约40秒时观察到(图6A、6B和6C)。Mabs 515H7(133nM)(图6A)和c515H7(133nM)(图6C)产生了对于SDF-1(100nM)诱导的钙信号的强烈抑制。Mab 301aE5(133nM)(图6B)产生了对于SDF-1(100nM)诱导的钙信号的部分抑制。

实施例7：以抗CXCR4Mabs 515H7、c515H7和301aE5抑制HIV-1原发隔离群KON、MN与92UG024(X4病毒)在人PBMC中的复制

单周期中和分析

此分析使用相应浓缩和稀释的原发隔离群KON、MN和92UG024在36小时内进行，以保证在感染2天之后能检测到2％感染的CD4T淋巴细胞。

二十五微升不同稀释的Mabs 515H7、c515H7和301aE5在37℃下与25μl病毒孵育1小时。人PBMC(25μl)以20x10⁶细胞/ml加入到96孔板(U底，Costar 3599)中的Mab/病毒混合物并在RPMI 164010％FCS和20U/ml IL-2(R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)中培养36小时。

在培养2天后，以病毒p24抗原的细胞内染色来检测HIV感染的淋巴细胞。根据厂商建议使用Cytofix/Cytoperm和Perm/Wash试剂盒(BD Biosciences)固定细胞并使其渗透，并以加入在Perm/Wash溶液中1/160稀释使用的荧光抗p24Mab(FITC-或PE-抗p24，克隆KC57；Beckman Coulter/Immunotech，海厄利亚，佛罗里达州)在4℃染色15分钟。在含有3％FBS的PBS中洗涤后，于流式细胞仪(LSRII；BD Biosciences)以DIVA软件(BD Biosciences)分析之前，在300μl PBS中稀释PBMC。通过以前向和侧向散射参数鉴定的活细胞群中设门20,000个物质来确定不同样品中的p24阳性细胞的百分数。用活/死溶液试剂盒(Invitrogen)分析活细胞亚群。在减去模拟病毒感染的细胞中的背景物质后得到p24抗原阳性值。

中和百分数被定义为与无Mab的对照感染孔相比p24阳性细胞的减少。中和滴度被定义为使得感染细胞的百分数减低90％的抗体浓度(在一式三份进行的系列稀释之间的插值)。

如图7、8和9所示，抗CXCR4Mabs 515H7、c515H7和301aE5能抑制HIV-1 X4 MN、KON和92UG024原发隔离群在PBMC中的复制。在表9中总结(以μg/ml表示的)ICs的结果。

表9

实施例8：以抗CXCR4 Mabs 515H7、c515H7和301aE5抑制HIV-1原发隔离群89.6(双向性X4/R5病毒)在人PBMC中的复制

单周期中和分析

此分析使用相应浓缩和稀释的原发隔离群89.6在36小时内进行，以保证在感染2天之后能检测到2％感染的CD4T淋巴细胞。

二十五微升不同稀释的Mabs 515H7、c515H7和301aE5在37℃下与25μl病毒孵育1小时。人PBMC(25μl)以20x10⁶细胞/ml加入到96孔板(U底，Costar 3599)中的Mab/病毒混合物并在RPMI 1640 10％ FCS和20U/ml IL-2(R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)中培养36小时。

在培养2天后，以病毒p24抗原的细胞内染色来检测HIV感染的淋巴细胞。根据厂商建议使用Cytofix/Cytoperm和Perm/Wash试剂盒(BD Biosciences)固定细胞并使其渗透，并以加入在Perm/Wash溶液中1/160稀释使用的荧光抗p24Mab(FITC-或PE-抗p24，克隆KC57；Beckman Coulter/Immunotech，海厄利亚，佛罗里达州)在4℃染色15分钟。在含有3％FBS的PBS中洗涤后，于流式细胞仪分析(LSRII；BD Biosciences)以DIVA软件(BD Biosciences)分析之前，在300μl PBS中稀释PBMC。通过以前向和侧向散射参数鉴定的活细胞群中设门20,000个物质来确定不同样品中的p24阳性细胞的百分数。用活/死溶液试剂盒(Invitrogen)分析活细胞亚群。在减去模拟病毒感染的细胞中的背景物质后得到p24抗原阳性值。

如图10和11所示，抗CXCR4 Mabs 515H7、c515H7和301aE5能抑制HIV-189.6原发隔离群在PBMC中的复制。在表10中总结(以μg/ml表示的)ICs的结果。

表10

实施例9：以抗CXCR4 Mab c515H7与抗CCR5分子马拉维诺相结合抑制HIV-1原发隔离群89.6和UG93067(双向性X4/R5病毒)在人PBMC中的复制

中和分析，分析HIV原发隔离群在原代PBMC上的多轮复制

此分析(将系列稀释的c515H7Mab或马拉维诺或两者的组合与系列稀释的病毒结合)分析了PBMC(外周血单核细胞)上的多轮感染。简单讲，在预水化96孔过滤板(1.25μm孔径，Durapor DV；Millipore，莫尔塞姆，法国)中，4份25μl分装的(两倍)系列稀释的c515H7Mabs或马拉维诺或两者组合的每一个与系列稀释的病毒孵育。在含稀释的c515H7Mab或马拉维诺或两者组合的滴定的同样平板上进行病毒的对照滴定(25μl RPMI代替稀释的c515H7Mabs或马拉维诺)。在37℃下1小时之后，加入4x10⁶细胞/ml浓度的25μl PHA刺激的PBMC(来自五名健康供体的PHA活化PBMC的集合)以实现75μl终培养体积的RPMI、10％胎牛血清(FCS)和每毫升20IU的白介素2(IL-2)(R&DSystem)。在37℃下24小时之后，加入100μl同样的培养基。在第4天以过滤进行两次洗涤(每次200μl RPMI)以去除c515H7Mabs和马拉维诺，并加入200μl新鲜培养基。在第7天，以ELISA测定培养上清中p24的存在并与阴性对照(以稀释病毒感染并维持在10^-6M齐多夫定【AZT】中的培养物)的相比以确定阳性孔。使用一式四份孔来确定每个稀释的c515H7Mabs或马拉维诺或两者组合不存在(V₀)和存在(Vn)时的病毒滴度(50％组织培养感染剂量【TCID₅₀】)。中和滴度被定义为导致病毒滴度降低90％(Vn/V₀＝0.1)的c515H7Mabs或马拉维诺或两者组合的稀释。

如图12所示，c515H7Mabs以IC₉₀为2μg/ml抑制双向性X4R5病毒89.6复制(图12)。50μg/ml马拉维诺未达到IC₉₀抑制活性(图12)。而且，向抗体515H7中加入2μg/ml马拉维诺增强了c515H7Mabs的抑制活性，其IC₉₀为0.2μg/ml(图12)。

使用不同稀释的两个分子和另一双向性病毒UG93067评估了c515H7Mabs和马拉维诺组合的有益效果。如图13所示，Mabs c515H7和马拉维诺的抑制活性类似。这些结果表明病毒UG93067使用CCR5或CXCR4受体的能力是同等的。使用UG93067病毒能证实更好的活性，只有这些X4抑制剂(c515H7Mabs)和R5抑制剂(马拉维诺)的组合(每种10μg/ml)使得病毒滴度降低90％(图13)。

实施例10：抗CXCR4嵌合Mab c515H7的生产

设计嵌合形式的小鼠515H7Mab：它对应于相关小鼠抗体的轻链和重链可变区，遗传上融合于人Cκ和IgG1/IgG2/IgG4恒定区。通过使用HEK293/EBNA系统和pCEP4表达载体(InVitrogen，US)瞬时转染来生产重组Mab。

在上述说明书中描述了各自的氨基酸和核苷酸序列。而且，如上表3公开IgG2和4同型序列(IgG4是优选同型)，在此还提及了IgG1同型重链序列即c515H7VH(G1wt)(其对应于氨基酸序列SEQ ID No.80和核苷酸序列SEQ IDNo.81)。

以全局基因合成(Genecust，卢森堡)合成对应于515H7Mab轻链和重链可变区的整个核苷酸序列。将其亚克隆到携带人IgG1/IgG2/IgG4免疫球蛋白轻链【Cκ】或重链【CH1-铰链-CH2-CH3】恒定区的整个编码序列的pCEP4载体(InVitrogen，美国)中。根据实验指南(Sambrook和Russel，2001)所述的传统分子生物学技术或根据供应商指示来进行所有克隆步骤。每个基因构建体经大染料终端循环测序试剂盒(Big Dye terminator cycle sequencing kit，AppliedBiosystems，美国)以核苷酸测序充分验证，并使用3100遗传分析仪(AppliedBiosystems，美国)分析。

在定轨摇床(110rpm转速)上、在添加6mM谷氨酰胺的50ml无血清培养基Excell 293(SAFC Biosciences)中常规生长悬浮适应的HEK293EBNA细胞(InVitrogen，美国)于250ml摇瓶中。使用在水中制备的终浓度1mg/ml的线性25kDa聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)与质粒DNA(终浓度为1.25μg/ml，重链与轻链质粒比例为1∶1)混合，以2.10⁶细胞/ml进行瞬时转染。在转染后4小时，以一体积新鲜培养基稀释培养物以实现终细胞密度为10⁶细胞/ml。基于细胞存活力和Mab生产监测培养过程。一般来讲，维持培养4到5天。使用蛋白质A树脂(GE Healthcare，美国)上的传统层析法纯化Mab。以适合于功能评估的水平生产Mab。生产水平通常为纯化Mab在6至15mg/l之间。

实施例11：以FACS分析鉴定抗CXCR4嵌合Mab c515H7的结合特异性

在此实验中，以FACS分析检查抗CXCR4嵌合Mab c515H7对人CXCR4的特异结合。

NIH3T3-hCXCR4转染细胞与剂量范围自0μg/ml至10μg/ml的单克隆抗体c515H7孵育。然后以1％BSA/PBS/0.01％NaN3洗涤细胞。接下来，向细胞中加入Alexa-标记的二抗并使其在4℃孵育20分钟。然后再洗涤细胞两次。在第二次洗涤后，进行FACS分析。图15提供了此结合研究结果，显示抗CXCR4嵌合Mab c515H7特异性结合于人CXCR4-NIH3T3转染细胞系。在NIH3T3野生型细胞中未检测到结合(数据未显示)。

实施例12：以生物荧光共振能量转移(BRET)法检测c515H7Mab对于CXCR4同源二聚体的效果

此功能性分析容许评价SDF-1和/或c515H7Mab结合于CXCR4受体诱导的CXCR4同源二聚体水平的构象变化。

通过使用传统分子生物学技术，将用于调研相互作用配偶体的表达载体构建为带有相应染料(海肾荧光素酶，Rluc和黄色荧光蛋白，YFP)的融合蛋白质。在进行BRET实验前两天，以编码相应BRET配偶体：【CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP】的表达载体瞬时转染HEK293细胞以研究CXCR4同源二聚体化。一天后，在多聚赖氨酸预包被的白色96MW平板上分散细胞于完全培养基【添加有10％FBS的DMEM】。首先在37℃下、以5％CO₂培养细胞以保证细胞粘附于平板。然后以200μl DMEM/孔过夜饥饿细胞。在紧接BRET实验前，去除DMEM并以PBS快速洗涤细胞。然后在37℃下、在有或没有抗体的PBS中孵育细胞10分钟，然后加入终体积50μl的5μM coelenterazine H(含或不含100nM SDF-1)。在37℃下再孵育10分钟之后，使用Mithras LB940多标记阅读仪(Berthold)起始485nm和530nm的光发射获取(在室温下1秒/波长/孔，重复15次)。

如前所述进行BRET比例的计算(Angers等，2000)：【(发光值530nm)-(发光值485nm)XCf】/(发光值485nm)，这里对于同样实验条件下只表达Rluc融合蛋白质的细胞Cf＝(发光值530nm)/(发光值485nm)。简化此方程显示BRET比例对应于两种BRET配偶体存在时获得的530/485nm比例(以分析中只有融合于Rluc的配偶体存在时、在同样实验条件下获得的530/485nm比例纠正)。为便于可读性，结果表示成milliBRET单位(mBU)；mBU对应于BRET比例乘以1000。

SDF1(100nM)增加了大约10％的供体和(融合于CXCR4受体的)受体蛋白质空间接近性导致的BRET信号，可能表明CXCR4/CXCR4同源二聚体形成或预先存在的二聚体的构象变化(图16)。Mab c515H7能够调节SDF-1诱导的CXCR4同源二聚体的构象变化(抑制SDF-1诱导BRET增高的96％，图16)。Mab c515H7也能自身调节CXCR4/CXCR4空间接近性，表明此Mab对于CXCR4/CXCR4同源二聚体构象的影响(图16)。

实施例13：使用表达CD4和CXCR4或CCR5的GFP转导人骨肉瘤细胞(GHOST)体外评估Mab 515H7抗HIV-1活性。

为了确定CXCR4 515H7 Mab的特异性，使用表达CD4和CXCR4或CCR5的GHOST细胞评估此Mab的抗HIV-1活性。

在48小时内，使用X4HIV-1LAI病毒(与表达CXCR4的Ghost细胞)或R5 HIV-1BaL病毒(与表达CCR5的Ghost细胞)进行此分析。于添加有10％FCS的Dulbecco培养基中，铺被500μl Ghost细胞(2.510⁵细胞/ml)24小时。在37℃下孵育不同稀释的Mab 515H71小时，并且随后向细胞中加入稀释的HIV-1LAI病毒(1/10)和HIV-1BaL病毒(1/7)48小时。细胞经受胰蛋白酶消化并以1X PBS洗涤。在黑暗中、+4℃下加入300μL 1.5％多聚甲醛到细胞沉淀2小时，以固定细胞并灭活病毒。以流式细胞仪分析GFP阳性细胞并计算HIV-1感染的抑制。

感染细胞的抑制百分数被定义为与无Mab的对照感染孔相比较。表11中总结了ICs结果(以μg/ml为单位)，抗CXCR4Mab 515H7能够抑制HIV-1X4Lai病毒在CXCR4表达Ghost细胞中的感染，然而在抑制HIV-1R5BaL病毒在CCR5表达的Ghost细胞中的感染中完全没有活性。

表11

实施例14：515H7抗CXCR4小鼠抗体的人源化和所述h515H7片段的生成

一般步骤

通过应用CDR嫁接的整体规则进行515H7抗CXCR4抗体的人源化。通过应用IMGT唯一编号方案及IMGT文库和工具(Lefranc，1997-www.imgt.org)进行CDR和框架(FR)区域的免疫遗传分析和定义。

在稳定转染人CXCR4的NIH3T3细胞系上确定515H7人源化变体的结合。以和生物素化小鼠抗体竞争的分析来评估结合活性。在第二次尝试中，评估人源化抗体抑制生物素化SDF-1与RAMOS细胞结合的能力。选择RAMOS细胞，因为其高表达CXCR4和低表达CXCR7和SDF-1。

用这些分析来鉴定抗CXCR4抗体的重组人源化版本。可变区与人IgG1/k恒定区格式化并被克隆至哺乳动物表达载体pCEP。在HEK293细胞中瞬时表达重组IgG1/κ-衍生的抗体。过滤表达培养上清并使用蛋白质A琼脂糖纯化抗体。在PBS中重新缓冲纯化的抗体并以ELISA确定抗体浓度。

以使用特异于人源化抗体可变区的寡核苷酸的PCR生成重组抗体片段并亚克隆这些片段于大肠杆菌系统。以固定化金属离子亲和层析(IMAC)进行抗体片段的纯化。

-515H7可变区的人源化

图17和18中阐述了重链和轻链可变区的不同序列比对。

在第一系列的实验中，分析了三个首先人源化变体的抗CXCR4结合活性。VH可变区1(VH1)和小鼠VL组合，并且评估了这些构建体抑制生物素化小鼠515H7亲本抗体结合的能力。VH1可变区的氨基酸序列包括SEQ ID No.90而核苷酸序列包括SEQ ID No.91。全长VH1氨基酸序列包括SEQ ID No.92而核苷酸序列包括SEQ ID No.93。此构建体显示与嵌合抗体类似的与小鼠抗体竞争的能力(图19A)。这表明多数人类VH可变区具有与嵌合抗体相同的结合能力。因此，VH1与VL变体2相结合(图19B)。

在进一步实验中，确定抗体515H7的人源化变体是否抑制SDF-1与CXCR4表达细胞的结合(图20)。通过在流式细胞仪中检测生物素化SDF-1评估hz515H7人源化变体的抑制能力。人源化抗体hz515H7 VH1 D76N VL2具有和嵌合c515H7类似的抑制SDF-1结合的能力。

还检验了人源化变体hz515H7 VH1 VL2的抗体片段，并且确定所述抗体片段能够完全抑制SDF-1的结合(图20)。

实施例15：以FACS分析鉴定抗CXCR4人源化Mabs 515H7结合特异性

在此实验中，以FACS分析检查抗CXCR4人源化Mabs 515H7对于人CXCR4的特异性结合。

在黑暗中，在4℃、100μl Facs缓冲液中将NIH3T3、hCXCR4转染的NIH3T3与0到10μg/mL人源化Mabs 515H7(hz515H7 VH1 D76N VL2，hz515H7 VH1 D76N VL2.1，hz515H7 VH1 D76N VL2.2，hz515H7 VH1 D76NVL2.3)孵育20分钟。在Facs缓冲液洗涤三次后，在黑暗中，在4℃将细胞与二抗(山羊抗人Alexa 488，1/500稀释)孵育20分钟。在Facs缓冲液中洗涤三次后，在每孔加入碘化丙啶并以Facs仅分析存活细胞。评价至少5000个活细胞以评估每个条件下的荧光强度平均值。

图21中显示【以FACS获得的平均荧光强度(MFI)】，提供了这些结合研究的结果，抗CXCR4人源化Mabs hz515H7特异性结合于人CXCR4-NIH3T3转染细胞系(NIH3T3亲本细胞的MFI＝2.2)。

实施例16：以生物荧光共振能量转移(BRET)法检测hz515H7Mab对于CXCR4同源二聚体的效果

此功能性分析容许评价SDF-1和/或hz515H7 VH1 D76N VL2、hz515H7 VH1D76N VL2.1、hz515H7 VH1 D76N VL2.2、hz515H7 VH1 D76N VL2.3结合于CXCR4受体诱导的CXCR4同源二聚体水平的构象变化。

如前所述进行BRET比例的计算(Angers等，2000)：【(发光值530nm)-(发光值485nm)X Cf】/(发光值485nm)，这里对于同样实验条件下只表达Rluc融合蛋白质的细胞Cf＝(发光值530nm)/(发光值485nm)。简化此方程显示BRET比例对应于两种BRET配偶体存在时获得的530/485nm比例(以分析中只有融合于Rluc的配偶体存在时、在同样实验条件下获得的530/485nm比例纠正)。为便于可读性，结果表示成milliBRET单位(mBU)；mBU对应于BRET比例乘以1000。

SDF1(100nM)增加大约12％的得自于供体和(融合于CXCR4受体的)受体蛋白质空间接近性的BRET信号，可能表明CXCR4/CXCR4同源二聚体形成或预先存在的二聚体的构象变化(图22)。

515H7人源化Mabs能够调节SDF-1诱导的CXCR4同源二聚体的构象变化，对于hz515H7 VH1D76N-VL2 Mab来讲(SDF-1)诱导的BRET上升的抑制百分数约为88％，hz515H7 VH1D76N-VL2.1Mab为65％，hz515H7 VH1D76N-VL2.2Mab为33％而hz515H7 VH1D76N-VL2.3Mab为21％(图22)。

Claims

1.一个分离的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于：它包括至少一个互补决定区CDR，其选自包括IMGT编号系统所定义的氨基酸序列SEQ ID No.1至6和30至33的CDR。

2.根据权利要求1所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于：它包括一条轻链，其包括分别包括氨基酸序列SEQ ID No.1、2和3的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和一条重链，其包括分别包括氨基酸序列SEQ IDNo.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。

3.根据权利要求2所述的抗体、或衍生的化合物、或其功能片段，其特征在于：它包括包括氨基酸序列SEQ ID No.7的轻链和包括氨基酸序列SEQ ID No.8的重链。

4.根据权利要求2所述的抗体、或衍生的化合物、或其功能片段，其特征在于：它是嵌合抗体，而且它包括选自SEQ ID No.56、57或58的重链序列，及轻链序列SEQ ID No.59。

5.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：它是人源化抗体，而且它包括由SEQ ID No.64组成的重链可变区序列，及选自SEQ ID No.65、66、82或83的轻链可变区序列。

6.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：它是人源化抗体，而且它包括人源化抗体、或衍生的化合物或其功能性片段，其包括选自SEQ ID No.67、68或69的重链序列，及选自SEQ ID No.70、71、84或85的轻链序列。

7.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述功能性片段由片段Fv、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fab’、scFv-Fc、双特异性抗体、或其半衰期由于化学修饰而增长的任意片段组成。

8.根据权利要求7所述的抗体，其特征在于：它是包括氨基酸序列SEQ IDNo.54的scFv。

9.根据权利要求1所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于：它包括一条轻链，其包括分别包括氨基酸序列SEQ ID No.1、2和30的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和一条重链，其包括分别包括氨基酸序列SEQ IDNo.31、32和33的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。

10.根据权利要求9所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于：它包括一条包括氨基酸序列SEQ ID No.34的轻链和一条包括氨基酸序列SEQ ID No.35的重链。

11.一条分离的核酸，其特征在于它选自下列核酸：

a)如权利要求1至10中所述的一条核酸，DNA或RNA，其编码一个抗体或其功能性片段或衍生物的一个；

b)一条包括DNA序列的核酸，该DNA序列选自由SEQ ID No.14至19和41至45组成的CDR序列；

c)一条包括DNA序列的核酸，该DNA序列选自由SEQ ID No.20、21、46、47、72、73、74、86和87组成的重链和轻链可变区序列；

d)一条包括DNA序列的核酸，该DNA序列选自由SEQ ID No.60至63、75至79、88和89组成的重链和轻链序列；

e)一条包括由SEQ ID No.55组成的DNA序列的核酸；

f)如b)、c)、d)或e)中所限定的核酸的相应RNA核酸；

g)如a)、b)、c)、d)和e)中所限定的核酸的互补核酸；及

h)一条至少18个核苷酸的核酸，其能够在高严谨度条件下与SEQ ID No.14至19和41至45序列的CDR至少一个杂交。

12.一个载体，其包括如权利要求11所要求的核酸。

13.一个宿主细胞，其包括如权利要求12所要求的载体。

14.一个除人以外的转基因动物，其包括至少一个以权利要求12所要求的载体转化的细胞。

15.一种用于生产如权利要求1至10的任一个所要求的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个的方法，其特征在于它包括下列步骤：

a)在培养基中及合适的培养条件下培养如权利要求13所要求的细胞；及

b)从起始培养基或所述培养细胞回收所述抗体、或其功能性片段或衍生物的一个。

16.以权利要求15所要求的方法可获得的或已获得的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个。

17.作为药剂的根据权利要求1至10和16所述的抗体。

18.根据权利要求1至10或16至17所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于：它抑制HIV-1KON原发隔离群在PBMC中的复制，其IC₉₀为至少5μg/ml，优选至少10μg/ml。

19.一种组合物，其包括由如权利要求1至10和16至18的任一项所要求的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个组成的化合物作为活性成分。

20.作为药剂的如权利要求19所要求的组合物。

21.根据权利要求19和20所要求的组合物，用于预防或用于治疗HIV感染。

22.根据权利要求21所要求的组合物，特征在于所述HIV感染是X4向性HIV感染。

23.根据权利要求21所要求的组合物，特征在于所述HIV感染是X4/R5向性HIV感染。

24.根据权利要求19至23所述的组合物，其特征在于：它包括至少第二个抗HIV化合物，该化合物选自能特异性抑制HIV进入和/或复制的化合物。

25.根据权利要求24所述的组合物，其特征在于：所述至少第二个抗HIV化合物选自抗逆转录病毒药物如HIV蛋白酶抑制剂(PI)、核苷/核苷酸HIV逆转录酶抑制剂(NRTI/NtRTI)、非核苷HIV逆转录酶抑制剂(NNRTI)、HIV进入抑制剂、HIV整合酶抑制剂。

26.根据权利要求24或25所述的组合物，其特征在于所述至少第二个抗HIV化合物是马拉维诺。

27.用于筛选和/或鉴定作为CXCR4拮抗剂抗病毒试剂的分子的方法，包括步骤：

a)选择表达CXCR4的细胞，

b)孵育所述细胞和权利要求1至10或16至18所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，及

c)评估检验的分子对于抗体、或其功能性片段或衍生物的一个和CXCR4之间结合的潜在抑制，及

d)选择能够产生所述抑制的分子。