MXPA06000252A

MXPA06000252A - Anticuerpos y usos de los mismos.

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Publication number: MXPA06000252A
Application number: MXPA06000252A
Authority: MX
Inventors: Daniel Plaksin; Avigdor Levanon; Esther Szanton; Yocheved Hagay; Rachel Ben-Levy; Yael Nisgav; Yariv Kanfi
Original assignee: Bio Technology General Israel
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2006-12-15
Also published as: WO2005010153A2; EP1649001A2; JP2007528711A; BRPI0411945A; AU2004259406A1; IL172510A0; KR20060106631A; CN101300021A; WO2005010153A3; RU2006102570A; CA2536644A1

Abstract

La presente invencion proporciona anticuerpos o fragmentos ellos que se unen a celulas de cancer y es importante en fenomenos fisiologicos, tales como arrollamiento de celulas y metastasis. Tambien se proporcionan metodos terapeuticos y de diagnostico y composiciones que usan esos fragmentos de anticuerpo. Los metodos y composiciones de acuedo con la presente invencion pueden usarse en agentes terapeuticos blanco y en el diagnostico, pronostico y determinacion de fases y terapia para enfermedades tales como cancer, que incluyen crecimiento de tumor y metastasis, leucemia, enfermedad autoinmune, y enfermedad inflamatoria. Tambien se proporciona una biblioteca de dominios de union a inmunoglobulina que tienen un dominio de union de antigenos diverso para la union complementaria, en donde la biblioteca tiene diversidad solamente en CDR3 de cadena pesada.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Anticuerpos , Presentación de Fago y Tejido Blanco El blanco selectivo de tejido de los agentes terapéuticos es una disciplina en surgimiento en la industria farmacéutica. Se han diseñado nuevos tratamientos para el cáncer basados en la colocación de blanco para aumentar la especificidad y la potencia del tratamiento mientras reduce la toxicidad, mejorando asi la eficacia general. Los anticuerpos monoclonales de ratón (MAb) de antigenos asociados con el tumor se han empleado en un intento de tener una toxina, radionucleótido, y conjugados qumioterapéuticos blanco a tumores. Además, se han explotado antigenos de diferenciación, tales como CD19, CD20, CD22 y CD25, como blancos específicos del cáncer en el tratamiento de enfermedades hematopoyéticas .

Aunque se ha estudiado ampliamente, este enfoque tiene varias limitaciones. Una de las limitaciones es la dificultad de asilar MAb apropiados que presentan la unión selectiva. Una segunda limitación es la necesidad de una alta inmunogenicidad del anticuerpo como un prerrequisito para el aislamiento exitoso del anticuerpo. Una tercera limitación es que el producto final tiene secuencias no humanas, que inducen respuesta inmunes, por ejemplo cuando un MAb de ratón se administra a un humano, se genera una respuesta de anticuerpo antiratón humana (HAMA) . La respuesta HAMA con frecuencia deriva en una hemivida del suero más corta e impide tratamientos repetitivos, disminuyendo asi el valor terapéutico del anticuerpo. Esta última limitación tiene interés estimulado tanto en crear anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados de origen murino como en descubrir anticuerpos humanos. Otra limitación de este enfoque es que permite el aislamiento de solamente una especie de anticuerpo dirigida contra solamente antigenos conocidos y purificados. Además, este método no es selectivo siempre que permita el aislamiento de anticuerpos contra marcadores de la superficie celular que están presentes en células normales asi como malignas.

Existen muchos factores que influyen en la eficacia terapéutica de los MAb para tratar el cáncer. Estos factores incluyen la especificidad y el nivel de expresión del antigeno en las células de tumor, heterogeneidad antigénica y accesibilidad de la masa de tumor. Las leucemias y los linfornas han sido generalmente más sensibles al tratamiento con anticuerpos que los tumores sólidos, tales como carcinomas. Los MAb se unen rápidamente a células de leucemia y linfoma en el torrente sanguíneo y penetran fácilmente las células malignas en el tejido linfático, haciendo a los tumores linfoides excelentes candidatos para la terapia basada en MAb. Un sistema ideal consiste en identificar un MAb que reconoce un marcador en la superficie celular de células madre que producen células de progenie maligna.

Se usan bibliotecas de fago para seleccionar fragmentos de variantes de una sola cadena aleatoria (scFv) que se unen a proteínas blanco predeterminadas aisladas tales como anticuerpos, hormonas y receptores. Además, el uso de bibliotecas de presentación de anticuerpos en general, y bibliotecas de scFv de fago en particular, facilita un medio alternativo de descubrir moléculas únicas para hacer blanco específico, aún no reconocido y no determinado, en grupos de la superficie celular.

Leucemia, linfoma y mieloma son cánceres que se originan en la médula ósea y en los tejidos linfáticos y participan en el crecimiento incontrolado de las células . La leucemia linfoblástica aguda (ALL) es una enfermedad heterogénea definida por características clínicas e inmunológicas específicas. Como otras formas de la ALL, la causa definitiva de la mayor parte de los casos de ALL de las células B (B-ALL) se desconoce; aunque, en muchos casos, la enfermedad deriva de alteraciones genéticas adquiridas en el ADN del una sola célula, que producen anormalidades y multiplicación continua. El pronóstico para pacientes afectados por B-ALL es significativamente peor que para pacientes con otras leucemias, tanto en niños como en adultos. La leucemia linfocitica crónica (CLL) es una forma de progreso lento de la leucemia, caracterizada por un número aumentado de linfocitos . La leucemia mielógena aguda (AML) es un grupo heterogéneo de neoplasmas que tienen una célula progenitora que, en condiciones normales, da origen a células diferenciadas en los extremos de la serie mieloide (eritrocitos, granulocitos, monocitos y plaquetas) . Como en otras formas de neoplasia, la AML está asociada con alteraciones genéticas adquiridas que derivan en el reemplazo de células mieloides diferenciadas normalmente con blastos relativamente indiferenciados , que presentan uno o más tipos de diferenciación mieloide temprana. La AML generalmente evoluciona en la médula ósea y, en menor medida, en los órganos hematopoyéticos secundarios . La AML afecta principalmente a los adultos y tiene picos de incidencia entre las edades de 15-40, pero también se sabe que afecta tanto a niños como a adultos mayores . Casi todos los pacientes con AML requieren tratamiento inmediatamente después del diagnóstico para lograr la remisión clínica, en donde no hay evidencia de niveles anormales de células de blastos indiferenciadas en circulación.

Hasta la fecha, se ha desarrollado una variedad de MAb que inducen la actividad citolítica contra células de tumor. El MAb murino muMab4D5 producido contra el dominio extracelular de HER2 (P185) y que se halló que inhibe notablemente la proliferación de las células de tumor humanas que sobreexpresan HER2 se humanizó para producir la droga HERCEPTIN® (trastuzumab) , aprobada por la FDA (Administración de Drogas y Alimentos) y se está usando para tratar el cáncer de mamas humano (Patentes Estadounidenses N° 5.821.337 y 5.720.1954). Después de la unión, el anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento de células de tumor que depende del receptor de factor de crecimiento de HER2. Además, un anticuerpo quimérico contra DC20, Rituxan® (rituximab) , que produce el agotamiento rápido de células B periféricas, que incluyen aquellas asociadas con linfoma, fue aprobado recientemente por la FDA (Patente Estadounidense N° 5.1843.439). La unión de este anticuerpo a células blanco deriva en la lisis que depende del complemento. Este producto se ha aprobado recientemente y se está usando actualmente en la medicina clínica para tratar el linfoma no de Hodgkin de células B de bajo nivel.

Se están desarrollando o están en ensayo clínico otros varios anticuerpos humanizados y quiméricos. Además, una inmunoglobulina humanizada (Ig) que reacciona específicamente con el antígeno CD33, expresada tanto en células mieloides normales como en la mayor parte de los tipos de células leucémicas mieloides, se conjugó a la droga anticáncer caliqueamicina, CMA-676 (Sievers et al, Blood Supp. 308: 504a (1997)). Este conjugado, denominado droga MYLOTARG®, ha tenido recientemente la aprobación de la FDA (Carón et al, Cáncer Supp. 73: 1049-56 (1994)). En vista de su actividad citolíotica, un anticuerpo anti-CD33 adicional (HumM195) , actualmente en ensayos clínicos, se conjugó a varios agentes citotóxicos, que incluyen gelonina toxina (McGraw et al, Cáncer Immunol. Inmmunother. 39: 367-74 (1994)) y radioisótopos 133I (Carón et al, Blood 83: 1760-68 (1994)), 99Y (Jurcic et al, Blood Supp. 92:613 a (1998)) y 213Bi (Humm et al, Blood Supplement 38: 231P (1997) ) .

Un anticuerpo quimérico contra el antígeno de leucocito CD45 (cHuLym3) está en estudios clínicos para el tratamiento de leucemia y linfoma humanos (Sun et al, Cáncer Immunol.

Immunother. 48: 1595-602 (2000)). En ensayos in vitro, se observó lisis de células específicas en ensayos de ADCC (Citotoxicidad mediada por Células que Depende del Anticuerpo) (Henkart, Immunlty 1: 343-46 (1994); Squier y Cohén, Current Opln. Immunol. 6: 4417-52 (1994) ) .

Se han creado anticuerpos terapéuticos para que tengan afinidad más alta a su blanco, que debe ser estable, y para la biodistribución óptima. Véase, por ejemplo, Presta, Current Pharma. Biotechnol., 3: 237-56 (2002); Presta et al, Biochem. Society Transactions, 30(4): 487-90 (2002).

A diferencia de la humanización monoclonal de ratón y de la construcción de anticuerpos quiméricos, el uso de la tecnología de presentación de fagos permite el aislamiento de scFv que tienen secuencias completamente humanas. ün anticuerpo completamente humano contra el receptor TGFa-2 humano basado en un clon de scFv derivado de la tecnología de presentación de fagos se desarrolló recientemente. Este scFv, que se convirtió en una IgG4 completamente humana capaz de competir con la unión de TGFa-2 (Thompson et al, J. Immunol. Meth. L2217 : 17-29 (1999)), tiene fuerte actividad proliferativa . La tecnología de presentación de fagos, conocida para un experto en el arte, se describe más específicamente en las siguientes publicaciones: Smith, Science 228: 1315 (1985); Scott et al, Science 249: 386-90 (1990); Cwirla et al, PNAS 87: 6378-82 (1990); Devlin et al, Science 249: 1404-06 (1990); Griffiths et al, EMBO J. 13(14): 3245-60 (1994); Bass et al, Proteins 8: 309-14 (1990); McCafferty et al, Nature 348: 552-54 (1990); Nissim et al, EMBO J. 13: 692-98 (1994); Patentes Estadounidenses N° 5.427.908, 5.432.018, 5.223.409 y 5.403.1114184.

Ligando para Moléculas de Anticuerpos scFv Aisladas Las plaquetas, fibrinógenos, GPIb, selectinas, y PSGL-1 (Ligando 1 de P-Selectina Glicoproteina) juegan cada un papel importante en varias condiciones patogénicas o estados de enfermedad, tales como inflamación anormal o patogénica, reacciones inmunes anormales o patogénicas, reacciones autoinmunes, metástasis, adhesión anormal o patogénica, trombosis y/o restenosis, y agregación anormal o patogénica. Por lo tanto, los anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con las plaquetas y con estas moléculas serian útiles en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades y trastornos que involucran a éstas y otras condiciones patogénicas.

Plaquetas Las plaquetas son componentes bien caracterizados del sistema sanguíneo y juegan varios papeles importantes en la hemostasis, trombosis y/o restenosis. La lesión de los vasos sanguíneos pone en movimiento un proceso denominado hemostasis, que se caracteriza por una serie de eventos secuenciales . La reacción inicial a los vasos sanguíneos lesionados es la adhesión de las plaquetas a la región afectada sobre la superficie interior del vaso. El paso siguiente es la agregación de muchas capas de plaquetas a las plaquetas adheridas previamente, formando un tapón y sellando la pared del vaso. El tapón hemostático se hace más resistente por la deposición de polímeros de fibrina. El coágulo o tapón se degrada solamente cuando se ha reparado la lesión.

Las plaquetas circulantes son partículas citoplásmicas liberadas desde la periferia de megacariocitos . Las plaquetas cumplen una función importante en la hemostasis. Cuando ocurre una lesión vascular, las plaquetas se adhieren a las superficies del tejido lesionado y se unen unas a otras (cohesión) . Esta secuencia de eventos ocurre rápidamente, formando una masa sin estructura (generalmente denominada tapón de plaquetas o trombo) en el sitio de la lesión vascular. El fenómeno de cohesión, también llamado agregación, puede iniciarse in vitro con una variedad de sustancias, o agonistas, tales como colágeno, difosfato de adenosina (ADP) , epinefrina, serotonina, y ristocetina. La agregación es uno de los numerosos ensayos in vitro realizados como una medida de la función de las plaquetas .

Importancia de las Plaquetas en la Metástasis La metástasis de tumores es tal vez el factor más importante que limita la supervivencia de los pacientes con cáncer. Los datos acumulados indican que la capacidad de las células de tumores de interactuar con las plaquetas huésped representa uno de los determinantes indispensables de la metástasis (Oleksowicz, Trombosis Res. 79: 261-74 (1995)).

Se ha demostrado que la capacidad de las células de tumor de agregar plaquetas se correlaciona con el potencial de metástasis de las células de tumor y se ha mostrado que la inhibición de la agregación de plaquetas inducida por tumores se correlaciona con la supresión de la metástasis en modelos de roedores. Se ha demostrado que la interacción de células de tumor con las plaquetas involucra moléculas de adhesión a la membrana y secreción de agonistas. La expresión de glicoproteinas de plaquetas inmuno-relacionadas se ha identificado en lineas de células de tumor. Se ha demostrado que las glicoproteinas inmuno-relacionadas de plaquetas, GPIb, GPIIb/IIIa, GPIb/IX y la subunidad integrina ccv se expresan en la superficie de las lineas de células de tumor de mamas (Oleksowicz, (1995) , supra; Kaniyama et al, J.Lab. Clin. Med. 117 (3) : 209-17 (1991)).

Gasic et al (PNAS 61:46-52 (1968)) demostraron que la trombocitopenia inducida por anticuerpos redujo notablemente el número y el volumen de las metástasis producidas por adenocarcinoma de colon CT26, carcinoma de pulmón de Lewis, y melanoma B16 ( arpatkin et al, J. Clin. Invest. 81(4): 1012-19 (1988); Clezardin et al, Cáncer Res. 53(19): 4695-700 (1993)). Además, se descubrió que una sola cadena de polipéptido (60kd) se expresa en la membrana superficial de células HEL que está estrechamente relacionada con GPIb y corresponde a una subunidad GPIba O-glicosilada en forma incompleta o anormal (Kieffer et al, J. Biol. Chem. 261(34): 15854-62 (1986)).

Las plaquetas también participan en el proceso de metástasis. Cuando las células de cáncer metastásico entran en el torrente sanguíneo, se forman complejos multicelulares compuestos de plaquetas y leucocitos que recubren células de tumor. Estos complejos, que pueden denominarse microémbolos, ayudan a las células de tumor a evadir el sistema inmune. El recubrimiento de las células de tumor por las plaquetas requiere la expresión de P-selectina por las plaquetas.

Complejo de GPIb Cada paso en el proceso de la hemostasis requiere la presencia de receptores en la superficie de las plaquetas. Uno de los receptores que es importante en la hemostasis es el complejo de glicoproteína Ib-IX (también llamado CD42) . Este receptor media la adhesión (unión inicial) de las plaquetas a la pared del vaso sanguíneo en sitios de lesión uniendo el factor von Willebrand (vWF) en el subendotelio . También cumple funciones cruciales en otras dos funciones de las plaquetas importantes en la hemostasis : (a) la agregación de plaquetas inducida por alto corte en regiones de estenosis arterial y (b) la activación de plaquetas inducida por bajas concentraciones de trombxna.

El complejo de GPIb-IX es uno de los principales componentes de la superficie exterior de la membrana plasmática de las plaquetas. Este complejo de GPIb-IX comprende tres polipéptidos de conexión a la membrana: una cadena de de 130 kDa unida a disulfuro y una cadena de ß de 25 kDa de GPIb y una GPIX (22 kDa) asociada en forma no covalente. La totalidad de las subunidades se presentan en cantidades equimolares en la membrana de la plaqueta para la expresión de superficie celular eficiente y la función del complejo CD42, que indica que se requiere la unión correcta de las tres subunidades en un complejo para la expresión completa en la membrana plasmática. La cadena de a de GPIb comprende tres dominios estructurales distinguibles: (1) un dominio de péptido de extremo de N globular que contiene secuencias repetidas ricas en leucina y secuencias de flanco de enlace de Cys; (2) un dominio de macroglicopéptido similar a mucina altamente glicosilada; y (3) una región de extremo de C asociada a la membrana que contiene el puente de disulfuro a GPIba y secuencias transmembrana y citoplásmicas . Varias lineas de evidencia indican que vWF y el dominio que se une a trombina del complejo de GPIb-IX residen en una región globular que abarca aproximadamente 300 aminoácidos en el extremo de amino de GPIba. El complejo de GPIb-IX de plaqueta humana es un receptor clave de la membrana que media tanto la función como la reactividad de la plaqueta. El reconocimiento de vWF de unión subendotelial por GPIb permite que las plaquetas se adhieran a los vasos sanguíneos lesionados. Además, la unión de vWF a GPIba también induce la activación de las plaquetas, que puede involucrar la interacción de un dominio citoplásmico del GPIb-IX con el citoesqueleto o fosfolipasa A2. Además, GPIba contiene un sitio de unión de alta afinidad para a-tombina, que facilita la activación de las plaquetas mediante un mecanismo aún peor definido.

Selectinas y PSGL-1 Las P-, E- y L-Selectinas son miembros de una familia de moléculas de adhesión que, entre otras funciones, median el arrollamiento de los leucocitos sobre el endotelio vascular. P-Selectina se almacena como gránulos en plaquetas y se transporta a la superficie después de la activación por trombina, histamina, éster de forbol, u otras moléculas estimuladoras. P-Selectina también se expresa en células endoteliales activadas. E-Selectina se expresa en células endoteliales y L-Selectina se expresa en neutrófilos, monocitos, células T y células B.

PSGL-1 (también denominada CD162) es un ligando de mucina glicoproteina para P-Selectina, E-Selectina y L-Selectina que comparte la similitud estructural con GPIb (Afshar-Kharghan et al (2001) , supra) . PSGL-1 es un homodimero unido a disulfuro que tiene un sitio de ruptura de PACE (Enzimas que Convierten Aminoácidos Básicos Pares). La porción extracelular de PSGL-1 contiene tres sitios de glicosilación unidos a N y tiene numerosas ramificaciones de oligosacáridos unidos a O sialiladas, fucosiladas (Moore et al, J. Biol. Chem. 118: 445-56 (1992)). La mayor parte de los sitios de N-glican y muchos de los sitios de O-glican se ocupan. Las estructuras de los O-glican de PSGL-1 de células HL-60 humanas se han determinado. Los subconjuntos de estos O-glican son estructuras sialiladas y fucosiladas de núcleo 2 que se requieren para la unión a selectinas.

PSGL-1 tiene 361 residuos en células HL60, con una región extracelular de 267 residuos, una región trans-membrana de 25 residuos y una región intracelular de 69 residuos. PSGL-1 forma un homodimero o heterodimero enlazado a disulfuro en la superficie celular (Afshar-Kharghan et al, Blood 97: 3306-12 (2001) ) . La secuencia que codifica PSGL-1 está en un solo axón, de manera que no debería ser posible un empalme alternativo. Sin embargo, PSGL-1 en las células HL60 y en la mayor parte de las líneas de células, tiene 15 repeticiones consecutivas de una secuencia de consenso de 10 residuos presente en la región extracelular, aunque hay 14 y 16 repeticiones de esta secuencia en los leucocitos polimorfonucleares , monocitos, y otras varias líneas de células, que incluyen la mayor parte de los leucocitos nativos .

PSGL-1 se expresa en neutrófilos como un dímero, con pesos moleculares aparentes de 250 kDa y de 160 kDa, mientras que en HL60 la forma dimérica es de aproximadamente 220 kDa. Cuando se analiza en condiciones de reducción, cada subunidad se reduce la mitad. Las diferencias en la masa molecular se pueden deber a polimorfismos de la molécula causados por la presencia de números diferentes de repeticiones de decámeros (Leukocyte Typing VI. Editado por T. Kishimoto et al (1997)).

PSGL-1 se expresa también en la mayor parte de los leucocitos, tales como neutrófilos, monocitos, leucocitos, subconjuntos de células B, y todas las células T (Kishimoto et al (1997) , supra) . PSGL-1 media el arrollamiento de leucocitos en el endotelio activado, en plaquetas activadas, y en otros leucocitos y sitios inflamatorios y media el arrollamiento de neutrófilos en P-Selectina. PSGL-1 también puede mediar interacciones de neutrófilo-neutrófilo a través de la unión con L-Selectina, mediando asi la inflamación (Snapp et al, Blood 91(1): 154-64 (1998)).

El arrollamiento de leucocitos es importante en la inflamación, y la interacción entre P-Selectina (expresada por el endotelio activado y en las plaquetas, que puede inmovilizarse en sitios de lesión) y PSGL-1 es instrumental para atar y arrollar leucocitos en las paredes de los vasos (Ramachandran et al, PNAS 98(18): 10166-71 (2001); Afshar- harghan et al (2001), supra). El arrollamiento celular también es importante en la metástasis y se cree que P- y E-Selectina en las células endoteliales se une a las células metastásicas , facilitando así la extravasación desde el torrente sanguíneo en los tejidos circundantes.

Por lo tanto, se ha hallado PSGL-1 en todos los leucocitos: neutrófilos, monocitos, linfocitos, células T periféricas activadas, granulocitos , eosinófilos, plaquetas y en algunas células madre positivas CD34 y en ciertos subconjuntos de células B. P-Selectina se expresa selectivamente en plaquetas activadas y células endoteliales . La interacción entre P-Selectina y PSGL-1 promueve el arrollamiento de leucocitos en las paredes de los vasos, y la acumulación anormal de leucocitos en sitios vasculares deriva en diferentes inflamaciones patológicas. Las contribuciones estéreo-especificas de sulfatos de tirosina individuales en PSGL-1 son importantes para la unión de P-Selectina a PSGL-1. La carga también es importante para la unión: la reducción de NaCl (de 150 a 50 rtiM) mejoró la unión (Kd 75 n ) . La sulfatación de tirosina en PSGL-1 mejora, pero no se requiere finalmente para la adhesión de PSGL-1 en P-Selectina. La sulfatación de tirosina de PSGL-1 soporta la adhesión de arrollamiento más lenta a todas las velocidades de corte y soporta la adhesión de arrollamiento a velocidades de corte mucho más altas (Rodgers et al, Biophys. J. 81: 2001-09 (2001)). Además, se ha sugerido que la expresión de PSGL-1 en las plaquetas es 25-100 veces menor que aquella de los leucocitos (Frenette et al, J. Exp. Med. 191(8): 1413-22 (2001)).

Se generó un anticuerpo monoclonal comercialmente disponible para PSGL-1 humano, KPLl y se mostró que inhibe las interacciones entre PSGL-1 y P-Selectina y entre PSGL-1 y L-selectina. El epítope de KPLl se mapeó a la región de sulfatación de tirosina de PSGL-1 (YEYLDYD) (SEQ ID N°:l) (Snapp et al, Blood 91(1) :154-64 (1998) ) .

El pretratamiento de células de tumor con O-sialoglicoproteasa, que remueve ligandos de mucina sialilados, fucosilados, también inhibió la formación del complejo de célula de tumor-plaqueta. Los experimentos in vivo indican que cualquiera de estos tratamientos deriva en una mayor asociación de monocitos con células de tumor circulantes, lo cual sugiere que la reducción de la unión de plaquetas aumenta el acceso por células inmunes a las células de tumor circulantes (Varki y Varki, Bras . J. Biol.. 34 (6) : 1711-17 (2001) ) .

Fibrinógeno Existen dos formas de fibrinógeno normal: (?) normal y ? prima, cada una de las cuales se halla en individuos normales. El fibrinógeno normal, que es la forma más abundante (aproximadamente un 90% del fibrinógeno total que está en el cuerpo) , está compuesto de dos cadenas de ß de 55 kDa idénticas, dos cadenas de ß de 95 kDa idénticas y dos cadenas de ? de 49,5 kDa idénticas. La variante normal del fibrinógeno, que es la forma menos abundante (aproximadamente un 10% del fibrinógeno que está en el cuerpo) , está compuesto de dos cadenas de ß de 55 kDa idénticas, dos cadenas de ß de 95 kDa idénticas, una cadena de ? de 49,5 kDa y una variante de la cadena de ? prima de 50,5 kDa. Las cadenas de gamma y gamma prima son codificadas ambas por el mismo gen, con un empalme alternativo que ocurre en el extremo de 3' . La cadena de gamma normal está compuesta de los aminoácidos 1-411 y la variante normal de la cadena de gamma prima está compuesta de 427 aminoácidos, de los cuales los aminoácidos 1-407 son los mismos que aquellos de la cadena gamma normal y los aminoácidos 408-427 son VRPEHPAETEYDSLYPEDDL (SEQ ID N° 2) . Esta región normalmente se ocupa con moléculas de trombina.

El fibrinógeno se convierte en fibrina mediante la acción de trombina en la presencia de calcio ionizado para producir la coagulación de la sangre. La fibrina también es un componente de los trombos, y exudados inflamatorios agudos.

Sulfatación de Proteínas La sulfatación de proteínas es una modificación post-traducción amplia que consiste en la unión covalente enzimática de sulfato, a cadenas laterales de azúcar o a la cadena principal de polipéptido. Esta modificación ocurre en el compartimiento trans-Golgi. Las proteínas sulfatadas incluyen proteínas secretoras, proteínas con gránulos blanco, y las regiones extracelulares de proteínas de la membrana plasmática. Tirosina es un residuo de aminoácido que actualmente se sabe que sufre sulfatación. Kehoe et al, Chem. Biol. 7: R57-61 (2000). Otros aminoácidos, por ejemplo treonina, también pueden sufrir sulfatación, particularmente en células enfermas.

Con respecto a GPIb, el dominio globular del extremo de N de carga negativa de GPIb contiene tres residuos de tirosina que se sabe que sufren sulfatación. GPIba (CD42) , expresado por plaquetas y megacariocitos y que media la unión de las plaquetas y el arrollamiento en el subendotelio a través de la unión con vWF, también contiene un grupo de aminoácidos de carga negativa entre Asp-269 y Asp-287. Se piensa que ese medio altamente ácido e hidrófilo es un prerrequisito para la sulfatación, porque la tirosilproteína . sulfotransferasa reconoce específicamente y sulfata tirosinas adyacentes a los residuos de aminoácidos (Bundgaard et al, J. Biol. Chem. 272:21700-05 (1997)). La sulfatación completa de la región ácida de GPIba da una región con una densidad de carga negativa notable, 13 cargas negativas dentro de un tramo de 19 aminoácidos, que lo hace un sitio candidato para la interacción electrostática con otras proteínas. Varias líneas de evidencia indican que, en células CHO transfectadas que expresan el . complejo GPIb-IX y en GPIbcc de plaqueta, los tres residuos de tirosina contenidos en este dominio (Tyr-276, Tyr-278 y Tyr-279) sufren sulfatación.

Con respecto a PSGL-1 esta proteína tiene tres sitios de sulfatación potenciales (en cada uno de los tres residuos de tirosina en el dominio del extremo de N de la molécula) seguidos por 10-16 repeticiones de decámero que tienen alto contenido de prolina, serina y treonina.

Se sabe que la sulfatación de PSGL-1 es relevante para la unión de P-selectina, y las contribuciones estéreo-específicas de sulfatos de tirosina individuales en PSGL-1 son importantes para la unión de P-selectina a PSGL-1. Hay muchos indicios, sin embargo, de que la sulfatación de solamente un residuo de tirosina es suficiente para la unión a P-selectina. [J. Biol. Chem. , Volumen 273, 12, 7078-87). La sulfatación de tirosina de PSGL-1 soporta adhesión de arrollamiento a todos los índices de corte y soporta la adhesión de arrollamiento a índices de corte mucho más altos (Rodgers et al, Biophys . J. 81: 2001-09 (2001)).

También se piensa que las tirosinas del extremo de N sulfatadas influyen en la función de los receptores de CC-quimiocina, tales como CCR5, que sirven como coreceptores con el receptor de siete segmentos transmembrnna relacionado (7TMS) para la entrada de virus de inmunodeficiencia humana y de simio (HIV-1, HIV-2, y SIV) en células blanco. Por ejemplo, se piensa que las tirosinas del extremo de N sulfatadas contribuyen a la unión de CCR5 a los complejos de MIP-la, MIP-?ß y HIV-1 gpl20/CD4 y a la capacidad del HIV-1 de entrar en las células que expresan CCR5 y CD4. CXCR4, otro coreceptor de HIV-1 importante, también se sulfata (Farzan et al, Cell 196(5): 1667-76 (1999)). La sulfatación de tirosinas cumple una función menos significativa en la entrada del HIV-1 que depende de CXCR4 que en la entrada que depende de CCR5; por lo tanto se demuestra una posible función de la sulfatación de tirosina en la familia de XCC-quimiocina y se califica más bajo una diferencia general en la utilización de HIV-1 de CCR5 y CXCR4 (Farzan et al, J. Biol.. Chem. 277(33): 219, 484-89 (2002) ) .

Se identificaron anticuerpos que se unen a PSGL-1 y/O GPIb usando una biblioteca de fagos que se revelan en las solicitudes de Patente estadounidenses N° 10/032.41213; 10/032.1037; 10/029.1988; 10/029.1926; 09/1751.1181; 10/189.032 y 60/258.948 y en las Solicitudes de patente internacionales N° PCT/ÜS01/49.442 y PCT/üSOl/49.440. Ejemplos específicos de anticuerpos revelados en estas solicitudes de patente incluyen anticuerpos Yl, Y17 y L32. Estos anticuerpos se aislaron de la línea de gérmenes (DP32) y se descubrió que se unen específicamente a un epítope, hallado en proteínas de las células hematopoyéticas , que se sulfatan en la tirosina del extremo de N y se piensa que están involucradas en la migración celular, por ejemplo, la metástasis de tumores.

Los epítopes sulfatados identificados previamente como unidos a Y1/Y17/L32 se caracterizan por la presencia de grupos sulfatados, tales como residuos de tirosina sulfatada o grupos carbohidrato o lípido sulfatado, preferentemente dentro de lun grupo de dos o más aminoácidos ácidos, que están en ligandos y receptores que cumplen funciones importantes en diversos procesos tales como inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, adhesión, trombosis y/o restesnosis, arrollamiento celular, ly agregación. Esos epítopes también se hallan en células enfermas, tales como células de T-ALL, células de B-CLL, células de AML, células de mieloma múltiple y células metastásicas .

Estos epitopes son blancos útiles para la mediación terapéutica de estos procesos (asi como agentes blanco) ly para procedimientos de diagnóstico.

Objeti os Un objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos y polipéptidos que se unen a epitopes que están presentes en diferentes moléculas instrumentales en procesos tales como arrollamiento de células, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, y entrada de HIV.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar anticuerpos y polipéptidos que se unen a epitopes que participan en procesos tales como adhesión, trombosis y/o restenosis y agregación de plaquetas y que se pueden usar para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares tales como infarto de miocardio, y restenosis, y para el tratamiento de enfermedades inflamatorias .

También es un objetivo de esta invención utilizar anticuerpos y polipéptidos en métodos para diagnosticar, pronosticar, o determinar fases de diferentes estados de enfermedad de un individuo, tales como por ejemplo AML, T-ALL, leucemia b, B-CLL, Pre-B-CLL, mieloma múltiple, metástasis, infección de HIV, enfermedades cardiovasculares, u otras enfermedades en las cuales funciones o acciones celulares tales como arrollamiento de células, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, cumplen una función significativa. Además, estos anticuerpos de la presente invención pueden usarse como el agente blanco para dirigir un compuesto terapéutico a una célula o sitio especifico.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos de tratamiento para diferentes estados de enfermedad tales como, por ejemplo, AML, T-ALL, leucemia B, B-CLL, Pre-B-ALL, mieloma múltiple, metástasis, infección de HIV, enfermedades cardiovasculares, u otras enfermedades en las cuales funciones o acciones celulares tales como arrollamiento de células, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, cumplen una función significativa. Y otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método de purgar células de tumores.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar anticuerpos y polipéptidos para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diferentes estados de enfermedad tales como por ejemplo, AML, T-ALL, leucemia B, B-CLL, Pre-B-ALL, mieloma múltiple, metástasis, infección de HIV, enfermedades cardiovasculares que incluyen lesión por reperfusión y aterosclerosis, u otras enfermedades en las cuales funciones o acciones celulares tales como' arrollamiento de células, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, cumplen una función significativa.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar anticuerpos y polipéptidos, que estimulan células T, células NK y/o estimulan la citotoxicidad y/o apóptosis que depende del anticuerpo.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar polipéptidos, vectores de expresión y células huésped recombinantes que expresan anticuerpos que están involucradas en procesos tales como arrollamiento de células, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, entrada de HIV, adhesión, trombosis restenosis y agregación de plaquetas .

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una biblioteca de dominios de unión de inmunoglobulina, lque son específicamente moléculas de scFv. Éstos y otros objetivos de la invención se dan aquí.

EXTRACTO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un anticuerpo y un polipéptido que comprende una secuencia de consenso: ?1-?2-?3-?1?-?5-?6 (SEQ ID N° 3) , en donde Xi y X5 son aminoácidos hidrófobos, y X2, X3 y X5 son cualquier aminoácido, en donde X2 es preferentemente un aminoácido básico, y en donde la secuencia de consenso está dispuesta desde el extremo de N al extremo de C o desde el extremo de C al extremo de N. La secuencia de consenso está preferentemente dentro de las regiones hipervariables del anticuerpo y más preferentemente dentro de la región de CDR3. Preferentemente, la secuencia de consenso excluye una región de CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID N° 4. La presente invención además proporciona un anticuerpo y polipéptido que tienen las capacidades de unión de un anticuerpo de scFv de SEQ ID N° 5 o SEQ ID N° 6.

La presente invención además proporciona un proceso para producir un anticuerpo o un polipéptido que comprende los pasos de proporcionar una biblioteca de presentación de fago, proporcionar un péptido de la SEQ ID N° 7 que se une a un anticuerpo o polipéptido que tiene las capacidades de unión de un fragmento de anticuerpo de scFv de SEQ ID N°4, panear la biblioteca de presentación de fago para un fragmento de anticuerpo de scFv que se une al péptido de la SEQ ID N° 7, y producir un anticuerpo o polipéptido que comprende el fragmento de anticuerpo de scFv que se une al polipéptido de la SEQ ID N° 7.

La presente invención también proporciona una biblioteca de dominios de unión a inmunoglobulina, específicamente moléculas de scFv, que comprende un dominio que se une a diversos antigenos para la unión complementaria, en donde la biblioteca tiene diversidad solamente en la cadena pesada CDR3.

La presente invención también comprende composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención. Estas composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratar, diagnosticar, pronosticar o determinar fases de diferentes condiciones que incluyen condiciones relacionadas con o que involucran arrollamiento de células, inflamación, enfermedad autoinmune, agregación de plaquetas, restenosis, infección de HIV, metástasis, crecimiento y/o replicación de células de tumor y crecimiento y/o replicación de células de leucemia. Estas composiciones pueden usarse para inhibir el arrollamiento de células, inhibir la inflamación, inhibir la enfermedad autoinmune, inhibir la agregación de plaquetas, inhibir la restenosis, inhibir la infección de HIV, inhibir la metástasis, inhibir el crecimiento y/o la replicación de células de tumor, aumentar la mortalidad de células de tumor, inhibir el crecimiento y/o la replicación de células de leucemia, aumentar el índice de mortalidad de células de leucemia, alterar la susceptibilidad de las células enfermas al daño por agentes antienfermedad, aumentar la susceptibilidad de células de tumor al daño por agentes anticáncer, aumentar la susceptibilidad de células de leucemia al daño por agentes antileucemia, ainhibir ela umento en el número de células de tumor en un paciente que tiene un tumor, reducir el número de células de tumor en un paciente que tiene cáncer, inhibir el aumento en el número de células de leucemia en un paciente que tiene leucemia, y reducir el número de células de leucemia en un paciente que tiene leucemia .

La presente invención además proporciona un método de fabricar un medicamento para el tratamiento de diferentes estados de enfermedad tales como, por ejemplo, A L, T-ALL, leucemia B, células de B-CLL, Pre-B-ALL, mieloma múltiple, metástasis, infección de HIV, enfermedades cardiovasculares, u otras enfermedades en las cuales funciones o acciones celulares tales como arrollamiento de células, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, cumplen una función significativa.

La presente invención también proporciona un método de diagnosticar, pronosticar o determinar fases de una enfermedad en un paciente proporcionando una muestra que contiene una célula del paciente y determinar si los anticuerpos o polipéptidos de la presente invención se unen a la célula del paciente, indicando asi que el paciente está en riesgo o tiene la enfermedad.

La presente invención también proporciona un método de purgar células de tumor de un paciente proporcionando una muestra que contiene células del paciente e incubar las células del paciente con un anticuerpo o polipéptido de la presente invención.

DEFINICIONES Los anticuerpos (Abs), o inmunoglobulinas (Igs), son moléculas de proteínas que se unen a un antígeno. Cada unidad de unión funcional de anticuerpos naturales está compuesta de unidades de cuatro cadenas de polipéptido (dos pesadas y dos livianas) unidas por enlaces de disulfuro. Cada una de las cadenas tiene una región constante y variable. Los anticuerpos naturales pueden dividirse en varias clases que incluyen IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, basado en su componente de cadena pesada. La clase IgG comprende varias subclases que incluyen, en forma no limitada, IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. Las inmunoglobulinas se producen in vivo con linfocitos B, y cada una de esas moléculas reconoce un determinante antigénico extraño particular y facilita el aclaramiento de ese antigeno.

Los anticuerpos pueden producirse y usarse en muchas formas, que incluyen complejos de anticuerpos. Como se usa aqui, el término "complejo de anticuerpo" o "complejos de anticuerpos" se usa para indicar un complejo de uno o más anticuerpos con otro anticuerpo o con un fragmento o fragmentos de anticuerpo, o un complejo de dos o más fragmentos de anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fv, Fab, F(ab, )2r Fe y Fd. En consecuencia, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende un complejo de un anticuerpo o un fragmento de él.

Como se utiliza aqui en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, un Fv se define como una molécula que está compuesta de una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo humano y una región variable de una cadena liviana de un anticuerpo humano, que puede ser el mismo o diferente, y en donde la región variable de la cadena pesada se conecta, une, fusiona o une en forma covalente o se asocia con la región variable de la cadena liviana. El Fv puede ser un Fv de una sola cadena (scFv) o un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv) . Un scFv está compuesto de los dominios variables de cada una de las cadenas pesadas y livianas de un anticuerpo, unidos por un separador de polipéptido de aminoácido flexible o un ligador. El ligador puede ser ramificado o no ramificado. Preferentemente, el ligador tiene 0-15 residuos de aminoácidos, y más preferentemente el ligador es (Gly4Ser)3 (SEQ ID N° 8).

La molécula de Fv, en si misma, está compuesta de una primera cadena y una segunda cadena, cada cadena tiene una primera, segunda y tercera región ipervariable . Los bucles hipervariables dentro de los dominios variables de las cadenas livianas y pesadas se denominan Regiones Determinantes Complementarias (CDR) . Existen las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cada una de las cadenas pesadas y livianas. Se cree que estas regiones forman el sitio de unión de antigeno y pueden modificarse específicamente para dar la actividad de unión mejorada. La más variable de estas regiones es la región CDR3 de la cadena pesada. Se entiende que la región CDR3 es la región más expuesta de la molécula de Ig y, como se muestra y se proporciona aquí, es el sitio principalmente responsable de las características de unión selectivas y/o específicas observadas. ün fragmento de una molécula de Fv se define como toda molécula más pequeña que el Fv original que aún mantiene las características de unión selectiva y/o específica del Fv original. Ejemplos de esos fragmentos incluyen en forma no taxativa (1) un minicuerpo, que comprende un fragmento de la cadena pesada solamente del Fv, (2) un microcuerpo, que comprende una unidad fraccionada pequeña de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (Solicitud Internacional N° PCT/IL99/00581) , (3) cuerpos similares que tienen un fragmento de la cadena liviana, y (4) cuerpos similares que tienen una unidad funcional de una región variable de cadena liviana.

Como se usa aquí, el término "fragmento Fab" es un fragmento de unión de antígeno monovalente de una inmunoglobulina . Un fragmento Fab está compuesto de la cadena liviana y parte de la cadena pesada. ün fragmento F(ab')2 es un fragmento de unión de antígeno bivalente de una inmunoglobulina obtenido mediante digestión de pepsina. Contiene tanto cadenas livianas como parte de ambas cadenas pesadas.

Un fragmento Fe es una porción que no se une a un antígeno de una inmunoglobulina. Contiene la porción del extremo de carboxi de cadenas pesadas y los sitios de unión para el receptor de Fe.

Un fragmento Fd es la región variable y la primera región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina .

Los anticuerpos policlonales son el producto de una respuesta inmune y están formados por numerosos linfocitos B diferentes. Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una célula B clonal.

Los aminoácidos hidrófobos son generalmente valina (V) , isoleucina (I), leucina (L) , metionina (M) , fenilalanina (F) , triptofan (W) , cisteina (C) , alanina (A) , tirosina (Y) , treonina (T) , serina (S) , prolina (P) y glicina (G) . los aminoácidos básicos son generalmente arginina, histidina y lisina.

Un cassette, aplicado a polipéptidos y definido en la presente invención, se refiere a una secuencia dada de aminoácidos consecutivos que sirve como un marco y se considera una sola unidad y se manipula como tal. Los aminoácidos se pueden reemplazar, insertar, remover o unir a uno o ambos extremos. En forma similar, los tramos de aminoácidos se pueden reemplazar, insertar, remover o unir a uno o ambos extremos.

El término "epitope" se usa aquí para indicar el determinante antigénico o sitio de reconocimiento o sitio de antigeno que interactúa con un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, complejo de anticuerpo o un complejo que tiene un fragmento de unión de él o receptor de célula T. El término epitope se usa en forma indistinta aquí con los términos ligando, dominio, y región de unión .

Selectividad aquí se define como la capacidad de una molécula blanco para elegir y unir una entidad o estado celular de una mezcla de entidades o estados de entidad, todas las entidades o estados de entidad pueden ser especificas para la molécula blanco.

El término "afinidad" como se usa aqui es una medida de la resistencia de la unión (constante de asociación) entre una molécula de unión (por ejemplo, un sitio de unión en un anticuerpo) y un ligando (por ejemplo, determinante antigénico) . La resistencia de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de antigeno en un anticuerpo y un solo epitope es la afinidad del anticuerpo para ese epitope. Los anticuerpos de baja afinidad se unen al antigeno débilmente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que loa anticuerpos de alta afinidad se unen al antigeno más apretadamente y permanecen unidos más tiempo. El término "avidez" difiere de afinidad, porque el primero refleja la valencia de la interacción antigeno-anticuerpo .

Especificidad de la interacción anticuerpo-antigeno: Aunque la reacción de antigeno-anticuerpo es especifica, en algunos casos los anticuerpos producidos por un antigeno pueden reaccionar en forma cruzada con otro antigeno no relacionado. Esas reacciones cruzadas ocurren si dos antigenos diferentes comparten una estructura homologa o similar, epitope o una región de anclaje de ella, o si los anticuerpos específicos para un epitope se unen a un epitope no relacionado que posee una conformación de estructura o propiedades químicas similares.

Una plaqueta es un fragmento citoplásmico similar a un disco de un megacariocito que se esparce en el seno de la médula y posteriormente circula en el torrente sanguíneo periférico. Las plaquetas tienen varias funciones fisiológicas que incluyen la función principal en la formación de coágulos. Una plaqueta contiene gránulos ubicados en el centro y protoplasma claro periférico, pero no tiene ningún núcleo definido.

La aglutinación como se usa aquí significa el proceso mediante el cual se hace que bacterias, células, discos u otras partículas suspendidas de tamaño similar se adhieran y formen masas. El proceso es similar a la precipitación pero las partículas son de mayor tamaño y están en suspensión en lugar estar en solución.

El término agregación significa una aglutinación de plaquetas inducida in vitro, y trombina y colágeno, como parte de un mecanismo secuencial que deriva en la formación de un trombo o tapón hemostático.

La sustitución de aminoácidos conservadores se define como un cambio en la composición del aminoácido cambiando uno o dos aminoácidos de un péptido, polipéptido o proteína, o un fragmento de ellos. La sustitución es de aminoácidos con propiedades generalmente similares (por ejemplo, ácidos, básicos, aromáticos, tamaño, de carga positiva o negativa, polaridad, no polaridad) de manera tal que las sustituciones no alteran sustancialmente las características del péptido, polipéptido o proteína (por ejemplo, carga, punto isoeléctrico, afinidad, avidez, conformación, solubilidad) o su actividad. Sustituciones típicas que pueden realizarse para esa sustitución de aminoácidos conservadora pueden estar entre los grupos de aminoácidos siguientes: Glicina (G) , alanina (A) , valina (V) , leucina (L) e isoleucina (I) Acido aspártico (D) y ácido glutámico (E) Alanina (A), serina (S) y treonina (T) Histidina (H) , lisina (K) y arginina (R) Asparagina (N) y glutamina (Q) Fenilalanina (F) , tirosina (Y) y triptofan (W) Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden fabricarse, por ejemplo, en regiones que flanquean a las regiones hipervariables principalmente responsables de las características de unión selectivas y/o específicas de la molécula, así como otras partes de la molécula, por ejemplo un cassette de cadena pesada variable. En forma adicional o alternativa, la modificación puede lograrse reconstruyendo las moléculas para formar anticuerpos de tamaño completo, diacuerpos (dímeros) , triacuerpos (trímeros) , y/o tetracuerpos (tetrámeros) o para formar minicuerpos o microcuerpos .

Un promotor es una región del ADN en la cual la ARN polimerasa se une e inicia la transcripción.

Una biblioteca de presentación de fagos (también denominada biblioteca de péptidos/anticuerpos de fago, biblioteca de fagos, o biblioteca de péptidos/anticuerpos) comprende una población grande de fagos (108 o más), cada partícula de fago presenta una secuencia de péptido.

Una composición farmacéutica se refiere a una formulación que comprende un péptido o polipéptido de la invención y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable de él, o un complejo de anticuerpo-agente farmacéutico (anticuerpo-agente) y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable de él .

Un agente se refiere a un agente que es útil en el tratamiento de enfermedad activa, tratamiento profiláctico, o diagnóstico de un mamífero que incluye, en forma no taxativa, un humano, bovina, equino, porcino, murino, canino, felino, o cualquier otro animal de sangre caliente. El agente se selecciona del grupo de radioisótopo, toxina, oligonucleótido, proteina recombinante, fragmento de anticuerpo, agentes farmacéuticos, agentes anticáncer, agentes antileucémicos, agentes anti-metástasis, agentes antineoplásicos, agentes anti-enfermedad, agentes antiadhesión, agentes anti-trombosis, agentes anti-restenosis, agentes anti-autoinmune, agentes anti-agregación, agentes antibacterianos, agentes antivirales, y agentes antiinflamatorios. Otros ejemplos de esos agentes incluyen, en forma no taxativa, agentes antivirales que incluyen acyclovir, ganciclovir y zidovudina; agentes anti-trombosis/resteñosis que incluyen cilostazol, dalteparina de sodio, reviparina de sodio, y aspirina; agentes antiinflamatorios que incluyen zaltoprofeno, pranoprofeno, droxicam, acetil salicílico 17, diclofenac, ibuprofeno, dexibuprofeno, sulindac, naproxeno, amtolmetina, celecoxib, indometacina, rofecoxib, y nimesulid; agentes anti-autoinmune que incluyen leflunomida, denileucina, diftitox, subreo, WinRho SDF, defibrotida, y ciclofosfamida; y agentes anti-adhesión/anti-agregación que incluyen limaprost, clorcromeno y ácido hialurónico y derivados, combinaciones y modificaciones de ellos. ün agente antileucemia es un agente con actividad antileucemia. Por ejemplo, los agentes antileucemia incluyen agentes que inhiben o detienen el crecimiento de células leucémicas o preleucémicas inmaduras, agentes que eliminan células leucémicas o preleucémicas, agentes que aumentan la susceptibilidad de células leucémicas o preleucémicas a otros agentes antileucemia, y agentes que inhiben la metástasis de células leucémicas. En la presente invención, un agente antileucemia también puede ser un agente con actividad anti-angiogénica que previene, inhibe, retarda o detiene la vascularización de tumores.

El agente anticáncer es un agente con actividad anticáncer. Por ejemplo, los agentes anticéncer incluyen agentes que inhiben o detienen el crecimiento de células cancerosas o precancerosas inmaduaras, agentes que eliminan células cancerosas o precancerosas, agentes que aumentan la susceptibilidad de células cancerosas o precancerosas a otros agentes anticáncer, y agentes que inhiben la metástasis de células cancerosas. En la presente invención, un agente anticáncer también puede ser un agente con actividad antiangiogénica que previene, inhibe, retarda o detiene la vascularización de tumores.

El patrón de expresión de un gen puede estudiarse analizando la cantidad del producto gen producido en diferentes condiciones, en momentos específicos, en diferentes tejidos, etc. Un gen se considera que se "sobreexpresa" cuando la cantidad de producto gen es más alta que la que se halla en un control normal, por ejemplo un control no enfermo.

Una célula dada puede expresar en su superficie una proteína que tiene un sitio de unión (o epítope) para un anticuerpo dado, pero ese sitio de unión puede existir en una forma críptica (por ejemplo, se impide o bloquea esféricamente, o carece de las características necesarias para la unión por el anticuerpo) en la célula en un estado, que puede denominarse una primera fase (fase I) . La fase I puede ser, por ejemplo, un estado no enfermo, sano, normal. Cuando el epítope existe en forma críptica, no es reconocido por el anticuerpo dado, es decir, no existe ninguna unión del anticuerpo a este epítope o a la célula dada en la fase I. Sin embargo, el epítope puede exponerse por ejemplo, sufriendo él mismo modificaciones, o siendo desbloqueado porque las moléculas vecinas o asociadas s modifican o porque una región sufre un cambio de conformación. Ejemplos de modificaciones incluyen cambios en el plegado, cambios en modificaciones después de la traducción, cambios en la fosfolipidación, cambios en la sulfatación, cambios en la glicosilación, y similares. Esas modificaciones pueden ocurrir cuando la célula entra en un estado diferente, que puede denominarse una segunda fase (fase II) . Ejemplos de segundos estados, o fases, incluyen activación, proliferación, transformación, o en un estado maligno. Al ser modificado, el epitope puede entonces exponerse y el anticuerpo puede unirse.

Los péptido-miméticos (imitadores de péptidos) son moléculas que ya no contienen ningún enlace de péptido, es decir enlaces de amida, entre aminoácidos; sin embargo, en el contexto de la presente invención, el término péptido mimético incluye moléculas que ya no tienen carácter completamente péptido, tales como pseudo-péptidos, semi-péptidos y peptoides. Ya sean completa o parcialmente no péptidos, los péptidomiméticos de acuerdo con esta invención proporcionan una disposición espacial de grupos químicos reactivos que se asemeja estrechamente a la disposición tridimensional de grupos activos en el péptido en el cual se basa el péptidomimético . Estas moléculas incluyen moléculas pequeñas, lípidos, polisacáridos o conjugados de ellos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra los datos numéricos de ELISA de fago de clones seleccionados de acuerdo con la presente invención para analizar la unión a PSGL-1.

La Figura 2 ilustra datos numéricos de ELISA de scFv de clones seleccionados de acuerdo con la presente invención para analizar la unión a PSGL-1.

La Figura 3 ilustra datos numéricos del análisis FACS de scFv de clones seleccionados de acuerdo con la presente invención y L32 para analizar la unión a células ML-2 que expresan PSGL-1.

La Figura 4 ilustra datos numéricos de ELISA de scFv de clones seleccionados de acuerdo con la presente invención y L32 para analizar la unión a glicocalicina .

La Figura 5 ilustra datos de análisis FACS de scFv de clones seleccionados de acuerdo con la presente invención y L32 para analizar la unión a las plaquetas y granulocitos .

La Figura 6 muestra una comparación de la relación de unión de granulicito/plaqueta de clones seleccionados de acuerdo con la presente invención y L32.

La Figura 7 ilustra resultados que analizan la unión de S15 a células ML-2 en la presencia y ausencia de KPL-1.

La Figura 8 ilustra datos numéricos de análisis FACS c proporcionan una comparación de la unión de scFv purificados células ML-2 en PBS .

La Figura 9 ilustra datos numéricos de análisis FACS que proporcionan una comparación de la unión de scFv purificados a células ML-2 en PBS.

La Figura 10 ilustra datos numéricos de análisis FACS que proporcionan una comparación de la unión de scFv purificados a células ML-2 en 50% plasma.

La Figura 11 ilustra datos numéricos análisis FACS que proporcionan una comparación de la unión scFv purificados a células ML-2 en 50% plasma.

La Figura 12 ilustra un análisis FACS de la respuesta a la dosis de scFv purificados a células ML-2.

La Figura 13 ilustra la unión de clones de fago seleccionados a péptidos sulfatados de GPlb y PSGL-1.

La Figura 14 muestra la unión de scFv a glicocalicina .

La Figura 15 es un gráfico de la unión de diferentes scFv a concentraciones crecientes a plaquetas lavadas usando citometria de flujo.

La Figura 16 ilustra la unión de diferentes scFv a glicocalicina a través de un ensayo ELISA.

La Figura 17 ilustra el efecto de scFv A3R sobre la agregación de plaquetas inducida por ristocetina.

La Figura 18 ilustra el efecto de scFv de Yl, scFv de A3R y PBS control sobre la adhesión de plaquetas a poliestireno usando el ensayo de CPA.

La Figura 19 ilustra el nivel de scFv de A3R unido a plaquetas de conejillos de la India después de la inyección de bolo.

La Figura 20 ilustra la concentración plasmática de scFv de A3R en conejillos de la India después de la inyección de bolo.

La Figura 21 ilustra datos numéricos de la unión directa de scFv a péptidos basado en regiones sulfatadas de PSGL-1, GPIb Y CCR5. La Figura 22 ilustra ADCC inducida por IgG de S15 en muestras de pacientes con B-CLL.

La Figura 23 ilustra la participación de diferentes poblaciones de células efectoras en ADCC inducida por IgG de S15 en muestras de pacientes con B-CLL.

La Figura 24 ilustra la capacidad de IgG de S15 y rituximab para inducir la apóptosis en muestras de pacientes con 1B-CLL.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un anticuerpo o un fragmento de él que comprende una secuencia de consenso: X1-X2-X3-Pro-X5-X6 (SEQ ID N° 3) , en donde Xi y X6 son aminoácidos hidrófobos y X2, X3 y X5 son cualquier aminoácido, en donde X2 es preferentemente un aminoácido básico, y en donde la secuencia de consenso puede estar dispuesta desde el extremo de N al extremo de C o desde el extremo de C al extremo de N (ese anticuerpo se denomina aqui en anticuerpo de consenso) .

En una realización del anticuerpo de consenso de la presente invención, X2 se selecciona del grupo formado por arginina y lisina y Xi y X4 se seleccionan del grupo formado por leucina, valina, metionina, alanina, fenilalanina, e isoleucina. Preferentemente, el anticuerpo de consenso de esta realización comprende una secuencia de consenso que se selecciona del grupo formado por la SEQ ID N° 9 y SEQ ID N° 10. Más preferentemente, en esta realización, el anticuerpo de consenso comprende la SEQ ID N° 5 (la secuencia de CDR3 es la SEQ ID N° 9) y ese anticuerpo de consenso se denomina aqui S15. Alternativamente, el anticuerpo de consenso de esta realización más preferentemente es la SEQ ID N° 6 (la secuencia de CDR3 es la SEQ ID N° 10) y ese anticuerpo de consenso se denomina aqui A3R.

En otra realización del anticuerpo de consenso de la presente invención, X2 y X3 son arginina y el aminoácido hidrófobo X6 es preferentemente isoleucina. Preferentemente, el anticuerpo de consenso de esta otra realización comprende una secuencia de consenso que se selecciona del grupo formado por SEQ ID N° 9 y SEQ ID N° 10. Más preferentemente, el anticuerpo de consenso de esta otra realización es A3R y/o S15.

En otra realización del anticuerpo de consenso de la presente invención, ?? se selecciona del grupo formado por leucina y metionina, X2 y X3 son arginina, X5 se selecciona del grupo formado por serina y valina y ?ß isoleucina. Preferentemente, el anticuerpo de consenso de esta otra realización comprende una secuencia de consenso que se selecciona del grupo formado por SEQ ID N° 9 y SEQ ID N° 10.

En otra realización del anticuerpo de consenso de la presente invención, Xi es leucina, X2 se selecciona del grupo formado por un aminoácido básico y X6 se selecciona del grupo de aminoácidos hidrófobos. Los anticuerpos de consenso preferidos de esta realización comprenden anticuerpos de la serie D de SEQ ID N° 11 a SEQ ID N° 16. Más preferentemente, el anticuerpo de consenso de esta realización es Di (la región de CDR3 es la SEQ ID N° 14 y el scFv completo es la SEQ ID N° 55) o D3 (la región de CDR3 es la SEQ ID N° 13 y el scFv completo es la SEQ ID N° 56) .

El anticuerpo de consenso de la presente invención preferentemente se une en forma preferencial a un primer epitope en un segundo epitope, en donde al menos uno del primer y segundo epitope se sulfata. Ejemplos del primer y segundo epitope incluyen un epitope de PSGL-1 y un epitope de GPIb. Más preferentemente, el anticuerpo de consenso se une a epitopes de PSGL-1 y GPIb y preferentemente muestra la unión con afinidad más resistente a un epitope de PSGL-1 en un epitope de GPIb o la unión con afinidad más resistente a un epitope de GPIb en un epitope de PSGL-1. Alternativamente, el anticuerpo de consenso se une al primer y segundo epitopes (por ejemplo, PSGL-1 y GPIb) con afinidad similar. Ejemplos de anticuerpos adecuados que se unen a PSGL-1 y GPIb con afinidad similar incluyen Di y D3, el scFv completo o la región de CDR3.

En realizaciones donde el anticuerpo de consenso es A3R, preferentemente el anticuerpo de consenso se une a un epitope de GPIb sulfatado con afinidad más resistente que su unión a un epitope de PSGL-1 sulfatado. Específicamente, con respecto a una comparación de las propiedades de la unión de S15 y A3R a concentraciones similares, se ha descubierto que A3R se une a plaquetas de GPIb sanas con afinidad más resistente que S15. Se ha descubierto también que a concentraciones similares S15 se une a células sanguíneas enteras sanas (que contienen granulocitos, linfocitos, y monocitos que expresan PSGL-1) con afinidad más resistente que A3R.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a PSGL-1 sulfatado y/o GPIb sulfatado con una afinidad sustancialmente similar a aquella de S15 y preferentemente se une a PSGL-1 con una afinidad más resistente que a GPIb. Más preferentemente el anticuerpo se une al epitope de PSGL-1 sulfatado que se sulfata en el tercer residuo de tirosina del extremo de N en la posición 51. En otra realización, el anticuerpo de la presente invención se une específicamente a PSGL-1 sulfatado y/o a GPIb sulfatado con una afinidad sustancialmente similar a aquella de A3R y preferentemente se une a GPIb con una afinidad más resistente que a PSGL-1. Más preferentemente, el anticuerpo de esta realización se une a un epitope de GPIb sulfatado que se sulfata en el primer residuo de tirosina del extremo de N en posición 46. Alternativamente, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente al PSGL-1 sulfatado (preferentemente sulfatado en el tercer residuo de tirosina del extremo de N en Tyr-51) y a GPIb sulfatado (preferentemente sulfatado en la primera tirosina del extremo de N en Tyr-276) con una afinidad sustancialmente similar a aquella de DI y/o D3.

Como resultado de la diferencia en la afinidad de los diferentes anticuerpos de la presente invención (por ejemplo, S15 ly A3R) a PSGL-1 y GPIb sulfatado y porque estos dos anticuerpos difieren en las posiciones Xi y X5 de la secuencia de consenso, Xi y 5 de la secuencia de consenso del anticuerpo de consenso de la presente invención pueden contribuir a la unión del anticuerpo de consenso a sitios de sulfatación de tirosina. Por consiguiente, los aminoácidos de las posiciones de ?? y X5 de la secuencia de consenso pueden seleccionarse específicamente según el epítope sulfatado particular es el blanco para la unión. En otras palabras, las posiciones ?? y X5 pueden alterarse para adaptar un anticuerpo para unirse específicamente a un epítope sulfatado. Además, como S15 preferentemente se une al epítope de PSGL-1 que comprende la modificación del sulfato en la tercera tirosina del extremo de N y A3R preferentemente se une a un epítope de GPIb que tiene una modificación de sulfato en la primera tirosina del extremo de N (si bien DI y D3 se unen a PSGL-1 y a A3R igualmente) , Xi y X5 de la secuencia de consenso pueden ser relevantes para la unión de S15 y A3R a la tercera y primera tirosina sulfatada de PSGL-1 y GPIb, respectivamente.

Los anticuerpos que se unen a PSGL-1 y/o GPIb se identificaron usando una biblioteca de presentación de fagos y se revelaron en las Solicitudes de patente estadounidenses N° 10/032.423; 10/032.037; 10/029.988; 10/029.926; 09/751.181; 10/189.032; y 60/258.948 y las Solicitudes Internacionales N° PCT/üSOl/49442 y PCT/üSOl/49440. Ejemplos específicos de anticuerpos revelados en estas solicitudes incluyen loa anticuerpos Yl, Y17 y L32. Estos anticuerpos se aislaron de la línea de gérmenes (DP32) y se descubrió que se unen específicamente a un epítope, hallado en proteínas de las células hematopoyéticas, que se sulfata en la tirosina de extremo de N y se piensa que participa en la migración de células, por ejemplo la metástasis de tumor.

Los epítopes sulfatdos que se unen a Y1/Y17/L32 se caracterizan por la presencia de grupos sulfatados, tales como residuos de tirosina sulfatados o grupos carbohidrato o lípido sulfatados, preferentemente dentro de un grupo de dos o más aminoácidos ácidos, que se hallan en ligandos y receptores que cumplen importantes funciones en diversos procesos tales como inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, adhesión, trombosis y/o restenosis, arrollamiento de células, y agregación. Esos epítopes también se hallan en células enfermas, tales como células de T-ALL, células de B-CLL, células de AML, células de mieloma múltiple, y células metastásicas .

Los anticuerpos de consenso de la presente invención, que se aislaron de la familia DP32, se unen a proteínas que tienen epítopes de tirosina sulfatada. Esas proteínas incluyen, en forma no taxativa, PSGL-1, GPIb, a-12-antiplasmina, aminopeptidasa B, receptores de CC quimiocina tales como CCR2, CCR5, CXLCR3, CXCR4, CCR8 y CCR2b, receptores de seite segmentos transmembrana (7TMS) , factores de coagulación tales como factor V, VIII y IX, cadena gamma de fibrinógeno, cofactor II de heparina, secretograninas tales como secretogranina II, vitronectina, precursor amiloide, -2-aminoplasmina, colecistocinina, a-cloriogonadotropina, complemento C4, demartan sulfatorproteoglican, fironectina, y castrina. En una realización preferida, el anticuerpo de consenso de la presente invención se une a receptores de CC quimiocina sulfatados tales como CCR5, CXCR4, y CCR2b. Las tirosinas sulfatadas pueden contribuir a la unión de CCR5 a ???-?a, ???ß y HIV-1 gpl20/CD4 y a la capacidad de HIV-1 de entrar en las células que expresan CCR5 y CD4.

Además, la unión de los anticuerpos de la presente invención puede depender de la fase de desarrollo de la célula (el subtipo de AML se clasifica basado en el sistema francés-estadounidense-británico usando la morfología observada en bajo procesamiento de rutina y manchado citoquímico) . Los anticuerpos pueden unirse a células de AML que son del subtipo M3 o superior, pero no células del subtipo M0 o MI . Además, los anticuerpos pueden o no unirse a células del subtipo M2. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invención muestran baja unión a la médula ósea sana, normal (por ejemplo, células CD34+) . Se piensa que esas diferencias están basadas en alteraciones en la expresión y/o sulfatación de PSGL-1, asi como posibles cambios de conformación en PSGL-1 que exponen un epitope ligeramente diferente.

En consecuencia, el anticuerpo de consenso puede no unirse a células indiferenciadas len la médula ósea tales como M0, Mi, M2 y M3. Se cree que PSGL-1, al cual se une el anticuerpo de consenso, no se expresa a niveles significativos o no se sulfata en estas células indiferenciadas . El anticuerpo de consenso de la presente invención puede también unirse a células de la médula ósea sansas (tales como células CD34+) .

En una realización más preferida, el anticuerpo de consenso de la presente invención se une a PSGL-1 sulfatado. El anticuerpo S15, en particular, presenta selectividad mejorada para PSGL-1 sulfatado. Si bien los glóbulos blancos involucrados en la inflamación, tales como monocitos, neutrófilos, y linfocitos, se reclutan principalmente con las cuatro moléculas de adhesión, PSGL-1, P-selectina, VLA-4, y VCAM-l en los procesos inflamatorios de enfermedades tales como aterosclerosis (Huo y Ley, Acta Physíol. Scand. , 173: 35-43 (2001); Libby, Sci. Am. May: 48-55 (2002); Wang et al, J. Am. Coll. Cardiol. 38: 577-582 (2001) ) . La interferencia del anticuerpo de consenso y particularmente S15, con cualquiera de las moléculas centrales sugiere una función potencial para el anticuerpo de consenso en la eliminación de enfermedades relacionadas.

Específicamente, P-selectina controla la unión y el arrollamiento de células. Además, las interacciones de P-selectina - PSGL-1 activan otras numerosas moléculas en células que están íntegramente conectadas con tumorigénesis (cuando se refiere a células malignas) y respuestas inflamatorias (cuando se refiere a glóbulos blancos) (Shebuski y ilgore, J. Pharmacol. Exp. Ther. 300: 729-735 (2002)). Basado en este entendimiento de la capacidad de P-selectina de regular los procesos celulares, es evidente que la selectividad de scFv sulfatado del anticuerpo de consenso ly S15 para PSGL-1 sulfatdo puede hacerlos una molécula superior para tratar una variedad de enfermedades malignas e inflamatorias. Además, los modelos de enfermedad maligna han mostrado que la unión de P-selectina a células malignas requiere la sulfatación de PSGL-1 (Ma y Geng, J. Immunol. 168: 1690-1696 (2002)). Este requerimiento es similar a aquel para la unión del anticuerpo de consenso y particularmente para la unión de S15. Por lo tanto, se puede esperar que el anticuerpo de consenso y particularmente S15 pueda anular la facilitación de P-selectina del progreso de la enfermedad maligna.

El anticuerpo de consenso de la presente invención, particularmente en realizaciones donde X2 y X3 son arginina, y Xe es isoleucina, y preferentemente A3R, también presenta selectividad mejorada para GPIb sulfatado. GPIb está involucrado en la agregación de plaquetas involucradas mediante alto corte en regiones de esetenosis arterial y activación de plaquetas inducida por bajas concentraciones de trombina. Basado en este entendimiento de GPIb, es evidente que la selectividad de scFv mejorada del anticuerpo de consenso y A3R para GPIb sulfatado puede hacerlo una molécula superior para tratar una variedad de enfermedades cardiovasculares e inflamatorias.

Preferentemente, el anticuerpo de consenso de la presente invención se une a un epitope presente en al menos un tipo de célula involucrado en la inflamación o tumorigénesis, que incluye células de T-ALL, células de AML, células de Pre-B-ALL, células de leucemia B, células de B-CLL, células de mieloma múltiple, células metastásicas . Más preferentemente, el anticuerpo de consenso de la presente invención puede unirse a epitopes en una molécula de lipido, carbohidrato, péptido, glicolipido, glicoproteina, lipoproteina, y/o polisacárido . Esos epitopes preferentemente tienen al menos un grupo sulfatado. Alternativamente, pero también preferentemente, el anticuerpo de consenso de la presente invención reacciona en forma cruzada con dos o más epitopes, cada epitope tiene uno o más residuos de tirosina sulfatada, y al menos un grupo de dos o más aminoácidos ácidos, uno de cuyos ejemplos es PSGL-1. Estos anticuerpos o fragmentos de ellos de la presente invención pueden internalizarse en células de AML, por ejemplo, después de la unión a PSGL-1. Esa internalización puede ocurrir a través de endocitosis y un proceso activo que depende del proceso, del tiempo y de la temperatura.

Las regiones hipervariables del anticuerpo de consenso y los anticuerpos son las que se unen con sustancialmente la misma afinidad que S15, A3ER, Si, Sil, DI y D3 de acuerdo con la presente invención que participan en la formación de los sitios de unión al antigeno. El sitio de unión al antígeno es complementario de la estructura de los epitopes a los cuales se unen los anticuerpos, en consecuencia estos sitios de unión se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR) . Existen tres CDR en cada cadena liviana y pesada de un anticuerpo (CDRl, CDR2 y CDR3) , cada una ubicada en los bucles que conectan las hebras ß de los dominios VH y VL. La más variable de estas regiones es la región CDR3 de la cadena pesada. Se entiende que la región CDR3 es la región más expuesta de la molécula de Ig y, como se establece aqui, tiene una función central en la determinación de las caracteristics de unión selectiva y/o especifica observadas.

DP32, que es una de las lineas germinales presentes en la biblioteca de presentación de fagos, es la linea germinal especifica de la biblioteca de fagos de la cual se aisla el anticuerpo de consenso de la presente invención. En consecuencia, DP32 proporciona los anticuerpos de la presente invención con al menos las regiones variables marco de cadenas pesadas y livianas, las regiones CDR1 de cadena liviana, CDR2 y CDR3 y/o CDR1 y CDR2 de cadena pesada. DP32 también proporciona una estructura tridimensional en la cual se conformaron las regiones hipervariables . Se sabe bien que la especificidad de un anticuerpo se determina por su conformación tridimensional. Por lo tanto, las limitaciones impuestas por DP32 pueden cumplir una función significativa en la determinación de la especificidad de los anticuerpos de la presente invención. Además, DP32 tiene diferentes aminoácidos cargados, que pueden cumplir una función estructural en el reconocimiento del antigeno de los anticuerpos.

De acuerdo con la presente invención, las CDR también pueden insertarse en cassettes para producir anticuerpos. Un cassette, aplicado a los polipéptidos y definido en la presente invención, se refiere a una secuencia dada de aminoácidos consecutivos que sirve como marco y se considera una sola unidad y se manipula como tal. Los aminoácidos pueden reemplazarse, insertarse, removerse, o unirse a uno o ambos extremos. En forma similar los tramos de aminoácidos se pueden reemplazar, insertar, remover o unir a uno o ambos extremos .

La secuencia de aminoácidos del cassette puede fijarse ostensiblemente, mientras que la secuencia reemplazada, insertada o unida puede ser altamente variable. El cassette puede estar compuesto de varios dominios, cada uno de los cuales abarca una función crucial para la construcción final.

El cassette de una realización particular de la presente invención comprende, desde el extremo de N, la región marco 1 (FR1), CDRl, la región marco 2 (FR2), CDR2, la región marco 3 (FR3) y la región marco 4 (FR4) .

En una realización de la invención, es posible reemplazar regiones distinguibles dentro del cassette. Por ejemplo, las regiones hipervariables CDR2 y CDR1 del cassette pueden reemplazarse o modificarse mediante sustituciones de aminoácidos no conservadoras o preferentemente conservadoras.

En la presente invención, el anticuerpo de consenso y los anticuerpos que se unen con sustancialmente la misma afinidad que A3R y S15, tienen una cadena pesada y una cadena liviana, y cada cadena tiene primera, segunda y tercera región hipervariable, que son las regiones CDR3, CDR2 y CDRl, respectivamente. La selectividad especificidad de la unión se determinan particularmente con la región CDR3 de una cadena, posiblemente con la región CDR3 de la cadena liviana y preferentemente con la región CDR3 de la cadena pesada, y en forma secundaria con las regiones CDR2 y CDRl de la cadena liviana y preferentemente de la cadena pesada. La selectividad y especificidad de la unión también puede verse influida secundariamente por las regiones superior o inferior que flanquean a la primera, segunda y/o tercera regiones hipervariables .

Preferentemente, la secuencia de consenso del anticuerpo de consenso está dentro de las regiones hipervariables del anticuerpos de consenso. En particular, la secuencia de consenso puede estar en la región CDR3, la región CDR2 o la región CDRl del anticuerpo de consenso. La totalidad o solamente una parte de la secuencia de consenso puede estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl. Por ejemplo, la secuencia de consenso puede superponerse con dos regiones hipervariables o puede estar parcialmente dentro de una o más regiones hipervariables y parcialmente dentro de otra parte de la región variable del anticuerpo de consenso. Preferentemente, la secuencia de consenso está en la región CDR3. También preferentemente, la secuencia de consenso excluye una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 4.

En particular, en una realización, el anticuerpo de consenso preferentemente incluye una o más secuencias de aminoácidos de SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18. En una realización alternativa, la secuencia de consenso preferentemente incluye una o más secuencias de aminoácidos de SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 17, y SEQ ID N° 18. Las secuencias de aminoácidos están preferentemente dentro de las regiones hipervariables del anticuerpo de consenso. En particular, las secuencias de aminoácido pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDR1 del anticuerpo de consenso. La totalidad o solamente una parte de las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl . Preferentemente, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 9 o SEQ ID N° 10 está en la región CDR3, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 17 está en la región CDR2 y la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 18 está en la región CDRl del anticuerpo de consenso.

La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen a PSGL-1 sulfatado y/o a GPIb sulfatado con sustancialmente la misma afinidad que S15, A3R, SI, Sil, DI y/o D3. En una realización, los anticuerpos se unen a PSGL-1 sulfatado y/o a GPIb sulfatado con sustancialmente la misma afinidad que S15 y en esta realización el anticuerpo preferentemente comprende uno o más de la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18. Preferentemente, estas secuencias de aminoácidos están en la región hipervariable del anticuerpo. En particular, las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, la región CDR2 o la región CDRl del anticuerpo. La totalidad o una parte de las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl. Preferentemente, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 9 está en la región CDR3, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 17 está en la región CDR2 y la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 18 está en la región CDRl del anticuerpo.

En otra realización, los anticuerpos de la presente invención se unen a PSGL-1 sulfatado y/o GPIb sulfatadol con sustancialmente la misma afinidad que A3R y en esta realización el anticuerpo preferentemente comprende una o más secuencias de aminoácido de SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 17, y SEQ ID N° 18. Preferentemente estas secuencias de aminoácidos están en la región hipervariable del anticuerpo. En particular, las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl del anticuerpo. La totalidad o una parte de las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl. Preferentemente, la secuencia de aminoácido de la SEQ ID N° 10 está en la región CDR3, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 17 está en la región CDR2 y la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 18 está en la región 1CDR1 del anticuerpo . En otra realización, los anticuerpos de la presente invención se unen a PSGL-1 sulfatado y/o a GPIb sulfatado con sustancialmente la misma afinidad que SI y en esta realización el anticuerpo preferentemente comprende una o más secuencias de aminoácido de SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18. Preferentemente, estas secuencias de aminoácidos están en la región hipervariable del anticuerpo. En particular, las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl del anticuerpo. La totalidad o una parte de las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl. Preferentemente, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 28 está en la región CDR3, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 17 está en la región CDR2 y la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 18 está en la región CDRl del anticuerpo.

En otra realización, los anticuerpos de la presente invención se unen a PSGL-1 sulfatado y/o a GPIb sulfatado con sustancialmente la misma afinidad que Sil y en esta realización el anticuerpo preferentemente comprende una o más secuencias de aminoácido de SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18. Preferentemente, estas secuencias de aminoácidos están en la región hipervariable del anticuerpo. En particular, las secuencias de aminoácido pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl del anticuerpo. La totalidad o una parte de las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 y en la región CDRl. Preferentemente, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 31 está en la región CDR3, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 17 está en la región CDR2 y la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 18 está en la región CDRl del anticuerpo.

En otra realización, los anticuerpos de la presente invención se unen a PSGL-1 sulfatado y/o a GPIb sulfatado con sustancialmente la misma afinidad que DI y en esta realización el anticuerpo preferentemente comprende una o más secuencias de aminoácido de SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18. Preferentemente, estas secuencias de aminoácido están en la región hipervariable del anticuerpo. En particular, las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, la región CDR2, o la región CDRl del anticuerpo. La totalidad o solamente una parte de las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, la región CDR2 o la región CDRl. Preferentemente, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 14 está en la región CDR3, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 17 está en la región CDR2 , y la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 18 está en la región CDRl del anticuerpo.

En otra realización, los anticuerpos de la presente invención se unen a PSGL-1 sulfatado y/o GPIb sulfatado con sustancialmente la misma afinidad que D3 y en esta realización el anticuerpo preferentemente comprende una o más secuencias de aminoácido de SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18. Preferentemente, las secuencias de aminoácidos están en la región hipervariable del anticuerpo. En particular, las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl del anticuerpo. La totalidad o solamente una parte de las secuencias de aminoácidos pueden estar en la región CDR3, en la región CDR2 o en la región CDRl. Preferentemente la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 13 está en la región CDR3, la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 17 está en la región CDR2 y la secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 18 está en la región CDRl del anticuerpo.

Para la totalidad de las secuencias de aminoácidos de <25 residuos de aminoácidos descritos y detallados aqui (por ejemplo, CDR, regiones que flanquean CDR) , se debe entender y considerar como otra realización de la invención que estas secuencias de aminoácidos incluyen dentro de su alcance una o dos sustituciones de aminoácidos y que preferentemente las sustituciones son sustituciones de aminoácidos conservadoras. Para la totalidad de las secuencias de aminoácidos de > 25 residuos de aminoácidos descritos y detallados aqui, se debe entender que y considerar como una realización de la invención que estas secuencias de aminoácidos incluyen dentro de su alcance una secuencia de aminoácidos con = 90% de similitud de secuencia con la secuencia original (Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997) ) . Se definen aminoácidos similares u homólogos como aminoácidos no idénticos que presentan propiedades similares, por ejemplo ácidos, básicos, aromáticos, tamaño, con carga positiva o negativa, polaridad o no polaridad.

El porcentaje de similitud u homología de aminoácidos o la similitud de secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de dos péptidos o polipéptidos diferentes. Las secuencias de anticuerpos se determinaron mediante secuenciación de ADN. Las dos secuencias se alinean, generalmente usando una de una variedad de programas de computadora diseñados con ese propósito, y se comparan los residuos de aminoácidos en cada posición. Luego se determina la identidad u homología de aminoácidos. Luego se aplica un algoritmo para determinar el porcentaje de similitud de aminoácido. Generalmente es preferible comparar secuencias de aminoácidos debido a la sensibilidad muy aumentada a la detección de relaciones sutiles entre las moléculas de péptido, polipéptido o proteina. La comparación de proteína puede tener en cuenta la presencia de sustituciones de aminoácidos conservadoras, mediante lo cual una desigualdad puede aún dar una calificación positiva si el aminoácido no idéntico tiene propiedades físicas y/o químicas similares (Altschul et al (1997) , supra) .

En una realización de la invención, las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas livianas y pesadas se pueden intercambiar entre las dos cadenas y entre los tres sitios hipervariables dentro y/o entre cadenas.

De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos de consenso y los anticuerpos que se unen con sustancialmente la misma afinidad que S15, A3R y/o D1/D3 incluyen anticuerpos IgG, IgA, IgD, IgE o IgM. La clase IgG abarca varias subclases que incluyen IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4.

Los anticuerpos pueden proporcionarse en muchas formas, tales como fragmentos, complejos y multimeros . De acuerdo con la presente invención, los fragmentos de anticuerpos incluyen moléculas de Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab2 y Fd. Los fragmentos de anticuerpos más pequeños, tales como fragmentos de Fv y fragmentos de Fab, también están incluidos en el término "fragmentos", siempre que mantengan las características de unión del anticuerpo original o un fragmento de mayor tamaño. Ejemplos de esos fragmentos serian (1) un anticuerpo, que comprende un fragmento de la cadena pesada solamente del Fv, (2) un microcuerpo, que comprende una unidad fraccionada de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (Solicitud Internacional N° PCT/IL99/00581) , (3) cuerpos similares que tienen un fragmento de la cadena liviana y (4) cuerpos similares que tienen una unidad funcional de una región variable de la cadena liviana. Las construcciones incluyen, por ejemplo, multimeros tales como diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos . El término "anticuerpo" abarca la totalidad de las moléculas, asi como derivados, combinaciones, modificaciones, homólogos, miméticos, y variantes de ellos, a menos que se especifique de otro modo o que se indique de otro modo basado en el contexto y/o conocimiento del arte.

Se ha establecido que scFv penetran en los tejidos y se aclaran desde la sangre más rápidamente que un anticuerpo de tamaño completo porque son de tamaño más pequeño (Adams et al, Br. J. Cáncer 77: 1405-12 (1988); Hudson, Curr. Opin. Imunol. 11(5): 548-557 (1999); Wu et al, Tumor Targetting 4: 47 (1999)). Por lo tanto, frecuentemente se emplean scFv en el diagnóstico, pronóstico o determinación de fases que involucran rótulos radioactivos tales como formación de imágenes de tumores para permitir un aclaramiento más rápido del rótulo radioactivo del cuerpo. Numerosos multimeros de scFv blanco de cáncer han estado recientemente en evaluación para la estabilidad y eficacia in vivo (Adams et al (1988), supra; Wu (1999), supra) .

Generalmente, se diseñan monómeros de scFv con el extremo final de C del dominio de VH atado por un ligador de polipéptido al residuo del extremo de N del VL. Optativamente se emplea una orientación invertida: el extremo final de C del dominio de VL se ata al residuo del extremo de N de VH a través de un ligador de polipéptido (Power et al, J. Immunol. Meth. 242: 193-204 (2000)). El ligador de polipéptido tiene generalmente quince aminoácidos de longitud. Cuando el ligador se reduce a tres a siete aminoácidos, los scFv no pueden plegarse en un dominio de Fv funcional y en cambio se asocian con un segundo scFv para formar un diacuerpo, üna mayor reducción de la longitud del ligador a menos de tres aminoácidos forma la asociación del scFv en trímeros o tetrámeros, según la longitud del ligador, la composición y las orientaciones de los dominios de Fv (Powers (2000) , supra) .

Recientemente, se ha descubierto que los fragmentos de anticuerpos multivalentes tales como dímeros, trímeros y tetrámeros de scFv con frecuencia proporcionan más alta afinidad comparados con la unión del anticuerpo parental al blanco. La afinidad más alta ofrece ventajas potenciales que incluyen una farmacocinética mejorada para aplicaciones blanco de tumor. Además, al estudiar P-Selectina y su PSGL-1 de ligando, que están involucrados en la atadura y el arrollamiento de leucocitos, los científicos han llegado a la conclusión de que las células que expresan formas diméricas de PSGL-1 establecieron adhesiones de arrollamiento más estables debido a esta afinidad de unión más alta. Estas adhesiones son más resistentes y presentaron menos fluctuación en las velocidades de arrollamiento. (Ramachandran et al, PNAS, 98(18): 10166-71 (2001)).

La mayor afinidad de unión de estas formas multivalentes puede ser beneficiosa en regímenes de diagnóstico y terapéuticos. Por ejemplo, se puede emplear un scFv como agente bloqueador para unirse a un receptor blanco y por lo tanto bloquear la unión del ligando "neutro". En esos casos, es deseable tener una asociación de afinidad más alta entre el scFv y el receptor para reducir las oportunidades de disociación, que puede permitir una unión indeseable del ligando natural al blanco. Además, esta afinidad más alta puede ser útil cuando los receptores blanco están involucrados en la adhesión y el arrollamiento o cuando los receptores blanco están en células presentes en áreas de flujo de deslizamiento alto, tales como las plaquetas. Una vez que se ha seleccionado y/o desarrollado un anticuerpo que tiene capacidades de unión deseadas, está dentro de la capacidad de un experto en el arte usar la guía provista aquí para producir construcciones o fragmentos que mantienen las características del anticuerpo original. Por ejemplo, se pueden elaborar moléculas de anticuerpos enteros, fragmentos Fv, fragmentos Fag, fragmentos Fa 2, dímeros, trímeros y otras construcciones que mantengan las características deseadas del anticuerpo seleccionado o desarrollado originalmente.

Si se desea sustituir aminoácidos, pero aún mantener las características de un anticuerpo, está dentro del conocimiento del arte elaborar sustituciones de aminoácidos. También se pueden hacer modificaciones tales como conjugación a otros diferentes agentes en los anticuerpos sin alterar sus características de unión. También pueden hacerse otras modificaciones, tales como aquellas hechas para producir anticuerpos más estables, en los anticuerpos o fragmentos sin alterar su especificidad. Por ejemplo, se pueden hacer modificaciones peptoides, modificaciones semipeptoides, modificaciones de péptidos cíclicos, modificaciones del extremo de N, modificaciones de extremos de C, modificaciones de enlace de péptido, modificaciones de la cadena principal, y modificaciones del residuo. También está dentro de la capacidad del trabajador experto siguiendo la guía de la presente memoria descriptiva ensayar los anticuerpos o fragmentos modificados para evaluar si sus características de unión se han cambiado.

En forma similar, está dentro de la capacidad del trabajador experto usando la guía dada aquí alterar las características de la unión de un anticuerpo para obtener una molécula con características más deseables. Por ejemplo, una vez que se identifica un anticuerpo que tiene propiedades deseables, se puede usar mutagénesis aleatoria o dirigida para generar variantes del anticuerpo, y esas variantes pueden detectarse por características deseables.

Usando métodos convencionales conocidos en el arte, un experto también puede determinar anticuerpos adicionales que tienen las capacidades de unión del anticuerpo de consenso y/o que se unen específicamente a PSGL-1 sulfatado y/o GPIb sulfatado y se unen con afinidad sustancialmente similar a aquella del S15 y A3R. Por ejemplo, anticuerpos adicionales tales como DI y D3, se pueden aislar usando métodos de biopaneo descritos aquí, en donde la molécula o la célula a la cual se une anticuerpo de consenso se usa para detectar una biblioteca de presentación de fagos particular, particularmente una biblioteca preparada a partir de un paciente con leucemia, linfoma y mieloma. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención, también pueden tener un marcador que puede insertarse o unirse a él para ayudar en la preparación e identificación de él, y en el diagnóstico. El marcador puede más tarde removerse de la molécula. Ejemplos de marcadores útiles incluyen: AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6 (SEQ ID N° 163), HSV, HTTPHH (SEQ ID N° 64), IRS, KT3, Proteína C, S-TAG®, T7, V5, y VSV-G (Jarvik y Telmer, Ann. Rev. Gen., 32, 601-18 (1998)). El marcador preferentemente es c-myc o KAK.

La presente invención proporciona anticuerpos scFv. Como se usó aquí, un scFv se define como una molécula que está compuesta de una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo humano y una región variable de cadena liviana de un anticuerpo humano, que puede ser la mismo o diferente, y en donde la región variable de la cadena pesada se conecta, se une, se fusiona, o se une en forma covalente o se asocia con la región variable de la cadena liviana .

Una construcción de scFv puede ser un multimero (por ejemplo, un dimero, trímero, tetrámero, y similares) de las moléculas de scFv que incorporan uno o más de los dominios hipervariables del anticuerpo. Todas las construcciones y fragmentos derivados de scFv mantienen características de unión mejoradas de manera que se unen selectiva y/o específicamente a una célula blanco a favor de otras células. La selectividad y/o especificidad de la unión se determina principalmente mediante regiones hipervariables. Los anticuerpos de la presente . invención pueden construirse para plegarse en formas de Fv multivalentes, que pueden mejorar la afinidad y especificidad de la unión y hemivida aumentada en la sangre.

Las formas multivalentes de scFv han sido diseñadas y producidas por otros. Un enfoque ha sido unir dos scFv con ligadores. Otro enfoque consiste en usar enlaces de disulfuro entre dos scFv para la ligadura. El enfoque más simple de la producción de Fv dimérico o trimérico fue informado por Hollinger et al, PNAS 90: 6444-48 (1993) y Kortt et al, Protein Eng. 10: 423-33 (1997). Uno de esos métodos se diseñó para elaborar dimeros de scFv agregando una secuencia de la región de proteína FOS y JUN para formar un cierre de leucina entre ellos en el extremo de c del scFv (Kostelny et al, J. Immunol . 148(5): 1457-53 (1992); De Kruif et al, J. Biol. Chem. 271(13): 7630-34 (1996)). Otro método se diseñó para elaborar tetrámeros agregando una secuencia de codificación de estreptavidina en el extremo de c del scFv. Estreptavidina está compuesta de 4 subunidades, de manera que cuando scFv-estreptavidina se dobla, 4 subunidades se acomodan para formar un tetrámero (Kipriyanov et al, Huía. Antibodies Hybridomas 6(3): 93-101 (1995)). En aún otro método, para elaborar dimeros, trímeros, y tetrámeros, se introduce una cisterna libre en la proteína de interés. Se usó un entrecruzamiento basado en péptido con números variables (2 a 4) de grupos maleimida para entrecruzar la proteína de interés a las cisternas libres (Cochran et al, Immunity 12(3): 241-50 (2000)).

En este sistema, la bibliteca de fagos (descrita aquí anteriormente) se puede diseñar para presentar scFv, que se pueden doblar en la forma monovalente de la región de Fv de un anticuerpo. Además, y también se ha discutido aquí anteriormente, la construcción es adecuada para la expresión bacterial. Los scFv creados genéticamente comprenden regiones variables de cadena pesada y de cadena liviana unidas por un separador de péptido flexible de 15 aminoácidos codificado en forma contigua. El separador preferido es (Gly4Ser)3 (SEQ ID N° 8). La longitud de este separador, junto con sus constituyentes aminoácidos, proporciona . un separador no voluminoso, que permite que las regiones VH y VL se doblen en un dominio de Fv funcional que proporciona la unión eficaz a. su blanco.

La variación de la longitud de los separadores es aún otro método preferido de formar dimeros, trímeros y triámeros (también denominados en el arte diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, respectivamente) . Los dimeros se forman en condiciones en las cuales el separador que une las dos cadenas variables de un scFv se acorta a generalmente 5-12 residuos de aminoácidos. Este separador acortado impide que las dos cadenas variables de la misma molécula se doblen en un dominio de Fv funcional. En cambio, se fuerza a los dominios a formar pares con dominios complementarios de otra molécula para crear dos dominios de unión. En un método preferido, un separador de solamente 5 aminoácidos (Gly4Ser) (SEQ ID N° 19) se usó para presentar la construcción. Este dimero puede formarse a partir de dos scFv idénticos, o a partir de dos poblaciones diferentes de scFv y mantener la actividad de unión mejorada selectiva y/o especifica de los scFv parentales, y/o mostrar resistencia o afinidad de la unión mejorada.

En forma similar, se forman triacuerpos en condiciones en las cuales el separador que une las dos cadenas variables de un scFv se acorta a generalmente menos de 5 residuos de aminoácidos, impidiendo que las dos cadenas variables de la misma molécula se doblen en un dominio de Fv funcional. En cambio, tres moléculas de scFv separadas se asocien para formar un trímero. En un método preferido, se obtuvieron triacuerpos removiendo completamente este separador flexible. El anticuerpo puede formarse a partir de tres scFv idénticos, o . a partir de dos o tres poblaciones diferentes de scFv, y mantener la actividad de unión mejorada selectiva y/o especifica del scFv parental, y/o mostrar resistencia o afinidad de unión aumentada.

Se forman tetracuerpos en forma similar en condiciones en las cuales el separador que une las dos cadenas variables de un scFv se acorta a generalmente menos de 5 residuos de aminoácido, impidiendo que las dos cadenas variables de la misma molécula se doblen en un dominio de Fv funcional. En cambio, cuatro moléculas de scFv separadas se asocian para formar un tetrámero. El tetracuerpo puede formarse a partir de cuatro scFv idénticos, o de 1-4 unidades individuales de poblaciones diferentes de scFv y debe mantener la actividad de unión mejorada selectiva y/o especifica del scFv parental y/o mostrar resistencia o afinidad de unión aumentada. Si se forman triacuerpos o tetracuerpos, en condiciones en las cuales el separador tiene generalmente menos de 5 residuos de aminoácidos de longitud, depende de la secuencia de aminoácido del scFv particular en la mezcla y las condiciones de la reacción.

La presente invención también proporciona polipéptidos Ique comprenden una secuencia de consenso: Xi-X2-X3-Pro-X5-X6 (SEQ ID N° 3) , en donde ?? y X6 son aminoácidos hidrófobos y X2, X3 y X5 son cualquier aminoácido. En una realización, del polipéptido, X2 se selecciona del grupo formado por arginina, lisina, y y X6 se seleccionan del grupo formado por leucina, valina, metionina, alanina, fenilalaina, e isoleucina. El polipéptido puede preferentemente comprendere SEQ ID N° 5. Alternativamente, el polipéptido puede comprender SEQ ID N° 6. En otra realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, X2 y X3 son arginina y el aminoácido hidrófobo X es preferentemente isoleucina. En otra realización del polipéptido de acuerdo con la presente invención, ?? se selecciona del grupo formado por leucina y metionina, X2 y X3 son arginina, X5 se selecciona del grupo formado por serina ly valina y ?ß es isoleucina. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser sustancialmente circulares o con forma de bucle.

La presente invención también proporciona polipéptidos que se unen específicamente a PSGL-1, en donde el polipéptido se une con una afinidad sustancialmente similar a S15. Alternativamente, o como agregado, los polipéptidos pueden unirse específicamente a GPIb con una afinidad sustancialmente similar a A3R.

La presente invención además proporciona polipéptidos aislados o purificados, tales como ácidos nucleicos recombinantes, que codifican los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención. Esos polipéptidos aislados y purificados se pueden producir en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos . Esos sistemas de . expresión incluyen vectores de expresión y células huésped transfectadas con esos vectores de expresión. También se conocen en el arte métodos para producir anticuerpos y polipéptidos en sistemas procarióticos y eucarióticos, que incluyen cultivar células huésped recombinantes en condiciones que permiten la expresión de esos anticuerpos y aislar o purificar esos anticuerpos de las células recombinantes o del medio de cultivo. ün sistema de células eucarióticas, definido en la presente invención y como se discutió, se refiere a un sistema de expresión para producir péptidos y polipéptidos mediante métodos de ingeniería genética, en donde la célula huésped es un eucariote. ün sistema de expresión eucariótica puede ser un sistema de mamífero, y el péptido o polipéptido producido en el sistema de expresión de mamífero, después de la purificación, de preferencia está sustancialmente libre de contaminantes de mamífero. Otros ejemplos de un sistema de expresión eucariótico útil incluyen sistemas de expresión de levadura. ün sistema procariótico preferido para la producción del péptido o polipéptido de la invención usa E. coli como el huésped para el vector de expresión. El péptido o polipéptido producido en el sistema de E. coli, después de la purificación, está sustancialmente libre de proteínas contaminantes de E. coli. El uso de un sistema de expresión procariótico puede derivar en el agregado de un residuo de metionina al extremo de N de algunas o todas las secuencias provistas en la presente invención. La remoción del residuo de metionina del extremo de N, después de la producción de péptido o polipéptido para permitir la expresión completa del péptido o polipéptido, se puede realizar como se sabe en el arte, un ejemplo es usando Aeromonas aminopeptidasa en condiciones adecuadas (Patente Estadounidense N° 5.763.215).

La presente invención también proporciona un proceso para seleccionar entidades, por ejemplo anticuerpos o fragmentos de ellos, o alternativamente entidades químicas inorgánicas pequeñas, que se unen a epítopes sulfatados. Estos métodos consisten en panear una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos para identificar anticuerpos o fragmentos y bibliotecas combinatorias para identificar entidades químicas inorgánicas pequeñas) contra un péptido que tiene un epítope sulfatado. Los epítopes sulfatados adecuados para el paneo pueden estar basados o derivar de, por ejemplo, PSGL-1, GPIb, -2-antiplasmina, aminopeptidasa B, receptores de CC quimiocina tales como CCR2, CCR5, CCR3, CXCR3, CXCR4, CCR8 y CCR2b, receptores de siete segmentos transmembrana (7TMS) , factores de coagulación tales como factor V, VIII y IX, cadena gamma de fibrinógeno, cofactor II de heparina, secretograminas tales como secretogramina I y II, vitromecina, precursor amiloide, ¦ -coriogonadotropina, complemento C4, ' dermatan sulfatoproteoglican, fibrolnectina, o castrina. Esos péptidos pueden sulfatarse en cualquier posición. Preferentemente, el péptido comprende el epítope sulfatado se obtiene o está basado en una región de PSGL-1 (especialmente cuando se sulfata en el residuo de tirosina en la posición 51 del extremo de N) , GPIb (especialmente cuando se sulfata en el residuo de tirosina en la posición 276 y a menor nivel el residuo de tirosina en la posición 279) , o CCR5 (especialmente cuando se sulfata en el residuo de tirosina en la posición 10) . En una realización, el método comprende inmovilizar el péptido en un soporte sólido. Optativamente, el método comprende paneo competitivo usando un péptido soluble no sulfatado o un péptido soluble sulfatado en una posición de tirosina alternada. El paneo de una biblioteca combinatoria apropiada para identificar una entidad química inorgánica pequeña puede, naturalmente, también usarse para realizar estos métodos.

En una realización preferida de la presente invención, el proceso para producir una entidad que se une a epitopes sulfatados (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo una biblioteca de presentación de fagos); (b) proporcionar un péptido de PSGL-1 de SEQ ID N° 7; (c) panear la biblioteca para seleccionar una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 7/ y (d) producir la entidad seleccionada (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 7.

En una realización preferida de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos) ; (b) proporcionar un péptido inmovilizado de PSGL-l (SEQ ID N° 7); (c) panear la biblioteca para seleccionar una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 7 en la presencia de un péptido de PSGL-l no sulfatado soluble (SEQ ID N° 26); y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 7.

En una realización preferida de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una bibliteca (por ejemplo, biblioteca de presentación de fagos) ; (b) proporcionar un péptido inmovilizado de PSGL-l (SEQ ID N°7); (c) panear la biblioteca para una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 17 en la presencia de un péptido de GPIb sulfatado soluble (SEQ ID N° 44 y/o 50), y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 7.

En una realización preferida de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos) ; (b) proporcionar un péptido inmovilizado de PSGL-1 (SEQ ID N° 7); (c) panear la biblioteca de por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 7 en la presencia de un péptido de GPIb sulfatado soluble (SEQ ID N° 44 y/o 50) o un péptido de PSGL-1 lno sulfatado (SEQ ID N° 26); y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 7.

En una realización preferida de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos) ; (b) proporcionar un péptido inmovilizado de PSGL-1 (SEQ ID N° 7); (c) panear la biblioteca para una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 7 en la presencia de un péptido de GPIb sulfatado soluble (SEQ ID N° 44 Y/o 50) y un péptido de GPIb no sulfatado soluble (SEQ ID N° 43); y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 7.

En una realización preferida de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos) ; (b) proporcionar un péptido inmovilizado de PSGL-1 (SEQ ID N° 7) ; (c) panear la biblioteca para una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 7 en la presencia de un péptido de GPIb sulfatado soluble (que se selecciona de SEQ ID N° 44, 50, 57 y 58 o combinaciones de ellas) y/o un péptido de PSGL-1 no sulfatado (SEQ ID N° 43); y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 7.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar un péptido inmovilizado del péptido de GPIb (SEQ ID N° 44); (c) panear la biblioteca para una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 44; y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 44.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos); (b) proporcionar un péptido inmovilizado del péptido GPIb (SEQ ID N° 44); (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 44 en la presencia de un péptido de GPIb no sulfatado soluble (SEQ ID N° 43); y (d) producir la entidad (por ejemplo, el. anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 44.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos); (b) proporcionar un péptido inmovilizado del péptido GPIb (SEQ ID N° 44); (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 44 en la presencia de uno o más de los péptidos de PSGL-1 sulfatados solubles de SEQ ID N° 7, 48, 49 o 59; y (d) producir la entidad (por ejemplo, el anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 44.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos); (b) proporcionar un péptido inmovilizado del péptido GPIb (SEQ ID N° 44); (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 44 en la presencia de uno o más de los péptidos de PSGL-1 sulfatados solubles de SEQ ID N° 7, 48, 49 o 59 y péptido PSGL-1 no sulfatado soluble (SEQ ID N° 26); y 8d) producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 44.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos); (b) proporcionar un péptido inmovilizado del péptido GPIb (SEQ ID N° 44); (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 44 en la presencia de uno o más péptidos de PSGL-1 sulfatados solubles de SEQ ID N° 7, 48, 49 o 59 y un péptido de GPIb no sulfatado soluble (SEQ ID N° 43); y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 44. En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos); (b) proporcionar un péptido inmovilizado del péptido de GPIb (SEQ ID N° 44) ; (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 44 en la presencia de uno o más de los péptidos de PSGL-l sulfatado soluble de SEQ ID N° 7, 48, 49 o 50 y uno o más de los péptidos de GPIb sulfatados solubles (SEQ ID N° 44 y/o 50), y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 44.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos) ; (b) proporcionar un péptido inmovilizado de CCR5 (SEQ ID N° 55) ; (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 53 y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 53.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación fagos) ; (b) proporcionar un péptido inmovilizado de CCR5 (SEQ ID N° 53); (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 53 en la presencia de un péptido de GPIb no sulfatado (SEQ ID N°43) y/o un péptido de PSGL-1 soluble nol sulfatado (SEQ ID N° 26); (d) producir la entidad (por ejemplo un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al polipéptido de SEQ ID N° 53.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar un péptido inmovilizado de CCR5 (SEQ ID N° 53) ; (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 53 en la presencia de un péptido GPIb sulfatado soluble (SEQ ID N° 44 y/o 50) y/o péptidos PSGL-1 sulfatados solubles ( SEQ ID N° 7, 48, 49 y/o 59) y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al polipéptido de SEQ ID N° 53.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos) ; (b) proporcionar un péptido inmovilizado de CCR5 (SEQ ID N° 53) ; (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 53 en la presencia de un péptido de GPIb sulfatado soluble (SEQ ID N° 44 y/o 50) y/o un péptido PSGL-1 soluble no sulfatado (SEQ ID N° 26); y (d) producir la entidad (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 53.

En otra realización de la presente invención, el proceso para producir una entidad (por ejemplo un anticuerpo o polipéptido de la presente invención) comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos); (b) proporcionar un péptido inmovilizado de CCR5 (SEQ ID N° 53) ; (c) panear la biblioteca por una entidad (por ejemplo, una partícula de fago) que se une al péptido inmovilizado de SEQ ID N° 53 en la presencia de un péptido GPIb sulfatado soluble (SEQ ID N° 44 y/o 50) y/o un péptido GPIb soluble no sulfatado (SEQ ID N° 43); y (d) producir la entidad (por ejemplo, anticuerpo o polipéptido que comprende el anticuerpo scFv) que se une al péptido de SEQ ID N° 53.

En un enfoque alternativo para un agente terapéutico con blanco en epítopes de tirosina sulfatada presente en las proteínas, tales como GPIb y PSGL-1, una entidad química inorgánica pequeña puede identificarse mediante la detección de una biblioteca combinatoria apropiada. Esa entidad química puede tener numerosas ventajas sobre un agente terapéutico basado en scFv o IgG. Por ejemplo, una entidad química inorgánica puede administrarse oralmente y tener un perfil de bioseguridad mejorado, que incluye reactividad cruzada inmune reducida. Se puede proporcionar selectividad mejorada hacia el blanco, particularmente siguiendo el diseño de droga racional para optimizar un compuesto seleccionado inicialmente . Otras ventajas incluyen costos de producción más bajos, duración en el estante más prolongada y un proceso de aprobación regulatoria menos complicado.

Dado que se han identificado numerosas realizaciones del epitope de la invención, por ejemplo en GPIb y PSGL-1, se puede tomar un enfoque impulsado por el ligando para identificar entidades químicas inorgánicas, que tienen muy estrecha especificidad, o alternativamente, blanco en más de un epitope de tirosina sulfatada para estados de enfermedad tales como lesión por reperfusión que consiste en más de un blanco distinguible que transporta cada uno ese epitope- El enfoque impulsado por el ligando acorta significativamente el proceso de detección para identificar blancos para la intervención de agentes terapéuticos y permite la validación de blanco simultánea con optimización, que puede realizarse con una serie de bibliotecas enfocadas.

Se puede diseñar y desarrollar una biblioteca de entidades químicas inorgánicas especializada para epítopes de tirosina sulfatada blanco primero analizando la interacción tridimensional entre un anticuerpo tal como Yl y sus blancos conocidos tales como residuos sulfatados Tyr-276 y Asp-277 de GPIb. Las bibliotecas químicas compuestas de entidades que imitan el sitio de unión de Yl y que proporcionan afinidad aumentada al blanco pueden desarrollarse mediante un diseño de bibliotecas combinatorias asistida por computadora.

La presente invención también proporciona una biblioteca para identificar anticuerpos humanos que se unen a epitopes sulfatados. La biblioteca es de dominios que se unen a inmunoglobulina que comprenden diversos dominios del unión al antigeno para la unión complementaria, en donde la biblioteca tiene diversidad solamente en la CDR3 de cadena pesada. Preferentemente, los dominios de unión a. inmunoglobulina son moléculas de scFv. También preferentemente, los dominios de unión a inmunoglobulina tienen regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) 1 y 2 derivados de DP32 y, más preferentemente, también tienen regiones variables de cadena liviana derivados de DP32. Los dominios de unión a inmunoglobulina de la presente biblioteca pueden presentarse en la superficie de cualquier vector adecuado, por ejemplo partículas de bacteriófago filamentoso, por ejemplo. En una realización, las bibliotecas de la presente invención pueden usarse para seleccionar motivos o epitopes sulfatados.

Los anticuerpos y fragmentos de unión de ellos de la presente invención pueden asociarse, combinarse, fusionarse o unirse a diferentes agentes, tales como drogas, toxinas, compuestos farmacéuticos, e isótopos radioactivos con, optativamente, un portador farmacéuticamente eficaz, para formar composiciones de droga-péptido, fusiones o conjugados que tienen actividad anti-enfermedad y/o anticáncer. Esos conjugados y fusiones también pueden usarse con propósitos de diagnóstico, pronóstico o determinación de fases .

Ejemplos de portadores útiles en la invención incluyen dextran, ?? ? (un polímero hidrófilo) , o cualquier otro polímero, tal como un polímero hidrófilo, así como derivados, combinaciones y modificaciones de ellos. Alternativamente, se pueden usar líposomas decorados, tales como liposomas decorados con moléculas de scFv Yl, tales como Doxil, un liposoma comercialmente disponible que contiene grandes cantidades de doxorubicina . Esos liposomas pueden prepararse para contener uno o más agentes deseados y mezclarse con los anticuerpos de la presente invención para proporcionar una relación alta de droga a anticuerpo.

Alternativamente, la unión entre el anticuerpo o polipéptido y el agente puede ser una unión directa. Una unión directa entre dos o más moléculas vecinas se puede producir a través de un enlace químico entre elementos o grupos de elementos en las moléculas. El enlace químico puede ser, por ejemplo, un enlace iónico, un enlace covalente, un enlace hidrófobo, un enlace hidrófilo, un enlace electrostático, o un enlace de hidrógeno. Los enlaces pueden ser, por ejemplo, enlaces de amida, sulfuro de carbono, péptido y/o disulfuro. Para unir el anticuerpo al agente o ligador, se pueden usar grupos funcionales amina, carboxi, hidroxilo, tiol y éster, que se sabe en el arte que forman enlaces covalentes.

La unión entre el péptido y el agente o entre el péptido y el portador, o entre el portador y el agente puede ser a través de un compuesto de ligador. Como se usa aquí, un compuesto de ligador se define como un compuesto que une dos o más grupos . El ligador puede ser de cadena recta o ramificado, ün compuesto de ligador ramificado puede estar compuesto de una ramificación doble, una ramificación triple, o un compuesto ramificado cuádruple o más ramificado. Los compuestos de ligador útiles en la presente invención incluyen aquellos que se seleccionan del grupo que tiene ácidos dicarboxilicos , maleimido hidrazidas, PDPH, hidrazidas de ácido carboxilico y péptidos pequeños.

Ejemplos más específicos de compuestos de ligador útiles, de acuerdo con la presente invención, incluyen: (a) ácidos dicarboxilicos tales como ácido succínico, ácido glutárico, y ácido adípico; (b) maleimido hidrazidas tales como N- [ácido maleimidocaproico] hidrazida, 4- [N-maleimidometil] ciclohexan-1-carboxilhidrazida, y N- [ácido maleimidoundecanoico] hidrazida, (c) (3- [2-piridiltio] propionil hidrazida); y (d) hidrazidas de ácido carboxilico que se seleccionan de 2-5 átomos de carbono y derivados, combionaciones , modificaciones y análogos de ellos.

La unión .a través del acoplamiento directo usando ligadores de péptidos pequeños también es útil. Por ejemplo, el acoplamiento directo entre el azúcar libre, por ejemplo, de la droga anticáncer doxorubicina y un scFv se puede realizar usando péptidos pequeños. Ejemplos de péptidos pequeños incluyen AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6 (SEQ ID N° 63), HSV, HTTPHH (SEQ ID N° 64), IRS, KT3, Proteína C, S-TAG®, T7, V5, VSV-G y KAK.

Los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención pueden unirse, conjugarse, formar complejos o asociarse de otro modo con agentes de formación de imagen (también denominados marcadores indicadores) , tales como radioisótopos, y estos conjugados pueden usarse con propósitos de diagnóstico, de pronóstico o de determinación de fases y de formación de imágenes. Se proporcionan estuches que tienen esos conjugados de radioisótopo-anticuerpo (o fragmento) .

Ejemplos de radioisótopos útiles para el diagnóstico, pronóstico, determinación de fases y formación de imágenes incluyen mindio, 113indio, 99mrenio, 105renio, 101renio, 99mtecnetio, 121mtelurio, 122mtelurio, 125mtelurio, 165tulio, 167tulio, 168tulio, 123yodo, 126yodo, 131yodo, 133yodo, 81mkriptón, 33xenón, 90itrio, 213bismuto, 77bromo, 18fluor, 95rutenio, 97rutenio, 103rutenio, 105rutenio, 107mercurio, 203mercurio, 67galio y 68galio. Los isótopos radioactivos preferidos son opacos a los rayos X o cualquier ion paramagnético adecuado.

La molécula del marcador indicador también puede ser una molécula de marcador fluorescente. Ejemplos de moléculas de marcador fluorescentes incluyen fluoresceina, ficoeritrina, o rodamina, o modificaciones o conjugados de ellas.

Los anticuerpos y polipéptidos que se conjugan con marcadores indicadores pueden usarse para diagnosticar, pronosticar, o determinar fases de estados de enfermedad. Además, la presente invención también proporciona un método de purgar células de tumor del un paciente proporcionando una muestra que contiene células del paciente e incubar las células del paciente con un anticuerpo de la presente invención. Esas actividades pueden realizarse in vivo, in vitro o ex vivo. Cuando el diagnóstico, pronóstico, o determinación de fases se realiza in vivo o ex vivo, el agente de formación de imágenes es de preferencia fisiológicamente aceptable en que no daña al paciente a un nivel inaceptable. Los niveles aceptables de daño pueden ser determinados por los médicos clínicos usando criterios tales como la severidad de la enfermedad y la disponibilidad de otras opciones.

La presente invención por lo tanto proporciona un estuche de diagnóstico para el análisis in vitro de la eficacia del tratamiento antes, durante o después del tratamiento, que tiene un agente de formación de imágenes que tiene un péptido de la invención unido a una molécula de marcador indicador, o un agente de formación de imágenes. La invención además proporciona un método de usar el agente de formación de imágenes para el diagnóstico, la localización y la formación de imágenes de un cáncer, más específicamente un tumor, que tiene los siguientes pasos: (a) poner las células en contacto con la composición; (b) medir la radioactividad unida a las células; y por lo tanto (c) visualizar el tumor.

Ejemplos de agentes de formación de imágenes adecuados incluyen colorantes fluorescentes, tales como FITC, PE y similares, y proteínas fluorescentes, tales como proteínas verde fluorescentes. Otros ejemplos incluyen moléculas radioactivas y enzimas que reaccionan con un sustrato para producir un cambio reconocible, tal como un cambio de color.

En un ejemplo, el agente de formación de imágenes del estuche es un colorante fluorescente, tal como FITC, y el estuche proporciona el análisis de la eficacia del tratamiento de cánceres, más específicamente de cánceres relacionados con la sangre, por ejemplo leucemia, linfoma y mieloma. El análisis FACS se usa para determinar el porcentaje de células manchadas por el agente de formación de imágenes y la intensidad del manchado en cada fase de la enfermedad, por ejemplo en el diagnóstico, durante el tratamiento, durante la remisión y durante la recaída.

La presente invención también proporciona un método de diagnosticar, pronosticar o determinar fases de una enfermedad en un paciente proporcionando una muestra que contiene una célula de un paciente y determinar si los anticuerpos de la presente invención se unen a la célula del paciente, indicando así que el paciente está en riesgo o tiene la enfermedad. Esas actividades pueden realizarse in vivo, in vitro o ex vivo. Cuando se realiza in vivo o ex vivo, el agente de formación de imágenes es de preferencia fisiológicamente aceptable en que no daña al paciente a un nivel inaceptable. Los niveles aceptables de daño pueden ser determinados por los médicos clínicos usando esos criterios como la severidad de la enfermedad y la disponibilidad de otras opciones.

Con respecto al cáncer, determinar las fases de una enfermedad en un paciente generalmente consiste en determinar la clasificación de la enfermedad basado en el tamaño, tipo, ubicación e invasividad del tumor. Un sistema de clasificación del cáncer por las características del tumor es la "Clasificación de TNM de Tumores Malignos" (6a edición) (L.H. Sobin, Ed.), que se incorpora como referencia aqui y que clasifica las fases del cáncer en las categorías T, N y M donde T describe el tumor primario de acuerdo con su tamaño y ubicación, N describe los nodos linfáticos regionales, y M describe metástasis distantes. Además, los números I, II, III y IV se usan para indicar las fases y cada número se refiere a una posible combinación de factores TNM. Por ejemplo, -un cáncer de mamas de Fase I se define con el grupo TMN: TI, NO, M0 que significa: TI: el tumor tiene 2 cm o menos de diámetro, NO: metástasis de nodo linfático no regional, M0 : metástasis no distante. Se usa otro sistema para determinar fases de AML, con subtipos de clasificación basado en el sistema Francés-Estadounidense-Británico usando la morfología observada bajo procesamiento de rutina y manchado citoquímico.

Además, una determinación de fases o clasificación de la Organización Mundial de la Salud propuesta recientemente de enfermedades neoplásicas de los tejidos hematopoyéticos y linfoides incluye (específicamente para AML) categorías de tipo de FAB tradicionales de enfermedad, así como tipos de enfermedad adicionales que se correlacionan con hallazgos citogenéticos específicos y AML asociada con mielodisplasia . Otros también han propuesto clasificaciones patológicas propuestas. Por ejemplo, una propuesta específica para AML incluye tipos de enfermedad que se correlacionan con translocaciones citogenéticas específicas y que pueden reconocerse en forma confiable mediante evaluación morfológica e inmunofenotipicación y que incorporan la importancia de cambios mielodisplásicos asociados. Este sistema estaría apoyado por estudios citogenéticos o genéticos moleculares y podría expandirse ya que se describen entidades clinicopatológicos reconocibles nuevos (Arber, M. J. Clin. Pathol. 115(4): 552-60 (2001)).

Los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención pueden unirse, conjugarse o asociarse de otro modo con agentes anticáncer, agentes antineoplásicos, agentes antivirales, agentes antimetastásicos, agentes antiinflamatorios, agentes antitrombosis, agentes anti-restenosis, agentes anti-agregación, agentes anti-autoinmunes, agentes anti-adhesión, agentes antienfermedad cardiovascular, agentes farmacéuticos, u otros agentes anti-enfermedad . Un agente se refiere a un agente que es útil en el tratamiento profiláctico o el diagnóstico de un mamífero que incluye, en forma no taxativa, un humano, bovino, equino, porcino, murino, canino, felino, o cualquier otro animal de sangre caliente.

Ejemplos de esos agentes incluyen, en forma no taxativa, agentes antivirales que incluyen acyclovir, ganciclovir y zidovudina; agentes anti-trombosis/restenosis que incluyen cilostazol, dalteparina de sodio, reviparina de sodio, y aspirina; agentes antiinflamatorios que incluyen zaltoprofeno, pranoprofeno, droxicam, acetil salicilico 17, diclofenac, ibuprofeno, dexibuprofeno, sulindac, naproxeno, antolmetina, celecoxib, indometacina, rofecoxib, y nimesulid; agentes anti-autoinmune que incluyen leflunomida, denileucina diftitox, subreo, WinRho SDF, defibrotida, y ciclofosfamida; y agentes anti-adhesión/anti-agregación que incluyen limaprost, clorcromeno y ácido hialurónico y derivados, combinaciones y modificaciones de ellos.

Ejemplos de agentes farmacéuticos incluyen antraciclinas tales como doxorubicina (adriamicina) , daunorubicina, idarubicina, detorubicina, carminomicina, epirubicina, esorubicina, morfolinodoxorubicina, morfolinodaunorubicina, metoximorfolinilldoxorubicina, metoximorfolinodaunorubicina y metoximorfolinildoxorubicina y derivados sustituidos, combinaciones y modificaciones de ellos. Otros ejemplos de agentes farmacéuticos incluyen cis-platino, taxol, caliqueamicina, vincristina, citarabina (Ara-C) , ciclofosfamida, prednisona, fludarabina, idarubicina, clorambucil, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida y bleomicina y derivados, combinaciones y modificaciones de ellos. La inhibición del crecimiento de una célula de cáncer incluye, por ejemplo, (i) prevención de crecimiento canceroso o metastásico, (ii) lentificación del crecimiento canceroso o metastásico, (iii) prevención total del proceso de crecimiento de la célula de cáncer o el proceso metastásico, mientras deja a la célula intacta y viva, (iv) interferencia del contacto de células de cáncer con el micromedio, (v) eliminación de la célula de cáncer .

La inhibición del crecimiento de una célula de leucemia incluye, por ejemplo, (i) prevención de crecimiento leucémico o metastásico, (ii) lentificación del crecimiento leucémico o metastásico, (iii) prevención total del proceso de crecimiento de la célula de leucemia o el proceso metastásico, mientras deja la célula intacta y viva, (iv) interferencia del contacto células de cáncer con el micromedio, o (v) eliminación de la célula de leucemia .

En una realización, la presente invención proporciona métodos de inducir o activar ADCC administrando los presentes anticuerpos.

Por consiguiente, el anticuerpo de consenso y los anticuerpos que se unen con sustancialmente la misma afinidad como S15 y A3R de la presente invención pueden activar ADCC y/o estimular células asesinas naturales (NK) (por ejemplo, CD56+) , células ?d T, y/o monocitos, que pueden derivar en la lisis de células. Generalmente, después de la administración de un anticuerpo que comprende una región de Fe o una parte del anticuerpo, el anticuerpo se une a un receptor de Fe (FcR) en células efectoras, por ejemplo, células NK, disparando la liberación de perforina y granzima B y/o la inducción de la expresión de FasL, que luego deriva en la apóptosis.

La unión de FasL expresada en células efectoras al receptor de Fas en la superficie de la célula blanco puede inducir la apóptosis de células blanco a través de la activación de la vía de transduccion de señal de receptor de Fas. En una realización, un anticuerpo IgG que comprende la secuencia de consenso de la invención induce la expresión de FasL en células efectoras. Diferentes factores pueden afectar la ADCC, que inluyen el tipo de células efectoras involucradas, citocinas (IL-2 y G-CSF, por ejemplo) , tiempo de incubación, el número de receptores presentes en la superficie de las células y la afinidad de anticuerpo.

Ejemplos de agentes anti-enfermedad, anticáncer y antileucémicos a los cuales los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención se pueden unir exitosamente incluyen toxinas, radioisótopos y compuestos farmacéuticos.

Ejemplos de toxinas incluyen gelonina, exotoxina Pseudomonas (PE) , PE40, PE38, toxina de difteria, ricina, o derivados, combinaciones y modificaciones de ellas.

Ejemplos de radioisótopos incluyen emisores de radiación gamma, emisores de positrones, y emisores de rayos X que pueden usarse para la localización y/o terapia, y emisores de radiación beta y emisores de radiación alfa que pueden usarse para la terapia. Los radioisótopos que se describieron previamente como útiles para el diagnóstico también son útiles para la terapéutica.

Ejemplos no taxativos de agentes anti-cáncer o anti-leucemia incluyen antraciclinas tales como doxorubicina (adriamicina) , daunorubicina,, idarubicina, detorubicina, carminomicina, epirubicina, esorubicina, morfolinodoxorubicina, morfolinodaunorubicina, moteximorfolinildoxorubicina, metoximorfolinodaunorúbicay metoximorfolinildoxorubicina y derivados sustituidos, combinaciones y modificaciones de ellas. Ejemplos de agentes farmacéuticos incluyen cis-platino, taxol, caliqueamicina, vincristina, citarabina (Ara-C) , ciclofosfamida, prednisona, daunorubicina, idarubicina, fludarabina, clorambucil, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida, y bleomicina, y derivados, combinaciones y modificaciones de ellas. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención tienen un anticuerpo o polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias de consenso de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo o polipéptido puede estar presente en una cantidad eficaz para inhibir el arrollamiento de células, la inflamación, la enfermedad auto-inmune, la metástasis, el crecimiento y/o la replicación de células de tumor o células de leucemia o aumentar el número de las células de tumor en un paciente que tiene células de tumor o leucemia en un paciente que tiene leucemia. Alternativamente, el anticuerpo o polipéptido puede estar presente en una cantidad eficaz para aumentar la mortalidad de células de tumor o células de leucemia. También alternativamente, el anticuerpo o polipéptido puede estar presente en una cantidad eficaz para alterar la susceptibilidad de las células enfermas al daño por agentes anti-enfermedad, de las células de tumor al daño por agentes anti-cáncer, o de las células de leucemia al daño por agentes anti-leucemia . También alternativamente, el anticuerpo o polipéptido puede estar presente en una cantidad eficaz para reducir el número de células de tumor en un paciente que tiene células de tumor o leucemia en un paciente que tiene leucemia. Aún también alternativamente, el anticuerpo o polipéptido puede estar presente en una cantidad eficaz para inhibir la restenosis en cuyo caso en anticuerpo de consenso preferentemente comprende A3R. El anticuerpo o el polipéptido también puede estar presente en una cantidad eficaz para inhibir la entrada del HIV y/o tratar la infección con HIV. Alternativamente, el anticuerpo o polipéptido, puede usarse como un agente blanco para dirigir un agente terapéutico a una célula o sitio especifico.

Los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención pueden administrarse a pacientes que lo necesitan a través cualquier método adecuado. Ejemplos de métodos incluyen administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, intratraqueal, intratecal, intraperitoneal, intralinfática, nasal, sublingual, oral, rectal, vaginal, respiratoria, bucal, intradérmica, transdérmica, o intrapleural .

Para la administración intravenosa, la formulación preferentemente se prepara de manera tal que la cantidad administrada al paciente es una cantidad eficaz desde 0,1 mg a 1000 mg de la composición deseada. Más preferentemente, la cantidad administrada está en la gama de 1 mg a 500 mg de la composición deseada. Las composiciones de la invención son eficaces en una amplia gama de dosificación y dependen de factores tales como los detalles de la enfermedad que se debe tratar, la semivida del péptido, o la composición farmacéutica basada en el polipéptido en el cuerpo del paciente, las características físicas y químicas de cualquier agente que forma complejo con el anticuerpo o fragmento de él y de la composición farmacéutica, la forma de administración de la composición farmacéutica, los detalles del paciente que se debe tratar o diagnosticar, así como otros parámetros que el médico tratante considera importantes.

La composición farmacéutica para administración oral puede estar en cualquier forma adecuada. Ejemplos incluyen tabletas, líquidos, emulsiones, suspensiones, jarabes, pastillas, y cápsulas. Los métodos de fabricación de composiciones farmacéuticas son conocidos en el arte (Véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (pub) ) .

La composición farmacéutica puede formularse también de manera de facilitar la liberación temporizada, sostenida, impulsada o continua. La composición farmacéutica también puede administrarse en un dispositivo, tal como un dispositivo de liberación temporizada, sostenida, impulsada o continua.

La composición farmacéutica para la administración tópica puede estar en cualquier forma adecuada, tal como cremas, ungüentos, lociones, parches, soluciones, suspensiones, liofilizados y geles. Las composiciones que tienen anticuerpos y polipéptidos de la presente invención pueden comprender diluyentes, excipientes, portadores, y similares farmacéuticamente aceptables convencionales. Las tabletas, pastillas y cápsulas pueden incluir excipientes convencionales tales como lactosa, almidón y estearato de magnesio. Los supositorios pueden incluir excipientes tales como ceras y glicerol. Las soluciones inyectables incluyen medios libres de pirógenos estériles tales como solución salina y pueden incluir agentes tampones, agentes estabilizantes o conservantes. También se pueden usar recubrimientos entéricos convencionales.

Los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención y las composiciones farmacéuticas de ellos, pueden usarse en métodos de tratar una enfermedad (por ejemplo, tratar puede incluir mejorar los efectos de una enfermedad, prevenir una enfermedad, o inhibir el progreso de una enfermedad) en pacientes que lo necesitan. Esos métodos incluyen inhibir el arrollamiento de células, la inflamación, la enfermedad autoinmune, la metástasis, el crecimiento y/o la replicacion de células de tumores o células de leucemia, o el aumento del número de células de tumor en un paciente que tiene células de tumor o de leucemia en un paciente que tiene leucemia. Además, esos métodos incluyen aumentar el índice de mortalidad de células de tumor o células de leucemia, alterar la susceptibilidad de las células enfermas al daño por agentes anti-enfermedad, de las células de tumor al daño por agentes anti-cáncer, o de las células de leucemia al daño por agentes anti-cáncer. Esos métodos también incluyen reducir el número de células de tumor en un paciente que tiene células de tumor o de leucemia en un paciente que tiene leucemia. Esos métodos también incluyen inhibir o reducir la entrada del HIV en las células y también, como resultado de esa inhibición, bloquear la replicacion de. HIV y tratar así la infección con HIV. Esos métodos incluyen también prevenir o inhibir enfermedades cardiovasculares tales como restenosis.

La presente invención además proporciona anticuerpos y polipéptidos para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diferentes estados de enfermedad tales como, por ejemplo, AML, T-ALL, B-leucemia, B-CLL, Pre-B-ALL, mieloma múltiple, metástasis, infección con HIV, enfermedades cardiovasculares, u otras enfermedades en donde funciones o acciones celulares tales como arrollamiento celular, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, cumplen una función significativa. Ese medicamento comprende los anticuerpos y los polipéptidos de la presente invención.

En toda la memoria descriptiva, se ha hecho referencia a diferentes publicaciones, patentes y solicitudes de patente. Las enseñanzas y descripciones de estas publicaciones, patentes y solicitudes de patente en su totalidad se incorporan como referencia en esta solicitud para describir en forma más completa el estado del arte al cual pertenece la presente invención.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se dan para ayudar a comprender e ilustrar adicionalmente la invención, pero no debe interpretarse que limitan su alcance de ninguna manera. Aunque se describen reactivos y condiciones de reacción específicos, se pueden hacer modificaciones que están comprendidos por el alcance de la invención.

Ejemplo 1 El presente ejemplo demuestra la selección, producción y caracterización inicial de los fragmentos de anticuerpos scFv de S15, que incluyen las capacidades de unión de fragmentos del anticuerpo S15. En resumen, una biblioteca de presentación de fagos basada en un andamio especifico de VH-VL con una CDR3-VH aleatoria de seis aminoácidos se utilizó para identificar un anticuerpo scFv que se une a PSGL-1 sulfatado. El anticuerpo scFv se obtuvo paneando contra un péptido sulfatdo sintético que tiene la secuencia de aminoácidos 1-17 de la molécula de PSGL-1 maduro desde el extremo de N al extremo de C o desde el extremo de C al extremo de N (que corresponde a los aminoácidos 42-58) de la molécula de PSGL-1 inmaduro, es decir que incluye la la secuencia de señal) . La citometria de flujo, particularmente la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y ELISA se usó para identificar y caracterizar clones de fagos específicos que se unen al péptido sulfatado sintético o a las células enteras que expresan PSGL-1.

La biblioteca de presentación de fagos se construyó desde un andamio de un clon aislado de una biblioteca de anticuerpos de fagos combinatoria (CAT) en un vector pHEN. El andamio contenía un VH3 (1-3, 3-20) y un VL (11-7) . La biblioteca se construyó mediante randomización del buble hipervariable de CDR3 de seis aminoácidos de longitud. Para proporcionar una construcción que tiene un solo sitio Eagl en la región 5' de la CDR3 (en lugar de dos sitios Eagl que se hallan en pHEN-Yl) , el sitio de restricción de Eagl en el extremo 3' del VL se mutó extirpando un fragmento de Xmal - Notl desde el pHEN-Yl e insertando un fragmento nuevo (templando un oligonucleótido de SEQ ID N° 20 y un oligonucleótido de SEQ ID N° 21) con una mutación de la parte de ligación del sitio Notl. La mutación se requirió para generar dos sitios únicos (Eagl y Xaml) y para introducir un producto de PCR del mismo tamaño pero con CDR3 randomizada. Después de la ligación, el plásmido se secuenció en la región de inserción y la mutación se confirmó. El pHEN-Yl-mut nuevo se restringió con Eagl y Xmal y el fragmento grande fue el vector para la ligación posterior .

La plantilla para la preparación de la CDR3 variable se hizo mediante PCR con lun oligonucleótido de SEQ ID N° 22 y un oligonucleótido de SEQ ID N° 23. El producto de PCR (plantilla A) se aisló de un gel de SDS-poliacrilamida y se purificó para mayores amplificaciones. La plantilla A se usó para la amplificación con oligonucleótidos de SEQ ID N° 24 y SEQ ID N° 23, el producto se purificó y se denominó plantilla B. La plantilla B se amplificó con oligonucleótidos de SEQ ID N° 25 y SEQ ID N° 23, se purificó y se restringió con enzimas de restricción Eagl y Xmal. El vector restringido pHEN-Yl-mut se purificó y se ligó al último producto de PCR restringido con las mismas enzimas.

El producto de la ligación se usó para transformar células de TGl. El rendimiento de la transformación de 3 ligaciones dio 2,4 x 106 unidades de formación de colonias independientes (CFÜ) . La biblioteca se amplificó mediante la colocación en placas de SOBAG de 10 (13 cía) (20 g de Bacto-triptona, 5g de Bacto-levadura, 8,5 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0,1 M glucosa, 0,1 mg/ml de ampicilina por litro; para placas de 15 g de Bacto-agar. Las bacterias se resuspendieron en el medio SOBAG desde placas y se mantuvieron a -70°C en 20% glicerol. El titulador de la biblioteca amplificada fue de 1,5 x 109 CFü/ml. Una alícuota (108 CFU) de la biblioteca amplificada se infectó con el fago helper 13 07 para rescatar la biblioteca en una forma de fago para realizar los experimentos de biopaneo. Esta biblioteca contiene en el orden de 112,5xl06 miembros, por oposición a una biblioteca teórica que contiene 206 o 6,4xl07 miembros.

El biopaneo se realizó incubando el péptido inmovilizado de SEQ ID N° 7 con la biblioteca de presentación de fagos, removiendo el fago no unido mediante lavado, y específicamente eluyendo el fago unido. Los clones de fagos eluidos se amplificaron optativamente antes de ciclos adicionales de la unión y amplificación opcional enriqueciendo la mezcla de secuencias especificas a favor de aquellos clones de fagos que transportan fragmentos de anticuerpos que se unen mejor a los péptidos . Después de varios ciclos de paneo, se caracterizaron clones de fago individuales, y se determinaron las secuencias de los clones. En la presente invención, el clon del anticuerpo S15 se identificó paneando una biblioteca de presentación de fagos en solución con cuentas magnéticas de estreptavidina unidas a un péptido sulfatado biotinilado de SEQ ID N° L7. Este péptido se sintetizó químicamente y se basó en la secuencia altamente ácida hallada en los aminoácidos 42 a 58 dentro PSGL-1, que incluye la sulfatación el tercer residuo de tirosina. El extremo de N del péptido sintético se prolongó con ácido aminocaproico y se biotiniló en el grupo amino del ácido caproico para evitar el impedimento estérico del epítope sulfatado. El péptido sulfatado sintético de SEQ ID N° 7 se inmovilizó en cuentas magnéticas de estreptavidina (Dymal) mediante la incubación del péptido en exceso seguido por el lavado con PBST (PBS + 0,05% de Tween-20) y bloqueando con PBST-M (PBST suplementado con 5% de leche con bajo contenido de grasal) . Para el paneo, las cuentas unidas al péptido se incubaron con 2 x 1011 fagos. El péptido de la misma secuencia lineal (SEQ ID N° 45) que no se biotiniló ni se sulfató se agregó a la solución de paneo para evitar el aislamiento del clones de scFv que se unen a péptidos no sulfatados .

Se realizaron tres ciclos de paneo usando lavados de alta astringencia en PBST (20 minutos cada uno a 37°C) . Después del lavado, los fagos unidos se eluyeron con glicina 0,2M (pH 2,2) y se neutralizaron con Tris 1M (pH 9,1). El fago eluido se amplificó infectando bacterias de TGl y se rescataron con el fago helper M13K07. El enriquecimiento de hasta 5000 veces se logró después de tres ciclos de paneo. Después del tercer ciclo de paneo, se analizaron clones individuales para la secuencia de aminoácido en la región CDR3. Las secuencias de aminoácidos de la región CDR3 (SEQ ID N° 9, . 27-33, 35, 4) de esos clones seleccionados se enumeran en la Tabla 1.

TABLA 1 Secuencia de Clones SEQ NO: L R D P I (55%) (SEQ ID NO:27) L R P- P F L (10%) (SEQ ID NO:28) L R R P s I (6%) (SEQ ID NO:9) L T Y P H L (6%) (SEQ ID NO:29) L W P H L (3%) (SEQ ID NO:30) L R y P F F (3%) (SEQ E> NO:31) L R s P V L (3%) (SEQ I O:32) V R H P I M (3%) (SEQ E> NO:33) L R H P V A (3%) (SEQ ID NO;34) M R A P V I (3%) (SEQ ID NO:4) Los resultados que se muestran en la Tabla 1 indican que se obtuvo una secuencia de consenso resistente: residuos hidrófobos en la primera y sexta posiciones, generalmene un residuo básico en la segunda posición y una prolina en la cuarta posición en todas las secuencias de CDR3.

Para analizar más la unión al péptido sulfatado sintético, basado en la parte sulfatada de PSGL-1, se realizaron análisis ELISA usando sobrenadantes de fago (Figura 1) y scFv no purificado (Figura 2) de clones no paneados y. seleccionados. Estos experimentos incluyeron análisis de los anticuerpos scFv Yl y L32, que se identificaron previamente y se halló que se unen a PSGL-1. Yl se describe en la Solicitud de Patente N° 10/029.926 y en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US01/49.440 y L32 se describe en la Solicitud de Patente Estadounidense N° 10/189.032). Los análisis ELISA se realizaron en paralelo usando el péptido sulfatado sintético de SEQ ID N° 7 en los receptáculos de "ensayo") y el péptido no sulfatado sintético de SEQ ID N° 26 en los receptáculos de "cadena principal". Se recubrieron con péptidos placas de NH-CovaLink® (NUNC) según las recomendaciones del fabricante. Los datos de unión obtenidos de los receptáculos de la cadena principoal se restaron a los datos de unión de los sistemas correspondientes en los receptáculos de ensayo, para generar los resultados que se muestran en las Figuras 1 y 2. Se usó un clon de fago elegido en forma aleatoria como el control negativo (NC) la unión al péptido sulfatado sintético.

Que S15 presenta al menos 100 veces mayor unión a células ML-2 comparado con L32 e Yl .

El análisis FACS se realizó para analizar la unión de scFv de S15, Yl y L32 purificados a células ML-2 en la presencia de 50% plasma. Los resultados que se muestran en las Figuras 10 y 11, indican que el valor absoluto de la unión por S15 fue significativamente más alto (al menos 10 veces) comparado con L32 e Yl.

La respuesta a la dosis de la unión de scFv de S15 purificado a células ML-2 también se analizó y se comparó con aquella de L32 e Yl . Como se muestra en la Figura 112, la respuesta a la dosis de S15 es significativamente mayor que aquella de L32 e Yl, aún a 10 nanogramos (ng) .

Ejemplo 3 Este ejemplo describe la identificación de dos anticuerpos adicionales que comprenden la secuencia de consenso que se obtuvo paneando la biblioteca descrita en el Ejemplo 1 contra un péptido sintético que corresponde a los residuos 268-2185 de GPIb que incluye sulfatación en la primera posición de tirosina.

El presente ejemplo demuestra la selección, producción y caracterización inicial de los fragmentos de anticuerpo scFv de DI y D3, que incluyen las capacidades de unión de los fragmentos de anticuerpos Di y D3. En resumen, una biblioteca de presentación de fagos basada en un andamio especifico de VH-VL con una CDR3-VH aleatoria de seis aminoácidos se utilizó para identificar un anticuerpo scFv que se une a GPIb sulfatado. El anticuerpo scFv se obtuvo paneando contra un péptido sulfatado sintético que tiene la secuencia de aminoácidos 268-285 (GDEGDTDLY (SO4) DYYPEEDTE) (SEQ ID N° 44) de la molécula de GPIb madura del extremo de N al extremo de C (que corresponde a los aminoácidos 284-301 de la molécula de GPIb inmadura, es decir que incluye la secuencia de señal) . La citometria de flujo, particularmente la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y ELISA se usó para identificar y caracterizar clones de fagos específicos que se unen al péptido sulfatado sintético o a plaquetas que expresan GPIb.

La biblioteca de presentación de fagos usada se describe en el Ejemplo 1.

El biopaneo se realizó incubando el péptido inmovilizado de SEQ ID N° 44 (GDEGDTDLYSDYYPEEDTE) con la biblioteca de presentación de fagos, removiendo el fago no unido mediante lavado y específicamente eluyendo el fago unido. Los clones de fago eluidos se amplificaron optativamente antes de ciclos adicionales de unión y amplificación opcional, enriqueciendo la mezcla de secuencias especificas a favor de esos clones de fago que transportan fragmentos de anticuerpos que se unen menor a los péptidos. Después de varios ciclos de paneo, se caracterizaron clones de fagos individuales y las secuencias de los clones se determinaron .

En la presente invención, los clones de anticuerpos DI y D3 se identificaron paneando una biblioteca de presentación de fagos en solución con un péptido sulfatado sintetizado quimicamente de SEQ ID N° 44 unido en forma covalente a cuentas magnéticas. El péptido sulfatado de SEQ ID N° 44 se une en la secuencia altamente ácida que se halla en los aminoácidos 268-285 dentro de GPIb maduro, que incluye la sulfatación del primer residuo de tirosina. El péptido sulfatado sintético de SEQ ID N° 44 se unió en forma covalente a cuentas magnéticas de amina (Dynal) mediante la reacción que consiste en EDONHS, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las cuentas se lavaron con PBST (PBS + 0,05% Tween 20) y se bloquearon con PBST- (PBST suplementado con 5% de leche con bajo contenido de grasa) . Para el paneo, las cuentas unidas al péptido se incubaron con 2x 1011 fagos. El péptido de la misma secuencia lineal (SEQ ID N° 43) pero que no tiene sulfatación se agregó a la solución de paneo para evitar el aislamiento de clones de scFv que se unen a péptidos no sulfatados .

Se realizaron tres ciclos de paneo usando lavados de alta astringencia en PBST (20 minutos cada uno a 37°C) . Después del lavado, los fagos unidos se eluyeron con glicina 0,2M (pH 2,2) y se neutralizaron con Tris 1M (pH 9,1). El fago eluido se amplificó infectando bacterias TG1 y se rescató con el fago helper M13K07. El enriquecimiento de hasta 5000 pliegues se logró después de tres ciclos de paneo. Después del tercer ciclo de paneo, se analizaron clones individuales para la secuencia de aminoácido en la región CDR3. Las secuencias de aminoácidos de la región CDR3 (SEQ ID N° 11-16) de esos clones seleccionados se enumeran en la Tabla 3..

TABLA 3 Los resultados que se muestran en la Tabla 3 indican que se obtuvo una secuencia de consenso resistentes: residuos hidrófobos en la primera y sexta posiciones, generalmente un residuo básico en la segunda posición, y una prolina en la cuarta posición en todas las regiones CDR3.

Para analizar adicionalmente la unión al péptido sulfatado sintético, basado en una parte sulfatada de GPIb, se realizaron análisis ELISA usando un fago (Figura 13) de clones paneados y seleccionados. Los análisis ELISA se realizaron en paralelo usando el péptido sulfatado sintético de SEQ ID N° 44 de GPIb sulfatado (GDEGDTDLYSDYYPEEDTE) en los receptáculos de "ensayo" el péptido no sulfatado GPIb sintético de SEQ ID N° 43 (GDEGDTDLYDYYPEEDTE) en los receptáculos de la "cadena principal" asi como péptidos sulfatados y no sulfatados obtenidos de PSGL-1 respectivamente de SEQ ID N° 7 (QATEYEYLDYSDFLPETE) y SEQ ID N° 26 (QATEYEYLDYDFLPETE) . Con los péptidos se recubrieron placas de NH-CovaLink® (NUNC) según las recomendaciones del fabricante. Los datos de unión obtenidos de los receptáculos de la cadena principal · se restaron de los datos de los sistemas correspondientes de los receptáculos de ensayo, para generar los resultados que se muestran en la Figura 13. ün clon de fago elegido en forma aleatoria se usó como control negativo (NC) para la unión al péptido sulfatado sintético.

La Figura 13 muesstra que cada uno de los clones de fago seleccionados se unió específicamente a ambos péptidos sulfatados sintéticos, es decir GPIb y PSGL-1. Si bien los clones presentaron una gama de resistencia de la unión a los péptidos sulfatados sintéticos, cada clon presentó el mismo comportamiento con respecto a GPIb y a PSGL-1..

Se analizaron scFv de clones seleccionados mediante ELISA para evaluar la unión a glicocalicina (la parte de la membrana exterior derivada de GPIb expresado en plaquetas) . Como se muestra en la Figura 14, los scFv Di y D3 presentaron una unión significativa, mientras que D2 y D16 prsentaron una unión débil y D5 y D9 fueron similares al control negativo.

Se analizaron scFv (1 µg por experimento) de clones seleccionados mediante FACS para evaluar la unión a ML-2, una linea de células M4 de AML que expresa PSGL-1. Como se muestra en la Tabla 4, la totalidad de los scFv se unieron a las células ML-2, a diferentes sensibilidades. DI y D3 presentaron la unión más resistente a ML-2, presumiblemente a través de la interacción con un epitope de PSGL-1.

TABLA 4 Ejemplo 4 El presente ejemplo demuestra la unión de varios anticuerpos scFv que tienen secuencias de CDR3 que están dentro de la secuencia de consenso de la presente invención. En resumen, usando la secuencia de CDR3 de Yl-scFv como un andamio, se produjeron scFv mutantes y se evaluó el efecto de estas mutaciones sobre la unión a las plaquetas y granulocitos .

Usando la mutagénesis dirigida al sitio en la CDR3 de la cadena pesada (CDR3H) de Yl-scFv, se generaron regiones CDR3 adicionales que están dentro de la secuencia de consenso. Estos scFv adicionales luego se ensayaron para determinar la unión relativa a plaquetas y granulocitos .

Se sabe que Yl-scFv se une al epitope de GPIba con carga negativa que está en las plaquetas. Dentro de las seis secuencias de aminoácidos que comprenden la CDR3H de Yl hay un residuo de arginina es decir un aminoácido con carga positiva, en la segunda posición. Para examinar el efecto electrostático posible de este residuo de arginina en la unión a GPIba, se construyeron cuatro scFv mutantes. R2A mutante tiene el residuo de arginina reemplazado por alanina; el A3R mutante tiene una arginina adicional en la posición 3, que remplaza a alanina; V5R tiene una arginina adicional en la posición 5, que reemplaza a valina. El cuarto scFv era un mutante extendido. Los scFv mutantes se resumen en la Tabla 5.

TABLA 5 Se realizó un análisis comparativo de los cuatro scFv mutantes y Yl scFv en la unión a plaquetas mediante análisis FACS, de la siguiente manera.

El anticuerpo anti-scFv se generó mediante inmunización de un conejo con 400 µg de una mezcla de scFv, y se rotuló usando la Phycolink®. Estuche de conjugación de R-ficoeritrina (ProZyme, San Leandro, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se incubaron alícuotas (10 µg/ml) de scFv con 107 plaquetas lavadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las plaquetas luego se lavaron en PBS que contiene 1% BSA y se incubaron con R-ficoeritrina - anticuerpo anti-scFv durante 1 hora a temperatura ambiente. Las plaquetas luego se lavaron, se resuspendieron en PBS y se analizaron muestras (104 plaquetas) mediante FACS (VACScan, Becton-Dickinson, CA) .

La Figura 15 muestra la unión promedio +SEM de 3 experimentos usando plaquetas de diferentes donantes. R2A mutante no presenta unión a plaquetas, comparado con el scFv parental de Yl, sugiriendo que la arginina de la segunda posición de CDR3H puede tener un papel en la función de unión a plaquetas. V5R mutante se unió a plaquetas en forma similar al Yl-scFv detipo silvestre, a la gama de concentraciones de entre 1 y 10 µg/ml. A una concentración de 20 µg/ml sin embargo, la unión de V5R fue dos veces más alta comparada con Yl scFv (Figura 15) . En cambio, A3R scFv mutante presentó una unión nueve veces más alta a las plaquetas comparado con Yl scFv a todas las concentraciones ensayadas, sugiriendo que un residuo de arginina adicional adyacente al residuo de arginina en la posición 2 puede aumentar la unión a plaquetas. El scFv extendido no se unió a plaquetas (Figura 15) , como se esperaba de un mutante que no tiene arginina en la segunda posición.

El scFv también se analizó por su capacidad de unión a glicocalicina purificada y a GPIboc derivado de péptidos usando ensayos ELISA. La Figura 16 muestra estos resultados como la unión promedio de 5 µg/ml de scFv + STDV de 2 experimentos. R2A scFv mutante y el scFv extendido no se unieron a GPIbcc purificado ni a ningúno de los péptidos derivados de GPIboc. V5R se unió a glicocalicina purificada y a péptidos derivados de GPIba en forma similar a 1Y1. A3R mutante presentó unión mejorada a glicocalicina comparado con Yl . 1111111 El efecto de scFv mutante sobre la agregación de plaquetas se evaluó en estudios realizados de la siguiente manera. Plaquetas lavadas se agitaron a 500 rpm a 37 °C en un Lumiagregómetro (Chronolog, Havertown, PA) . La diferencia en la transmisión de luz a través de la supresión de plaquetas y el medio de suspensión lse tomó como 100% de agregación. El efecto de mAb-scFv sobre la agregación de plaquetas se evaluó mediante incubación con diferentes concentraciones de mAb-scFv durante 2 minutos a temperatura ambiente antes de agregar agonistas y anotando la agregación durante cuatro minutos .

El efecto de A3R scFv sobre la agregación de plaquetas se halló que era coherente con su capacidad de unión a plaquetas mejorada. La Figura 17 muestra que este mutante presenta una inhibición más eficaz de la agregación de plaquetas que depende de vWF inducida por ristocetina en plaquetas lavadas, comparada con Yl scFv (IC50 de 0,2 µ? y 0,8 µ?, respectivamente) .

Tomados juntos, estos experimentos demuestran que un residuo de arginina en la posición 2 en el Y1-CDR3H puede ser relevante para la unión a GPIboc de plaqueta. Además, esa unión puede participar en la interacción electrostática ya que el agregado de un residuo de arginina adicional en la posición 3 aumentó tanto la capacidad de unión a plaquetas como la función anti-agregación .

Ejemplo 5 La actividad biológica de A3R y de Yl scFv se evaluó también en un ensayo de Analizador de Cono y Plaqueta (CPA) , que es un método nuevo para evaluar clínicamente la adhesión y la agregación de plaquetas sanguíneas enteras en una superficie de poliestireno bajo índices de corte altos, imitando entonces las condiciones fisiológicas (Varón et al (1997) Thromb. Res. 85(4): 28e3-294; Shenkman et al (2000) Thromb. Res. 99(4): 353-361).

Estos experimentos se realizaron de la siguiente manera. Se colocaron muestras de sangre (0,2 mi) en placas de poliestireno de cuatro receptáculos de cultivo sin tejido (Nunc, Rockilde, Dinamarca) y se sometieron a flujo durante 1 minuto a un corte de 1300 s-1, usando un cono de Teflón giratorio, que se diseñó específicamente para este sistema. El cono tenía un diámetro de 14 mm con un ángulo de 2,45°, que indujo un esfuerzo de corte de fluido constante sobre la superficie completa de la placa. Los receptáculos luego se lavaron completamente con PBS, se mancharon con manchado de May-Grunwald y se analizaron con un microscopio de luz invertida (Olympus, Tokio, Japón) conectado a un sistema de análisis de imágenes (Galai, Migdal Haemek, Israel) .

El ensayo CPA se realizó para evaluar el efecto de 1 µ? (25 µg/ml) y 2 µ? (50 µg/ml) de anticuerpos scFv sobre la adhesión de plaquetas en el ensayo CPA. Como se muestra en la Figura 18, mientras el A3R mutante demostró una reducción en la cobertura de superficie del 13% en el control al 7% y 3% a una concentración de 1 µ? y 2 µ?, respectivamente. En comparación, Yl-scFv no tuvo ningún efecto sobre la cobertura de superficie y fue similar al control a ambas concentraciones . Estos resultados indicaron que A3R mutante inhibe la adhesión de plaquetas a la superficie de poliestireno en condiciones de flujo mediante CPA a través de su unión al receptor de GPIb en las plaquetas .

El tamaño promedio (AS) de ambos anticuerpos se redujo ligeramente (no se muestran datos) . Estos resultados indican que A3R scFv puede inhibir la adhesión de plaquetas a la superficie de poliestireno en condiciones de flujo a través de su unión al receptor de GPIb en plaquetas.

Basado en las observaciones de que A3R se une a GPIb sulfatado e impide la interacción entre GPIb y vWF que ocurre exclusivamente en condiciones de esfuerzo de alto corte, que ocurre en las arterias pequeñas o creada por la estenosis arterial, este anticuerpo puede ser de uso terapéutico para prevenir y/o tratar la enfermedad aterosclerótica .

Ejemplo 6 El presente ejemplo describe una comparación de las características de unión de S15, A3R e Yl al plasma rico en plaquetas sano (PRP) .

Se realizó el análisis FACS en muestras de PRP preparadas a partir de dos donantes sanos para analizar la unión de Yl, A3R, y S15 a concentraciones diferentes a las plaquetas, cuyos resultados se ilustran en la Tabla 6.

TABLA 6 Muestra N° de PRP *"Neg" significa negativo y se define como cuando Geo Promedio inferior a 10.

Muestra de PRP N°2 Los resultrados de la Tabla 6 indican que a concentraciones de ?µ?, A3R se une a plaquetas con una afinidad más fuerte que S15, que se une a plaquetas con una afinidad más fuerte que Yl . A l µg, geo medio promedio de ambas muestras de PRP fue 116 para A3R, 26 para S15 y negativo para Yl .

Se analizaron scFv seleccionados (0,5 µg por experimento) mediante FACS para evaluar la unión a PRP (Plasma rico en Plaquetas) que expresa GPIb. Como se muestra en la Tabla 7, Di y D3 presentaron unión significativa a PRP, la unión de DI a un nivel relativamente mayor. El nivel de unión de Di a PRP fue similar a aquella que presentó scFv Sil (LRYPFF) (SEQ ID N° 31), cuya selección se describe en el Ejemplo 1 de la Solicitud de Patente Estadounidense Acta N° 10/611.238.

TABLA 7 Ejemplo 7 El presente ejemplo describe una comparación de las características de unión de S15, A3R, e Yl a células sanguíneas enteras sanas que contienen granulocitos (G) , linfocitos (L) , y monocitos (M) .

Se realizó el análisis FACS en muestras de sangre entera humanas de dos donantes sanos para anlizar la unión de Yl, A3R y S15 a diferentes concentraciones a células sanguíneas enteras, cuyos resultados se ilustran en la Tabla 8.

TABLA 8 Muestra de Sangre Entera N°l Muestra de Sangre Entera N°2 Los resultados de la Tabla 8 ' indican que la afinidad.de unión de S15 a células sanguíneas enteras es más alta que la afinidad de unión de A3R e Yl. A una concentración de 0,1 µg, el geo medio promedio de la unión a S15 de muestras de sangure entera fue medio a alto, mientras que geo medio promedio de A3R e Yl de ambas muestras de sangre entera fue negativo o ligeramente positivo a 0,5 µg.

Se analizaron scF Dl, D3 y Sil (0,5 µg por experimento) mediante FACS para evaluar la unión a sangre entera (restringido en linfocitos, monocitos y plaquetas) . Como se muestra en la Tabla 9, DI presentó la mayor unión a todos los tipos de célul relación los otros dos scFv.

TABLA 9 Ejemplo 8 Este ejemplo describe el desarrollo de un sistema de modelo animal in vivo no humano para estudiar adicionalmente las propiedades de los anticuerpos que comprenden la secuencia de consenso. üna meta inicial fue identificar una especie de mamífero no humano en la cual uno (o más) de los anticuerpos (a) se une a las plaquetas y (b) es capaz de inhibir la agregación de plaquetas.

La capacidad de diferentes anticuerpos de unirse a plaquetas aisladas de diferentes especies de mamíferos se determinó mediante análisis FACS y los resultados de la unión relativa se resumen en la Tabla 10.

TABLA 10 ND = No determinado Dentro de cada especie ensayada, scFv Yl presentó la unión relativa más débil entre los anticuerpos que comprenden la secuencia de consenso. Esta observación soporta la conclusión de que los scFv mutantes (A3R) y seleccionados de bibliotecas (S15, Sil, SI y Di) todos tienen capacidad de unión mejorada para epitopes sulfatados, como ocurre en GPIb de plaqueta.

Por ejemplo, scFv A3R y S15 presentan una capacidad de unión 5-9 veces mayor que en plaquetas humanas y de conejillos de Indias, mientras que la capacidad de unión de Sil, SI y Di a aquellas especies es 25 veces mayor que Yl .

Con respecto al conjunto de especies de plaquetas no humanas unido por el panel de scFv, Sil, SI y DI se unen cada uno a plaquetas derivadas de perros, conejillos de Indias y conejos. S15 se une a plaquetas de perros (afinidad más alta) , conejillos de Indias y cerdos, pero no de conejos, ratones o monos (mandril y mono cinomalogo) . Fundamentalmente, el conejillo de Indias es la única especie no humana identificada en la cual todos los anticuerpos que comprenden la secuencia de consenso son capaces de unirse a plaquetas.

Efecto sobre la agregación de plaquetas Aunque SI, Sil y DI se unen a plaquetas obtenidas de conejillos de Indias a una afinidad mucho más alta en relación con S15, la totalidad de estos scFv presentan una capacidad similar con respecto a la inhibición de la agregación de plaquetas.

El efecto inhibitorio de scFv S15 sobre la agregación de plaquetas de conejillos de Indias (IC50 80-160 µg/ml) se halló que fue 18-10 veces más baja en relación con su efecto inhibitorio sobre plaquetas obtenidas de humanos. Esto puede deberse a la unión más baja relativa del anticuerpo scFv S15 a plaquetas obtenidas de conejillos de Indias.

La unión de los anticuerpos IgGl S15 e IgG Yl a plaquetas humanas y obtenidas de perros se halló que era similar. Los dos anticuerpos indujeron la agregación de plaquetas en plaquetas de humanos y obtenidas de perros a la misma concentración. Farmacocinética de scFv en conejillos de Indias Para evaluar la farmacocinética del anticuerpo scFv en conejillos de Indias, 10 mg/kg de scFv A3R se administró en forma intravenosa a conejillos de Indias como un solo bolo. El nivel del scFv A3R en la sangre de los conejillos de Indias en diferentes puntos de tiempo se determinó usando el ensayo ELISA y el nivel del scFv unido a plaquetas se determinó usando un análisis FACS .

Tres conejillos Indias machos (peso de 500g) se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de cetamina (50 mg/kg) mezclada con xilazina (20 mg/kg) . Se administró scFv A3R mediante una inyección intravenosa de bolo a 10 mg/kg (5 mg/conejillo de Indisas) . Se extrajeron muestras de sangre al tiempo 0 (antes de la administración del anticuerpo) y a 3, 10, 20, 30, 60,90, 120, 180 y 360 minutos después de la administración del anticuerpo. En cada punto de tiempo, se extrajeron 0,5 mi de sangre. Se usó citrato de sodio al 3,8% como anticoagulante. Se obtuvo plasma centrifugando muestras de sangre a 3000 x g durante 15 minutos y se almacenó a -20 °C y se obtuvo PRP centrifugando muestras de sangre a 150 x g durante 10 minutos. A3R scFv unido a plaquetas se ensayó en PRP de conejillos de Indias mediante análisis FACS usando anticuerpos rotulados con PE anti-scFv. Las concentraciones de anticuerpo scFv A3R en plasma se ensayaron mediante ELISA especifico.

El análisis FACS se usó para evaluar el nivel de anticuerpo scFv A3R unido a plaquetas de conejillos de Indias a puntos de tiempo diferentes después de la administración de bolos. Los resultados (Figura 19) mostraron que a los 10 minutos después de la administración de bolos de 10 mg/kg de scFv-A3R, el nivel de scFv unido a plaquetas fue del 40%-80% del nivel máximo y alcanzó el nivel máximo después de 120 minutos. La unión del anticuerpo scFv-A3R a plaquetas permaneció alto durante 360 minutos (6 horas) y se redujo un 90% a las 24 horas después de la administración del bolo..

El nivel en plasma de A3R-scFv se midió mediante ELISA usando placas cubiertas con péptido GPIb que tiene tirosina sulfatada a Tyr-276 (1 µ?/receptáculo) . Se detectó scFv lunido agregando un anticuerpo anti-VL de conejo (liviano variable) , seguido por HRP anti-conejo (Sigma) y sustrato de 3., 3' , 5, 5' -tetrametil-bencidina ( MB) (Sigma, St . Louis, MO) . La intensidad del color producido se leyó con un lector de placas de ELISA (Anthos, Salzburgo) O.D. 450. La concentración en plasma del scFv en cada muestra se calculó desde curvas estándar construido agregando una cantidad conocida de estos anticuerpos al plasma de conejillo de Indias o a PBS que contiene un 0,05% de Tween 20 y un 2% de leche descremada .

Los resultados muestran que la concentración en plasma de scFv A3R hizo pico 3 minutos después de la inyección de bolo y disminuyó gradualmente durante 6 horas (Figura 20) . La semivida de A3R en el conejillo de Indias fue 139±9 minutos..

En resumen, el estudio precedente proporciona una indicación preliminar de que A3R tiene un perfil farmacocinético favorable, basado en que se logró rápidamente el nivel de saturación en las plaquetas blanco y la semivida relativamente prolongada.

Ejemplo 9 El biosensor BIAcore usa detección de resonancia de plasma superficial y permite el análisis cinético en tiempo real de dos especies interactuantes . Este sistema se usó para medir la cinética de unión de los scFv Yl, A3R y S15 a glicocalicina, un polipéptido obtenido de GPIb de plaqueta.

Las afinidades " de unión de los anticuerpos para glicocalicina se determinaron usando un aparato BIAcore (BIAcore, Uppsala, Suecia) . Glicocalicina (ligando inmovilizado) se inmovilizó en forma covalente en un chip CM5 (BIAcore) en acetato de sodio 10 mM, a pH 4,6, a un flujo de 20 µ?? min-1. Todos los experimentos de unión se realizaron en tampón HBS, a pH 7,4 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA) ue incluye 0, 005% (v/v) del detergente no iónico, P20 (polioxietileno sorbitan) . Las afinidades de unión (KD) de los anticuerpos para glicocalicina se determinaron suando el software BIAevaluation 3.1 (BIAcore), desde cinéticas Ka (índice de asociación) y Kd (índice de disociación) promedio.

A3R-scFv se une a glicocalicina de plaqueta con afinidad más alta que el Yl-scFv (7 veces) , como lo indica su índice de asociación más rápido (Tabla 11) . Estos resultados están de acuerdo con los resultados obtenidos con el análisis FACS en plaquetas intactas. Sl5-scFv también se une a glicocalicina con afinidad más alta que Yl-scFv pero más baja que A3R.

TABLA 11 Ejemplo 10 Este ejemplo describe la unión directa de anticuerpos que comprenden la secuencia de consenso a pépticos sintéticos basado en esas regiones de PSGL-1, GlPb y CCR5 que sufren sulfatación en residuos de tirosina.

Los péptidos sintéticos usados fueron los siguientes. PSGL-1 (residuos 42-58) derivados QATEYEYLDYDFLPETE (no sulfatado) SEQ m NO;26 QATEYS EYLDYDFLPETE (sulfatado en 1a posición tirosina) SEQ ro NO:48 QATEYEYS LDYDFLPETE (sulfatado en 2a posición tirosina) SEQ ID NO:49 QATEYEYLDYS DFLPETE (sulfatado en 3a posición tirosina) SEQ ID NO:7 GPIb (residuos 2168-285) derivados GDEGDTDLYDYYPEEDTE (no sulfatado) SEQ ID NO:43 GDEGDTDLY5 DYYPEEDTE(sulfatado 2a posición tirosina) SEQ ID NO:44 GDEGDTDLYDYY5 PEEDTÉ'( sulfatado 3a posición tirosina) SEQ ID NO:50 CCR5 (residuos 1-18) derivados MDYOVSSPIYDINYYTSE (no sulfatado) SEO ED NO-.51 MDYS QVSSPIYDINYYTSE (sulfatado 1 "'posición de tirosina) SEQ ID NO:52 MDYQVSSPIY5 DINYYTSE (sulfatado 2a posición de tirosina) SEQ ID NO.-53 MDYQVSSPIYDINY5 YTSE (sulfatado 3o posición de tirosina) SEQ ID NO:54 Los scFv fueron N06 (control negativo, Yl (P03) , S15, Sil, SI, S9, s.c. 3:1 y Sil.

Los diferentes péptidos sulfatados y no sulfatados se adhirieron a placas de microtitulo NH CovaLink® (Nunc, Dinamarca) después del pretratamiento de las placas con Sulfo-NHS (3,48 mg/ml) y EDC (3,07 mg/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por un lavado en agua y tres lavados en PBS que contiene 0,05% Tween. Las placas se bloquearon con tampón PBS que contiene un 5% de leche descremada y lun 0,05% de Tween usando agitación suave a temperatura ambiente durante 1 hora. Se agregaron péptidos sintéticos (???µ? por receptáculo), seguido por el lavado 5 veces con tampón PBS que contiene un 0,05% de Tween y las placas se secaron a temperatura ambiente. Para .la unión, se agregaron anticuerpos scFv purificados de proteina A (0, 5µg/ eceptáculo) a las placas para la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. -Para el ELISA, se agregó un anticuerpo (anti-scFv) policlonal VL anti-humanc de conejo en tampón de bloqueo a las placas para la incubación a 25°C durante.60 minutos. El exceso de anti-scFv se removió lavando 5 veces con tampón PBS que contiene un 0,05% de Tween. Se agregó un anticuerpo rotulado con HRP anticonejo de cabra en tampón de bloqueo para la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, y el exceso se removió lavando 10 veces. Se agregó un desarrollador TMB durante 5 minutos y se neutralizó con 0,5M H2S04 (100 µ?/receptáculo) . La reacción de color se leyó con un lector de placas de ELISA a 450 nm de longitud de onda. Cada muestra se ensayó por duplicado y se calculó el promedio.

TABLA 12 La Tabla 12 y la Figura 21 indican que todos los anticuerpos scFv ensayados que comprenden la secuencia de consenso se unieron significativamente al péptido derivado de PSGL-1 slulfatado en la tercera posición de tirosina, pero no a aquel sulfatado en la primera o segunda posición de tirosina. Los anticuerpos de una sola cadena Si, S9 y 3.1 mostraron la unión más resistente al péptido derivado de PSGL-1 sulfatado en la tercera posición de tirosina. Estos anticuerpos también se unen al péptido derivado de GPIb sulfatado en la primera posición de tirosina, los scFv Si, S9 y 3.1 muestran la unión más resistente y los scFv S115 y Sil muestran la unión intermedia al péptido derivado de PBIb sulfatado en la tercera posición de tirosina. También se observó una unión significativa de estos anticuerpos al péptido derivado de CCR5 sulfatado en la segunda posición de tirosina, pero no a aquel sulfatado en. la primera o tercera posición de tirosina. El anticuerpo de una sola cadena Sil mostró la unión más resistente al péptido derivado de · CCR5 sulfatado en la segunda posición de tirosina. No se observó ninguna unión con el anticuerpo control, scFv.

Los resultados obtenidos con el péptido derivado de CCR5 sulfatado en la segunda posición de tirosina sugieren que al menos scFv Sil y posiblemente otros anticuerpos que comprenden la secuencia de consenso pueden tener potencial como inhibidores de la infectividad con HIV en células humanas .

Ejemplo 11 Se realizaron estudios para demostrar que un anticuerpo IgG que comprende la secuencia de consenso de la invención es capaz de mediar la citotoxicidad de las células que depende edel anticuerpo (ADCC) de células blanco, particularmente células de B-CLL derivadas de muestras de pacientes. Además, el hiper entrecruzamxento de Sl5-IgG con anticuerpos Fe anti- umanos secundarios demostró que un mecanismo apoptótico también contribuye a la eliminación de células.

Los experimentos de Citotoxicidad de Células que Depende del Anticuerpo (ADCC) fueron los siguientes. Células efectoras mononucleares y blanco se separaron en FICOLL® y las células blanco luego se rotularon con PKH26, que incorpora establemente un colorante fluorescente dentro de las regiones de lipidos de las membranas celulares. Las células luego se lavaron y se incubaron con células efectoras a diferentes relaciones de Efector : Blanco (E:T), en la ausencia o en la presencia de concentraciones diferentes de S15 IgG o anticuerpos control durante 24 horas. Las células muertas se mancharon con TOPRO® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) y se analizaron mediante FACS en células blanco restringidas.

Células efectoras mononucleares de donantes sanos y células blanco de B-CLL de tres pacientes se co-incubaron a diferentes relaciones de E:T en la presencia y en la ausencia de S15-IgG durante 24 horas, seguido por el análisis FACS. La Figura 22B muestra la citotoxicidad de las células efectoras mediada por S15 IgG en las tres muestras, con lun 30%-50% de ADCC comparadas con el control .

ADCC de S15-IgG está mediada por células asesinas naturales y monociticas . Se analizaron células efectoras por su capacidad de efectuar ADCC mediada por S15 IgG de células de B-CLL. Se aislaron células asesinas naturales (CD56+) y monociticas (CD14+) tanto de donantes normales como de pacientes con B-CLL usando cuentas magnéticas disponibles comercialmente . La Figura 23 muestra que las células NK de lun donante normal y de pacientes con B-CLL fueron capaces de efectuar ADCC, lo cual derivó en un 50% y un 35% de eliminación respectivamente. Los monocitos tanto de donantes normales como de pacientes con B-CLL también fueron capaces de efectuar ADCC (lun 5%-13%) . Sin embargo, las células NK de CD56+ constituyeron la población de células efectoras más significativa para ADCC mediada por S15 IgG de células de B-CLL.

Los experimentos de apóptosis fueron los siguientes. Se separaron células mononucleares de pacientes con B-CLL en FICOLL® y las células se incubaron en la presencia o en la ausencia de S15-IgG o anticuerpos control durante 10 minutos a 37 °C. Luego se agregaron anticuerpos anti-humanos y se incubaron durante 4-24 horas a 37 °C. Luego se mancharon células enfermas (CD19+, CD5+) con marcadores apoptóticos Amexina y TOPRO® y se analizaron mediante FACS .

Apóptosis inducida de S15-IgG. El análisis FACS mostró que las células mononucleares (CD19+, CD5+) de pacientes con B-CLL en la presencia de Sl5-IgG presentaron un 10% de apóptosis dentro de las 5 horas (Figura 24). El agregado de anticuerpos secundarios, que se entrecruzan con el Sl5-IgG, produjo un 50% de apóptosis dentro de las 5 horas (Figura 24).

Esto constituye una fuerte evidencia de que el entrecruzamiento de un anticuerpo dirigido hacia un epitope sulfatado en PSGL-1 dispara señales para la apóptosis de células de B-CLL primarias. Esto implica que PSGL-1 puede ser un blanco para inducir la apóptosis en pacientes con B-CLL in vivo, en donde el efecto del entrecruzamiento se puede mediar con el receptor de Fe que transporta células por ejemplo monocitos, células NK CD56+ y células ?d+ T.

A diferencia de S15~IgG, el anticuerpo humanizado Rituximab, que se usa ampliamente para el tratamiento de diferentes enfermedades linfoides que incluyen B-CLL, no mostró ningún aumento de la apóptosis luego del entrecruzamiento (Figura 25) .

Los efectos apoptóticos y de entrecruzamiento descritos anteriormente para Sl5-IgG pueden inhibirse usando el anticuerpo murino KPLl dirigido contra PSGL-1, que solo no induce la apóptosis (no se muestran datos) . Esto confirma Ique la señal apoptotica se media a través de un epitope en PSGL-1.

Además, el análisis FACS mostró que S15 IgG se une a todas las muestras de B-CLL ensayadas, a diferencia de su unión marginal a células B normales. Tomados juntos, los resultados sugieren que S15-IgG es un candidato prometedor como agente terapéutico en el tratamiento de B-CLL, ya que sus efectos citotóxicos y apoptóticos parecen ser mediados a través del reconocimiento especifico de un epitope sulfatado de PSGL-1 expresado en estas células enfermas .

Ejemplo 8 Detección de Biblioteca de Compuestos Inorgánicos, ün péptido sulfatado sintético (sulfatado en un residuo de tirosina específico dado dentro de la secuencia de aminoácido conocida del péptido) derivado de un receptor específico (proteína) se puede preparar con un marcador de biotina (biotinilado) acoplado al péptido sintético a través de un ligador lcorto tal como ácido caproico. Se pueden preparar péptidos control usando el mismo péptido sintético sin sulfatación y sin el marcador de biotina ("B") · Además, se pueden preparar péptidos sulfatados sintéticos derivados de otras proteínas no sulfatadas sin que tengan el marcador de biotina ("C") como controles adicionales.

El péptido biotinilado precedente ("A") se puede acoplar a cuentas magnéticas recubiertas con estrepavidina y el exceso de péptido biotinilado no unido luego se lava. El conjugado de biotina-estretavidina péptido ("D") puede detectarse contra una biblioteca de entidades químicas pequeñas en la presencia de un gran exceso de péptido control no sulfatado ("B") en condiciones fisiológicas (37°C, pH 7,0-7,4, concentración de sales, conductividad, etc.) para las moléculas que se unen a "A". Las cuentas magnéticas acopladas luego se lavan dos veces con tampón, cada vez se centrifugan para remover el exceso de moléculas no unidas. Las moléculas unidas a las cuentas magnéticas ("E") se pueden eluir, identificar químicamente y preparar en mayor cantidad para una nueva detección.

La confirmación de la unión a péptidos sulfatados biotinilados por compuestos químicos seleccionados ("E") puede realizarse mediante otro proceso de detección. Este proceso incluye la competencia con péptidos sulfatados no relacionados que se biotinilan (proceso 1) o la competencia con un anticuerpo o fragmentos de él (por ejemplo, scFv) que se une específicamente al péptido biotinilado, "A" (proceso 2) .

Re-detección mediante la competencia con péptidos sulfatados biotinilados no relacionados (Proceso 1) . Para asegurar que los compuestos se unan especificamente a "A", se puede realizar una segunda vuelta de detección. El conjugado de biotina-estreptavidina péptido ("D") puede re-detectarse con los compuestos "E" seleccionados en la presencia de un gran exceso de péptidos sulfatados biotinilados no relacionados, "C". El tubo luego se centrifuga, el conjugado de biotina-estretavidina péptido acoplado a cuentas magnéticas se lavó dos veces con tampón y se centrifugó cada vez para remover el exceso de moléculas no unidas. Los compuestos que se unieron a las cuentas magnéticas pueden eluirse para la identificación de compuestos químicos. Se pueden preparar cantidades mayores del compuesto químico para otros estudios, tales como validación de la unión selectiva a "A" y el ensayo de eficacia in vitro e in vivo.

La re-detección mediante competencia con anticuerpo antisulfatado scFv especifico (Proceso 2) fue la siguiente. Los compuestos con afinidad de unión preferida a "A" se pueden re-detectar haciendo competir la unión del conjugado de biotina-estreptavidina péptido ("D") con cada uno de los compuestos seleccionados "E" en la presencia de un gran exceso de anticuerpo scFv especifico que reconoce y se une específicamente a "A". Los compuestos químicos que se inhiben específicamente a partir de la unión a "A" con el anticuerpo scFv pueden prepararse para otros estudios, tales como validación de la unión selectiva a "A", y el ensayo de eficacia in vitro e in vivo.

La descripción y los ejemplos precedentes se han presentado exclusivamente para ilustrar la invención y no son taxativos. Dado que a los expertos en el arte se les pueden ocurrir modificaciones de las realizaciones descritas que incorporan el espíritu y la esencia de la invención, se deberá interpretar que la invención incluye todo aquello que está dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y sus equivalentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento de él que comprende una secuencia de consenso: Xi-Xz-Xa-Pro-Xs-Xe En donde Xx y X6 son aminoácidos hidrófobos y X2, X3 y X5 son cualquier aminoácido.

2. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los aminoácidos hidrófobos se seleccionan del grupo formado por leucina, valina, metionina, alanina, fenilalanina e isoleucina.

3. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde X2 es un aminoácido básico.

4. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el aminoácido básico se selecciona del grupo formado por arginina y lisina.

5. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde X2 y X3 son arginina.

6. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde Xe es isoleucina.

7. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde Xi se selecciona del grupo formado por leucina y metionina y X5 se selecciona del grupo formado por serina y valina.

8. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de consenso está dentro de las regiones hipervariables del anticuerpo o fragmento de él.

9. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde una región determinante de complementariedad (CDR) comprende al menos una parte de la secuencia de consenso.

10. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la CDR es la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de él.

11. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él comprende una región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido del grupo formado SEQ ID N° 9, 10, 13, 14, 28 y 31.

12. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR) que tiene una secuencia de aminoácido que se selecciona del grupo formado por SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18.

13. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él comprende una primera región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR) que se selecciona del grupo formado por SEQ ID N° 9, 10, 13, 14, 28, y 31; una segunda CDR de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 17 y una tercera CDR de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID N° 18.

14. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él comprende una secuencia que se selecciona del grupo formado por SEQ ID N° 5, 6, 55, 56, 60 y 61.

15. El anticuerpo lo fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él se une a un epitope sulfatado de PSGL-1, GPIb y/o CCR5.

16. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él reacciona en forma cruzada con dos o más epitopes, cada epitope tiene uno o más residuos de tirosina.

17. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 15, en donde cada epitope comprende al menos un grupo de dos o más aminoácidos ácidos .

18. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él se une a uno o más epitopes, sulfatados en una o más posiciones presentes en una proteina que se selecciona del grupo formado por: a-2 antiplasmina, aminopeptidasa B, receptores de CC quimiocina, un receptor de siete segmentos transmembrana (7TMS) , factores de coagulación V, VIII y IX, cadena gamma de fibrinógeno, cofactor de heparaina II, secretogramina I y II, vincristina, precursor amilodie, a-2-antiplasmina, colecistocinina, a-coriogonadotropina, complemento C4, dermatan sulfatoproteoglican, fibronectina y castrina.

19. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el receptor de CC-quimiocina se selecciona del grupo formado por CCR2, CCR5, CXCR3, CXCR4, CCR8 y CCR2b.

20. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él se une a un epitope en al menos un tipo de célula que se selecciona del grupo formado por células de pre-B-ALL, células de CLL, células de mieloma múltiple, células metastásicas, células de T-ALL, células de AML, plaquetas, granulocitos, linfocitos y monocitos .

21. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él se une e inhibe la agregación de plaquetas .

22. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el anticuerpo o fragmento de él comprende al menos una parte de SEQ ID N° 9, 10, 28 y 31.

23. El anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de él además se une a un epitope en una molécula de lipido, carbohidrato, péptido, glicolipido, glicoproteina, lipoproteina, y/o lipopolisacárido .

24. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente aceptable de él.

25. Un estuche de diagnóstico, pronóstico o determinación de fases que comprende un anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1 y un agente de formación de imágenes.

26. Una secuencia de ADN aislada o purificada que codifica el anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1.

27. ün vector de expresión que comprende la secuencia de ADN aislada o purificada de acuerdo con la reivindicación 24.

28. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 27.

29. La célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 28, o la progenie de ella, en donde la célula huésped recombinante expresa el anticuerpo o fragmento de él.

30. Un método de producir un anticuerpo o fragmento de él que comprende cultivar la célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 28, en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo o fragmento de él.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, que además comprende aislar o purificar el anticuerpo o fragmento de él desde la célula huésped recombinante o el medio de la célula huésped recombinate.

32. Un polipéptido que comprende una secuencia de consenso: Xi~X2-X3-Pro-X5-X6 En donde ?? y X6 son aminoácidos hidrófobos y X2, X3 y X5 son cualquier aminoácido.

33. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el polipéptido es sustancialmente circular o un bucle.

34. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el polipéptido se une a PSGL-1, GPIb y/o CCR5 sulfatado, y en donde el polipéptido se une con una afinidad sustancialmente similar a aquella de un anticuerpo scFv o un fragmento de él de SEQ ID N° 5, 6, 55, 56, 60 o 61.

35. ün método de tratar una enfermedad que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

36. ün método de tratar el arrollamiento celular que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composicón farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

37. ün método de tratar una infección que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la infección es producida por HIV.

39. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la administración previene la entrada de HIV.

40. Un método de tratar la inflamación que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

41. ün método de inhibir la enfermedad autoinmune que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

42. ün método de inhibir la metástasis que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

43. Un método de inhibir el crecimiento y/o la replicación de células de tumor que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

44. Un método de aumentar el índice de mortalidad de células de tumor que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

45. Un método de inhibir el crecimiento y/o la replicación de células de leucemia que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

46. ün método de aumentar el índice de mortalidad de células de leucemia que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

47. Un método de inhibir el crecimiento y/o la repelicación de células de B-CLL que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

48. Un método de aumentar el índice de mortalidad de células de leucemia que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

49. Un método de alterar la susceptibilidad de las células enfermas al daño por agentes anti-enfermedad que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

50. Un método de aumentar la susceptibilidad de células de tumor al daño por agentes anticáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

51. ün método de aumentar la susceptibilidad de células de leucemia al daño por agentes antileucemia que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

52. ün método de aumentar la susceptibilidad de células de B-CLL al daño por agentes antileucemia que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

53. ün método de inhibir la agregación de plaquetas que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

54. ün método de inhibir la restenosis que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

55. ün método de producir la citotoxicidad mediada por células que depende del anticuerpo (ADCC) que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

56. El método de acuerdo con la reivindicación 55, en donde la ADCC es mediada por células efectoras que comprenden células asesinas naturales (NK) o monociticas.

57. ün método de producir la apóptosis en células de leucemia que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

58. ün método de estimular una célula asessina natural (NK) o una célula T que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24.

59. El uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24 en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad.

60. Un método de diagnosticar, pronosticar o determinar fases de una enfermedad en un paciente que comprende: proporcionar una muestra que contiene una célula del paciente y determinar si el anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1 se une a la célula del paciente, indicando asi que el paciente está en riesgo o tiene la enfermedad.

61. lün método de purgar células de tumor de un paciente que comprende : proporcionar una muestra que contiene células del paciente y incubar las células del paciente con un anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1.

62. El método de acuerdo con la reivindicación 61, en donde la purga ocurre ex vivo.

63. ün método para seleccionar un anticuerpo o fragmento de él o un polipéptido que comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca de presentación de fagos, (b) proporcionar un péptido que se selecciona del grupo formado por SEQ ID N° 7, 44 y 53, (c) panear la biblioteca de presentación, de fagos para seleccionar un anticuerpo scFv o lun fragmento de él que se une al péptido que se selecciona del grupo formado por SEQ ID N° 7, 44, 50 y 53; y (d) producir el anticuerpo scFv o fragmento de él seleccionado.

64. El método de acuerdo con la reivindicación 63, en donde el anticuerpo scFv o fragmento de él seleccionado se une a un péptido que se selecciona del grupo formado por SEQ ID N° 7, 44 y 53.

65. El método de acuerdo con la reivindicación 63, en donde péptido lse inmoviliza.

66. El método de acuerdo con la reivindicación 65, en donde el paso (c) además comprende: panear en la presencia de al menos un péptido soluble que se selecciona del grupo formado por SEQ ID N° 26, 43, 44, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 57, 58, y 59.

67. El método de acuerdo con la reivindicación 65, en donde el anticuerpo o fragmento de él seleccionado no se une a la SEQ ID N° 26, 48 o 49.

68. El método de acuerdo con la reivindicación 65, en donde el anticuerpo o fragmento de él seleccionado no se une a SEQ ID N° 43.

69. El método de acuerdo con la reivindicación 65, en donde anticuerpo o fragmento de él seleccionado no se une a SEQ ID 51, 52 o 54.

70. Un anticuerpo o fragmento de él producido de acuerdo con el método de acuerdo con la reivindicación 63.

71. Una biblioteca de dominios de unión a inmunoglobulina que comprende un dominio de unión de antigenos diverso para la unión complementaria, en donde la biblioteca tiene diversidad solamente en la CDR3 de cadena pesada.

72. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 71, en donde los dominios de unión a inmunoglobulina son moléculas de scFv.

73. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 71, en donde los dominios de unión a inmunoglobulina . comprenden regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) 1 y 2 derivadas de DP32.

74. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 71, en donde los dominios de unión a inmunoglobulina comprenden regiones variables de cadena liviana derivadas de DP32.

75. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 71, en donde los dominios de unión a inmunoglobulina se presentan en la superficie de partículas bacteriófago filamentosas.

76. Un método de seleccionar un epitope sulfatado que comprende los pasos de: proporcionar una biblioteca de acuerdo con la reivindicación 71, panear la biblioteca por un epitope sulfatado que se une al dominio de unión de antigeno; y aislar el epitope sulfatado.

77. Una molécula inorgánica pequeña, en donde la molécula pequeña se une a un epitope sulfatado de PSGL-1, GPIb y/o CCR5.

78. Una composición farmacéutica que comprende una molécula inorgánica pequeña de acuerdo con la reivindicación 77.