MXPA05000272A

MXPA05000272A - Anticuerpos y usos de ellos.

Info

Publication number: MXPA05000272A
Application number: MXPA05000272A
Authority: MX
Inventors: Hoch Mar-Chaim Hagit
Original assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2002-07-01
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2005-09-20
Also published as: KR20060011925A; AU2003263764A1; BR0312483A; JP2005536199A; CN1678347A; RU2005101621A; EP1534332A2; IL166063A0; PL374439A1; EP1534332A4; WO2004003166A3; CA2491363A1; WO2004003166A2

Abstract

La presente invencion proporciona anticuerpos o fragmentos de ellos que se unen a celulas de cancer y son importantes en fenomenos fisiologicos, tales como arrollamiento de celulas y metastasis. Tambien se proporcionan metodos terapeuticos y de diagnostico, pronostico o determinacion de etapas y las composiciones que usan esos anticuerpos o fragmentos de ellos. Los metodos y composiciones de acuerdo con la presente invencion pueden utilizarse en el diagnostico y la terapia de enfermedades como cancer, que incluyen crecimiento de tumores y metastasis, leucemia, enfermedad autoinmune y enfermedad inflamatoria.

Description

ANTICUERPOS Y USOS DE ELLOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con anticuerpos que se unen a epítopes particulares que están presentes en células, tales como células de cáncer, células metastáticas, células de leucemia, leucocitos, y plaquetas, y que son importantes en fenómenos fisiológicos diversos tales como arrollamiento de células, metástasis, inflamación y enfermedades autoinmunes . En particular, los anticuerpos pueden tener actividad anti-cáncer, actividad anti-metástasis , actividad anti-leucemia, actividad anti-viral, actividad anti-infección, y/o actividad contra otras enfermedades, tales como enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares tales como infarto de miocardio, enfermedades retinopáticas , y enfermedades causadas por interacciones de proteína-proteína que dependen de la tirosina sulfatada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Anticuerpos, Presentación de Fagos y Blanco de Tejido El blanco selectivo de tejidos de los agentes terapéuticos es una disciplina emergente en la industria f rmacéutica. Los nuevos tratamientos del cáncer basados en blancos se han diseñado para aumentar la especificidad y la potencia del tratamiento reduciendo simultáneamente la toxicidad, mejorando así la eficacia general. Se han empleado anticuerpos monoclonales de ratones (MAb) de antígenos asociados con tumores en un intento hacer blanco en toxinas, radionucleótidos y conjugados quimioterapéuticos a tumores. Además, se han explotado antígenos de diferenciación, tales como CD19, CD20, CD22 y CD25, como blancos específicos del cáncer en el tratamiento de enfermedades hematopoyéticas .

Aunque se lo ha estudiado ampliamente, este enfoque tiene varias limitaciones. Una de las limitaciones es la dificultad para los MAb apropiados que presentan la unión selectiva. Una segunda limitación es la necesidad de una alta inmunogenicidad del anticuerpo como prerrequisito para el aislamiento exitoso del anticuerpo. Una tercera limitación es que el producto final tiene secuencias no humanas, que inducen respuestas inmunes; por ej emplo cuando se da un MAb de ratón a un humano se genera una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) . La respuesta de HAMA con frecuencia deriva en una hemivida del suero más corta e impide tratamientos repetitivos, disminuyendo por lo tanto el valor terapéutico del anticuerpo. Esta última limitación ha estimulado el interés tanto en la creación de anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados de origen murino como en el descubrimiento de anticuerpos humanos . Otra limitación de este enfoque es que permite el aislamiento de solamente una sola especie de anticuerpos dirigidos contra solamente antígenos conocidos y purificados. Más aún, este método no es selectivo en la medida en que permite el aislamiento de anticuerpos contra marcadores de la superficie celular que están presentes en células normales así como malignas.

Existen numerosos factores que influyen en la eficacia terapéutica de los MAb para tratar el cáncer. Estos factores incluyen la especificidad y el nivel de expresión del antigeno sobre células de tumores, heterogeneidad antigénica y accesibilidad de la masa del tumor. Las leucemias y los linfornas han sido generalmente más sensibles al tratamiento con anticuerpos que los tumores sólidos tales como los carcinomas . Los MAb se unen rápidamente a células de leucemia y linfoma en el torrente sanguíneo y penetran fácilmente en las células malignas en el tejido linfático, haciendo a los tumores linfoides excelentes candidatos para la terapia basada en MAb. Un sistema ideal implica identificar un MAb que reconoce un marcador en la superficie celular de células madres que están produciendo células descendientes malignas.

Se han utilizado bibliotecas de presentación de fago para seleccionar fragmentos de variantes de una sola cadena al azar (scFv) que se unen a proteínas blanco predeterminadas, aisladas, tales como anticuerpos, hormonas y receptores. El uso de bibliotecas de presentación de anticuerpos en general, y de bibliotecas de scFv de fagos en particular, facilita un medio alternativo de descubrir moléculas únicas para apuntar a blancos específicos, aún no reconocidos y no determinados, de grupos de superficie celular.

Leucemia, linfoma y mieloma son cánceres que se originan en tejidos de la médula ósea y linfáticos y que están involucrados en el crecimiento incontrolado de las células . La leucemia linfobl stica aguda (ALL) es una enfermedad heterogénea que está definida por características clínicas e inmunológicas específicas. Como otras formas de ALL, la causa definitiva de la mayor parte de los casos de ALL de células B (B-ALL) se desconoce; aunque, en muchos casos, la enfermedad deriva de alteraciones genéticas adquiridas en el ADN de una sola célula, que produce anormalidades y multiplicación continua. El pronóstico para pacientes afectados con B-ALL es significativamente peor que para pacientes con otras leucemias, tanto en niños como en adultos . La leucemia linfocitica crónica (CLL) , uno de cuyos ejemplos es CLL de células B (B-CLL) es una forma de leucemia que progresa lentamente, caracterizada por un número aumentado de linfocitos . La leucemia mielógena aguda (AML) es un grupo heterogéneo de neoplasmas que tienen una célula progenitora que, en condiciones normales, da origen a células diferenciadas en sus extremos de la serie mieloide (eritrocitos, granulocitos , monocitos, y plaquetas) . Como en otras formas de neoplasia, la AML está asociada con alteraciones genéticas adquiridas que derivan en el reemplazo de células mieloides normalmente diferenciadas con blastos relativamente no diferenciados, que presentan uno o más tipos de diferenciación mieloide temprana. La AML generalmente evoluciona en la médula ósea y, en menor medida, en lo órganos hematopoyé icos secundarios . La AML afecta principalmente a los adultos y tiene picos de incidencia entre las edades de 15-40, pero también se sabe que afecta tanto a niños como a adultos mayores. Casi todos los pacientes con AML requieren un tratamiento inmediatamente después del diagnóstico para lograr una remisión clínica, en la cual no hay ninguna evidencia de niveles anormales de células de blastos no diferenciadas circulando.

Hasta la fecha, se han desarrollado una variedad de MAb que inducen la actividad citolítica contra células de tumores. El MAb murino muMAb4D5 producido contra el dominio extracelular de HER2 (P185) y que se halló que inhibe notablemente la proliferación de células de tumores humanos que sobreexpresan HER2 se humanizó para producir la droga HERCEPTIN® (trastuzumab) , aprobada por la FDA (Administración de Drogas y Alimentos) y que se está utilizando para tratar el cáncer de mama humano (Patentes Estadounidenses N° 5.821.337 y 5.720.954). Después de la unión, el anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento de las células de tumores que depende del receptor del factor de crecimiento de HER2. Además, un anticuerpo quimérico contra CD20, que produce el agotamiento rápido de las células B periféricas, que incluye aquellas asociadas con el linfoma, fue aprobado recientemente por la FDA (Patente Estadounidense N° 5.843.439). La unión de este anticuerpo a células blanco deriva en la lisis dependiente del complemento. Este producto ha sido aprobado recientemente y se está utilizando actualmente en la medicina clínica para tratar los linfornas que no son de Hodgkin de células B de grado bajo.

Hay varios otros anticuerpos humanizados y quiméricos en desarrollo o en ensayos clínicos. Por ejemplo, una inmunoglobulina humanizada (Ig) que reacciona específicamente con el antígeno CD33, que se expresa tanto en células mieloides normales como en la mayor parte de los tipos de células leucémicas mieloides, se conjugó a la droga anti-cáncer calicheamicin, CMA-676 (Sievers et al, Blood Supp. 308: 504a (1997) ). Este conjugado, denominado droga MYLOTARG®, ha sido aprobado recientemente por la FDA (Carón et al, Cáncer Supp., 73, 1049-56 (1994) ) . A la luz de esta actividad citolítica, un anticuerpo anti-CD33 adicional (HumM195) , actualmente en ensayos clínicos, se conjugó a varios agentes citotóxicos, que incluyen la toxina gelotonina (McGraw et al, Cncer Immunol . Immunothe . 39: 367-74 (1994)) y los radioisótopos 131I (Carón et al, Blood 83: 1760-68 (1994)), 90Y (Jurcic et al, Blood Supp. 92: 613a (1998) ) y 213Bi (Human et al, Blood Supplement 38: 231P (1997)). Un anticuerpo quimérico contra el antígeno leucocítico CD45 (cHuLym3) está también en estudios clínicos para el tratamiento de leucemia y linfoma humanos (Sun et al, Cáncer Immunol. Immunother. 48: 595-602 (2000)). En ensayos in vitro, se observó la lisis de células específicas en ensayos de ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo) (Henkart , Immunity 1: 343-46 (1994); Squier y Cohén, Current Opin. Immunol. 6 : 447-52 (1994) ) .

Estos anticuerpos terapéuticos también se han creado específicamente para que tengan una afinidad más alta con su blanco, para que sean más estables, y para una biodistribución óptima. Véase, por ejemplo, Presta, Current Pharma. Biotechnol . , 3: 237-56 (2002); Presta et al, Biochem. Society Transactions , 30(4) : 487-90 (2002) .

A diferencia de la humanización y construcción monoclonal de ratón de anticuerpos quiméricos, el uso de la tecnología de presentación de fagos permite aislar scFv que tienen secuencias totalmente humanas . Un anticuerpo totalmente humano contra el receptor TGFP2 humano se desarrolló recientemente basado en un clon de scFv derivado de la tecnología de presentación de fagos . Este scFv, que se convirtió en una IgG4 totalmente humana capaz de competir con la unión de TGFp2 (Thompson et al, J. Immunol . Meth. 227: 17-29 (1999)), tiene una fuerte actividad anti-proliferativa. La tecnología de presentación de fagos, conocida para un experto en el arte, se describe más específicamente en las siguientes publicaciones: Smith, Science 228: 1315 (1985); Scott et al, Science 249: 386-90 (1990); Cwirla et al, PNAS 87: 6378-82 (1990); Devlin et al, Science 249: 404-06 (1990); Griffiths et al, E BO J. 13(14): 3245-60 (1994); Bass et al, Proteins 8: 309-14 (1990); McCafferty et al , Nature 348: 5523-54 (1990); Nissim et al, EMBO J. 13: 692-98 (1994); Patentes Estadounidenses N° 5.427.908, 5.432.018, 5.223.409 y 5.403.484, lib.

Ligando para Moléculas de Anticuerpos de scFv Aislados Las plaquetas, fibrinógenos , GPIb, selectinas, y PSGL-1 (Ligando 1 de Glicioproteina de P-Selectina) juegan cada uno un papel importante en varias condiciones patogénicas o estados de enfermedad, tales como inflamación anormal o patogénica, reacciones inmunes anormales o patogénicas, reacciones autoinmunes, metástasis, adhesión anormal o patogénica, trombosis y/o restenosis, agregación anormal o patogénica. Por lo tanto, los anticuerpos que se unen o reaccionan en forma cruzada con plaquetas y con estas moléculas serían útiles en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades o trastornos que involucran a éstas y otras condiciones patogénicas .

Plaquetas Las plaquetas son componentes bien caracterizados del sistema sanguíneo y juegan varios papeles importantes en la hemostasis, trombosis y/o restenosis . La lesión de los vasos sanguíneos pone en movimiento un procesos denominado hemostasis, que se caracteriza por una serie de eventos secuenciales . La reacción inicial a los vasos sanguíneos lesionados es la adhesión de las plaquetas a la región afectada en la superficie interior del vaso. El paso siguiente es la agregación de muchas capas de plaquetas sobre las plaquetas que se adhirieron previamente, formando un tapón hemostático y sellando la pared del vaso. El tapón hemostático se fortalece más mediante la deposición de polímeros de fibrina. El coágulo o tapón se degrada solamente cuando se ha reparado la lesión.

Las plaquetas circulantes son partículas citoplásmicas liberadas desde la periferia de megalocariocitos . Las plaquetas juegan un importante papel en la hemostasis . Al ocurrir una lesión vascular, las plaquetas se adhieren a las superficies de los tejidos lesionados y se unen unas a otras (cohesión) . Esta secuencia de eventos ocurre rápidamente, formando una masa sin estructura (comúnmente llamada tapón de plaquetas o trombo) en el sitio de la lesión vascular. El fenómeno de cohesión, también denominado agregación, puede iniciarse in vitro con una variedad de sustancias, o agonistas, tales como colágeno, difosfato de adenosina (ADP) , epinefrina, serotonina, y ristocetina. La agregación es uno de los numerosos ensayos in vitro realizados como una medida de la función de las plaquetas .

Importancia de las Plaquetas en la Metástasis La metástasis de los tumores es tal vez el factor más importante que limita la supervivencia de los pacientes con cáncer. Los datos acumulados indican que la capacidad de las células de tumores de interactuar con las plaquetas huésped representa uno de los factores determinantes indispensables de la metástasis (Oleksowicz, Trombosis Res. 79: 261-74 (1995)). Cuando células de cáncer metastáticas ingresan en el torrente sanguíneo, se forman compuestos multicelulares compuestos de plaquetas y leucocitos que recubren a las células de tumores. Estos complejos, que se denominan microémbolos , ayudan a las células de tumores a evadir el sistema inmune. El recubrimiento de las células de tumores por las plaquetas requiere la expresión de P-selectina por las plaquetas .

Se ha demostrado que la capacidad de las células de tumores de agregar plaquetas se correlaciona con el potencial de metástasis de las células de tumores, y se ha demostrado que la inhibición de la agregación de plaquetas inducida por los tumores se correlaciona con la supresión de la metástasis en modelos de roedores . Se ha demostrado que la interacción de células de tumores con las plaquetas consiste en moléculas de adhesión a la membrana y secreción de agonistas . La expresión de glicoproteínas de plaquetas inmuno-relacionadas se ha identificado en líneas de células de tumores . Se ha demostrado que las glicoproteínas inmuno-relacionadas de las plaquetas, GPIb, GPIIb/IIIa, GPIb/IX y la subunidad Ov de integrina se expresan en la superficie de las líneas de células de tumores de mama (Oleksowicz, (1995) , supra; Kamiyama et al, J. Lab. Clin. Med. 117(3): 209-17 (1991)).

Gasic et al (PNAS 61: 46-52 (1968)) mostró que la trombocitopenia inducida por anticuerpos redujo notablemente el número y el volumen de las metástasis producidas por el adenocarcinoma de colon CT26, carcinoma de pulmón de Lewis, y melanoma B16 (Karpatkin et al, J. Clin. Invest . 81(4): 1012-19 (1988); Clezardin et al, Cáncer Res. 53(9): 4695-700 (1993)). Más aún, se halló que una sola cadena de polipéptidos (60kd) se expresa en la membrana superficial de las células HEL que está estrechamente relacionada con GPIb y corresponde a una subunidad de GPIb O-glicosilada en forma incompleta o anormal ( ieffer et al, J. Biol. Chem. 261(34): 15854-62 (1986)).

Complejo GPIb Cada paso en el proceso de la hemostasis requiere la presencia de receptores en la superficie de las plaquetas. Uno de los receptores que es importante en la hemostasis es el complejo de glicoproteína Ib-IX (también denominado CD42). Este receptor media la adhesión (unión inicial) de las plaquetas a la pared del vaso sanguíneo en sitios de lesión uniendo el factor von Willebrand (vWF) en el subendotelio . También tiene roles cruciales en otras dos funciones de las plaquetas importantes en la hemostasis: (a) la agregación de plaquetas inducida por el alto corte en regiones de estenosis arterial y (b) la activación de plaquetas inducida por bajas concentraciones de trombina.

El complejo GPIb-IX es uno de los principales componentes de la superficie exterior de la membrana plasmática de las plaquetas . Este complejo comprende tres polipéptidos que se extienden sobre la membrana: una cadena a de 130 kDa unida a disulfuro y una cadena ß de 25 kDa de GPIb y un GPIX asociado en forma no covalente (22 kDa) . La totalidad de las subunidades se presentan en cantidades equimolares en la membrana de las plaquetas para la expresión de la superficie celular eficiente y la función del complejo de CD42, que indica que se requiere la unión correcta de las tres subunidades en un complejo para la expresión completa en la membrana plasmática. La cadena a de GPIb consiste en tres dominios estructurales distinguibles: (1) un dominio de péptido de extremo de N globular que contiene secuencias de repetición ricas en leucina y secuencias flanqueadoras unidas a Cys; (2) un dominio de macroglicopolipéptido similar a mucina altamente glicosilada; y (3) una región de extremo de C asociada a la membrana que contiene el puente de disulfuro a GPIba y secuencias transmembrana y citoplásmicas .

Varias líneas de prueba indican que el vWF y el dominio de unión a trombina del complejo GPIb-IX residen en una región globular que abarca aproximadamente 300 aminoácidos en el extremo amino de GPIba. Como el complejo GPIb-IX de plaquetas es un receptor de la membrana clave que media tanto la función como la reactividad de las plaquetas, el reconocimiento del vWF unido al subendotelio por GPIb permite que las plaquetas se adhieran a los vasos sanguíneos lesionados. Además, la unión del vWF a GPIba también induce la activación de las plaquetas, que puede involucrar la interacción de un dominio citoplásmico del GPIb-IX con el citoesqueleto de fosfolipasa A2. Más aún, GPIba contiene un sitio de unión de alta afinidad para a-trombina, lo cual facilita la activación de las plaquetas mediante un mecanismo aún pobremente definido .

El dominio globular del extremo de N de GPIba contiene un haz de aminoácidos con carga negativa. Varias líneas de prueba indican que en las células CHO transfectadas que expresan el complejo de GPIb-IX y en la plaqueta GPIba, los tres residuos de tirosina contenidos en este dominio (Tyr-276, Tyr-278 y Tyr-279) sufren sulfatación .

Sulfatación de Proteína La sulfatación de proteína es una modificación post-translacional ampliamente expandida que consiste en la unión covalente enzimática de sulfato, a cadenas laterales de azúcar o a la cadena principal del polipéptido. Esta modificación ocurre en el compartimiento trans-Golgi. Las proteínas sulfatadas incluyen proteínas secretoras, proteína blancos para gránulos, y las regiones extracelulares de proteínas de la membrana plasmática. La tirosina es un residuo de aminoácido que actualmente se sabe que sufre sulfatación. Kehoe et al, Chem. Biol . 7: R57-61 (2000). Otros aminoácidos, por ejemplo treonina, pueden también sufrir sulfatación, particularmente en células enfermas.

Se ha descubierto que numerosas, proteínas son sulfatadas por tirosina, pero la presencia de tres o más tirosinas sulfatadas en un solo polipéptido, como se halló en GPIb, no es común. GPIba (CD42) , expresado por plaquetas y megacariocitos y que media la unión de plaquetas y el arrollamiento sobre el subendotelio a través de la unión con v F, también contiene numerosas cargas negativas en su dominio del extremo de N. Se piensa que ese medio altamente ácido e hidrófilo es un prerrequisito para la sulfatación, porque la tirosilproteína sulfotransferasa reconoce específicamente y sulfata tirosinas adyacentes a los residuos de aminoácidos (Bundgaard et al, J. Biol . Chem. 272:21700-05 (1997) ) . La sulfatación completa de la región ácida de GPIba produce una región con una densidad de cargas negativas notable, 13 cargas negativas dentro de una extensión de 19 aminoácidos, y es un sitio candidato para la interacción electrostática con otras proteínas .

También se piensa que las tirosinas de extremo N sulfatadas influyen en el papel de los receptores de CC-quimiocina, tales como CCR5 , que sirven como co-receptores con el receptor de segmento de transmiembro siete relacionado (7T S) para el ingreso de virus de inmunodeficiencia humana y de simios (HIV-1, HIV-2 y SIV) en células blanco. Por ejemplo, se piensa que las tirosinas de extremo de N sulfatadas contribuyen a la unión de CCR5 a los complejos MIP-loc, MIP-?ß y HIV-1 gpl20/CD4 y a la capacidad del HIV-l de entrar en células que expresan CCR5 y CD4. CXCR4, otro importante co-receptor de HIV-1, también se sulfata (Farzan et al, Cell 96(5): 667-76 (1999)). La sulfatación de las tirosinas juega un papel menos significativo en la entrada del HIV-1 que depende de CXCR4 que la entrada que depende de CCR5; por lo tanto se demuestra un posible papel de la sulfatación de las tirosinas en la familia de la CXC-quimiocinas y acentúa una diferencia general en la utilización del HIV-1 de CCR5 y CXCR4 (Farzan et al, J. Biol.. Chem. 277(33): 29, 484-89 (2002)).

Selectinas y PSGL-1 Las P-, E- y L-Selectinas son miembros de la familia de las moléculas de adhesión que, entre otras funciones, median el arrollamiento de los leucocitos en el endotelio vascular. La P-Selectina se almacena como granulos en las plaquetas y se transporta a la superficie después de la activación por la trombina, histamina, éster de forbol, u otras moléculas estimuladoras. La P-Selectina también se expresa sobre células endoteliales activadas. La ?-Selectina se expresa en células endoteliales , y la L-Selectina se expresa en neutrófilos , monocitos, células T y células B.

PSGL-1 (también denominado CD162) es un ligando de mucina glicoproteína para P-Selectina, E-Selectina y L-Selectina que comparte la similitud estructural con GPIb (Afshar-Kharghan et al (2000) , supra) . PSGL-1 es un homodímero unido a disulfuro que tiene un sitio de ruptura de PACE (Enzimas de Conversión de Pares de Aminoácidos Básicos) . PSGL-1 también tiene tres sitios de sulfatación de tirosina potenciales seguidos por 10-16 repeticiones de decámeros que tienen alto contenido de prolina, serina y treonina. La porción extracelular de PSGL-1 contiene tres sitios de glicosilación unidos a N y tiene numerosas ramificaciones de oligosacáridos unidos a O sialilados, fucosilados (Moore et al, J. Biol .. Chem. 118: 445-56 (1992)). La mayor parte de los sitios de N-glican y muchos de los sitios de O-glican están ocupados . Se han determinado las estructuras de los O-glican de PSGL-1 de células HL-60 humanas. Los subgrupos de estos O-glican son estructuras sialiladas y fucosiladas de núcleo 2, que son necesarias para la unión a selectinas. La sulfatación de tirosina de una región de extremo de amino de PSGL-1 también es necesaria para la unión a P-Selectina y L-Selectina. Además, hay un propéptido de extremo de N que probablemente se rompe después de la traslación.

PSGL-1 tiene 361 residuos en células HL60, con una región extracelular de 267 residuos, una región trans-membrana de 25 residuos y una región intracelular de 69 residuos y forma un homodímero o hterodímero unido a disulfuro sobre la superficie celular (Afshar-Kharghan et al, Blood 97: 3306-12 (2001)). La secuencia que codifica PSGL-1 está en un solo exón, de manera que no sería posible un empalme alternativo. Sin embargo, PSGL-1 en las células HL60, y en la mayor parte de las líneas de células, tiene 15 repeticiones consecutivas de secuencias de consenso de 10 residuos presentes en la región extracelular, aunque hay 14 y 16 repeticiones de esta secuencia en los leucocitos polimorfonucleares , monocitos, y otras varias líneas de células, que incluyen la mayor parte de los leucocitos nativos. PSGL-1 se expresa en los neutrófilos como un dímero, con pesos moleculares aparentes de 250 kDa y 160 kDa, mientras que en HL60 la forma dimérica es de aproxiamamente 220 kDa. Cuando se la analiza en condiciones de reducción, cada subunidad se reduce la mitad. Las diferencias en la masa molecular pueden deberse a polimorfismos en la molécula producidos por la presencia de diferentes números de repeticiones de decámeros (Leukocyte Typing VI. Editado por T. Kishimoto et al (1997)).

La mayor parte de los leucocitos, tales como neutrófilos, monocitos, leucocitos, subgrupos de células B, y todas las células T expresan PSGL-1 (Kishimoto et al (1997) , supra) . PSGL-1 media el arrollamiento de leucocitos en el endotelio activado, en plaquetas activadas, y en otros leucocitos y sitios inflamatorios y media el arrollamiento de neutrófilos en P-Selectina. PSGL-1 puede también mediar interacciones de neutrófilo-neutrófilo a través de la unión con L-Selectina, mediando así la inflamación (Snapp et al, Blood 91(1): 154-64 (1998)).

El arrollamiento de leucocitos es importante en la inflamación, y la interacción entre P-Selectina (expresada por el endotelio activado y en las plaquetas, que puede inmovilizarse en sitios de lesión) y PSGL-1 es un instrumento para la ligadura y arrollamiento de leucocitos en las paredes de los vasos sanguíneos (Ramachandran et al, PNAS 98(18): 10166-71 (2001); Afs ar- harghan et al (2001) , supra) . El arrollamiento de células es también importante en la metástasis, y se cree que las P- y E-Selectinas en las células endoteliales se unen a células metastáticas , facilitando así la extravasación del torrente sanguíneo en los tej idos circundantes .

Por lo tanto, se ha encontrado PSGL-1 sobre todos los leucocitos: neutrófilos, monocitos, linfocitos, células T periféricas activadas, granulocitos , eosinófilos, plaquetas y sobre algunas células madres positivas CD34 y ciertos subgrupos de células B. P-Selectina se expresa selectivamente en plaquetas activadas y células endoteliales . La interacción entre P-Selectina y PSGL-1 promueve el arrollamiento de leucocitos sobre las paredes de los vasos, y la acumulación anormal de leucocitos en sitios vasculares deriva en diversas inflamaciones patológicas. Las contribuciones estére-específicas de sulfates de tirosina individuales sobre PSGL-1 son importantes para la unión de P-Selectina a PSGL-1. La carga también es importante para la unión: reducción de NaCl (de 150 a 50 mM) unión mejorada ( d 75 nM) . La sulfatación de tirosina sobre PSGL-1 mejora, pero finalmente no es necesaria para la adhesión de PSGL-1 sobre P-Selectina. La sulfatación de tirosina de PSGL-1 soporta la adhesión de arrollamiento más lenta a todos los índices de corte y soporta la adhesión de arrollamiento a índices de corte mucho más altos (Rodgers et al, Biophys. J. 81: 2001-09 (2001)) . Más aún, se ha sugerido que la expresión de PSGL-1 en las plaquetas es 25-100 veces menor que la de los leucocitos (Frenette et al, J. Exp . Med. 191(8) : 1413-22 (2000)) .

Se ha mostrado que un anticuerpo monoclonal comercialmente disponible para PSGL-1 humano, KPL1, inhibe las interacciones entre PSGL-1 y P-Selectina y entre PSGL-1 y L-selectina. El epítope de KPL1 se mapeó en la región de sulfatación de tirosina de PSGL-1 (YEYLDYD) (Snapp et al, Blood 91(1): 154-64 (1998)).

El pretratamxento de células de tumores con O-sialoglicoproteasa, que remueve ligandos de mucina sialilados, fucosilados, también inhibió la formación de complejos de células de tumores y plaquetas . Los experimentos in vivo indican que cualquiera de estos tratamientos deriva en una mayor asociación de monocitos con células de tumores circulantes, lo cual sugiere que la reducción de la unión a plaquetas aumenta el acceso por células inmunes a las células de tumores circulantes (Varki y Varki, Braz. J. Biol. Res. 34(6): 711-17 (2001)).

Fibrinógeno Existen dos formas de fibrinógeno humano normal : normal (?) y ? prima, cada una de las cuales se halla en individuos normales. El fibrinógeno normal, que es la forma más abundante (un 9% del fibrinógeno total hallado en el cuerpo) , está compuesto de dos cadenas a de 55 kDa idénticas, dos cadenas ß de 95 kDa idénticas y dos cadenas ? de 49,5 kDa idénticas. El fibrinógeno variante normal, que es la forma menos abundante (un 10% del fibrinógeno hallado en el cuerpo) , está compuesto de dos cadenas a de 55 kDa idénticas, dos cadenas ß de 95 kDa idénticas, una cadena ? de 49,5 kDa y una cadena ? prima variante de 50,5 kDa. Las cadenas gamma y gamma prima son codificadas ambas por el mismo gen, con un empalme alternativo que ocurre en el extremo 3' . La cadena gamma normal está compuesta por los aminoácidos 1-411 y la cadena gamma prima variante normal está compuesta por 427 aminoácidos, de los cuales los aminoácidos 1-407 son los mismos que aquellos de la cadena gamma normal y los aminoácidos 408-427 son VRPEHPAETEYDSLLYPEDDL . Esta región está normalmente ocupada con moléculas de trombina.

El fibrinógeno se convierte en fibrina mediante la acción de trombina en la presencia de calcio ionizado para producir la coagulación de la sangre . La fibrina también es un componente de los trombos, y los exudados inflamatorios agudos.

Obj etivos Un objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos, fragmentos de ellos o complejos de ellos, que se unen a epítopes presentes en diversas moléculas instrumentos en procesos tales como arrollamiento de células, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, y metástasis, aunque no están involucrados en procesos tales como adhesión, trombosis y/o restenosis y agregación, cuyos epítopes están presentes en células enfermas, tales como células de AML, células de T-ALL, células de Pre-B-ALL, B-leucemia, células de B-CLL, células de mieloma múltiple, y células metastáticas.

Otro objetivo de la presente invención incluye el uso de esos anticuerpos en el desarrollo y la provisión de medicamentos para la inhibición del arrollamiento de células, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, y metástasis, aunque no están involucrados en la adhesión, trombosis y/o restenosis y agregación, y para el tratamiento de enfermedades, tales como AML, T-ALL, B-leucemia, B-CLL, Pre-B-ALL, mieloma múltiple, metástasis, enfermedades cardiovasculares tales como infarto de miocardio, enfermedades retinopáticas , enfermedades provocadas por interacciones de proteina-proteína que dependen de la tirosina sulfatada, u otras enfermedades en las cuales esas funciones o acciones celulares juegan un papel significativo .

También es un objetivo de esta invención utilizar los anticuerpos en métodos para diagnosticar, pronosticar, o determinar las fases de evolución de diversos estados de enfermedad de un individuo, tales como .por ejemplo, AML, T-ALL, B~leucemia, B-CLL, Pre-B-ALL, mieloma múltiple, y metástasis u otras enfermedades en las cuales funciones o acciones celulares tales como arrollamiento de células, inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, juegan un papel significativo. Y otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método de purga de células de tumores .

Aún otro objetivo de la invención es proporcionar métodos de activación de ADCC o estimulación de células NK o T mediante la administración de anticuerpos . Éstos y otros objetivos de la invención se proporcionan aquí.

EXTRACTO PE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de ellos que tienen las capacidades de unión de un fragmento de anticuerpo scFv de la ID DE SEC N°:l. La presente invención también proporciona anticuerpos o fragmentos de ellos, en donde al menos un anticuerpo, o un fragmento de unión de él, tiene una primera región hipervariable de la ID de SEC N°:2, una segunda región hipervariable de la ID de SEC N° : 3, y/o una tercera región hipervariable de la ID de SEC N° : . Los anticuerpos o fragmentos de ellos, de la presente invención preferentemente se unen o reaccionan en forma cruzada con un epítope de PSGL-1. También, preferentemente, los anticuerpos o fragmentos de ellos de la presente invención se unen a un epítope en al menos un tipo de célula que se selecciona del grupo formado por T-ALL, AML, B-leucemia, B-CLL y células de leucemia de mieloma múltiple.

La presente invención también proporciona epítopes aislados que tienen una secuencia de aminoácidos que se une a los anticuerpos o fragmentos de unión de ellos de la presente invención. Preferentemente, el epítope aislado se ubica entre los aminoácidos 1 y 17 del PSGL-1 maduro, que está dentro de un haz de aminoácidos con carga negativa.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas y procesos para la producción de esos anticuerpos o fragmentos de ellos. Se proporcionan métodos que utilizan esas composiciones farmacéuticas para tratar diferentes condiciones, que incluyen condiciones relacionadas con la inhibición o el tratamiento del arrollamiento de células; la inhibición o el tratamiento de la inflamación; la inhibición o el tratamiento de una enfermedad autoinmune; la inhibición o el tratamiento de una infección (por ejemplo, una infección viral tal como HIV) ; la inhibición o el tratamiento de la metástasis; la inhibición o el tratamiento del crecimiento y/o la replicación de células de tumores; el aumento de la mortalidad de las células de tumores; la inhibición del crecimiento y/o la replicación de células de leucemia; el aumento del Indice de mortalidad de células de leucemia; alteración de la susceptibilidad de las células enfermas de ser dañadas por agentes contra la enfermedad; aumento de la susceptibilidad de células de tumores de ser dañadas por agentes anti-cáncer; aumento de la susceptibilidad de las células de leucemia de ser dañadas por agentes anti-leucemia; inhibición del aumento en el número de células de tumores en un paciente que tiene un tumor; disminución del número de células de tumores en un paciente que tiene cáncer; inhibición del aumento en el número de células de leucemia en un paciente que tiene leucemia; y disminución del número de células de leucemia en un paciente que tiene leucemia. Se proporcionan otros métodos para inducir ADCC o estimular células NK o T que utilizan los presentes anticuerpos o fragmentos de ellos .

La presente invención también proporciona un método de purga de células de tumores de un paciente proveyendo una muestra que contiene células del paciente e incubando las células del paciente con un anticuerpo o polipéptido de la presente invención.

DEFINICIONES Anticuerpos (Ab) , o inmunoglobulinas (Ig) , son moléculas de proteínas que se unen a un antígeno. Cada unidad de unión funcional de anticuerpos naturales está compuesta de unidades de cuatro cadenas de polipéptxdo (2 pesadas y 2 livianas) unidas juntas por enlaces de polipéptxdo. Cada una de las cadenas tiene una región constante y variable. Los anticuerpos naturales pueden dividirse en varias clases que incluyen IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, basado en su componente de cadena pesada. La clase IgG abarca varias subclases que incluyen, en forma no taxativa, IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. Se producen inmunoglobulinas in vivo con linfocitos B, y cada una de esas moléculas reconoce un determinante antigénico extraño particular y facilita el aclaramiento de ese antigeno. Los anticuerpos pueden producirse y utilizarse en muchas formas, que incluyen complejos de anticuerpos. Como se utiliza aquí, el término "complejo de anticuerpo" o "complejos de anticuerpos" significa un complejo de uno o más anticuerpos con otro anticuerpo o con un fragmento o fragmentos de anticuerpos, o un complejo de dos o más fragmentos de anticuerpos. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fv, Fab, F(ab' )2/ Fe, y Fd. Por consiguiente, el término "anticuerpo o fragmento de él" como se utiliza aquí incluye un complejo de anticuerpo o complejos de anticuerpos.

Como se utiliza aquí en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, un Fv se define como una molécula que está compuesta por una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo humano y una región variable de una cadena liviana de un anticuerpo humano, que pueden ser iguales o diferentes, y en donde la región variable de la cadena pesada se conecta, une, fusiona o une covalentemente o se asocia con la región variable de la cadena liviana. El Fv puede ser un Fv de una sola cadena (scFv) o un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv) . Un scFv está compuesto por los dominios variables de cada una de las cadenas pesada y liviana de un anticuerpo, unidas por un separador de polipéptido de aminoácido flexible, o un ligador. El ligador puede ser ramificado o no ramificado. Preferentemente, el ligador es 0-15 residuos de aminoácidos, y más preferentemente, el ligador es (Gly4Ser)3.

La molécula de Fv, ella misma, está compuesta de una primera cadena y una segunda cadena, cada cadena tiene una primera, segunda y tercera región hipervariable . Los bucles hipervariables dentro de los dominios variables de las cadenas liviana y pesada se denominan Regiones Determinantes Complementarias (CDR) . Hay regiones CDR1, CDR2 y CDR3 en cada una de las cadenas pesada y liviana. Se cree que estas regiones forman el sitio de unión al antígeno y pueden modificarse específicamente para dar la actividad de unión mejorada. La más variable de estas regiones es la región CDR3 de la cadena pesada. Se entiende que la región CDR3 es la región más expuesta de la molécula de Ig y, como se muestra y se proporciona aquí, es el sitio principalmente responsable de las características de unión selectiva y/o específica observadas .

Un fragmento de una molécula Fv se define como toda molécula más pequeña que el Fv original que aún mantiene las características de unión selectiva y/o específica del Fv original. Ejemplos de esos fragmentos incluyen en forma no taxativa (1) un anticuerpo, que comprende un fragmento de la, cadena pesada solamente del Fv, (2) un microcuerpo, que comprende una unidad fraccionada pequeña de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (Solicitud Internacional N° PCT/IL99/00581) , (3) cuerpos similares que tienen un fragmento de la cadena liviana, y (4) cuerpos similares que tienen una unidad funcional de una región variable de cadena liviana. Se debe apreciar que un fragmento de una molécula Fv puede ser un polipéptido sustancialmente circular o de bucle .

Como se utiliza aqui el término "fragmento Fab" es un fragmento de unión a antígeno monovalente de una inmunoglobulina . Un fragmento Fab está compuesto de la cadena liviana y parte de la cadena pesada.

Un fragmento F(ab' )2 es un fragmento de unión a un antígeno bivalente de una inmunoglobulina obtenida mediante digestión de pepsina. Contiene ambas cadenas livianas y parte de ambas cadenas pesadas .

Un fragmento Fe es una porción de unión que no es a un antígeno de una inmunoglobulina. Contiene la porción de extremo de carboxi de cadenas pesadas y los sitios de unión para el receptor de Fe.

Un fragmento Fd es la región variable y la primera región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina. Los anticuerpos policlonales son el producto de una respuesta inmune y son formados por un número de diferentes linfocitos B . Los anticuerpos monoclonales derivan de una célula B clonal .

Un cassette, aplicado a polipéptidos y definido en la presente invención, se refiere a una secuencia dada de aminoácidos consecutivos que sirve como un marco y se considera una sola unidad y se manipula como tal . Los aminoácidos pueden reemplazarse, insertarse, removerse o unirse a uno o ambos extremos. En forma similar, los tramos de aminoácidos se pueden reemplazar, insertar, remover o unir a uno o ambos extremos.

El término "epítope" como se utiliza aquí significa el determinante antigénico o sitio de reconocimiento o sitio de antígeno que interactúa con un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, complejo de anticuerpo o un complejo que tiene un fragmento de unión de él o un receptor de células T. El término epítope se utiliza en forma indistinta aquí con los términos ligando, dominio y región de unión.

La selectividad se define aquí como la capacidad de una molécula blanco de elegir y unirse a una entidad o estado celular de una mezcla de entidades o estados de entidad, todas las entidades o estados de entidad pueden ser específicos de la molécula blanco.

El término "afinidad" como se utiliza aquí es una medida de la resistencia de la unión (constante de asociación) entre una molécula de unión (por ejemplo un sitio de unión en un anticuerpo) y un ligando (por ejemplo un determinante antigénico) . La resistencia de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión a un solo antígeno en un anticuerpo y un solo epítope es la afinidad del anticuerpo para el epítope. Los anticuerpos de baja afinidad se unen al antígeno débilmente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen al antígeno en forma más tiesa y permanecen unidos durante más tiempo. El término "avidez" difiere de afinidad, porque el primero refleja la valencia de la interacción antigeno-anticuerpo .

Especificidad de la interacción de anticuerpo-antígeno : Aunque la reacción del anticuerpo al antigeno es especifica, en algunos casos los anticuerpos producidos por un antigeno pueden reaccionar en forma cruzada con otro antígeno no relacionado . Esas reacciones cruzadas ocurren si dos antígenos diferentes comparten una estructura homologa o similar, un epítope, o una región de anclaje de él, o si los anticuerpos específicos de un epítope se unen a un epítope no relacionado que posee propiedades químicas o de conformación de la estructura similares .

Una plaqueta es un fragmento citoplásmico similar a un disco de un megacariocito que se derrama en el seno de la médula y posteriormente circula en el torrente sanguíneo periférico. Las plaquetas tienen varias funciones fisiológicas que incluyen un rol principal en la coagulación. Una plaqueta contiene gránulos ubicados en el centro y protoplasma transparente periférico, pero no tiene ningún núcleo definido.

Aglutinación como se utiliza aquí significa el proceso mediante el cual se hace que bacterias, células, discos u otras partículas de tamaño similar suspendidas se adhieran y formen grumos. El proceso es similar a la precipitación pero las partículas son de mayor tamaño y están en suspensión en lugar de estar en solución.

El término agregación significa una agrupación de plaquetas inducida in vitro, y trombina y colágeno, como parte de un mecanismo secuencial que deriva en la formación de un trombo o tapón hemostático.

La sustitución de aminoácidos conservadora se define como un cambio en la composición de aminoácidos por medio del cambio de uno o dos aminoácidos de un péptido, polipéptido o proteína o un fragmento de ellos . La sustitución es de aminoácidos con propiedades generalmente similares (por ejemplo, ácidos, básicos, con carga positiva o negativa, polaridad, no polaridad) de manera tal que las sustituciones no alteren sustancraímente las características del péptido, polipéptido o proteína (por ejemplo, la carga, punto isoeléctrico, afinidad, avidez, conformación, solubilidad, o su actividad. Las sustituciones típicas que pueden realizarse para esa sustitución de aminoácidos conservadora pueden ser entre los siguientes grupos de aminoácidos : glicina (G) , alanina (A) , valina (V) , leucina (L) e isoleucina (I) ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E) alanina (A) , serina (S) y treonina (T) histidina (H) , lisina (K) y arginina (R) asparagina (N) y glutamina (Q) fenilalanina (F) , tirosina (Y) y triptofano (W) Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden hacerse, por ejemplo, en regiones que flanquean a las regiones hipervariables principalmente responsables de las características de unión selectiva y/o específica de la molécula, así como otras partes de la molécula, por ejemplo cassette de cadena pesada variable. Como adición o alternativa, la modificación puede lograrse mediante la reconstrucción de las moléculas para formar anticuerpos de tamaño completo, diacuerpos (dímeros) , triacuerpos (tímeros) , y/o tetracuerpos (tetrámeros) o para formar minicuerpos o microcuerpos .

Un fagémido se define como una partícula de fago que transporta el ADN del plásmido . Los fagémidos son vectores de plásmidos diseñados para contener un origen de la replicación desde un fago filamentoso, tal como MI3 o fd. Como transporta el ADN de plásmido, la partícula fagémido no tiene suficiente espacio para contener el complemento completo del genoma del fago. El componente que falta del genoma del fago es una información esencial para empaquetar la partícula del fago. Para propagar el fago, en consecuencia, es necesario cultivar las partículas del fago deseadas junto con una cepa de fago helper que complementa la información para empaquetamiento faltante.

Un promotor es una región en el ADW en la cual la polimerasa del ARN se une e inicia la transcripción.

Una biblioteca de presentación de fago (también denominada biblioteca de péptido/anticuerpo de fago, biblioteca de fago o biblioteca de péptido/anticuerpo) comprende una gran población de fagos (108 o más) , cada partícula de fago presenta una secuencia de péptido o polipéptido diferente . Estos fragmentos de péptidos o polipéptidos pueden se pueden construir para ser de longitud variable. El péptido o polipéptido presentado puede derivar de, en forma no taxativa, cadenas pesadas o livianas de anticuerpos humanos .

Una composición farmacéutica se refiere a una formulación que comprende un anticuerpo o péptido o polipéptido de la invención y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable de él, o un complejo de anticuerpo-agente farmacéutico (anticuerpo-agente) y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable de él .

Un agente se refiere a un agente que es útil en el tratamiento de una enfermedad activa, tratamiento profiláctico, o diagnóstico de un mamífero que incluye, en forma no taxativa, un humano, bovino, equino, porcino, murino, canino, felino, o cualquier otro animal de sangre caliente. El agente se selecciona del grupo de radioisótopo, toxina, agente farmacéutico, oligonucleótido, proteina recombinante, fragmento de anticuerpo, agentes anticáncer, agentes anti-adhesión, agentes anti-trombosis , agentes anti-restenosis , agentes anti-autoinmune, agentes antiagregación, agentes antibacterianos, agentes antivirales, y agentes antinflamatorios . Otros ejemplos de esos agentes incluyen, en forma no taxativa, agentes antivirales que incluyen acyclovir, ganciclovir, y ziduvudina; agentes anti-trombosis/restenosis que incluyen cilostazol, sodio de dalteparina, sodio de reviparina, y asprina; agentes antinflamatorios que incluyen zaltoprofeno, pranoprofeno, droxicam, acetil salicílico 17, diclofenac, ibuprofeno, dexibuprofeno, sulindac, naproxeno, amtolmetina, celecoxib, indometacina, rofecoxib, y nimesulid; agentes anti-autoinmunes que incluyen leflunomida, denileucin difitox, subreum, WinRho, SDF, defibrotida, y ciclofosfamida; y agentes anti-adhesión/anti-agregación que incluyen limaprost, clorcromeno y ácido hialurónico .

Un agente anti-leucemia es un agente con actividad anti-leucemia . Por ejemplo, los agentes anti-leucemia incluyen agentes que inhiben o detienen el crecimiento de células leucémicas o preleucémicas inmaduras, agentes que eliminan células leucémicas o preleucémicas, agentes que aumentan la susceptibilidad de las células leucémicas o preleucémicas a otros agentes anti-leucemia, y agentes que inhiben la metástasis de células leucémicas. En la presente invención, un agente anti-leucemia puede también ser un agente con actividasd anti-angiogénica que previene, inhibe, retarda o detiene la vascularización de los tumores.

Los patrones de expresión de un gen pueden estudiarse analizando la cantidad del producto gen producido en diversas condiciones, a horas especificas, en diversos tejidos, etc. Se considera que un gen se "sobreexpresa" cuando la cantidad del producto gen es mayor que la que se halla en un control normal, por ejemplo un control no enfermo.

Una célula dada puede expresar en su superficie una proteína que tiene un sitio de unión (o epítope) para un anticuerpo dado, pero ese sitio de unión puede existir en una forma críptica (por ejemplo, impedirse o bloquearse estéricamente, o carecer de las características necesarias para la unión por el anticuerpo) en la célula en un estado, que puede denominarse una primera etapa (etapa I) . La etapa I puede ser, por ejemplo, un estado normal, sano, no deseado. Cuando el epitope existe en forma críptica, no es reconocido por el anticuerpo dado, es decir, no existe ninguna unión del anticuerpo a este epitope o a la célula dada en la etapa I. Sin embargo, el epitope puede exponerse, por ejemplo, sufriendo modificaciones o desbloqueándolo porque moléculas cercanas o asociadas se modifican o porque una región sufre un cambio de conformación. Ejemplos de modificaciones incluyen cambios en los pliegues, cambios en las modificaciones después de la translación, cambios en la fosfolipidación, cambios en la sulfatación, cambios en la glicosilación, y similares. Esas modificaciones pueden ocurrir cuando la célula entra en un estado diferente, que puede denominarse una segunda etapa (etapa II) . Ejemplos de segundos estados, o etapas, incluyen activación, proliferación, transformación o en un estado maligno. Al ser modificado, el epitope puede exponerse, y el anticuerpo puede unirse.

Los péptido-miméticos (miméticos de péptidos) son moléculas (por ejemplo, anticuerpos) que ya no contienen ningún enlace de pép ido, es decir enlace de amida, entre los aminoácidos; sin embargo, en el contexto de la presente invención, el término mimético de péptido incluye moléculas que ya no son completamente péptidas, tales como pseudo-péptidos , semi-péptidos y peptoides . Sean completa o parcialmente no péptidos, los péptidomiméticos de acuerdo con esta invención proporcionan una disposición espacial de grupos químicos reactivos que se parece estrechamente a la disposición tridimensional de los grupos activos en el péptido en el cual está basado el péptidomimético . Estas moléculas incluyen moléculas pequeñas, lípidos, polisacáridos , o conjugados de ellos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra el análisis FACS después del manchado con TM3.13 scFv de células de T-ALL.

La Figura 2 ilustra datos numéricos del análisis de Lumiagregómetro de la agregación de plaquetas en la presencia de anticuerpos scFv como un porcentaje de la agregación control de plaquetas lavadas o PR .

La Figura 3 ilustra el análisis FACS que compara la unión de diferentes anticuerpos scFv con las plaquetas : la Figura 3A es AN51-PE (FSC) , la Figura 3B es AN51-PE (FL2-H) , la Figura 3C es un control negativo, la Figura 3D es Yl-myc+, la Figura 3E es Yl, la Figura 3F es L32 y la Figura 3G es TMl .1.

La Figura 4 ilustra análisis FACS que comparan la capacidad de los anticuerpos scFv (N01, Yl-myc+, y L32) de competir e interferir con la unión del anticuerpo Yl rotulado a las células KG-l en diferentes concentraciones: la Figura 4A es 0 ng, la Figura 4B es 100 ng, la Figura 4C es 250 ng, la Figura 4D es 500 ng, la Figura 4E es 1000 ng, la Figura 4F es 2500 ng, y la Figura 4G es 5000 ng.

La Figura 5 ilustra datos numéricos de análisis FACS que comparan la capacidad de los anticuerpos scFv (N01, Yl-myc+, y L32) de competir o interferir con la unión del anticuerpo Yl rotulado a células KG-l.

La Figura 6 ilustra datos numéricos de análisis ELISA que proporcionan comparaciones de la unión de diferentes concentraciones de anticuerpos scFv (TM1.1, Yl-myc+, Yl y L32) a glicocalicina.

La Figura 7 ilustra análisis Western de la unión de anticuerpos L32 y Yl scFv a GC, plasma, y proteínas de la membrana de células KG-l y Raji.

La Figura 8 ilustra datos numéricos de análisis ELISA que proveen comparaciones de la unión de anticuerpos scFv (Yl-myc+, T 1.1, y L32) a fibrinógeno, PSGL-1 y péptidos relacionados con GPIba.

La Figura 9 ilustra datos numéricos de análisis FACS después del manchado de las plaquetas con el anticuerpo Y17 scFv, en la presencia de concentraciones variables de péptidos derivados de GPIb. Los resultados se presentan como el porcentaje de reducción en el medio geo de la respuesta obtenida el anticuerpo scFv solo.

La Figura 10 ilustra datos numéricos de análisis ELISA después de la unión del anticuerpo Yl e Y17 scFv a PSGL1 sulfatado en diversas posiciones diferentes.

La Figura 11 ilustra datos numéricos de análisis FACS que proporcionan comparaciones de la unión anticuerpos scFv (la Figura 11A es TM1.1, la Figura 11B es TM1.3, y la Figura 11C es L32) a T-ALL y células sanguíneas periféricas normales (N-PBL) en función de la concentración de cada anticuerpo scFv.

La Figura 12 ilustra datos numéricos de un estudio in vivo de los efectos de la administración de los anticuerpos L32 e Yl scFv sobre los pesos de los hígados (Figura 12A) y la prevalencia del tumor (Figura 12B) en un modelo de tumor de células Molt4 de ratones SCID .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un anticuerpo o un fragmento de él que tiene capacidades de unión de un fragmento de anticuerpo scFv de la ID de SEC N°l, que se une a PSGL-1. Por lo tanto, estos anticuerpos de la presente invención tienen afinidad de unión similar a la ID de SEC N°l. El fragmento scFv de la ID de SEC N°l se ha designado L32. Por consiguiente, preferentemente, un anticuerpo de la presente invención es L32. Este anticuerpo se identificó detectando una biblioteca de fagos, que tiene diversidad solamente en las regiones CDR3 de cadena pesada, contra una célula de leucemia para seleccionar anticuerpos específicos que reconocen determinantes de la superficie de células de leucemia, en donde el receptor específico previamente no se conocía o había caracterizado. Utilizando este método, se identificó otro anticuerpo, L31. Aunque la presente invención abarca muchos anticuerpos, L32 se utilizará en adelante como ejemplo.

Previamente, se identificaron otros anticuerpos que se unen a células leucémicas en las Solicitudes de Patentes Estadounidenses N° 10/032.423; 10/032.037; 10/029.988; 10/029.926; 09/751.181; y 60/258.948 y en las Solicitudes de Patentes Internacionales N° PCT/US01/49442 y PCT/US01/49440 usando la misma biblioteca de fagos. Ejemplos específicos de anticuerpos revelados en estas solicitudes de patentes incluyen los anticuerpos Yl e Y17. Se descubrió que los anticuerpos revelados en estas solicitudes de patentes se unen específicamente a un epítope, hallado en proteínas de las células hematopoyéticas, que se sulfata en una tirosina de extremo N y se piensa que está involucrado en la migración celular, por ejemplo, la metástasis de tumores.

Tanto el anticuerpo L32 como los anticuerpos revelados en las aplicaciones de Y1/Y17 se unen a células leucémicas, aunque L32 se une a células leucémicas con aproximadamente cinco veces más afinidad que Yl . Basado en este hecho, asi como en el hecho de que los anticuerpos se aislaron de una línea germinal común (DP32), se realizaron estudios comparativos para determinar la correlación entre sus respectivos epítopes de unión. Posteriormente se determinó que L32 parece unirse al mismo epítope sulfado que Y1/Y17. Como el epítope de Y1/Y17 está específicamente presente en las plaquetas, aunque se ha sugerido que los niveles de expresión son 25-100 veces menor que aquella de los leucocitos (Frenette et al, J. Exp. Med. 191(8): 1413-22 (2000)), también se evaluó la unión de L32 a las plaquetas. Sin embargo, se descubrió que L32 se une solamente en forma despreciable a las plaquetas y, más aún, no afecta la agregación de las plaquetas . En la Tabla 1 se expone un resumen de Yl scFv e IgG comparados con L32 scFv e IgG.

TABLA 1 Yl scFv Yl IgG L32 scFv L32 IgG Unión a WBC Baja Alta Alta Muy Alta Unión a Células Baj a Alta Alta Muy Alta de Leucemia Reactividad de Baja Alta Alta Muy Alta PSGL-1 Competencia con Algo Si Sí Sí KPL1 Unión de Alta Alta Baja- Baja- Plaquetas Ninguna Ninguna Agregación de Inhibe Inducción Ningún -- Plaquetas Efecto Reactividad de Se une Se une Muy Baja- Muy Baja- GPIb Ninguna Ninguna Componente de Fibrinogeno Fibrinogeno No Muy Bajo- Plasma ? prima ? prima detectado Ninguno CCF4 CCF4 Efecto In Vitro No ADCC No ADCC Detectado Detectado Los epítopes sulfatados previamente identificados como uniéndose a Y1/Y17 se caracterizan por la presencia de grupos sulfatados, tales como residuos de tirosina sulfatada o grupos carbohidrato o lípido sulfatado, preferentemente dentro de un grupo de dos o más aminoácidos ácidos, que se hallan en ligandos y receptores que juegan papeles importantes en procesos diversos tales como inflamación, reacciones inmunes, infección, reacciones autoinmunes, metástasis, adhesión, trombosis y/o restenosis, arrollamiento de células, y agregación. Esos epítopes también se hallan en células enfermas, tales como células de B- leucemia, células de B-CLL, células de AML, células de mieloma múltiple, y células de metástasis. Estos epítopes son blancos útiles para la mediación terapéutica de estos procesos y para procedimientos de diagnóstico o pronóstico, que incluyen la determinación de las fases de evolución de la enfermedad.

El L32 scFv ha mejorado la selectividad para PSGL-1 sulfatado. Los glóbulos blancos involucrados en la inflamación, tales como monocitos, neutrófilos, y linfocitos, son reclutadas principalmente por las cuatro moléculas de adhesión, PSGL-1, P-Selectina, VLA-4, y VCAM-1 en los procesos inflamatorios de enfermedades tales como aterosclerosis (Huo y Ley, Acta Phys . Scand., 173: 35-43 (2001); Libby, Sci . Am. May: 48-55 (2002); Wang et al, J. Am. Coll . Cardiol . 38: 577-582 (2001)). La interferencia de L32 con cualquiera de estas moléculas centrales puede sugerir un rol potencial para L32 en la anulación de enfermedades relacionadas. Específicamente, P-selectina controla la unión y arrollamiento celular. Además, las interacciones de P-selectina - PSGL-1 activan otras numerosas moléculas en células que están íntegramente conectadas con la tumorigénesis (cuando se refiere a células malignas) y respuestas inflamatorias (cuando se refieren a los glóbulos blancos) (Shebuski y Kilgore, J. Pharmacol. Exp. T er. 300: 729-735 (2002)). Basado en esta comprensión de la capacidad de las P-selectinas de regular procesos celulares, es evidente que la selectividad de L32 scFv mejorada para PSGL-1 sulfatado puede hacerla una molécula superior para tratar una variedad de enfermedades malignas e inflamatorias. Más aún, modelos de enfermedades malignas han mostrado que la unión de la P-selectina a células malignas requiere la sulfatación de PSGL-1 (Ma y Geng, J. Immunol . 168: 1690-1696 (2002)) . Este requerimiento es similar a aquel para la unión de L32. Por lo tanto, se puede esperar que L32 pueda eliminar la facilitación de P-selectina del avance de la enfermedad maligna.

Más aún, se descubrió que para estos anticuerpos de la presente invención la unión depende de la etapa del desarrollo de la célula (el subtipo de AML se clasifica basado en el sistema Francés-Americano-Británico usando la morfología observada en el procesamiento y manchado citoquímico de rutina) : los anticuerpos se unen a células de AML que son del subtipo M3 o superior, pero no células del subtipo MO o MI . Además, los anticuerpos pueden unirse o no a las células del subtipo M2. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invención no se unen a la médula ósea normal, sana (por ejemplo, células CD34+) . Se piensa que esas diferencias se basan en alteraciones en la expresión y/o sulfatación de PSGL-1, así como posibles cambios de conformación en PSGL-1 que exponen un epxtope ligeramente diferente.

Preferentemente, el anticuerpo L32 de la presente invención se une a diferentes moléculas o epítopes involucrados en la inflamación, tales como PSGL-1. También preferentemente, el anticuerpo L32 se une a un epitope presente en por lo menos un tipo de célula involucrado en la inflamación o tumorogénesis, que incluye células de T-ALL, células de AML, y células de B-leucemia. También preferentemente, el anticuerpo L32 de la presente invención se une a epítopes en una molécula de lípido, carbohidrato, péptido, glicolípido, glicoproteína, lipoproteína, y/o lipopolisacárido . Esos epítopes preferentemente tienen al menos un grupo sulfatado. Alternativamente, pero también preferentemente, el anticuerpo L32 reacciona en forma cruzada con dos o más epítopes, cada epitope tiene uno o más residuos de tirosina sulfatada, y al menos un grupo de dos o más aminoácidos ácidos, uno de cuyos ejemplos es PSGL-1.

Después de la unión a PSGL-1 presente en la superficie de la célula, algunos de estos anticuerpos o fragmentos de ellos de la presente invención pueden internalizarse en la célula. Generalmente, los anticuerpos de IgG completos se internalizan, mientras que los fragmentos de anticuerpos más pequeños (tales como scFv) no se internalizan. Se deberá apreciar que los anticuerpos pueden internalizarse en cualquier célula que expresa PSGL-1, incluyendo células de AML, por ejemplo. Esta internalización puede ocurrir a través de endocitosis, un proceso activo que depende de la manera, el tiempo y la temperatura.

Son las regiones hipervariables de los anticuerpos L32 de la presente invención las que participan en la formación de los sitios de unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno es complementaria de la estructura de los epítopes a los cuales se unen los anticuerpos, en consecuencia estos sitios de unión se denominan regiones que determinan la complementariedad (CDR) . Hay tres CDR en cada cadena liviana y pesada del anticuerpo (CDR1, CDR2 y CDR3) , cada una ubicada en los bucles que conectan las hebras ß de los dominios VH y VL. La más variable de estas regiones es la región CDR3 de la cadena pesada. Se entiende que la región CDR3 es la región más expuesta de la molécula de Ig y, como se establece aqui, tiene un rol central en la determinación de las características de la unión selectiva y/o específica observadas .

DP32, que es una de las 49 líneas germinales presentes en la biblioteca de presentación de fagos, en la línea germinales específica de la biblioteca de fagos de la cual se aislaron los anticuerpos scFv de la presente invención. En consecuencia, DP32 proporciona a los anticuerpos de la presente invención de por lo menos las regiones variables marco de cadenas pesada y liviana, las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena liviana, y/o CDR1 y CDR2 de cadena pesada. DP32 también proporciona una estructura tridimensional en la cual se conformaron las regiones hipervariables . Se sabe bien que la especificidad de un anticuerpo es determinada por su conformación tridimensional . Por lo tanto, las limitaciones impuestas por DP32 puede tener un rolo significativo en la determinación de la especificidad de anticuerpos L32. Más aún, DP32 tiene diversos aminoácidos cargados, que pueden tener un rol estructural en el reconocimiento del anticuerpo L32.

De acuerdo con la presente invención, las CDR pueden insertarse en cassettes para producir anticuerpos. Un cassette, aplicado a los polipéptidos y definido en la presente invención, se refiere a una secuencia dada de aminoácidos consecutivos que sirve como un marco y se considera una sola unidad y se manipula como tal. Los aminoácidos pueden reemplazarse, insertarse, removerse o unirse en uno o ambos extremos. En forma similar, los tramos de aminoácidos se pueden reemplazar, insertar, remover o unir en uno o ambos extremos .

La secuencia de aminoácidos del cassette puede fijarse ostensiblemente, mientras que la secuencia reemplazada, insertada o unida puede ser altamente variable. El cassette puede comprender varios dominios, cada uno de los cuales abarca una función crucial para la construcción final .

El cassette de una realización particular de la presente invención comprende, desde el extremo de N, la región marco 1 (FR1) , CDR1, región marco 2 (FR2) , CDR2 , región marco 3 (FR3) , y región marco 4 (FR4) .

En una realización de la invención, es posible reemplazar diferentes regiones dentro del cassette. Por ejemplo, las regiones hipervariables CDR2 y CDR1 del cassette pueden reemplazarse o modificarse mediante sustituciones de aminoácidos no conservadoras o, preferentemente, conservadoras.

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo o fragmento de él tiene una cadena pesada y liviana, y cada cadena tiene una primera, segunda y tercera región hipervariable , que son las regiones CDR3 , CDR2 y CDR1, respectivamente. Particularmente, una región CDR3 de una cadena, la región CDR3 de la cadena liviana, o, preferentemente, la región CDR3 de la cadena pesada y, más preferentemente, las regiones CDR3 de cadena pesada y liviana determinan la selectividad y especificidad de la unión. Secundariamente, la selectividad y especificidad de la unión son determinadas por las regiones CDR2 y CDR1 de la cadena liviana y, preferentemente, de la cadena pesada. Las regiones superior o inferior que flanquean a la primera, segunda y/o tercera regiones hipervariables también pueden influir secundariamente en la selectividad y especificidad de la unión.

En una realización preferida de la presente invención, al menos un anticuerpo o un fragmento de él tiene una primera región hipervariable (CDR3) de la Identificación de Secuencia N° 2. Además, o alternativamente, al menos un anticuerpo o un fragmento de él tiene una segunda región hipervariable (CDR2) de la ID de SEC N° 3. Además, o alternativamente, al menos un anticuerpo o un fragmento de él tiene una tercera región hipervariable (CDR1) de la ID de SEC N° 4. Más preferentemente, al menos un anticuerpo o un fragmento de él tiene una primera región hipervariable (CDR3) de la ID de SEC N° 2 y una segunda región ipervariable (CDR2) de la ID de SEC N°3 y una tercera región hipervariable (CDR1) de la ID de SEC N° 4.

En una realización particularmente preferida, al menos un anticuerpo, o un fragmento de unión de él, del anticuerpo o fragmento de él es un scFv que tiene la ID de SEC N°l.

Para la totalidad de las secuencias de aminoácidos de < 25 residuos de aminoácidos descritos y detallados aquí (por ejemplo, las regiones CDR, las regiones que flanquean a las CDR) , se debe entender y considerar como otra realización de la invención que estas secuencias de aminoácidos incluyen dentro de su alcance una o dos sustituciones de aminoácidos y que preferentemente las sustituciones son sustituciones de aminoácidos conservadoras. Para la totalidad de las secuencias de aminoácidos de >25 residuos de aminoácidos descritas y detalladas aquí, se debe entender y considerar como una realización de la invención que estas secuencias de aminoácidos incluyen dentro de su alcance una secuencia de aminoácidos con >90% se similitud de secuencia con la secuencia original (Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1957) ) . Los aminoácidos similares u homólogos se definen como aminoácidos no idénticos que presentan propiedades similares, por ejemplo, ácidos, básicos, aromáticos, tamaño, con carga positiva o negativa, polaridad o no polaridad.

El porcentaje de similitud u homología de aminoácidos o similitud de secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de dos péptidos o polipéptidos diferentes. Se determinaron secuencias de anticuerpos mediante secuencias de ADN. Las dos secuencias se alinean, generalmente usando una variedad de programas de computación diseñados con ese fin, y se comparan los residuos de aminoácidos en cada posición. Se determina luego la identidad u homología de los aminoácidos . Luego se aplica un algoritmo para determinar el porcentaje de similitud de los aminoácidos. Generalmente es preferible comparar secuencias de aminoácidos, debido a la sensibilidad muy aumentada a la detección de relaciones sutiles entre las moléculas de péptido, polipéptido o proteína. La comparación de proteínas puede tomar en cuenta la presencia de sustituciones de aminoácidos conservadoras, por lo cual una desigualdad puede aún dar una calificación positiva si el aminoácido no idéntico tiene propiedades físicas y/o- químicas similares (Altschul et al (1997) , supra) .

En una realización de la invención, las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas liviana y pesada pueden intercambiarse entre las dos cadenas y entre los tres sitios hipervariables dentro y/o entre las cadenas. Más aún, las secuencias de las regiones hipervariables pueden alterarse para tenderse sobre o más de las COR. También en regiones variables marco, también de manera tal que pueden estar sólo parcialmente en 1 CDR.

La presente invención proporciona un péptido o polipéptido que tiene un nticuerpo o fragmento de unión al antigeno de él, una construcción de él o una construcción de un fragmento. De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos incluyen los anticuerpos IgG, IgA, IgD, IgE o IgM. La clase IgG abarca varias subclases que incluyen IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4.

Los anticuerpos pueden proporcionarse en muchas formas, tales como fragmentos, complejos, y multímeros. De acuerdo con la presente invención, los fragmentos de anticuerpos incluyen moléculas de Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab2 y Fd. Fragmentos de anticuerpos más pequeños, tales como fragmentos de Fv y fragmentos de Fab, también están incluidos en el término "fragmentos" , siempre que mantengan las características de unión del anticuerpo original o fragmento de mayor tamaño. las construcciones incluyen, por ejemplo, multímeros tales como diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos . Las frases "anticuerpo, fragmento de unión de él, o complejo que tiene un anticuerpo o fragmento de unión de él" y wanticuerpo o fragmento" abarcan la totalidad de estas moléculas, así como derivados, combinaciones, modificaciones, homólogos, miméticos, y variantes de ellos, a menos que se especifique lo contrario o se indique lo contrario basado en el contexto y/o conocimiento en el arte.

Se ha establecido que los scFv penetran en los tejidos y se aclaran de la sangre más rápidamente que un anticuerpo de tamaño completo porque son de tamaño más pequeño (Adams et al, Br. J. Cáncer 77: 1405-12 (1988); Hudson, Curr. Opin. Immunol . 11(5): 548-557 (1999); Wu et al, Tumor Targeting 4: 47 (1999)). Por lo tanto, los scFv generalmente se emplean en diagnósticos que consisten en rótulos radioactivos tales como la representación de imágenes de tumores para permitir un aclaramiento más rápido del rótulo radioactivo del cuerpo. Numerosos multímeros de scFv blanco de cáncer se han sometido recientemente a evaluación preclínica de la estabilidad y eficacia in vivo (Adams et al (1988) , supra; Wu (1999) , supra) .

Generalmente, los monómeros de scFv se diseñan con el extremo final de G del dominio VH atado por un ligador de polipéptido al residuo de extremo de N del VL. Optativamente se emplea una orientación invertida: el extremo final de C del dominio VL se ata al residuo de extremo de N de VH a través de un ligador de polipéptido (Power et al, J. Immunol . Meth. 242: 193-204 (2000)). El ligador de polipéptido tiene generalmente cinco aminoácidos de longitud. Cuando el ligador se reduce a tres a siete aminoácidos, los scFv pueden doblarse en un dominio de Fv funcional y en cambio asociarse con un segundo scFv para formar un diacuerpo. Reducir más la longiud del ligador a menos de tres aminoácidos obliga a la asociación del scFv en trímeros o tetrámeros, según la longitud del ligador, la composición y las orientaciones de los dominios de Fv. (Powers (2000) , supra) .

Recientemente, se ha descubierto que los fragmentos de anticuerpos multivalentes tales como dímeros, trímeros y tetrámeros de scFv con frecuencia proporcionan una afinidad más alta con respecto a la unión del anticuerpo padre al blanco. La afinidad más alta ofrece ventajas potenciales que incluyen farmacocinética mejorada para aplicaciones de tumores blanco. Además, al estudiar la P-Selectina y su ligando PSGL-1, que están involucrados en la unión y arrollamiento de leucocitos, los científicos han llegado a la conclusión de que las células que expresan formas diméricas de PSGL-1 establecieron adhesiones de arrollamiento más estables debido a esta afinidad de unión más alta. Estas adhesiones son más resistentes a doblarse y exhibieron menos fluctuación en las velocidades de arrollamiento. (Ramachandran et al, PNAS, 98(18): 10166-71 (2001)).

Las formas multivalentes de scFv han sido diseñadas y producidas por otros . Un enfoque ha sido unir dos scFv con ligadores . Otro enfoque consiste en utilizar enlaces de disulfuro entre dos scFv para la ligadura. El enfoque más simple para la producción de Fv dimérico o trimérico fue informado por Hollinger et al, PNAS 90: 6444-48 (1993) y Kortt et al, Protein Eng. 10: 423-33 (1997). Uno de tales enfoques se diseño para fabricar dímeros de scFv agregando una secuencia de la región de la proteína FOS y JU para formar un cierre de leucina entre ellas en el extremo de c del scFv (Kostelny et al, J. Immunol . 148(5): 1547-53 (1993); De Kruif et al, J. Biol . Chem. 271(13): 7630-34 (1996)). Otro método se diseñó para fabricar tetrámeros agregando una secuencia de codificación de streptavidina en el extremo de c del scFv. Streptavidina está compuesta de 4 subunidades, de manera que cuando el scFv-streptavidina se dobla, 4 subunidades se acomodan para formar un tetrámero (Kipriyanov et al, Hum. Antivodies Hybridomas 6(3): 91-101 (1995)). En aún otro método, para fabricar dímeros, trímeros y tetrámeros, se introduce una cisterna libre en la proteína de interés. Un entrecruzamiento basado en péptidos con números variables (2 a 4) de grupos de maleimida se utilizó para entrecruzar la proteína de interés a las cisteínas libres (Cochran et al, Immunity 12(3): 241-50 (2000) ) .

La mayor afinidad de estas formas multivalentes puede ser beneficioso en el diagnóstico, pronóstico, determinación de etapas de evolución y regímenes terapéuticos. Por ejemplo, un scFv puede emplearse como un agente de bloqueo para unirse a un receptor blanco y por lo tanto bloquear la unión del ligando "natural". En esas instancias, es deseable tener una asociación de afinidad más alta entre el scFv y el receptor para reducir las oportunidades de disociación, que puede permitir una unión indeseable del ligando natural al blanco. Además, esta afinidad más alta puede ser útil cuando los receptores blanco están involucrados en la adhesión y arrollamiento o cuando los receptores blanco están en células presentes en áreas de alto flujo, tales como las plaquetas.

En este sistema, la biblioteca de fagos (descrita aquí anteriormente) se puede diseñar para presentar scFv, que pueden doblarse en la forma monovalente de la región de Fv de un anticuerpo. Más aún, y también se discutió anteriormente aquí, la construcción es adecuada para la expresión bacteriana. Los scFv creados genéticamente comprenden regiones variables de cadena pesada y cadena liviana unidas por un separador de péptido flexible de 15 aminoácidos codificados en forma contigua. El separador es (Gly4Ser)3. La longitud del separador, junto con sus aminoácidos constituyentes proporciona un separador no voluminoso, que permite que las regiones VH y VL se doblen en un dominio de Fv funcional que proporciona la unión eficaz a su blanco .

La variación de la longitud de los separadores es aún otro método preferido de la formación de dxmeros, trímeros y tetrámeros (con frecuencia denominados en el arte diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos , respectivamente). Los dímeros se forman en condiciones en las cuales el separador que une las dos cadenas variables de un scFv se acorta a generalmente 5-12 residuos de aminoácidos. Este separador acortado impide que las dos cadenas variables de la misma molécula se doblen en un dominio de Fv funcional. En cambio, se obliga a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra molécula para crear dos dominios de unión. En un método preferido, se utilizó un separador de solamente 5 aminoácidos (Gly4Ser) para la construcción de diacuerpos. El dimero puede formarse a partir de dos scFv idénticos, o a partir de dos poblaciones diferentes de scFv y mantienen la actividad de unión mejorada selectiva y/o especifica del scFv parental, y/o muestran resistencia o afinidad de unión aumentada .

En una forma similar, se forman triacuerpos en condiciones en las cuales el separador que une las dos cadenas de un scFv se acorta a generalmente menos de 5 residuos de aminoácidos, impidiendo que las dos cadenas variables de la misma molécula se doblen en un dominio Fv funcional. En cambio, tres moléculas de scFv separadas se asocian para formar un trímero. En un método preferido, se obtuvieron triacuerpos removiendo completamente este separador flexible. El triacuerpo puede formarse a partir de tres scFv idénticos, o a partir de dos o tres poblaciones diferentes de scFv, y mantener la actividad de unión mejorada selectiva y/o específica del scFv parental y/o muestra resistencia o afinidad de unión aumentada.

Se forman tetracuerpos en forma similar en condiciones en las cuales el separador que une las dos cadenas variables de un scFv se acorta a generalmente menos de 5 residuos de aminoácidos , impidiendo que las dos cadenas variables de la misma molécula se doblen en un dominio de Fv funcional. En cambio, cuatro moléculas de scFv separadas se asocian para formar un tetrámero . El tetracuerpo puede formarse a partir de cuatro scFv idénticos, o a partir de 1-4 unidades individuales de diferentes poblaciones de scFv y debe mantener la actividad de unión mejorada selectiva y/o específica del scFv parental y/o muestra resistencia o afinidad de unión mejorada. Si se forman triacuerpos o tetracuerpos, en condiciones en las cuales el separador tiene generalmente menos de 5 residuos de aminoácidos de longitud, depende de la secuencia de aminoácidos del scFv particular en las condiciones de mezcla y reacción.

Una vez que se ha seleccionado y/o desarrollado un anticuerpo, un fragmento o una construcción que tiene las capacidades de unión deseadas, está dentro de la capacidad de un experto en el arte utilizar la guía provista aquí para producir construcciones y fragmentos que mantienen las características del anticuerpo original. Por ejemplo, se pueden hacer moléculas de anticuerpos completos, fragmentos Fv, fragmentos Fab, fragmentos Fab2, dímeros, trímeros, y otras construcciones que mantienen las características deseadas del anticuerpo, fragmento o construcción que se seleccionó o desarrolló originalmente.

Si se desea sustituir aminoácidos, pero aún mantener las características de un anticuerpo o fragmento, está dentro de la capacidad del experto en el arte fabricar sustituciones de aminoácidos conservadoras. También se pueden hacer modificaciones como conjugar a diversos agentes, a los anticuerpos o fragmentos sin alterar sus características de unión. También se pueden hacer otras modificaciones, tales como aquellas hechas para producir anticuerpos o fragmentos más estables, en los anticuerpos o fragmentos sin alterar su especificidad. Por ejemplo, se puede hacer una modificación de peptoides, modificación de semipeptoides , modificación de péptidos cíclicos, modificación del extremo de N, modificación del extremo de C, modificación del enlace de péptido, modificación de la cadena principal, y modificación del residuo. También está dentro de la capacidad del experto seguir la guía de la presente memoria descriptiva para ensayar los anticuerpos o fragmentos modificados para evaluar si sus características de unión se han cambiado.

En forma similar, está dentro de la capacidad del experto usar la guía provista aquí para alterar las características de unión de un anticuerpo, fragmento o construcción para obtener una molécula con algunas características deseables. Por ejemplo, una vez que se identifica un anticuerpo que tiene las propiedades deseables, se puede utilizar la mutagénesis aleatoria o dirigida para generar variantes del anticuerpo, y se pueden detectar características deseables de esas variantes.

Utilizando métodos convencionales conocidos en el arte, un experto en el arte puede determinar anticuerpos de adición o fragmentos de ellos que tienen las capacidades de unión de L32 scFv. Por ejemplo, se pueden aislar anticuerpos adicionales utilizando los métodos de biopaneo descritos aquí, en donde la molécula o célula a la que se une L32 se utiliza para detectar una biblioteca de presentación de fagos particular, particularmente una biblioteca preparada a partir de un paciente con leucemia, linfoma y mieloma.

Los anticuerpos y fragmentos, de acuerdo con la presente invención, también pueden tener un marcador que puede insertarse o unirse a él para ayudar en la preparación e identificación de él y en el diagnóstico o pronóstico, incluyendo la determinación de las etapas de la enfermedad. Ejemplos de marcadores útiles incluyen: AU1, AU5 , BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Proteína C, S-TAG®, T7 , V5 , y VSV-G (Jarvik y Telmer, Ann. Rev. Gen., 32, 601-18 (1993)). El marcador es preferentemente c-myc o KAK.

Los anticuerpos, fragmentos de ellos o construcciones de ellos, péptidos, polipéptidos, proteínas, y fragmentos y construcciones de ellos, se pueden producir en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos . Los métodos para producir anticuerpos y fragmentos en sistemas procarióticos y eucarióticos son conocidos en el arte .

Un sistema celular eucariótico, definido en la presente invención y discutido aquí, se refiere a un sistema de expresión para producir péptidos o polipéptidos mediante métodos de ingeniería genética, en donde la célula huésped es un eucariote. Un sistema de expresión eucariotico puede ser un sistema de mamífero, y el péptido o polipéptido producido en el sistema de expresión de mamífero, después de la purificación, está de preferencia sustancialmente libre de contaminantes de mamíferos. Otros ejemplos de un sistema de expresión eucariotico incluyen sistemas de expresión de levadura.

Un sistema procariotico preferido para la producción del péptido o polipéptido de la invención utiliza E. coli como el huésped para el vector de expresión. El péptido o polipéptido producido en el sistema de E. coli, después de la purificación, está sustancialmente libre de proteínas contaminantes de E. coli. El uso de un sistema de expresión procariotico puede derivar en el agregado de un residuo de metionina al extremo de N de algunas o la totalidad de las secuencias provistas para la presente invención. La remoción del residuo de metionina del extremo de N, después de la producción del péptido o polipéptido para permitir la expresión completa del péptido o polipétido, se puede realizar como se sabe en el arte, un ejemplo es mediante el uso de aminopeptidasa de Aeromonas en condiciones adecuadas (Patente Estadounidense N° 5.763.215).

En una realización preferida de la presente invención, el proceso para producir un anticuerpo o un fragmento de él tiene los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca de presentación de fagos; (b) proporcionar una molécula o célula a la cual se pueda unir un anticuerpo o un fragmento de él que tiene las capacidades de unión de un fragmento del anticuerpo scFv de la ID de SEC N°l; (c) panear la biblioteca de presentación de fagos por una partícula de fago que presenta un oligopéptido o polipéptido que se une a la molécula o célula; y (d) producir un anticuerpo o un fragmento de él que tiene al menos un anticuerpo o fragmento de unión de él que tiene un anticuerpo o un fragmento de unión de él, que tiene el péptido o polipéptido que se une a la molécula o célula.

Los anticuerpos y polipéptidos de la presente invención puede formar complejos por ejemplo asociarse, combinarse, fusionarse o unirse a diversos agentes farmacéuticos tales como drogas, toxinas, e isótopos radioactivos y optativamente, con un portador farmacéuticamente eficaz, para formar composiciones de péptido y droga que comprenden un anticuerpo/polipéptido y un agente farmacéutico que tiene actividad anti-enfermedad y/o anti-cáncer. Esas composiciones también pueden utilizarse con fines de diagnóstico .

Ejemplos de portadores útiles en la invención incluyen dextran, HPMA (un polímero hidrófilo) , o cualquier otro polímero, tal como un polímero hidrófilo, así como derivados, combinaciones y modificaciones de ellos. Alternativamente, se pueden utilizar liposomas decorados, tales como liposomas decorados con moléculas de scFv Yl (por ejemplo, Doxil, un liposoma comercialmente disponible que contiene grandes cantidades de doxorubicina) . Esos liposomas pueden prepararse para contener uno o más agentes deseados y mezclarse con los anticuerpos de la presente invención para proporcionar una relación alta de la droga al anticuerpo.

Alternativamente, la unión entre el anticuerpo o el fragmento de él y el agente puede ser una unión directa. Una unión directa entre dos o más moléculas vecinas se puede producir a través de un enlace químico entre elementos o grupos de elementos en las moléculas. El enlace químico puede ser, por ejemplo, un enlace iónico, un enlace covalente, un enlace hidrófobo, un enlace hidrófilo, un enlace electrostático, o un enlace de hidrógeno. Los enlaces pueden ser, por ejemplo, enlaces de amida, sulfuro de carbono, péptido, y/o disulfuro. Para unir el anticuerpo al agente o ligador, se pueden utilizar grupos funcionales amina, carboxi, hidroxilo, tilo y éster, que se conocen en el arte para formar enlaces covalentes .

La unión entre el péptido y el agente o entre el péptido y el portador, o entre el portador y el agente puede ser a través de un compuesto ligador. Como se utiliza aquí, en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, un compuesto ligador se define como un compuesto que une dos o más grupos. El ligador puede ser de cadena recta o ramificado, ün compuesto ligador ramificado puede estar compuesto de una ramificación doble, una ramificación triple, o un compuesto cuádruple o más ramificado. Los compuestos ligadores útiles en la presente invención incluyen aquellos seleccionados del grupo que tiene ácidos dicarboxilicos, malemido hidrazidas, PDPH, hidrazidas de ácido carboxílico, y péptidos pequeños .

Ejemplos más específicos de compuestos ligadores útiles, de acuerdo con la presente invención, incluyen: (a) ácidos dicarboxilicos tales como ácido succínico, ácido glutárico, y ácido adípico; (b) maleimido hidrazidas tales como N- [ácido maleimidocaproico] hidrazida, 4- [N-maleimidometil] ciclohexan-1-carboxilhidrazida, y N- [ácido maleimidoundecanoico] hidrazida; (c) (3- [2-piridiltio]propionil hidrazida) ; y (d) hidrazidas de ácido carboxílico seleccionadas de 2-5 átomos de carbono, y derivados, combinaciones, modificaciones y análogos de ellos.

La unión a través de acoplamiento directo utilizando ligadores de péptido también es útil. Por ejemplo, el acoplamiento directo entre el azúcar libre de, por ejemplo, la droga anti-cáncer doxorubicina y un scFv puede lograrse utilizando péptidos pequeños. Ejemplos de péptidos pequeños incluyen AUl, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3 , Proteína C, S-TAG®, T7, V5, VSV-G y ??.

Los anticuerpos y fragmentos de ellos de la presente invención pueden unirse, conjugarse, formar complejos o asociarse de otro modo con agentes de formación de imagen (también denominados marcadores indicadores), tales como radioisótopos, y estos conjugados pueden utilizarse con fines de diagnóstico, pronóstico o determinación de etapas de evolución y de formación de imágenes. Se proporcionan kits que tienen conjugados de radioisótopo-anticuerpo (o fragmento) .

Ejemplos de radioisótopos útiles para diagnóstico, pronóstico, o determinación de etapas de evolución incluyen 11:Lindio, 113indio, S9mrenio, 105renio, 101renio, 99mtecnetio, 121tntelerio, 122mtelerio, 1S5tulio, 1S7tulio, 168tulio, 123yodo, 12eyodo, 131yodo, 133yodo, 81mcriptón, 33xenón, 90itrio, 213bismuto, "bromo, 18flúor, S5rutenio, 97rutenio, 103rutenio, 107mercurio, 203mercurio, 67galio, y 6Bgalio.

Los isótopos radioactivos preferidos son opacos a los rayos X o cualquier otro ion paramagnético adecuado.

La molécula de marcador indicador puede también ser una molécula de marcador fluorescente. Ejemplos de moléculas de marcador fluorescente incluyen fluoresceína, ficoeritrina, o rodamina o modificaciones o conjugados de ellas.

Los anticuerpos o fragmentos conjugados a marcadores indicadores pueden utilizarse para diagnosticar, pronosticar, determinar etapas de estados de enfermedad proporcionando una muestra que contiene una célula del paciente y que determina si los anticuerpos de la presente invención se une a la célula del paciente, indicando de esta manera que el paciente está en riesgo o tiene la enfermedad. Más aún, la presente invención también proporciona un método de purgar células de tumor de un paciente proporcionando una muestra que contiene células del paciente e incubando las células del paciente con un anticuerpo de la presente invención. Esas actividades pueden llevarse a cabo in vivo, in vitro o ex vivo. Cuando se llevan a cabo in vivo o ex vivo, el agente de formación de imágenes es de preferencia fisiológicamente aceptable en que no daña al paciente a un nivel aceptable. Los niveles aceptables de daño pueden ser determinados por los médicos clínicos usando criterios tales como la severidad de la enfermedad y la disponibilidad de otras opciones.

Con respecto al cáncer, la determinación de las etapas de evolución de una enfermedad en un paciente generalmente consiste en determinar la clasificación de la enfermedad basado en el tamaño, ubicación, e invasividad del tumor. Un sistema de clasificación para clasificar el cáncer por características del tumor es la "Clasificación TNM de Tumores Malignos" (6a Edición) (LH Sobin, Ed. ) , que se incorpora como referencia aquí y que clasifica las etapas del cáncer en categorías T, N y M donde T describe el tumor primario de acuerdo con su tamaño y ubicación, N describe los nodulos linfáticos y M describe metástasis distantes. Además, los números I, II, III y IV se utilizan para indicar las etapas y cada número se refiere a una combinación posible de factores de TNM. Por ejemplo, un cáncer de mama de la Etapa I se define con el grupo TMN: TI, NO, M0 que significan: TI: el tumor tiene 2 cm o menos de diámetro, NO: ninguna metástasis de nodulo linfático regional, MO : ninguna metástasis distante. Otro sistema se utiliza para determinar las etapas de AML, con subtipos de clasificaciones basados en el sistema francés-americano-británico utilizando la morfología observada con procesamiento y manchado citoquímico de rutina.

Además, una determinación de etapas o clasificación de enfermedades neoplásicas de los tejidos hematopoyéticas y linfoides de la Organización Mundial de la Salud (OMS) propuesta recientemente, incluye (específicamente para AML) las categorías de enfermedad del tipo de FAB tradicionales, así como tipos de enfermedad adicionales que se correlacionan con hallazgos citogenéticos específicos y AML asociados con mielodisplasia . Otros han propuesto también clasificaciones patológicas . Por ejemplo, una propuesta específica para AML incluye tipos de enfermedad que se correlacionan con translocaciones citogenéticas y pueden reconocerse en forma confiable mediante evaluación morfológica e inmunofenotipificación y que incorporan la importancia de cambios mielodisplásicos asociados. Este sistema está sostenido por estudios citogenéticos o moleculares y puede expandirse como entidades clinicopatológicas reconocibles nuevas que se describen (Arber, Am. J. Clin. Pathol . 115(4): 552-60 (2001) ) .

La presente invención proporciona un kit para diagnóstico, pronóstico o determinación de etapas para el análisis in vivo de la eficacia del tratamiento antes, durante o después del tratamiento, que tiene un agente de formación de imágenes que tiene un péptido de la invención unido a una molécula de marcador indicador, o un agente "de formación de imágenes. La invención además proporciona un método de usar el agente de formación de imágenes para el diagnóstico de la localización, el pronóstico de sobrevida, y la determinación de etapas o la formación de imágenes de un cáncer, más específicamente un tumor, que tiene los siguientes pasos: (a) poner en contacto las células con la composición; (b) medir la radioactividad unida a las células; y por lo tanto (c) visualizar el tumor.

Ejemplos de agentes de formación de imágenes adecuadas incluyen colorantes fluorescentes, tales como FITC, PE y similares, y proteínas fluorescentes, tales como proteínas verde fluorescentes. Otros ejemplos incluyen moléculas radioactivas y enzimas que reaccionan con un sustrato para producir un cambio reconocible, tal como un cambio de color.

En un ejemplo, el agente de formación de imágenes del kit es un colorante fluorescente, tal como FITC, y el kit proporciona el análisis de la eficacia del tratamiento de cánceres, más específicamente cánceres relacionados con la sangre, por ejemplo, leucemia, linfoma y mieloma. Se utiliza el análisis de FACS para determinar el porcentaje de células manchadas por el agente de formación de imágenes y la intensidad del manchado en cada etapa de la enfermedad, por ejemplo, al diagnosticar, durante el tratamiento, durante la remisión y durante la recaída.

Los anticuerpos y fragmentos de ellos, de la presente invención pueden unirse, conjugarse, o asociarse de otro modo con agentes anti-cáncer, agentes antineoplásicos , agentes antivirales, agentes antimetastásicos , agentes antinflamatorios , agentes anti-trombosis, agentes anti-restenosis , agentes anti-agregación, agentes anti-autoinmune, agentes anti-adhesión, agentes contra enfermedades cardiovasculares, agentes farmacéuticos u otros agentes anti-enfermedad. Un agente se refiere a un agente que es útil en el tratamiento profiláctico o el diagnóstico de un mamífero que incluye, en forma no taxativa, un humano, bovino, equino, porcino, murino, canino, felino, o cualquier otro animal de sangre caliente.

Ejemplos de esos agentes incluyen, en forma no taxativa, agentes antivirales que incluyen acyclovir, ganciclovir y zidovudina; agentes anti-trombosis/restenosis que incluyen colostazol, sodio de dalteparina, sodio de reviparina, y aspirina; agentes antinflamatorios que incluyen zaltoprofeno, pranoprofeno, droxicam, acetil salicílico 17, diclofenac, ibuprofeno, dexibuprofeno, sulindac, naproxeno, amtolmetina, celecoxib, indometacina, rofecoxib, y nimesulid; agentes anti-autoinmune que incluyen leflunomida, denileucin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotida y ciclofosfamida; y agentes anti-adhesión/anti-agregación que incluyen limaprost, clorcroraeno, y ácido hialurónico .

Ejemplos de agentes farmacéuticos incluyen las antraciclinas, tales como doxorubicina (adriamicina) , danorubicina (daunomicina) , idarubicina detorubicina, carminomicina, epirubicina, esorubicina, así como morfolino y derivados sustituidos y combinaciones de ellos. Otros ejemplos de agentes farmacéuticos incluyen cis-platino, taxol, calicheamicin, vincristina, citarabina (Ara-C) , ciclofosfamida, prednisona, fludarabina, idarubicina, clorambucil, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida y bleomicina, y derivados, combinaciones y modificaciones de ellos .

La inhibición del crecimiento de una célula de cáncer incluye, por ejemplo, (i) prevención del crecimiento canceroso o metastásico, (ii) hacer lento el crecimiento canceroso o metastásico, (iii) prevención total del proceso de crecimiento de la célula de cáncer o el proceso metastásico, mientras se deja la célula intacta y viva, (iv) interferir con el contacto de las células de cáncer con el micromedio, o (v) eliminación de la célula de cáncer.

La inhibición del crecimiento de una célula de leucemia incluye, por ejemplo, (i) la prevención del crecimiento leucémico o metastásico, (ii) hacer lento el crecimiento leucémico o metastásico, (iii) la prevención total del proceso de crecimiento de la célula de leucemia o el proceso metastásico, mientras se deja la célula intacta y viva, (iv) interferir con el contacto de células de cáncer con el micromedio, o (v) eliminación de la célula de leucemia.

Ejemplos de agentes anti-enfermedad, anti-cáncer, y antileucémicos a los cuales se pueden unir exitosamente los anticuerpos o fragmentos de la presente invención incluyen toxinas, radioisótopos y compuestos farmacéuticos.

Ejemplos de toxinas incluyen gelonina, exotoxina de Pseudomonas (PE), PE40, PE38, toxina de difteria, ricina, o derivados, combinaciones y modificaciones de ellas.

Ejemplos de radioisótopos incluyen emisores de radiación gamma, emisores de positrones, y emisores de rayos X que pueden utilizarse para la localización y/o terapia, y emisores de rayos beta y emisores de rayos alfa que pueden utilizarse para terapia. Los radioisótopos descritos anteriormente coo útiles para el diagnóstico, pronóstico y determinación de etapas son también útiles para terapéutica.

Ejemplos no taxativos de agentes anti-cáncer y antileucemia incluyen antraciclinas tales como doxorubicina (adriamicina) , daunorubicina (daunomicina) , idarubicina, detorubicina, carminoicina, epirubicina, esorubicina, y morfolino y derivados sustituidos, combinaciones y modificaciones de ellos. Ejemplos de agentes farmacéuticos incluyen cis-platino, taxol, calicheamiciña, vincristina, citarabina (Ara-C) , ciclofosfamida, prednisona, daunorubicina, idarubicina, fludarabina, clorambucil, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida, y bleomicina, y derivados, combinaciones y modificaciones de ellas. Preferentemente, el agente anti-cáncer o anti-leucemia es doxorubicina, morfolinodoxorubicina o morfolinodaunorubicina .

En una realización, la presente invención proporciona métodos de inducción o activación de ADCC administrando los presentes anticuerpos. Por consiguiente, estos anticuerpos pueden activar ADCC y/o estimular células agresoras naturales (NK) (por ejemplo CD56+) , células citotóxicas (por ejemplo CD8+) , y/o monocitos, que pueden derivar en la lisis de células. Generalmente, después de la administración de una anticuerpo que comprende una región Fe o una porción del anticuerpo, dicho anticuerpo se une a un Fe receptor (FcR) sobre células efectoras, por ejemplo, células NK, disparando la liberación de perforina y granzima B, que luego deriva en la apoptosis. Diversos factores pueden afectar ADCC, incluyendo el tipo de células efectoras involucradas, citocinas (IL-2 y G-CSF, por ejemplo), tiempo de incubación, el número de receptores presentes en la superficie de las células y la afinidad del anticuerpo.

En una realización, las composiciones farmacéuticas, de la presente invención tienen un anticuerpo o un fragmento de él con las capacidades de unión de un fragmento de anticuerpo scFv de la ID de SEC N°l y un portador farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo o un fragmento de él puede estar presente en una cantidad eficaz para inhibir o tratar el arrollamiento de células, la inflamación, infección, enfermedad auto-inmune, metástasis, crecimiento y/o replicación de células de tumores o células de leucemia, o el aumento del número de células de tumor en un paciente que tiene un tumor o células de leucemia en un paciente que tiene leucemia. Alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de él puede estar presente en una cantidad eficaz para aumentar la mortalidad de las células de tumor o células de leucemia. También alternativamente, el anticuerpo o fragmento de él puede estar presente en una cantidad eficaz para alterar la susceptibilidad de las células enfermas al daño por agentes anti-enfermedad, células de tumor al daño por agentes anticáncer, o células de leucemia al daño por agentes antileucemia. También alternativamente, el anticuerpo o fragmento de él puede estar presente en una cantidad eficaz para disminuir el número de células de tumor en un paciente que tiene un tumor o células de leucemia en un paciente que tiene leucemia.

Se pueden administrar anticuerpos, construcciones, conjugados, y fragmentos de la presente invención a pacientes que los necesitan por cualquier método adecuado. Ejemplos de métodos incluyen administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, intratraqueal , intratecal, intralinf tica, nasal, sublingual, oral, rectal, vaginal, respiratoria, bucal, intradérmica, transdérmica, o intrapleural .

Para la administración intravenosa, la formulación preferentemente se prepara de manera tal que la cantidad administrada al paciente es una cantidad eficaz de 0,1 mg a 1.000 mg de la composición deseada. Más preferentemente, la cantidad administrada está en la gama de 1 mg a 500 mg de la composición deseada. Las composiciones de la invención son eficaces en una amplia gama de dosificaciones y dependen de factores tales como los detalles de la enfermedad que se debe tratar, la hemivida del péptido, o la composición farmacéutica basada en polipéptidos en el cuerpo del paciente, características físicas y químicas de un agente que forma un complejo con el anticuerpo o un fragmento de él y de la composición farmacéutica, la forma de administración de la composición farmacéutica, detalles del paciente se debe tratar o diagnosticar, así como otros parámetros que el médico tratante considera importantes .

La composición farmacéutica para la administración oral puede estar en cualquier forma adecuada. Ejemplos de ellos incluyen tabletas, líquidos, emulsiones, suspensiones, jarabes, pastillas, cápsulas. Los métodos de fabricación de composiciones farmacéuticas son conocidos en el arte (Véase, por ejemplo, emington, La Ciencia y Práctica de Farmacia, Alfonso R. Gennaro (Ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (pub) ) .

La composición farmacéutica puede también formularse de manera tal que facilite la liberación temporizada, sostenida, pulsada, o continua. La composición farmacéutica también puede administrarse en un aparato, tal como un aparato para la liberación temporizada, sostenida, pulsada o continua. La composición farmacéutica para la administración tópica puede ser en cualquier forma adecuada, tal como cremas, ungüentos, lociones, parches, soluciones, suspensiones, liofilizados , y geles . Las composiciones que tienen anticuerpos, construcciones, conjugados y fragmentos de la presente invención pueden comprender diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, excipientes, portadores y similares. Tabletas, pastillas, cápsulas pueden incluir excipientes convencionales tales como lactosa, almidón y estearato de magnesio. Los supositorios pueden incluir excipientes tales como ceras y glicerol. Las soluciones inyectables comprenden medios libres de pirógeno estériles tales como solución salina, y pueden incluir agentes tampón, agentes de estabilización o conservantes. Se pueden utilizar también recubrimientos entéricos convencionales.

En anticuerpo o un fragmento de él y composiciones farmacéuticas de ellos, puede utilizarse en métodos de tratamiento de una enfermedad (por ejemplo, el tratamiento puede incluir mejorar los efectos de una enfermedad, prevenir una enfermedad, o inhibir el avance de una enfermedad) en pacientes que lo necesitan. Esos métodos incluyen inhibir o tratar el arrollamiento de células, inflamación, enfermedad autoinmune, metástasis, crecimiento y/o replicación de células de tumor o células de leucemia, o el aumento del número de células de tumores en un paciente que tiene un tumor o células de leucemia en un paciente que tiene leucemia. Además, tales métodos incluyen aumentar el índice de mortalidad de células de tumor o células de leucemia o alterar la susceptibilidad de células enfermas al daño por agentes anti-enfermedad, de células de tumor al daño por agentes anti-cáncer, o de células de leucemia al daño por agentes anti-cáncer. Tales métodos también incluyen disminuir el número de células de tumor en un paciente que tiene un paciente que tiene células de tumor o leucemia en un paciente que tiene leucemia.

La presente invención también proporciona un método de purgar células de tumor desde un paciente proporcionando una muestra que contiene células del paciente e incubar las células del paciente con un anticuerpo de la presente invención. En una realización, la purga ocurre ex vivo.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se exponen para ayudar a comprender e ilustrar adicionalmente la invención, pero se debe interpretar que limitan su alcance de ninguna manera. Aunque se describen reactivos y condiciones de reacción específicos, se pueden hacer modificaciones que están abarcadas por el alcance de la invención.

Ejemplo 1 El presente ejemplo demuestra la selección, producción y caracterización inicial de fragmentos del anticuerpo L32 scFv. En resumen, se utilizó una biblioteca de presentación de fagos que presentan fragmentos de anticuerpos scFv para obtener y producir moléculas blanco, y se utilizó citometría de flujo, particularmente clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) , para identificar y aislar clones de fagos específicos, cuyo péptido o polipéptido reconoce células blanco. La biblioteca de presentación de fagos utilizada aquí se construyó a partir de linfocitos de sangre periféricas de 49 donantes humanos no inmunizados.

Se seleccionaron clones de fagos y se identificaron a través de un procedimiento de varios pasos denominado biopaneo . El biopaneo se llevó a cabo incubando variantes de ligandos de proteínas de presentación de fagos (una biblioteca de presentación de fagos) con células blanco, removiendo fagos no unidos mediante una técnica de lavado, y específicamente eluyendo el fago unido. Los clones de fagos eluidos optativamente se amplificaron antes de ciclos adicionales de unión y amplificación opcional que enriquecieron la mezcla de secuencias especificas a favor de aquellos clones de fagos que transportan fragmentos de anticuerpos que se unen mejor al blanco. Después de varias rondas de paneo, se caracterizaron clones de fagos individuales y las secuencias de los péptidos presentadas por los clones se determinaron colocando en secuencia el ADN correspondiente del virión de fago.

En la presente invención, la detección de células de T-linfoma se llevó a cabo contra epítopes no definidos para los pasos de biopaneo iniciales, con la posterior selección de clones realizada con una célula blanco deseada (por ejemplo, células de leucemia B, células de B-CLL, células de AML, células de mieloma múltiple, y células metastásicas) , cuyos marcadores de la superficie de células blanco se desconocen.

Utilizando el protocolo de Ll, se descubrió el clon de anticuerpo L32 scFv paneando una biblioteca de presentación de fagos sobre células de T-linfoma intactas. Este protocolo comenzó con prelavado. Alícuotas de 1 mi que contienen 2xl07 células de leucemia/linforna T congeladas de pacientes, almacenadas a -70 °C, se fundieron rápidamente a 37 °C, e inmediatamente se diluyeron en 10 mi de PBS-Leche (MPBS) al 2% frío. Se centrifugaron células 5' a 120 x g a temperatura ambiente (RT) , se lavaron dos veces, se suspendieron en MPBS, se contaron con un hemocitómetro . La biblioteca de fago de presentación de scFv (Nissim et al, EMBO J., 13: 692-98 (1994)) se utilizó con la aceptación de MRC. La biblioteca se construyó originalmente como una biblioteca de fagémido que presenta fragmentos de scFv en donde los dominios VH y VL se unieron con un polipéptido flexible. Los scFv presentados en la biblioteca de fagémido se fusionó al extremo de N de la proteína de recubrimiento menor pIII del fago, que luego se subclonó en el vector pHENl. Los repertorios de fragmentos de anticuerpos se generaron primero mediante PCR a partir de genes V reordenados de linfocitos sanguíneos periféricos de humanos no inmunizados (denominados "repertorios naive"). Para diversificar los repertorios, se introdujeron secuencias de nucleótidos aleatorias que codifican longitudes de CDR3 de cadena pesada de 4-12 residuos en un banco de 49 segmentos de genes de VH humanos clonados . El fragmento de VL fusionado en la totalidad de los clones se obtuvo de un solo gen V no mutado de la línea germinal IGLV3S1, creando una biblioteca de un solo recipiente de aproximadamente 108 clones.

La selección del clon del anticuerpo L32 scFv se llevó a cabo en un volumen final de 0,5 mi de MPBS que contiene 10e células T, 1011 Unidades de Formación de Colonias (CFU) de fagémidos (biblioteca de Nissim) y 1013 bacteriófagos de tipo silvestre M13, con agitación lenta durante 1 hora a 4°C. El lavado de células luego se realizó suspendiendo las células con MPBS y centrifugando a 120 x g a 4°C. El procedimiento de selección + lavado de células se repitió tres veces .

Después de la primera ronda de selección, se eluyeron fagémidos unidos de células de T-linfoma incubando las células durante 5 minutos a temperatura ambiente, con 150 µ? de glicina 0,1 M, a pH 2,2. Después de la neutralización, se centrifugaron células y se descartaron, y el fluido sobrenadante que contiene las partículas de fago eluidas se recogieron y se denominaron stock de El . Este stock de El se amplificó mediante el agregado de 1 mi de células TG-1 que crecen exponencialmente e incubando durante 30 minutos a 37 °C. Se colocó una alícuota en una placa con fines de titulación, y el volumen restante se colocó sobre placas grandes (150 mm) que contienen 2xTY/AMP (1,6% Triptona, 1% extracto de levadura, 0,5% NaCl y 100 µg/ml de ampicilina) . Se incubaron placas toda la noche a 30 °C. Para determinar la salida después de cada ronda de paneo, se enumeraron colonias en la placa de titulación, y se calculó la salida total.

Se prepararon cultivos bacterianos nuevos de las cepas bacterianas TG-1 y HB2151 para la infección (amplificación) cultivando las células a Aeoo de 0,5-0,9 (células que crecen exponencialmente) . Se utilizaron células TG-1 de E. coli para la propagación de fago y células HB2151 de E. coli para la producción de proteína scFv. Las colonias de las placas grandes se rasparon y mezclaron. Una alícuota (107) de células TG-1 de E. coli resistentes a ampicilina se cultivó en un cultivo líquido a A600 de 0,5, luego se infectó con fago helper (VSC-M13, Stratágeme) para producir un gran stock de fagémidos amplificados. Se recuperaron fagémidos mediante un procedimiento de precipitación con PEG (Harrison et al, Métodos en Enzimología (1996) 267: 83-109). Aproximadamente 1012 fagémidos/ml del stock de El amplificado, descrito anteriormente, se utilizó para las rondas posteriores de paneo contra células T.

Se llevaron a cabo segundas y terceras rondas de "paneos secuenciales" esencialmente como se describió para el primer procedimiento de paneo con las siguientes modificaciones: (i) para el segundo paneo secuencial, se utilizaron 1011 fagémidos, y (ii) después de la selección y el lavado, los fagémidos unidos se eluyeron incubando las células durante 15 minutos a temperatura ambiente, en 50 µ? de PBS/l% de BSA+ATP (10 mM) . Se centrifugaron células y el fluido sobrenadante se recogió. La salida que contiene los fagémidos eluidos derivados de la segunda ronda de este procedimiento, denominado ElATl, se utilizó para la tercera ronda del paneo secuencial, como se describió anteriormente, sin amplificación. Después de la elusión de ATP, como en la segunda ronda, los fagémidos se amplificaron en células TG-1, como se describió anteriormente. El stock amplificado final se denominó E1AT2. Una alícuota (5 µ?) se mezcló con un cultivo bacteriano de TG-1 para la infección, titulación, y análisis de secuencia. El volumen restante (45 µ?) se incubó con 1,3 mi de suspensión de células TG-1 para la amplificación y almacenamiento.

El número estimado de fagémidos utilizados para el paneo (entrada) y el número estimado de fagémidos unidos eluidos (salida) se resumió para los tres pasos consecutivos del protocolo de biopaneo de Ll en la Tabla 2. Se enumera la fuente de células y el medio de elusión para cada resultado de salida así como el término utilizado para distinguir cada stock por separado .

TABLA 2 Stock de Fuente de Elusión Salida Stock Entrada Células amplificado Biblioteca T-linforna Ácido 3,3xl06 El de Nissim: 1012 El-1011 T-Linforna ATP (lOmM) 500 E1AT1* E1AT1-500 T-Linforna ATP (lOmM) 37 E1AT2 *Eluido pero no amplificado Los resultados que se muestran en la Tabla 1 indican que, cuando la solución de ATP se utilizó para la segunda y tercera rondas, el número de fago eluido fue muy bajo, lo cual indica un posible aumento en la especificidad del fago. Después del paneo, se seleccionaron varios clones de cada ronda para la secuencia. Las secuencias de aminoácidos que se presenta en esta sección son las siguientes: (a) secuencias que aparecieron más de una vez entre los clones seleccionados, (b) secuencias de la región CDR3 de la cadena pesada solamente (VH-CD 3) y (c) la especie de la línea germinal de cada clon aislado.

TABLA 3 Clon Tamaño de Secuencia de VH- Línea Salida Frecuencia VH-CDR3 CDR3 Germinal L32 8 Leu Asn Pro Lys VH3-DP32 E1AT2 4/15 Val Lys His Met (ID de SEC N°4) L31 7 Leu Arg Gly Gly VH3-DP32 E1AT2 5/15 Asn Ala Met (ID de SEC N°5) Se identificaron dos tipos de clones, L32 y L31, después del protocolo de biopaneo de Ll; y sus secuencias se presentan en la Tabla 3. Se presentan el número de residuos de aminoácidos de la región CDR3 (tamaño de VH-CDR3) y las secuencias específicas de CDR3 , junto con la designación de la linea germinal de cada clon. Además, se presenta el número de veces que se aisló un tipo de clon específico, en función del número total de clones para el protocolo de Ll (frecuencia) . Es interesante que, aunque la biblioteca contenía VH de cinco familias de VH diferentes (VH1, VH2, VH3 , VH4 y VH6) donde VH3 constituye el 47% de los genes utilizados, ambos clones aislados son de la familia de VH3 (DP32) . Ésta es una ventaja para el proceso de purificación de scFv, ya que se utiliza Proteína A Sefarosa para purificar scFv derivados de la familia de VH3 y no se pueden utilizar para purificar clones derivados de las familias de VH que no sean VH3.

Ej emplo 2 El presente ejemplo describe la producción de diversos anticuerpos scFv utilizados como control en estudios comparativos .

El aislamiento y la caracterización de los clones de anticuerpos Yl e Y17 scFv se describen en detalle en las Solicitudes de Patentes Estadounidenses N° 10/032.423; 10/032.037; 10/029.988; 10/029.926; 09/751.181; y 60/258.948 y en las Solicitudes de Patentes Internacionales N° PCT/USOl/49442 y PCT/USOl/49440.

Además, se seleccionaron clones de scFv control negativo. Para todos los experimentos de unión, se recogió un solo clon de la biblioteca naive (antes de la selección) . Un stock de fago y un scFv soluble, denominado N14, se prepararon a partir de este clon. El análisis de secuencias indica que pertenece a la familia de genes VH4-DP65. La secuencia del limero VH-CDR3 codificado por este clon, denominado NI4 CDR3 , es la ID de SEC N°6. Un clon negativo adicional, N01, se utilizó en los experimentos de análisis de unión. El clon N01 (reactivo a partículas del virus de la hepatitis B recombinante [HBV] ) pertenece a la familia de VH3-DP35 y la secuencia del 9mero VH-CDR3 codificada por este clon, denominada N01 CDR3 , es la ID de SEC N°7. Los clones del anticuerpo TM scFv (abajo) se aislaron usando el protocolo TM mediante el paneo de una biblioteca de presentación de fago en membranas de células de T-linfoma. En este protocolo, el prelavado de células T (2xl07) se realizó como se describió anteriormente en el protocolo de Ll . Después del prelavado de las células T, la selección se llevó a cabo sobre membranas de células de T-linfoma inmovilizadas agregando 2 mi de MPBS que contiene 1012 fagémidos de la biblioteca de Nissim original. El tubo se agitó lentamente durante 30 minutos, luego se incubó durante otros 90 minutos sin agitación (ambos pasos a temperatura ambiente) . Los fagémidos no unidos en exceso se removieron decantando los contenidos de los tubos y lavando el tubo 10 veces con PBS, 0,1% Tween, seguido por 10 lavados con PBS. Para la elusión, células TG-1 de E.coli que crecen exponencialmente (2 mi) se agregaron directamente al tubo y se incubaron con agitación lenta a 37 °C. Como anteriormente, se colocó una alícuota en una placa para titulación, y el volumen restante se colocó en una placa para amplificación. Además, la amplificación se realizó como se describió en el protocolo de Ll . El procedimiento de selección se repitió para dos rondas adicionales, usando 1011 fagémidos del stock amplificado previamente. El primer clon del stock amplificado del tercer procedimiento de paneo, en membranas de células T inmovilizadas, se denominó TM1. l-myc+/TMl .1. Se prepararon varios anticuerpos scFv a partir de este clon, en particular TM1.1 y una variante de él con un marcador myc (TM1. l-myc+) . Además del clon de TMl.l-myc+, los siguientes clones adicionales se aislaron utilizando el protocolo de TM. El stock amplificado del tercer paneo de membrana se utilizó para panear células de T-linforna intactas . El procedimiento se llevó a cabo esencialmente como se describió para el protocolo de Ll precedente, usando 2xl07 células y 1010 fagémidos . Después de 2 horas de incubación a 4°C, se eluyeron fagémidos unidos de la pelotilla de células lavada con 50 µ? de Tripsina : EDTA (0 , 25% : 0 , 05%) , luego se neutralizaron agregando 50 µ? de FCS . Para la titulación y amplificación, se utilizó 1 mi de un cultivo de TG-1 de E. coli (A6o=0,5). El stock amplificado, denominado TM2 , se utilizó para una ronda adicional de paneo en células de T-linfoma, como anteriormente. El stock final se denominó TM3. Las secuencias de scFv aisladas como resultado del seguimiento del protocolo de TM se presentan en la Tabla 4. La actividad de unión después de la rotulación de FITC del scFv también se evaluó par verificar la retención de la especificidad de scFv (ver el Ejemplo 7) . Por ejemplo, la especificidad de la unión de TM3.13 a células de T-ALL se verificó mediante su unión de acuerdo con el análisis de FACS (ver la Figura 1) . TABLA 4 Clon Tamaño de Secuencia de Línea Salida Frecuencia VH-CDR3 VH-CDR3 Germinal TM2.31 7 Leu Thr His Arg VH3-DP46 TM2 2/10 Ser Ser Arg TM2.23 7 Thr Gln Arg Arg VH3-DP53 TM2 5/10 Asp Leu Gly TM3.20 7 Lys Arg Val Ser VH3-DP70 TM3 1/7 Leu Leu Thr TM3.18 7 Ser Tyr Arg Arg VH3-DP 7 TM3 2/7 His Ser Arg TM3.13 11 Arg Asp Lys Thr VH3-DP26 TM3 1/7 Thr Asn Phe Tyr Phe Met Lys Ej emplo 3 El presente ejemplo demuestra la producción, purificación, rotulación y caracterización de clones de L32 scFv.

Para la producción de scFv soluble, pHENl, un vector utilizado para construir la biblioteca de fagémidos originales, se diseñó con un codón de parada ámbar codificado en la unión del gen de scFv y el gen pIII. En consecuencia, cuando los vectores de los clones seleccionados se introducen mediante la infección con fagémidos en HB2151 de E. coli, que es una cepa no supresora, este sistema permite la producción y la secreción de scFv soluble en periplasma bacteriano (Harrison et al, Methods in Enzymol . 267: 83-109 (1996)). El scFv luego es fácilmente recuperable del caldo de cultivo. Los scFv solubles se producen bajo el control del promotor lacZ (Gilbert y Muller-Hill, PUAS (Estados Unidos) 58: 2415 (1967)), que luego se induce con IPTG (isopropiltiogalactosido) .

Una secuencia que codifica un marcador de c-myc de 10 aminoácidos, ID de SEC N°8, está contenida en el vector arriba de la mutación ámbar. El extremo de C del scFv expresado debe transportar el marcador de c-myc, que puede detectarse utilizando anticuerpos del marcador anti-myc de ratón (derivado de la Colección Europea de Cultivo de Células (ECACC) 9E10-hibridoma) .

Los scFv de clones seleccionados y del clon control N01 todos pertenecen a la familia de VH3 , permitiendo la purificación en una columna de afinidad de Proteína A. Fracciones periplásmicas (100-250 mi) , de cultivos inducidos de cada clon, se prepararon e incubaron con cuentas de Proteína A Sefarosa. Los scFv unidos se recuperaron de la columna mediante elución con ácido (0,1M glicina, pH 3,0), seguido por la neutralización eluida con Tris, pH 8,0. La concentración de la proteína recuperada se determinó mediante medición de A28o, seguida por el intercambio de tampón PBS mediante diálisis o sobre una columna de G-25 Sefarosa.

El scFv de un clon L32 derivado del protocolo de Ll también pertenece a la familia de genes de VH3 (DP-32) . Sin embargo, después de la extracción del periplasma, se requirió 5 inM DTT y se agregó antes de cargar la muestra en la columna de afinidad de Proteína A, después de lo cual se realizó la purificación y la recuperación de cuentas de Proteína A Sepharosa y el intercambio de tampón PBS que se describió anteriormente.

El scFv del clon negativo N14 pertenece a la familia de genes de VH4, que no se puede purificar en una columna de afinidad de Proteína A, en consecuencia se purificó en una columna de Sephacryl S-200. Se purificó scFv N14 precipitando la proteína total en la fracción periplásmica de un cultivo inducido de 200 mi usando sulfato de amonio al 60%. La pelotilla se suspendió en 2 mi de 0,lxPBS, 5 mM EDTA, 5 mM PMSF, y se cargó sobre una columna de Sephacryl S-200 (1,5 x 90 cm) equilibrada previamente con el tampón circulante (0,lxPBS, 5 mM EDTA). Se fraccionaron proteínas, y se mezclaron fracciones que contienen el N14 scFv (detectado por SDS-PAGE y análisis Western) , se liofilizaron, y se suspendieron en 1/10 volumen de H20. El NI4 scFv (sin rotular y rotulado con FITC) luego se usó como un control negativo en experimentos de análisis de FACS .

Los scFv purificados luego se rotularon con FITC. Se suspendió 1 mg de scFv purificado a partir de cada preparación, en PBS y se acopló a FITC usando un kit comercial de conjugación de Marcador de Fluoro FITC (Sigma-Aldrich Corp., St . Louis, MO) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la purificación y rotulado con FITC, el perfil de cada preparación (rotulada y sin rotular) se analizó mediante SDS-PAGE, Western blotting, HPLC usando una columna de Superdex-75 (A2so Y A495) y fluorometría . Los análisis indicaron un 80% de pureza del NI scFv, y un 90% de pureza para los clones de VH3 , con aproximadamente 2 moléculas de FITC conjugado a cada molécula de scFv (relación de F/P de 2:1) .

Ejemplo 4 El presente ejemplo demuestra la unión de L32 scFv a plaquetas lavadas y a plasma rico en plaquetas (PRP) y los efectos de L32 scFv sobre la agregación de plaquetas.

Para los estudios de agregación de plaquetas, se recogió sangre en un tubo que contiene citrato de sodio al 3,8%. Se preparó PRP mediante centrifugación a 250 x g durante 10 minutos. El concentrado de plaquetas, en ácido-citrato-dextrosa (ACD) , se obtuvo de un banco de sangre. Se aislaron plaquetas, se lavaron una vez con tampón que contiene ACD y se lavaron con solución salina a una relación de 1:7. Las plaquetas se centrifugaron a 800 g durante 10 minutos, después de cada lavado, y se suspendieron en solución de Tyrodes (2 mM MgCl2, 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 3 mM NaH3P0 , 0,1% glucosa, 5 mM Hepes y 0,355 albúmina, a pH 7,35) y se contó el número de células.

PRP y las plaquetas lavadas se agitaron a 500 rpm a 37°C, en sangre entera, en un Lumiagregómetro (Chronolog, Havertown, PA) . La diferencia en la transmisión de luz a través de la suspensión de plaquetas y el medio de suspensión se tomaron como 100% de agregación. Se evaluó el efecto de L32 sobre la agregación de plaquetas agregando una concentración diferente de L32 antes de agregar el agonista, y el efecto se registró durante 4 minutos (Figura 2) .

Se realizó un ensayo de agregación usando plaquetas lavadas. La mezcla de la reacción contiene 2xl08 plaquetas lavadas/ml y 4 µg/ml de factor von Willebrand porcino. Después de una incubación de 3 minutos a 37 CC, se agregó 0,4 mg/ml de ristocetina (un agonista de agregación) , y la respuesta de agregación se registró durante 4 minutos. Los efectos de L32 y otros anticuerpos scFv sobre la agregación de plaquetas se evaluaron agregando 50 g/ml del scFv antes de agregar el agonista, y el efecto se registró durante 4 minutos. El efecto de L32 sobre la aglutinación que depende de vWF de plaquetas lavadas se ensayó en dos muestras de plaquetas lavadas (n=2) y la aglutinación normal (90% de aglutinación) se observó en contraste con la eliminación de la aglutinación por Yl, un scFv con efectos conocidos. El efecto de TM1. l~myc+ , aislado usando el protocolo de TM, también se evaluó como control. En las mismas condiciones, el anticuerpo Yl scFv inhibió la agregación de plaquetas inducida por Ristocina en un 70% (Figura 2) .

Para el ensayo de agregación usando PRP, la mezcla de la reacción contiene PRP (2xl08/ml) . Después de 3 minutos de incubación a 37 °C, se agregó 1 mg/1 de ristocetina (un agonista de agregación) y la respuesta de agregación se registró durante 4 minutos. La diferencia en la transmisión de luz a través de la suspensión de plaquetas y PPP (plaqueta pobre en plasma) se tomó como 100% de agregación. El efecto de L32 sobre la agregación de plaquetas se evaluó en PRP de tres donantes diferentes (n=3) agregando 50 µ9/t?1 de L32 scFv antes de agregar el agonista, y el efecto se registró durante 4 minutos. La agregación normal (90% de agregación) se observó después de agregar L32 scFv a PRP (Figura 2) . Como se mencionó anteriormente, el efecto de L32 se comparó con aquellos de TM1.1 e Yl . En forma similar a las plaquetas lavadas, Yl inhibió la agregación de plaquetas de PRP un 70%.

En conclusión, 50 g/ml del clon de L32 no tuvo ningún efecto inhibidor significativo sobre la agregación de plaquetas de las plaquetas lavadas o PRP.

El manchado con L32 scFv (unión) de plaquetas también se evaluó mediante FACS. Este método es útil para mediciones basadas en la intensidad del manchado por marcadores fluorescentes . Como se indica en la Figura 3, el manchado con Yl e Yl-myc+ scFv (un anticuerpo Yl scFv reactivo con glicocalicina con un marcador c-myc) derivó en plaquetas manchadas desde PRP. En cambio, la señal fluorescente después del manchado de estas plaquetas con L32 scFv permaneció relativamente sin cambio, comparado con el manchado con anticuerpos control (comparar los histogramas de la Figura 3, en donde TMl.l-myc+ es un scFv que no se une a ningún epítope asociado a plaquetas) .

E emplo 5 La unión de scFv L32 a diversas líneas de células diferentes se analizó mediante FACS . El análisis se llevó a cabo después del manchado de tres pasos con (i) L32; (ii) anticuerpo de una sola cadena; y (iii) anticuerpo rotulado con FITC anti-conejo. Las diferentes líneas de células se clasificaron de acuerdo con la relación del medio geo de la población de células después de la unión de L32 comparado con el control negativo, como se muestra en la Tabla 5. Se asignó baja unión a células con una relación de 1, se asignó unión media a células con una relación dentro de la gama de 1-4, y se asignó alta unión a células con una relación superior a 4.

TABLA 4 L32 L32 L32 Alta Media Baj a G-1 Molt-4 Raji Jurkat Hut78 Daudi HEL UMÜC3 562 Namalwa CCRF-CEM HL60 Se investigó la competencia por el mismo sitio de .unión entre Yl y L32 en estas células por estos anticuerpos de una sola cadena. En uno de esos experimentos, se evaluó la competencia de anticuerpos sin rotular por el Yl rotulado con biotina (Yl-myc+) a células KG-1 (una línea de células humana derivada de un paciente de AML) . Los resultados se muestran en las Figuras 4 y 5. Como se muestra, L32 compite por la unión de Yl en células KG-1 similar al Yl scFv. Estos resultados estuvieron apoyados por estudios de ensayo de radiorreceptor preliminares en los cuales L32 scFv desplazó parcialmente la unión de Yl scFv rotulado con 125I a células KG-1 en una forma que depende de la dosis. La capacidad de los anticuerpos sin rotular de competir con L32 scFv rotulado con biotina (0,5, 2 o 5 µg) en la unión a células KG-1 se evaluó en estudios de competencia. Los resultados que se presentan en las solicitudes de patentes estadounidenses N° 10/032.423; 10/032.037; 10/029.988; 10/029.926; 09/751.181; y 60/258.948 y en las Solicitudes de Patentes Internacionales N° PCT/US01/49442 y PCT/US01/49440 demuestran que Yl y los anticuerpos anti-CD162 compiten por la unión al antígeno CD162. El análisis de FACS se utilizó para medir la unión del anticuerpo rotulado, y los resultados se expresan como los valores medios geométricos de unión. Estos resultados, que se resumen en la Tabla 6, demuestran que el desplazamiento de anticuerpos por los anticuerpos Yl scFv y anti-CD162 depende de la concentración. Cuando la cantidad de anticuerpo sin rotular es mucho mayor que el anticuerpo rotulado, más del 70% de la unión es desplazada por los anticuerpos específicos, mientras que el TM1.1 scFv no específico no tiene ningún efecto significativo sobre la unión de L32. Si bien anti-CD162 tuvo la máxima capacidad para desplazar L32 (más del 89%) , los anticuerpos Yl y L32 scFv desplazaron la unión de L32 a diferentes niveles. Basado en los resultados presentados y en otros, se requirió menos L32 que Yl para competir por la unión de L32 e Yl, lo cual sugiere que L32 tiene mayor capacidad de unión que aquella del Yl al mismo sitio. Por lo tanto, estos resultados apoyan más la especificidad de la unión de L32 y una relación sustancial entre el epítope de L32 y aquellos reconocidos por los anticuerpos Yl y anti-CD162.

TABLA 6 Concentración Concentración de Biotina de L32 del Inhibidor 0,5 µg L32-B 2 µg L32-B 5 µg L32-B Ninguna 22, 65 50 µg TM1.1 21, 6 28,3 38,32 50 µg Yl 6,36 12,99 21, 99 50 µg L32 5, 66 9,34 22, 58 5 µg anti- 4, 06 3,95 4,4 CD162 La competencia entre los anticuerpos L32, Yl y anti-CD162 se evaluó examinando el nivel de desplazamiento de la unión del anticuerpo anti-CD162 rotulado a células KG-1. Se descubrió que los anticuerpos L32 e Yl scFv (50 µg) reducían el medio geométrico de la rotulación de anti-CD162 (5 µg) de células KG-1 un 82%. Por lo tanto, los epítopes de estos anticuerpos aparentemente están relacionados .

Ej emplo 6 El presente ejemplo demuestra la unión del anticuerpo L32 scFv a Glicocalicina (GC) , un fragmento proteolítíco de GPIb, mediante ELISA.

GC se purificó a partir de plaquetas humanas nuevas como lo describe Michalson (Blood 67: 19-26 (1986)). Antes del uso en ensayos , la identidad de GPIb se confirmó mediante ??? usando dos preparaciones de anticuerpos monoclónales comerciales diferentes; el primer anticuerpo (clon H1P1) , adquirido a Pharmigen (San Diego, CA) , inhibe la agregación de plaquetas inducida por ristocetina, y la segunda preparación de anticuerpos (clon PM6/40) , adquirida a Serotec Inc. (Raleigh, NC) , no inhibe la agregación de plaquetas.

El análisis cuantitativo de la unión de L32 a GC se determinó mediante ELISA. GC diluida a 1 g/ml (PBS X 1) se usó para recubrir receptáculos de placas Maxisorp mediante incubación toda la noche a 4°C. Después de remover GC en exceso, las placas se bloquearon con PBSTM (solución salina con tampón fosfato que contiene 2% de leche y 0,05% Tween) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de un lavado extenso con PBST, las placas se incubaron con diversas concentraciones de scFv diluido en PBSTM. Posteriormente, las placas se incubaron con anti-scFv diluido 1:250, o anti-VL 1:50, o anti-myc 1:100, seguido por HRP anti-Conejo (Jackson) diluido 1:25.000 en PBSTM o HRP anti ratón 1:25.000 (según sea relevante) . La reacción se desarrolló con TMB y se detuvo agregando 0,5 M ¾S04. Las placas se leyeron a 450 nm usando un lector de ELISA, y los resultados de las muestras por duplicado se promediaron, los valores unitarios de ELISA se calcularon restando el valor de OD (manchando sin un anticuerpo primario) a los valores promedio. Los resultados ilustrados en la Figura 6 indican que la unión de Yl a GC es 3-4 veces mayor que aquella de L32.

E emplo 7 El presente ejemplo demuestra la unión del anticuerpo L32 scFv a proteínas de diversas fuentes derivadas de humanos mediante análisis de Western blot.

Se prepararon extractos de células (lisado) . Las células (2xl06) se cosecharon y se centrifugaron en un microcentrifugador (1300 rpm, 4°C, 5 minutos) . La pelotilla se lavó con 0,5-1 mi de PBS y mezclando suavemente, y la mezcla se centrifugó como antes. El lavado con 0,5-1 mi de PBS se repitió, y las células con forma de pelotillas se suspendieron en tampón de lisis (200 µ1/20 x 106 pelotillas de células) . El tampón de lisis usado fue 50 mM Tris a pH 7,4, 1 mm P SF 1% NP-40 y 1 mM EDTA, aunque también se pueden usar otros tampones de lisis adecuados. La suspensión se incubó durante 60 minutos, sobre hielo, y luego se centrifugó (3000 rpm, 4°C, 5 minutos) . El sobrenadante luego se recogió y se dividió en alícuotas .

También se prepararon una fracción de membrana cruda y una extracción de proteínas de membrana. Se agregaron 20 volúmenes de tampón de homogeneización a 1 volumen de células empaquetadas. El tampón de homogeneización contenía un 2% (p/v) de T een 20, 1 mM MgS0 , 2 mM CaCl2, 150 mM NaCl , y 125 mM Tris-HCI, a pH 7,4. También se agregaron los siguientes inhibidores de proteasa: 1 mM PMSF, 5 µg/ml de Leupeptina, y 5 µg/ml de Aprotonina. Las células se homogeneizaron usando un homogeneizador de Potter-Elvehj em con una mano de mortero giratoria de Teflón (Ultra-Torex) a una velocidad de tres a cinco golpes . La muestra se mantuvo fría durante la homogeneización, y luego se agitó durante 1 hora en un baño de hielo. La muestra se sometió a pocos golpes adicionales en el homogeneizador, y luego se centrifugó a 3000 g durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante se recogió y se centrifugó a 45000 g (rotor ss-34 a 19000 rpm) durante 1 hora a 4°C. El sobrenadante de la centrifugación de 45000 g se descartó. Una solución de 50 mM Tris 7,4, 1 mM EDTA, 1% NP-40 e inhibidores de proteasa se agregaron a la pelotilla y la pelotilla disuelta se colocó sobre hielo durante 1 hora.

Se prepararon muestras de proteína de plasma después de diluir el plasma mezclado a partir de un banco de sangre de individuos sanos 1:10 (v/v) con PBS. La solución diluida se filtró a través de membranas de 0,45 µt? y las alícuotas se guardaron congeladas (-20°C) hasta que se analizaron. Luego se pasaron las muestras sobre 10% SDS-PAGE a 140-160 Voltios, durante 3,5 horas en el aparato Sigma Z37, 503-9. Las muestras sometidas a electroforesis se transfirieron en un tampón Tris Glicina (20% MeOH, 192 mM glicina, 25 mM TRIS, pH 8,3) a una membrana de nitrocelulosa toda la noche a 20 Voltios a temperatura ambiente.

La membrana de nitrocelulosa se bloqueó usando 5% de leche descremada durante 1 hora a temperatura ambiente . La membrana luego se lavó 3 veces durante 5 minutos cada una con 0,055 Tween 20 en PBS a temperatura ambiente. La membrana se incubó con 5 µg/ml de Yl-biotina, L32-biotina, o TM1.1-biotina en 2% de leche descremada, en PBS, durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana luego se lavó 3 veces durante 5 minutos con 0,05% Tween 20 frío, en PBS, en el ambiente frío (4°C a 10°C) . La membrana luego se incubó en el ambiente frío con una dilución 1:1000 de SAV-HRP (streptavidina-HRP) (a una concentración final de 1 µg/ml) , en 2% de leche descremada, 0,05% Tween. La dilución se llevó a cabo a temperatura ambiente (a 25 °C) y luego el SAV-HRP diluido se enfrió sobre hielo durante 10-15 minutos antes del uso. La incubación se llevó a cabo durante 1 hora con agitación suave .

Después de la incubación con SAV-HRP, la membrana se lavó, como antes . La membrana luego se incubó con la mezcla Super Signal (Pierce) durante 5 minutos como se indica en el protocolo comercial, luego la solución en exceso se secó. La membrana se expuso a una película de rayos X (Fuji) y la película se reveló. Los resultados de estos estudios (Figura 7) indican que L32 se une a una proteína en células de leucemia con un peso molecular de aquel de PSGL-1, 105 kD . Además, tanto L32 como Yl reaccionan con las mismas bandas de células GC y KG-1. Sin embargo, la unión de L32 a proteínas de plasma es mucho más baja que Yl, y el extracto de células Raji fue negativo para esta banda de >100 kiDa.

Ejemplo 8 El presente ejemplo demuestra la unión comparativa a péptidos sulfatados y no sulfatados a L32 e Yl mediante ELISA.

Los péptidos sintéticos sulfatados y no sulfatados basados en epitopes probables (aminoácidos 268 a 285 de GPIb y 1-17 de PSGL-1 maduro) se prepararon y utilizaron para evaluar la especificidad de la unión del anticuerpo L32 scFv (ELISA) . Los péptidos sulfatados y no sulfatados (1 µ?) se unieron a placas de microtítulo adecuadas para el análisis ELISA, y los péptidos no unidos se lavaron completamente antes de que los sitios de unión no específicos se bloquearan. Las placas se incubaron con anticuerpos scFv en las concentraciones indicadas (ver Figura 8) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los scFv unidos se detectaron usando anticuerpos anti-v"L de conejo policlonales , seguidos por antisuero anti-conejo de peroxidasa de rábano picante (HRP) . Las muestras se desarrollaron usando el sustrato TMB, y la reacción de peroxidasa se detuvo, después de 10 minutos, con 0,5 M H2S04. La unión de L32 a estos péptidos se comparó con la de los anticuerpos Yl y TMl.l (como control negativo) scFv. El manchado de fondo (en la ausencia del anticuerpo primario) se restó a cada valor para obtener los valores presentados en el gráfico de barras. Los péptidos evaluados para la unión, y sus propiedades estructurales esenciales se presentan en la Tabla 7.

TABLA 7 Fuente de Denominación Secuencia AA Peso Sulfatación Péptido Molecular Fibrinógeno A VRPEHPAETEYESLYPEDDL 20 2389 ? prima Fibrinógeno B VRPEHPAETEY*ESLY*P 20 2549 Sulfatado ? prima EDDL PSGL-1- QATEYEYLDYDFLPETE 17 2126 e tremo de n PSGL-1- D QATEY*EYLDYDFLPETE 17 2206 Sulfatado extremo de n PSGL-1- E QATEY*EY*LDYDFLPETE 17 2286 Sulfatado extremo de n PSGÑ-1- QATEY*EYLDY*DFLPETE 17 2286 Sulfatado extremo de n PSGL-1- G QATEYEY*LDYDFLPETE 17 2286 Sulfatado extremo de n Fuente de Denominación Secuencia AA Peso Sulfatación Péptido Molecular PSGL-1- H QATEYEY*LDY*DFLPETE 17 2286 Sulfatado e tremo de n PSGL-1- I QATEYEYLDY*DFLPETE 17 2286 Sulfatado extremo de n PSGL-1- J QATEY*EY*LDY*DFLPETE 17 2286 Sulfatado ex remo de n GPIbot K, Pl GDEGDTDLYDYYPEEDTE 18 2126 - GPIb L, P1S GDEGDTDLY*DY*Y*PEEDTE 18 2366 Sulfatado GPIb P14S GDEGDTDLYDYY*PEEDTE 18 1732 Sulfatado GPIba P28S TDLY*DYYPEEDTE 13 1732 Sulfatado CCR5 M MDYQVSSPYDINYYTSE 19 2189 CCR5 N MDY*QVSSPY*DI Y*YTSE 18 2429 - Y* designa Tirosinas sulfatadas Se obtuvo una unión de anticuerpo L32 scFv que depende de 1 dosis significativa con péptidos F, H, I y J, es decir péptido relacionados con PSGL-1 sulfatados en el tercer residuo d tirosina, y con L y P28S, es decir péptidos relacionados co GPIbot sulfatados en el primer residuo de tirosina (Figura 8) . La unión del anticuerpo L32 scFv a J fue muy similar a su unión a I. Si bien la unión al péptido L relacionado con GPIb (P1S) fue significativa, sin embargo fue comparativamente menor que la obtenida con péptidos relacionados con PSGL-1. Se descubrió que ni Yl ni L32 se unieron significativamente a los péptidos G y D relacionados con PSGL-1 sulftado (que carecen de sulfatación en el tercer residuo) . Más aún, ni ?1 ni L32 se unieron a péptidos sulfatados (o no sulfatados relacionados con la cadena de fibrinógeno ?. Ningún anticuerpo scFv se une a los péptidos en los cuales las tirosinas no están sulfatadas, lo cual indica que se necesita la sulfatación para la unión. Más aún, los datos sobre el péptido relacionado con GPIb, P28S, sugieren que la sulfatación de la primera tirosina es significativa para la unión a GPIb, mientras que los datos sobre los péptidos I y J de PSGL-1, comparados con E, sugieren que la sulfatación de la tercera tirosina es significativa para la unión a PSGL-1. Si bien Yl y L32 presentan patrones sustancialmente idénticos de comportamiento de unión con respecto a los péptidos sulfatados (en este ensayo) , Yl parece presentar una unión de afinidad más alta en relación con Y32 en cada caso.

A partir de los resultados experimentales precedentes y de los datos presentados en las solicitudes de patente estadounidenses N° 10/032.423; 10/032.037; 10/029.988; 10/023.926; 09/751.181; y 60/258.948 y en las Solicitudes de Patentes Internacionales N° PCT/USOl/49442 y PCT/USOl/49440 , se llegó a la conclusión de que el epítope para el anticuerpo L32 scFv está ubicado entre los aminoácidos 1 y 17 sobre PSGL-l en la cual hay un grupo de aminoácidos con carga negativa.

PSGL-l, que es un receptor para E, L- y P-selectinas , se identificó como un ligando del anticuerpo Yl basado en ensayos de competencia, en donde la unión del anticuerpo Yl a células KG-1 se llevó a cabo en la presencia de diferentes anticuerpos anti PSGL-l comercialmente disponibles. La región de extremo de N de PSGL-l contiene residuos de tirosina sulfatada acompañados por un grupo de aminoácidos con carga negativa. (Solicitudes de Patentes Estadounidenses N° 10/032.423; 10/032.037; 10/029.988; 10/029.926; 09/751.181; y 60/258.948 y en las Solicitudes de Patentes Internacionales N° PCT/USOl/49442 y PCT/USOl/49440) .

Aunque el anticuerpo Yl se une a varias moléculas, tales como la molécula de glicocalicina sobre plaquetas, fibrinógeno gamma prima, compuesto complemento 4 de plasma humano, y la molécula de PSGL-l, su afinidad a células de leucemia primarias obtenidas de pacientes con AML o mieloma múltiple (MM) es más alta en relación con los epítopes mencionados anteriormente.

Si bien no deseamos atarnos a ninguna teoría particular, la mayor afinidad relativa de Yl (comparada con la de L32) a péptidos sulfatados, comparada con la mayor afinidad relativa de L32 (comparada con la de Yl) para líneas de células leucémicas y células malignas, que se muestra en los Ejemplos 10, 16 y 17 a continuación, puede deberse a factores tales como posibles diferencias en la conformación o exposición de las secuencias de péptidos pertinentes en el contexto de las proteínas nativas completas en células. Por ejemplo, los péptidos usados en los experimentos eran lineales y no tenían una estructura secundaria y terciaria, como la tendrían en su estado nativo. Esas diferencias pueden no ser evidentes en los péptidos sintéticos, que son péptidos lineales no limitados. Por lo tanto, la aplicación terapéutica potencial de la unión del anticuerpo L32 puede no ser perceptible en el sistema de péptidos sintéticos artificiales, sugerido por los sistemas celulares.

Ej emplo 9 Los resultados en las Solicitudes de Patentes Estadounidenses 10/032.423; 10/032.037; 10/029.988; 10/029.926; 09/751.181; y 60/258.948 y en las Solicitudes de Patentes Internacionales N° PCT/US01/49442 y PCT/USOl/49440 han demostrado que los anticuerpos Yl e Y17 tienen perfiles de reconocimiento similares en las plaquetas. El presente ejemplo demuestra los efectos de la sulfatación de tirosina de péptido derivada de GPIb y mutaciones en la unión del anticuerpo Y17 scFv a plaquetas lavadas, y la dependencia de la sulfatación de tirosina para la unión de Y17 a péptidos derivados de PSGL-1.

Los péptidos derivados de GPIb seleccionados de la Tabla 6 y dos péptidos derivados de GPIb abreviados del extremo de N adicionales con las siguientes secuencias se usaron en estos estudios: P2S - TDLY*DY*Y*PEEDTE y P25S - TDLYDY*Y*PEED .

La unión del anticuerpo Y17 scFv a plaquetas lavadas se examinaron mediante FACS como se describió en el Ejemplo 4. Los efectos de los diversos péptidos sobre la unión de Y17 a las plaquetas se evaluaron primero incubando Y17 junto con la concentración indicada de péptido (ver la Figura 9) , antes de agregar la preparación de plaquetas.

De la totalidad de los péptidos ensayados, el péptido derivado de GPIb que contiene tirosina en la posición 276 (P28S) produjo la mayor inhibición de la unión de Y17 a plaquetas lavadas. Los péptidos derivados de GPIb, que contienen cambios de aminoácidos se prepararon y se ensayaron para confirmar los requerimientos de secuencia de consenso para el reconocimiento de Y17. Estos resultados sugieren que la primera tirosina sulfatada es importante para la unión de Y17 a plaquetas lavadas. Sin embargo, la sulfatación de la segunda Tirosina aparentemente no tiene un rol en el reconocimiento de Y17. los residuos de aminoácidos con carga negativa de Aspartato (D) en las posiciones 277 y 275 son importantes para la unión a Y17. Los resultados fueron similares a aquellos observados con Yl .

Para verificar qué condiciones determinan la unión del anticuerpo Y17 a PSGL1, se hizo el análisis ELISA usando péptidos derivados de PSGL1 unidos a placas. Cinco y 20 µg/ml del anticuerpo Y17 scFv se unieron fuertemente a péptidos derivados de PSGL1 , I que contienen tirosina sulfatada en la tercera posición, y a J que contiene tres péptidos sulfatados. La Figura 10 indica que la unión de Y17 scFv a J fue ligeramente mayor que la unión de Yl a J, y ambos scFv se unieron en forma similar a l. Su unión a I fue mayor que su unión a J. Ni Yl ni Y17 se unieron significativamente a G (péptido PSGL1 sin sulfatación) . En resumen, al nivel del péptido, los tres clones, Yl, Y17 y L32, tienen perfiles de especificidad similares.

Ejemplo 10 El presente ejemplo demuestra la unión de L32 a células primarias de voluntarios normales y pacientes con leucemia. La totalidad de los procedimientos para el cultivo de clones bacterianos, protocolo de inducción, cosecha de fragmentos de anticuerpo scFv, y purificación de fragmentos de anticuerpos se llevaron a cabo según Harrison et al, (1990), supra. Básicamente, dos o más clones de scFv individuales pueden seleccionarse de la biblioteca de presentación de fago de anticuerpos de Nissim I para preparar anticuerpos policlonales derivados de conejo que reconocen cualquier anticuerpo scFv individual presente en la biblioteca de Nissim o cualquier IgG o fragmento de ella siempre que contenga el mismo VL o un fragmento de él .

Se crearon anticuerpos policlonales contra VL derivado del clon de anticuerpo scFv (Yl) obtenido de la biblioteca de fago de anticuerpo de Nissim I. El fragmento de ADN que codifica el dominio de VL del anticuerpo humano se clonó con PCR desde el clon de Yl (el fragmento de ADN idéntico puede obtenerse de cualquier otro clon de la biblioteca de Nissim I (Nissim et al, (1994) supra) o aún del genoma humano usando la misma metodología) con los siguientes iniciadores de oligonucleótidos sintéticos: oligo 5 '-Ndel (TTTCATATGGAGCTGACTCAGGACCTGCT) y oligo 3'-EcoRI (TTTGAATTCCTATTTTGCTTTTGCGGC) . Después de la amplificación mediante la reacción en cadena de polimerasa (condiciones de PCR: 94°C 1', 56°C 2', 72°C 2' x 30 luego 65°C 5'), el fragmento de ADN obtenido se digirió con enzimas de restricción Ndel y EcoRI y se clonó en sitios de enzimas de restricción Ndel y EcoRI de un plásmido digerido previamente, que es el vector de expresión inducible por IPTG usado para la expresión procariotica de proteínas recombinantes en E. coli.

Se transformaron células de E. coli con la mezcla de ligación, y se seleccionaron clones positivos mediante amplificación de PCR usando los iniciadores de oligonucleótidos precedentes. Se cultivaron células que alojan este plásmido y se indujo su expresión mediante IPTG. Después de la inducción con IPTG, se cosecharon células bacterianas mediante centrifugación después de haber sido cultivadas durante 16 horas a 22 °C, a partir de 1 L de cultivo. Se aislaron cuerpos de inclusión y se solubilizaron en guanidina-HCl + DTE y se plegaron nuevamente mediante la dilución en un tampón que contiene TRIS-ARGININA-EDTA. Después de plegar nuevamente durante 48 horas a 5°C-10°C, la solución que contiene proteína se dializó y se concentró en 20 mM Glicina, a pH 9. La solución dializada que contiene proteínas se repurificó utilizando una columna de intercambio iónico, HiTrapQ, y se eluyó con un gradiente de NaCl . El pico principal se analizó mediante SDS-PAGE y mediante filtración de gel . Al menos 10 mg de VL purificado se obtuvieron del cultivo de 1 L original .

Luego se inmunizaron conejos con VL (400 mg) en la presencia de CFA (adyuvante de Fruend completo) , luego con VL (200 mg) en la presencia de IFA (adyuvante de Fruend incompleto) a intervalos de 2 a 4 semanas. Los títulos obtenidos fueron bajos (1:50-1:100), probablemente debido a la alta homología entre los VL de humanos y conejos.

Se utilizaron anticuerpos anti-scFv policlonales, directamente a partir del suero de los conejos inmunizados o después de la purificación sobre una columna de Proteína A Sefarosa, para detectar la unión del anticuerpo scFv a células analizadas mediante FACS o a diversas fracciones de proteína separadas mediante SDS-PAGE (análisis de Western blot) .

Generalmente, uno de los análisis de FACS se realizó para ensayar y confirmar la especificidad de los clones seleccionados. Se estableció procedimiento de "manchado de tres pasos", usando extractos crudos o scFv sin rotular purificados, seguidos por anticuerpos anti-myc de ratón y, finalmente, anticuerpos antiratón conjugados a FITC o PE. Este procedimiento se hizo alternativamente usando anti-VL de conejo, como el segundo reactivo, seguido por anticuerpos anti-conejo rotulados con FITC. El análisis de FACS de células, de muestras de sangre o de médula ósea, requiere 5-8x1O5 glóbulos blancos, que se han suspendido en PBS que contiene un 1% de BSA. La unión se llevó a cabo durante 1 hora a 4°C. Después de cada paso, las células se lavaron y se suspendieron en PBS que contiene un 1% de BSA. Después del paso de manchado final, la lisis de glóbulos rojos fue el paso final en el ensayo y estuvo seguida por la suspensión de células en PBS, luego leída por FACS (Becton-Dickinson) . El análisis ,de células manchadas mediante el procedimiento de "manchado de dos pasos" se hizo como una alternativa al procedimiento de tres pasos primero exponiendo células a anticuerpos primarios rotulados con myc o biotina y pOsteriormente manchándolos con anticuerpos anti-myc rotulados con FITC o streptavidina rotulada con PE, respectivamente. Un procedimiento para el manchado directo de células con scFv-FITC se estableció para los análisis de FACS posteriores. Este nuevo métodio requiere solamente un paso de incubación para el rotulado de scFv con FITC. Además, el alto fondo intrínseco, debido a la reactividad del anti-myc con PBL normal, fue mucho menor cuando se usó scFv-FITC para el análisis de FACS. Los resultados obtenidos con la rotulación directa de scFv con FITC y el "manchado de tres pasos" fueron muy similares, lo cual indica que la actividad biológica del scFv rotulado no fue destruido por el procedimiento de rotulación con FITC. Por lo tanto, los scFv rotulados mantienen la actividad de unión similar a aquella de los anticuerpos sin rotular.

El protocolo de FACS se llevó a cabo para analizar muestras de sangre y médula ósea. Se proporcionaron muestras de hospitales, con el consentimiento del paciente. Inicialmente , se mancharon muestras de células usando el procedimiento de tres pasos en el cual la detección de los anticuerpos scFv unidos fue logrado por anticuerpos de marcador anti-myc de ratón seguidos por anticuerpos de Ig anti-ratón rotulados en forma fluorescente. En este análisis, cuyos resultados se presentan en la Figura 11, los scFv del ensayo (TMl.l, TM3.13 y L32 derivados de paneos de células T) mostraron consistentemente altos niveles de unión a células de T-linfoma / leucemia, comparados con linfocitos de sangre periféricos normales (N-PBL) . En cambio, las células de B-CLL presentaron niveles relativamente bajos de manchado con los scFv, en forma similar a los que presentaron los N-PBL (Tabla 8) . Cuando se usó la dilución de scFv 1/50 para el análisis de FACS, se detectó solamente una unión de fondo.

TABLA 8 Tipo de Célula Control L32 T-linforna/leucemia 1,4 40 B-CLL 0,2 5 N-PBL* * 4,9 5 *Se usaron solamente anti-myc y FITC anti-ratón. **Linfocitos de sangre periféricos normales En etudios posteriores, muestras de sangre entera y médula ósea del paciente (y muestras de individuos normales) se ajustaron a 30 µ?/tubo. Cinco microlitros de CD33-APC (para AML) o CD19-APC (para B-CLL) o CD38-APC (para mieloma múltiple) se agregaron por tubo, y 5 µ? de CD45-PerCp y 5 µ? de scFv ?1 o scFv TM1.1 control o CD162-PE (KPL1) también se agregaron por tubo. Los tubos se incubaron durante 30 minutos a 4°C, con agitación suave. Los reactivos en exceso se lavaron agregando 2 mi de PBS y centrifugando durante 5 minutos a 1200 rpm. El sobrenadante se descartó. En ensayos de un paso, se realizó luego un paso de lisis. Se diluyeron 500 microlitros de solución de BD Lisina 1:10 con ddH20, y se agregaron 300 µ? a cada muestra de paciente. Las muestras se revolvieron a alta velocidad, se incubaron durante 12 minutos a 4°C y se lavaron como anteriormente. Después de descartar el sobrenadante, se agregaron 500 µ? de PBS. Las muestras se leyeron con un FACS usando una instalación de adquisición de muestras de sangre de acuerdo con las normas internacionales. Para ensayos que consisten en dos o tres pasos, el tampón contenía PBS + 1%BSA + 0,5% de azida de sodio, y se hicieron las incubaciones y lavados que se describieron anteriormente .

Para las muestras de sangre de individuos normales, se hizo un análisis para determinar la selectividad de la unión de L32 a subpoblaciones de células de sangre usando el análisis de FACS comparado con la selectividad de Yl . Existe una variabilidad entre donantes en la unión de Yl y L32. Por consiguiente, los resultados que representan la mayor parte de los casos se resumen cualitativamente en la Tabla 9. La unión de L32 scFv a granulocitos , linfocitos, y monocitos fue generalmente mayor que la unión de Yl acFv a estas células. En cambio, la unión de L32 scFv a las plaquetas fue similar al antecedente y generalmente menor que la de Yl scFv. Estos resultados también apoyan aquellos que se presentan en el Ejemplo 6 (ver la Figura 2) , que describe el bajo efecto sobre la agregación de plaquetas en PRP y la aglutinación de plaquetas lavadas.

TABLA 9 Tipo de Unión en Relación con Control Negativo Célula Yl L32 Linfocitos Fondo - Baj a Baj a+/ - Monocitos +/-Baja Media+/++ Granulocitos Baj a-Media+ Media - Alta++ Plaquetas +/-Baja Fondo La escala está basada en los siguientes criterios (ésta no es una escala absoluta, una relación de 2x se traduciría realmente en una unión varias veces más alta) : - manchado de fondo +/- hasta 2x la relación del flujo medio entre scFv negativo y scFv ensayado + 2x - 3x la relación del flujo medio entre scFv negativo y scFv ensayado ++ 4x - 6x la relación del flujo medio entre scFv negativo y scFv ensayado. +++ 6x - 8x la relación de flujo medio entre scFv negativo y scFv ensayado ++++ >10x la relación de flujo medio entre scFv negativo y acFv ensayado.

Es importante señalar que la totalidad de los resultados de esta tabla se obtienen usando el procedimiento de dos o tres pasos que consiste en la amplificación de la señal. Además, cuando se usa más de un paso de manchado, las plaquetas se activan, y la señal resultante de un efecto relacionado con el procedimiento se amplifica. En esos procedimientos, el anticuerpo rotulado se une a ambos GPIb y el PSGL-1 recién expuesto se expone en las plaquetas activadas.

Para las muestras de sangre/médula ósea de pacientes con cáncer, se hizo un análisis para determinar la selectividad de la unión de L32 usando el análisis de FACS comparada con la selectividad de Yl. La unión se midió como el resultado de la unión por segundos anticuerpos rotulados. Los resultados, presentados en la Tabla 10, indican que L32 generalmente se une a células enfermas en una mayor magnitud que Yl . En forma concomitante, la unión de L32 a granulocitos, linfocitos y monocitos fue mayor que la de Yl. Esta unión aumentada sugiere interacciones reducidas con células normales, que pueden traducirse en dosis de anticuerpo más bajas para el tratamiento.

TABLA 10 Enfermedad Tipo de Unión en relación con control Célula negativo Yl L32 i¾ML (4 muestras) Enfermedad Gama de + a +++ ++++ Linfocitos Gama de + a ++ +++ Granulocitos +/- ++ MM (2 muestras) Enfermedad +++ ++++ Linfocitos ++ +++ Monocitos ++ +++ Granulocitos ++ +++ B-Leucemia (2 muestras) Enfermedad Gama de - a ++ + Linfocitos Gama de + a ++ +++ Monocitos +++ ++++ Granulocitos ++ ++++ Se debe señalar que el anticuerpo monoclonal especifico de CD162 comercial, PSGL-1 anti-humano, desplazó la unión de L32 en todas las muestras ensayadas, incluyendo i¾ML, leucemia de células de cabello, y enfermedades de células B (por ejemplo, Pre-B-ALL, B-ALL, B-CLL, B-PLL, y mieloma múltiple) .

IgG entera, diacuerpos, triacuerpos y fragmentos Fab todos compartieron la especificidad de los anticuerpos scFv y anti-CD162 desplazó la unión de cada forma de anticuerpo.

Ejemplo 11 El presente ejemplo demuestra la unión de L32 a células primarias de animales de diversas especies.

La selectividad de la unión de L32 a subpoblaciones de células sanguíneas se evaluó para muestras de sangre de animales de diversas especies. Muestras de sangre entera se mancharon con L32 o Yl scFv, seguidas por anti-scFv de conejo rotuladas con PE (manchado de dos pasos) . Las muestras se analizaron posteriormente mediante análisis de FACS. Los resultados, que se presentan en la Tabla 11, indican que la variación en la unión por ambos anticuerpos existe entre especies. De todos modos, Yl generalmente manchó granulocitos en una mayor magnitud que L32, y se halló que Yl manchó plaquetas, mientras que L32 no las manchó, lo cual indica que Yl, de hecho, tiene una especificidad más amplia que L32.

TABLA 11 Especie/población de células Unión según Análisis de FACS Yl L32 Ratón (Balb/c) Granulocitos +/- Plaquetas ++ Otras poblaciones de células Rata Todas las poblaciones de - células Rata Todas las poblaciones de - células Cone o Granulocitos + + Otras poblaciones de - células Conejillo de Indias Linfocito + Especie/población de células Unión según Análisis de FACS Yl L32 Monocito ++ - Granulocito ++ - Plaqueta + - Perro Linfocitos - - Monocitos ++ +/- Granulocitos + - Plaquetas +++ - Ejemplo 12 El presente ejemplo demuestra los efectos de la administración de L32 a ratones que llevan células malignas de origen humano.

Ratones SCID (Jackson) se pretrataron con 100 mg/kg CTX, y se inocularon células Molt-4 (T leucemia) por via intravenosa a través de la vena de la cola 5 días después de la inyección de CTX. Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos de tratamiento (6 por grupo) y se trataron 5 días más tarde, durante tres semanas, con PBS, Molt-4, Yl y dos semanas con L32. Los ratones del grupo Molt-4 no se trataon. El Dia 33, los ratones fueron sacrificados, y se pesaron sus hígados. La Figura 12 demuestra que el peso del hígado de los ratones con crecimientos de Molt-4 se duplicaron y la prevalencia del tumor que se midió mediante histología fue un 65%. El tratamiento con anticuerpos Yl o L32 scFv redujo sustancialmente la carga de tumores de los ratones tratados.

Ejemplo 13 El presente ejemplo demuestra la construcción, expresión y purificación de diacuerpos y triacuerpos de L32.

El vector pHEN-L32 que codifica el L32 original se amplifica usando PCR para las regiones VL y VH, individualmente. El oligonucleótido de sentido y oligonucleótido antisentido se usaron para la reacción PCR de Vi. El producto cADN con el tamaño esperado se purifica, se coloca en secuencia y se digiere con enzimas de restricción. El mismo procedimiento se emplea para amplificar la región VH. El producto de PCR de VH se digiere con enzimas de restricción. Se emplea un procedimiento de ligación triple en el vector pHEN, predigerido. El vector final se denomina pTria-L32. Después de la transformación de E. coli, varios clones se recogen para otro análisis, que incluye la secuencia de ADN, la expresión de proteína, y la extracción del espacio periplásmico de las bacterias. SDS-PAGE en condiciones de reducción y el análisis de Western blot se realizan para confirmar el tamaño de los triacuerpos de L32.

El vector pTria-L32 se hace lineal con una enzima de restricción, y los oligonucleótidos con dos hebras complementarios sintéticos se templan previamente y se ligan en el sitio de restricción entre las cadenas pesada de L32 y liviana de L32. Este nuevo vector se denomina pDia-L32. Como se describe para los triacuerpos, la secuencia de ADN y la expresión de proteina se confirman.

La expresión en E. coli es esencialmente la que se describe para scFv L32. Sin embargo, la purificación de los diacuerpos y triacuerpos de L32 del periplasma de las células de E. coli transformadas es diferente. La forma monomérica de scFv L32 puede purificarse sobre uan columna de afinidad de cuentas de Proteina A Sefarosa. Las formas multiméricas de L32, sin embargo, se purifican mediante este procedimiento, en consecuencia las proteínas periplásmicas exraidas de las bacterias se precipitan toda la noche con sulfato de amonio al 60%, se suspenden en ¾0 y se cargan sobre una columna de exclusión de tamaño de Sephacryl-200 (Pharmacia) equilibrada previamente con 0,lxPBS. Se recogen fracciones y se analizan mediante HPLC, y las fracciones separadas que contienen las formas diméricas o timéricas se recogen para el rotulado con FITC y el análisis de FACS.

Ejemplo 14 El presente ejemplo muestra la producción de L32-cys-kak (dimero de cisteina) .

Un litro de un cultivo bacteriano de ?pL-L32-cys-kak se indujo durante 2-3 horas a 42°C. Este cultivo se centrifugó a 5000 RPM durante 30 minutos y la pelotilla se suspendió en 180 mi de TE (50 mM Tris-HCl a pH 7,4, 20 mM EDTA) , y se agregaron 8 mi de lisozima (de un stock de 5 mg/ml) y se incubaron durante 1 hora. Se agregaron 20 mi de 5 M NaCl y 25 mi de 25% Tritón y se incubaron durante otra hora. Esta mezcla se centrifugó a 13000 RPM durante 60 minutos a 4°C y el sobrenadante se descartó. La pelotilla se suspendió en TE con la ayuda de un tissuemiser (u homogeneizador) . Este proceso se repitió de 3 a 4 veces hasta que los cuerpos de inclusión (pelotilla) son de color gris/marrón claro.

Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en 6M Guanidina-HCl, 0,1 M Tris (pH 7,4), 2 mM EDTA (1,5 gramos de cuerpos de inclusión en 10 mi de tampón de solubilización proporcionaron 10 mg/ml de proteina soluble) . Esto se incubó durante al menos 4 horas. La concentración de proteína se midió y se llevó a una concentración de 10 mg/ml. Se agregó DTE a una concentración final de 65 mM y se incubó toda la noche a temperatura ambiente. El nuevo plegado se inició mediante la dilución de 10 mi de proteína (gota a gota) a una solución que contiene 0,5 M Arginina, 0,1 M Tris a pH 8, 2 mM EDTA, 0,9 mM GSSG. La solución que se pliega nuevamente se incubó durante 48 horas a 10°C. La solución que se pliega nuevamente que contiene la proteína se dializó en un tampón que contiene 25 mM tampón fosfato a pH 6, 100 mM Urea, y se concentró a 500 mi. La solución concentrada/dializada se unió a una columna de SP-sefarosa y la proteína se eluyó con un gradiente de NaCl (hasta 1 M) .

Ejemplo 15 La producción de anticuerpo de L32 IgG y los fragmentos Fabi y F(ab')2 se debe realizar de la siguiente manera, como se ha hecho para Yl IgG.

Células CHO se cultivan en el medio F-12 con un suplemento con 10% de suero de ternero fetal y 40 g/ml de gentamicina a 37°C, en una atmósfera de CO2 al 5%. Un día antes de la transfección, se siembran 1-I,5xl06 células en platillos de 90 mm. Los cultivos se co-transfectan con 10 µg del ADN que codifica para las cadenas liviana y pesada del anticuerpo L32. La transfección se lleva a cabo con la técnica de reactivo de transfección FuGene (Roche) . Después de 2 días de cultivo en medios de cultivo no selectivos, las células se cultivan durante 10-12 días en un medio F-12 que contiene 550 µg/ml de neomicina y 3 µg/ml de puromicina. Las células se tripsinizan y se clonan limitando la dilución de 0,5 célula/receptáculo en placas de plástico de 96 receptáculos Costar. Se recogen colonias individuales, se cultivan en platillos de seis receptáculos y se transfectan a matraces para otra selección (para determinar el nivel de expresión y la secreción de anticuerpos a los medios de cultivo) .

Las células CHO" se cultivan en el medio F-12 con un suplemento con 10% de suero de ternero fetal y 40 µg/ml de gentamicina a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%. Un día antes de la transfección de 0,8-lxlO6 células se sembraron sobre platillos de 90 mm. Los cultivos se transfectaron con 10 µg del ADN que codifica las cadenas liviana y pesada del anticuerpo L32 clonado bajo el promotor de CMV (citomegalovirus) y el gen dhfr bajo el promotor de sv-40. La transfección se llevó a cabo usando la técnica de reactivo de transfección FuGene (Roche) . Después de 2 días de cultivo en medios de cultivo no selectivos, las células se cultivaron en un medio que contiene 100 nM - 5 ¡u de metotrexato (MTX) y suero de ternero fetal dializado para seleccionar clones (después de limitar la dilución) que expresan niveles alumentados del anticuerpo L32 entero.

Se establece un ensayo ELISA sándwich para determinar la concentración de anticuerpos que se segregan en el sobrenadante de células CHO transfectadas . Para cuantificar la concentración de anticuerpos, se usan los siguientes reactivos: una IgGl antihumana monoclonal (Fe) (Sigma) como el anticuerpo recubierto, un conjugado de IgG anti-humana de cabra (específico de la cadena de ?) y biotina como el detector (Sigma) y una IgGl, lambda, humana purificada (Sigma) como estándar.

Se cultivaron células en frascos de rodillo a una concentración final de l-2xl08 células por frasco en un medio F-12 con un suplemento con suero de ternero fetal al 10%, neomicina y puromicina (como se indicó anteriormente) . Para la producción de anticuerpos, se dultivaron células en el mismo medio, pero con 2% de suero de ternero fetal durante dos días. El anticuerpo segregado se purifica sobre una columna de proteína G sefarosa (Pharmacia) y sefarosa de columna Q de intercambio de iones (Pharmacia) . La unión es en 20 mM de tampón fosfato de sodio a pH 7,0, mientras que la elusión es en 0,1 M tampón de glicina, a pH 2,5-3,0. La cantidad del anticuerpo purificado se determina mediante absorbencia de radiación ultravioleta y ELISA, mientras que su pureza se analiza mediante SDS-PAGE y HPLC.

Fragmentación de L32 IgG en Fabi y F(abf )2. Inicialmente, fragmentos de anticuerpos monovalentes y divalentes se preparan usando Ficina inmovilizada (Pierce) . La descomposición de Ficina produce fragmentos F(ab' )2 en la presencia de 1 mM cisteina. En forma similar, aumentando la concentración del activador de cisteina en el tampón de digestión a 10 mM, se pueden crear fragmentos Fab a partir de la IgG original. Después de la digestión, los fragmentos se purifican sobre una columna de Proteína A inmovilizada. Los fragmentos F(ab' )2 y Fabi se concentran usando un microconcentrador con un corte de peso molecular de 10.000 a 30.000 Dalton. La recuperación de proteínas se determina usando la absorbencia a 280 nm. La pureza del fragmento se determina usando electroforesxs de gel.

Además, se aplican 10 mg de anticuerpo 132 purificado a una suspensión de 0,5 mi de Papaína inmovilizada en un tampón de digestión a 37°C, durante 16 horas. La reacción se termina eluyendo el digesto con 1,5 ral de tampón de unión. La separación Fabi de los fragmentos de IgG y Fe sin digerir es hace usando la columna de Proteina A con tampón de unión. El Fabi está contenido en el flujo. Leyendo la absorbencia a 280 nm, las fracciones pico que contienen los fragmentos se mezclan, se concentran y se dializan contra PBS, a pH 7,4, toda la noche. La recuperación, pureza y caracterización de la proteina se detarmina mediante absorbencia a 280 nm y electroforesis de gel.

Ejemplo 16 El efecto de scFv L32 sobre la unión de los anticuerpos scFv Yl (Tabla 11) o IgG Yl (Tabla 12) a las células ML2 se evaluó mediante ensayos de competencia usando el análisis de FACS.

Un microgramo del anticuerpo competidor (L32 scFv, Yl scFv (P03), KPL-1 o N06 scFv control) se agregó a células ML2 (0,5 x 106 células por ensayo) . Después de 30 minutos de incubación, se agregó scFv o IgG rotulada con Yl-PE durante otros 30 minutos de incubación a 37 °C. Después de la incubación las muestras se lavaron una vez con tampón de FACS y se analizaron.

Los resultados se dan en el número medio de Geo como un promedio mediano de dos tubos por duplicado analizados. El valor medio de geo es una expresión exponencial y no lineal de la afinidad de la unió .

Los resultados que se muestran en la Tabla 12 indican que L32 scFv inhibe, eficazmente (un 80%) la unión de scFv Yl-PE a las células ML2, es decir L32 scFv inhibe en una forma similar a Yl scFv. En cambio, el anticuerpo control negativo no relacionado scFv N06 inhibe la unión solamente un 20%.

TABLA 12 Muestra Mediana Porcentaje de inhibición Control 5 - KPL-l-PE 700 - Yl-PE 240 - Yl-PE + N06 190 20 Yl-PE + P03 48 80 Yl-PE + L32 40 83 TABLA 13 Muestra Mediana Porcentaje de Inhibición 200mg 500mg lOOOmg 200mg 500mg lOOOmg Control 3 ND ND ND ND Yl 12,5 ND ND ND ND Yl-PE + Yl 3 ND ND 100% ND ND Yl-PE + KPL-1 2 ND ND 100% ND ND Yl-PE + P03 7,5 6 5 40% 52% 60% Yl-PE + L32 5,5 3,8 3,7 54% 79% 80% ND= No se hizo desde la inhibición completa lograda concentración más baja Los resultados que se muestran en la Tabla 13 indican que mientras IgG Yl solo (concentración final de 200 ng) se unió a las células con un Medio de Geo de 12,5, la competencia con 200 ng de IgG Yl o KPL-1 "frió" (anticuerpo monoclonal murino disponible comercialmente contra PSGL1) redujo el Medio de Geo de la unión de IgG Yl a 3 y 2 respectivamente. La unión de IgG Yl a células ML2 se inhibió (compitió) con el anticuerpo scFv Yl en una forma que depende de la dosis, es decir 200 ng del anticuerpo scFv Yl redujo la unión de IgG Yl a un Medio de Geo de 7,5 mientras que 1000 ng la redujeron a un Medio de Geo de 5. La unión de IgG Yl a células ML2 también se inhibió (compitió) con el anticuerpo scFv L32 en una forma que depende de la dosis, pero en una magnitud aún mayor que la ejercida por scFv Yl, es decir que 200 ng del anticuerpo scFv L32 redujeron la unión de IgG Yl a un Medio de Geo de 5,5 mientras que 1000 ng la redujeron a un Medio de Geo de 3,7.

Si bien tanto scFv Yl como scFv L32 inhibieron la unión de IgG Yl a células ML2, a concentraciones idénticas del anticuerpo, la inhibición ejercida por scFv L32 es más pronunciada que la ejercida por scFv Yl. Más aún, ambos anticuerpos de IgG ensayados (IgG Yl y KPL-1) tienen afinidad más alta a las células ML2 en relación con los dos anticuerpos scFv ensayados ya que reducen el Medio de Geo de la unión de XgG Yl a un Medio de Geo de 3 y 2 respectivamente .

Ejemplo 17 El presente ejemplo demuestra la unión de L32 a diversas subpoblaciones de células sanguíneas, que incluyen células normales (Tabla 14) y enfermas (Tabla 15), usando el análisis FACS.

Primero, el análisis se llevó a cabo para determinar la selectividad de la unión de L32 scFv a las células precursoras CD34+, aisladas de muestras de médula ósea humana normal (NBM) , comparado con Yl scFv. La unión se midió después del manchado con anticuerpos rotulados (anti-scFv-PE) . Cada muestra de NBM se ensayó con ambos anticuerpos en ensayos idénticos.

Los criterios usados para evaluar la unión son los siguientes: Medio de Geo (GM) inferior a 10: Negativo Medio de Geo (GM) entre 11 y 20: Unión de Baja Afinidad Medio de Geo (GM) entre 21 y 40: Unión de Afinidad Media Medio de Geo (GM) entre 41 y más: Unión de Afinidad Alta Como se muestra en la Tabla 14, de 32 muetras de NBM ensayadas, 24 (75%) no se unieron ni a L32 ni a Yl. Seis muestras (19%) mostraron unión de baja afinidad para L32, 1 (3%) mostró unión de afinidad media para L32, y 1 (3%) mostró unión de afinidad media para L32 e Yl. En general, los perfiles de unión de L32 e Yl a células CD34+ fueron similares.

TABLA 14 Número Código P03 L32 Número Código P03 L32 NI 105351 Neg Neg N17 AHSBM24 Neg Neg N2 AH/NBM01 Neg 13 NI8 AHJBM26 Neg Neg N3 AH/NBM03 Neg Neg N19 AHJBM27 9,6 22 N4 AH/NBM04 Neg Neg N20 AHJBM28 Neg 17 N5 KBM33 Neg 14 N21 AHJBM31 26 28 N6 AH/NBM08 Neg Neg N22 AHJBM36 Neg Neg N7 AH/NBM09 10 13 N23 AHJBM37 Neg Neg N8 AH/NBM10 10 14 N24 AHJBM38 Neg Neg N9 AH/NBM11 Neg Neg N25 AHJBM39 Neg Neg N10 AH/NBM12 Neg Neg N26 AHJBM40 Neg Neg Nll AH/NBM13 Neg Neg N27 AHJBM41 Neg Neg NI2 105377 Neg Neg N28 AHJBM42 Neg Neg NI3 AH/NBM14 Neg Neg N29 AHJBM43 Neg Neg N14 AH/NBM20 9 16 N30 AHJBM44 Neg Neg NI5 AH/NBM22 Neg Neg N31 AHJBM45 Neg Neg NI 6 AH/NBM23 Neg Neg N32 102546 Neg Neg Los números de la tabla representan la media geométrica de la muestra.

Además, se llevó a cabo el análisis de FACS comparativo de la unión de L32 scFv e Yl scFv (P03) a células de leucemia primarias humanas (AML, MM, B-CLL y B-ALL) aisladas de muestras de sangre de pacientes. La unión de L32 se comparó con la de Yl en las mismas muestras en ensayos idénticos. Los criterios de unión se expusieron anteriormente.

La Tabla 15 muestra los datos obtenidos de la totalidad de las muestras de pacientes ensayadas, y la Tabla 16 resume los datos de afinidad para la afinidad de L32 e Yl en muestras de AML y B-CLL.

TABLA 15 Código Tipo Población de Células Enfermedad Linfocito Monocito Granulocito Unión de L32 a Pacientes con Leucemia 1 42824 AML/M2 53/10001 68 - - 2 42841 AML/M4 330 123 9002 280 3 42868 AML/M2 43 120 1000 345 4 42873 AML/M4 24 94 _ 80 Código Tipo Población de Células Enfermedad Linfocito Monocito Granulocxto 42874 AML/M4 Negativo 73 35 Negativo 42902 AML/M6 26 78 - - 42933 A L/M5 200 18 - - 42939 AML/M2 57 110 - 160 42946 AML/MO Negativo 98 - - R0298 AML/MO 23 260 - - R9849 7AML/M4 470 260 - 340 KAM095 RAEB 30 83 - 240 R5440-7 AML/M3 200 140 - - R0376 AML/M1/M2 102 65 295 186 K¾M096 AML/M2 36 41 - - KAM108 Recaída de 943 143 360 280 AML KAMI09 AML/M5 91 18 - 38 KA M097 MM 100 27 - - 42934 MM 650 130 560 150 42938 MM 550 110 360 160 KPC105 Plasmocito 340 330 - 280 KBC098 B-CLL 37 154 - 240 KBC100 B-CLL 10 46 - 68 KBC101 B-CLL Negativo4 140 280 190 Código Tipo Población de Células Enfermedad Linfocito Monocito Granulocito 26 KBC102 B-CLL Negativo 110 27 KBC103 B-CLL 13 46 300 230 28 KBC104 B-CLL Negativo4 60 260 Negativo 29 KBC105 B-CLL 70 250 260 30 BC106 B-CLL Negativo 68 200 140 31 KBC107 B-CLL 17 165 420 270 32 R3093-7 B-ALL Negativo 41 490 90 33 R313-0 B-ALL Negativo 26 100 Unión de Yl scFv a Pacientes con Leucemia 1 42824 7AML/M2 Neg/871 50 2 42841 AML/M4 125 59 210¿ 126 3 42868 AML/M2 15 53 100 180 4 42873 AML/M4 12 38 43 5 42874 AML/M4 Negativo 36 30 ' Negativo 6 42902 AML/M6 19 24 7 42933 AML/M5 62 10 8 42939 AML/M2 18 51 9 42946 AML/M0 Negativo 27 10 R0298 AML/M0 Negativo 43 12 R9849 AML/M4 230 160 225 13 KAM095 RAEB 12 20 74 Código Tipo Población de Células Enfermedad Linfocito Monocito Granulocito 14 R5440-7 AML/M3 95 43 - - 15 R0376 7AML/M1/M2 29 18 100 63 16 KAM096 AML/M2 17 15 - - 17 ???108 Recalda de 153 20 110 120 AML 18 KA 109 AML/M5 40 14 - 18 19 KAMM097 M 70 13 - - 20 42934 MM 170 30 160 50 21 42938 MM 184 30 128 68 22 KPC105 Plasmocito 117 116 - 100 23 KBC098 B-CLL 21 70 - 140 24 BC100 B-CLL 19 17 - 27 25 KBC101 B-CLL Negativo4 29 84 47 26 KBC102 B-CLL Negativo - - 60 27 KBC103 B-CLL Negativo 20 86 110 28 BC104 B-CLL Negativo4 10 84 Negativo 29 KBC105 B-CLL 46 117 - 133 30 KBC106 B-CLL Negativo 41 98 65 31 KBC107 B-CLL 9,5 79 - 126 32 R3093-7 B-ALL Negativo - - - 33 R313-0 B-7ALL Negativo - - - ¦""Dos poblaciones de enfermedad 2De las células enfermas 3La sangre periférica contiene 2,5% células CD34+ 4Las células son CD19+/CD5- De las 17 muestras de AML ensayadas, 15 (88%) fueron positivas para la unión por L32 donde 10 muestras (59%) mostraron unión de alta afinidad (medio de Geo promedio 165) y 5 muestras (29%) mostraron una unión de afinidad media (medio de Geo promedio 28). Trece (76%) de las muestras de AML también fueron positivas para la unión de Yl, pero el análisis comparativo (Tabla 16) indica que la afinidad de unión promedio de L32 es siempre notablemente más alta que la de Yl en la misma población de muestra. En general, un 50% de las muestras de pacientes con AML en la etapa M2 presentan una unión por L32 e Yl. En la etapa M3 y más, un 90% de las muestras se unen a ambos anticuerpos, con niveles de afinidad variables (no se muestran datos) .

De las 9 muestras de B-CLL ensayadas, 4 (44%) fueron positivas para la unión por L32 donde 1 muestra (11%) mostró una unión de alta afinidad (medio de Geo 70), 1 muestra (11%) mostró unión de afinidad media (medio de Geo 37) y 2 muestras (22%) mostraron unión de baja afinidad (medio de Geo promedio 15) . Tres (33%) de las muestras de B-CLL ensayadas también fueron positivas para la unión de Yl, pero el análisis comparativo (Tabla 16) indica que la afinidad de unión promedio de L32 es siempre notablemente mayor que la de Yl en la misma población de muestra.

De las cuatro muestras de MM y plastmacitoma ensayadas, todas mostraron unión de alta afinidad tanto a L32 como a Yl, pero la afinidad de L32 fue mayor que la de Yl (medio de Geo promedio 410 contra medio de Geo promedio 135, respectivamente) . De las dos muestras de B-ALL ensayadas, ambas fueron negativas para la unión de L32 e Yl.

TABLA 16 AML B-CLL L32 Yl L32 Yl Alto Medio de Geo Enfermedad 165 61 70 46 Linfocitos 117 50 107 42 Monocitos 638 145 323 58 Granulocitos 239 10 169 70 Medio de Geo Medio Enfermedad 28 12 37 21 Linfocitos 41 15 26 9 Monocitos 35 30 Neg Neg Granulocitos Neg Neg Neg Neg Bajo Medio de Geo Enfermedad Ninguno Ninguno 13 9 Linfocitos 18 12 Neg Neg Monocitos Neg Neg Neg Neg Granulocitos Neg Neg Neg neg *Los números son Medios de Geo promedio basados en los resultados ilustrados en la Tabla 14. El grupo de alta, media y baja afinidad se determinó de acuerdo con los datos de L32 Los resultados de las Tablas 15 y 16 indican claramente que en la población enferma asi como en las subpoblaciones maduras (linfocitos, monocitos y granulocitos) en muestras de sangre de AML y B-CLL primarias la unión del anticuerpo L32 es siempre notablemente mayor que la de Yl .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento de él que se une a un epitope de PSGL-1, en donde el anticuerpo o el fragmento de él tiene las capacidades de unión de un scFv de la ID de SEC N° 1.

2. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de él comprende una región de determinación de complementariedad de cadena pesada (CDR) seleccionada del grupo formado por ID de SEC N°2, ID de SEC N°3 e ID de SEC N°4.

3. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dos CDR de cadena pesada se seleccionan del grupo formado por la ID de SEC N°2, la ID de SEC N°3 y la ID de SEC N°4.

4. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 3, en donde tres CDR de cadena pesada se seleccionan del grupo formado por la ID de SEC ?°2 la ID de SEC N°3 y la ID de SEC N°4.

5. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el anticuerpo o un fragmento de él comprende la ID de SEC N°l.

6. El anticuerpo o un fragmento de él que se une a un epitope de PSGL-1 que comprende una región de determinación de complementariedad de cadena pesada (CDR) seleccionada del grupo formado por la ID de SEC N°2, la ID de SEC N°3 y la ID de SEC N°4.

7. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dos CDR de cadena pesada se seleccionan del grupo formado por la ID de SEC N° 2, la ID de SEC N°3 y la ID de SEC N°4.

8. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 7, en donde tres CDR de cadena pesada se seleccionan del grupo formado por la ID de SEC N°2, la ID de SEC N°3 y la ID de SEC N°4.

9. Un anticuerpo o un fragmento de él que se une a un epitope de PSGL-1 que comprende la ID de SEC N°l.

10. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de él comprende al menos una región variable de marco de la linea germinal DP32.

11. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de él es un péptido o polipéptido sustancialmente circular o en bucle.

12. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el epitope comprende al menos un grupo sulfatado.

13. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de él se une a dos o más epitopes, cada epitope comprende uno o más residuos de tirosina sulfatada.

14. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 13, en donde cada epitope comprende al menos un grupo de dos o más aminoácidos ácidos.

15. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de él reacciona en forma cruzada con dos o más epítopes, cada epítope tiene uno o más residuos de tirosina sulfatada.

16. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 15, en donde cada epitope comprende un grupo de dos o más aminoácidos ácidos .

17. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de él se une a un epitope en por lo menos un tipo de célula que se selecciona del grupo formado por células de T-ALL, células de AML, células de B-leucemia, B-CLL, y células de mieloma múltiple.

18. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de él se une a un epitope en una molécula de lipido, carbohidrato, péptido, glicolipido, glicoproteína, lipoproteina, y/o lipopolisacárido .

19. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de él se acopla o forma un complejo con un agente que se selecciona del grupo formado por agentes anti-cáncer, antileucémicos, antimetástasis, antineoplásicos, anti-enfermedad, anti-adhesión, anti-trombosis, anti-restenosis, anti-autorainmune, antiagregación,, antibacterianos, antivirales, y antinflamatorios .

20. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente es un agente antiviral que se selecciona del grupo formado por acyclovir, ganciclovir y zidovudina.

21. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente es un agente anti-trombosis/anti-restenosis que se selecciona del grupo formado por cilostazol, sodio de dalteparina, sodio de reviparina y aspirina.

22. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente es un agente antinflamatorio que se selecciona del grupo formado por zaltoprofeno, pranoprofeno, droxicam, acetil salicílico 17, diclofenac, ibuprofeno, dexibuprofeno, sulindac, naproxeno, amtolmetina, celecoxib, indometacina, rofecoxib, y nimesulid.

23. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente es un agente anti-autoinmune que se selecciona del grupo formado por leflunomida, denileucin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotida, y ciclofosfamida.

24. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el agente es un agente anti-adhesion /anti-agregación que se selecciona del grupo formado por limaprost, clorcromeno, y ácido hialurónico.

25. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el agente se selecciona del grupo formado por toxinas, radioisótopos, agentes de formación de imagen, y agentes farmacéuticos.

26. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la toxina se selecciona del grupo formado por gelomina, exotoxina de Pseudomonas (PE), PE40, PE38, ricina, y modificaciones y derivados de ellas.

27. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el radioisótopo se selecciona del grupo formado por emisores de rayos gamma, emisores de positrones, emisores de rayos X, emisores de rayos beta, y emisores de rayos alfa.

28. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el radioisótopo se selecciona del grupo formado por ulindio, 113indio, 99mrenio, 105renio, 101renio 99mtecnetio, 121mtelerio, 122mtelerio, 165tulio, 167tulio, 168tulio 123yodo, 1 6yodo, 131yodo, 133yodo, 81racriptón, 33xenón, 90itrio 213bismuto, 77bromo, 18flúor, 95rutenio, 97rutenio, 103rutenio 107mercurio, 203mercurio/ 67galio, y 68galio.

29. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 25 , en donde el agente farmacéutico es antracilina.

30. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 29, en donde la antracilina se selecciona del grupo formado por doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, detorubicina, carminomicina, epirubicina, esorubicina, morfolinodoxorubicina, morfolinodaunorubicina, y metoximorfolinildoxorubicina .

31. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el agente farmacéutico se selecciona del grupo formado por cis-platino, taxol, calicheamicina, vincristina, citarabina (Ara-C) , ciclofosfamida, prednisona, fludarabina, clorabucil, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida, y bleomicina, y derivados y combinaciones de ellas.

32. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el anticuerpo o el fragmento de él se acopla o forma complejos con un vehículo o portador que puede acoplarse o formar complejos con más de un agente.

33. El anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el vehículo o portador se selecciona del grupo formado por dextran, polímeros lipófilos, ????, y liposomas y derivados y modificaciones de ellos.

34. Un epítope aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que se une al anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1.

35. El epítope aislado de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el epítope aislado comprende al menos un grupo sulfatado.

36. El epítope aislado de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el grupo sulfatado es una tirosina sulfatada.

37. El epítope aislado de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el epítope aislado comprende un grupo de aminoácidos con carga negativa.

38. El epítope aislado de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el grupo comprende los aminoácidos 1 y 17 de PSGL-1 maduro.

39. Un polinucleótido aislado o purificado que codifica el anticuerpo o un fragemento de él.

40. Un vector de expresión que comprende las secuencias de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 39.

41. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 40.

42. Una célula huésped recombinante de la reivindicación 41, o una descendiente de ella en donde la célula expresa el anticuerpo o un fragmento de él.

43. Un método de producción de una célula recombinante que comprende transfectar una célula con el vector de expresión de la reivindicación 40.

44. Un método de producción de un anticuerpo o un fragmento de él que comprende cultivar la célula de la reivindicación 41 en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo o un fragmento de él.

45. El método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde el método además comprende aislar o purificar el anticuerpo o un fragmento de él de la célula o el medio de la célula.

46. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

47. Un kit para diagnóstico, pronóstico o determinación de etapas de una enfermedad que comprende un anticuerpo o un fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1 y un agente de formación de imagen.

48. El kit para diagnóstico, pronóstico o determinación de etapas de una enfermedad de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el agente de formación de imagen es un isótopo radioactivo.

49. Un método de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 46.

50. Un método de tratamiento del arrollamiento de células que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 46.

51. Un método de mejora de los efectos de la inflamación, la prevención de la inflamación, el tratamiento de la inflamación, o la inhibición del avance de la inflamación que comprende administrar a un paciente que necesita de él una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 46.

52. Un método de tratamiento de una infección que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 46.

53. El método de la reivindicación 52, en donde la infección está producida por el HIV.

54. El método de la reivindicación 52, en donde la administración impide el ingreso del HIV en la célula.

55. Un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 46.

56. Un método de tratamiento de metástasis que comprende administrar a un paciente que la necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

57. Un método de tratamiento del crecimiento y/o la replicación de células de tumores que comprende administrar a un paciente que la necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

58. Un método de aumento del índice de mortalidad de células de tumores que comprende administrar a un paciente que la necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

59. Un método de tratamiento del crecimiento y/o la replicación de células de leucemia que comprende administrar a un paciente que la necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

60. Un método de aumento del índice de mortalidad de células de leucemia que comprende administrar a un paciente que la necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

61. Un método de alteración de la susceptibilidad de las células enfermas al daño por agentes anti-enfermedad que comprende administrar a un paciente que la necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

62. Un método de aumento de la susceptibilidad de las células de tumores al daño por agentes anti-cáncer que comprende administrar a un paciente que la necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

63. Un método de aumento de la susceptibilidad de las células de leucemia al daño por agentes anticáncer que comprende administrar a un paciente que la necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

64. Un método de inhibición del aumento en el número de células de tumores en un paciente que tiene un tumor que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

65. Un método de reducción del número de células de tumores en un paciente que tiene un tumor que comprende administrar a un paciente que la necesita una composición farmacéutic de la reivindicación 46.

66. Un método de inhibición del aumento en el número de células de leucemia en un paciente que tiene leucemia que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

67. Un método de reducción del número de células de leucemia en un paciente que tiene leucemia que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

68. Un método para producir anticuerpos que depende de la citotoxicidad mediada por células (ADCC) que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

69. Un método de estimulación de una célula asesina natural (NK) o una célula T que comprende administrar a un paciente que lo necesita una composición farmacéutica de la reivindicación 46.

70. Un método de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad en un paciente que comprende proporcionar una muestra que comprende una célula del paciente y determinar si el anticuerpo o un fragmento de él de la reivindicación 1 se une a la célula del paciente, indicando de este modo que el paciente corre riesgo de tener la enfermedad o la tiene.

71. Un método de diagnóstico o pronóstico de inflamación en un paciente que comprende: proporcionar una muestra que comprende una célula del paciente y determinar si el anticuerpo o un fragmento de él de la reivindicación 1 se une a la célula del paciente, indicando de este modo que el paciente corre riesgo de tener inflamación o la tiene.

72. Un método de diagnóstico o pronóstico de infección en un paciente que comprende: proporcionar una muestra que contiene una célula del paciente y determinar si el anticuerpo o un fragmento de él de la reivindicación 1 se une a la célula del paciente, indicando de este modo que el paciente corre riesgo de tener una infección o la tiene.

73. El método de la reivindicación 72, en donde la infección está provocada por el HIV.

74. Un método de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad autoinmune en un paciente que comprende: proporcionar una muestra que contiene una célula del paciente y determinar si el anticuerpo o un fragmento de él de la reivindicación 1 se une a la célula del paciente, indicando de este modo que el paciente corre riesgo de tener una enfermedad autoinmune o la tiene.

75. Un método de diagnóstico, pronóstico o determinación de etapas de la metástasis en un paciente que comprende: proporcionar una muestra que contiene una célula del paciente y determinar si el anticuerpo o un fragmento de él de la reivindicación 1 se une a la célula del paciente, indicando de este modo que el paciente corre riesgo de tener metástasis o la tiene.

76. Un método de diagnóstico, pronóstico o determinación de etapas de una célula de tumor en un paciente que comprende: proporcionar una muestra que contiene una célula del paciente y determinar si el anticuerpo o un fragmento de él de la reivindicación 1 se une a la célula del paciente, indicando de este modo que el paciente corre riesgo de tener una célula de tumor o la tiene.

77. Un método de diagnóstico, pronóstico o determinación de etapas de leucemia en un paciente que comprende: proporcionar una muestra que contiene una célula del paciente y determinar si el anticuerpo o un fragmento de él de la reivindicación 1 se une a la célula del paciente, indicando de este modo que el paciente corre riesgo de tener leucemia o la tiene.

78. Un método de purga de células de tumores de un paciente que comprende: proporcionar una muestra que contiene células del paciente y incubar las células del paciente con un anticuerpo o un fragmento de él de la reivindicación 1.

79. El método de la reivindicación 78, en donde la purga ocurre ex vivo.

80. El uso de una composición farmacéutica de la reivindicación 46 en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad.

81. El uso de acuerdo con la reivindicación 80, en donde la enfermedad se selecciona del grupo formado por arrollamiento de células, inflamación, una enfermedad autoinmune, una infección, metástasis, crecimiento y/o replicación de células de tumores, y crecimiento y/o replicación de células de leucemia.

82. Una composición farmacéutica de la reivindicación 46 para el uso en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad.

83. La composición farmacéutica de la reivindicación 82, en donde la enfermedad se selecciona del grupo formado por arrollamiento de células, inflamación, una enfermedad autoinmune, una infección, metástasis, crecimiento y/o replicación de células de tumores, y crecimiento y/o replicación de células de leucemia.

84. Un proceso para producir un anticuerpo o un fragmento de él que comprende los pasos de: proporcionar una biblioteca de presentación de fago; proporcionar al menos dos moléculas o células que se unen a un anticuerpo o un fragmento de él que tiene las capacidades de unión de un anticuerpo o fragmento scFv o un fragmento de él de la ID de SEC N°l; panear la biblioteca de presentación de fago por una partícula de fago que presenta un oligopéptido o polipéptido que se une a por lo menos dos de las moléculas o células; y producir un anticuerpo o un fragmento de él que comprende un anticuerpo o un fragmento de él o un fragmento de unión de él que comprende el péptido o polipéptido que se une a por lo menos dos de las moléculas o células.

85. Un anticuerpo o un fragmento de él producido de acuerdo con el proceso de la reivindicación 84. Listado de Secuencias Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser 155 160 165 Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg lie Thr Cys Gln Gly Asp Ser 170 175 180 Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 185 190 195 Ala Pro Val Leu Val He Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly 200 205 210 He Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly'Asn Thr Ala Ser 215 220 225 Leu Thr lie Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 230 235 240 Cys Asu Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu 260 265 270 lie Ser Glu Glu Asp Leu ABn Gly Ala Ala 275 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Horno sapiens <400> 2 Met Arg Ala Pro Val He 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Horno sapiens <400> 3 Gly He Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met 5 <210> 4 <211> 7 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Arg Gly Gly Asn Ala Met 5 <210> 6 <211> 11 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Leu Thr Tyr Asn Ser Tyr Glu Val Pro Thr 10 <210> 7 <21> 9 <212> PRT <2130> Homo sapiens <400> 7 Thr Asn Trp Tyr Leu Arg Pro Leu Asn 5 <210> 8 >211> 10 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Gln Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu 5 10