KR20060011925A

KR20060011925A - 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20060011925A
Application number: KR1020047021603A
Authority: KR
Inventors: 레바논아비그도; 벤-레비레이첼; 플라크신다니엘; 스잔턴에스터; 하가이요체베드; 호크마-카임하기트
Original assignee: 사비언트 파마슈티컬즈 인코퍼레이티드
Priority date: 2002-07-01
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2006-02-06
Also published as: IL166063A0; EP1534332A2; JP2005536199A; WO2004003166A2; CA2491363A1; MXPA05000272A; RU2005101621A; WO2004003166A3; BR0312483A; AU2003263764A1; EP1534332A4; PL374439A1; CN1678347A

Abstract

본 발명은 암 세포에 결합하며, 세포 회전 및 전이와 같은 생리학적 현상에 있어서 중요한 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 이러한 항체 또는 이의 단편을 사용하는 치료 및 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 방법 및 조성물 역시 제공된다. 본 발명에 따른 방법 및 조성물은 종양 성장 및 전이, 백혈병, 자가면역 질환 및 염증성 질환을 비롯하여 암과 같은 질병의 진단 및 치료에 사용될 수 있다.

Description

항체 및 이의 용도{ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 암 세포, 전이 세포, 백혈병 세포, 백혈구 및 혈소판 등의 세포 상에 존재하고, 세포 회전, 전이, 염증 및 자가면역 질환과 같은 다양한 생리학적 현상에서 중요한 역할을 하는 특정 에피토프에 결합하는 항체에 관한 것이다. 특히, 이 항체는 항암 활성, 항전이 활성, 항백혈병 활성, 항바이러스 활성, 항감염 활성 및/또는 염증성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환(예, 심근경색), 망막병증 질환 및 황산화된 티로신 의존성 단백질-단백질 상호작용에 의해 유발되는 질환과 같은 기타 질환에 대한 활성을 나타낼 수 있다.

항체, 파지 디스플레이 및 조직 표적화

치료제의 조직 선택적 표적화는 약학 산업의 신흥 분야이다. 표적화에 기초한 새로운 암 치료법은 독성을 감소시키면서 치료의 특이성 및 효능을 증가시킴으로써 전체적인 효능을 증강시키도록 디자인되었다. 종양 관련 항원에 대한 마우스 모노클로널 항체(MAb)는 독소, 방사성 뉴클레오티드 및 화학요법제를 종양에 표적화하기 위한 시도에 사용되어 왔다. 또한, CD19, CD20, CD22 및 CD25와 같은 분화 항원은 조혈기 악성종양을 치료하는 데 있어서 암 특이적 표적으로서 이용되어 왔다.

이러한 접근법은 광범위하게 연구되었으나 몇 가지 제약이 있다. 첫 번째 제약은 선택적 결합을 나타내는 적절한 MAb를 분리하는 것의 어려움에 있다. 두 번째 제약은 성공적인 항체 분리를 위한 전제 조건으로서 높은 항체 면역원성이 요구된다는 것이다. 세 번째 제약은 최종 생성물이 면역 반응을 유도하는 비-인간 서열을 갖는다는 것인데, 예를 들어 마우스 MAb가 인간에게 투여될 경우, 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응이 발생할 것이다. HAMA 반응은 종종 혈청 반감기를 더 단축시키고 반복 치료를 차단함으로써 항체의 치료적 효과를 감소시킨다. 이러한 세 번째 제약은 마우스 기원의 키메라 또는 인간화된 모노클로날 항체의 개발 및 인간 항체의 발견에 있어서의 관심을 자극하였다. 이러한 접근법의 또 다른 제약은 단지 공지의 정제된 항원에 대해 유도된 단일 항체 종만을 분리할 수 있다는 것이다. 게다가 이러한 방법은, 악성 세포뿐 아니라 정상 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 항체의 분리를 허용하는 한에 있어서는 선택적이지 않다.

암을 치료하기 위한 MAb의 치료 효능에 영향을 주는 요인은 다수가 있다. 이러한 요인은 종양 세포에 대한 항원 발현의 특이성 및 발현 수준, 항원 이질성 및 종양 덩어리의 접근성을 포함한다. 백혈병 및 림프종은 일반적으로 암종과 같은 고형 종양보다 항체를 사용한 치료에 반응성이 더 컸다. MAb는 혈류 중의 백혈병 및 림프종 세포에 재빨리 결합하여 림프계 조직 내의 악성 세포에 쉽게 침투하기 때문에 림프계 종양은 MAb 기초 치료에 대한 좋은 후보물질이 된다. 이상적인 시스템은 악성 선조 세포를 생성하는 줄기 세포의 세포 표면 상의 마커를 인식하는 MAb를 동정하는 것을 포함한다.

파지 라이브러리는 항체, 호르몬 및 수용체와 같은 분리된 소정의 표적 단백질에 결합하는 무작위 단일쇄 변형 단편(scFv)을 선별하는 데 사용되었다. 일반적으로는 항체 디스플레이 라이브러리, 구체적으로는 파지 scFv 라이브러리는 특이적인, 아직 파악되지 않은 미정의 세포 표면 부분을 표적화하기 위한 독특한 분자를 발견하는 대안적인 수단을 용이하게 한다.

백혈병, 림프종 및 흑색종은 골수 및 림프계 조직에서 유래되며 제어되지 않는 세포 성장과 관련이 있는 암이다. 급성 림프성 백혈병(ALL)은 특수한 임상적 및 면역학적 특성에 의해 정의되는 불균일한 질환이다. 다른 형태의 ALL과 마찬가지로, 대부분의 사례의 B 세포 ALL(B-ALL)의 명확한 원인은 알려져 있지 않으며, 다만, 많은 경우, 이 질환은 단일 세포의 DNA의 후천적인 유전적 변경으부터 발생하여 비정상성 및 연속적인 증식을 유발한다. B-ALL에 걸린 환자에 대한 예후는 소아 및 성인 모두에서 다른 백혈병 환자보다 훨씬 나쁘다. 만성 림프성 백혈병(CLL) (이 중 한 예는 B 세포 CLL(B-CLL)임)은 진행이 서서히 일어나는 형태의 백혈병이며, 림프구의 수가 증가하는 것이 특징이다. 급성 골수성 백혈병(AML)은 정상적인 상태에서 골수 세포계(적혈구, 과립구, 단핵구 및 혈소판)의 최종 분화된 세포를 발생시키는 선조 세포를 갖는 불균질한 신생물의 집단이다. 다른 형태의 신조직 형태에서와 마찬가지로, AML은 정상적으로 분화된 골수 세포를 비교적 미분화된 아세포로 치환시키는 결과를 초래하여 한 유형 이상의 조기 골수 세포 분화를 나타내는 후천적인 유전적 변경과 연관되어 있다. AML은 일반적으로 골수에서 진화하며, 2차 조혈 기관에서는 더 적은 정도로 진화한다. AML은 주로 성인에게 발병하며 15∼40 세에 발병률이 최고조에 달하지만, 어린이와 노인에게도 발병하는 것으로 알려져 있다. 거의 모든 AML 환자는 임상적 완화를 얻기 위해서는 진단 후 바로 치료를 받아야 하며, 이때, 순환하는 미분화 아세포의 비정상적 수준에 대한 증거는 없다.

지금까지, 종양 세포에 대한 세포 용해성 활성을 유도하는 다양한 MAb가 개발되었다. HER2(P185)의 세포외 도메인에 대해 생성되었으며 HER2를 과발현하는 인간 종양 세포의 증식을 현저히 억제하는 것으로 확인된 마우스 MAb muMab4D5는 약물 HERCEPTIN(등록상표) (trastuzumab)을 생성하도록 인간화되었으며, 이 약물은 FDA에 의해 승인을 받았고, 인간 유방암을 치료하는 데 사용되고 있다(미국 특허 제5,821,337호 및 제5,720,954호). 항체는 결합 후 HER2 성장 인자 수용체에 의존적인 종양 세포 성장을 억제할 수 있다. 또한, 림프종과 관련된 것을 비롯하여 말초 B 세포의 급격한 고갈을 유발하는 CD20에 대한 키메라 항체 역시 최근에 FDA의 승인을 받았다(미국 특허 제5,843,439호). 표적 세포에 대한 이러한 항체의 결합은 보체 의존적 용해를 유발한다. 이러한 생성물은 최근에 승인되었고, 현재 초기 B 세포 비-호지킨 림프종의 치료를 위해 임상에서 사용되고 있다.

몇 가지 다른 인간화 항체 및 키메라 항체가 현재 개발중에 있거나 임상 시험중에 있다. 예를 들어, 정상 골수 세포뿐 아니라 대부분의 유형의 골수 백혈병 세포에서 발현되는 CD33 항원과 특이적으로 반응하는 인간화된 면역글로불린(Ig)은 항암 약물 칼리체아미신 CMA-676에 접합되었다(Sievers et al., Blood Supp. 308: 504a (1997)). 약물 MYLOTARG(등록상표)로 알려진 이러한 접합체는 최근에 FDA의 승인을 받았다(Caron et al., Cancer Supp. 73: 1049-56 (1994)). 세포 용해 활성 의 측면에서, 현재 임상 시험중에 있는 추가적인 항-CD33 항체(HumM195)는 겔로닌 독소(McGraw et al., Cancer Immunol. Immunother. 39: 367-74 (1994)) 및 방사능 동위원소 ¹³¹I(Caron et al., Blood 83: 1760-68 (1994)), ⁹⁰Y(Jurcic et al., Blood Supp. 92: 613a (1998)) 및 ²¹³Bi(Humun et al., Blood Supplement 38: 231P (1997))를 비롯하여 몇 가지 세포독성 제제에 접합되었다. 백혈구 항원 CD45(cHuLym3)에 대한 키메라 항체 역시 인간 백혈병 및 림프종의 치료를 위해 임상 시험중에 있다(Sun et al., Cancer Immunol. Immunother 48: 595-602 (2000)). 시험관내 분석에서는, ADCC((antibody dependent cell-mediated cytotoxicity; 항체 의존적 세포 매개 세포독성) 분석에서 특이적 세포 용해가 관찰되었다(Henkart, Immunity 1: 343-46 (1994); Squier and Cohen, Current Opin. Immunol. 6: 447-52 (1994)).

이러한 치료적 항체 역시 그 표적에 대한 높은 친화력을 갖고, 보다 안정해지도록 하고, 최적 생체내 분포를 위해 특이적으로 조작되었다. (참고 문헌: Presta, Current Pharma. Biotechnol., 3: 237-56 (2002); Presta et al., Biochem. Society Transactions, 30(4): 487-90 (2002).

마우스 모노클로널 인간화 및 키메라 항체의 작제와는 달리, 파지 디스플레이 기법의 이용은 완전한 인간 서열을 갖는 scFv의 분리를 가능하게 한다. 인간 TGFβ2에 대한 완전한 인간 항체는 파지 디스플레이 기법으로부터 유래된 scFv 클론에 기초하여 최근에 개발되었다. 이러한 scFv는 TGFβ2의 결합과 경쟁할 수 있는 완전한 인간 IgG4로 전환되었으며(Thompson et al., J. Immunol. Meth. 227: 17-29 (1999)), 이것은 강력한 항증식 활성을 보유한다. 당분야에 공지되어 있는 파지 디스플레이 기법에 대해서는 하기 간행물에 더욱 상세히 기술되어 있다: Smith, Science 228: 1315 (1985); Scott et al., Science 249: 386-90 (1990); Cwirla et al., PNAS 87: 6378-82 (1990); Devlin et al., Science 249: 404-06 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 13(14): 3245-60 (1994); Bass et al., Proteins 8: 309-14 (1990); McCafferty et al., Nature 348: 552-54 (1990); Nissim et al., EMBO J. 13: 692-98 (1994); 미국 특허 제5,427,908호, 제5,432,018호, 제5,223,409호 및 제5,403,484호, lib.

분리된 scFv 항체 분자에 대한 리간드

혈소판, 피브리노겐, GPIb, 셀렉틴 및 PSGL-1(P-셀렉틴 당단백질 리간드-1)은 각각 몇 가지 병원성 상태 또는 질환 상태, 예컨대 비정상적 또는 병원성 염증, 비정상적 또는 병원성 면역 반응, 자가면역 반응, 전이, 비정상적 또는 병원성 유착, 혈전증 및/또는 재발협착증 및 비정상적 또는 병원성 응집에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 혈소판 및 상기한 분자에 결합하거나 이와 교차반응하는 항체는 그와 같은 병원성 상태를 포함하여 질환 및 장애의 진단 및 치료에 유용할 것이다.

혈소판

혈소판은 혈액계의 잘 규명된 성분으로서, 지혈, 혈전증 및/또는 재발협착증에서 몇 가지 중요한 역할을 한다. 혈관에 대한 손상은, 일련의 순차적인 사건을 특징으로 하는 지혈이라고 알려진 과정을 작동되게 한다. 손상된 혈관에 대한 최초 의 반응은 혈관 내면 상의 손상된 영역에 혈소판을 부착시키는 것이다. 다음 단계는 이미 부착된 혈소판에 다수의 혈소판 층을 응집시켜 지혈 플러그를 형성하고 혈관을 밀폐시키는 것이다. 지혈 플러그는 피브린 중합체의 침착에 의해 더욱 강화된다. 응혈 또는 플러그는 손상이 수복되는 경우에만 분해된다.

순환하는 혈소판은 거핵구의 주변으로부터 방출되는 세포질 입자이다. 혈소판은 지혈에 있어서 중요한 역할을 한다. 혈관이 손상되면, 혈소판은 손상된 조직 표면에 들러 붙어 서로 부착한다(유착). 이러한 일련의 사건은 급속히 발생하여 혈관 손상 부위에 무정형의 덩어리(일반적으로 혈소판 플러그 또는 혈전이라 부름)를 형성한다. 응집이라고도 불리는 유착 현상은 다양한 물질 또는 작용제, 예컨대 콜라겐, 아데노신-디포스페이트(ADP), 에피네프린, 세로토닌 및 리스토세틴에 의해 시험관내에서 개시될 수 있다. 응집은 혈소판 기능의 한 척도로서 수행되는 다양한 시험관내 테스트 중 하나이다.

전이에 있어서 혈소판의 중요성

종양 전이는 아마도 암 환자의 생존을 제한하는 가장 중요한 인자일 것이다. 축적된 데이터에 의하면 종양 세포가 숙주 혈소판과 상호작용할 수 있는 능력은 전이의 필수불가결한 결정 인자 중 하나이다(Oleksowicz, Thrombosis Res. 79: 261-74 (1995)). 전이성 암 세포가 혈류에 진입할 경우, 종양 세포를 코팅하는 혈소판및 백혈구로 이루어진 다세포 복합체가 형성된다. 이러한 복합체는 미소색전이라 칭하기도 하며, 이는 종양 세포가 면역계를 침입하는 것을 보조한다. 혈소판에 의한 종양 세포의 코팅은 혈소판에 의한 P-셀렉틴의 발현을 필요로 한다.

종양 세포가 혈소판을 응집시키는 능력은 종양 세포의 전이 잠재력과 상관성이 있음은 입증되었으며, 종양 유도 혈소판 응집의 억제가 설치류 모델에서 전이의 억제와 상관성이 있는 것으로 나타났다. 혈소판과의 종양 세포 상호작용은 막 유착 분자 및 작용제 분비를 수반하는 것으로 입증되었다. 면역 관련 혈소판 당단백질의 발현은 종양 세포주에서 확인된 바 있다. 혈소판 면역 관련 당단백질인 GPIb, GPIIb/IIIa, GPIb/IX 및 인테그린 α_v 서브유닛은 유방 종양 세포주의 표면에서 발현된다(Oleksowicz, (1995), supra; Kamiyama et al., J. Lab. Clin. Med. 117 (3): 209-17 (1991)).

Gasic 등의 문헌[PNAS 61: 46-52 (1968)]은 항체 유도 혈소판 감소증이 CT26 결장 선암, 루이스 폐암 및 B16 흑색종에 의해 생산되는 전이의 수 및 용적을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다(Karpatkin et al., J. Clin. Invest. 81(4): 1012-19 (1988); Clezardin et al., Cancer Res. 53(19): 4695-700 (1993)). 뿐만 아니라, GPIb와 밀접한 관련이 있고 불완전하게 또는 비정상적으로 O-글리코실화된 GPIbα서브유닛에 상응하는 단일 폴리펩티드 사슬(60 kd)이 HEL 세포의 표면 막 상에 발현되는 것으로 확인되었다(Kieffer et al., J. Biol. Chem. 261 (34): 15854-62 (1986)).

GPIb 복합체

지혈 과정의 각 단계는 혈소판 표면 상의 수용체의 존재를 요한다. 지혈에 있어서 중요한 한 수용체는 당단백질 Ib-IX 복합체(CD42로도 알려짐)이다. 이 수용 체는 내피하의 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 결합함으로써 손상 부위의 혈관벽에 대한 혈소판의 유착(최초 부착)을 매개한다. 이것은 또한 지혈에서 중요한 다른 두 가지 혈소판 기능에 있어서 중요한 역할을 한다: (a) 동맥 협착 부위의 고전단에 의해 유도되는 혈소판의 응집 및 (b) 저농도의 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 활성화.

GPIb-IX 복합체는 혈소판 원형질막의 외면의 주요 성분 중 하나이다. 이 복합체는 막에 걸친 3개의 폴리펩티드 - GPIb의 이황화 결합된 130 kDa α-사슬 및 25 kDa β-사슬 및 비공유 결합된 GPIX(22 kDa)를 포함한다. 이들 서브유닛 모두는 혈소판 막 상에 CD42 복합체의 효율적인 세포 표면 발현 및 기능을 위한 등몰량으로 존재하는데, 이는 3개의 서브유닛의 복합체로의 적절한 조립이 원형질막 상에서의 완전한 발현에 필요하다는 것을 나타낸다. GPIb의 α-사슬은 3개의 상이한 구조적 도메인으로 구성된다: (1) 루신이 풍부한 반복 서열 및 Cys 결합의 측접 서열을 포함하는 구형의 N-말단 펩티드 도메인; (2) 고도로 글리코실화된 뮤신 유사 대형당펩티드 도메인; 및 (3) GPIbα에 대한 이황화 가교 및 경막 및 세포질 서열을 포함하는 막에 결합된 C-말단 영역.

몇 가지 증거는, vWF 및 GPIb-IX 복합체의 트롬빈 결합 도메인이 GPIbα의 아미노 말단에서 약 300 아미노산을 포함하는 구형 영역 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 인간 혈소판 GPIb-IX 복합체는 혈소판 기능 및 반응성 둘 다를 매개하는 주요 막 수용체이기 때문에, GPIb에 의한 내피하에 결합된 vWF의 인식은 혈소판이 손상된 혈관에 부착할 수 있게 한다. 게다가, GPIbα에 대한 vWF의 결합은 또한 혈 소판 활성화를 유도하고, 이는 세포골격 또는 포스포리파제 A2와 GPIb-IX의 세포질 도메인의 상호작용을 연루시킬 수 있다. 게다가, GPIbα는 α-트롬빈에 대한 고친화성의 결합 부위를 포함하는데, 이는 아직 충분히 정의되지 않은 메카니즘에 의해 혈소판 활성화를 촉진한다.

GPIbα의 N-말단 구형 도메인은 음전하 아미노산의 클러스터를 포함한다. 몇 가지 증거는 GPIb-IX 복합체를 발현하는 형질감염된 CHO 세포 및 혈소판 GPIbα에서, 이 도메인에 포함된 3개의 티로신 잔기(Tyr-276, Tyr-278 및 Tyr-279)가 황산화된다는 것을 암시한다.

단백질 황산화

단백질 황산화는 당 측쇄 또는 폴리펩티드 골격에 대한 설페이트의 효소적 공유 결합을 수반하는 일반적인 번역후 변형이다. 이 변형은 트랜스-골지 구획에서 발생한다. 황산화된 단백질은 분비성 단백질, 과립을 위해 표적화된 단백질 및 원형질막 단백질의 세포외 영역을 포함한다. 티로신은 현재 황산화되는 것으로 알려진 아미노산 잔기이다. Kehoe et al., Chem. Biol. 7: R57-61 (2000). 다른 아미노산, 예를 들어 트레오닌 역시, 특히 질병 세포에서 황산화될 수 있다.

다수의 단백질이 티로신 황산화되는 것으로 확인되었으나, GPIb에서 발견되는 것과 같은 단일 폴리펩티드 내의 3개 이상의 황산화된 티로신의 존재는 일반적인 것은 아니다. GPIbα(CD42)는 혈소판 및 거핵구에 의해 발현되며, vWF와의 결합을 통해 내피하층에 대한 혈소판의 부착 및 내피하층 상에서의 회전을 매개하며, 이는 또한 그 N-말단 도메인에 다수의 음전하를 포함한다. 그와 같은 높은 산성 및 친수성 환경은 황산화의 전제 조건인 것으로 생각되는데, 왜냐하면 티로실단백질 설포트랜스퍼라제는 산성 아미노산 잔기에 인접한 티로신을 특이적으로 인식하여 황산화시키기 때문이다(Bundgaard et al., J. Biol. Chem. 272: 21700-05 (1997)). GPIbα의 산성 부위의 완전한 황산화는 두드러진 음전하 밀도를 갖는 부위 - 19 아미노산 스트레치 내의 13 음전하 - 를 산출하며, 다른 단백질과의 정전기적 상호작용을 위한 후보 부위가 된다.

또한, 황산화된 N-말단 티로신은, 인간 및 원숭이 면역결핍증 바이러스(HIV-1, HIV-2 및 SIV)의 표적 세포로의 진입을 위해 관련된 7개의 경막 세그먼트(7TMS) 수용체와의 보조 수용체로서 작용하는 CC-케모카인 수용체, 예컨대 CCR5의 역할에 영향을 주는 것으로 생각된다. 예를 들어, 황산화된 N-말단 티로신은 CCR5의 MIP-1α, MIP-1β및 HIV-1 gp120/CD4 복합체에 대한 결합에 기여하고, HIV-1이 CCR5 및 CD4를 발현하는 세포로 진입할 수 있는 능력에 기여한다. 또 다른 중요한 HIV-1 보조 수용체인 CXCR4 역시 황산화된다(Farzan et al., Cell 96 (5): 667-76 (1999)). 티로신 황산화는 CCR-5 의존적 진입보다 CXCR4 의존적 HIV-1 진입에 있어서 덜 중요한 역할을 한다. 이로써, CXC-케모카인 패밀리 내의 티로신 황산화를 위한 가능한 역할을 입증하며, CCR5 및 CXCR4의 HIV-1 이용률에 있어서의 일반적인 차이를 분명히 보여준다(Farzan et al., J. Biol. Chem. 277 (33): 29,484-89 (2002)).

셀렉틴 및 PSGL-1

P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴은 다른 기능 중에서도 특히 혈관 내피 상에서의 백혈구의 회전을 매개하는 유착 분자 패밀리의 한 구성원이다. P-셀렉틴은 혈 소판 내에서 과립으로서 저장되며, 트롬빈, 히스타민, 포볼 에스테르, 또는 기타 자극성 분자에 의해 활성화된 후 표면으로 수송된다. P-셀렉틴은 활성화된 내피 세포에서도 발현된다. E-셀렉틴은 내피 세포에서 발현되며, L-셀렉틴은 호중구, 단핵구, T 세포 및 B 세포 상에서 발현된다.

PSGL-1(CD162로도 불림)은 GPIb와 구조적 유사성을 공유하는 P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴에 대한 뮤신 당단백질 리간드이다(Afshar-Kharghan et al. (2001), supra). PSGL-1은 PACE(Paired Basic Amino Acid Converting Enzymes; 쌍을 이루는 염기성 아미노산 전환 효소) 절단 부위를 갖는 이황화 결합 동형이량체이다. PSGL-1은 또한 3개의 잠재적인 티로신 황산화 부위, 이에 이어 프롤린, 세린 및 트레오닌이 많은 10∼16개의 10량체 반복 서열을 보유한다. PSGL-1의 세포외 부분은 N-결합 글리코실화 부위를 포함하며, 다수의 살리실화, 푸코실화된 O-결합 올리고당 분지를 포함한다(Moore et al., J. Biol. Chem. 118: 445-56 (1992)). N-글리칸 부위의 대부분과 O-글리칸 부위의 다수를 점유한다. 인간 HL-60 세포로부터의 PSGL-1의 O-글리칸의 구조는 결정되었다. 이러한 O-글리칸의 부분집합은 셀렉틴에 대한 결합에 요구되는 살리실화 및 푸코실화된 구조인 코어-2이다. PSGL-1의 아미노 말단 영역의 티로신 황산화 역시 P-셀렉틴 및 L-셀렉틴에 대한 결합에 요구된다. 또한, 아마도 번역후에 절단되는 것으로 생각되는 N-말단 프로펩티드도 존재한다.

PSGL-1은 HL60 세포 내에 361개의 잔기를 보유하는데, 267 잔기의 세포외 영역, 25 잔기의 경막 영역 및 69 잔기의 세포내 영역을 포함하며, 세포 표면 상에 이황화 결합된 동형이량체 또는 이형이량체를 형성한다(Afshar-Kharghan et al., Blood 97: 3306-12 (2001)). PSGL-1을 코딩하는 서열은 단일 엑손 내에 존재하여서 선택적 스플라이싱이 불가능해야 한다. 그러나, HL60 세포 및 대부분의 세포주 내의 PSGL-1은 세포외 영역에 존재하는 10 잔기 컨센서스 서열로 이루어진 15개의 연속 반복 서열을 가지며, 다만, 다형핵 백혈구, 단핵구, 및 대부분의 천연 백혈구를 포함하는 기타 몇 종의 세포주에서는 이러한 서열의 14개 및 16개의 반복 서열이 존재한다.

PSGL-1은 호중구 상에서 겉보기 분자량이 250 kDa 및 160 kDa인 이량체로서 발현되는 반면, HL60 상에서는 이량체 형태가 약 220 kDa이다. 환원 조건 하에 분석하였을 때, 각 서브유닛은 반으로 감소된다. 분자량의 차이는 상이한 수의 10량체 반복 서열의 존재에 의해 유발되는 분자 내의 다형성에 의한 것일 수 있다(Leukocyte Typing VI. Edited by T. Kishimoto et al. (1997)).

대부분의 혈액 백혈구, 예컨대 호중구, 단핵구, 백혈구, B 세포의 부분집단 및 모든 T 세포는 PSGL-1을 발현한다(Kishimoto et al. (1997), supra). PSGL-1은 활성화된 내피, 활성화된 혈소판, 기타 백혈구 및 염증성 부위에서 백혈구의 회전을 매개하며, P-셀렉틴 상에서의 호중구의 회전을 매개한다. PSGL-1은 또한 L-셀렉틴과의 결합에 의해 호중구-호중구 상호작용을 매개함으로써 염증을 매개한다(Snapp et al., Blood 91 (1) : 154-64 (1998)).

백혈구 회전은 염증에 있어서 중요하며, P-셀렉틴(활성화된 내피 및 혈소판 상에서 발현됨, 이는 손상 부위에서 고정화될 수 있음)과 PSGL-1 간의 상호작용은 혈관 벽 상의 백혈구의 고정 및 회전에 도움이 된다(Ramachandran et al., PNAS 98 (18): 10166-71 (2001); Afshar-Kharghan et al. (2001), supra). 세포 회전은 전이에 있어서도 중요하며, 내피 세포 상에서의 P-셀렉틴과 E-셀렉틴은 전이 세포에 결합함으로써 혈류로부터 주변 조직으로의 분출을 촉진하는 것으로 생각된다.

따라서, PSGL-1은 모든 백혈구: 호중구, 단핵구, 림프구, 활성화된 말초 T 세포, 과립구, 호산구, 혈소판 상에서 발견되었으며, 몇몇 CD34 양성 줄기 세포 및 특정한 B 세포 부분집단 상에서도 확인되었다. P-셀렉틴은 활성화된 혈소판 및 내피 세포 상에서 선택적으로 발현된다. P-셀렉틴과 PSGL-1 간의 상호작용은 혈관 벽 상에서의 백혈구의 회전을 촉진하며, 혈관 부위에서의 비정상적인 백혈구의 축적은 각종 병원성 염증을 초래한다. PSGL-1 상의 개별 티로신 설페이트의 입체 특이적인 기여는 PSGL-1에 대한 P-셀렉틴의 결합에 있어 중요하다. 전하 역시 결합에 있어 중요한데, NaCl을 낮추면(150 mM에서 50 mM으로) 결합을 증강시켰다(Kd ∼75 nM). PSGL-1 상의 티론신 황산화는 P-셀렉틴 상의 PSGL-1의 부착을 강화시키지만 이에 궁극적으로 요구되는 것은 아니다. PSGL-1 티로신 황산화는 모든 전단 속도에서 더 느린 회전 부착을 지지하며, 훨씬 더 빠른 전단 속도에서 회전 부착을 지지한다(Rodgers et al., Biophys. J. 81: 2001-09 (2001)). 뿐만 아니라, 혈소판 상에서의 PSGL-1 발현은 백혈구의 발현보다 25∼100배 더 낮다는 것이 제안되었다(Frenette et al., J. Exp. Med. 191(8): 1413-22 (2000)).

인간 PSGL-1에 대한 시판되는 모노클로널 항체인 KPL1은 PSGL-1과 P-셀렉틴 및 PSGL-1과 L-셀렉틴 간의 상호작용을 억제하는 것으로 나타났다. KPL1 에피토프 는 PSGL-1의 티로신 황산화 영역(YEYLDYD)에 맵핑되었다(Snapp et al., Blood 91(1): 154-64 (1998)).

시알릴화, 푸코실화된 뮤신 리간드를 제거하는 O-시알로글리코프로테아제로 종양 세포를 전처리하는 것 역시 종양 세포-혈소판 복합체 형성을 억제하였다. 시험관내 실험에 의하면 이들 처리 중 어느 것이나 더 많은 단핵구가 순환하는 종양 세포와 결합하도록 하며, 이는 혈소판 결합을 감소시키는 것이 순환하는 종양 세포에 대한 면역 세포의 접근을 증가시킨다는 것을 시사한다(Varki and Varki, Braz. J. Biol. Res. 34(6): 711-17 (2001)).

피브리노겐

정상적인 인간 피브리노겐은 두 가지 형태 - 정상(γ) 및 γ프라임이 있으며, 이들 각각은 정상적인 개체에서 발견된다. 보다 풍부한 형태(신체에서 발견되는 총 피브리노겐의 약 90%)인 정상 피브리노겐은 두 개의 동일한 55 kDa α사슬, 두개의 동일한 95 kDa β사슬 및 두 개의 동일한 49.5 kDa γ사슬로 이루어진다. 정상적인 변형 피브리노겐은 보다 덜 풍부한 형태(신체에서 발견되는 피브리노겐의 약 10%)이며, 두 개의 동일한 55 kDa α사슬, 두 개의 동일한 95 kDa β사슬, 한 개의 49.5 kDa γ사슬 및 한 개의 변형 50.5 kDa γ프라임 사슬로 이루어진다. 감마 및 감마 프라임 사슬은 둘 다, 3' 말단에서 선택적 스플라이싱이 일어나는, 동일한 유전자에 의해 코딩된다. 정상적인 감마 사슬은 아미노산 1-411로 이루어지며, 정상적인 변형 감마 프라임 사슬은 427 아미노산으로 이루어지는데, 이 중에서 아미노산 1-407은 정상 감마 사슬의 것과 동일하고, 아미노산 408-427은 VRPEHPAETEYDSLYPEDDL이다. 이 영역은 정상적으로는 트롬빈 분자에 의해 점유된다.

피브리노겐은 이온화된 칼슘 존재 하에 트롬빈의 작용에 의해 피브린으로 전환되어 혈액의 응고를 유발한다. 피브린은 또한 혈전 및 급성 염증성 삼출액의 한 성분이다.

목적

본 발명의 목적은 세포 회전, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응 및 전이와 같은 과정에 기여하나, 유착, 혈전증 및/또는 재발협착증 및 응집과 같은 과정에는 관여하지 않는 다양한 분자 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체, 이의 단편 또는 이의 복합체를 제공하는 것으로서, 상기 에피토프는 질병 세포, 예를 들어 AML 세포, T-ALL 세포, 프리-B-ALL 세포, B-백혈병 세포, B-CLL 세포, 다발성 골수종 세포 및 전이 세포 상에 존재한다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 회전, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응 및 전이의 억제를 위한 의약(유착, 혈전증 및/또는 재발협착증 및 응집에는 관여하지 않음), AML, T-ALL, B-백혈병, B-CLL, 프리-B-ALL, 다발성 골수종, 전이, 심혈관 질환(예, 심근경색), 망막병증, 황산화된 티로신 의존적 단백질-단백질 상호작용에 의해 유발되는 질환, 또는 상기한 세포 기능 또는 작용이 중요한 역할을 하는 기타 질환의 치료를 위한 의약을 개발하고 제공하는 데 있어서 상기한 항체를 사용하는 용도를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 AML, T-ALL, B-백혈병, B-CLL, 프리-B-ALL, 다발성 골수종, 전이, 또는 세포 회전, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이와 같이 그러한 세포 기능 또는 작용이 중요한 역할을 하는 기타 질환과 같은, 개체의 다양한 질환 상태를 진단하거나, 예후를 판정하거나 또는 병기를 결정하는 방법에 있어서 상기 항체를 이용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항체를 투여함으로써 ADCC를 활성화하거나 NK 또는 T 세포를 자극하는 방법을 제공하는 것이다.

본원에서는 본 발명의 이와 같은 목적이 제공된다.

발명의 개요

본 발명은 서열 번호 1의 scFv 항체 단편의 결합 능력을 갖는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 항체 또는 이의 결합 단편이 서열 번호 2의 제1 초가변 부위, 서열 번호 3의 제2 초가변 부위 및/또는 서열 번호 4의 제3 초가변 부위를 갖는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 바람직하게는 PSGL-1의 에피토프에 결합하거나 이와 교차 반응한다. 또한, 바람직하게는 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 T-ALL, AML, B-백혈병, B-CLL 및 다발성 골수종 백혈병 세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 유형 상의 에피토프에 결합한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 결합 단편에 결합하는 아미노산 서열을 갖는 분리된 에피토프를 제공한다. 바람직하게는, 분리된 에피토프는 성숙 PSGL-1의 아미노산 1∼17 사이에 위치하며, 성숙 PSGL-1은 음전하 아미노산의 클러스터 내에 존재한다.

그러한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법 역 시 제공한다. 세포 회전의 억제 또는 치료; 염증의 억제 또는 치료; 자가면역 질환의 억제 또는 치료; 감염(예, HIV와 같은 바이러스 감염)의 억제 또는 치료; 전이의 억제 또는 치료; 종양 세포의 성장 및/또는 복제의 억제 또는 치료; 종양 세포의 사멸률의 증가; 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제의 억제; 백혈병 세포의 사멸률의 증가; 항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성의 변화; 항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포의 감수성의 증가; 항백혈병제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성의 증가; 종양을 가진 환자에서의 종양 세포수 증가의 억제; 암 환자에서의 종양 세포수의 감소; 백혈병 환자에서의 백혈병 세포수의 증가 억제; 및 백혈병 환자에서의 백혈병 세포수의 감소와 관련된 병태를 포함하여 다양한 병태를 치료하기 위해 그러한 약학 조성물을 사용하는 방법이 제공된다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 사용하여 ADCC를 유도하거나 NK 또는 T 세포를 자극하는 다른 방법도 제공된다.

본 발명은 또한 환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하고, 환자 유래의 세포를 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드와 함께 항온처리함으로써 환자로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다.

정의

항체(Ab), 또는 면역글로불린(Ig)는 항원에 결합하는 단백질 분자이다. 자연 발생 항체의 각 기능성 결합 단위는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 4개의 폴리펩티드 사슬(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진다. 각 사슬은 불변 부위 및 가변 부위를 갖는다. 자연 발생 항체는 그 중쇄 성분에 기초하여 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함하는 몇 가지 부류로 분류될 수 있다. IgG 부류는 IgG₁, IgG₂, IgG₃, 및 IgG₄를 비롯하여 몇 개의 하위 부류를 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 면역글로불린은 B 림프구에 의해 생체내에서 생산되며, 그러한 각 분자는 특정 외부 항원성 결정 인자를 인식하고, 그 항원의 제거를 촉진한다.

항체는 항체 복합체를 비롯하여 여러 형태로 생성되어 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체 복합체" 또는 "항체 복합체들"이란 하나 이상의 항체와 다른 항체의 복합체, 또는 하나 이상의 항체와 항체 단편(들)의 복합체, 또는 2 이상의 항체 단편의 복합체를 의미하는 것으로 사용된다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, F(ab')₂, Fc, 및 Fd 단편을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "항체 또는 이의 단편"이란 용어는 항체 복합체 또는 항체 복합체들을 포함한다.

본 명세서 및 청구의 범위에서 사용되는 Fv는 같거나 다를 수 있는, 인간 항체의 중쇄의 가변 부위 및 인간 항체의 경쇄의 가변 부위로 이루어진 분자로서, 이때, 중쇄의 가변 부위는 경쇄의 가변 부위에 연결되거나, 결합되거나, 융합되거나 또는 공유 결합되거나, 또는 이와 회합된다. Fv는 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이황화 안정화된 Fv(dsFv)일 수 있다. scFv는 가요성 아미노산 폴리펩티드 스페이서 또는 링커에 의해 결합된, 항체의 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인으로 이루어진다. 링커는 분지될 수도 있고 비분지될 수도 있다. 바람직하게는, 링커는 0∼15 아미노산 잔기이며, 가장 바람직하게는 링커는 (Gly₄Ser)₃이다.

Fv 분자 자체는 제1 사슬 및 제2 사슬로 이루어지며, 각 사슬은 제1, 제2 및 제3의 초가변 부위를 갖는다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 내의 초가변 루프는 상보성 결정 부위(CDR)라 칭한다. 중쇄 및 경쇄 각각에는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 부위가 존재한다. 이들 부위는 항원 결합 부위를 형성하는 것으로 생각되며, 강화된 결합 활성을 나타내도록 특이적으로 변형될 수 있다. 이들 부위 중 자연적으로 가장 가변성이 큰 부위는 중쇄의 CDR3 부위이다. CDR3 부위는 Ig 분자의 가장 노출된 부위인 것으로 이해되며, 본원에서 제시하는 바와 같이, 관찰되는 선택적 및/또는 특이적 결합 특성에 가장 많이 기여하는 부위이다.

Fv 분자의 단편은 원형(original) Fv의 선택적 및/또는 특이적인 결합 특성을 여전히 보유하는 원형 Fv보다 작은 임의의 분자로서 정의된다. 그러한 단편의 예로는 비제한적으로 (1) Fv의 중쇄의 단편만으로 이루어진 미니바디, (2) 항체 중쇄 가변 부위의 작은 부분 단위를 포함하는 마이크로바디(국제 출원 PCT/IL99/00581), (3) 경쇄의 단편을 갖는 더 작은 바디, 및 (4) 경쇄 가변 부위의 기능성 단위를 갖는 유사한 바디를 포함한다. Fv 분자의 단편은 실질적으로 원형 또는 루프형의 폴리펩티드일 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용되는 용어 "Fab 단편"은 면역글로불린의 1가 항원 결합 단편이다. Fab 단편은 경쇄와, 중쇄의 일부분으로 이루어진다.

F(ab')₂ 단편은 펩신 분해에 의해 얻어지는 면역글로불린의 2가 항원 결합 단편이다. 이것은 양 경쇄와, 양 중쇄의 일부분을 포함한다.

Fc 단편은 면역글로불린의 비-항원 결합 부분이다. 이것은 중쇄의 카르복시 말단 부분 및 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함한다.

Fd 단편은 면역글로불린의 중쇄의 가변 부위 및 제1 불변 부위이다.

폴리클로널 항체는 면역 반응의 산물이며, 다수의 상이한 B 림프구에 의해 형성된다. 모노클로널 항체는 하나의 클론성 B 세포로부터 유래된다.

폴리펩티드에 대해 적용되고 본 발명에서 정의되는 바와 같은 카세트는 프레임워크로서 작용하는 소정의 연속 아미노산 서열을 의미하며, 단일 단위로서 간주되고 단일 단위로서 조작된다. 아미노산은 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다. 마찬가지로, 아미노산의 스트레치는 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다.

"에피토프"란 용어는 본원에서 항체, 항체 단편, 항체 복합체 또는 이의 결합 단편을 갖는 복합체 또는 T 세포 수용체와 상호작용하는 항원 결정 인자 또는 인식 부위 또는 항원 부위를 의미하는 것으로 사용된다.

선택성이란, 실체 또는 실체 상태의 혼합물로부터 하나의 실체 또는 세포 상태를 선택하여 결합하는 표적화 분자의 능력으로서 정의되며, 상기의 모든 실체 또는 실체 상태는 표적화 분자에 대해 특이적일 수 있다.

본원에서 사용되는 "친화력(affinity)"이란 결합 분자(예, 항체 상의 한 결합 부위)와 리간드(예, 항원 결정 인자) 간의 결합 강도(결합 상수)의 척도이다. 항체 상의 단일 항원 결합 부위와 단일 에피토프 간의 비공유 상호작용의 총 합의 강도는 그 에피토프에 대한 항체의 친화력이다. 저친화성 항체는 항원에 약하게 결 합하여 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 항원에 보다 강하게 결합하여 더 오랫동안 결합된 상태로 유지된다. "결합력(avidity)"이란 항체-항원 상호작용의 수가(valence)를 반영하기 때문에 친화력과는 다르다.

항체-항원 상호작용의 특이성: 항원-항체 반응은 특이적이지만, 어떤 경우에는 한 항원에 의해 유도된 항체는 다른 무관한 항원과 교차반응할 수 있다. 그러한 교차 반응은 두 개의 상이한 항원이 상동성 또는 유사한 구조, 에피토프, 또는 이의 고정 영역을 공유하는 경우나, 또는 한 에피토프에 특이적인 항체가 유사한 구조 배좌 또는 화학적 특성을 보유하는 무관한 에피토프에 결합하는 경우에 발생한다.

혈소판은 골수강에 방출되어 그 후 말초 혈류에서 순환하는 거핵구의 원형 세포질 단편이다. 혈소판은 응혈 과정에서의 주요 역할을 비롯하여 몇 가지 생리학적인 기능을 보유한다. 혈소판은 중심부에 위치한 과립 및 말초의 투명한 원형질을 포함하지만, 뚜렷한 핵은 갖고 있지 않다.

본원에서 사용되는 유착은 현탁된 박테리아, 세포, 디스크 또는 기타 유사한 크기의 입자들이 부착되어 덩어리를 형성하는 과정을 의미한다. 이 과정은 침전과 유사하지만, 입자들은 더 크고 용액보다는 현탁액으로 존재한다.

응집이란 용어는 시험관내에서 유도된 혈소판의 덩어리지는 현상을 의미하며, 트롬빈 및 콜라겐은 순차적 메카니즘의 일부로서 혈전 또는 지혈 플러그의 형성을 유도한다.

보존적 아미노산 치환은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 단편의 하나 또는 두 개의 아미노산을 변화시키는 것에 의한 아미노산 조성의 변화로서 정의된다. 치환은 대체로 유사한 성질(예, 산성, 염기성, 방향성, 크기, 양전하 또는 음전하, 극성, 비극성)을 갖는 아미노산에 대해 이루어지며, 이러한 치환은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 특성(예, 전하, 등전점, 친화력, 결합력, 배좌, 가용성) 또는 활성을 실질적으로 변화시키지 않도록 이루어진다. 그러한 보존적 아미노산 치환을 위해 수행될 수 있는 전형적인 치환은 다음과 같은 아미노산의 군 중에서 이루어질 수 있다.

글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 루신(L) 및 이소루신(I)

아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)

알라닌(A), 세린(S) 및 트레오닌(T)

히스티딘(H), 리신(K) 및 아르기닌(R)

아스파라긴(N) 및 글루타민(Q)

페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)

보존적 아미노산 치환은, 예를 들어 분자의 선택적 및/또는 특이적 결합 특성의 주된 원인이 되는 초가변 부위에 측접한 부위뿐 아니라, 예를 들어 가변 중쇄 카세트와 같은 분자의 다른 부분에서 이루어질 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 변형은 전체 크기의 항체, 디아바디(이량체), 트리아바디(삼량체) 및/또는 테트라바디(사량체)를 형성하기 위해 또는 미니바디 또는 마이크로바디를 형성하기 위해 분자를 재구성함으로써 수행될 수 있다.

파지미드는 플라스미드 DNA를 보유하는 파지 입자로서 정의된다. 파지미드는 필라멘트형 파지, 예컨대 fd의 m13으로부터의 복제 기점을 포함하도록 디자인된다. 이것은 플라스미드 DNA를 보유하기 때문에 파지미드 입자는 파지 게놈의 완전한 보체를 포함하기 위한 충분한 공간을 보유하고 있지 않다. 파지 게놈으로부터 유실된 성분은 파지 입자를 패키징하는 데 필수적인 정보이다. 따라서 파지를 증폭시키기 위해서는, 유실된 패키징 정보를 보완하는 헬퍼 파지 종과 함께 원하는 파지 입자를 배양할 필요가 있다.

프로모터는 RNA 폴리머라제가 결합하여 전사를 개시시키는 DNA 상의 영역이다.

파지 디스플레이 라이브러리(파지 펩티드/항체 라이브러리, 파지 라이브러리, 또는 펩티드/항체 라이브러리라고도 함)는 대형 파지 집단(10⁸ 이상)을 포함하며, 각 파지 입자는 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 나타낸다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드 단편은 다양한 길이가 되도록 작제할 수 있다. 나타내어진 펩티드 또는 폴리펩티드는 인간 항체 중쇄 또는 경쇄로부터 유래될 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.

약학 조성물이란 본 발명의 항체 또는 펩티드 또는 폴리펩티드와 이의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제, 또는 항체-약제(항체-제제) 복합체와 이의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제형을 의미한다.

제제란, 인간, 소, 말, 돼지, 쥐, 개, 고양이 또는 임의의 기타 온혈 동물을 비롯하여(이에 국한되는 것은 아님) 포유동물의 활성 질환의 치료, 예방적 치료 또 는 진단에 유용한 제제를 의미한다. 제제는 방사능 동위원소, 독소, 약제, 올리고뉴클레오티드, 재조합 단백질, 항체 단편, 항암제, 항유착제, 항혈전제, 항재발협착제, 항자가면역제, 항응집제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택된다. 그러한 제제의 다른 예는 비제한적으로 아시클로비어, 간시클로비어 및 지도부딘을 포함하는 항바이러스제; 실로스타졸, 달테파린 나트륨, 레비파린 나트륨 및 아스피린을 포함하는 항혈전제/항재발협착제; 잘토프로펜, 프라노프로펜, 드록시캄, 아세틸 살리실릭 17, 디클로페낙, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 설린닥, 나프록센, 암톨메틴, 셀레콕시브, 인도메타신, 로페콕시브 및 니메술리드를 포함하는 항염증제; 레플루노마이드, 데닐루킨 디프티톡스, 수브레움, WinRho SDF, 데피브로타이드 및 시클로포스파마이드를 포함하는 항자가면역제; 리마프로스트, 클로크로멘 및 히알루론산을 포함하는 항유착제/항응집제로 이루어진 군에서 선택된다.

항백혈병제는 항백혈병 활성을 가진 제제이다. 예를 들어, 항백혈병제는 백혈병 세포 또는 미성숙 예비 백혈병 세포의 성장을 억제 또는 중지시키는 제제, 백혈병 또는 예비 백혈병 세포를 사멸시키는 제제, 다른 항백혈병 제제에 대한 백혈병 또는 예비 백혈병 세포의 감수성을 증가시키는 제제 및 백혈병 세포의 전이를 억제하는 제제를 포함한다. 본 발명에서는, 항백혈병제는 또한 종양의 혈관형성을 예방, 억제, 지연 또는 중지시키는 항혈관신생 활성을 갖는 제제일 수 있다.

유전자의 발현 패턴은 특정한 시간에 다양한 조건 하에 다양한 조직에서 생성되는 유전자 생성물의 양을 분석함으로써 연구할 수 있다. 유전자는 유전자 생성 물의 양이 정상 대조군, 예를 들어 비질환 대조군에서 발견되는 것보다 많은 경우에 "과발현"되는 것으로 간주된다.

소정의 세포는 소정의 항체에 대한 결합 부위(또는 에피토프)를 갖는 단백질을 그 표면에 발현할 수 있으나, 그 결합 부위는 제1 기(I기)라 불리기도 하는 상태의 세포에서 잠재 형태(cryptic form)로 존재할 수 있다(예를 들어, 항체에 의해 공간적으로 방해 또는 차단되거나, 항체에 의한 결합에 필요한 특징이 결여됨). I기는, 예를 들어 정상적 상태, 건강한 상태, 비질환 상태일 수 있다. 에피토프가 잠재 형태로 존재하는 경우, 이것은 소정의 항체에 의해 인식되지 않는데, 즉, I기에서는 이 에피토프 또는 소정의 세포에 대한 항체의 결합이 존재하지 않는다. 그러나, 에피토프는, 예를 들어 스스로 변형을 겪거나 차단이 해제됨으로써 노출될 수 있는데, 왜냐하면 가까이 있거나 결합된 분자들이 변형되거나 또는 부위가 배좌 변화를 겪기 때문이다. 변형의 예로는 폴딩의 변화, 번역후 변형의 변화, 포스포리피데이션의 변화, 황산화의 변화, 글리코실화의 변화 등을 포함한다. 그러한 변형은 세포가 제2 기(II기)라 불리는 다른 상태로 진입할 때 발생할 수 있다. 제2 상태 또는 제2 기의 예는 활성화, 증식, 형질전환을 포함하거나 또는 악성 상태로 존재할 수 있다. 에피토프는 변형되면 노출될 수 있고 항체가 결합할 수 있다.

펩티도-모의체(펩티드 모의체)는 아미노산 간에 임의의 펩티드 결합, 즉, 아미드 결합을 더 이상 포함하지 않는 분자(예, 항체)이다. 그러나, 본 발명에서, 펩티드 모의체란 용어는 자연적으로는 더 이상 완전한 펩티드가 아닌 분자, 예컨대 유사 펩티드, 반펩티드 및 펩토이드를 포함하는 것이다. 완전한 비-펩티드이든 부 분적인 비-펩티드이든지 간에, 본 발명에 따른 펩티드 모의체는 펩티드 모의체의 기초를 이루는 펩티드 내의 활성 기의 3차원적 배열과 매우 유사한 반응성 화학적 부분의 공간적 배열을 제공한다. 이러한 분자들은 작은 분자, 지질, 다당류 또는 이들의 접합체를 포함한다.

도 1은 T-ALL의 TM3.13 scFv 염색 후의 FACS 분석을 도시한다.

도 2는 세척된 혈소판 또는 PRP의 대조군 응집의 백분율로서 나타낸, scFv 항체 존재 하의 혈소판 응집의 발광응집측정기(Lumiaggregometer) 분석의 수치 데이터 결과를 나타낸다.

도 3은 혈소판에 대한 다양한 scFv의 결합을 비교한 FACS 분석을 나타낸다: 도 3A는 AN51-PE(FSC)이고, 도 3B는 AN51-PE(FL2-H)이고, 도 3C는 음성 대조군이고, 도 3D는 Y1-myc+이고, 도 3E는 Y1이고, 도 3F는 L32이고, 도 3G는 TM1.1이다.

도 4는 scFv 항체(NO1, Y1-myc+, 및 L32)가 다양한 농도의 KG-1 세포에 대한 표지된 Y1 항체의 결합과 경쟁하고 이를 방해하는 능력을 비교한 FACS 분석을 도시한다: 도 4A는 0 ng이고, 도 4B는 100 ng이고, 도 4C는 250 ng이고, 도 4D는 500 ng이고, 도 4E는 1000 ng이고, 도 4F는 2500 ng이고, 도 4G는 5000 ng이다.

도 5는 scFv 항체(NO1, Y1-myc+, 및 L32)가 KG-1 세포에 대한 표지된 Y1 항체의 결합과 경쟁하고 이를 방해하는 능력을 비교한 FACS 분석의 수치 데이터 결과를 도시한다.

도 6은 글리코칼리신에 대한 다양한 농도의 scFv 항체(TM1.1, Y1-myc+, Y1, 및 L32)의 결합의 비교를 제시하는 ELISA 분석의 수치 데이터 결과를 도시한다.

도 7은 KG-1 및 Raji 세포로부터의 GC, 원형질 및 막 단백질에 대한 L32 및 Y1 scFv 항체의 웨스턴 분석을 도시한다.

도 8은 피브리노겐, PSGL-1 및 GPIbα관련 펩티드에 대한 scFv 항체(Y1-myc+, TM1.1, 및 L32)의 결합의 비교를 제시하는 ELISA 분석의 수치 데이터 결과를 도시한다.

도 9는 다양한 농도의 GPIb 유래 펩티드 존재 하에, Y17 scFv 항체로 혈소판을 염색한 후의 FACS 분석의 수치 데이터 결과를 도시한다. 결과는 scFv 항체만을 사용하여 얻은 반응의 기하 평균의 감소율(%)로서 제시된다.

도 10은 다양한 상이한 위치에서 황산화된 PSGL1에 대한 Y1 및 Y17 scFv 항체의 결합 후의 ELISA 분석의 수치 데이터 결과를 도시한다.

도 11은 각 scFv 항체의 농도의 함수로서 나타낸, T-ALL 및 정상 말초 혈액 세포(N-PBL)에 대한 scFv 항체(도 11A는 TM1.1이고, 도 11B는 TM1.3이고, 도 11C는 L32임)의 결합의 비교를 제시하는 FACS 분석의 수치 데이터 결과를 도시한다.

도 12는 SCID 마우스-Molt4 세포 종양 모델에서 간 중량(도 12A) 및 종양 확산(도 12B)에 대한 L32 및 Y1 scFv 항체 투여의 효과를 분석한 생체내 분석의 수치 데이터 결과를 도시한다.

본 발명은 PSGL-1에 결합하는 서열 번호 1의 scFv 항체 단편의 능력을 보유하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 이러한 항체는 서열 번호 1과 유사한 결합 친화력을 갖는다. 서열 번호 1의 scFv 단편은 L32로 명명하였다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 항체는 L32이다. 이러한 항체는 백혈병 세포 표면 결정 인자를 인식하는 특이적 항체를 선별하기 위하여 백혈병 세포에 대하여, 중쇄 CDR3 부위에서만 다양성을 갖는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정하였으며, 이때 특이적 수용체는 이전에 공지되었거나 규명되지 않은 것이다. 이와 동일한 방법을 이용하여 다른 항체 L31을 동정하였다. 본 발명은 다수의 항체를 포함하지만, 이하에서는 L32를 예시적으로 사용할 것이다.

종래에, 백혈병 세포에 결합하는 다른 항체가 동일한 파지 라이브러리를 사용하여 미국 출원 제10/032,423호; 제10/032,037호; 제10/029,988호; 제10/029,926호; 제09/751,181호; 및 제60/258,948호 및 국제 출원 PCT/US01/49442 및 PCT/US01/49440에서 확인되었다. 상기 출원에 개시된 항체의 구체적인 예로는 Y1 및 Y17 항체를 포함한다. 상기 출원에 개시된 항체는 N-말단 티로신에서 황산화된, 조혈 세포의 단백질 상에서 발견되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 발견되었으며, 세포 이동, 예를 들어 종양 전이에 관여하는 것으로 생각된다.

L32 항체 및 Y1/Y17 출원에 개시된 항체 둘 다 백혈병 세포에 결합하지만, L32는 Y1보다 약 4배 이상 더 큰 친화력으로 백혈병 세포에 결합한다. 이러한 사실과 항체가 일반적인 생식선(DP32)으로부터 분리되었다는 사실을 토대로 하여, 이들 개개의 결합 에피토프 간의 상관성을 결정하기 위해 비교 연구가 수행되었다. 이어서, L32가 Y1/Y17과 동일한 황산화된 에피토프에 결합하는 것으로 확인되었다. Y1/Y17 에피토프는 혈소판 상에 특이적으로 존재하기 때문에, 발현 수준이 백혈구 의 발현 수준보다 25∼100배 더 낮음에도 불구하고(Frenette et al., J. Exp. Med. 191 (8): 1413-22 (2000)), 혈소판에 대한 L32의 결합 역시 평가하였다. 그러나, L32만이 혈소판에 무시할 정도로 결합할 뿐만 아니라 혈소판 응집에 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다. Y1 scFv 및 IgG를 L32 scFv 및 IgG와 비교한 결과를 요약한 것을 하기 표 1에 기재한다.

	Y1 scFv	Y1 IgG	L32 scFv	L32 IgG
WBC 결합	낮음	높음	높음	매우 높음
백혈병 세포 결합	낮음	높음	높음	매우 높음
PSGL-1 반응성	낮음	높음	높음	매우 높음
KPL1과의 경쟁	약간	유	유	유
혈소판 결합	높음	높음	낮음 - 무	낮음 - 무
혈소판 응집	억제	유도	영향 없음	-
GPIb 반응성	결함	결합	매우 낮음 - 무	매우 낮음 - 무
원형질 성분	피브리노겐γ 프라임 CCF4	피브리노겐γ 프라임 CCF4	검출되지 않음	매우 낮음 - 무
시험관내 효과	검출되지 않음	ADCC	검출되지 않음	ADCC

Y1/Y17에 대한 결합으로서 이전에 확인된 황산화된 에피토프는, 바람직하게는 2 이상의 산성 아미노산의 클러스터 내의 황산화된 부분, 예컨대 황산화된 티로신 잔기 또는 황산화된 탄수화물 또는 지질 부분의 존재를 특징으로 하며, 이는 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이, 유착, 혈전증 및/또는 재발협착증, 세포 회전 및 응집과 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하는 리간드 및 수용체 상에서 발견된다. 그러한 에피토프는 질병 세포, 예를 들어 B-백혈병 세포, B-CLL 세포, AML 세포, 다발성 골수종 세포, 및 전이 세포 상에서도 발견된다. 이러한 에피토프는 이러한 과정의 치료적 중재와, 병기 결정을 비롯하여 진단 또는 예후 판정 절차를 위한 유용한 표적이다.

L32 scFv는 황산화된 PSGL-1에 대한 증가된 선택성을 갖는다. 염증에 관여하는 백색 세포, 예를 들어 단핵구, 호중구 및 림프구는 아테롬성 동맥경화증과 같은 질환의 염증 진행에 주로 4종의 유착 분자, PSGL-1, P-셀렉틴, VLA-4, 및 VCAM-1에 의해 참여하게 된다(Huo and Ley, Acta Physiol. Stand, 173: 35-43 (2001); Libby, Sci. Ans. May: 48-55 (2002); Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 38: 577-582 (2001)). 이러한 중심 분자 중 어느 하나에 의한 L32의 방해는 관련된 질환을 해결하는 데 있어서의 L32의 잠재적 역할을 시사할 수 있다. 구체적으로, P-셀렉틴은 세포 부착 및 회전을 제어한다. 또한, P-셀렉틴-PSGL-1 상호작용은 종양발생(악성 세포와 관련되었을 때) 및 염증성 반응(백혈구와 관련되었을 때)과 필수적으로 연관된 세포 표면 상의 다수의 다른 분자를 활성화시킨다(Shebuski and Kilgore, J. Pharmacol. Exp. Cher. 300: 729-735 (2002)). P-셀렉틴이 세포 과정을 조절할 수 있는 능력에 대한 이와 같은 이해에 기초하면, 황산화된 PSGL-1에 대한 강화된 L32 scFv 선택성은 이 분자를 다양한 악성 및 염증성 질환을 치료하기 위한 우수한 분자로 만들 수 있음이 분명하다. 게다가, 악성 질환의 모델은, 악성 세포에 대한 P-셀렉틴의 결합은 PSGL-1의 황산화를 필요로 한다는 것을 보여주었다(Ma and Geng, J. Immunol. 168: 1690-1696 (2002)). 이러한 요건은 L32 결합에 대한 요건과 유사하다. 따라서, L32가 진행성 악성 질환의 P-셀렉틴 촉진을 파괴할 수 있음을 예측할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 이러한 항체들은 세포의 발달 단계에 의존적이다 (AML 아형은 통상적인 처리 및 세포화학적 염색에 의해 관찰된 형태를 이용하여 프렌치-아메리칸-브리티시 시스템에 기초하여 분류됨): 이 항체는 아형 M3 또는 이보다 높지만, M0 또는 M1 아형 세포는 아닌 AML 세포에 결합한다. 또한, 이 항체는 M2 아형 세포에 결합할 수도 하지 않을 수도 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 정상적이고 건강한 골수(예, CD34+ 세포)에는 결합하지 않는다. 그러한 차이는 PSGL-1 발현 및/또는 황산화에 있어서의 변경뿐 아니라, 약간 다른 에피토프를 노출시키는 PSGL-1 내의 가능한 배좌적 변화에 기초한 것으로 생각된다.

바람직하게는, 본 발명의 L32 항체는 PSGL-1과 같은, 염증에 관여하는 다양한 분자 또는 에피토프에 결합한다. 또한 바람직하게는, L32 항체는 T-ALL 세포, AML 세포, 및 B-백혈병 세포를 비롯하여 염증 및 종양발생에 관여하는 하나 이상의 세포 유형 상에 존재하는 에피토프에 결합한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 L32 항체는 지질, 탄수화물, 펩티드, 당지질, 당단백질, 지단백질 및/또는 지다당류 분자 상의 에피토프에 결합한다. 대안으로, 그러나 역시 바람직하게는, L32 항체는 2 이상의 에피토프와 교차 결합하며, 각 에피토프는 하나 이상의 황산화된 티로신 잔기 및 2 이상의 산성 아미노산의 하나 이상의 클러스터를 보유하는데, 클러스터의 한 예가 PSGL-1이다.

세포 표면 상에 존재하는 PSGL-1에 결합한 후, 본 발명의 항체 또는 이의 단편 중 일부는 세포 내로 흡수될 수 있다. 일반적으로, 완전한 IgG 항체는 흡수되는 반면, 유사한 항체 단편(예, scFv)은 흡수되지 않는다. 항체는, 예를 들어 AML 세포를 비롯하여 PSGL-1을 발현하는 임의의 세포로 흡수될 수 있다. 그러한 흡수는 방식, 시간 및 온도 의존적인 능동적 과정인 엔도사이토시스를 통해 일어날 수 있다.

본 발명의 L32 항체의 초가변 부위는 항원 결합 부위를 형성하는 데 참여한다. 항원 결합 부위는 항체가 결합하는 에피토프의 구조에 상보적이며, 이에 따라 이러한 결합 부위는 상보성 결정 부위(CDR)라 불린다. 항체의 각 경쇄 및 중쇄 상에는 3개의 CDR(CDR1, CDR2, 및 CDR3)이 존재하는데, 이들 각각은 V_H 및 V_L 도메인의 β가닥을 연결하는 루프 상에 위치한다. 이들 영역 중 가장 가변성이 큰 영역은 중쇄의 CDR3 부위이다. CDR3 부위는 Ig 분자의 가장 노출된 영역이며, 본원에서 제시하는 바와 같이, 관찰되는 선택적 및/또는 특이적 결합 특성을 결정하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 이해된다.

파지 디스플레이 라이브러리에 존재하는 49 생식선 중 하나인 DP32는 본 발명의 scFv 항체를 분리해 낸 파지 라이브러리의 특정한 생식선이다. 따라서, DP32는 본 발명의 항체에 적어도 중쇄 및 경쇄 프레임워크 가변 부위, 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 부위, 및/또는 중쇄 CDR1 및 CDR2를 제공한다. DP32는 또한 초가변 부위가 정합되는 3차원 구조를 제공한다. 항체의 특이성은 3차원적 배좌에 의해 결정되는 것으로 널리 공지되어 있다. 따라서, DP32에 의해 부여되는 제약은 L32 항체의 특이성을 결정하는 데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 게다가 DP32는 다양한 하전된 아미노산을 갖는데, 이는 L32 항체 인식에 있어서 구조적 역할을 할 수 있다.

본 발명에 따르면, CDR은 항체를 생산하기 위한 카세트에 삽입될 수 있다. 폴리펩티드에 대해 적용되고 본 발명에서 정의되는 바와 같은 카세트는 프레임워크로서 작용하는 소정의 연속 아미노산 서열을 의미하며, 단일 단위로서 간주되고 단일 단위로서 조작된다. 아미노산은 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다. 마찬가지로, 아미노산의 스트레치는 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다.

카세트의 아미노산 서열은 표면상으로는 고정될 수 있지만, 치환, 삽입 또는 부착된 서열은 가변성이 클 수 있다. 카세트는 몇 개의 도메인으로 이루어질 수 있으며, 각각의 도메인은 최종 작제물에 있어서 중요한 기능을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예의 카세트는 N-말단에서부터 프레임워크 영역 1(FR1), CDR1, 프레임워크 영역 2(FR2), CDR2, 프레임워크 영역 3(FR3), 및 프레임워크 영역 4(FR4)를 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서, 카세트 내의 상이한 영역들을 치환하는 것이 가능하다. 예를 들어, 카세트의 CDR2 및 CDR1 초가변 부위는 비보존적, 또는 바람직하게는 보존적 아미노산 치환으로 치환되거나 변형될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 항체 또는 이의 단편은 중쇄 및 경쇄를 보유하며, 각 사슬은 제1, 제2 및 제3의 초가변 부위를 가지는데, 이는 각각 CDR3, CDR2, 및 CDR1 부위이다. 특히, 한 사슬의 CDR3 부위, 경쇄의 CDR3 부위 또는, 바람직하게는 중쇄의 CDR3 부위, 보다 바람직하게는 중쇄 및 경쇄 CDR3 부위 둘 다 결합 선택성 및 특이성을 결정한다. 부차적으로, 결합 선택성 및 특이성은 경쇄, 바람직하게는 중쇄의 CDR2 및 CDR1 부위에 의해 결정된다. 제1, 제2 및/또는 제3의 초가변 부위에 측접한 상류 또는 하류 영역 역시 부차적으로 결합 선택성 및 특이성에 영향을 줄 수 있다.

본 발명의 한 가지 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 2의 제1 초가변 부위(CDR3)를 갖는다. 추가적으로 또는 대안적으로, 하나 이상의 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 3의 제2의 초가변 부위(CDR2)를 갖는다. 또한, 추가적으로 또는 대안적으로 하나 이상의 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 4의 제3의 초가변 부위(CDR1)를 갖는다. 보다 바람직하게는, 하나 이상의 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 2의 제1의 초가변 부위(CDR3) 및 서열 번호 3의 제2의 초가변 부위(CDR2) 및 서열 번호 4의 제3의 초가변 부위(CDR1)를 갖는다.

특히 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 1의 scFv이다.

본원에 기재되고 상세히 설명된, 아미노산 잔기가 25개 이하인 아미노산 서열(예, CDR 부위, CDR 측접 부위)의 경우, 본 발명의 추가 구체예로서 이들 아미노산 서열은 그 범위 내에 1 또는 2의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 바람직하게는 그 치환은 보존적 아미노산 치환인 것으로 이해되고 간주되어야 한다. 본원에 기재되고 상세히 설명된, 아미노산 잔기가 25개를 초과하는 모든 아미노산 서열의 경우, 본 발명의 한 구체예로서 이들 아미노산 서열은 그 범위 내에 원래의 서열과 90% 이상의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 이해되고 간주되 어야 한다(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)). 유사한 또는 상동성의 아미노산은 유사한 특성, 예를 들어 산성, 염기성, 방향성, 크기, 양전하 또는 음전하, 극성, 비극성을 나타내는 동일하지 않은 아미노산으로 정의된다.

퍼센트 아미노산 유사성 또는 상동성 또는 서열 유사성은 두 개의 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드로 이루어진 아미노산 서열을 비교함으로써 결정한다. 항체 서열은 DNA 서열 분석에 의해 결정하였다. 두 개의 서열은 일반적으로 해당 목적을 위해 디자인된 다양한 컴퓨터 프로그램 중 하나에 의해 정렬되며, 각 위치에서의 아미노산을 비교한다. 그 후 아미노산 동일성 또는 상동성을 결정한다. 그 후 알고리즘을 적용하여 퍼센트 아미노산 유사성을 결정한다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 분자 간의 미묘한 관계를 검출하는 데 있어 민감성이 매우 크다는 점에서 일반적으로 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다. 단백질 비교는 보존적 아미노산 치환의 존재를 설명할 수 있으므로, 이에 의하여, 부정합은 동일하지 않은 아미노산이 유사한 물리적 및/또는 화학적 특성을 보유한다면 양의 점수를 나타낼 수 있다(Altschul et al. (1997), supra).

본 발명의 한 구체예에서, 경쇄 및 중쇄 각각의 3개의 초가변 부위는 두 사슬 간에, 사슬 내 및/또는 사이에 있는 3개의 초가변 부위 간에 상호교환될 수 있다. 뿐만 아니라, 초가변 부위의 서열은 2 이상의 CDR에 걸쳐 존재할 수 있도록 변경될 수 있다. 1 CDR 내에 단지 부분적으로 존재할 수 있도록, 프레임워크 가변 부위에도 가능하다.

본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이의 작제물, 또는 단편의 작제물을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명에 따르면, 항체는 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 항체를 포함한다. IgG 부류는 IgG₁, IgG₂, IgG₃, 및 IgG₄를 비롯하여 몇 가지 하위 부류를 포함한다.

항체는 단편, 복합체 및 다량체와 같은 여러 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 따르면, 항체 단편은 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab₂, 및 Fd 분자를 포함한다. 유사한 항체 단편, 예컨대 Fvs의 단편 및 Fab의 단편 역시 이들이 원래의 항체 또는 더 큰 단편의 결합 특성을 보유하고 있는 한, "단편"이라는 용어에 포함된다. 작제물은, 예를 들어 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디와 같은 다량체를 포함한다. "항체, 이의 결합 단편, 또는 항체 또는 이의 결합 단편을 갖는 복합체" 및 "항체 또는 단편"이란 어구는, 달리 명시되거나 또는 내용 및/또는 당분야의 지식에 기초하여 다른 의미로 나타낸 것이 아니라면, 상기와 같은 분자 모두는 물론, 그 유도체, 조합체, 변형체, 동족체, 모의체 및 변이체를 포함하는 의미이다.

scFv는 그 크기가 완전한 크기의 항체보다 작기 때문에 조직을 침투하여, 완전한 크기의 항체보다 더욱 빨리 혈액으로부터 제거되는 것으로 알려져 있다(Adams et al., Br. J Cancer 77: 1405-12 (1988); Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11(5): 548-557 (1999); Wu et al., Tumor Targeting 4: 47 (1999)). 따라서, scFv는 종종 종양 영상화와 같은 방사능 표지를 포함하는 진단 분석에서 사용되어 신체로부터 방사능 표지가 보다 신속하게 제거될 수 있도록 한다. 최근에, 다수의 암 표적화 scFv 다량체가 생체내 안정성 및 효능에 대하여 예비 임상 평가 중에 있다(Adams et al. (1988), supra, Wu (1999), supra).

전형적으로, scFv 단량체는 V_L의 N-말단 잔기에 대한 폴리펩티드 링커에 의해 고정된 V_H 도메인의 C-말단부를 갖도록 디자인된다. 경우에 따라, 역 배향이 이용된다: V_L 도메인의 C-말단부가 폴리펩티드 링커를 통해 V_H의 N-말단부에 고정된다(Power et al., J. Immun. Meth. 242: 193-204 (2000)). 폴리펩티드 링커는 일반적으로 그 길이가 약 15개 아미노산이다. 링커가 약 3∼7개 아미노산으로 축소될 경우, scFv는 기능성 Fv 도메인으로 폴딩될 수 없고, 대신에 제2 scFv와 결합하여 디아바디를 형성한다. 링커의 길이를 3개 아미노산보다 더 작게 축소시키면, 링커 길이, 조성 및 Fv 도메인 배향에 따라, 삼량체 또는 사량체로의 scFv의 회합이 촉진된다(Powers (2000), supra).

최근, scFv 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 다가 항체 단편이 종종 표적에 대한 모 항체의 결합에 비해 더 큰 친화력을 제공한다는 것이 발견되었다. 이러한 더 높은 친화력은 종양 표적화 적용을 위한 개선된 약물 역학을 비롯하여 잠재적인 이점을 제공한다. 추가적으로, 백혈구의 고정 및 회전에 관여하는 P-셀렉틴 및 이의 리간드 PSGL-1을 연구함에 있어서, 과학자들은 PSGL-1의 이량체 형태를 발현하는 세포는 이러한 더 높은 결합 친화력으로 인하여 더욱 안정한 회전 부착을 확립한다는 결론을 내렸다. 이러한 부착은 만곡 진행에 더 저항성이 크고 회전 속도의 변동이 더 적었다(Ramachandran et al., PNAS, 98 (18): 10166-71 (2001)).

scFv의 다가 형태는 다른 연구자들에 의해 디자인되고 생성된 바 있다. 한 가지 방법은 두 개의 scFv를 링커를 사용하여 연결하는 것이었다. 또 다른 방법은 두 개의 scFv를 연결시키기 위해 그 사이에 이황화 결합을 이용하는 것이었다. 이량체 또는 삼량체의 Fv의 생산을 위한 가장 간단한 방법은 Holliger 등[PNAS 90: 6444-48 (1993)] 및 Kortt 등[Protein Eng. 10: 423-33 (1997)]에 의해 보고되었다. 그와 같은 방법 중 하나는 FOS 및 JUN 단백질 영역의 서열을 추가하여 scFv의 c-말단에서 그 사이에 루신 지퍼를 형성함으로써 scFv의 이량체를 제조하도록 디자인되었다(Kostelny et al., Immunol. 148(5): 1547-53 (1992); De Kruif et al., J. Biol. Chem. 271(13): 7630-34 (1996)). 또 다른 방법은 scFv의 c-말단에 스트렙타빈 코딩 서열을 첨가함으로써 사량체를 제조하도록 디자인되었다. 스트렙타비딘은 4개의 서브유닛으로 이루어지며, 따라서 scFv-스트렙타비딘이 폴딩될 경우 4개의 서브유닛은 사량체를 형성하도록 스스로 조정한다(Kipriyanov et al., Hum Antibodies Hybridomas 6(3): 93-101 (1995)). 또 다른 방법에서는, 이량체, 삼량체 및 사량체를 제조하기 위하여 유리 시스테인을 소정의 단백질에 도입한다. 다양한 수(2∼4)의 말레이미드기를 갖는 펩티드 기초 가교제를 사용하여 유리 시스테인에 소정의 단백질을 교차 결합시켰다(Cochran et al., Immunity 12(3): 241-50 (2000)).

이러한 다가 형태의 더 큰 결합 친화력은 진단, 예후 판정, 병기 결정 및 치료 계획에 있어서 유익할 수 있다. 예를 들어, scFv는 표적 수용체에 결합하는 차단제로서 사용될 수 있으며, 따라서 "천연" 리간드의 결합을 차단할 수 있다. 이러 한 경우에는, 표적에 대한 천연 리간드의 바람직하지 않은 결합을 허용할 수 있는 해리의 기회를 감소시키기 위하여 scFv와 수용체 간에 더 큰 친화성 회합을 갖게 하는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 더 큰 친화력은 표적 수용체가 부착 및 회전에 관여하거나, 표적 수용체가 높은 만곡 진행 흐름 영역에 존재하는 세포(예, 혈소판) 상에 존재할 경우 유용할 수 있다.

이러한 시스템에서는, 파지 라이브러리(전술한 바와 같은)는 항체의 Fv 영역의 1가 형태로 폴딩할 수 있는 scFv를 나타내도록 디자인될 수 있다. 게다가, 또한 전술한 바와 같이, 이 작제물은 박테리아 발현에 적합하다. 유전적으로 조작된 scFv는 연속 코딩되는 15 아미노산의 가요성 펩티드 스페이서에 연결되는 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함한다. 바람직한 스페이서는 (Gly₄Ser)₃이다. 이 스페이서의 길이는 그 아미노산 구성과 함께 벌키하지 않은 스페이서를 제공하며, 이는 V_H 및 V_L 영역이 그 표적에 대한 효과적인 결합을 제공하는 기능성 Fv 도메인으로 폴딩될 수 있게 한다.

스페이서의 길이를 변화시키는 것은 이량체, 삼량체 및 사량체(당분야에서는 이를 각각 디아바이, 트리아바디 및 테트라바디라고도 칭함)를 형성하는 또 다른 바람직한 방법이다. 이량체는 scFv의 두 개의 가변 사슬을 연결시키는 스페이서가 일반적으로 5∼12 아미노산 잔기로 단축되는 조건 하에 형성된다. 이렇게 단축된 스페이서는 동일한 분자로부터의 두 개의 가변 사슬이 기능성 Fv 도메인으로 폴딩되는 것을 방지한다. 대신에, 그 도메인들은 다른 분자의 상보성 도메인과 쌍을 이 루어 두 개의 결합 도메인을 형성하게 된다. 바람직한 방법에서는, 단 5개의 아미노산(Gly₄Ser)의 스페이서가 디아바디 작제에 사용되었다. 이러한 이량체는 두 개의 동일한 scFv로부터 형성되거나 2종의 상이한 집단의 scFv로부터 형성될 수 있으며, 모 scFv(s)의 선택적 및/또는 특이적으로 강화된 결합 활성을 유지하고/하거나 증가된 결합 강도 또는 친화력을 나타낸다.

유사한 방식으로, 트리아바디는 scFv의 두 개의 가변 사슬을 연결하는 스페이서가 대체로 5 아미노산 잔기 미만으로 단축되는 조건 하에 형성되어, 동일한 분자로부터의 두 개의 가변 사슬이 기능성 Fv 도메인으로 폴딩되는 것을 방지한다. 대신에, 3개의 별개의 scFv 분자가 회합하여 삼량체를 형성한다. 바람직한 방법에서는, 트리아바디는 이러한 가요성 스페이서를 완전히 제거하여 얻었다. 트리아바디는 3개의 동일한 scFv로부터 형성되거나, 2 또는 3개의 상이한 scFv 집단으로부터의 형성될 수 있으며, 모 scFv(s)의 선택적 및/또는 특이적으로 강화된 결합 활성을 유지하고/하거나 증가된 결합 강도 또는 친화력을 나타낸다.

테트라바디는 유사하게, scFv의 두 개의 가변 사슬을 연결하는 스페이서가 대체로 5 아미노산 잔기 미만으로 단축되는 조건 하에 형성되어, 동일한 분자로부터의 두 개의 가변 사슬이 기능성 Fv 도메인으로 폴딩되는 것을 방지한다. 대신에, 4개의 별개의 scFv 분자가 회합하여 사량체를 형성한다. 테트라바디는 4개의 동일한 scFv로부터 형성되거나, scFv의 상이한 집단으로부터의 1∼4개의 개별 단위로부터 형성될 수 있으며, 모 scFv(s)의 선택적 및/또는 특이적으로 강화된 결합 활성 을 유지하고/하거나 증가된 결합 강도 또는 친화력을 나타낸다. 스페이서가 일반적으로 5 아미노산 잔기 미만인 조건 하에 트리아바디가 형성되는지 테트라바디가 형성되는지는, 혼합물 중의 특정 scFv(s)의 아미노산 서열 및 반응 조건에 좌우된다.

일단 항체, 단편 또는 소정의 결합 능력을 보유하는 작제물이 선별되고/되거나 개발되면, 당업자라면 본원에 제공된 안내에 따라 원형의 항체의 특성을 유지하는 작제물 및 단편을 생성할 수 있다. 예를 들어, 완전 항체 분자, Fv 단편, Fab 단편, Fab₂ 단편, 이량체, 삼량체, 및 기타 작제물은 최초로 선택되거나 개발된 항체, 단편 또는 작제물의 원하는 특성을 보유하도록 제조될 수 있다.

아미노산을 치환시기되, 여전히 항체 또는 단편의 특성을 보유하도록 하고자 한다면, 보존적 아미노산 치환을 이용할 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있다. 다양한 제제에 대한 접합과 같은 변형 역시 그 결합 특성을 변화시키지 않고 항체 또는 단편에 이루어질 수 있다. 다른 변형, 예를 들어 보다 안정한 항체 또는 단편을 생성하기 위해 이루어지는 변형 역시 그 특이성을 변화시키지 않고 항체 또는 단편에 가해질 수 있다. 예를 들어, 펩토이드 변형, 세미펩토이드 변형, 시클릭 펩티드 변형, N 말단 변형, C 말단 변형, 펩티드 결합 변형, 골격 변형 및 잔기 변형이 수행될 수 있다. 당업자라면, 본 명세서의 안내에 따라, 변형된 항체 또는 단편에 대해 그 결합 특성이 변화되었지를 평가하기 위한 테스트를 수행할 수 있다.

마찬가지로, 당업자라면 본원에 제공된 안내에 따라, 더욱 바람직한 특성을 갖는 분자를 얻기 위하여 항체, 단편, 또는 작제물의 결합 특성을 변화시킬 수 있 다. 예를 들어, 일단 바람직한 특성을 갖는 항체가 동정되면, 무작위 또는 유도된 돌연변이 유발법을 이용하여 항체의 변형체를 생성할 수 있으며, 그러한 변형체가 바람직한 특성을 갖는지를 스크리닝할 수 있다.

당분야에 공지된 통상적인 방법을 이용하여, 당업자라면 L32 scFv의 결합 능력을 갖는 추가 항체 또는 이의 단편을 결정할 수도 있다. 예를 들어, 추가 항체는 본원에 기재된 바이오패닝(biopanning) 방법을 이용하여 분리할 수 있는데, 이때 L32가 결합하는 분자 또는 세포는 특정 파지 디스플레이 라이브러리, 특히 백혈병, 림프종 및 골수종 환자로부터 준비된 라이브러리를 스크리닝하는 데 이용된다.

본 발명에 따른 항체 및 단편에는 그 제조 및 동정과, 병기 결정을 비롯하여 진단 및 예후 판정에 도움이 되는 태그를 삽입하거나 부착시킬 수 있다. 태그는 후에 분자로부터 제거될 수 있다. 유용한 태그의 예로는 AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, 단백질 C, S-TAG(등록상표), T7, V5, 및 VSV-G(Jarvik and Telmer, Ann. Rev. Gen., 32, 601-18 (1998))가 있다. 태그는 c-myc 또는 KAK인 것이 바람직하다.

항체, 이의 단편 또는 이의 작제물, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 및 이의 단편 및 작제물은 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 생성할 수 있다. 원핵 및 진핵 시스템에서 항체 및 단편을 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.

본원에 정의되어 있고 본원에서 기술하는 바와 같은 진핵 세포 시스템은 숙주가 원핵 세포인, 유전 공학 방법에 의해 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 발현 시스템을 의미한다. 진핵 발현 시스템은 포유동물 시스템일 수 있으며, 포 유동물 발현 시스템에서 생성된 펩티드 또는 폴리펩티드는 정제 후에 바람직하게는 실질적으로 포유동물 오염원이 없다. 유용한 진핵 발현 시스템의 다른 예로는 효모 발현 시스템을 포함한다.

본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 바람직한 원핵 시스템은 발현 벡터에 대한 숙주로서 이. 콜라이(E. coli)를 사용한다. 이. 콜라이 시스템에서 생성된 펩티드 또는 폴리펩티드는 정제 후에 실질적으로 이. 콜라이 오염 단백질이 없다. 원핵 발현 시스템을 사용하면 본 발명을 위해 제공되는 서열 중 일부 또는 전부의 N-말단에 메티오닌 잔기가 추가될 수 있다. N-말단 메티오닌 잔기를 제거하면, 펩티드 또는 폴리펩티드가 완전히 발현되도록 하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 제조는 당분야에 공지된 바와 같이 수행할 수 있으며, 그 한 예는 적절한 조건 하에 에어로모나스(Aeromonas) 아미노펩티다제를 사용하는 것이다(미국 특허 제5,763,215호).

본 발명의 바람직한 구체예에서, 항체 또는 이의 단편의 제조 방법은 다음 단계를 포함한다; (a) 파지 디스플레이 라이브러리를 제공하는 단계; (b) 서열 번호 1의 scFv 항체 단편의 결합 능력을 갖는 항체 또는 이의 단편이 결합할 수 있는 분자 또는 세포를 제공하는 단계; (c) 상기 분자 또는 세포에 결합하는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 나타내는 파지 입자에 대하여 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 상기 분자 또는 세포에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 갖는, 항체 또는 이의 결합 단편을 갖는 하나 이상의 항체 또는 이의 결합 단편을 갖는 항체 또는 이의 단편을 제조하는 단계.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는, 예를 들어 다양한 약제, 예컨대 약물, 독소 및 방사능 동위원소와, 경우에 따라 약학적으로 유효한 담체와 복합체를 형성하는, 예를 들어 회합되거나, 결합되거나, 융합되거나, 또는 연결되어 항체/폴리펩티드 및 항질병 및/또는 항암 활성을 갖는 약제를 포함하는 펩티드-약물 조성물을 형성할 수 있다. 그러한 조성물은 진단 목적을 위해 사용될 수도 있다.

본 발명에 유용한 담체의 예로는 덱스트란, HPMA(친수성 중합체), 또는 임의의 기타 중합체, 예컨대 친수성 중합체뿐 아니라 이의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. 대안으로, scFv Y1 분자로 장식된 리포좀(예, Doxil, 다량의 독소루비신을 함유하는 시판되는 리포좀)과 같은 장식된 리포좀을 사용할 수 있다. 이러한 리포좀은 하나 이상의 원하는 제제를 포함하도록 제조될 수 있으며, 본 발명의 항체와 혼합하여 높은 약물 대 항체 비를 제공하도록 할 수 있다.

대안으로, 항체 또는 이의 단편과 제제 사이의 결합은 직접 결합일 수 있다. 2 이상의 이웃하는 분자 간의 직접 결합은 분자 내의 원소 또는 원소군 간의 화학 결합을 통해 생성될 수 있다. 화학 결합은, 예를 들어 이온 결합, 공유 결합, 소수성 결합, 친수성 결합, 정전기적 결합 또는 수소 결합일 수 있다. 결합은, 예를 들어 아미드, 탄소-설파이드, 펩티드 및/또는 이황화 결합일 수 있다. 항체를 제제 또는 링커에 부착시키기 위해서, 공유 결합을 형성하는 것으로 당분야에 공지되어 있는 아민, 카르복시, 히드록실, 티올 및 에스테르 작용기를 사용할 수 있다.

펩티드와 제제 또는 펩티드와 담체, 또는 담체와 제제 간의 결합은 링커 화합물에 의한 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 명세서 및 청구의 범위 에서 링커 화합물은 2 이상의 부분을 연결시키는 화합물로서 정의된다. 링커는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 분지된 링커 화합물은 이중 분지, 삼중 분지 또는 사중 분지 또는 그 이상으로 분지된 화합물로 이루어질 수 있다. 본 발명에 유용한 링커 화합물은 디카르복실산, 말레미도 하이드라지드, PDPH, 카르복실산 하이드라지드 및 작은 펩티드를 포함한 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.

본 발명에 따르면, 유용한 링커 화합물의 보다 구체적인 예로는 (a) 숙신산, 글루타르산 및 아디프산과 같은 디카르복실산; (b) N-[말레이미도카프론산] 하이드라지드, 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실하이드라지드 및 N-[말레이미도운데칸산] 하이드라지드와 같은 말레이미도 하이드라지드; (c) (3-[2-피리딜디티오]프로피오닐 하이드라지드); 및 (d) 2∼5의 탄소 원자로부터 선택되는 카르복실산 하이드라지드, 및 이의 유도체, 조합체, 변형체 및 유사체를 포함한다.

작은 펩티드 링커를 사용하는 직접 커플링에 의한 결합 역시 유용하다. 예를 들어, 항암 약물 독소루비신의 유리 당과 scFv 사이의 직접 커플링은 작은 펩티드를 사용하여 수행할 수 있다. 작은 펩티드의 예로는 AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, 단백질 C, S-TAG(등록상표), T7, V5, VSV-G, 및 KAK를 포함한다.

본 발명의 항체 및 이의 단편은 방사능 동위원소와 같은 영상화제(표식 마커라고도 함)에 결합되거나, 접합되거나, 이와 복합체를 형성하거나, 또는 다른 방식으로 회합될 수 있으며, 이러한 접합체는 진단, 예후 판정, 또는 병기 결정 및 영상화 목적에 사용될 수 있다. 그러한 방사능 동위원소 항체(또는 단편) 접합체를 포함하는 키트가 제공된다.

진단, 예후 판정 또는 병기 결정에 유용한 방사능 동위원소의 예로는 ¹¹¹인듐, ¹¹³인듐, ^99m레늄, ¹⁰⁵레늄, ¹⁰¹레늄, ^99m테크네튬, ^121m텔루륨, ^122m텔루륨, ^125m텔루륨, ¹⁶⁵툴륨, ¹⁶⁷툴륨, ¹⁶⁸툴륨, ¹²³요오드, ¹²⁶요오드, ¹³¹요오드, ¹³³요오드, ^81m크립톤, ³³크세논, ⁹⁰이트륨, ²¹³비스무트, ⁷⁷브롬, ¹⁸플루오르, ⁹⁵루테늄, ⁹⁷루테늄, ¹⁰³루테늄, ¹⁰⁵루테늄, ¹⁰⁷수은, ²⁰³수은, ⁶⁷갈륨, 및 ⁶⁸갈륨을 포함한다. 바람직한 방사능 동위원소는 X-선 또는 임의의 적합한 상자성 이온에 불투명하다.

표식 마커 분자는 형광 마커 분자일 수도 있다. 형광 마커의 예로는 플루오레세인, 피코에리스린, 또는 로다민, 또는 이들의 변형체 또는 접합체를 포함한다.

표식 마커에 접합된 항체 또는 단편은 환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계 및 본 발명의 항체가 환자의 세포에 결합하는지를 결정하는 단계에 의해 그 환자가 질병 위험이 있는지 질병을 보유하고 있는지를 결정함으로써 질병 상태를 진단하거나, 예후를 판정하거나 또는 병기를 결정하는 데 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명은 또한 환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계 및 환자 유래의 세포와 본 발명의 항체를 항온처리하는 단계에 의해 환자로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다. 그러한 과정은 생체내, 시험관내 또는 체외에서 수행될 수 있다. 생체내 또는 체외에서 수행되는 경우, 영상화제는 환자에게 허용되지 않는 수준으로 유해하지 않는다는 점에서 생리학적으로 허용될 수 있는 것이 바람직하다. 허용 가능한 유해성 수준은 질환의 심각성 및 다른 선택의 유용성에 따라 의사가 그러한 기준을 이용하여 결정할 수 있다.

암의 경우, 환자의 병기를 결정하는 것은 일반적으로 종양의 크기, 유형, 위치 및 침입성에 기초하여 질환의 분류를 결정하는 것을 포함한다. 종양 특성에 의해 암을 분류하기 위한 한 가지 분류 시스템은 "TNM Classification of Malignant Tumours" (6판) (L. H. Sobin, Ed.)(본원에서 참고로 인용함)이며, 여기에서는 암의 단계를 T, N, 및 M 카테고리로 분류하는데, 여기서 T는 그 크기 및 위치에 따라 주요 종양을 나타내고, N은 국부 림프절을 나타내고, M은 원격 전이를 나타낸다. 또한, 숫자 I, II, III 및 IV는 단계를 나타내는데 사용되며, 각 수는 TNM 인자의 가능한 조합을 의미한다. 예를 들어, I기 유방암은 TMN 그룹: T1, NO, MO에 의해 정의된다. T1 - 종양의 직경이 2 cm 이하임, NO - 국부 림프절 전이가 없음, MO - 원격 전이가 없음. 또 다른 시스템은 AML의 병기를 결정하는 데 사용되는데, 분류된 아형은 통상적인 처리 및 세포화학적 염색 하에 관찰되는 형태를 이용하는 프렌치-아메리칸-브리티시 시스템에 기초한 것이다.

또한, 최근에 제안된 세계 보건 기구(WHO)의 조혈 및 림프계 조직의 신생물 형성 질환의 병기 결정 및 분류는 (특별히 AML에 대해서), 질병의 전통적인 FAB-형 카테고리뿐 아니라, 특이적인 세포유전학적 발견 및 골수이형성증과 관련된 AML과 서로 관련이 있는 추가적인 질병 유형을 포함한다. 다른 연구자들 역시 병리학적 분류를 제안하였다. 예를 들어, AML에 특이적인 한 가지 제안은 세포유전학적 전위와 상관성이 있고, 형태학적 평가 및 면역형별에 의해 쉽게 파악될 수 있으며, 관 련된 골수이형성적 변화의 중요성을 통합시키는 질병 유형을 포함한다. 이러한 시스템은 세포유전학 또는 분자유전학적 연구에 의해 지지되었으며, 새로운 인식할 수 있는 임상병리학적 실체가 소개됨에 따라 확장될 수 있었다(Arber, Am. J. Clin. Pathol. 115(4): 552-60 (2001)).

본 발명은 표식 마커 분자 또는 영상화제에 결합된 본 발명의 펩티드를 갖는 영상화제를 포함하는, 치료 전, 치료 중 또는 치료 후 치료 효능의 시험관내 분석을 위한 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 세포와 조성물을 접촉시키는 단계; (b) 세포에 결합된 방사능 활성을 측정하는 단계; 및 이로써 (c) 종양을 가시화하는 단계를 포함하는, 암, 보다 구체적으로는 종양의 진단적 병소 위치 확인, 생존율 예측 및 병기 결정 또는 영상화를 위해 영상화제를 사용하는 방법을 제공한다.

적합한 영상화제의 예로는 형광 염료, 예컨대 FITC, PE 등, 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질을 들 수 있다. 다른 예로는 기질과 반응하여 색 변화와 같은 인식할 수 있는 변화를 생성하는 효소 및 방사능 분자를 포함한다.

한 예로서, 키트의 영상화제는 FITC와 같은 형광 염료이고, 키트는 암, 보다 구체적으로는 혈액 관렴 암, 예를 들어 백혈병, 림프종 및 골수종의 치료 효능을 분석하기 위한 키트를 제공한다. FACS 분석은, 예를 들어 진단시, 치료중, 완화시와 재발시에 질병의 각 단계에서 영상화제에 의해 염색된 세포의 비율 및 염색 강도를 측정하기 위해 사용된다.

본 발명의 항체 및 이의 단편은 항암제, 항신생물제, 항바이러스제, 항전이 제, 항염증제, 항혈전제, 항재발협착제, 항응집제, 항자가면역제, 항유착제, 항심혈관질환제, 약제 또는 기타 항질병제에 결합되거나, 접합되거나, 또는 다른 방식으로 회합될 수 있다. 제제란 비제한적으로 인간, 소, 말, 돼지, 쥐, 개, 고양이 또는 기타 다른 온혈동물을 비롯하여 포유동물의 예방적 치료 또는 진단에 유용한 제제를 의미하다.

그러한 제제의 예로는 비제한적으로 아시클로비어, 간시클로비어 및 지도부딘을 포함하는 항바이러스제; 실로스타졸, 달테파린 나트륨, 레비파린 나트륨 및 아스피린을 포함하는 항혈전제/항재발협착제; 잘토프로펜, 프라노프로펜, 드록시캄, 아세틸 살리실릭 17, 디클로페낙, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 설린닥, 나프록센, 암톨메틴, 셀레콕시브, 인도메타신, 로페콕시브 및 니메술리드를 포함하는 항염증제; 레플루노마이드, 데닐루킨 디프티톡스, 수브레움, WinRho SDF, 데피브로타이드 및 시클로포스파마이드를 포함하는 항자가면역제; 리마프로스트, 클로크로멘 및 히알루론산을 포함하는 항유착제/항응집제를 포함한다.

약제의 예로는 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신(다우노마이신), 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신뿐 아니라, 모르폴리노 및 이의 치환된 유도체 및 조합체를 포함한다. 약제의 다른 예로는 시스-백금, 택솔, 칼리체아미신, 빈크리스틴, 시타라빈(Ara-C), 시클로포스파마이드, 프레드니손, 플루다라빈, 이다루비신, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로마이드, 탈리도마이드 및 블레오마이신, 및 이들의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다.

암 세포의 성장 억제는, 예를 들어 (i) 암 또는 전이 성장의 예방, (ii) 암 또는 전이 성장의 속도 저감, (iii) 세포를 무결하게 생존된 상태로 유지하면서 암 세포의 성장 진행 또는 전이 진행을 총체적으로 방지하는 것, (iv) 암 세포와 미소환경의 접촉을 방해하는 것, 또는 (v) 암 세포를 사멸시키는 것을 포함한다.

백혈병 세포의 성장 억제는, 예를 들어 (i) 백혈병 또는 전이 성장의 예방, (ii) 백혈병 또는 전이 성장의 속도 저감, (iii) 세포를 무결하게 생존된 상태로 유지하면서 백혈병 세포의 성장 진행 또는 전이 진행을 총체적으로 방지하는 것, (iv) 백혈병 세포와 미소환경의 접촉을 방해하는 것, 또는 (v) 백혈병 세포를 사멸시키는 것을 포함한다.

본 발명의 항체 및 단편을 유용하게 결합시킬 수 있는 항질병제, 항암제 및 항백혈병제의 예로는 독소, 방사능 동위원소 및 약제를 포함한다.

독소의 예로는 겔로닌, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소(PE), PE40, PE38, 디프테리아 독소, 리신, 또는 이의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다.

방사능 동위원소의 예로는 병소 위치 확인 및/또는 치료에 사용될 수 있는 감마 방출제, 양전자 방출제 및 x-선 방출제, 및 치료에 사용될 수 있는 베타 방출제 및 알파 방출제를 포함한다. 진단, 예후 판정 및 병기 결정에 유용한 전술한 방사능 동위원소 역시 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

항암제 또는 항백혈병제의 비제한적인 예로는 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신(다우노마이신), 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 및 모르폴리노 및 이의 치환된 유도체, 조 합체 및 변형체를 포함한다. 약제의 다른 예로는 시스-백금, 택솔, 칼리체아미신, 빈크리스틴, 시타라빈(Ara-C), 시클로포스파마이드, 프레드니손, 다우노루비신, 이다루비신, 플루다라빈, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로마이드, 탈리도마이드 및 블레오마이신, 및 이들의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. 바람직하게는, 항암제 또는 항백혈병제는 독소루비신, 모르폴리노독소루비신 또는 모르폴리노다우노루비신이다.

한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 투여함으로써 ADCC를 유도 또는 활성화시키는 방법을 제공한다. 따라서, 이러한 항체들은 ADCC를 활성화하고/하거나, 자연 킬러(NK) 세포(예, CD56+), T-세포독성 세포(예, CD8+), 및/또는 단핵구를 자극하여 세포 용해를 유도할 수 있다. 일반적으로, 항체의 Fc 영역 또는 부분을 포함하는 항체를 투여한 후, 상기 항체는 효과기 세포, 예를 들어 NK 세포 표면의 Fc 수용체(FcR)에 결합하여 퍼포린 및 그랜자임 B의 방출을 유발시키며, 이는 후에 아폽토시스를 초래한다. 관련된 효과기 세포의 유형, 사이토카인(예, IL-2 및 G-CSF), 인큐베이션 시간, 세포 표면 상에 존재하는 수용체의 수, 및 항체 친화력을 비롯하여 다양한 인자가 ADCC에 영향을 미칠 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 서열 번호 1의 scFv 항체 단편의 결합 능력을 갖는 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 세포 회전, 염증, 감염, 자가 면역 질환, 전이, 종양 세포 또는 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제, 또는 종양을 가진 환자의 종양 세포 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포수의 증가를 억제 또는 치료하기에 유효한 양으로 존재 할 수 있다. 대안으로, 항체 또는 이의 단편은 종양 세포 또는 백혈병 세포의 사멸률을 증가시키는 데 유효한 양으로 존재할 수 있다. 또는, 항체 또는 이의 단편은 항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성, 항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포의 감수성, 또는 항백혈병제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성을 변화시키기에 유효한 양으로 존재할 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 이의 단편은 종양을 가진 환자의 종양 세포의 수 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포의 수를 감소시키는 데 유효한 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 항체, 작제물, 접합체 및 단편은 적합한 방법에 의해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 방법의 예로는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 기관지내, 포막내, 복강내, 림프선내, 비강, 설하, 경구, 직장, 질, 기도, 협측, 피내, 경피, 또는 늑막내 투여를 포함한다.

정맥내 투여의 경우, 제형은 바람직하게는, 환자에게 투여되는 양이 소정의 조성물 약 0.1 mg∼약 1000 mg의 유효량이 되도록 제조된다. 보다 바람직하게는, 투여되는 양은 소정의 조성물 약 1 mg∼약 500 mg이 될 것이다. 본 발명의 조성물은 광범위한 용량 범위에서 유효하며, 치료되는 질병의 구체적 특징, 환자 신체 내에서의 펩티드 또는 폴리펩티드계 약학 조성물의 반감기, 항체 또는 이의 단편과 복합체를 형성한 제제 및 약학 조성물의 물리 화학적 특성, 약학 조성물의 투여 방식, 치료 또는 진단 대상 환자의 구체적 특징 및 치료의가 중요하다고 판단하는 기타 파라미터에 좌우된다.

경구 투여를 위한 약학 조성물은 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다. 그 예로는 정제, 액제, 에멀션, 현탁제, 시럽, 필, 캐플릿 및 캡슐을 들 수 있다. 약학 조성물의 제조 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다(참조: Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (pub)).

약학 조성물은 또한 시한 방출, 지속 방출, 펄스 방출 또는 연속 방출을 용이하게 하도록 제형될 수 있다. 약학 조성물은 또한 시한, 지속, 펄스 또는 연속 방출 장치와 같은 장치에 의해 투여될 수 있다. 국소 투여를 위한 약학 조성물은 크림, 연고, 로션, 패치, 용액, 현탁액, 동결 건조물 및 젤과 같은 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 항체, 작제물, 접합체 및 단편을 포함하는 조성물은 통상적인 약학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 담체 등을 포함할 수 있다. 정제, 필, 캐플릿 및 캡슐은 락토스, 전분 및 스테아르산마그네슘과 같은 통상적인 부형제를 포함할 수 있다. 좌제는 왁스 및 글리세롤과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 주사 가능한 용액은 염수와 같은 멸균된 발열원이 없는 매질을 포함하며, 완충제, 안정화제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 통상적인 장용 코팅 역시 사용될 수 있다.

항체 또는 이의 단편 및 이의 약학 조성물은 이를 필요로 하는 환자의 질병의 치료 방법(예를 들어, 치료는 질병의 영향을 완화시키는 것, 질병의 예방하는 것, 또는 질병의 진행을 억제하는 것을 포함할 수 있음)에 사용될 수 있다. 그러한 방법으로는 세포 회전, 염증, 자가 면역 질환, 전이, 종양 세포 또는 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제, 또는 종양을 가진 환자의 종양 세포 또는 백혈병 환자의 백 혈병 세포수의 증가를 억제 또는 치료하는 것을 포함한다. 또한, 그러한 방법은 항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성, 항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포의 감수성, 또는 항암제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성을 변화시키는 것을 포함한다. 그러한 방법은 또한 종양을 가진 환자의 종양 세포의 수 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계 및 환자 유래의 세포와 본 발명의 항체를 항온처리하는 단계에 의해 환자 유래의 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 제거는 체외에서 수행된다.

하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕고 본 발명을 추가로 예시하기 위해 기술된 것이나, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하려는 것은 아니다. 특정한 시약 및 반응 조건을 기재하였으나, 본 발명의 범위에 포함되는 변형이 이루어질 수 있다.

실시예 1

본 실시예는 L32 scFv 항체 단편의 선별, 제조 및 초기 특성 규명에 관해 설명한다. 요약하면, scFv 항체 단편을 나타내는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 표적화 분자를 제조하였으며, 유세포 계측법, 특히 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 이용하여 표적 세포를 인식하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 갖는 특이적인 파지 클론을 동정 및 분리하였다. 본원에서 사용되는 파지 디스플레이 라이브러리는 49명의 비면역화된 인간 공여체의 말초 혈액 림프구로부터 작제하였다.

파지 클론은 바이오패닝이라고 하는 다단계 절차를 통해 선별 및 동정하였다. 바이오패닝은 단백질 리간드 변형체를 나타내는 파지(파지 디스플레이 라이브러리)와 표적 세포를 항온처리하는 단계, 세척 기법에 의해 비결합 파지를 제거하는 단계 및 결합된 파지를 특이적으로 용출하는 단계에 의해 수행하였다. 용출된 파지 클론은 임의로 증폭시킨 후, 추가적인 결합 및 선택적 증폭 사이클을 수행하였으며, 이로써 특정 서열의 풀을 표적에 최적 결합하는 항체 단편을 보유하는 파지 클론쪽으로 농축시켰다. 몇 순환의 패닝 후에, 개별 파지 클론의 특성을 분석하고, 그 클론에 의해 나타내어진 펩티드의 서열을 파지 비리온의 해당 DNA를 서열 분석함으로써 결정하였다.

본 발명에서는, T-림프종 세포의 스크리닝은 최초 바이오패닝 단계에서는 정의되지 않은 에피토프에 대하여 수행하고, 이후의 클론 선별은 원하는 표적 세포(예, B-백혈병 세포, B-CLL 세포, AML 세포, 다발성 골수종 세포, 및 전이 세포)를 사용하여 수행하였으며, 이의 표적 세포 표면 마커는 미지의 것이다.

L1 프로토콜을 사용하여, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 무결한 T-림프종 세포를 패닝함으로써 L32 scFv 항체 클론을 발견하였다. 이 프로토콜은 사전 세척에서부터 시작하였다. -70℃에서 보관하였던, 환자 유래의 동결된 백혈병/림프종 T 세포 2 x 10⁷개를 포함하는 1 ml 분액을 37℃에서 급속 해동하고, 즉시 10 ml 저온 2% PBS-밀크(MPBS)에 희석시켰다. 세포를 실온(RT)에서 120 x g로 5'간 회전시키고, 2회 세척하고, MPBS에 현탁시키고, 혈구계산기로 계산하였다. scFv 디스플레이 파지 라이브러리(Nissim et al., EMBO J., 13: 692-98 (1994))는 MRC의 동의 하에 사용하였다. 이 라이브러리는 처음에는 V_H 및 V_L 도메인이 가요성 폴리펩티드에 의해 결합된 scFv 단편을 나타내는 파지미드 라이브러리로서 작제하였다. 파지미드 라이브러리에 나타내어진 scFv는 파지의 마이너 코트 단백질 pIII의 N-말단에 융합시켰으며, 그 후 pHEN1 벡터에 서브클로닝하였다. 항체 단편의 저장소는 먼저 비면역화 인간의 말초 혈액 림프구["나이브(naive) 저장소"라 함]의 재배열된 V-유전자로부터 PCR에 의해 생성하였다. 저장소를 다양화하기 위해, 4∼12 잔기의 중쇄 CDR3 길이를 코딩하는 무작위 뉴클레오티드 서열을 49개의 클로닝된 인간 V_H 유전자 세그먼트의 뱅크에 도입하였다. 그것이 유도된 모든 클론에서의 융합된 V_L 단편은 생식선 IGLV3S1의 단일 비돌연변이 V 유전자였으며, 약 10⁸개 클론의 단일 포트 라이브러리를 생성하였다.

L32 scFv 항체 클론의 선별은 10⁶ T 세포, 10¹¹ 콜로니 형성 단위(CFU)의 파지미드(Nissim library), 및 10¹³ 야생형 박테리오파지 M13을 함유하는 최종 부피 0.5 ml에서 4℃에서 1 시간 동안 저속으로 진탕시키면서 수행하였다. 그 후 전술한 바와 같이 세포를 MPBS로 현탁시키고, 4℃에서 120 x g에서 원심분리함으로써 세포를 세척하였다. 선별 + 세포 세척 절차는 3회 반복하였다.

1 순환 선별 후에, RT에서 5 분간 세포와 150 ㎕의 0.1 M 글리신, pH 2.2를 항온처리함으로써 T-림프종 세포로부터 결합된 파지미드를 용출시켰다. 중화시킨 후, 세포를 회전시켜 버리고, 용출된 파지 입자를 함유하는 상청액을 수집하여 E1 원액이라 명명하였다. 이 E1 원액을, 기하급수적으로 성장하는 TG-1 세포 1 ml를 추가하고 37℃에서 30 분간 항온처리함으로써 증폭시켰다. 분액을 적정 목적으로 도말하고, 남아있는 부피는 2xTY/AMP(1.6% 트립톤, 1% 효모 추출물, 0.5% NaCl 및 lOO ㎍/ml 암피실린)를 함유하는 대형 평판(150 mm)에 도말하였다. 평판은 30℃에서 밤새 항온처리하였다. 매 순환 패닝 후의 산출을 측정하기 위해, 적정 평판 상의 콜로니의 수를 계산하였고, 총 산출을 계산하였다.

박테리아 균주 TG-1 및 HB2151의 신선한 박테리아 배양물을, 세포를 A₆₀₀이 0.5∼0.9가 될 때까지(기하급수적으로 성장하는 세포) 세포를 성장시켜 감염을 위해 준비하였다(증폭). 이. 콜라이 TG-1 세포를 파지 증식에 사용하였고, 이. 콜라이 HB2151 세포는 scFv 단백질 생산을 위해 사용하였다. 대형 평판으로부터 콜로니를 긁어내어 모았다. 암피실린 내성 이. 콜라이 TG-1 세포의 분액(∼10⁷)을 액체 배양물에서 A₆₀₀이 ∼0.5가 될 때까지 성장시킨 후, 헬퍼 파지(VSC-M13, 스트라타진)로 감염시켜 대형의 증폭된 파지미드 스톡을 제조하였다. 파지미드는 PEG 침전 절차에 의해 회수하였다(Harrison et al., Methods in Enzymology (1996) 267: 83- 109). 전술한 바와 같은 증폭된 E1 스톡 1 m당 약 10¹²의 파지미드를 T 세포에 대한 후속 패닝 절차에 사용하였다.

2 순환 및 3 순환의 "순차 패닝"은 다음과 같은 변형을 가하여 1차 패닝 절 차에 대해 기술한 것과 실질적으로 동일하게 수행하였다: (i) 2차 순차 패닝의 경우, ∼10¹¹ 파지미드를 사용하였으며, (ii) 선별 및 세척 후에, 50 ㎕의 PBS/1% BSA+ATP(1O mM) 중에서 RT에서 15 분간 세포를 항온처리함으로써 결합된 파지미드를 용출시켰다. 세포를 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 이러한 절차의 2 순환 패닝으로부터 유래된 용출된 파지미드를 함유하는 생성물은 E1AT1으로 명명하였으며, 증폭시키지 않고 전술한 바와 같이 3 순환의 순차 패닝에 사용하였다. ATP 용출 후에, 2 순환 패닝에서와 같이, 전술한 바와 같이 파지미드를 TG-1 세포에서 증폭시켰다. 증폭된 최종 스톡은 E1AT2로 명명하였다. 감염, 적정 및 서열 분석을 위해 한 분액(5 ㎕)을 TG-1 박테리아 배양물과 혼합하였다. 남아있는 부피(45 ㎕)는 증폭 및 보관을 위해 1.3 ml의 TG-1 세포 현탁액과 항온처리하였다.

패닝에 사용되는 파지미드의 어림수(투입) 및 용출된 결합된 파지미드의 어림수(산출)은 표 2에 L1 바이오패닝 프로토콜의 3개의 연속 단계에 대하여 요약하였다. 각 산출 결과에 대한 세포 공급원 및 용출 매질과, 각각의 개별 스톡을 구별하기 위해 사용된 용어를 기재하였다.

투입 스톡	세포 공급원	용출	산출	증폭된 스톡
Nissim 라이브러리 - 10¹²	T-림프종	산	3.3 x 10⁶	E1
E1 - 10¹¹	T-림프종	ATP(10 mM)	500	E1AT1^*
E1AT1 - 500	T-림프종	ATP(10 mM)	37	E1AT2
* 용출되었으나 증폭되지 않음

표 1에 기재된 결과는, ATP 용출이 2 순환 및 3 순환에 사용될 경우, 용출된 파지의 수가 매우 적다는 것을 나타내며, 이는 파지 특이성이 증가할 수 있음을 암시하는 것이다.

패닝 후에, 각 순환으로부터의 몇 개의 클론을 서열 분석을 위해 선별하였다. 이 섹션에 제시된 아미노산 서열은 다음과 같다: (a) 선별된 클론 중에서 1회 이상 나타나는 서열, (b) 중쇄만의 CDR3 부위(VH-CDR3), 및 (c) 각각의 분리된 클론의 VH 생식선의 종.

클론	VH-CDR3 크기	VH-CDR3 서열	생식선	산출	빈도
L32	8	Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met (서열 번호 4)	VH3-DP32	E1AT 2	4/15
L31	7	Leu Arg Gly Gly Asn Ala Met (서열 번호 5)	VH3-DP32	E1AT 2	5/15

두 가지 유형의 클론 L32 및 L31은 L1 바이오패닝 프로토콜 후에 동정되었으며, 그 서열은 상기 표 3에 기재하였다. CDR3 부위의 아미노산 잔기의 수(VH-CDR3 크기) 및 특이적 CDR3 서열은 각 클론의 생식선 명명과 함께 제시하였다. 뿐만 아니라, 특정 클론 유형이 분리된 횟수를 L1 프로토콜에 대해 서열 분석한 클론의 총 수의 함수(빈도)로서 제시하였다. 흥미로운 사실은, 라이브러리가 5 가지의 상이한 VH 패밀리(VH1, VH2, VH3, VH4, 및 VH6)로부터의 VH를 함유하였고, VH3는 사용된 유전자의 ∼47%를 구성하였음에도 불구하고, 분리된 클론 둘 다 VH3 패밀리(DP32)였다는 것이다. 이것은 scFv 정제 과정에 있어 유리하게 작용하는데, 왜냐하면 단백질 A 세파로스는 VH3 패밀리로부터 유래된 scFv를 정제하는 데 사용되며, VH3 이 외의 VH 패밀리로부터 유래된 클론은 정제할 수 없기 때문이다.

실시예 2

본 실시예는 대조군으로서 비교 연구에 사용된 다양한 scFv 항체의 생산에 대해 기술한다.

Y1 및 Y17 scFv 항체 클론의 분리 및 특성화에 대해서는 미국 특허 출원 제10/032,423호; 제10/032,037호; 제10/029,988호; 제10/029,926호; 제09/751,181 호; 및 제60/258,948호 및 국제 출원 PCT/US01/49442 및 PCT/US01/49440에 상세히 기술되어 있다.

또한, 음성 대조군 scFv 클론을 선별하였다. 모든 결합 실험에서는, 나이브 라이브러리로부터(선별 전) 단일 클론을 피킹하였다. 파지 스톡 및 N14로 명명된 가용성 scFv는 이 클론으로부터 준비하였다. 서열 분석은 이것이 V_H4-DP65 유전자 패밀리에 속한다는 것을 나타낸다. 이 클론에 의해 코딩되는 11량체 V_H-CDR3의 서열은 N14 CDR3로 명명하였으며, 서열 번호 6이다. 추가의 음성 클론 N01은 결합 분석 실험에 사용하였다. 클론 N01(재조합 B형 간염 바이러스[HBV] 입자에 반응성임)은 V_H3-DP35 패밀리에 속하며, 이 클론에 의해 코딩되는 9량체 V_H-CDR3의 서열은 N01 CDR3로 명명하였고, 서열 번호 7이다.

TM scFv 항체 클론(하기)은 T-림프종 세포 막 표면의 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝함으로써 TM 프로토콜을 사용하여 분리하였다. 이 프로토콜에서는, T 세포(2 x 10⁷)의 사전 세척을 L1 프로토콜로 전술한 바와 같이 수행하였다. T 세포 의 사전 세척 후에, 최초의 Nissim 라이브러리로부터 10¹² 파지미드를 함유하는 2 ml MPBS를 첨가함으로써 고정화된 T-림프종 세포 막 상에서 선별을 수행하였다. 튜브를 30 분간 저속으로 진탕시킨 후, 진탕 없이 90 분간 더 항온처리하였다(두 단계 모두 RT에서). 튜브 내용물을 따라내고 튜브를 PBS, 0.1% 트윈으로 10회 세척하고, 이어서 PBS로 10회 세척함으로써 과량의 비결합 파지미드를 제거하였다. 용출을 위해, 기하급수적으로 성장하는 이. 콜라이 TG-1 세포(2 ml)를 튜브에 직접 첨가하고, 37℃에서 저속으로 진탕시키면서 항온처리하였다. 전술한 바와 같이, 분액을 적정을 위해 도말하고, 남아있는 부피는 증폭을 위해 도말하였다. 또한, L1 프로토콜로 전술한 바와 같이 증폭을 수행하였다. 이전에 증폭된 스톡의 10¹¹ 파지미드를 사용하여 추가의 2회 순환에 대해 선별 절차를 반복하였다. 고정화된 T 세포막 상의, 3차 패닝 절차의 증폭된 스톡의 첫 번째 클론을 TM1.1-myc+/TM1.1로 명명하였다. 이 클론, 구체적으로 TM1.1 및 myc 태그를 갖는 이의 변형체(TM1.1-myc+)로부터 몇 개의 scFv 항체를 준비하였다.

TM1.1-myc+ 클론에 추가하여, TM 프로토콜을 이용하여 하기의 추가적인 클론을 분리하였다. 3차 막 패닝의 증폭된 스톡을 무결한 T-림프종 세포를 패닝하는 데 사용하였다. 이 절차는 전술한 L1 프로토콜에 대하여 기술한 것과 실질적으로 동일하게 2 x 10⁷ 세포 및 10¹⁰ 파지미드를 사용하여 수행하였다. 4℃에서 2 시간 동안 항온처리한 후, 결합된 파지미드를 트립신:EDTA(0.25%:0.05%) 50 ㎕를 사용하여 세척된 세포 펠릿으로부터 용출시킨 후, FCS 50 ㎕를 첨가하여 중화시켰다. 적정 및 증폭을 위해서는, 이. 콜라이 TG-1 배양물(A₆₀₀ = 0.5) 1 ml를 사용하였다. TM2로 명명된 증폭된 스톡은 전술한 바와 같이, T-림프종 세포 표면에서의 추가 패닝 순환을 위해 사용하였다. 최종 스톡은 TM3으로 명명하였다. TM 프로토콜 후의 결과로서 분리된 scFv의 서열은 하기 표 4에 기재하였다. scFv의 FITC 표지화 후의 결합 활성 역시 평가하여 scFv 특이성을 보유함을 확인하였다(실시예 7 참조). 예를 들어, T-ALL 세포에 대한 TM3.13의 특이성은 FACS 분석에 따라 그 결합에 의해 확인하였다.

클론	VH-CDR3 크기	VH-CDR3 서열	생식선	산출	빈도
TM2.3 1	7	Leu Thr His Arg Ser Ser Arg	VH3-DP46	TM2	2/10
TM2.2 3	7	Thr Gln Arg Arg Asp Leu Gly	VH3-DP53	TM2	5/10
TM3.2 0	7	Lys Arg Val Ser Leu Leu Thr	VH3-DP70	TM3	1/7
TM3.1 8	7	Ser Tyr Arg Arg His Ser Arg	VH3-DP47	TM3	2/7
TM3.1 3	11	Arg Asp Lys Thr Thr Asn Phe Tyr Phe Met Lys	VH3-DP26	TM3	1/7

실시예 3

본 실시예는 L32 scFv 클론의 제조, 정제, 표지화 및 특성 분석을 설명한다.

가용성 scFv를 제조하기 위해서, 최초의 파지미드 라이브러리를 작제하는 데 사용된 벡터 pHEN1을 scFv 유전자와 pIII 유전자의 접합부에 코딩된 앰버 종결 코돈을 갖도록 디자인하였다. 따라서, 선별된 클론의 벡터가 파지미드 감염에 의해 비-저해 인자 균주인 이. 콜라이 HB2151으로 도입되었을 때, 이 시스템은 박테리아 주변 세포질로의 가용성 scFv의 생산 및 분비를 가능하게 한다(Harrison et al., Methods in Enzymol. 267: 83-109 (1996)). 그 후 scFv는 배양액으로부터 쉽게 회수될 수 있다. 가용성 scFv는 lacZ 프로모터의 제어 하에 생산되며(Gilbert and Muller-Hill, PNAS (US) 58: 2415 (1967)), 이는 그 후 IPTG(이소프로필티오갈락토시드)에 의해 유도된다.

10 아미노산의 c-myc 태그를 코딩하는 서열 - 서열 번호 8 - 은 벡터 내에 앰버 돌연변이의 상류에 포함된다. 발현된 scFv의 C-말단은 c-myc 태그를 보유하여야 하며, 이 태그는 마우스 항-myc 태그 항체(유럽 모식균 배양 수집소(ECACC) 9E10- 하이브리도마로부터 유도됨)를 사용하여 검출할 수 있다.

선별된 클론 및 대조군 클론 N01의 scFv는 모두 VH3 패밀리에 속하며, 단백질 A 친화성 컬럼 상에서의 정제를 가능하게 한다. 각 클론의 유도된 배양물로부터의 주변 세포질 분획(100∼250 ml)을 준비하여 단백질 A 세파로스 비드와 함께 항온처리하였다. 결합된 scFv는 산 용출(0.1 M 글리신, pH 3.0)에 의해 컬럼으로부터 회수한 후, Tris, pH 8.3을 사용하여 용출물을 중화시켰다. 회수된 단백질의 농도는 A₂₈₀ 측정에 의해 결정하였으며, 이어서 투석에 의해 또는 G-25 세파로스 컬럼 상에서 PBS 완충액 교환을 실시하였다.

L1 프로토콜로부터 유도된 클론 L32의 scFv 역시 VH3 유전자 패밀리(DP-32)에 속한다. 그러나, 주변 세포질로부터 추출한 후, 5 mM DTT가 필요하여, 단백질-A 친화성 컬럼 상에 샘플을 로딩하기 전에 첨가한 다음, 단백질-A 세파로스 비드 상 에서 정제 및 회수하고, 전술한 바와 같이 PBS 완충액 교환을 수행하였다.

음성 대조군 N14의 scFv는 VH4 유전자 패밀리에 속하며, 이는 단백질 A 친화성 컬럼 상에서 정제할 수 없었으며, 따라서 세파크릴 S-200 컬럼 상에서 정제하였다. ScFv N14는 60% 황산암모늄을 사용하여 총 단백질을 200 ml의 유도된 배양물의 주변 세포질 분획에 침전시켜 정제하였다. 펠릿은 0.1 x PBS, 5 mM EDTA, 5 mM PMSF 2 ml에 현탁시키고, 이것을 진행 완충액(0.1 x PBS, 5 mM EDTA)으로 사전 평형화시킨 세파크릴 S-200 컬럼(1.5 x 90 cm)에 로딩하였다. 단백질을 분별화하고, N14 scFv를 함유하는 분획(SDS-PAGE 및 웨스턴 분석으로 검출)을 모아서 동결 건조시키고 1/10 부피의 H₂O에 현탁시켰다. 그 후 N14 scFv(비표지 및 FITC-표지)를 FACS 분석 실험에서 음성 대조군으로서 사용하였다.

그 후 정제된 scFv는 FITC로 표지하였다. 각 제제로부터의 약 1 mg의 정제된 scFv를 PBS에 현탁시키고, 제조업자의 지시에 따라 플루오로-태그 FITC 접합 시판용 키트(시그마-알드리치 코포레이션, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 사용하여 FITC에 커플링하였다. 정제 및 FITC 표지화 후에, 각 제제(표지화 및 비표지화)의 프로필을 SDS-PAGE, 웨스턴 블로팅, 수퍼덱스-75 컬럼을 사용한 HPLC(A₂₈₀ 및 A₄₉₅), 및 형광측정에 의해 분석하였다. 분석 결과, N14 scFv에 대해서는 80% 순도, VH3 클론에 대해서는 90% 순도였고, 각 scFv 분자에 약 2 분자의 FITC가 접합되었다(F/P 비 2:1).

실시예 4

본 실시예는 세척된 혈소판 및 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)에 대한 L32 scFv 의 결합 및 혈소판 응집에 대한 L32 scFv의 효과를 입증한다.

혈소판 응집 실험을 위해, 3.8% 시트르산나트륨을 함유하는 튜브에 혈액을 모았다. 250 x g에서 10 분간 원심분리하여 PRP를 준비하였다. 산-시트레이트-덱스트로스(ACD) 중의 혈소판 농축물은 혈액 은행으로부터 입수하였다. 혈소판을 분리하고, ACD를 함유하는 완충액으로 1회 세척하고, 염수로 1:7의 비로 세척하였다. 매회 세척 후 혈소판을 800 g에서 10 분간 원심분리하고, Tyrodes 용액(2 mM MgCl₂, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 3 mM NaH₂P0₄, 0.1% 글루코스, 5 mM Hepes 및 0.35% 알부민, pH 7.35)에 현탁시키고, 세포의 수를 계산하였다.

PRP 및 세척된 혈소판을 전혈로 발광응집측정기(Chronolog, Havertown, PA)에서 37℃에서 500 rpm에서 교반하였다. 혈소판 현탁액과 현탁 매질을 통한 빛 투과의 차이를 100% 응집으로서 간주하였다. 혈소판 응집에 대한 L32의 효과는 작용제를 첨가하기 전 상이한 농도의 L32의 첨가에 의해 평가하고, 이 효과를 4 분간 기록하였다(도 2).

응집 분석은 세척된 혈소판을 사용하여 수행하였다. 반응 혼합물은 2 x 10⁸ 세척된 혈소판/ml 및 4 ㎍/ml의 돼지 폰 빌레브란트 인자를 함유한다. 37℃에서 3 분 항온처리한 후, 0.4 mg/ml의 리스토세틴(응집 작용제)을 첨가하고, 응집 반응을 4 분간 기록하였다. 혈소판 응집에 대한 L32 및 기타 scFv 항체의 영향은 작용제를 첨가하기 전 50 ㎍/ml의 scFv를 첨가함으로써 평가하였으며, 효과는 4 분간 기록하 였다. 세척된 혈소판의 폰 빌레브란트 인자 의존적 응집에 대한 L32의 영향은 세척된 혈소판(n=2)의 두 샘플에서 테스트하였으며, 정상적 응집(90% 응집)은 공지된 효과를 갖는 scFv인 Y1에 의한 응집의 제거에 대하여 관찰하였다. TM 프로토콜을 사용하여 분리한 TM1.1-myc+의 효과 역시 대조군으로서 평가하였다. 동일한 조건에서, Y1 scFv 항체는 리스토시틴 유도 혈소판 응집을 ∼70% 억제하였다(도 2).

PRP를 사용한 응집 분석을 위해서는, 반응 혼합물은 PRP(∼2 x 10⁸/ml)를 함유한다. 37℃에서 3 분간 항온처리한 후, 1 mg/ml의 리스토세틴(응집 작용제)을 첨가하고, 응집 반응을 4 분간 기록하였다. 혈소판 현탁액과 PPP(혈소판이 적은 혈장)을 통한 빛 투과의 차이를 100% 응집으로서 간주하였다. 혈소판 응집에 대한 L32의 효과는 3개의 상이한 공여체(n=3)로부터의 PRP에서 작용제를 첨가하기 전 50 ㎍/ml의 scFv를 첨가함으로써 평가하고, 그 효과는 4 분간 기록하였다. 정상 응집(90% 응집)은 PRP에 L32 scFv를 첨가한 후에 관찰되었다(도 2). 전술한 바와 같이, L32의 효과는 TM1.1 및 Y1의 효과와 비교하였다. 세척된 혈소판과 유사하게, Y1은 PRP 혈소판 응집을 ∼70% 억제하였다.

결론적으로, 50 ㎍/ml의 클론 L32는 세척된 혈소판 또는 PRP의 혈소판 응집에 유의적인 억제 효과를 나타내지 못했다.

혈소판의 L32 scFv 염색(결합) 역시 FACS로 측정하였다. 이 방법은 형광 마커에 의한 염색 강도에 기초한 측정에 유용하다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Y1 및 Y1-myc+ scFv(c-myc 태그를 갖는 글리코칼리신 반응성 Y1 scFv 항체)를 사용한 염 색은 PRP로부터 염색된 혈소판을 생성하였다. 이와는 달리, 이들 혈소판을 L32 scFv로 염색한 후의 형광 시그널은 대조군 항체를 사용하여 염색한 것에 비해 상대적으로 변화하지 않았다(도 3의 히스토그램과 비교할 것, 도 3에서 TM1.1-myc+는 어떠한 혈소판 결합 에피토프에도 결합하지 않는 scFv임).

실시예 5

각종 상이한 세포주에 대한 scFv L32의 결합은 FACS로 분석하였다. 분석은 (i) L32; (ii) 항-단일쇄 항체; 및 (iii) 항-토끼 FITC-표지 항체를 사용한 3 단계 염색 후에 수행하였다. 음성 대조군의 것에 대한, L32 결합 후의 세포 집단의 기하 평균의 비에 따라 여러 세포주를 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 분류하였다. 낮은 결합력의 세포에는 1의 비를 할당하였고, 중간 결합력의 세포에는 1∼4의 비를 할당하였고, 높은 결합력의 세포에는 4보다 큰 비를 할당하였다.

L32 높음	L32 중간	L32 낮음
KG-1	Molt-4	Raji
Jurkat	Hut78 HEL K562 CCRF-CEM HL60	Daudi UMUC3 Namalw a

이들 단일쇄 항체에 의한 이들 세포 상에서의 Y1과 L32 간의 동일한 결합 부위에 대한 경쟁을 조사하였다. 그러한 한 실험에서는, KG-1 세포(AML 환자로부터 유래된 인간 세포주)에 대한 바이오틴 표지된 Y1(Y1-myc+)에 대한 비표지 항체의 경쟁을 평가하였다. 결과는 도 4 및 5에 나타내었다. 도시된 바와 같이, L32는 자 체가 Y1 scFv와 유사하게 KG-1 세포 상의 Y1 결합에 대해 경쟁한다. 이러한 결과는, L32 scFv가 용량 의존적 방식으로 KG-1 세포에 대한 ¹²⁵I 표지된 Y1 scFv의 결합을 부분적으로 치환하였던 예비 방사능 수용체 분석 실험에 의해 지지되었다.

KG-1 세포에 대한 결합에 있어서 비표지된 항체가 바이오틴 표지된 L32 scFv(0.5, 2 또는 5 ㎍)와 경쟁하는 능력을 경쟁 실험에서 평가하였다. 미국 특허 출원 제10/032,423호; 제10/032,037호; 제10/029,988호; 제10/029,926호; 제09/751,181호; 및 제60/258,948호 및 국제 출원 PCT/US01/49442 및 PCT/US01/49440에 제시된 결과들은 Y1 및 항-CD162 항체가 CD162 항원에 대한 결합에 대해 경쟁한다는 것을 입증한다. FACS 분석은 표지된 항체 결합을 측정하는 데 이용되었고, 그 결과는 결합의 기하 평균값으로서 나타내었다. 이러한 결과들은, 표 6에 요약된 바와 같이, Y1 scFv 및 항-CD162 항체에 의한 항체 치환의 농도 의존성을 입증한다. 비표지된 항체의 양이 표지된 항체의 양보다 훨씬 더 많을 경우, 결합의 70% 이상이 특이적 항체에 의해 치환되는 반면, 비특이적 TM1.1 scFv는 L32 결합에 유의적인 영향을 미치지 못하였다. 항-CD162는 L32를 치환하는 데 가장 큰 역량을 나타내지만(89% 정도), Y1 및 L32 scFv 항체는 상이한 정도로 L32 결합을 치환하였다. 제시된 결과 및 기타 결과에 기초하여, L32 및 Y1 결합 둘 다에 대해 경쟁하는 데 Y1보다 L32가 적게 필요하였으며, 이는 L32가 동일한 부위에서 Y1보다 더 큰 결합 역량을 보유함을 시사하는 것이다. 따라서, 이러한 결과들은 L32 결합의 특이성, 및 L32 에피토프와 Y1 및 항-CD162 항체에 의해 인식되는 것 간의 상당한 연관성을 추 가로 지지한다.

억제제 농도	L32 바이오틴 농도
억제제 농도	0.5 ㎍ L32-B	2 ㎍ L32-B	5 ㎍ L32-B
무	22.65
50 ㎍ TM1.1	21.6	28.3	38.32
50 ㎍ Y1	6.36	12.99	21.99
50 ㎍ L32	5.66	9.34	22.58
5 ㎍ 항-CD62	4.06	3.95	4.4

L32, Y1, 및 항-CD162 항체 간의 경쟁은 KG-1 세포에 대한 표지된 항-CD162 항체의 치환 정도를 조사함으로써 추가로 평가하였다. L32 및 Y1 scFv 항체(50 ㎍) 둘 다 KG-1 세포의 항-CD162(5 ㎍) 표지화의 기하 평균을 약 82% 감소시키는 것으로 확인되었다. 따라서, 이들 항체의 에피토프는 명백히 서로 밀접한 관련이 있다.

실시예 6

본 실시예는 ELISA에 의한, GPIb의 단백질 분해 단편인 글리코칼리신(GC)에 대한 L32 scFv 항체의 결합을 입증한다.

GC는 Michalson[Blood 67: 19-26 (1986)]에 의해 기술된 바와 같이 신선한 인간 혈소판으로부터 정제하였다. 분석에 사용하기 전에, 두 개의 상이한 시판되는 모노클로널 항체 제제를 사용하여 EIA에 의해 GPIb의 실체를 확인하였으며, 이때, 파민젠(San Diego, CA)으로부터 구입한 제1 항체(클론 H1P1)는 리스토세틴 유도 혈소판 응집을 억제하고, 세로텍 인코포레이트(Raleigh, NC)로부터 구입한 제2 항체 제제(클론 PM6/40)는 혈소판 응집을 억제하지 않는다.

GC에 대한 L32의 결합의 정량적 분석은 ELISA에 의해 측정하였다. 1 ㎍/ml (PBS X 1)로 희석시킨 GC는 4℃에서 밤새 항온처리함으로써 맥시솝 평판 웰을 코팅하는 데 사용하였다. 과량의 GC를 제거한 후, 평판을 PBSTM(2% 우유 및 0.05% 트윈을 함유하는 인산염 완충 염수 용액)으로 실온에서 1 시간 동안 차단하였다. PBST로 충분히 세척한 후, 평판을 PBSTM에 희석시킨 다양한 농도의 scFv와 함께 항온처리하였다. 이후에, 평판을 1:250으로 희석시킨 항-scFv, 또는 1:50으로 희석시킨 항-VL 또는 1:100으로 희석시킨 항-myc과 항온처리한 후, PBSTM에 1:25,000으로 희석시킨 항-토끼 HRP(Jackson) 또는 1:25,000으로 희석시킨 항-마우스 HRP(참고용으로서)와 항온처리하였다. 반응은 TMB를 사용하여 진행시켰으며, 0.5 M H₂S0₄를 첨가하여 중단시켰다. 평판은 ELISA 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였고, 이중 샘플의 결과를 평균내었으며, ELISA 단위 값은 평균값으로부터 바탕(1차 항체를 사용하지 않고 염색함) OD 값을 감하여 계산하였다. 도 6에 도시된 결과는 GC에 대한 Y1 결합이 L32의 결합보다 약 3∼4배 더 크다는 것을 나타낸다.

실시예 7

본 실시예는 웨스턴 블롯 분석에 의해 다양한 인간 유래의 공급원으로부터의 단백질에 대한 L32 scFv 항체 결합을 보여준다.

세포 추출물(용해물)을 준비하였다. 세포(2 x 10⁶)를 회수하고, 마이크로원심분리기(1300 rpm, 4℃, 5 분)에서 원심분리하였다. 펠릿을 0.5∼1 ml의 PBS로 세척하고, 약하게 혼합하고, 이 혼합물을 전술한 바와 같이 원심분리하였다. 0.5∼1 ml의 PBS를 사용한 세척을 반복하고, 펠릿화된 세포를 용해 완충액(200 ㎕/20 x 10⁶ 세포 펠릿)에 현탁시켰다. 사용된 용해 완충액은 50 mM Tris pH 7.4, 1 mm PMSF 1% NP-40, 및 1 mM EDTA였으나, 다른 적합한 용해 완충액을 사용할 수도 있다. 현탁액은 약 60 분간 얼음 위에서 항온처리하였고, 그 후 원심분리하였다(3000 rpm, 4℃, 5 분). 그 후 상청액을 수집하여 분액으로 나누었다.

미정제 막 분획 및 막 단백질의 추출물 역시 준비하였다. 20 부피의 균질화 완충액을 1 부피의 패킹된 세포에 첨가하였다. 균질화 완충액은 2%(w/v) 트윈 20, 1 mM MgS0₄, 2 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 및 25 mM Tris-HCl, pH 7.4를 함유하였다. 하기의 프로테아제 억제제 역시 첨가하였다: 1 mM PMSF, 5 ㎍/ml 루펩틴, 및 5 ㎍ /ml 아프로토닌. 세포를 회전 테플론 페슬(Ultra-Torex)을 구비한 Potter-Elvehjem 균질기를 사용하여 3∼5 스트로크의 속도로 균질화하였다. 샘플은 균질화하는 동안 저온 상태로 유지하였고, 그 후 빙욕에서 1 시간 동안 교반하였다. 샘플을 균질기에서 몇 회의 추가 스트로크에 가한 후, 4℃에서 3000 g로 30 분간 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 45000 g(19000 rpm 로터 ss-34)에서 4℃에서 1 시간 동안 원심분리하였다. 45000 g 원심분리로부터 얻은 상청액은 버렸다. 50 mM Tris 7.4, 1 mM EDTA, 1% NP-40 및 프로테아제 억제제의 용액을 펠릿에 첨가하고, 용해된 펠릿을 1 시간 동안 얼음 위에 두었다.

건강한 개체의 혈액 은행으로부터 모은 혈장을 PBS로 1:10(v/v)으로 희석시킨 후 혈장 단백질 샘플을 준비하였다. 희석된 용액은 0.45 ㎛ 멤브레인에 통과시켜 여과하고, 분액은 분석시까지 동결된 상태(-20℃)로 보관하였다. 그 후 샘플을 시그마 Z37,503-9 장치를 사용하여 140∼160 볼트에서 3.5 시간 동안 10% SDS-PAGE에서 전개하였다. 전기영동된 샘플을 RT 및 20 볼트에서 트리스 글리신 완충액(20% MeOH, 192 mM 글리신, 25 mM TRIS, pH 8.3) 중에서 니트로셀룰로스 멤브레인에 이전시켰다.

니트로셀룰로스 멤브레인을 RT에서 1 시간 동안 5% 탈지유를 사용하여 차단시켰다. 그 후 멤브레인을 RT에서 5 분간 3회 세척하였는데, 매회 PBS 중의 0.05% 트윈 20으로 세척하였다. 멤브레인을 PBS 중의 5 ㎍/ml Y1-바이오틴, L32-바이오틴, 또는 2% 탈지유 중의 TM1.1-바이오틴과 RT에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 그 후 멤브레인을 5 분간 3회 세척하였는데, 매회 저온실에서(약 4℃∼약 10℃) 저온 0.05% 트윈 20 PBS 용액으로 세척하였다. 그 후 멤브레인을 저온실에서 2% 탈지유, 0.05% 트윈 중의 1:1000의 SAV-HRP(스트렙타비딘-HRP) 희석액(최종 농도 1 ㎍/ml)과 항온처리하였다. 희석은 RT(약 25℃)에서 수행하였고, 그 후 희석된 SAV-HRP는 사용 전에 얼음 위에서 10∼15 분간 냉각시켰다. 항온처리는 약하게 진탕시키면서 1 시간 동안 수행하였다.

SAV-HRP과 항온처리한 후, 멤브레인을 전술한 바와 같이 세척하였다. 그 후 멤브레인을 시판용 프로토콜에 지시된 대로 수퍼 시그널(Super Signal) 혼합물(피어스)과 5 분간 항온처리하고, 그 후 과량의 용액을 건조시켰다. 멤브레인을 X-선 필름(후지)에 노출시키고, 그 필름을 현상하였다. 이러한 실험의 결과(도 7)는 L32가 PSGL-1의 것의 분자량, 약 105 kD을 갖는 백혈병 세포 상의 단백질에 결합한다는 것을 나타낸다. 또한, L32 및 Y1 둘 다 GC 및 KG-1 세포의 동일한 밴드와 반응 한다. 그러나, 혈장 단백질에 대한 L32 결합은 Y1보다 훨씬 더 적으며, Raji 세포 추출물은 이러한 > 100 kDa에 대해 음성이었다.

실시예 8

본 실시예는 ELISA에 의해 L32 및 Y1에 대한 황산화 및 비황산화된 펩티드의 결합을 비교한 것을 보여준다.

유사한 에피토프(GPIb의 아미노산 268∼285 및 성숙 PSGL-1의 아미노산 1∼17)를 토대로 황산화 및 비황산화된 합성 펩티드를 제조하고, L32 scFv 항체의 결합 특이성을 평가하는 데 사용하였다(ELISA). 황산화 및 비황산화된 펩티드(1 μM)를 ELISA 분석에 적합한 미량적정 평판에 부착시키고, 부착되지 않은 펩티드는 철저히 세척한 후, 비특이적 결합 부위를 차단시켰다. 평판은 표시된 농도로(도 8 참조) scFv 항체와 RT에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 부착된 scFv는 폴리클로널 토끼 항-V_L 항체 및 이어서 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 항-토끼 항혈청을 사용하여 검출하였다. 샘플은 기질 TMB를 사용하여 발색시키고, 약 10 분 후 0.5 M H₂S0₄를 첨가하여 퍼옥시다제 반응을 중단시켰다. 이들 펩티드에 대한 L32 결합은 Y1 및 TM1.1(음성 대조군으로서) scFv 항체의 것과 비교하였다. 바탕 염색(1차 항체 부재시)은 각 값으로부터 감하여 막대 그래프에 제시된 값을 얻었다. 펩티드의 결합력을 평가하고, 그 필수적인 구조적 특성을 하기 표 7에 제시하였다.

유의적인, 용량 의존적인 L32 scFv 항체 결합은 펩티드 F, H, I 및 J, 즉, 세 번째 위치의 티로신 잔기에서 황산화된 PSGL-I-관련 펩티드 및 L 및 P28S, 즉, 첫 번째 티로신 잔기에서 황산화된 GPIbα-관련 펩티드를 사용하여 얻었다(도 8). J에 대한 L32 scFv 항체 결합은 I에 대한 그 결합과 매우 유사하였다. GPIb-관련 L(P1S) 펩티드에 대한 결합은 유의적이지만, 이것은 그럼에도 불구하고 PSGL-1 관련 펩티드를 사용하여 얻은 것보다 비교할 수 있을 만큼 낮았다. Y1이나 L32나 어 느 것도 황산화된 PSGL-1 관련 펩티드 G 및 D(세 번째 잔기에 황산화가 없음)에 유의적으로 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 게다가, Y1이나 L32나 어느 것도 피브리노겐 γ-사슬에 관련된 황산화된(또는 비황산화된) 펩티드에 결합하지 않았다. 어느 scFv 항체도 티로신이 황산화되지 않은 펩티드에는 결합하지 않았는데, 이는 황산화가 결합에 필요함을 나타낸다. 뿐만 아니라, GPIb-관련 펩티드, P28S에 대한 데이터는 첫 번째 티로신의 황산화가 GPIb에 대한 결합에 중요하다는 것을 시사하는 반면, PSGL-1 펩티드 I 및 J에 대한 데이터는 E와 비교하여 세 번째 티로신의 황산화가 PSGL-1에 대한 결합에 중요함을 시사한다. Y1 및 L32는 황산화된 펩티드에 대하여 결합 거동의 패턴이 실질적으로 동일하나(이러한 분석에서), Y1은 각 경우 L32에 대한 결합 친화력이 더 큰 것으로 나타난다.

상기 실험 결과 및 미국 특허 출원 제10/032,423호; 제10/032,037호; 제10/029,988호; 제10/029,926호; 제09/751,181호; 및 제60/258,948호 및 국제 출원 PCT/US01/49442 및 PCT/US01/49440에 제시된 데이터로부터, L32 scFv 항체에 대한 에피토프는 성숙 PSGL-1 상의 아미노산 1∼17 사이에 위치하며, 여기에 음전하 아미노산의 클러스터가 존재한다는 결론을 내렸다.

E-, L- 및 P-셀렉틴에 대한 수용체인 PSGL-1은 경쟁 분석에 기초하여 Y1 항체의 리간드로서 확인되었으며, 이때 KG-1 세포에 대한 Y1 항체의 결합은 시판되는 여러 항 PSGL-1 항체 존재 하에 수행되었다. PSGL-1의 N-말단 영역은 음전하 아미노산의 클러스터가 동반되는 황산화된 티로신 잔기를 포함한다(미국 출원 제10/032,423호; 제10/032,037호; 제10/029,988호; 제10/029,926호; 제09/751,181호; 및 제60/258,948호 및 국제 출원 PCT/US01/49442 및 PCT/US01/49440).

Y1 항체가 몇 개의 분자, 예컨대 혈소판 상의 글리코칼리신 분자, 피브리노겐-감마 프라임, 인간 혈장의 보체 화합물 4, 및 PSGL-1 분자에 결합함에도 불구하고, AML 또는 다발성 골수종(MM) 환자로부터 유래된 1차 백혈병 세포에 대한 친화력은 전술한 에피토프에 비해 더 크다.

어떠한 특정한 이론에 제한되기를 바라는 것은 아니며, 하기 실시예 10, 16 및 17에 제시된 바와 같이, 백혈병 세포주 및 악성 세포에 대한 L32의 더 큰 상대적 친화력과 비교하여(Y1의 친화력과 비교하여), 황산화된 펩티드에 대한 Y1의 더 큰 상대적 친화력(L32의 친화력과 비교하여)은 세포 상의 완전한 천연 단백질에 있어서 관련된 펩티드 서열의 배좌 또는 노출에 있어서 가능한 차이와 같은 인자에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 실험에 사용된 펩티드는 선형이며, 그 천연 상태에서 갖는 것과 같은 2차 및 3차 구조를 가지고 있지 않았다. 그러한 차이는 속박되지 않은 선형 펩티드인 합성 펩티드에서는 분명하지 않을 수 있다. 따라서, L32 항체 결합의 치료적 적용 잠재성은, 세포 시스템에 의해 제시되는 인공 합성 펩티드 시스템에서는 인지하지 못할 수 있다.

실시예 9

미국 출원 제10/032,423호; 제10/032,037호; 제10/029,988호; 제10/029,926호; 제09/751,181호; 및 제60/258,948호 및 국제 출원 PCT/US01/49442 및 PCT/US01/49440의 결과는 Y1 및 Y17 항체가 혈소판 상에서 유사한 인식 프로필을 갖는다는 것을 입증하였다. 본 실시예는 GPIb 유래의 펩티드 티로신 황산화 및 돌 연변이가 세척된 혈소판에 대한 Y17 scFv 항체 결합에 미치는 영향, 및 PSGL-1 유래의 펩티드에 대한 Y17 결합의 티로신 황산화에 대한 의존성을 입증한다.

표 6으로부터 선택된 GPIb 유래 펩티드 및 하기 서열을 갖는 두 개의 추가적인 N-말단이 생략된 GPIb 유래 펩티드를 본 실험에 사용하였다: P2S -TDLY*DY*Y*PEEDTE 및 P25S - TDLYDY*Y*PEEDTE.

세척된 혈소판에 대한 Y17 scFv 항체 결합은 실시예 4에 기술된 FACS에 의해 조사하였다. 다양한 펩티드가 혈소판에 대한 Y17 결합에 미치는 영향은 먼저 Y17을 표시된 농도의 펩티드(도 9 참조)와 항온처리한 후 혈소판 제제에 첨가하여 평가하였다.

테스트된 모든 펩티드 중에서, 276번 위치(P28S)에서 황산화된 티로신을 포함하는 GPIb 유래 펩티드는 세척된 혈소판에 대한 Y17 결합을 최대한으로 억제하였다. 아미노산 변화를 포함하는 GPIb 유래 펩티드를 제조하고, Y17 인식에 대해 컨센서스 서열 요건을 확인하기 위해 테스트하였다. 이러한 결과들은 첫 번째 황산화된 티로신이 세척된 혈소판에 대한 Y17 결합에 중요하다는 것을 시사한다. 그러나, 두 번째 티로신의 황산화는 Y17 인식에 있어서 어떠한 역할을 하지 못하는 것이 분명하다. 277번 위치 및 275번 위치에서의 아스파르테이트(D)의 음전하 아미노산 잔기 역시 Y17 결합에 있어 중요하다. 이 결과는 Y1에 대하여 관찰된 것과 유사하였다.

PSGL1에 대한 Y17 scFv 항체 결합을 결정하는 조건을 확인하기 위해, 평판에 결합된 PSGL1 유래 펩티드를 사용하여 ELISA 분석을 수행하였다. Y17 scFv 항체 5 및 20 ㎍/ml는 양 PSGL-1 유래의 펩티드, 즉 세 번째 위치에서 황산화된 티로신을 포함하는 I 및 3개의 황산화된 펩티드를 포함하는 J에 강하게 결합하였다. 도 10은 J에 대한 Y17 scFv 결합이 J에 대한 Y1 결합보다 약간 더 컸으며, 양 scFv는 I에 유사하게 결합하였음을 나타낸다. I에 대한 이들의 결합은 J에 대한 결합보다 더 컸다. Y1이나 Y17 어느 것도 G(황산화되지 않은 PSGL1 펩티드)에는 유의적으로 결합하지 않았다.

요약하면, 펩티드 수준에서 3개의 모든 클론, Y1, Y17, 및 L32는 유사한 특이성 프로필을 갖는다.

실시예 10

본 실시예는 정상적인 지원자 및 백혈병 환자로부터의 1차 세포에 대한 L32의 결합을 입증한다.

박테리아 클론 배양, 유도 프로토콜, scFv 항체 단편 회수, 및 항체 단편 정제에 대한 모든 절차는 Harrison 등의 상기 문헌(1996)에 따라 수행하였다. 기본적으로, 임의의 2 이상의 개별 scFv 클론을 Nissim I 항체 파지 라이브러리로부터 선별하여, Nissim 라이브러리에 존재하는 임의의 개별 scFv 항체 또는 임의의 IgG 또는 이의 단편(이것이 동일한 V_L 또는 이의 단편을 포함한다면)을 인식하는 토끼 유래의 폴리클로널 항체를 제조할 수 있다.

폴리클로널 항체는 Nissim I 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도된 scFv 항체 클론(Y1)으로부터 유래된 V_L에 대하여 생성되었다. 인간 항체의 V_L 도메 인을 코딩하는 DNA 단편을 Y1 클론으로부터 하기의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 즉, 올리고 5'-Ndel (TTTCATATGGAGCTGACTCAGGACCCTGCT) 및 올리고 3'-EcoRI (TTTGAATTCCTATTTTGCTTTTGCGGC)를 사용하여 PCR 클로닝하였다(동일한 DNA 단편은 Nissim I 라이브러리(Nissim et al., (1994), supra)의 임의의 다른 클론으로부터 얻을 수 있거나 또는 동일한 방법을 이용하여 인간 게놈으로부터 얻을 수 있음). 폴리머라제 연쇄 반응(PCR 조건: 94℃ 1', 56℃ 2', 72℃ 2' x 30, 그 후 65℃ 5')에 의해 증폭시킨 후, 얻어진 DNA 단편을 NdeI 및 EcoRI 제한 효소로 분해하고, 사전에 분해한 플라스미드의 NdeI 및 EcoRI 제한 효소 부위로 클로닝하였으며, 이것은 이. 콜라이에서 재조합 단백질의 원핵 발현에 사용되는 IPTG 유도성 발현 벡터이다.

이. 콜라이 세포는 결찰 반응물로 형질전환시키고, 상기한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 양성 클론을 선별하였다. 이 플라스미드를 보유하는 세포를 성장시키고, IPTG에 의해 발현을 유도하였다. IPTG로 유도한 다음, 22℃에서 16 시간 동안 성장시킨 후, 1 L의 배양액으로부터 원심분리에 의해 박테리아 세포를 회수하였다. 봉입체를 분리하고, 구아니딘-HCl + DTE 중에 용해시키고, TRIS-아르기닌-EDTA를 함유하는 완충액 중에 희석시켜 리폴딩하였다. 5∼10℃에서 48 시간 동안 리폴딩한 후, 단백질을 함유하는 용액을 투석하고, 20 mM 글리신, pH 9에서 농축시켰다. 단백질을 함유하는 투석된 용액을 이온 교환 컬럼 HiTrapQ를 사용하여 재정제하고, NaCl 구배로 용출시켰다. 주요 피크는 SDS-PAGE 및 젤 여과에 의해 분석하였다. 최초 1 L 배양액으로부터 최소 10 mg의 정제된 V_L을 얻었다.

그 후 토끼를 CFA(완전 프로인트 보조제) 존재 하에 V_L(400 mg)로 면역화하고, 그 후 2∼4 주 간격으로 IFA(불완전 프로인트 보조제) 존재 하에 V_L(200 mg)로 면역화하였다. 얻어진 역가는 낮았으며(1:50∼1:100), 이는 아마도 인간 및 토끼 유래 V_L 간에 상동성이 높기 때문인 것 같다.

면역화된 토끼의 혈청으로부터 직접 또는 단백질 A-세파로스 컬럼 상에서 정제한 후의 폴리클로널 항-scFv 항체를 사용하여, FACS에 의해 분석된 세포 또는 SDS-PAGE(웨스턴 블롯 분석)에 의해 분리된 다양한 단백질 분획에 대한 scFv 항체 결합을 검출하였다.

일반적으로, 선별된 클론의 특이성을 테스트 및 확인하기 위해 3 가지 FACS 분석 중 하나를 수행하였다. 미정제 추출물 또는 정제된 비표지 scFv를 사용하고, 이어서 마우스 항-myc 항체를 사용하고, 마지막으로 FITC- 또는 PE-접합된 항-마우스 항체를 사용하는 "3 단계 염색" 절차를 확립하였다. 이러한 절차는 대안적으로 제2 시약으로서 토끼 항-VL을 사용하고, 이어서 FITC-표지된 항-토끼 항체를 사용하여 수행하였다. 혈액 또는 골수 샘플 유래의 세포의 FACS 분석에는 5∼8 x 10⁵개의 백혈구가 필요하였으며, 이것은 1% BSA를 함유하는 PBS에 현탁시켜 사용하였다. 결합은 4℃에서 1 시간 동안 수행하였다. 각 단계 후, 세포를 세척하고, 1% BSA를 함유하는 PBS에 현탁시켰다. 최종 염색 단계 후, 적혈구의 용해는 이 분석의 마지막 단계였고, 이어서 세포를 PBS에 현탁시킨 후, FACS(벡턴-디킨슨)로 판독하였다. "2 단계 염색" 절차에 의해 염색된 세포의 분석은, 세포를 먼저 myc- 또는 비오틴-표지된 1차 항체에 노출시킨 후, 이들을 각각 FITC 표지된 항-myc 항체 또는 PE 표지된 스트렙타비딘으로 염색함으로써 3 단계 절차에 대한 대안으로서 수행하였다. scFv-FITC를 사용한 직접 세포 염색 절차는 후속 FACS 분석을 위해 확립하였다. 이러한 새로운 방법은 scFv-FITC 표지화를 위해 한 단계의 항온처리만 필요로 한다. 또한, 항-myc과 정상 PBL과의 높은 반응성에 기인한 고유의 높은 바탕값은 scFv-FITC가 FACS 분석에 사용될 때보다 훨씬 더 낮았다. 직접 FITC-scFv 표지화 및 "3 단계 염색" 둘 다에 의해 얻어진 결과는 매우 유사하였으며, 이는 표지된 scFv의 생물학적 활성이 FITC 표지화 절차에 의해 파괴되지 않았음을 나타낸다. 따라서, 표지된 scFv는 비표지 항체의 결합 활성과 유사한 결합 활성을 보유한다.

FACS 프로토콜은 혈액 및 골수 샘플을 분석하기 위해 수행하였다. 샘플은 병원으로부터 제공받았으며, 환자의 동의를 얻었다. 처음에, 세포 샘플을 3 단계 염색 절차를 이용하여 염색하였으며, 이때 결합된 scFv 항체의 검출은 마우스 항-myc 태그 항체를 사용하고, 이어서 형광 표지된 항-마우스 Ig 항체를 사용하여 수행하였다. 이 분석에서는, 그 결과를 도 11에 제시하였으며, 테스트 scFv(T 세포 패닝으로부터 유래된 TM1.1, TM3.13, 및 L32)는 정상 말초 혈액 림프구(N-PBL)와 비교하였을 때 T-림프종/백혈병 세포에 대해 높은 수준의 결합을 일관적으로 나타내었다. 이와는 달리, B-CLL 세포는 N-PBL에 의해 나타내어지는 것과 유사하게, scFv에 의해 비교적 낮은 수준으로 염색되었다(표 8). FACS 분석에 1/50 scFv 희석이 이용될 경우, 바탕값 결합만이 검출되었다.

세포 유형	대조군	L32
T-림프종/백혈병	1.4	40
B-CLL	0.2	5
N-PBL**	4.9	5
* 항-myc 및 항-마우스-FITC만을 사용하였음 ** 정상 말초 혈액 림프구

후속 실험에서는, 환자의 전혈 또는 골수 샘플(및 정상 개체로부터의 샘플)을 30 ㎕/튜브로 조정하였다. 튜브당 5 ㎕의 CD33-APC(AML에 대하여) 또는 CD19-APC(B-CLL에 대하여) 또는 CD38-APC(다발성 골수종에 대하여)를 첨가하고, 또한 튜브당 5 ㎕의 CD45-PerCp 및 5 ㎕의 scFv Y1 또는 대조군 scFv TM1.1 또는 CD162-PE (KPL1)를 첨가하였다. 튜브를 약하게 진탕하면서 4℃에서 30 분간 항온처리하였다. 2 ml의 PBS를 첨가하고 1200 rpm에서 5 분간 회전시킴으로써 과량의 반응물을 세척하였다. 상청액은 버렸다. 1 단계 분석에서는 그 후 용해 단계를 수행하였다. 500 ㎕의 BD 라이신 용액을 ddH₂O로 1:10으로 희석시키고, 각 환자 샘플에 300 ㎕를 첨가하였다. 샘플을 고속으로 진탕시키고 4℃에서 12분간 항온처리하고, 상기와 같이 세척하였다. 상청액을 버린 후 500 ㎕의 PBS를 첨가하였다. 샘플은 국제 기준에 따른 혈액 샘플 입수 설정을 이용하여 FACS로 판독하였다. 2 또는 3 단계를 포함하는 분석의 경우, 작용 완충액은 PBS + 1% BSA + 0.05% 나트륨 아지드를 함유하였고, 항온처리 및 세척은 전술한 바와 같이 수행하였다.

정상 개체로부터의 혈액 샘플의 경우, FACS 분석을 이용하여 혈액 세포의 부분집단에 대한 L32의 결합의 선택성을 Y1 선택성과 비교하여 측정하기 위해 분석을 수행하였다. 결합은 표지된 제2 또는 제3의 항체를 사용하여 염색한 후에 측정하였다. Y1 및 L32 결합 둘 다에 있어서 공여체 간 편차가 있다. 따라서, 대부분의 사례를 대표하는 결과를 하기 표 9에 정성적으로 요약하였다. 과립구, 림프구 및 단핵구에 대한 L32 scFv 결합은 이들 세포에 대한 Y1 scFv 결합보다 대체로 더 컸다. 이와는 달리, 혈소판에 대한 L32 scFv 결합은 바탕값과 유사하였으며, Y1 scFv에 의한 결합보다 대체로 더 작았다. 이러한 결과들은 PRP에서의 혈소판의 응집 및 세척된 혈소판 응집에 대한 낮은 효과를 설명하는, 실시예 6에 제시된 결과(도 2 참조)를 추가로 지지한다.

세포 유형	음성 대조군에 상대적인 결합
세포 유형	Y1	L32
림프구	바탕값 - 저	저+/-
단핵구	+/-저	중+/++
과립구	저 - 중+	중 - 고++
혈소판	+/-저	바탕값-

스케일링은 하기 기준에 기초한 것이다(이것은 절대적 스케일이 아니며, 2x 비는 실제로 몇 배 더 큰 결합으로 해석될 수 있다)

- 바탕 염색

+/- 음성 scFv와 테스트된 scFv 간의 평균 흐름의 비의 최대 2x

+ 음성 scFv와 테스트된 scFv 간의 평균 흐름의 비의 2x∼3x

++ 음성 scFv와 테스트된 scFv 간의 평균 흐름의 비의 4x∼6x

+++ 음성 scFv와 테스트된 scFv 간의 평균 흐름의 비의 2x∼8x

++++ 음성 scFv와 테스트된 scFv 간의 평균 흐름의 비의 10x 초과

상기 표의 결과들은 모두 시그널을 증폭을 포함하는 2 또는 3 단계 염색 절차를 이용하여 유도된 것임에 주목하는 것이 중요하다. 또한, 하나 이상의 염색 단계를 이용할 경우, 혈소판을 활성화되고, 절차 관련 효과로부터 발생하는 시그널은 증폭된다. 이러한 절차에서는, 표지된 항체는 활성화된 혈소판 표면에 노출된 GPIb 및 새로 노출된 PSGL-1 둘 다에 결합한다.

암 환자로부터의 혈액/골수 샘플에 대해서는, FACS 분석을 이용하여 L32의 결합의 선택성을 Y1 선택성에 비교하여 측정하기 위한 분석을 수행하였다. 결합은 표지된 2차 항체에 의한 결합의 결과로서 측정되었다. 표 10에 제시된 결과는, L32가 대체로 Y1보다 더 높은 정도로 질병 세포에 결합한다는 것을 나타낸다. 동시에, 과립구, 림프구 및 단핵구에 대한 L32 결합은 Y1의 결합보다 더 컸다. 이러한 증가된 결합은 정상 세포와의 감소된 상호작용을 시사하며, 이로써 치료를 위해 더 적은 용량의 항체를 사용할 수 있다.

질병	세포 유형	음성 대조군에 상대적인 결합
질병	세포 유형	Y1	L32
AML (4 샘플)	질병 림프구 과립구	+ 내지 +++의 범위 + 내지 ++의 범위 +/-	++++ +++ ++
MM (2 샘플)	질병 림프구 단핵구 과립구	+++ ++ ++ ++	++++ +++ +++ +++
B-백혈병 (2 샘플)	질병 림프구 단핵구 과립구	- 내지 ++의 범위 + 내지 ++의 범위 +++ ++	+ +++ ++++ ++++

시판되는 CD162-특이적 모노클로널 항체, 항-인간 PSGL1은 AML, 모상 세포 백혈병 및 B-세포 악성종양(예, 프리-B-ALL, B-ALL, B-CLL, B- PLL, 및 다발성 골수종)을 비롯하여 모든 테스트 샘플에서 L32의 결합을 치환하였음에 주목하여야 한다.

완전 IgG, 디아바디, 트리아바디 및 Fab 단편은 모두 scFv 항체의 특이성을 공유하였으며, 항-CD162는 각 항체 형태의 결합을 치환하였다.

실시예 11

본 실시예는 다양한 종의 동물로부터 유래된 1차 세포에 대한 L32의 결합을 입증한다.

혈액 세포의 부분집단에 대한 L32 결합의 선택성은 다양한 종의 동물로부터의 혈액 샘플에 대하여 평가하였다. 전혈 샘플은 L32 또는 Y1 scFv로 염색한 후, 이어서 PE-표지된 토끼 항-scFv(2 단계 염색)로 염색하였다. 이후에 샘플은 FACS 분석으로 분석하였다. 표 11에 제시된 결과는, 종 간에 두 항체에 의한 결합에 있어서 편차가 존재한다는 것을 나타낸다. 그러나, Y1은 일반적으로 L32보다 더 많이 염색되었으며, Y1은 대체로 혈소판을 염색한 것으로 확인된 반면, L32는 혈소판을 염색하지 못하였으며, 이는 Y1이 실제로 L32보다 특이성이 더 광범위하다는 것을 암시한다.

종/세포 집단	FACS 분석에 따른 결합
종/세포 집단	Y1	L32
마우스(Balb/c) 과립구 혈소판 기타 세포 집단	+/- ++ -	- - -
래트 모든 세포 집단	-	-
토끼 과립구 기타 세포 집단	+ -	+ -
기니 피그 림프구 단핵구 과립구 혈소판	+ ++ ++ +	- - - -
개 림프구 단핵구 과립구 혈소판	- ++ + +++	- +/- - -

실시예 12

본 실시예는 인간 기원의 악성 세포를 보유하는 마우스에 대한 L32의 투여 효과를 입증한다.

SCID 마우스(잭슨)을 100 mg/kg CTX로 전처리하고, CTX를 주사한 지 5일 후 에 Molt-4(T 백혈병) 세포를 꼬리 정맥에 정맥(i.v.) 주사하였다. 마우스를 처리군(군당 6 마리)으로 무작위로 나누고, 이들을 5일 후에 PBS, Molt-4, Y1으로 4 주간 처리하고, L32로 2 주간 처리하였다. Molt-4 군의 마우스는 처리하지 않았다. 33일째, 마우스를 희생시키고, 그 간의 무게를 측정하였다. 도 12는 Molt-4 성장을 갖는 마우스의 간 중량이 두 배였으며, 조직화학에 의해 측정한 종양 유병률은 ∼65%였음을 보여준다. Y1 또는 L32 scFv 항체를 사용한 처리는 처리된 마우스의 종양 함유량을 현저히 감소시켰다.

실시예 13

본 실시예는 L32 디아바디 및 트리아바디의 작제, 발현 및 정제에 대해 설명한다.

원형의(original) L32를 코딩하는 벡터 pHEN-L32를 V_L 및 V_H 영역 둘 다에 대하여 개별적으로 PCR을 이용하여 증폭시켰다. V_L PCR 반응에 대해 센스 올리고뉴클레오티드 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 예상 크기의 cDNA 생성물을 정제하고, 서열을 분석하고, 제한 효소로 분해하였다. V_H 영역을 증폭시키는 데에도 동일한 절차를 이용하였다. V_H PCR 생성물은 제한 효소로 분해하였다. 사전 분해한, pHEN 벡터로의 삼중 결찰 과정을 이용하였다. 최종 벡터를 pTria-L32라 명명하였다. 이. 콜라이 형질전환 후, DNA 서열 분석, 단백질 발현 및 박테리아의 주변 세포질 영역으로부터의 추출을 비롯한 추가 분석을 위해 몇 개의 클론을 피킹하였다. 환원 조건 하의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 L32 트리아바디의 크기를 확인하였다.

pTria-L32 벡터를 제한 효소로 선형화하고, 합성 상보성 2본쇄 올리고뉴클레오티드를 사전 어닐링하여 L32-중쇄 및 L32-경쇄 사이의 제한 부위로 결찰시켰다. 이러한 새로운 벡터를 pDia-L32라 명명하였다. 트리아바디에 대해 기술한 바와 같이, DNA 서열 및 단백질 발현을 확인하였다.

이. 콜라이에서의 발현은 실질적으로 scFv L32에 대해 기술한 것과 동일하다. 그러나, 형질전환된 이. 콜라이 세포의 주변 세포질로부터의 L32 디아바디 및 트리아바디의 정제 과정은 서로 다르다. scFv L32 단량체 형태는 단백질-A 세파로스 비드의 친화성 컬럼 상에서 정제할 수 있다. 그러나, L32의 다량체 형태는 이 절차에 의한 정제가 비효율적이며, 따라서 박테리아로부터 추출된 주변 세포질 단백질은 60% 황산암모늄으로 밤새 침전시키고, H₂0에 현탁시켜서, 0.1 x PBS로 예비 평형화시킨 세파크릴-200(파마시아) 크기 배제 컬럼 상에 로딩하였다. 분획들을 수집하여 HPLC로 분석하고, 이량체 또는 삼량체 형태를 함유하는 개별 분획을 FITC 표지화 및 FACS 분석을 위해 수집한다.

실시예 14

본 실시예는 L32-cys-kak(시스테인 이량체)의 생산 과정을 설명한다.

1 ℓ의 λpL-L32-cys-kak 박테리아 배양물을 42℃에서 2∼3 시간 동안 유도하였다. 이 배양물을 5000 RPM에서 30 분간 원심분리하고, 펠릿을 180 ml의 TE(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA)에 현탁시키고, 8 ml의 라이소자임(5 mg/ml 원액 으로부터)을 첨가하고, 1 시간 동안 항온처리하였다. 20 ml의 5 M NaCl 및 25 ml의 25% 트리톤을 첨가하고, 1 시간 더 항온처리하였다. 이 혼합물을 4℃에서 13000 RPM에서 60 분간 원심분리하고, 상청액은 버렸다. 펠릿은 조직 분쇄기(또는 균질기)를 사용하여 TE에 현탁시켰다. 이 과정은, 봉입체(펠릿)가 회색/연갈색이 될 때까지 3∼4회 반복하였다.

봉입체는 6 M 구아니딘-HCl, 0.1 M 트리스(pH 7.4), 2 mM EDTA에 용해시켰다(10 ml 용해 완충액 중의 1.5 g의 봉입체는 ∼10 mg/ml 가용성 단백질을 제공함). 이것을 적어도 4 시간 동안 항온처리하였다. 단백질 농도를 측정하고, 농도를 10 mg/ml로 맞추었다. 최종 농도가 65 mM이 되도록 DTE를 첨가하고, 실온에서 밤새 항온처리하였다. 10 ml의 단백질을 0.5 M 아르기닌, 0.1 M 트리스, pH 8, 2 mM EDTA, 0.9 mM GSSG를 함유하는 용액에 (적가하면서) 첨가하여 희석시켜서 리폴딩을 개시시켰다. 리폴딩 용액은 ∼10℃에서 48 시간 동안 항온처리하였다. 단백질을 함유하는 리폴딩 용액을 25 mM 인산염 완충액 pH 6, 100 mM 우레아를 함유하는 완충액 중에서 투석하고, 500 ml로 농축시켰다. 농축 및 투석된 용액은 SP-세파로스 컬럼에 결합하였으며, 단백질은 NaCl 구배(최대 1 M)로 용출시켰다.

실시예 15

완전 L32 IgG 항체 및 Fab₁ 및 F(ab')₂ 단편의 생산은 Y1 IgG에 대해 수행한 것과 같이 하기와 같이 수행할 수 있다.

CHO^- 세포를 10% 소 태아 혈청 및 40 ㎍/ml 젠타마이신이 보강된 F-12 배지 에서 37℃에서 5% CO₂ 대기에서 배양하였다. 형질감염 하루 전에, 1-1.5-1 x 10⁶ 세포를 90 mm 접시에 접종하였다. 배양물을 L32 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 10 ㎍으로 동시 형질감염시켰다. 형질감염은 FuGene(로쉐) 형질감염 시약 기법을 이용하여 수행하였다. 비선별성 성장 배지에서 2일간 성장시킨 후, 세포를 550 ㎍/ml 네오마이신 및 3 ㎍/ml 퓨로마이신을 함유하는 F-12 배지에서 10∼12일간 배양하였다. 세포를 트립신 처리하고, 코스타 96웰 플라스틱 평판에서 웰당 0.5 세포로 제한 희석시켜 클로닝하였다. 개별 콜로니를 피킹하여, 6웰 접시에서 배양하고, 추가 선별(성장 배지에 대한 발현 수준 및 항체 분비를 측정하기 위함)을 위해 플라스크로 옮겼다.

CHO^- 세포를 10% 소 태아 혈청 및 40 ㎍/ml 젠타마이신이 보강된 F-12 배지에 5% CO₂ 대기에서 37℃에서 배양하였다. 형질전환 하루 전에 0.8∼1 x 10⁶ 세포를 90 mm 접시에 접종하였다. CMV(사이토메갈로 바이러스) 프로모터 하에 클로닝된 L32 항체의 경쇄 및 중쇄와 sv-40 프로모터 하의 dhfr 유전자를 코딩하는 DNA 10 ㎍으로 배양물을 형질감염시켰다. 형질감염은 FuGene(로쉐) 형질감염 시약 기법을 이용하여 수행하였다. 비선별성 성장 배지에서 2일간 성장시킨 후, 세포를 10O nM ∼ 5 μM의 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 배지에서 배양하고, 소 태아 혈청을 투석시켜 완전 L32 항체의 발현 수준 증가를 나타내는 클론을 선별하였다(제한 희석 후).

샌드위치 ELISA 분석은 형질감염된 CHO 세포의 상청액으로 분비되는 항체 농도를 측정하기 위해 수립한다. 항체 농도를 정량하기 위하여 하기 시약을 사용하였다: 코팅된 항체로서 모노클로널 항-인간 IgG1(Fc)(시그마), 검출인자로서 염소 항-인간 IgG(γ-사슬 특이적) 바이오틴 접합체(시그마), 및 표준물질로서 정제된 인간 IgG1, 람다(시그마).

세포를 롤러 용기에서, 10% 소 태아 혈청, 네오마이신 및 퓨로마이신(상기한 바와 같은 양)이 보강된 F-12 배지에서 용기당 1∼2 x 10⁸ 세포의 최종 농도가 될 때까지 배양하였다. 항체 생산을 위해, 동일하나 2% 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 2일간 더 배양하였다. 분비된 항체는 단백질 G 세파로스 컬럼(파마시아) 및 이온 교환 컬럼-Q 세파로스(파마시아) 상에서 정제하였다. 결합은 20 mM 인산나트륨 완충액 pH 7.0 중에서 수행하며, 용출은 0.1 M 글리신 완충액, pH 2.5∼3.0 중에서 수행하였다. 정제된 항체의 양은 UV 흡광도 및 ELISA에 의해 측정하고, 그 순도는 SDS-PAGE 및 HPLC에 의해 분석하였다.

L32 IgG를 단편화하면 Fab₁ 및 F(ab')₂가 생성된다. 처음에는, 1가 및 2가 항체 단편은 고정화된 Ficin(피어스)를 사용하여 준비하였다. 1 mM 시스테인 존재 하에 Ficin 절단은 F(ab')₂ 단편을 생성한다. 유사하게, 분해 완충액 중의 시스테인 활인자의 농도를 10 mM로 증가시키면 원형의 IgG로부터 Fab 단편이 생성될 수 있다. 분해 후, 단편들을 고정화된 단백질 A 컬럼 상에서 정제하였다. F(ab')₂ 및 Fab₁ 단편은 10,000 또는 30,000 달톤 분자량 컷오프를 이용하여 마이크로농축기를 사용하여 농축시켰다. 단백질 회수율은 280 nm에서의 흡광도를 이용하여 측정하였다. 단편 순도는 젤 전기영동을 이용하여 측정하였다.

또한, 정제된 L32 항체 10 mg을 37℃에서 분해 완충액 중의 고정화된 파파인 슬러리 0.5 ml에 16 시간 동안 적용하였다. 반응은 1.5 ml의 결합 완충액을 첨가하여 분해물을 용출시켜 종료시킨다. 분해되지 않은 IgG 및 Fc 단편으로부터의 Fab₁의 분리는 결합 완충액을 사용하여 단백질 A 컬럼을 이용하여 수행하였다. Fab₁은 이를 통과하는 흐름 중에 함유되어 있다. 280 nm에서 흡광도를 읽어서, 단편들을 함유하는 피크 분획을 모아서, 농축시키고, PBS, pH 7.4에 대하여 밤새 투석하였다. 단백질 회수율, 순도 및 특성화는 280 nm에서의 흡광도 및 젤 전기영동에 의해 측정하였다.

실시예 16

ML2 세포에 대한 scFv Y1(표 11) 또는 IgG Y1(표 12) 항체의 결합에 대한 scFv의 효과는 FACS 분석을 이용하여 경쟁 분석에 의해 평가하였다.

1 ㎍의 경쟁 항체(L32 scFv, Y1 scFv (P03), KPL-1 또는 대조군 N06 scFv)를 ML2 세포(0.5 x 10⁶ 세포/분석)에 첨가하였다. 항온처리 30 분 후, Y1-PE로 표지된 scFv 또는 IgG를 37℃에서의 추가 항온처리 30분간 첨가하였다. 항온처리 후 샘플을 FACS 완충액으로 1회 세척하고 분석하였다.

결과는 분석된 두 개의 이중 튜브의 중간값 평균으로서 기하 평균수로 나타 내었다. 기하 평균값은 결합 친화력의 지수적 표현이며 직선적 표현이 아니다.

표 12에 나타낸 결과는 L32 scFv가 ML2 세포에 대한 scFv Y1-PE의 결합을 효과적으로 억제한다(약 80%까지)는 것을 나타내는데, 즉, L32 scFv가 Y1 scFv와 유사한 방식으로 억제한다는 것을 나타낸다. 이와는 달리, 무관한 음성 대조군 항체 scFv N06은 결합을 단지 20%만 억제한다.

샘플	중간값	억제율(%)
대조군	5	-
KPL-1-PE	700	-
Y1-PE	240	-
Y1-PE + N06	190	20
Y1-PE + P03	48	80
Y1-PE + L32	40	83

샘플	중간값			억제율(%)
샘플	200 ng	500 ng	1000 ng	200 ng	500 mg	1000 ng
대조군	3	ND	ND	-	ND	ND
Y1	12.5	ND	ND	-	ND	ND
Y1-PE + Y1	3	ND	ND	100%	ND	ND
Y1-PE + KPL-1	2	ND	ND	100%	ND	ND
Y1-PE + P03	7.5	6	5	40%	52%	60%
Y1-PE + L32	5.5	3.8	3.7	54%	79%	80%
ND = 완전한 억제가 저농도에서 이루어졌기 때문에 수행하지 않음

표 13의 결과는 IgG Y1 단독으로(최종 농도 200 ng)는 기하 평균 12.5로 세포에 결합한 반면, "콜드" IgG Y1 또는 KPL-1(시판되는 PSGL1에 대한 쥐 모노클로널 항체) 200 ng과의 경쟁은 IgG Y1 결합의 기하 평균을 각각 3 및 2로 감소시켰음 을 나타낸다. ML2 세포에 대한 IgG Y1 결합은 scFv Y1 항체에 의해 용량 의존적 방식으로 억제(경쟁)되었으며, 즉, 200 ng의 scFv Y1 항체는 IgG Y1의 결합을 기하 평균 7.5로 감소시킨 반면, 1000 ng은 기하 평균 5로 감소시켰다. ML2 세포에 대한 IgG Y1 결합 역시 용량 의존적 방식으로 scFv L32 항체에 의해 억제(경쟁)되었으나, scFv Y1에 의해 유발되는 것보다 훨씬 더 큰 정도로 억제되었으며, 즉, 200 ng의 scFv L32 항체는 IgG Y1의 결합을 기하 평균 5.5로 감소시킨 반면, 1000 ng은 기하 평균 3.7로 감소시켰다.

scFv Y1 및 scFv L32 둘 다 동일한 항체 농도에서 ML2 세포에 대한 IgG Y1의 결합을 억제한 반면, scFv L32에 의해 유발된 억제는 scFv Y1에 의해 유발되는 것보다 더욱 두드러졌다. 게다가, 테스트한 두 IgG 항체(IgG Y1 및 KPL-1)는 테스트한 두 scFv 항체에 비해 ML2 세포에 대한 친화력이 더 컸는데, 왜냐하면 이들은 IgG Y1의 기하 평균을 각각 3 및 2로 감소시켰기 때문이다.

실시예 17

본 실시예는 정상 세포(표 14) 및 질병 세포(표 15) 둘 다를 포함하여 혈액 세포의 다양한 부분집단에 대한 L32의 결합을 FACS 분석을 이용하여 입증한다.

먼저, 분석은 정상 인간 골수(NBM) 샘플로부터 분리한, CD34+ 전구체 세포에 대한 L32 scFv 결합의 선택성을 Y1 scFv와 비교하여 측정하기 위해 수행하였다. 결합은 표지된 항체(항-scFv-PE)를 사용하여 염색한 후에 측정하였다. 각 NBM 샘플은 동일한 분석에서 두 항체를 사용하여 테스트하였다.

결합을 평가하기 위해 사용된 기준은 다음과 같다:

기하 평균(GM) 10 이하 - 음성

기하 평균(GM) 11∼20 - 저친화력 결합

기하 평균(GM) 21∼40 - 중간 친화력 결합

기하 평균(GM) 41 이상 - 고친화력 결합

표 14에서 기재된 바와 같이, 테스트한 NBM 샘플 32개 중에서 24개(75%)는 L32에도 Y1에도 결합하지 않았다. 6개의 샘플(19%)은 L32에 대한 낮은 친화력 결합을 나타내었으며, 1개(3%)는 L32 및 Y1 둘 다에 대하여 중간 친화력 결합을 나타내었다. 전반적으로, CD34+ 세포에 대한 L32 및 Y1의 결합 프로필은 유사하였다.

또한, 환자의 혈액 샘플로부터 분리한 인간 1차 백혈병 세포(AML, MM, B-CLL, 및 B-ALL)에 대한 L32 scFv 및 Y1 scFv(PO3)의 결합의 비교용 FACS 분석을 수 행하였다. 동일한 분석에서 동일한 샘플 중에서 L32의 결합을 Y1의 결합과 비교하였다. 결합 기준은 바로 위에서 기재한 바와 같다.

표 15는 테스트한 모든 환자 샘플로부터 얻은 데이터를 제시하며, 표 16은 AML 및 B-CLL 샘플에서의 L32 및 Y1 친화력에 대한 친화력 데이터를 요약한 것이다.

테스트한 17개의 AML 샘플 중에서, 15개(88%)는 L32에 의한 결합에 대하여 양성이었으며, 10개 샘플(59%)은 고친화력 결합을 나타내었고(기하 평균 165), 5개의 샘플(29%)은 중간 친화력 결합을 나타내었다(기하 평균 28). AML 샘플 중 13개(76%)는 Y1 결합에도 양성이었으나, 비교 분석(표 16)은 L32 평균 결합 친화력이 동일한 샘플 집단에서 Y1의 평균 결합 친화력보다 항상 현저하게 더 크다는 것을 나타낸다. 일반적으로, M2 기의 AML 환자 샘플의 약 50%는 L32 및 Y1 둘 다에 의한 결합을 나타낸다. M3 기 이상에서는, 샘플의 약 90%가 다양한 친화력으로 상기 두 항체에 결합한다(데이터는 제시하지 않음).

테스트한 9개의 B-CLL 샘플 중에서, 4개(44%)는 L32에 의한 결합에 양성이었으며, 한 샘플(11%)은 고친화력 결합을 나타내었고(기하 평균 70), 한 샘플(11%)은 중간 친화력 결합을 나타내었고(기하 평균 37), 두 샘플(22%)은 저친화력 결합을 나타내었다(기하 평균 15). 테스트한 B-CLL 샘플 중 3개(33%)는 Y1 결합에도 양성 이었으나, 비교 분석(표 16)은 L32 평균 결합 친화력이 동일한 샘플 집단에서 Y1의 평균 결합 친화력보다 항상 현저하게 더 크다는 것을 나타낸다.

테스트한 4개의 MM 및 형질세포종은 모두 L32 및 Y1 둘 다에 대하여 높은 친화력의 결합을 나타내으나, L32의 친화력은 Y1의 것보다 더 컸다(기하 평균 각각 410 대 135). 테스트한 2개의 B-ALL 샘플은 둘 다 L32 및 Y1의 결합에 대하여 음성이었다.

	AML		B-CLL
	L32	Y1	L32	Y1
높은 기하 평균
질병	165	61	70	46
림프구	117	50	107	42
단핵구	638	145	323	58
과립구	239	110	169	70
중간 기하 평균
질병	28	12	37	21
림프구	41	15	26	9
단핵구	35	30	음성	음성
과립구	음성	음성	음성	음성
낮은 기하 평균
질병	무	무	13	9
림프구	18	12	음성	음성
단핵구	음성	음성	음성	음성
과립구	음성	음성	음성	음성
* 수치는 표 14에 나타낸 결과에 기초한 기하 평균이다. L32 데이터에 따라 높은, 중간, 낮은 친화성 군을 결정하였다.

표 15 및 16의 결과는, 1차 AML 및 B-CLL 혈액 샘플에서 질병 집단뿐 아니라 다른 성숙 부분집단(림프구, 단핵구 및 과립구)에서도 L32 항체 결합이 항상 Y1 항체 결합보다 현저하게 더 높다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Savient Pharmaceuticals, Inc. <120> ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 10793/71 <140> PCT/US03/20602 <141> 30-06-2003 <150> 10/189,032 <151> 01-07-2002 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 280 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala 1 5 10 15 Met AlaGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu 20 25 30 35 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met 40 45 50 55 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly 60 65 70 75 Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 80 85 90 95 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 115 Cys Ala Arg Met Arg Ala Pro Val Ile Trp Gly GlnGly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg 120 125 130 135 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln 140 145 150 155 Asp Pro Ala Val Ser val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser 160 165 170 175 Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val 180 185 190 195 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 200 205 210 215 Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 220 225 230 235 Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 240 245 250 255 Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 265 270 275 280 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ala Pro Val Ile 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Arg Gly Gly Asn Ala Met 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Leu Thr Tyr Asn Ser Try Glu Val Pro Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Thr Asn Trp Tyr Leu Arg Pro Leu Asn 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10

Claims

서열 번호 1의 scFv의 결합 능력을 보유하는, PSGL-1의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 중쇄 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제2항에 있어서, 두 개의 중쇄 CDR이 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
제3항에 있어서, 세 개의 중쇄 CDR이 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
제4항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 1을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 중쇄 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하는 PSGL-1의 에피토프에 결합하는 항체 또 는 이의 단편.
제6항에 있어서, 두 개의 중쇄 CDR이 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
제7항에 있어서, 세 개의 중쇄 CDR이 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
서열 번호 1을 포함하는 PSGL-1의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 생식선 DP32로부터의 하나 이상의 프레임워크 가변 부위를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 실질적으로 원형 또는 루프형의 펩티드 또는 폴리펩티드인 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 에피토프는 하나 이상의 황산화된 부분을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 2 이상의 에피토프에 결합하며, 각 에피토프는 하나 이상의 황산화된 티로신 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제13항에 있어서, 각 에피토프는 2 이상의 산성 아미노산의 클러스터 하나 이상을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 2 이상의 에피토프와 교차 결합하며, 각 에피토프는 하나 이상의 황산화된 티로신 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제15항에 있어서, 각 에피토프는 2 이상의 산성 아미노산의 클러스터 하나 이상을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 T-ALL 세포, AML 세포, B-백혈병 세포, B-CLL 및 다발성 골수종 세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 세포 유형 상의 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 지질, 탄수화물, 펩티드, 당지질, 당단백질, 지단백질 및/또는 지다당류 분자 상의 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 항암제, 항백혈병제, 항전이제, 항신생물제, 항질병제, 항유착제, 항혈전제, 항재발협착제, 항자가면역제, 항응집제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택되는 제제에 커플링되거나 이와 복합체를 형성하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제19항에 있어서, 제제는 아시클로비어, 간시클로비어 및 지도부딘으로 이루어진 군에서 선택되는 항바이러스제인 항체 또는 이의 단편.
제19항에 있어서, 제제는 실로스타졸, 달테파린 나트륨, 레비파린 나트륨 및 아스피린으로 이루어진 군에서 선택되는 항혈전제/항재발협착제인 항체 또는 이의 단편.
제19항에 있어서, 제제는 잘토프로펜, 프라노프로펜, 드록시캄, 아세틸 살리실릭 17, 디클로페낙, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 설린닥, 나프록센, 암톨메틴, 셀레콕시브, 인도메타신, 로페콕시드 및 니메설리드로 이루어진 군에서 선택되는 항염증제인 항체 또는 이의 단편.
제19항에 있어서, 제제는 레플루노마이드, 데닐루킨 디프티톡스, 수브레움, WinRho SDF, 데피브로타이드 및 시클로포스파마이드로 이루어진 군에서 선택되는 항자가면역제인 항체 또는 이의 단편.
제19항에 있어서, 제제는 리마프로스트, 클로크로멘 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 항유착제/항응집제인 항체 또는 이의 단편.
제19항에 있어서, 제제는 독소, 방사능 동위원소, 영상화제 및 약제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
제25항에 있어서, 독소는 겔로닌, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소(PE), PE40, PE38, 리신 및 이들의 변형체 및 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
제25항에 있어서, 방사능 동위원소는 감마 방출제, 양전자 방출제, x-선 방출제, 베타-방출제 및 알파-방출제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
제25항에 있어서, 방사능 동위원소는 ¹¹¹인듐, ¹¹³인듐, ^99m레늄, ¹⁰⁵레늄, ¹⁰¹레늄, ^99m테크네튬, ^121m텔루륨, ^122m텔루륨, ^125m텔루륨, ¹⁶⁵툴륨, ¹⁶⁷툴륨, ¹⁶⁸툴륨, ¹²³요오 드, ¹²⁶요오드, ¹³¹요오드, ¹³³요오드, ^81m크립톤, ³³크세논, ⁹⁰이트륨, ²¹³비스무트, ⁷⁷브롬, ¹⁸플루오르, ⁹⁵루테늄, ⁹⁷루테늄, ¹⁰³루테늄, ¹⁰⁵루테늄, ¹⁰⁷수은, ²⁰³수은, ⁶⁷갈륨 및 ⁶⁸갈륨으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
제25항에 있어서, 약제는 안트라사이클린인 항체 또는 이의 단편.
제29항에 있어서, 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 모르폴리노독소루비신, 모르폴리노다우노루비신 및 메톡시모르폴리닐독소루비신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
제25항에 있어서, 약제는 시스-백금, 택솔, 칼리체아미신, 빈크리스틴, 시타라빈(Ara-C), 시클로포스파마이드, 프레드니손, 플루다라빈, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로마이드, 탈리도마이드 및 블레오마이신과, 이들의 유도체 및 조합체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의단편.
제19항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 제제에 커플링되거나 이와 복합체를 형성할 수 있는 비이클 또는 담체에 커플링되거나 이와 복합체를 형성하는 것인 항체 또는 이의 단편.
제32항에 있어서, 비이클 또는 담체는 덱스트란, 친지성 중합체, HPMA 및 리포좀과, 이들의 유도체 및 변형체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
제1항의 항체 또는 이의 단편에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 에피토프.
제34항에 있어서, 분리된 에피토프는 하나 이상의 황산화된 부분을 포함하는 것인 분리된 에피토프.
제35항에 있어서, 황산화된 부분은 황산화된 티로신인 분리된 에피토프.
제34항에 있어서, 분리된 에피토프는 음전하 아미노산의 클러스터를 포함하는 것인 분리된 에피토프.
제37항에 있어서, 클러스터는 성숙 PSGL-1의 아미노산 1∼17을 포함하는 것인 분리된 에피토프.
제1항의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 분리된 또는 정제된 폴리뉴클레오 티드.
제39항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
제40항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
제41항에 있어서, 세포는 항체 또는 이의 단편을 발현하는 것인 재조합 숙주 세포 또는 이의 자손 세포.
제40항의 발현 벡터로 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는 재조합 세포의 제조 방법.
항체 또는 이의 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 제41항의 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체 또는 이의 단편의 제조 방법.
제44항에 있어서, 방법은 세포 또는 세포의 배지로부터 항체 또는 이의 단편을 분리 또는 정제하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제1항의 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
제1항의 항체 또는 이의 단편 및 영상화제를 포함하는 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 키트.
제47항에 있어서, 영상화제는 방사능 동위원소인 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 키트.
질병의 치료를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질병의 치료 방법.
세포 회전의 치료를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 세포 회전의 치료 방법.
염증의 치료를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 염증의 효과를 완화시키거나, 염증을 예방하거나, 염증을 치료하거나, 염증의 진행을 억제하는 방법.
감염의 치료를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 감염의 치료 방법.
제52항에 있어서, 감염은 HIV에 의해 유발되는 것인 방법.
제52항에 있어서, 투여는 HIV의 세포 진입을 방지하는 것인 방법.
자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질환의 치료 방법.
전이의 치료를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 전이의 치료 방법.
종양 세포의 성장 및/또는 복제의 치료를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포의 성장 및/또는 복제의 치료 방법.
종양 세포의 사멸률 증가를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포의 사멸률을 증가시키는 방법.
백혈병 세포의 성장 및/또는 복제의 치료를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제의 치료 방법.
백혈병 세포의 사멸률 증가를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을투여하는 것을 포함하는, 백혈병 세포의 사멸률을 증가시키는 방법.
항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성 변화를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항질병제에 의한 손상에 대해 질병 세포의 감수성을 변화시키는 방법.
항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포의 감수성 증가를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항암제에 의한 손상에 대해 종양 세포의 감수성을 증가시키는 방법.
항암제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성 증가를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항암제에 의한 손상에 대해 백혈병 세포의 감수성을 증가시키는 방법.
종양 세포수 증가의 억제를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 종양을 가진 환자에서 종양 세포수의 증가를 억제하는 방법.
종양 세포수 감소를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 종양을 가진 환자에서 종양 세포수를 감소시키는 방법.
백혈병 세포수 증가의 억제를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 백혈병 환자에서 백혈병 세포수의 증가를 억제하는 방법.
백혈병 세포수의 감소를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 백혈병 환자에서 백혈병 세포수를 감소시키는 방법.
항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)의 유도를 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 방법.
자연 킬러(NK) 세포 또는 T 세포 자극을 필요로 하는 환자에게 제46항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 자연 킬러(NK) 세포 또는 T 세포를 자극하는 방법.
환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및

제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자의 세포에 결합하는지를 결정함으로써, 그 환자가 질병 위험이 있는지 또는 질병을 보유하고 있는지를 나타내는 단계

를 포함하는, 환자의 질병을 진단하거나 예후를 판정하는 방법.
환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및

제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자의 세포에 결합하는지를 결정함으로써, 그 환자가 염증 위험이 있는지 또는 염증을 보유하고 있는지를 나타내는 단계

를 포함하는, 환자의 염증을 진단하거나 예후를 판정하는 방법.
환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및

제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자의 세포에 결합하는지를 결정함으로써, 그 환자가 감염 위험이 있는지 또는 감염을 보유하고 있는지를 나타내는 단계

를 포함하는, 환자의 감염을 진단하거나 예후를 판정하는 방법.
제72항에 있어서, 감염은 HIV에 의해 유발되는 것인 방법.
환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및

제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자의 세포에 결합하는지를 결정함으로써, 그 환자가 자가면역 질환 위험이 있는지 또는 자가면역 질환을 보유하고 있는지를 나타내는 단계

를 포함하는, 환자의 자가면역 질환을 진단하거나 예후를 판정하는 방법.
환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및

제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자의 세포에 결합하는지를 결정함으로써, 그 환자가 전이 위험이 있는지 또는 전이를 보유하고 있는지를 나타내는 단계

를 포함하는, 환자의 전이를 진단하거나 예후를 판정하거나 병기를 결정하는 방법.
환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및

제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자의 세포에 결합하는지를 결정함으로써, 그 환자가 종양 위험이 있는지 또는 종양 세포를 보유하고 있는지를 나타내는 단계

를 포함하는, 환자의 종양 세포를 진단하거나 예후를 판정하거나 병기를 결정하는 방법.
환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및

제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자의 세포에 결합하는지를 결정함으로써, 그 환자가 백혈병 위험이 있는지 또는 백혈병을 보유하고 있는지를 나타내는 단계

를 포함하는, 환자의 백혈병을 진단하거나 예후를 판정하거나 병기를 결정하는 방법.
환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및

환자 유래의 세포와 제1항의 항체 또는 이의 단편을 항온처리하는 단계

를 포함하는, 환자로부터 종양 세포를 제거하는 방법.
제78항에 있어서, 제거는 체외에서 이루어지는 것인 방법.
질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 제46항의 약학 조성물의 용도.
제80항에 있어서, 질병은 세포 회전, 염증, 자가면역 질환, 감염, 전이, 종양 세포의 성장 및/또는 복제와, 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 용도.
제46항에 있어서, 질병의 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는 것인 약학 조성물.
제82항에 있어서, 질병은 세포 회전, 염증, 자가면역 질환, 감염, 전이, 종양 세포의 성장 및/또는 복제와, 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
파지 디스플레이 라이브러리를 제공하는 단계;

서열 번호 1의 scFv 항체 또는 이의 단편의 결합 능력을 보유하는 항체 또는 이의 단편에 결합하는 2 이상의 분자 또는 세포를 제공하는 단계;

상기 분자 또는 세포 중 2 이상에 결합하는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 나타내는 파지 입자에 대하여 상기 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝(panning)하는 단계; 및

상기 분자 또는 세포 중 2 이상에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 이의 단편 또는 이의 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 제조하는 단계

를 포함하는, 항체 또는 이의 단편의 제조 방법.
제84항의 방법에 따라 제조된 항체 또는 이의 단편.