KR20060106631A - 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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다니엘 플라크신
아비그도르 레바논
에스테르 스잔톤
요체베드 하가이
라첼 벤-레비
야엘 니스가브
야리브 칸피
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바이오-테크널러지 제너럴 (이스라엘) 리미티드
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Abstract

본 발명은 암 세포에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공하며, 세포 회전 및 전이와 같은 생리학적 현상에 중요하다. 그러한 항체 또는 이의 단편을 사용하는 치료 및 진단 방법과 조성물도 제공된다. 본 발명에 따른 방법 및 조성물은 표적화 치료제와, 종양 성장 및 전이를 비롯한 암, 백혈병, 자가면역 질병 및 염증성 질병과 같은 질병의 진단, 예후 및 병기 결정과 치료에 사용할 수 있다. 또한, 상보성 결합을 위한 다양한 항원 결합 도메인을 가지는 면역글로불린 결합 도메인의 라이브러리도 제공되는 데, 이 때 라이브러리는 중쇄 CDR3에서만 다양성을 가진다.

Description

항체 및 이의 용도{ANTIBODIES AND USES THEREOF}
기술분야
본 발명은 암 세포, 전이 세포, 백혈병 세포, 백혈구 및 혈소판 등의 세포 상에 존재하고, 세포 회전(rolling), 전이, 염증 및 자가면역 질환과 같은 다양한 생리학적 현상에서 중요한 역할을 하는 특정 에피토프(epitope)에 결합하는 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이 항체는 항암 활성, 항전이 활성, 항백혈병 활성, 항바이러스 활성, 항감염 활성 및/또는 기타 질환, 예를 들면 염증성 질환, 자가면역 질환, HIV 감염, 심혈관 질환(예, 심근 경색), 망막증 질환 및 황산화 티로신 의존성 단백질-단백질 상호작용에 의해 유발되는 질환에 대한 활성을 보유할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 신체내에 있는 특이적 세포 또는 부위에 치료제를 유도하는 표적화제로서 이용할 수 있다.
배경기술
항체, 파아지 발현(phage display) 및 조직 표적화
치료제의 조직 선택적 표적화는 약학 산업에서 새롭게 출현하는 분야이다. 표적화에 기초한 새로운 암 치료법은 독성을 감소시키면서 치료의 특이성 및 효능을 증가시킴으로써 전체적인 효능을 증강시키도록 설계되어 왔다. 종양 관련 항원에 대한 마우스 모노클로날 항체(MAb)는 독소, 방사성 뉴클레오티드 및 화학요법제 컨쥬케이트를 종양에 표적화하기 위한 시도에서 사용되어 왔다. 또한, CD19, CD20, CD22 및 CD25와 같은 분화 항원은 조혈 악성종양을 치료하는 데 있어서 암 특이적 표적으로서 이용되어 왔다.
이러한 접근법은 광범위하게 연구되었으나 몇가지 제약이 있다. 첫번째 제약은 선택적 결합을 나타내는 적절한 MAb를 분리하는 어려움에 있다. 두번째 제약은 성공적인 항체 분리를 위한 전제 조건으로서 높은 항체 면역원성이 요구된다는 것이다. 세번째 제약은 최종 생성물이 면역 반응을 유도하는 비-인간 서열을 갖는다는 것이다. 예를 들어 마우스 MAb가 인간에게 투여될 경우, 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응이 발생할 것이다. 이 HAMA 반응은 종종 결과적으로 혈청 반감기를 더 단축시키고 반복 치료를 차단함으로써 항체의 치료적 효과를 감소시킨다. 이러한 세번째 제약은 뮤린(murine) 기원의 키메라 또는 인간화 모노클로날 항체의 조작에 있어서, 그리고 인간 항체의 발견에 있어서의 관심을 자극하고 있다. 이러한 접근법의 또 다른 제약은 이 접근법이 단지 공지의 정제된 항원에 대해 유도된 단일 항체 종만을 분리할 수 있다는 것이다. 게다가 이러한 방법은, 악성 세포뿐 아니라 정상 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 항체의 분리를 허용하는 한에 있어서는 선택적이지 않다.
암을 치료하기 위한 MAb의 치료적 효능에 영향을 주는 요인은 다수가 있다. 이들 요인은 종양 세포에 대한 항원 발현의 특이성 및 발현 수준, 항원 이질성 및 종양 덩어리의 접근성을 포함한다. 백혈병 및 림프종은 일반적으로 암종과 같은 고형 종양보다 항체를 사용한 치료에 반응성이 더 컸다. MAb는 혈류 중의 백혈병 및 림프종 세포에 신속하게 결합하여 림프계 조직 내의 악성 세포에 쉽게 침투하는데, 이는 림프양 종양으로 하여금 MAb 기초 요법에 대한 매우 우수한 후보물질이 되게 한다. 이상적인 시스템은 악성 선조 세포를 생성하는 줄기 세포의 세포 표면 상의 마커를 인식하는 MAb를 동정하는 것을 수반한다.
파아지 라이브러리는 항체, 호르몬 및 수용체와 같은 분리된 소정의 표적 단백질에 결합하는 무작위 단일쇄 변형 단편(scFv)을 선별하는 데 사용되고 있다. 일반적으로는 항체 발현 라이브러리, 구체적으로는 파아지 scFv 라이브러리의 이용은 특이적인, 아직 파악되지 않은 미정의 세포 표면 부분을 표적화하기 위한 독특한 분자를 발견하는 대안적인 수단을 용이하게 한다.
백혈병, 림프종 및 흑색종은 골수 및 림프게 조직에서 유래되며 제어되지 않는 세포 성장과 관련이 있는 암이다. 급성 림프구성 백혈병(ALL)은 특이한 임상적 및 면역학적 특성에 의해 정의되는 불균일한 질환이다. 다른 형태의 ALL과 마찬가지로, B 세포 ALL(B-ALL)의 대부분 사례의 명확한 원인은 알려져 있지 않지만, 많은 사례에서, 이 질환은 단일 세포의 DNA의 후천적인 유전적 변경으로부터 발생하여 비정상 및 연속적인 증식을 유발한다. B-ALL에 걸린 환자에 대한 예후는 소아 및 성인 모두에서 다른 백혈병 환자보다 훨씬 나쁘다. 만성 림프성 백혈병(CLL)은 진행이 서서히 일어나는 형태의 백혈병이며, 림프구의 수가 증가하는 것을 특징으로 한다. 급성 골수성 백혈병(AML)은 정상적인 상태에서 골수양 세포계(적혈구, 과립구, 단핵구 및 혈소판)의 최종 분화된 세포를 발생시키는 선조 세포를 갖는 불균질한 신생물의 집단이다. 다른 형태의 신조직 형태에서와 마찬가지로, AML은 정상 적으로 분화된 골수양 세포를 비교적 미분화된 아세포로 치환시키는 결과를 초래하여 한 유형 이상의 조기 골수양 세포 분화를 나타내는 후천적인 유전적 변경과 연관되어 있다. AML은 일반적으로 골수에서 진화하며, 2차 조혈 기관에서는 더 적은 정도로 진화한다. AML은 주로 성인에게 발병하며 15∼40세에 발병률이 최고조에 달하지만, 어린이와 노인에게도 발병하는 것으로 알려져 있다. 거의 모든 AML 환자는 임상적 완화를 얻기 위해서는 진단 후 바로 치료를 받아야 하며, 이때, 순환하는 미분화 아세포의 비정상적 수준에 대한 증거는 없다.
지금까지, 종양 세포에 대한 세포 용해성 활성을 유도하는 다양한 MAb가 개발되고 있다. HER2(P185)의 세포외 도메인에 대해 생성되었으며 HER2를 과발현하는 인간 종양 세포의 증식을 현저히 억제하는 것으로 확인된 마우스 MAb muMab4D5는 약물 HERCEPTIN(등록상표)(trastuzumab)을 생성하도록 인간화되었으며, 이 약물은 FDA에 의해 승인을 받았고, 인간 유방암을 치료하는 데 사용되고 있다(미국 특허 제5,821,337호 및 제5,720,954호). 결합을 수행한 후, 항체는 HER2 성장 인자 수용체에 의존적인 종양 세포 성장을 억제할 수 있다. 또한, 림프종과 관련된 것을 비롯하여 말초 B 세포의 급격한 고갈을 유발하는 CD20에 대한 키메라 항체도 최근에 FDA의 승인을 받았다(미국 특허 제5,843,439호). 표적 세포에 대한 이러한 항체의 결합은 결과적으로 보체 의존적 용해를 유발한다. 이러한 생성물은 최근에 승인되었고, 현재 저급 B 세포 비-호지킨 림프종을 치료하는 데 임상에서 사용되고 있다.
몇 가지 다른 인간화 항체 및 키메라 항체가 현재 개발중에 있거나 임상 시험중에 있다. 예를 들어, 정상 골수양 세포 상에서 뿐만 아니라 대부분의 유형의 골수양 백혈병 세포 상에서 모두 발현되는 CD33 항원과 특이적으로 반응하는 인간화된 면역글로불린(Ig)은 항암 약물 칼리체아미신 CMA-676에 접합되었다(Sievers et al., Blood Supp . 308: 504a (1997)). 약물 MYLOTARG(등록상표)로 알려진 이러한 접합체(congugate)는 최근에 FDA의 승인을 받았다(Caron et al., Cancer Supp . 73: 1049-56 (1994)). 세포 용해 활성의 측면에서, 현재 임상 시험중에 있는 추가적인 항-CD33 항체(HumM195)는 겔로닌 독소(McGraw et al., Cancer Immunol . Immunother. 39: 367-74 (1994)) 및 방사능 동위원소 131I(Caron et al., Blood 83: 1760-68 (1994)), 90Y(Jurcic et al., Blood Supp . 92: 613a (1998)) 및 213Bi(Humun et al., Blood Supplement 38: 231P (1997))를 비롯하여 몇 가지 세포독성 제제에 접합되었다.
또한, 백혈구 항원 CD45(cHuLym3)에 대한 키메라 항체도 인간 백혈병 및 림프종의 치료에 대한 임상 시험중에 있다(Sun et al., Cancer Immunol . Immunother 48: 595-602 (2000)). 시험관내 분석에서는, ADCC((antibody dependent cell-mediated cytotoxicity; 항체 의존적 세포 매개 세포독성) 분석에서 특이적 세포 용해가 관찰되었다(Henkart, Immunity 1: 343-46 (1994); Squier and Cohen, Current Opin . Immunol. 6: 447-52 (1994)).
또한, 이러한 치료적 항체 역시 그 표적에 대한 높은 친화력을 갖고, 보다 안정해지도록 하고, 최적 생체내 분포를 위해 특이적으로 조작되었다. (참고 문헌: Presta, Current Pharma . Biotechnol ., 3: 237-56 (2002); Presta et al., Biochem. Society Transactions , 30(4): 487-90 (2002).
마우스 모노클로날 인간화 및 키메라 항체의 작제와는 대조적으로, 파아지 발현 기법의 이용은 완전한 인간 서열을 갖는 scFv의 분리를 가능하게 한다. 파아지 발현 기법으로부터 유래된 scFv 클론에 기초한 인간 TGFα-2 수용체에 대한 완전한 인간 항체가 최근에 개발되었다. 이러한 scFv는 TGFα-2의 결합과 경쟁할 수 있는 완전한 인간 IgG4로 전환되었는데(Thompson et al., J. Immunol . Meth . 227: 17-29 (1999)), 이것은 강력한 항증식 활성을 보유한다. 파아지 발현 기법은, 해당 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 하기 간행물에 더욱 상세히 기술되어 있다: Smith, Science 228: 1315 (1985); Scott et al., Science 249: 386-90 (1990); Cwirla et al., PNAS 87: 6378-82 (1990); Devlin et al., Science 249: 404-06 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 13(14): 3245-60 (1994); Bass et al., Proteins 8: 309-14 (1990); McCafferty et al., Nature 348: 552-54 (1990); Nissim et al., EMBO J. 13: 692-98 (1994); 미국 특허 제5,427,908호, 제5,432,018호, 제5,223,409호 및 제5,403,484호.
분리된 scFv 항체 분자에 대한 리간드
혈소판, 피브리노겐, GPIb, 셀렉틴 및 PSGL-1(P-셀렉틴 당단백질 리간드-1)은 각각 몇 가지 병원성 상태 또는 질환 상태, 예컨대 비정상적 또는 병원성 염증, 비정상적 또는 병원성 면역 반응, 자가면역 반응, 전이, 비정상적 또는 병원성 유착, 혈전증 및/또는 재발협착증 및 비정상적 또는 병원성 응집에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 혈소판 및 상기한 분자에 결합하거나 이와 교차반응하는 항체는 그 와 같은 병원성 상태 및 다른 병원성 상태를 포함하여 질환 및 장애의 진단 및 치료에 유용할 것이다.
혈소판
혈소판은 혈액계의 잘 규명된 성분으로서, 지혈, 혈전증 및/또는 재발협착증에서 몇 가지 중요한 역할을 한다. 혈관에 대한 손상은, 일련의 순차적인 사건을 특징으로 하는 지혈이라고 알려진 과정을 작동되게 한다. 손상된 혈관에 대한 개시 반응은 혈관 내면 상의 손상된 영역에 혈소판을 유착시키는 것이다. 다음 단계는 이미 유착된 혈소판에 다수의 혈소판 층을 응집시켜 지혈 플러그를 형성하고 혈관을 밀폐시키는 것이다. 지혈 플러그는 피브린 중합체의 침착에 의해 더욱 강화된다. 응혈 또는 플러그는 손상이 수복되는 경우에만 분해된다. 순환하는 혈소판은 거핵구의 주변으로부터 방출되는 세포질 입자이다. 따라서, 혈소판은 지혈에 있어서 중요한 역할을 한다. 혈관이 손상되면, 혈소판은 손상된 조직 표면에 들러 붙어 서로 유착(합착)한다. 이러한 일련의 사건은 급속히 발생하여 혈관 손상 부위에 무정형의 덩어리(일반적으로 혈소판 플러그 또는 혈전이라 부름)를 형성한다. 응집이라고도 불리는 합착 현상은 다양한 물질 또는 작용제, 예컨대 콜라겐, 아데노신-디포스페이트(ADP), 에피네프린, 세로토닌 및 리스토세틴에 의해 시험관내에서 개시될 수 있다. 응집은 혈소판 기능의 한 척도로서 수행되는 다양한 시험관내 테스트 중 하나이다.
전이에 있어서 혈소판의 중요성
종양 전이는 아마도 암 환자의 생존을 제한하는 가장 중요한 인자일 것이다. 축적된 데이터에 의하면 종양 세포가 숙주 혈소판과 상호작용할 수 있는 성능은 전이의 필수불가결한 결정 인자 중 하나이다(Oleksowicz, Thrombosis Res . 79: 261-74 (1995)).
종양 세포가 혈소판을 응집시키는 성능은 종양 세포의 전이 잠재력과 상관성이 있음은 입증되었으며, 종양 유도 혈소판 응집의 억제가 설치류 모델에서 전이의 억제와 상관성이 있는 것으로 나타났다. 혈소판과의 종양 세포 상호작용은 막 유착 분자 및 작용제 분비를 수반하는 것으로 입증되었다. 면역 관련 혈소판 당단백질의 발현은 종양 세포주에서 확인되었다. 혈소판 면역 관련 당단백질인 GPIb, GPIIb/IIIa, GPIb/IX 및 인테그린 αv 서브유닛은 유방 종양 세포주의 표면에서 발현된다(Oleksowicz, (1995), supra; Kamiyama et al., J. Lab . Clin . Med . 117 (3): 209-17 (1991)).
Gasic 등의 문헌[PNAS 61: 46-52 (1968)]은 항체 유도 혈소판 감소증이 CT26 결장 선암, 루이스 폐암 및 B16 흑색종에 의해 생산되는 전이의 수 및 용적을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다(Karpatkin et al., J. Clin . Invest . 81(4): 1012-19 (1988); Clezardin et al., Cancer Res . 53(19): 4695-700 (1993)). 또한, 단일 폴리펩티드 사슬(60 kd)은 GPIb와 밀접한 관련이 있고 불완전하게 또는 비정상적으로 O-글리코실화된 GPIbα서브유닛에 상응하는 HEL 세포의 표면 막 상에 발현되는 것으로 확인되었다(Kieffer et al., J. Biol . Chem . 261 (34): 15854-62 (1986)).
또한, 혈소판은 전이의 과정에도 관련이 있다. 전이성 암 세포가 혈류에 유입되는 경우, 종양 세포를 코팅하고 있는 혈소판 및 백혈구로 구성된 다세포 복합 체가 형성된다. 이러한 복합체는, 미세혈전(microemboli)이라고도 칭할 수 있는 것으로, 면역계를 침입할 때 종양 세포에 도움을 준다. 혈소판에 의해 종양 세포을 코팅하는 것은 혈소판에 의해 P-셀렉틴의 발현을 필요로 한다.
GPIb 복합체
지혈 과정의 각 단계는 혈소판 표면 상의 수용체의 존재를 요한다. 지혈에 있어서 중요한 한 수용체는 당단백질 Ib-IX 복합체(CD42로도 알려짐)이다. 이 수용체는 내피하의 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 결합함으로써 손상 부위의 혈관벽에 대한 혈소판의 유착(최초 부착)을 매개한다. 이것은 또한 지혈에서 중요한 다른 두 가지 혈소판 기능에 있어서 중요한 역할을 한다: (a) 동맥 협착 부위의 고전단에 의해 유도되는 혈소판의 응집 및 (b) 저농도의 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 활성화.
GPIb-IX 복합체는 혈소판 원형질 막의 외부 표면의 주요 성분 중 하나이다. 이 복합체는 막에 걸쳐 있는 3가지 폴리펩티드 - GPIb의 이황화 결합된 130 kDa α-사슬 및 25 kDa β-사슬 및 비공유 결합된 GPIX(22 kDa)를 포함한다. 이들 서브유닛 모두는 혈소판 막 상에 CD42 복합체의 효율적인 세포 표면 발현 및 기능을 위한 등몰량으로 존재하는데, 이는 3가지 서브유닛의 복합체로의 적절한 조립이 원형질막 상에서의 완전한 발현에 필요하다는 것을 나타낸다. GPIb의 α-사슬은 3개의 상이한 구조적 도메인으로 구성된다: (1) 루신이 풍부한 반복 서열 및 Cys 결합의 측접 서열을 함유하는 구형의 N-말단 펩티드 도메인; (2) 고도로 글리코실화된 뮤신 유사 거대당단백질 도메인; 및 (3) GPIbα경막에 대한 이황화 가교 및 세포질 서열 을 포함하는 막에 결합된 C-말단 영역.
몇 가지 일련의 증거는, vWF 및 GPIb-IX 복합체의 트롬빈 결합 도메인이 GPIbα의 아미노 말단에서 약 300 아미노산을 포함하는 구형 영역 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 인간 혈소판 GPIb-IX 복합체는 혈소판 기능 및 반응성 둘 다를 매개하는 주요 막 수용체이기 때문에, GPIb에 의한 내피하에 결합된 vWF의 인식은 혈소판이 손상된 혈관에 부착할 수 있게 한다. 게다가, GPIbα에 대한 vWF의 결합은 또한 혈소판 활성화를 유도하고, 이는 세포골격 또는 포스포리파제 A2와 GPIb-IX의 세포질 도메인의 상호작용을 수반할 수 있다. 게다가, GPIbα는 α-트롬빈에 대한 고친화성의 결합 부위를 포함하는데, 이는 아직 충분히 정의되지 않은 메카니즘에 의해 혈소판 활성화를 용이하게 한다.
셀렉틴 및 PSGL -1
P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴은 다른 기능 중에서도 특히 혈관 내피 상에서의 백혈구의 회전을 매개하는 유착 분자 부류 중 한 구성원이다. P-셀렉틴은 혈소판 내에서 과립으로서 저장되며, 트롬빈, 히스타민, 포볼 에스테르(phorbol ester), 또는 기타 자극성 분자에 의해 활성화된 후 표면으로 수송된다. 또한, P-셀렉틴은 활성화된 내피 세포 상에서도 발현된다. E-셀렉틴은 내피 세포에서 발현되며, L-셀렉틴은 호중구, 단핵구, T 세포 및 B 세포 상에서 발현된다.
PSGL-1(CD162라고도 칭함)은 GPIb와 실질적인 구조적 유사성을 공유하는 P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴에 대한 뮤신 당단백질 리간드이다(Afshar-Kharghan et al. (2001), supra). PSGL-1은 PACE(Paired Basic Amino Acid Converting Enzymes; 쌍 을 이루는 염기성 아미노산 전환 효소) 절단 부위를 갖는 이황화 결합 동형이량체이다. PSGL-1의 세포외 부분은 N-결합 글리코실화 부위를 포함하며, 다수의 살리실화, 푸코실화된 O-결합 올리고당 분지를 포함한다(Moore et al., J. Biol . Chem. 118: 445-56 (1992)). N-글리칸 부위의 대부분과 O-글리칸 부위의 다수가 점유되어 있다. 인간 HL-60 세포로부터의 PSGL-1의 O-글리칸의 구조는 결정되었다. 이러한 O-글리칸의 부분집합은 셀렉틴에 대한 결합에 요구되는 살리실화 및 푸코실화 구조인 코어-2이다.
PSGL-1은 HL60 세포 내에 361개의 잔기를 보유하는데, 267 잔기의 세포외 영역, 25 잔기의 경막 영역 및 69 잔기의 세포내 영역을 포함한다. PSGL-1은 세포 표면 상에 이황화 결합된 동형이량체 또는 이형이량체를 형성한다(Afshar-Kharghan et al., Blood 97: 3306-12(2001)). PSGL-1을 코딩하는 서열은 단일 엑손 내에 존재하여서 선택적 스플라이싱이 불가능해야 한다. 그러나, HL60 세포 및 대부분의 세포주 내의 PSGL-1은 세포외 영역에 존재하는 10 잔기 컨센서스 서열로 이루어진 15개의 연속 반복 서열을 가지며, 다만, 다형핵 백혈구, 단핵구, 및 대부분의 천연 백혈구를 포함하는 기타 몇 종의 세포주에서는 이러한 서열의 14개 및 16개의 반복 서열이 존재한다.
PSGL-1은 호중구 상에서 겉보기 분자량이 250 kDa 및 160 kDa인 이량체로서 발현되는 반면, HL60 상에서는 이량체 형태가 약 220 kDa이다. 환원 조건 하에 분석하였을 때, 각 서브유닛은 반으로 감소된다. 분자량의 차이는 상이한 수의 10량체 반복 서열의 존재에 의해 유발되는 분자 내의 다형성에 의한 것일 수 있다 (Leukocyte Typing VI. Edited by T. Kishimoto et al.(1997)).
PSGL-1은 대부분의 혈액 백혈구, 예컨대 호중구, 단핵구, 백혈구, B 세포의 부분집단 및 모든 T 세포 상에서도 발현된다(Kishimoto et al.(1997), supra). PSGL-1은 활성화된 내피, 활성화된 혈소판, 기타 백혈구 및 염증성 부위에서 백혈구의 로울링을 매개하며, P-셀렉틴 상에서의 호중구의 로울링을 매개한다. PSGL-1은 또한 L-셀렉틴과의 결합에 의해 호중구-호중구 상호작용을 매개함으로써 염증을 매개한다(Snapp et al., Blood 91(1): 154-64(1998)).
백혈구 로울링은 염증에 있어서 중요하며, P-셀렉틴(활성화된 내피 및 혈소판 상에서 발현됨, 이는 손상 부위에서 고정화될 수 있음)과 PSGL-1 간의 상호작용은 혈관 벽 상의 백혈구의 고정 및 로울링에 도움이 된다(Ramachandran et al., PNAS 98(18): 10166-71(2001); Afshar-Kharghan et al.(2001), supra). 세포 로울링은 전이에 있어서도 중요하며, 내피 세포 상에서의 P-셀렉틴과 E-셀렉틴은 전이 세포에 결합함으로써 혈류로부터 주변 조직으로의 분출을 촉진하는 것으로 생각된다.
따라서, PSGL-1은 모든 백혈구: 호중구, 단핵구, 림프구, 활성화된 말초 T 세포, 과립구, 호산구, 혈소판 상에서 발견되었으며, 몇몇 CD34 양성 줄기 세포 및 특정한 B 세포 부분집단 상에서도 확인되었다. P-셀렉틴은 활성화된 혈소판 및 내피 세포 상에서 선택적으로 발현된다. P-셀렉틴과 PSGL-1 간의 상호작용은 혈관 벽 상에서의 백혈구의 로울링을 촉진하며, 혈관 부위에서의 비정상적인 백혈구의 축적은 각종 병원성 염증을 초래한다. PSGL-1 상의 개별 티로신 설페이트의 입체 특이 적인 기여는 PSGL-1에 대한 P-셀렉틴의 결합에 있어 중요하다. 전하 역시 결합에 있어 중요한데, NaCl을 낮추면(150 mM에서 50 mM으로) 결합을 증강시켰다(Kd ∼75 nM). PSGL-1 상의 티론신 황산화는 P-셀렉틴 상의 PSGL-1의 부착을 강화시키지만 이에 궁극적으로 요구되는 것은 아니다. PSGL-1 티로신 황산화는 모든 전단 속도에서 더 느린 로울링 부착을 지지하며, 훨씬 더 빠른 전단 속도에서 로울링 부착을 지지한다(Rodgers et al., Biophys. J. 81: 2001-09(2001)). 뿐만 아니라, 혈소판 상에서의 PSGL-1 발현은 백혈구의 발현보다 25∼100배 더 낮다는 것이 제안되었다(Frenette et al., J. Exp. Med. 191(8): 1413-22(2000)).
인간 PSGL-1에 대한 시판되는 모노클로널 항체인 KPL1은 생성되어 PSGL-1과 P-셀렉틴 및 PSGL-1과 L-셀렉틴 간의 상호작용을 억제하는 것으로 나타났다. KPL1 에피토프는 PSGL-1의 티로신 황산화 영역(YEYLDYD)(SEQ ID NO: 1)에 맵핑되었다(Snapp et al., Blood 91(1): 154-64(1998)).
시알릴화, 푸코실화된 뮤신 리간드를 제거하는 O-시알로글리코프로테아제로 종양 세포를 전처리하는 것 역시 종양 세포-혈소판 복합체 형성을 억제하였다. 시험관내 실험에 의하면 이들 처리 중 어느 것이나 더 많은 단핵구가 순환하는 종양 세포와 결합하도록 하며, 이는 혈소판 결합을 감소시키는 것이 순환하는 종양 세포에 대한 면역 세포의 접근을 증가시킨다는 것을 시사한다(Varki and Varki, Braz. J. Biol. Res. 34(6): 711-17(2001)).
피브리노겐
정상적인 인간 피브리노겐은 두 가지 형태 - 정상(γ) 및 γ프라임이 있으 며, 이들 각각은 정상적인 개체에서 발견된다. 보다 풍부한 형태(신체에서 발견되는 총 피브리노겐의 약 90%)인 정상 피브리노겐은 두 개의 동일한 55 kDa α사슬, 두개의 동일한 95 kDa β사슬 및 두 개의 동일한 49.5 kDa γ사슬로 이루어진다. 정상적인 변형 피브리노겐은 보다 덜 풍부한 형태(신체에서 발견되는 피브리노겐의 약 10%)이며, 두 개의 동일한 55 kDa α사슬, 두 개의 동일한 95 kDa β사슬, 한 개의 49.5 kDa γ사슬 및 한 개의 변형 50.5 kDa γ' 사슬로 이루어진다. 감마 및 감마 프라임 사슬은 둘 다, 3' 말단에서 선택적 스플라이싱이 일어나는, 동일한 유전자에 의해 코딩된다. 정상적인 감마 사슬은 아미노산 1-411로 이루어지며, 정상적인 변형 감마 프라임 사슬은 427 아미노산으로 이루어지는데, 이 중에서 아미노산 1-407은 정상 감마 사슬의 것과 동일하고, 아미노산 408-427은 VRPEHPAETEYDSLYPEDDL(SEQ ID NO: 2)이다. 이 영역은 정상적으로는 트롬빈 분자에 의해 점유된다.
피브리노겐은 이온화된 칼슘 존재 하에 트롬빈의 작용에 의해 피브린으로 전환되어 혈액의 응고를 유발한다. 피브린은 또한 혈전 및 급성 염증성 삼출액의 한 성분이다.
단백질 황산화
단백질 황산화는 당 측쇄 또는 폴리펩티드 주쇄에의 황산의 촉매 공유 결합을 포함하는 일반적인 번역후 변형이다. 이 변형은 트랜스-골지 구획내에서 일어난다. 이러한 단백질은 분비 단백질, 과립을 표적으로 하는 단백질, 및 플라즈마 막 단백질의 세포외 영역을 포함한다. 티로신은 황산화를 거치는 것으로 최근에 알려 진 아미노산 잔기이다(Kehoe et al., Chem. Biol. 7: R57-61(2000)). 다른 아미노산, 예컨대 트레오닌도 황산화, 특히 병든 세포내에서 황산화를 거칠 수 있다.
GPIb에 대해서는, GPIb의 음하전된 N-말단 구상 도메인은 황산화를 거치는 것으로 알려진 3개의 티로신 잔기를 함유한다. 혈소판 및 거핵세포에 의해 발현되고, vWF와의 결합을 통해 내피밑층에의 혈소판 결합과 내피밑층 상의 로울링을 중개하는 GPIbα(CD42)는 또한 Asp-269와 Asp-287 사이의 음하전된 아미노산의 클러스터를 함유한다. 티로실단백질설포트랜스퍼라아제가 특히 산성 아미노 잔기에 인접한 티로신을 인지하고 황산화시기 때문에, 이러한 매우 산성이고 친수성의 환경은 황산화에 필수적인 것으로 생각된다(Bundgaard et al., J. Biol. Chem. 272: 21700-05(1997)). GPIba의 산성 영역의 완전 황산화는 다른 단백질과의 정전기 상호작용을 위한 후보 자리를 만들면서, 19개의 아미노산 스트레치내에 놀랄만한 음 전하 밀도 - 13개의 음 전하를 갖는 영역을 얻는다. 몇 개 라인의 증거가 GPIb-IX 복합체를 발현하는 형질감염된 CHO 세포 및 혈소판 GPIba 내에서 이 도메인에 함유된 3개의 티로신 잔기(Tyr-276, Tyr-278 및 Tyr-279)가 황산화를 거침을 시사하였다.
PSGL-l에 대해서는, 이 단백질은 (분자의 N-말단 도메인에서 3개의 티로신 잔기 각각 상에서) 3개의 잠재 황산화 자리를 가지며, 이어서 프롤린, 세린 및 트레오닌에서 높은 10-16 십합체 반복을 갖는다.
PSGL-1의 황산화는 P-셀렉틴의 결합을 위해 관련되어 있는 것으로 알려져 있고, PSGL-1 상의 개별 티로신 설페이트의 입체 특이적 기여는 P-셀렉틴의 PSGL-1에 대한 결합에 중요하다. 그러나, 단지 하나의 티로신 잔기의 황산화가 P-셀렉틴 결합에 충분하다는 일부 시사가 존재한다(J. Biol. Chem., Vol. 273, 12,7078-87). PSGL-1 티로신 황산화는 모든 전단 속도에서 더 늦은 로울링 부착을 지지하고, 훨씬 높은 전단 속도에서 로울링 부착을 지지한다(Rodgers et al., Biophys. J. 81: 2001-09(2001)).
황산화 N-말단 티로신이 인간 및 원숭이 면역결핍 바이러스(HIV-1, HIV-2, 및 SIV)의 표적 세포에의 진입을 위한 관련된 7개의 경막 세그먼트(7TMS)와 함께 조수용체로서 역할을 하는 CCR5와 같은 CC-케모킨 수용체의 역할에 영향을 미치는 것으로 또한 생각된다. 예컨대, 황산화 N-말단 티로신은 CCR5의 MIP-1α, MIP-1β, 및 HIV-1 gpl20/CD4 복합체에의 결합, 및 CCR5 및 CD4를 발현하는 세포에 진입하는 HIV-1의 능력에 기여하는 것으로 생각된다. 다른 중요한 HIV-1 조수용체인 CXCR4도 황산화된다(Farzan et al., Cell 96(5): 667-76(1999)). 티로신 황산화는 CCR5-의존성 진입보다 CXCR-4 의존성 HIV-1에서 덜 중요한 역할을 하므로, CXC-케모킨 족에서의 티로신 황산화를 위한 가능한 역할을 증명하고, CCR5 및 CXCR4의 HIV-1 이용에서의 일반적인 차이점을 강화시킨다(Farzan et al., J. Biol. Chem., 277(33): 29, 484-89(2002)).
PSGL-1 및/또는 GPIb에 결합하는 항체는 화지 라이브러리를 이용하여 확인하였고, 이는 미국 특허 출원 10/032,423; 10/032,037; 10/029,988; 10/029,926; 09/751,181; 10,189,032; 및 60/258,948 및 국제 특허 출원 PCT/US01/49,442 및 PCT/US01/49, 440에 개시되어 있다. 이들 출원에 개시된 항체의 특정 예는 Y1, Y17 및 L32 항체를 포함한다. 이들 항체는 배선(germ line)(DP32)으로부터 분리되어, N-말단 티로신에서 황산화되고 세포 이동, 예컨대 종양 전이에 관련되는 것으로 생각되는 조혈성 세포의 단백질 상에서 발견되는 에피토프에 특히 결합하는 것으로 밝혀졌다.
Y1/Y17/L32에의 결합으로 이전에 확인된 황산화 에피토프는 바람직하게는 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이, 혈전증, 부착 및/또는 재협착, 세포 로울링 및 응집과 같은 이러한 다양한 과정에서 중요한 역할을 하는 리간드 및 수용체 상에서 발견되는 2 이상의 산성 아미노산의 클러스터내의 황산화 티로신 잔기 또는 황산화 카르보하이드레이트 또는 지질 부분의 존재에 특징이 있다. 이러한 에피토프는 또한 병든 세포, 예컨대 T-ALL 세포, B-CLL 세포, AML 세포, 다발골수종 세포 및 전이 세포에서도 찾을 수 있다.
이들 에피토프는 (표적화제 뿐 아니라) 이들 과정의 치료 매개를 위한 표적 및 진단 절차를 위한 표적으로서 유용하다.
목적
본 발명의 목적은 세포 로울링, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이 및 HIV 진입과 같은 과정에 도움이 되는 다양한 분자 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체 및 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 부착, 혈전증 및/또는 재협착 및 혈소판 응집과 같은 과정에 관련되는 에피토프에 결합하고, 심근경색증 및 재협착과 같은 심장혈관병의 치료 및 염증 질환의 치료에 사용할 수 있는 항체 및 폴리펩티드를 제공하 는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 로울링, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이와 같은 이러한 세포 기능 또는 작용이 중요한 역할을 하는 예컨대 AML, T-ALL, B-백혈병, B-CLL, Pre-B-ALL, 다발골수종, 전이, HIV 감염, 심장혈관병 또는 다른 질환과 같은 개인의 다양한 질환 상태를 진단, 예후 또는 단계화하는 방법에 항체 및 폴리펩티드를 이용하는 것이다. 또한, 본 발명의 이들 항체는 특정 세포 또는 자리에의 치료에 관련된 표적화제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 로울링, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이와 같은 이러한 세포 기능 또는 작용이 중요한 역할을 하는 예컨대 AML, T-ALL, B-백혈병, B-CLL, Pre-B-ALL, 다발골수종, 전이, HIV 감염, 심장혈관병 또는 다른 질환과 같은 다양한 질환 상태를 위한 치료 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 종양 세포의 퍼징 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 로울링, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이와 같은 이러한 세포 기능 또는 작용이 중요한 역할을 하는 예컨대 AML, T-ALL, B-백혈병, B-CLL, Pre-B-ALL, 다발골수종, 전이, HIV 감염, 재관류 손상 및 죽상동맥경화증을 비롯한 심장혈관병 또는 다른 질환과 같은 다양한 질환 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 항체 및 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 T-세포, NK 세포를 자극하고/하거나 항체 의존성 세포 세포독성 및/또는 세포자멸사를 자극하는 항체 및 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 로울링, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이, HIV 진입, 부착, 혈전증, 재협착 및 혈소판 응집과 같은 과정에 관련되는 항체를 발현하는 폴리펩티드, 발현 벡터 및 재조합 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 특정하게 scFv 분자인 면역글로불린 결합 도메인의 라이브러리를 제공하는 것이다.
본 발명의 이들 목적 및 다른 목적이 본 명세서에서 제공된다.
발명의 개요
본 발명은 공통 서열X1-X2-X3-Pro-X5-X6(SEQ ID NO: 3)을 포함하는 항체 및 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서, X1 및 X6은 소수성 아미노산이고, X2, X3 및 X5는 임의의 아미노산이며, X2는 바람직하게는 염기성 아미노산이고, 공통 서열은 N-말단에서 C-말단으로 또는 C-말단에서 N-말단으로 배열된다. 공통 서열은 바람직하게는 항체의 과변이 영역내에, 더욱 바람직하게는 CDR3 영역내에 존재한다. 바람직하게는, 공통서열은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 배제한다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 scFv 항체의 결합 능력을 갖는 항체 또는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 화지 표시 라이브러리를 제공하는 단계를 포함하는 항체 또는 폴리펩티드의 제조 방법, SEQ ID NO: 4의 scFv 항체 단편의 결합 능력을 갖는 항체 또는 폴리펩티드에 결합하는 SEQ ID NO: 7의 폴리펩티드의 제공 방법, SEQ ID NO: 7의 펩티드에 결합하는 scFv 항체 단편을 위한 화지 표시 라이브러리의 패닝 방법, 및 SEQ ID NO: 7의 펩티드에 결합하는 scFv 항체 단편을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 라이브러리가 중쇄 CDR3에서만 다양성을 갖는, 보족 결합을 위한 다양한 항원 결합 도메인을 포함하는 면역글로불린 결합 도메인, 특히 scFv 분자의 라이브러리를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이들 약학 조성물은 세포 로울링; 염증; 자가면역 질환; 혈소판 응집; 재협착; HIV 감염; 전이; 종양 세포의 성장 및/또는 복제; 및 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제와 관련되거나 또는 이를 포함하는 증상을 비롯하여 다양한 증상의 치료, 진단, 예후 또는 단계화에 사용할 수 있다. 이들 약학 조성물은 세포 로울링의 억제; 염증의 억제; 자가면역 질환의 억제; 혈소판 응집의 억제; 재협착의 억제; HIV 감염의 억제; 전이의 억제; 종양 세포의 성장 및/또는 복제의 억제, 종양 세포의 사망률 증가, 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제의 억제, 백혈병 세포의 사망률 증가; 항질환제에 의해 손상받는 병든 세포의 감수성 변경; 항암제에 의해 손상받는 종양 세포의 감수성 증가; 항백혈병제에 의해 손상받는 백혈병 세포의 감수성의 증가; 종양을 가진 환자의 종양 세포의 수의 증가 억제; 암을 가진 환자의 종양 세포의 수의 감소; 백혈병을 가진 환자의 백혈병 세포의 수의 증가 억제; 및 백혈병을 가진 환자의 백혈병 세포의 수의 감소에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 세포 로울링, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이 와 같은 이러한 세포 기능 또는 작용이 중요한 역할을 하는 예컨대 AML, T-ALL, B-백혈병, B-CLL 세포, Pre-B-ALL, 다발골수종, 전이, HIV 감염, 심장혈관병 또는 다른 질환과 같은 다양한 질환 상태의 치료를 위한 약제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 환자로부터의 세포를 함유하는 샘플을 제공하고, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드가 환자의 세포에 결합하는지를 결정하여 환자가 질환의 위험에 있거나 질환을 갖는지를 시사함으로써 환자의 질환을 진단, 예후 또는 단계화하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 환자로부터의 세포를 함유하는 샘플을 제공하고, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드와 함께 환자로부터의 세포를 배양함으로써 환자로부터의 종양 세포를 퍼징하는 방법을 제공한다.
정의
항체(Ab), 또는 면역글로불린(Ig)는 항원에 결합하는 단백질 분자이다. 자연 발생 항체의 각 기능성 결합 단위는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 4개의 폴리펩티드 사슬(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진다. 각 사슬은 불변 부위 및 가변 부위를 갖는다. 자연 발생 항체는 그 중쇄 성분에 기초하여 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함하는 몇 가지 부류로 분류될 수 있다. IgG 부류는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 비롯하여 몇 개의 하위 부류를 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 면역글로불린은 B 림프구에 의해 생체내에서 생산되며, 그러한 각 분자는 특정 외부 항원성 결정 인자를 인식하고, 그 항원의 제거를 촉진한다.
항체는 항체 복합체를 비롯하여 여러 형태로 생성되어 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체 복합체" 또는 "항체 복합체들"이란 하나 이상의 항체와 다른 항체의 복합체, 또는 하나 이상의 항체와 항체 단편(들)의 복합체, 또는 2 이상의 항체 단편의 복합체를 의미하는 것으로 사용된다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, F(ab')2, Fc, 및 Fd 단편을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편의 복합체를 포함한다.
본 명세서 및 청구의 범위에서 사용되는 Fv는 같거나 다를 수 있는, 인간 항체의 중쇄의 가변 부위 및 인간 항체의 경쇄의 가변 부위로 이루어진 분자로서, 이때, 중쇄의 가변 부위는 경쇄의 가변 부위에 연결되거나, 결합되거나, 융합되거나 또는 공유 결합되거나, 또는 이와 회합된다. Fv는 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이황화 안정화된 Fv(dsFv)일 수 있다. scFv는 가요성 아미노산 폴리펩티드 스페이서 또는 링커에 의해 결합된, 항체의 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인으로 이루어진다. 링커는 분지될 수도 있고 비분지될 수도 있다. 바람직하게는, 링커는 0∼15 아미노산 잔기이며, 가장 바람직하게는 링커는 (Gly4Ser)3(서열 번호 제8번)이다.
Fv 분자 자체는 제1 사슬 및 제2 사슬로 이루어지며, 각 사슬은 제1, 제2 및 제3의 초가변 부위를 갖는다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 내의 초가변 루프는 상보성 결정 부위(CDR)라 칭한다. 중쇄 및 경쇄 각각에는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 부위가 존재한다. 이들 부위는 항원 결합 부위를 형성하는 것으로 생각되며, 강화된 결합 활성을 나타내도록 특이적으로 변형될 수 있다. 이들 부위 중 자연적으로 가장 가변성이 큰 부위는 중쇄의 CDR3 부위이다. CDR3 부위는 Ig 분자의 가장 노출된 부위인 것으로 이해되며, 본원에서 제시하는 바와 같이, 관찰되는 선택적 및/또는 특이적 결합 특성에 가장 많이 기여하는 부위이다.
Fv 분자의 단편은 원형(original) Fv의 선택적 및/또는 특이적인 결합 특성을 여전히 보유하는 원형 Fv보다 작은 임의의 분자로서 정의된다. 그러한 단편의 예로는 비제한적으로 (1) Fv의 중쇄의 단편만으로 이루어진 미니바디, (2) 항체 중쇄 가변 부위의 작은 부분 단위를 포함하는 마이크로바디(국제 출원 PCT/IL99/00581), (3) 경쇄의 단편을 갖는 더 작은 바디, 및 (4) 경쇄 가변 부위의 기능성 단위를 갖는 유사한 바디를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "Fab 단편"은 면역글로불린의 1가 항원 결합 단편이다. Fab 단편은 경쇄와, 중쇄의 일부분으로 이루어진다.
F(ab')2 단편은 펩신 분해에 의해 얻어지는 면역글로불린의 2가 항원 결합 단편이다. 이것은 양 경쇄와, 양 중쇄의 일부분을 포함한다.
Fc 단편은 면역글로불린의 비-항원 결합 부분이다. 이것은 중쇄의 카르복시 말단 부분 및 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함한다.
Fd 단편은 면역글로불린의 중쇄의 가변 부위 및 제1 불변 부위이다.
폴리클로널 항체는 면역 반응의 산물이며, 다수의 상이한 B 림프구에 의해 형성된다. 모노클로널 항체는 하나의 클론성 B 세포로부터 유래된다.
소수성 아미노산은 일반적으로 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 시스테인(C), 알라닌(A), 티로신(Y), 트레오닌 (T), 세린(S), 프롤린(P), 및 글리신(G)이다. 염기성 아미노산은 일반적으로 아르기닌, 히스티딘 및 리신이다.
폴리펩티드에 대해 적용되고 본 발명에서 정의되는 바와 같은 카세트는 프레임워크로서 작용하는 소정의 연속 아미노산 서열을 의미하며, 단일 단위로서 간주되고 단일 단위로서 조작된다. 아미노산은 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다. 마찬가지로, 아미노산의 스트레치는 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다.
"에피토프"란 용어는 본원에서 항체, 항체 단편, 항체 복합체 또는 이의 결합 단편을 갖는 복합체 또는 T 세포 수용체와 상호작용하는 항원 결정 인자 또는 인식 부위 또는 항원 부위를 의미하는 것으로 사용된다.
선택성이란, 실체 또는 실체 상태의 혼합물로부터 하나의 실체 또는 세포 상태를 선택하여 결합하는 표적화 분자의 능력으로서 정의되며, 상기의 모든 실체 또는 실체 상태는 표적화 분자에 대해 특이적일 수 있다.
본원에서 사용되는 "친화력(affinity)"이란 결합 분자(예, 항체 상의 한 결합 부위)와 리간드(예, 항원 결정 인자) 간의 결합 강도(결합 상수)의 척도이다. 항체 상의 단일 항원 결합 부위와 단일 에피토프 간의 비공유 상호작용의 총 합의 강도는 그 에피토프에 대한 항체의 친화력이다. 저친화성 항체는 항원에 약하게 결합하여 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 항원에 보다 강하게 결합하여 더 오랫동안 결합된 상태로 유지된다. "결합력(avidity)"이란 항체-항원 상 호작용의 수가(valence)를 반영하기 때문에 친화력과는 다르다.
항체-항원 상호작용의 특이성: 항원-항체 반응은 특이적이지만, 어떤 경우에는 한 항원에 의해 유도된 항체는 다른 무관한 항원과 교차반응할 수 있다. 그러한 교차 반응은 두 개의 상이한 항원이 상동성 또는 유사한 구조, 에피토프, 또는 이의 고정 영역을 공유하는 경우나, 또는 한 에피토프에 특이적인 항체가 유사한 구조 배좌 또는 화학적 특성을 보유하는 무관한 에피토프에 결합하는 경우에 발생한다.
혈소판은 골수강에 방출되어 그 후 말초 혈류에서 순환하는 거핵구의 원형 세포질 단편이다. 혈소판은 응혈 과정에서의 주요 역할을 비롯하여 몇 가지 생리학적인 기능을 보유한다. 혈소판은 중심부에 위치한 과립 및 말초의 투명한 원형질을 포함하지만, 뚜렷한 핵은 갖고 있지 않다.
본원에서 사용되는 유착은 현탁된 박테리아, 세포, 디스크 또는 기타 유사한 크기의 입자들이 부착되어 덩어리를 형성하는 과정을 의미한다. 이 과정은 침전과 유사하지만, 입자들은 더 크고 용액보다는 현탁액으로 존재한다.
응집이란 용어는 시험관내에서 유도된 혈소판의 덩어리지는 현상을 의미하며, 트롬빈 및 콜라겐은 순차적 메카니즘의 일부로서 혈전 또는 지혈 플러그의 형성을 유도한다.
보존적 아미노산 치환은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 단편의 하나 또는 두 개의 아미노산을 변화시키는 것에 의한 아미노산 조성의 변화로서 정의된다. 치환은 대체로 유사한 성질(예, 산성, 염기성, 방향성, 크기, 양전하 또는 음전하, 극성, 비극성)을 갖는 아미노산에 대해 이루어지며, 이러한 치환은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 특성(예, 전하, 등전점, 친화력, 결합력, 배좌, 가용성) 또는 활성을 실질적으로 변화시키지 않도록 이루어진다. 그러한 보존적 아미노산 치환을 위해 수행될 수 있는 전형적인 치환은 다음과 같은 아미노산의 군 중에서 이루어질 수 있다.
글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 루신(L) 및 이소루신(I)
아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)
알라닌(A), 세린(S) 및 트레오닌(T)
히스티딘(H), 리신(K) 및 아르기닌(R)
아스파라긴(N) 및 글루타민(Q)
페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)
보존적 아미노산 치환은, 예를 들어 분자의 선택적 및/또는 특이적 결합 특성의 주된 원인이 되는 초가변 부위에 측접한 부위뿐 아니라, 예를 들어 가변 중쇄 카세트와 같은 분자의 다른 부분에서 이루어질 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 변형은 전체 크기의 항체, 디아바디(이량체), 트리아바디(삼량체) 및/또는 테트라바디(사량체)를 형성하기 위해 또는 미니바디 또는 마이크로바디를 형성하기 위해 분자를 재구성함으로써 수행될 수 있다.
프로모터는 RNA 폴리머라제가 결합하여 전사를 개시시키는 DNA 상의 영역이다.
파지 디스플레이 라이브러리(파지 펩티드/항체 라이브러리, 파지 라이브러 리, 또는 펩티드/항체 라이브러리라고도 함)는 대형 파지 집단(108 이상)을 포함하며, 각 파지 입자는 하나의 펩티드 서열을 나타낸다.
약학 조성물이란 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드와 이의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제, 또는 항체-약제(항체-제제) 복합체와 이의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제형을 의미한다.
제제란, 인간, 소, 말, 돼지, 쥐, 개, 고양이 또는 임의의 기타 온혈 동물을 비롯하여(이에 국한되는 것은 아님) 포유동물의 활성 질환의 치료, 예방적 치료 또는 진단에 유용한 제제를 의미한다. 제제는 방사능 동위원소, 독소, 약제, 올리고뉴클레오티드, 재조합 단백질, 항체 단편, 약제, 항암제, 항백혈병제, 항전이제, 항혈관신생제, 항질환제, 항유착제, 항혈전제, 항재발협착제, 항자가면역제, 항응집제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택된다. 그러한 제제의 다른 예는 비제한적으로 아시클로비어, 간시클로비어 및 지도부딘을 포함하는 항바이러스제; 실로스타졸, 달테파린 나트륨, 레비파린 나트륨 및 아스피린을 포함하는 항혈전제/항재발협착제; 잘토프로펜, 프라노프로펜, 드록시캄, 아세틸 살리실릭 17, 디클로페낙, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 설린닥, 나프록센, 암톨메틴, 셀레콕시브, 인도메타신, 로페콕시브 및 니메술리드를 포함하는 항염증제; 레플루노마이드, 데닐루킨 디프티톡스, 수브레움, WinRho SDF, 데피브로타이드 및 시클로포스파마이드를 포함하는 항자가면역제; 및 리마프로스트, 클로르크로멘 및 히알루론산 및 이의 유도체, 조합물 및 변형물을 포함하는 항유착제/항응집제로 이루어진 군에서 선택된다.
항백혈병제는 항백혈병 활성을 가진 제제이다. 예를 들어, 항백혈병제는 백혈병 세포 또는 미성숙 예비 백혈병 세포의 성장을 억제 또는 중지시키는 제제, 백혈병 또는 예비 백혈병 세포를 사멸시키는 제제, 다른 항백혈병 제제에 대한 백혈병 또는 예비 백혈병 세포의 감수성을 증가시키는 제제 및 백혈병 세포의 전이를 억제하는 제제를 포함한다. 본 발명에서는, 항백혈병제는 또한 종양의 혈관형성을 예방, 억제, 지연 또는 중지시키는 항혈관신생 활성을 갖는 제제일 수 있다.
항암제는 항암 활성을 갖는 제제이다. 예를 들어, 항암제는 암 세포 또는 미성숙 예비 암 세포의 성장을 억제 또는 중지시키는 제제, 암 또는 예비 암 세포를 사멸시키는 제제, 다른 항암 제제에 대한 암 또는 예비 암 세포의 감수성을 증가시키는 제제 및 암 세포의 전이를 억제하는 제제를 포함한다. 본 발명에서, 항암제는 또한 종양의 혈관형성을 예방, 억제, 지연 또는 중지시키는 항혈관신생 활성을 갖는 제제일 수 있다.
유전자의 발현 패턴은 특정한 시간에 다양한 조건 하에 다양한 조직에서 생성되는 유전자 생성물의 양을 분석함으로써 연구할 수 있다. 유전자는 유전자 생성물의 양이 정상 대조군, 예를 들어 비질환 대조군에서 발견되는 것보다 많은 경우에 "과다발현"되는 것으로 간주된다.
소정의 세포는 소정의 항체에 대한 결합 부위(또는 에피토프)를 갖는 단백질을 그 표면에 발현할 수 있으나, 그 결합 부위는 제1 기(I기)라 불리기도 하는 상태의 세포에서 잠재 형태(cryptic form)로 존재할 수 있다(예를 들어, 항체에 의해 공간적으로 방해 또는 차단되거나, 항체에 의한 결합에 필요한 특징이 결여됨). I 기는, 예를 들어 정상적 상태, 건강한 상태, 비질환 상태일 수 있다. 에피토프가 잠재 형태로 존재하는 경우, 이것은 소정의 항체에 의해 인식되지 않는데, 즉, I기에서는 이 에피토프 또는 소정의 세포에 대한 항체의 결합이 존재하지 않는다. 그러나, 에피토프는, 예를 들어 스스로 변형을 겪거나 차단이 해제됨으로써 노출될 수 있는데, 왜냐하면 가까이 있거나 결합된 분자들이 변형되거나 또는 부위가 배좌 변화를 겪기 때문이다. 변형의 예로는 폴딩의 변화, 번역후 변형의 변화, 포스포리피데이션의 변화, 황산화의 변화, 글리코실화의 변화 등을 포함한다. 그러한 변형은 세포가 제2 기(II기)라 불리는 다른 상태로 진입할 때 발생할 수 있다. 제2 상태 또는 제2 기의 예는 활성화, 증식, 형질전환을 포함하거나 또는 악성 상태로 존재할 수 있다. 에피토프는 변형되면 노출될 수 있고 항체가 결합할 수 있다.
펩티도-모의체(펩티드 모의체)는 아미노산 간에 임의의 펩티드 결합, 즉, 아미드 결합을 더 이상 포함하지 않는 분자이다. 그러나, 본 발명에서, 펩티드 모의체란 용어는 자연적으로는 더 이상 완전한 펩티드가 아닌 분자, 예컨대 유사 펩티드, 반펩티드 및 펩토이드를 포함하는 것이다. 완전한 비-펩티드이든 부분적인 비-펩티드이든지 간에, 본 발명에 따른 펩티드 모의체는 펩티드 모의체의 기초를 이루는 펩티드 내의 활성 기의 3차원적 배열과 매우 유사한 반응성 화학적 부분의 공간적 배열을 제공한다. 이러한 분자들은 작은 분자, 지질, 다당류 또는 이들의 접합체를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 PSGL-1에 대한 결합을 분석하기 위한, 본 발명에 따른 선택된 클론의 파지 ELISA로부터 얻은 수치적 데이터를 나타낸다.
도 2는 PSGL-1에 대한 결합을 분석하기 위한, 본 발명에 따른 선택된 클론의 scFv ELISA로부터 얻은 수치적 데이터를 나타낸다.
도 3은 PSGL-1을 발현시키는 ML-2 세포에 대한 결합을 분석하기 위한, L32 및 본 발명에 따른 선택된 클론으로부터의 scFv의 FACS 분석으로부터 얻은 수치적 데이터를 나타낸다.
도 4는 글리코칼리신에 대한 결합을 분석하기 위한, L32 및 본 발명에 따른 선택된 클론으로부터의 scFv의 ELISA로부터 얻은 수치적 데이터를 나타낸다.
도 5는 혈소판 및 과립구에 대한 결합을 분석하기 위한, L32 및 본 발명에 따른 선택된 클론으로부터의 scFv의 FACS 분석으로부터 얻은 수치적 데이터를 나타낸다.
도 6은 L32 및 본 발명에 따른 선택된 클론의 과립구/혈소판 결합비의 비교를 나타낸다.
도 7은 KPL-1의 존재 및 부재시 ML-2 세포에 대한 S15의 결합 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 PBS에서 ML-2 세포에 대한 정제된 scFvs의 결합 비교를 제공하는 FACS 분석으로부터 얻은 수치적 데이터를 나타낸다.
도 9는 PBS에서 ML-2 세포에 대한 정제된 scFvs의 결합 비교를 제공하는 FACS 분석으로부터 얻은 수치적 데이터를 나타낸다.
도 10은 50% 혈장중 ML-2 세포에 대한 정제된 scFvs의 결합 비교를 제공하는 FACS 분석으로부터 얻은 수치적 데이터를 나타낸다.
도 11은 50% 혈장중 ML-2 세포에 대한 정제된 scFvs의 결합 비교를 제공하는 FACS 분석으로부터 얻은 수치적 데이터를 나타낸다.
도 12는 ML-2 세포에 대한 정제된 scFvs의 투여량 반응에 대한 FACS 분석을 나타낸다.
도 13은 GPIb 및 PSGL-1 황산화 펩티드에 대한 선택된 파지 클론의 결합을 나타낸다.
도 14는 글리코칼신에 대한 scFvs의 결합을 나타낸다.
도 15는 유세포분류기를 사용한, 세정된 혈소판에 대한 증가된 농도의 여러가지 scFvs의 결합에 대한 그래프이다.
도 16은 ELISA 분석을 통하여 글리코칼신에 대한 여러가지 scFvs의 결합을 나타낸다.
도 17은 리시토세틴에 의하여 유도되는 혈소판 응집에 미치는 A3R scFv의 효과를 나타낸다.
도 18 은 CPA 분석을 이용한 폴리스티렌에 부착된 혈소판 상에서의 Y1 scFv, A3R scFv 및 대조군 PBS의 효과를 도시한다.
도 19 는 볼루스 주사 후 기니아 피그에 결환된 A3R scFv 의 농도를 도시한다.
도 20 은 볼루스 주사 후 기니아 피그에 결환된 A3R scFv 의 혈장 농도를 도시한다.
도 21 은 PSGL-1, GPIb 및 CCR5 의 황산화 영역에 기재한 펩타이드에의 scFv의 직접적인 결합의 수치 데이타를 도시한다.
도 22 는 B-CLL 환자 샘플에서 S15 IgG 유도된 ADCC를 도시한다.
도 23 는 B-CLL 환자 샘플에서 S15 IgG 유도된 ADCC 중 상기 이펙터 세포 군집의 상관 관계를 도시한다.
도 24 는 B-CLL 환자 샘플에서 세포 자멸을 유도하기 위한 S15 IgG 및 리툭시맙의 능력을 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 컨센서스 서열: X1-X2-X3-Pro-X5-X6 (서열번호:3)을 포함하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것인데, 여기에서 X1 및 X6 는 소수성 아미노산이며 X2, X3 및 X5 는 임의의 아미노산이며, 여기서 X2 는 바람직하게는 염기성 아미노산이며, 여기서 컨센서스 서열은 N-말단으로부터 C-말단으로 또는 C-말단으로부터 N-말단으로 배열될 수 있다 (이러한 항체는 일반적으로 본원에서 컨센서스 항체로 지칭됨).
본 발명의 컨센서스 항체의 한 구체예에서, X2 는 아르기닌 및 라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되며 X1 및 X6 은 루신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌, 및 이소루신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 구체예의 컨센서스 항체는 서열번호:9 및 서열번호:10으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 구체예에서, 컨센서스 항체는 서열번호:5 (CDR3 서열은 서열번호:9)이고 이러한 컨센서스 항체는 본원에서 S15 로 고안되며 지칭된다. 대안적으로, 컨센서스 항체는 상기 구체예에서 보다 바람직하게는 서열번호:6 (CDR3 서열은 서열번호:10)이며 이러한 컨센서스 항체 본원에서 A3R으로 고안되며 지칭된다.
본 발명의 컨센서스 항체의 다른 구체예에서, X2 및 X3 은 아르기닌이고 소수성 아미노산 X6 은 바람직하게는 이소루신이다. 바람직하게는, 상기 다른 구체예의 컨센서스 항체는 서열번호:9 및 서열번호:10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 컨센서스 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 다른 구체예의 컨센서스 항체는 A3R 및/또는 S 15 이다.
본 발명의 컨센서스 항체의 다른 구체예에서, X1 는 루신 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며, X2 및 X3 은 아르기닌이고, X5 는 세린 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되며 X6 은 이소루신이다. 바람직하게는, 상기 다른 구체예의 컨센서스 항체는 서열번호:9 및 서열번호:10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 컨센서스 서열을 포함한다.
본 발명의 컨센서스 항체의 다른 구체예에서, X1 는 루신, X2 는염기성 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되며 X6 는 소수성 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 구체예의 바람직한 컨센서스 항체는 서열번호:ll 내지 서열번호:16 의 D 시리즈 항체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 구체예의 컨센서스 항체는 D1 (CDR3 영역은 서열번호: 14 이고 완전한 scFv 는 서열번호:55 임) 또 는 D3 (CDR3 영역은 서열번호: 13 이고 완전한 scFv 는 서열번호:56 임)이다.
본 발명의 컨센서스 항체는 바람직하게는 제2 에피토프 보다 제1 에피토프 우선적으로 결합하는데, 여기서 하나 이상의 제1 및 제2 에피토프는 황산화된다. 제1 및 제2 에피토프의 예로서 PSGL-1 에피토프 및 GPIb 에피토프를 포함한다. 보다 바람직하게는, 컨센서스 항체는 PSGL-1 및 GPIb 모두의 에피토프에 결합하고 바람직하게는 GPIb 에피토프보다 PSGL-1 에피토프에 더 강한 결합력을 갖는 결합 또는 PSGL-1 에피토프 보다 GPIb 에피토프에 더 강한 결합력을 갖는 결합을 나타낸다. 대안적으로, 컨센서스 항체는 유사한 결합력으로 제1 및 제2 에피토프 (예를 들어, PSGL-1 및 GPIb)에 결합한다. 비슷한 결합력으로 PSGL-1 및 GPIb에 결합하는 적절한 항체로는 D1 및 D3, 완전한 scFv 또는 CDR3 영역을 포함한다.
컨센서스 항체가 A3R 인 구체예에서, 바람직하게는 컨센서스 항체는 황산화된 PSGL-1 에피토프보다 더 강한 결합력으로 황산화된 GPIb의 에피토프에 결합한다. 구체적으로, 유사한 농도에서 S15 및 A3R 의 결합 특성 비교와 관련하여, A3R 가 S15 보다 강한 결합력으로 건강한 GPIb 혈소판에 결합하는 것이 발견되었다. 또한 유사한 농도에서 S15는 A3R 보다 강한 결합력으로 건강한 전혈 세포 (과립성 백혈구; 백혈구; 및 PSGL-1 를 발현하는 단핵구를 포함)에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 S15 와 실질적으로 유사한 결합력으로 황산화된 PSGL-1 및/또는 황산화된 GPIb 에, 바람직하게는 GPIb 보다 강한 결합력으로 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 보다 바람직하게는 항체는 51 위치의 제3 N- 말단 티로신 잔기에서 황산화된, 황산화된 PSGL-1 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 A3R와 실질적으로 유사한 결합력으로 황산화된 PSGL-1 및/또는 황산화된 GPIb 에, 바람직하게는 PSGL-1 보다 강한 결합력으로 GPIb 에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직하게는, 상기 구체예의 항체는 46 위치의 제1 N-말단 티로신 잔기에서 황산화된, 황산화된 GPIb 에피토프에 결합한다. 대안적으로, 본 발명은 D1 및/또는 D3 와 실질적으로 유사한 결합력으로 황산화된 PSGL-1 (바람직하게는 Tyr-51 의 제3 N-말단 티로신 잔기에서 황산화됨) 및 to 황산화된 GPIb (바람직하게는 Tyr-276 의 제1 N-말단 티로신 잔기에서 황산화됨)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
황산화된 PSGL-1 및 GPIb 에의 본 발명의 다양한 항체(예를 들어, S15 및 A3R)의 결합력 차이의 결과로서 그리고 이러한 두 항체의 컨센서스 서열의 X1 및 X5 의 위치가 다르기때문에, 본 발명의 컨센서스 항체의 컨센서스 서열의 X1 및 X5 는 티로신 황산화 부위에 컨센서스 항체의 결합에 기여할 수 있다. 따라서, 컨센서스 서열의 X1 및 X5 에서의 아미노산은 결합을 목표로 하는 특정 황산화 에피토프에 따라 특이적으로 선택될 수 있다. 즉, 위치 X1 및 X5 는 특정 황산화 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체에 맞춰 변경될 수 있다. 또한, S15 가 바람직하게는 제3 N-말단 티로신에서 황산화 변형을 포함하는 PSGL-1 에피토프에 결합하고 A3R이 바람직하게는 제1 N-말단 티로신에서 황산화 변형을 포함하는 GPIb 에피토프에 결합하기 때문에(반면 D 1 및 D3 는 모두 PSGL-1 및 A3R 에 동일하게 결합함), 컨센서스 서열의 X1 및 X5 는 각각 PSGL-1 및 GPIb의 제3 및 제1 황산화된 티로신에의 S15 및 A3R 결합에 연관될 수 있다.
PSGL-1 및 GPIb 에 결합하는 항체는 파지 라이브러리를 사용하여 동정하였으며 미국 출원 제10/032,423호; 제10/032,037호; 제10/029,988호; 제10/029,926호; 제09/751,181호; 제0,189,032호; 및 제60/258,948호 및 국제 출원 PCT/US01/49442 및 PCT/US01/49440 에 개시되어 있다. 상기 출원에 개시된 항체의 구체적인 예로는 Y1, Y17 및 L32 항체를 포함한다. 이러한 항체는 생식선(DP32)으로부터 단리되었으며 조혈 세포의 단백질 상에서 발견되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 발견되었으며, 세포 이동, 예를 들어 종양 전이에 관여하는 것으로 생각된다.
Y1/Y17/L32에 대한 결합으로서 이전에 확인된 황산화된 에피토프는, 바람직하게는 2 이상의 산성 아미노산의 클러스터 내의 황산화된 부분, 예컨대 황산화된 티로신 잔기 또는 황산화된 탄수화물 또는 지질 부분의 존재를 특징으로 하며, 이는 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이, 유착, 혈전증 및/또는 재발협착증, 세포 회전 및 응집과 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하는 리간드 및 수용체 상에서 발견된다. 그러한 에피토프는 질병 세포, 예를 들어 T-ALL 세포, B-CLL 세포, AML 세포, 다발성 골수종 세포, 및 전이 세포 상에서도 발견된다.
본 발명의 컨센서스 항체는, DP32 군으로부터 단리되며 황산화된 티로신 에피토프를 갖는 단백질에 결합한다. 이러한 단백질은 이에 제한되지는 않지만, PSGL-1, GPIb, α-2-안티플라스민; 아미노펩티다제 B; CC 케모카인 수용체 예컨대 CCR2, CCR5, CCR3, CXCR3, CXCR4, CCR8, 및 CCR2b; 7개의 경막 단편 (7TMS) 수용 체; 응집 인자 예컨대 인자 V, VIII, 및 IX; 피브리노겐 감마 사슬; 헤파린 보조 인자 II; 세크레토그라닌 예컨대 세크레토그라닌 I 및 II; 비트로넥틴, 아밀로이드 전구체, α-2-안티플라스민; 콜레시스토키닌; α-코리오고나도트로핀; 보체 C4; 더마탄 설파테프로테오글리칸; 피브로넥틴; 및 카스트린. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 컨센서스 항체는 황산화된 CC 케모카인 수용체 예컨대 CCR5, CXCR4, 및 CCR2b 에 결합한다. 황산화된 티로신은 CCR5 의 MIP-1a, MIPp, 및 HIV-1 gp120/CD4 에의 결합 및 CCR5 및 CD4 를 발현하는 세포로 혼입되는 HIV-1 의 능력에 기여할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 이러한 항체들은 세포의 발달 단계에 의존적이다(AML 아형은 통상적인 처리 및 세포화학적 염색에 의해 관찰된 형태를 이용하여 프렌치-아메리칸-브리티시 시스템에 기초하여 분류됨): 이 항체는 아형 M3 또는 이보다 높지만, M0 또는 M1 아형 세포는 아닌 AML 세포에 결합한다. 또한, 이 항체는 M2 아형 세포에 결합할 수도 하지 않을 수도 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 정상적이고 건강한 골수(예, CD34+ 세포)에는 결합하지 않는다. 그러한 차이는 PSGL-1 발현 및/또는 황산화에 있어서의 변경뿐 아니라, 약간 다른 에피토프를 노출시키는 PSGL-1 내의 가능한 배좌적 변화에 기초한 것으로 생각된다.
따라서, 컨센서스 항체는 M0, M1, M2, 및 M3 세포와 같은 골수 세포 내 미분화된 세포에는 결합하지 않을 수 있다. 컨센서스 항체가 결합하는 PSGL-1 은 현저한 농도로 발현되지 않으며, 이러한 미분화 세포 상에서 황산화되지 않는다. 본 발명의 컨센서스 항체는 또한 건강한 골수 세포(예컨대 CD34+ 세포)에 결합하지 않을 수 있다.
보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 컨센서스 항체는 황산화된 PSGL-1에 결합한다. S15 항체는 특히, PSGL-1에 대한 증가된 선택성을 갖는다. 염증에 관여하는 백색 세포, 예를 들어 단핵구, 호중구 및 림프구는 아테롬성 동맥경화증과 같은 질환의 염증 진행에 주로 4종의 유착 분자, PSGL-1, P-셀렉틴, VLA-4, 및 VCAM-1에 의해 참여하게 된다(Huo 및 Ley, Acta Physiol. Stand, 173: 35-43 (2001); Libby, Sci. Ans. May: 48-55 (2002); Wang et al., J. Am. Coll. Cardiol. 38: 577-582 (2001)). 컨센서스 항체의 방해, 특히 임의의 이러한 중심 분자를 갖는 S15 는 관련된 질환을 해결하는 데 있어서의 잠재적 역할을 시사할 수 있다.
구체적으로, P-셀렉틴은 세포 부착 및 회전을 제어한다. 또한, P-셀렉틴-PSGL-1 상호작용은 종양발생(악성 세포와 관련되었을 때) 및 염증성 반응(백혈구와 관련되었을 때)과 필수적으로 연관된 세포 표면 상의 다수의 다른 분자를 활성화시킨다(Shebuski 및 Kilgore, J. Pharmacol. Exp. Cher. 300: 729-735 (2002)). P-셀렉틴이 세포 과정을 조절할 수 있는 능력에 대한 이와 같은 이해에 기초하면, 황산화된 PSGL-1에 대한 컨센서스 항체 및 S15의 강화된 scFv 선택성은 이 분자를 다양한 악성 및 염증성 질환을 치료하기 위한 우수한 분자로 만들 수 있음이 분명하다. 게다가, 악성 질환의 모델은, 악성 세포에 대한 P-셀렉틴의 결합은 PSGL-1의 황산화를 필요로 한다는 것을 보여주었다(Ma 및 Geng, J. Immunol. 168: 1690-1696 (2002)). 이러한 요건은 컨센서스 항체 및 특히 S15 결합에 대한 요건과 유사하다. 따라서, 컨센서스 항체 및 특히 S15 가 진행성 악성 질환의 P-셀렉틴 촉진을 파괴 할 수 있음을 예측할 수 있다.
본 발명의 컨센서스 항체는, 특히 X2 및 X3 이 아르기닌이고, X6 이 이소루신, 바람직하게는 A3R 인 구체예에서, 황산화된 GPIb 에 대해 향상된 선택성을 또한 나타낸다. GPIb 는 동맥 협착 부위의 고전단에 의해 유도되는 혈소판의 응집 및 저농도의 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 활성화에 관련된다. GPIb의 이러한 이해를 기초로, 황산화된 GPIb에 대한 컨센서스 항체 및 A3R 의 향상된 scFv 선택성은 다양한 심혈관 및 염증 질환을 치료하는데 월등한 분자로 만든다.
바람직하게는, 본 발명의 컨센서스 항체는 T-ALL 세포, AML 세포, 전-B-ALL 세포, B-백혈병 세포, B-CLL 세포, 다발성 골수종 세포 및 종양발생에 관여하는 하나 이상의 세포 유형 상에 존재하는 에피토프에 결합한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 컨센서스 항체는 지질, 탄수화물, 펩티드, 당지질, 당단백질, 지단백질 및/또는 지다당류 분자 상의 에피토프에 결합한다. 이러한 에피토프는 바람직하게는 하나 이상의 황산화된 부분을 가진다. 대안으로, 그러나 역시 바람직하게는, 본 발명의 컨센서스 항체는 2 이상의 에피토프와 교차 결합하며, 각 에피토프는 하나 이상의 황산화된 티로신 잔기 및 2 이상의 산성 아미노산의 하나 이상의 클러스터를 보유하는데, 클러스터의 한 예가 PSGL-1이다. 본 발명의 이러한 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어 PSGL-1에 결합 후 AML 세포로 흡수될 수 있다. 그러한 흡수는 방식, 시간 및 온도 의존적인 능동적 과정인 엔도사이토시스를 통해 일어날 수 있다.
컨센서스 항체의 초가변 부위에는 항체가 항원 결합 부위를 형성하는 데 참여하는 본 발명에 따른 S15, A3R, S1, S11, D1 및 D3 과 실질적으로 동일한 결합력 으로 결합한다. 항원 결합 부위는 항체가 결합하는 에피토프의 구조에 상보적이며, 이에 따라 이러한 결합 부위는 상보성 결정 부위(CDR)라 불린다. 항체의 각 경쇄 및 중쇄 상에는 3개의 CDR(CDR1, CDR2, 및 CDR3)이 존재하는데, 이들 각각은 VH 및 VL 도메인의 β가닥을 연결하는 루프 상에 위치한다. 이들 영역 중 가장 가변성이 큰 영역은 중쇄의 CDR3 부위이다. CDR3 부위는 Ig 분자의 가장 노출된 영역이며, 본원에서 제시하는 바와 같이, 관찰되는 선택적 및/또는 특이적 결합 특성을 결정하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 이해된다.
파지 디스플레이 라이브러리에 존재하는 49 생식선 중 하나인 DP32는 본 발명의 scFv 항체를 분리해 낸 파지 라이브러리의 특정한 생식선이다. 따라서, DP32는 본 발명의 항체에 적어도 중쇄 및 경쇄 프레임워크 가변 부위, 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 부위, 및/또는 중쇄 CDR1 및 CDR2를 제공한다. DP32는 또한 초가변 부위가 정합되는 3차원 구조를 제공한다. 항체의 특이성은 3차원적 배좌에 의해 결정되는 것으로 널리 공지되어 있다. 따라서, DP32에 의해 부여되는 제약은 본 발명의 항체의 특이성을 결정하는 데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 게다가 DP32는 다양한 하전된 아미노산을 갖는데, 이는 항체의 항원 인식에 있어서 구조적 역할을 할 수 있다.
본 발명에 따르면, CDR은 항체를 생산하기 위한 카세트에 삽입될 수 있다. 폴리펩티드에 대해 적용되고 본 발명에서 정의되는 바와 같은 카세트는 프레임워크로서 작용하는 소정의 연속 아미노산 서열을 의미하며, 단일 단위로서 간주되고 단 일 단위로서 조작된다. 아미노산은 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다. 마찬가지로, 아미노산의 스트레치는 한 쪽 말단 또는 양 말단에서 치환되거나, 삽입되거나, 제거되거나 또는 부착될 수 있다.
카세트의 아미노산 서열은 표면상으로는 고정될 수 있지만, 치환, 삽입 또는 부착된 서열은 가변성이 클 수 있다. 카세트는 몇 개의 도메인으로 이루어질 수 있으며, 각각의 도메인은 최종 구조물에 있어서 중요한 기능을 포함한다.
본 발명의 특정 구체예의 카세트는 N-말단에서부터 프레임워크 영역 1(FR1), CDR1, 프레임워크 영역 2(FR2), CDR2, 프레임워크 영역 3(FR3), 및 프레임워크 영역 4(FR4)를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 카세트 내의 상이한 영역들을 치환하는 것이 가능하다. 예를 들어, 카세트의 CDR2 및 CDR1 초가변 부위는 비보존적, 또는 바람직하게는 보존적 아미노산 치환으로 치환되거나 변형될 수 있다.
본 발명에서, 컨센서스 항체 및 A3R 및 S15 와 실질적으로 동일한 결합력으로 결합하는 항체는 중쇄 및 경쇄를 보유하며, 각 사슬은 제1, 제2 및 제3의 초가변 부위를 가지는데, 이는 각각 CDR3, CDR2, 및 CDR1 부위이다. 결합 선택성 및 특이성은 특히, 한 사슬의 CDR3 부위, 가능하게는 경쇄의 CDR3 부위 또는, 바람직하게는 중쇄의 CDR3 부위, 이차적으로는 경쇄 및 바람직하게는 경쇄 CDR3 부위 둘 다 에 의해 결정한다. 제1, 제2 및/또는 제3의 초가변 부위에 측접한 상류 또는 하류 영역 역시 부차적으로 결합 선택성 및 특이성에 영향을 줄 수 있다.
바람직하게는, 공통 항체의 공통 서열은 공통 항체의 초가변부 내에 존재한다. 특히, 공통 서열은 공통 항체의 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역에 존재할 수 있다. 공통 서열의 전부 또는 일부만이 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 공통 서열은 2개의 초가변부와 중복되거나, 또는 하나 이상의 초가변부 내에서 부분적으로 그리고 공통 항체의 가변부의 또 다른 부분에서 부분적으로 중복될 수 있다. 바람직하게는, 공통 서열은 CDR3 영역 내에 있다. 또한 바람직하게는, 공통 서열에는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 배제한다.
특히, 일 구체예에서, 공통 항체는 서열 번호 9, 서열 번호 17, 및 서열 번호 18 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 대안적인 구체예에서, 공통 서열은 서열 번호 10, 서열 번호 17, 및 서열 번호 18 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 아미노산 서열은 공통 항체의 초가변부 내에 있는 것이 바람직하다. 특히, 아미노산 서열은 공통 항체의 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역 내에 있을 수 있다. 아미노산 서열의 전부 또는 일부만이 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역에 있을 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열은 공통 항체의 CDR3 영역에, 서열 번호 17의 아미노산 서열은 CDR2 영역에, 서열 번호 18의 아미노산 서열은 CDR1 영역에 존재한다.
본 발명은 S15, A3R, S1, S11, D1 및/또는 D3와 실질적으로 동일한 친화도로 황산화된 PSGL-1 및/또는 황산화된 GPIb에 결합한 항체를 제공한다. 일 구체예에 서, 항체는 S15와 실질적으로 동일한 친화도로 황산화된 PSGL-1 및/또는 황산화된 GPIb에 결합하며, 이 구체예에서, 항체는 서열 번호 9, 서열 번호 17, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열 중 하나 이상의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이들 아미노산 서열은 항체의 초가변부에 존재하는 것이 좋다. 특히, 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역에 존재할 수 있다. 아미노산 서열의 전부 또는 일부만이 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호 9의 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역에, 서열 번호 17의 아미노산 서열은 CDR2 영역에, 서열 번호 18의 아미노산 서열은 CDR1 영역에 존재한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 A3R과 실질적으로 동일한 친화도로 황산화된 PSGL-1 및/또는 황산화된 GPIb에 결합하며, 이 구체예에서, 항체는 서열 번호 10, 서열 번호 17, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열 중 하나 이상의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이들 아미노산 서열은 항체의 초가변부에 존재하는 것이 좋다. 특히, 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역에 존재할 수 있다. 아미노산 서열의 전부 또는 일부만이 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호 10의 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역에, 서열 번호 17의 아미노산 서열은 CDR2 영역에, 서열 번호 18의 아미노산 서열은 CDR1 영역에 존재한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 S1과 실질적으로 동일한 친화도로 황산화된 PSGL-1 및/또는 황산화된 GPIb에 결합하며, 이 구체예에서, 항체는 서열 번 호 28, 서열 번호 17, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열 중 하나 이상의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이들 아미노산 서열은 항체의 초가변부에 존재하는 것이 좋다. 특히, 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역에 존재할 수 있다. 아미노산 서열의 전부 또는 일부만이 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호 28의 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역에, 서열 번호 17의 아미노산 서열은 CDR2 영역에, 서열 번호 18의 아미노산 서열은 CDR1 영역에 존재한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 S11과 실질적으로 동일한 친화도로 황산화된 PSGL-1 및/또는 황산화된 GPIb에 결합하며, 이 구체예에서, 항체는 서열 번호 31, 서열 번호 17, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열 중 하나 이상의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이들 아미노산 서열은 항체의 초가변부에 존재하는 것이 좋다. 특히, 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역에 존재할 수 있다. 아미노산 서열의 전부 또는 일부만이 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호 31의 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역에, 서열 번호 17의 아미노산 서열은 CDR2 영역에, 서열 번호 18의 아미노산 서열은 CDR1 영역에 존재한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 D1과 실질적으로 동일한 친화도로 황산화된 PSGL-1 및/또는 황산화된 GPIb에 결합하며, 이 구체예에서, 항체는 서열 번호 14, 서열 번호 17, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열 중 하나 이상의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이들 아미노산 서열은 항체의 초가변부에 존재하는 것이 좋다. 특히, 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역에 존재할 수 있다. 아미노산 서열의 전부 또는 일부만이 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호 14의 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역에, 서열 번호 17의 아미노산 서열은 CDR2 영역에, 서열 번호 18의 아미노산 서열은 CDR1 영역에 존재한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 D3과 실질적으로 동일한 친화도로 황산화된 PSGL-1 및/또는 황산화된 GPIb에 결합하며, 이 구체예에서, 항체는 서열 번호 13, 서열 번호 17, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열 중 하나 이상의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이들 아미노산 서열은 항체의 초가변부에 존재하는 것이 좋다. 특히, 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역에 존재할 수 있다. 아미노산 서열의 전부 또는 일부만이 CDR3 영역, CDR2 영역, 또는 CDR1 영역 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호 13의 아미노산 서열은 항체의 CDR3 영역에, 서열 번호 17의 아미노산 서열은 CDR2 영역에, 서열 번호 18의 아미노산 서열은 CDR1 영역에 존재한다.
본원에 기재되고 상세히 설명된, 아미노산 잔기가 25개 이하인 모든 아미노산 서열(예, CDR, CDR 측접 영역)의 경우, 본 발명의 추가 구체예로서 이들 아미노산 서열은 그 범위 내에 1 또는 2의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 바람직하게는 그 치환은 보존적 아미노산 치환인 것으로 이해되고 간주되어야 한다. 본원에 기재되고 상세히 설명된, 아미노산 잔기가 25개를 초과하는 모든 아미노산 서열의 경우, 본 발명의 한 구체예로서 이들 아미노산 서열은 그 범위 내에 원래의 서열과 90% 이상의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 이해되고 간주되어야 한다(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)). 유사한 또는 상동성의 아미노산은 유사한 특성, 예를 들어 산성, 염기성, 방향성, 크기, 양전하 또는 음전하, 극성, 비극성을 나타내는 동일하지 않은 아미노산으로 정의된다.
퍼센트 아미노산 유사성 또는 상동성 또는 서열 유사성은 두 개의 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드로 이루어진 아미노산 서열을 비교함으로써 결정한다. 항체 서열은 DNA 서열 분석에 의해 결정하였다. 두 개의 서열은 일반적으로 해당 목적을 위해 디자인된 다양한 컴퓨터 프로그램 중 하나에 의해 정렬되며, 각 위치에서의 아미노산을 비교한다. 그 후 아미노산 동일성 또는 상동성을 결정한다. 그 후 알고리즘을 적용하여 퍼센트 아미노산 유사성을 결정한다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 분자 간의 미묘한 관계를 검출하는 데 있어 민감성이 매우 크다는 점에서 일반적으로 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다. 단백질 비교는 보존적 아미노산 치환의 존재를 설명할 수 있으므로, 이에 의하여, 부정합은 동일하지 않은 아미노산이 유사한 물리적 및/또는 화학적 특성을 보유한다면 양의 점수를 나타낼 수 있다(Altschul et al. (1997), supra).
본 발명의 한 구체예에서, 경쇄 및 중쇄 각각의 3개의 초가변부는 두 사슬 간에, 사슬 내 및/또는 사이에 있는 3개의 초가변부 간에 상호교환될 수 있다.
본 발명에 따르면, S15, A3R 및/또는 D1/D3과 실질적으로 동일한 친화도로 결합하는 공통 항체 및 항체는 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 항체를 포함한다. IgG 부류는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 비롯하여 몇 가지 하위 부류를 포함한다.
항체는 단편, 복합체 및 다량체와 같은 여러 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 따르면, 항체 단편은 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab2, 및 Fd 분자를 포함한다. 유사한 항체 단편, 예컨대 Fvs의 단편 및 Fab의 단편 역시 이들이 원래의 항체 또는 더 큰 단편의 결합 특성을 보유하고 있는 한, "단편"이라는 용어에 포함된다. 그러한 단편의 예는 (1) Fv의 중쇄의 단편만을 포함하는 미니바디, (2) 항체 중쇄 가변부의 작은 부분 단위를 포함하는 마이크로바디(국제 출원 PCT/IL99/00581), (3) 경쇄의 단편을 갖는 더 작은 바디, 및 (4) 경쇄 가변부의 기능성 단위를 갖는 유사한 바디이다. 구성체은, 예를 들어 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디와 같은 다량체를 포함한다. "항체"란, 달리 명시되거나 또는 내용 및/또는 당분야의 지식에 기초하여 다른 의미로 나타낸 것이 아니라면, 상기와 같은 분자 모두는 물론, 그 유도체, 조합체, 변형체, 동족체, 모의체 및 변이체를 포함하는 의미이다.
scFv는 그 크기가 완전한 크기의 항체보다 작기 때문에 조직을 침투하여, 완전한 크기의 항체보다 더욱 빨리 혈액으로부터 제거되는 것으로 알려져 있다(Adams et al., Br. J Cancer 77: 1405-12 (1988); Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11(5): 548-557 (1999); Wu et al., Tumor Targeting 4: 47 (1999)). 따라서, scFv는 종종 종양 영상화와 같은 방사능 표지를 포함하는 진단, 예후 또는 병기 결정(staging) 분석에서 사용되어 신체로부터 방사능 표지가 보다 신속하게 제거될 수 있도록 한다. 최근에, 다수의 암 표적화 scFv 다량체가 생체내 안정성 및 효능에 대하여 예 비 임상 평가 중에 있다(Adams et al. (1988), supra, Wu (1999), supra).
전형적으로, scFv 단량체는 VL의 N-말단 잔기에 대한 폴리펩티드 링커에 의해 고정된 VH 도메인의 C-말단부를 갖도록 디자인된다. 경우에 따라, 역 배향이 이용된다: VL 도메인의 C-말단부가 폴리펩티드 링커를 통해 VH의 N-말단부에 고정된다(Power et al., J. Immun. Meth. 242: 193-204 (2000)). 폴리펩티드 링커는 일반적으로 그 길이가 약 15개 아미노산이다. 링커가 약 3∼7개 아미노산으로 축소될 경우, scFv는 기능성 Fv 도메인으로 폴딩될 수 없고, 대신에 제2 scFv와 결합하여 디아바디를 형성한다. 링커의 길이를 3개 아미노산보다 더 작게 축소시키면, 링커 길이, 조성 및 Fv 도메인 배향에 따라, 삼량체 또는 사량체로의 scFv의 회합이 촉진된다(Powers (2000), supra).
최근, scFv 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 다가 항체 단편이 종종 표적에 대한 모 항체의 결합에 비해 더 큰 친화력을 제공한다는 것이 발견되었다. 이러한 더 높은 친화력은 종양 표적화 적용을 위한 개선된 약물 역학을 비롯하여 잠재적인 이점을 제공한다. 추가적으로, 백혈구의 고정 및 회전에 관여하는 P-셀렉틴 및 이의 리간드 PSGL-1을 연구함에 있어서, 과학자들은 PSGL-1의 이량체 형태를 발현하는 세포는 이러한 더 높은 결합 친화력으로 인하여 더욱 안정한 회전 부착을 확립한다는 결론을 내렸다. 이러한 부착은 만곡 진행에 더 저항성이 크고 회전 속도의 변동이 더 적었다(Ramachandran et al., PNAS, 98 (18): 10166-71 (2001)).
이러한 다가 형태의 더 큰 결합 친화력은 진단 및 치료 계획에 있어서 유익 할 수 있다. 예를 들어, scFv는 표적 수용체에 결합하는 차단제로서 사용될 수 있으며, 따라서 "천연" 리간드의 결합을 차단할 수 있다. 이러한 경우에는, 표적에 대한 천연 리간드의 바람직하지 않은 결합을 허용할 수 있는 해리의 기회를 감소시키기 위하여 scFv와 수용체 간에 더 큰 친화성 회합을 갖게 하는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 더 큰 친화력은 표적 수용체가 부착 및 회전에 관여하거나, 표적 수용체가 높은 만곡 진행 흐름 영역에 존재하는 세포(예, 혈소판) 상에 존재할 경우 유용할 수 있다.
일단 소정의 결합 능력을 보유하는 항체가 선별되고/되거나 개발되면, 당업자라면 본원에 제공된 안내에 따라 원형의 항체의 특성을 유지하는 구성체 및 단편을 생성할 수 있다. 예를 들어, 완전 항체 분자, Fv 단편, Fab 단편, Fab2 단편, 이량체, 삼량체, 및 기타 구성체은 최초로 선택되거나 개발된 항체의 원하는 특성을 보유하도록 제조될 수 있다.
아미노산을 치환시기되, 여전히 항체의 특성을 보유하도록 하고자 한다면, 보존적 아미노산 치환을 이용할 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있다. 다양한 제제에 대한 접합과 같은 변형 역시 그 결합 특성을 변화시키지 않고 항체에 이루어질 수 있다. 다른 변형, 예를 들어 보다 안정한 항체를 생성하기 위해 이루어지는 변형 역시 그 특이성을 변화시키지 않고 항체 또는 단편에 가해질 수 있다. 예를 들어, 펩토이드 변형, 세미펩토이드 변형, 시클릭 펩티드 변형, N 말단 변형, C 말단 변형, 펩티드 결합 변형, 골격 변형 및 잔기 변형이 수행될 수 있다. 당업자라면, 본 명세서의 안내에 따라, 변형된 항체 또는 단편에 대해 그 결합 특성이 변화되었 지를 평가하기 위한 테스트를 수행할 수 있다.
마찬가지로, 당업자라면 본원에 제공된 안내에 따라, 더욱 바람직한 특성을 갖는 분자를 얻기 위하여 항체의 결합 특성을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 일단 바람직한 특성을 갖는 항체가 동정되면, 무작위 또는 유도된 돌연변이 유발법을 이용하여 항체의 변형체를 생성할 수 있으며, 그러한 변형체가 바람직한 특성을 갖는지를 스크리닝할 수 있다.
당분야에 공지된 통상적인 방법을 이용하여, 당업자라면 공통 항체의 결합능을 가지고, 및/또는 황산화 PSGL-1 또는 황산화 GPIb에 특이적으로 결합하고 S15 및 AR3과 실질적으로 유사한 친화도로 결합하는 추가의 항체를 결정할 수도 있다. 예를 들어, D1 및 D3와 같은 추가 항체를, 본원에 기재된 바이오패닝(biopanning) 방법을 이용하여 분리할 수 있는데, 이때 공통 항체가 결합하는 분자 또는 세포는 특정 파지 디스플레이 라이브러리, 특히 백혈병, 림프종 및 골수종 환자로부터 준비된 라이브러리를 스크리닝하는 데 이용된다.
본 발명에 따른 항체에는 그 제조 및 동정과, 진단 판정에 도움이 되는 태그를 삽입하거나 부착시킬 수 있다. 태그는 후에 분자로부터 제거될 수 있다. 유용한 태그의 예로는 AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, 단백질 C, S-TAG(등록상표), T7, V5, 및 VSV-G(Jarvik and Telmer, Ann. Rev. Gen., 32, 601-18 (1998))가 있다. 태그는 c-myc 또는 KAK인 것이 바람직하다.
본 발명은 scFv 항체를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 scFv는, 동일하거나 상이할 수 있는 인간 항체의 중쇄 가변부와 인간 항체의 경쇄 가변부로 구성된 분자로서 정의되는데, 이 때 중쇄의 가변부는 경쇄의 가변부와 연결, 결합, 융합, 또는 공유 결합, 또는 회합되어 있다.
scFv 구성체은 항체의 초가변 도메인 중 하나 이상을 도입한 scFv 분자의 다량체(예, 이량체, 삼량체, 사량체 등)일 수 있다. 모든 scFv 유도 구성체 및 단편은 강화된 결합 특성을 보유하여 다른 세포에 비하여 표적 세포에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합한다. 결합 선택성 및/또는 특이성은 초가변부에 의해 주로 결정된다. 본 발명의 항체는 다가 Fv 형태로 폴딩되도록 구성되어, 결합 친화도 및 특이성을 향상시키고 혈액에서의 반감기를 증가시킬 수 있다.
scFv의 다가 형태는 다른 연구자들에 의해 디자인되고 생성된 바 있다. 한 가지 방법은 두 개의 scFv를 링커를 사용하여 연결하는 것이었다. 또 다른 방법은 두 개의 scFv를 연결시키기 위해 그 사이에 이황화 결합을 이용하는 것이었다. 이량체 또는 삼량체의 Fv의 생산을 위한 가장 간단한 방법은 Holliger 등[PNAS 90: 6444-48 (1993)] 및 Kortt 등[Protein Eng. 10: 423-33 (1997)]에 의해 보고되었다. 그와 같은 방법 중 하나는 FOS 및 JUN 단백질 영역의 서열을 추가하여 scFv의 c-말단에서 그 사이에 루신 지퍼를 형성함으로써 scFv의 이량체를 제조하도록 디자인되었다(Kostelny et al., Immunol. 148(5): 1547-53 (1992); De Kruif et al., J. Biol. Chem. 271(13): 7630-34 (1996)). 또 다른 방법은 scFv의 c-말단에 스트렙타빈 코딩 서열을 첨가함으로써 사량체를 제조하도록 디자인되었다. 스트렙타비딘은 4개의 서브유닛으로 이루어지며, 따라서 scFv-스트렙타비딘이 폴딩될 경우 4 개의 서브유닛은 사량체를 형성하도록 스스로 조정한다(Kipriyanov et al., Hum Antibodies Hybridomas 6(3): 93-101 (1995)). 또 다른 방법에서는, 이량체, 삼량체 및 사량체를 제조하기 위하여 유리 시스테인을 소정의 단백질에 도입한다. 다양한 수(2∼4)의 말레이미드기를 갖는 펩티드계 가교제를 사용하여 유리 시스테인에 소정의 단백질을 교차 결합시켰다(Cochran et al., Immunity 12(3): 241-50 (2000)).
이 시스템에서, 파지 라이브러리(전술한 바와 같음)는 항체의 Fv 영역의 1가 형태로 폴딩될 수 있는 scFv를 디스플레이하도록 디자인할 수 있다. 또한, 역시 전술한 바와 같이, 이 구성체는 박테리아에서의 발현에 적합하다. 유전적으로 조작된 scFv는 연속 코딩되는 15개 아미노산의 가요성 펩티드 스페이서에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직한 스페이서는 (Gly4Ser)3(서열 번호 8)이다. 그 아미노산과 함께 이 스페이서 구성체의 길이는 부피가 크지 않은 스페이서를 제공하며, 이것은 VH 및 VL 영역이 그 표적에 효과적으로 결합할 수 있는 기능적인 Fv 도메인으로 폴딩될 수 있게 한다.
스페이서의 길이를 변화시키는 것은 이량체, 삼량체 및 사량체(당분야에서는 흔히 각각 다이아바디, 트리아바디 및 테트라바디로 칭함)를 형성하는 또 다른 바람직한 방법이다. 이량체는 scFv의 두 개의 가변쇄를 연결하는 스페이서가 일반적으로 5∼12개의 아미노산 잔기로 단축되는 조건 하에 형성된다. 이러한 단축된 스페이서는 동일 분자로부터의 두 가변쇄가 기능적 Fv 도메인으로 폴딩되는 것을 방 지한다. 대신, 도메인들은 또 다른 분자의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 두 개의 결합 도메인을 형성하게 된다. 바람직한 방법에서는, 단지 5개 아미노산 (Gly4Ser)(서열 번호 19)이 다이아바디 구성에 사용되었다. 이 이량체는 두 개의 동일한 scFv로부터 형성될 수 있거나 또는 두 개의 상이한 scFv 집단으로부터 형성될 수 있으며, 모(parent) scFv(들)의 선택적 및/또는 특이적인 강화된 결합 활성을 보유하고/하거나 증가된 결합 강도 또는 친화력을 나타낸다.
유사한 방식으로, 트리아바디는, scFv의 두 개의 가변쇄를 연결하는 스페이서가 일반적으로 5개 미만의 아미노산 잔기로 단축되어, 동일 분자로부터의 두 개의 가변쇄가 기능적 Fv 도메인으로 폴딩되는 것을 방지하는 조건 하에 형성된다. 그 대신, 3개의 독립적인 scFv 분자가 회합하여 삼량체를 형성한다. 바람직한 방법에서, 트리아바디는 이러한 가요성 스페이서를 완전히 제거하여 얻었다. 트리아바디는 3개의 동일한 scFv로부터 형성되거나 또는 2개 또는 3개의 상이한 scFv집단으로부터 형성될 수 있으며, 모 scFv(들)의 선택적 및/또는 특이적인 강화된 결합 활성을 보유하고/하거나 증가된 결합 강도 또는 친화력을 나타낸다.
마찬가지로 테트라바디는 scFv의 두 개의 가변쇄를 연결하는 스페이서가 일반적으로 5개 미만의 아미노산 잔기로 단축되어, 동일 분자로부터의 두 개의 가변쇄가 기능적 Fv 도메인으로 폴딩되는 것을 방지하는 조건 하에 형성된다. 그 대신, 4개의 독립적인 scFv 분자가 회합하여 사량체를 형성한다. 테트라바디는 4개의 동일한 scFv로부터 형성되거나 또는 상이한 scFv 집단들로부터의 1∼4개의 개별 단위로부터 형성될 수 있으며, 모 scFv(들)의 선택적 및/또는 특이적인 강화된 결합 활 성을 보유하고/하거나 증가된 결합 강도 또는 친화력을 나타낸다. 스페이서 길이가 일반적으로 5개 미만의 아미노산 잔기인 조건 하에 트리아바디가 형성되는지 또는 테트라바디가 형성되는지는 혼합물 중의 특정 scFv(들)의 아미노산 서열 및 반응 조건에 따라 달라진다.
본 발명은 또한 공통 서열: X1-X2-X3-Pro-X5-X6(서열 번호 3)(여기서, X1및 X6은 소수성 아미노산이고 X2, X3, 및 X5는 임의의 아미노산이다)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 한 구체예에서, 폴리펩티드 중 X2는 아르기닌, 리신으로 구성된 군에서 선택되고, X1 및 X6은 루신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌 및 이소루신으로 구성된 군에서 선택된다. 폴리펩티드는 바람직하게는 서열 번호 5를 포함할 수 있다. 대안으로, 이 폴리펩티드는 서열 번호 6을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 또 다른 구체예에서, X2 및 X3은 아르기닌이고, 소수성 아미노산 X6은 바람직하게는 이소루신이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 또 다른 구체예에서, X1은 루신 및 메티오닌으로 구성된 군에서 선택되고, X2 및 X3은 아르기닌이고, X5는 세린 및 발린으로 구성된 군에서 선택되고, X6은 이소루신이다. 본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 원형이거나 루프형이다.
본 발명은 또한 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서 폴리펩티드는 S15와 실질적으로 유사한 친화력으로 결합한다. 대안으로 또는 이에 더하여, 폴리펩티드는 A3R과 실질적으로 유사한 친화력으로 GPIb에 특이적으 로 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및 항체를 코딩하는 재조합 핵산과 같은 분리된 또는 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 분리된 또는 정제된 폴리펩티드는 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 제조할 수 있다. 그러한 발현 시스템은 발현 벡터 및 그러한 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 포함한다. 그러한 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 재조합 숙주 세포를 배양하고 재조합 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 그러한 항체를 정제하는 것을 포함하여 원핵 및 진핵 시스템에서 항체 및 폴리펩티드를 생성하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 정의되어 있고 본원에서 기술하는 바와 같은 진핵 세포 시스템은 숙주 세포가 원핵 세포인, 유전 공학 방법에 의해 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 발현 시스템을 의미한다. 진핵 발현 시스템은 포유동물 시스템일 수 있으며, 포유동물 발현 시스템에서 생성된 펩티드 또는 폴리펩티드는 정제 후에 바람직하게는 실질적으로 포유동물 오염원이 없다. 유용한 진핵 발현 시스템의 다른 예로는 효모 발현 시스템을 포함한다.
본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 바람직한 원핵 시스템은 발현 벡터에 대한 숙주로서 이. 콜라이(E. coli)를 사용한다. 이. 콜라이 시스템에서 생성된 펩티드 또는 폴리펩티드는 정제 후에 실질적으로 이. 콜라이 오염 단백질이 없다. 원핵 발현 시스템을 사용하면 본 발명에서 제공되는 서열 중 일부 또는 전부의 N-말단에 메티오닌 잔기가 추가될 수 있다. N-말단 메티오닌 잔기를 제거하면, 펩티드 또는 폴리펩티드가 완전히 발현되도록 하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 제조는 당분야에 공지된 바와 같이 수행할 수 있으며, 그 한 예는 적절한 조건 하에 에어로모나스(Aeromonas) 아미노펩티다제를 사용하는 것이다(미국 특허 제5,763,215호).
본 발명은 또한 황산화된 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 단편 또는 대안적으로 작은 무기 화학 소재(entity)와 같은 소재를 선별하는 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 황산화된 에피토프를 가지는 펩티드에 대하여 라이브러리(예, 항체 또는 이의 단편을 동정하기 위한 파지 디스플레이 라이브러리 및 작은 유기 화학 소재를 동정하기 위한 조합 라이브러리)를 패닝(panning)하는 것을 포함한다. 패닝을 위한 적절한 황산화 에피토프는, 예를 들어 PSGL-1, GPIb, α-2-안티플라스민; 아미노펩티다제 B; CC 케모카인 수용체, 예컨대 CCR2, CCR5, CCR3, CXCR3, CXCR4, CCR8, 및 CCR2b; 7-막관통-분절(7TMS) 수용체; 응고 인자, 예컨대 인자 V, VIII, IX; 피브리노겐 감마쇄; 헤파린 보인자 II; 세크레토그레닌, 예컨대 세크레토그레닌 I 및 II; 비트로넥틴, 아밀로이드 전구체, α-2-안티플라스민; 콜레시스토키닌; α-코리오고나도트로핀; 보체 C4; 더마탄 설페이트프로테오글리칸; 피브로넥틴; 또는 카스트린을 기본으로 하거나 이들로부터 유도될 수 있다. 이러한 펩티드는 임의의 위치에서 황산화될 수 있다. 바람직하게는, 이 펩티드는 PSGL-1(특히 N-말단으로부터 51번 위치의 티로신 잔기에서 황산화될 때), GPIb(특히 276번 위치의 티로신 잔기 및 약간은 279번 위치의 티로신 잔기에서 황산화될 때) 또는 CCR5(특히 10번 위치의 티로신 잔기에서 황산화될 때)의 영역으로부터 유래되거나 또는 이에 기초한 황산화 에피토프를 포함한다. 한 구체예에서, 이 방법은 고체 지지체 상에 펩티드를 고정화하는 것을 포함한다. 경우에 따라, 이 방법은 비황산화, 가용성 펩티드 또는 다른 티로신 위치에서 황산화된 가용성 펩티드를 사용하는 경쟁적 패닝을 포함한다. 작은 무기 화학 소재를 동정하기 위해 적절한 조합 라이브러리를 패닝하는 것은, 물론, 상기 방법을 수행하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 황산화 에피토프에 결합하는 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) 서열 번호 7의 PSGL-1의 펩티드를 제공하는 단계; (c) 서열 번호 7의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)를 선별하기 위해 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 7의 펩티드에 결합하는 선별된 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)을 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) PSGL-1의 고정화된 펩티드(서열 번호 7)를 제공하는 단계; (c) 가용성 비황산화 PSGL-1 펩티드(서열 번호 26) 존재 하에 서열 번호 7의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)를 선별하기 위해 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 7의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) PSGL-1의 고정화된 펩티드(서열 번호 7)를 제공하는 단계; (c) 가용성 황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 44 및/또는 50) 존재 하에 서열 번호 7의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 7의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) PSGL-1의 고정화된 펩티드(서열 번호 7)를 제공하는 단계; (c) 가용성 황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 44 및/또는 50) 또는 비황산화 PSGL-1 펩티드(서열 번호 26) 존재 하에 서열 번호 7의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 7의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) PSGL-1의 고정화된 펩티드(서열 번호 7)를 제공하는 단계; (c) 가용성 황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 44 및/또는 50) 및 가용성 비황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 43) 존재 하에 서열 번호 7의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 7의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포 함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) PSGL-1의 고정화된 펩티드(서열 번호 7)를 제공하는 단계; (c) 가용성 황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 44, 50, 57 및 58 또는 이의 조합) 및/또는 비황산화 PSGL-1 펩티드(서열 번호 43) 존재 하에 서열 번호 7의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 7의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) GPIb 펩티드의 고정화된 펩티드(서열 번호 44)를 제공하는 단계; (c) 서열 번호 44의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 44의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) GPIb 펩티드의 고정화된 펩티드(서열 번호 44)를 제공하는 단계; (c) 가용성 비황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 43) 존재 하에 서열 번호 44의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 44의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) GPIb 펩티드의 고정화된 펩티드(서열 번호 44)를 제공하는 단계; (c) 서열 번호 7, 48, 49 또는 59의 가용성 황산화 PSGL-1 펩티드 중 하나 이상의 존재 하에 서열 번호 44의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 44의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) GPIb 펩티드의 고정화된 펩티드(서열 번호 44)를 제공하는 단계; (c) 서열 번호 7, 48, 49 또는 59의 가용성 황산화 PSGL-1 펩티드 및 가용성 비황산화 PSGL-1 펩티드(서열 번호 26) 중 하나 이상의 존재 하에 서열 번호 44의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 44의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) GPIb 펩티드의 고정화된 펩티드(서열 번호 44)를 제공하는 단계; (c) 서 열 번호 7, 48, 49 또는 59의 가용성 황산화 PSGL-1 펩티드 중 하나 이상 및 가용성 비황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 43) 중 하나 이상의 존재 하에 서열 번호 44의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 44의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) GPIb 펩티드의 고정화된 펩티드(서열 번호 44)를 제공하는 단계; (c) 서열 번호 7, 48, 49 또는 59의 가용성 황산화 PSGL-1 펩티드 중 하나 이상 및 가용성 황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 44 및/또는 50) 중 하나 이상의 존재 하에 서열 번호 44의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 44의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) CCR5의 고정화된 펩티드(서열 번호 53)를 제공하는 단계; (c) 서열 번호 53의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 53의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드) 를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) CCR5의 고정화된 펩티드(서열 번호 53)를 제공하는 단계; (c) 가용성 황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 43) 및/또는 황산화 가용성 PSGL-1 펩티드(서열 번호 26) 존재 하에 서열 번호 53의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 53의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) CCR5의 고정화된 펩티드(서열 번호 53)를 제공하는 단계; (c) 가용성 황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 44 및/또는 50) 및/또는 가용성 황산화 PSGL-1 펩티드(서열 번호 7, 48, 49 및/또는 59) 존재 하에 서열 번호 53의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 53의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) CCR5의 고정화된 펩티드(서열 번호 53)를 제공하는 단계; (c) 가용성 황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 44 및/또는 50) 및/또는 비황산화 가용성 PSGL-1 펩티드(서열 번호 26) 존재 하에 서열 번호 53의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 53의 펩티드 에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 소재(예, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드)를 제조하는 방법은 (a) 라이브러리(예, 파지 디스플레이 라이브러리)를 제공하는 단계; (b) CCR5의 고정화된 펩티드(서열 번호 53)를 제공하는 단계; (c) 가용성 황산화 GPIb 펩티드(서열 번호 44 및/또는 50) 및/또는 비황산화 가용성 GPIb 펩티드(서열 번호 43) 존재 하에 서열 번호 53의 고정화된 펩티드에 결합하는 소재(예, 파지 입자)에 대하여 라이브러리를 패닝하는 단계; 및 (d) 서열 번호 53의 펩티드에 결합하는 소재(예, scFv 항체를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체)를 생성하는 단계를 포함한다.
GPIb 및 PSGL-1과 같은 단백질 상에 존재하는 황산화 티로신 에피토프를 치료적 타겟으로 하기 위한 대안의 방법에서는, 적절한 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 작은 무기 화학 소재를 동정할 수 있다. 그러한 화학적 소재는 scFv 또는 IgG를 기초로 하는 치료제보다 수많은 장점을 가질 수 있다. 예를 들어, 무기 화학 소재는 경구 투여될 수 있거나 감소된 면역 교차 반응성을 포함하여 강화된 생체안전성 프로필을 가질 수 있다. 이것은, 특히 초기에 선별된 선도 화합물을 최적화하기 위한 합리적인 약물 디자인에 따라, 표적에 대하여 강화된 선택성을 제공할 수 있다. 다른 장점들로는 낮은 제조 비용, 보다 긴 저장 수명 및 덜 복잡한 규제 승인 절차를 들 수 있다.
본 발명의 에피토프의 다수의 구체예는 예컨대 GPIb 및 PSGL-1 상에서 동정 되어 있기 때문에, 리간드-유도 접근법(ligand-driven approach)을 취하여 매우 한정된 특이성을 가지는 무기 화학 부분을 동정하거나, 대안으로 상기 에피토프를 각각 보유하는 하나 이상의 현저한 표적을 포함하는 질병 상태(예, 재관류 손상)에 대한 하나 이상의 황산화된 티로신 에피토프를 표적으로 할 수 있다. 리간드-유도 접근법은 치료적 중재에 대한 표적을 동정하기 위해 스크리닝 과정을 유의적으로 단축시키고, 최적화와 함께 동시 표적 확인을 가능하게 하는데, 이는 일련의 집중형 라이브러리를 이용하여 수행할 수 있다.
황산화된 티로신 에피토프를 표적으로 하기 위해 전문화된 무기 화학 부분의 라이브러리를 디자인하고, Y1과 같은 항원과 이의 공지된 표적(예, GPIb의 황산화된 Tyr-276 및 Asp-277 잔기) 간의 3차원 상호작용을 분석하여 이를 처음으로 개발할 수 있다. Y1 결합 부위를 모사하고, 표적에 대한 친화도가 증가된 부분으로 구성된 화학 라이브러리는 컴퓨터를 활용한 조합 라이브러리 디자인에 의해 개발할 수 있다.
본 발명은 또한 황산화 에피토프에 결합하는 인간 항체를 동정하기 위한 라이브러리를 제공한다. 이 라이브러리는 면역글로불린 결합 도메인 중 상보적 결합을 위한 다양한 항원-결합 도메인을 포함하는 것으로, 이 라이브러리는 중쇄 CDR3에서만 다양성을 갖는다. 면역글로불린 결합 도메인은 scFv 분자가 바람직하다. 또한 면역글로불린 결합 도메인은 DP32에서 유래된 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1 및 2를 가지는 것이 바람직하며, 또한 DP32에서 유래된 경쇄 가변 영역을 가지는 것이 더 바람직하다. 본 발명의 라이브러리의 면역글로불린 결합 도메인은, 예를 들어 사상 박테리오파지 입자와 같은 임의의 적절한 벡터의 표면 상에서 발현될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 라이브러리는 황산화된 부분 또는 에피토프를 선별하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 결합 단편은 경우에 따라 약학적으로 유효한 담체와 함께 다양한 제제, 예컨대 약물, 독소, 약학 조성물 및 방사능 동위원소와 회합되거나, 결합되거나, 융합되거나, 또는 연결되어, 항질병 및/또는 항암 활성을 갖는 약물-펩티드 조성물, 융합체 또는 접합체를 형성할 수 있다. 그러한 조성물은 진단 목적, 예후 목적 또는 병기 결정 목적을 위해 사용될 수도 있다.
본 발명에 유용한 담체의 예로는 덱스트란, HPMA(친수성 중합체), 또는 임의의 기타 중합체, 예컨대 친수성 중합체 뿐 아니라 이의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. 대안으로, scFv Y1 분자로 장식된 리포좀(예, Doxil, 다량의 독소루비신을 함유하는 시판되는 리포좀)과 같은 장식된 리포좀을 사용할 수 있다. 이러한 리포좀은 하나 이상의 원하는 제제를 포함하도록 제조될 수 있으며, 본 발명의 항체와 혼합하여 높은 약물 대 항체 비를 제공하도록 할 수 있다.
대안으로, 항체 또는 폴리펩티드와 제제 사이의 결합은 직접 결합일 수 있다. 2 이상의 이웃하는 분자 간의 직접 결합은 분자 내의 원소 또는 원소군 간의 화학 결합을 통해 생성될 수 있다. 화학 결합은, 예를 들어 이온 결합, 공유 결합, 소수성 결합, 친수성 결합, 정전기적 결합 또는 수소 결합일 수 있다. 결합은, 예를 들어 아미드, 탄소-설파이드, 펩티드 및/또는 이황화 결합일 수 있다. 항체를 제제 또는 링커에 부착시키기 위해서, 공유 결합을 형성하는 것으로 당분야에 공지 되어 있는 아민, 카르복시, 히드록실, 티올 및 에스테르 작용기를 사용할 수 있다.
펩티드와 제제 또는 펩티드와 담체, 또는 담체와 제제 간의 결합은 링커 화합물에 의한 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 링커 화합물은 2 이상의 부분을 연결시키는 화합물로서 정의된다. 링커는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 분지된 링커 화합물은 이중 분지, 삼중 분지 또는 사중 분지 또는 그 이상으로 분지된 화합물로 이루어질 수 있다. 본 발명에 유용한 링커 화합물은 디카르복실산, 말레미도 하이드라지드, PDPH, 카르복실산 하이드라지드 및 작은 펩티드를 포함한 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.
본 발명에 따르면, 유용한 링커 화합물의 보다 구체적인 예로는 (a) 숙신산, 글루타르산 및 아디프산과 같은 디카르복실산; (b) N-[말레이미도카프론산] 하이드라지드, 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실하이드라지드 및 N-[말레이미도운데칸산] 하이드라지드와 같은 말레이미도 하이드라지드; (c) (3-[2-피리딜디티오]프로피오닐 하이드라지드); 및 (d) 2∼5의 탄소 원자로부터 선택되는 카르복실산 하이드라지드, 및 이의 유도체, 조합체, 변형체 및 유사체를 포함한다.
작은 펩티드 링커를 사용하는 직접 커플링에 의한 결합 역시 유용하다. 예를 들어, 항암 약물 독소루비신의 유리 당과 scFv 사이의 직접 커플링은 작은 펩티드를 사용하여 수행할 수 있다. 작은 펩티드의 예로는 AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, 단백질 C, S-TAG(등록상표), T7, V5, VSV-G 및 KAK를 포함한다.
본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 방사능 동위원소와 같은 영상화제(표식 마 커라고도 함)에 결합되거나, 접합되거나, 이와 복합체를 형성하거나, 또는 다른 방식으로 회합될 수 있으며, 이러한 접합체는 진단, 예후 판정, 또는 병기 결정 및 영상화 목적에 사용될 수 있다. 그러한 방사능 동위원소-항체(또는 단편) 접합체를 포함하는 키트가 제공된다.
진단, 예후 판정, 병기 결정 및 영상화에 유용한 방사능 동위원소의 예로는 111인듐, 113인듐, 99m레늄, 105레늄, 101레늄, 99m테크네튬, 121m텔루륨, 122m텔루륨, 125m텔루륨, 165툴륨, 167툴륨, 168툴륨, 123요오드, 126요오드, 131요오드, 133요오드, 81m크립톤, 33크세논, 90이트륨, 213비스무트, 77브롬, 18플루오르, 95루테늄, 97루테늄, 103루테늄, 105루테늄, 107수은, 203수은, 67갈륨 및 68갈륨을 포함한다. 바람직한 방사능 동위원소는 X-선 또는 임의의 적합한 상자성 이온에 불투명하다.
표식 마커 분자는 형광 마커 분자일 수도 있다. 형광 마커 분자의 예로는 플루오레세인, 피코에리스린, 또는 로다민, 또는 이들의 변형체 또는 접합체를 포함한다.
표식 마커에 접합된 항체 또는 폴리펩티드는 질병 상태를 진단하거나, 예후를 판정하거나 또는 병기를 결정하는 데 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명은 또한 환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계 및 환자 유래의 세포와 본 발명의 항체를 항온처리하는 단계에 의해 환자로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다. 그러한 활성은 생체내, 시험관내 또는 체외에서 수행될 수 있다. 진단, 예후 판정, 또는 병기 결정을 생체내 또는 체외에서 수행하는 경우, 영상화제는 환자에게 허용되지 않는 수준으로 유해하지 않는다는 점에서 생리학적으로 허용될 수 있는 것이 바람직하다. 허용 가능한 유해성 수준은 질환의 심각성 및 다른 선택의 유용성에 따라 의사가 그러한 기준을 이용하여 결정할 수 있다.
본 발명은 표식 마커 분자 또는 영상화제에 결합된 본 발명의 펩티드를 갖는 영상화제를 포함하는, 치료 전, 치료 중 또는 치료 후 치료 효능의 시험관내 분석을 위한 진단 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 세포와 조성물을 접촉시키는 단계; (b) 세포에 결합된 방사능 활성을 측정하는 단계; 및 이로써 (c) 종양을 가시화하는 단계를 포함하는, 암, 보다 구체적으로는 종양의 진단적 병소 위치 확인 및 영상화를 위해 영상화제를 사용하는 방법을 제공한다.
적합한 영상화제의 예로는 형광 염료, 예컨대 FITC, PE 등, 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질을 들 수 있다. 다른 예로는 기질과 반응하여 색 변화와 같은 인식할 수 있는 변화를 생성하는 효소 및 방사능 분자를 포함한다.
한 예로서, 키트의 영상화제는 FITC와 같은 형광 염료이고, 키트는 암, 보다 구체적으로는 혈액 관렴 암, 예를 들어 백혈병, 림프종 및 골수종의 치료 효능을 분석하기 위한 키트를 제공한다. FACS 분석은, 예를 들어 진단시, 치료중, 완화중 및 재발중에 질병의 각 단계에서 영상화제에 의해 염색된 세포의 비율 및 염색 강도를 측정하기 위해 사용된다.
본 발명은 또한 환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계 및 본 발명의 항체가 환자의 세포에 결합하는지를 결정하는 단계에 의해 그 환자가 질병 위험이 있는지 질병을 보유하고 있는지를 결정함으로써 질병 상태를 진단하거나, 예후를 판정하거나 또는 병기를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 활성은 생체내, 시험관내 또는 체외에서 수행될 수 있다. 생체내 또는 체외에서 수행되는 경우, 영상화제는 환자에게 허용되지 않는 수준으로 유해하지 않는다는 점에서 생리학적으로 허용될 수 있는 것이 바람직하다. 허용 가능한 유해성 수준은 질환의 심각성 및 다른 선택의 유용성에 따라 의사가 그러한 기준을 이용하여 결정할 수 있다.
암의 경우, 환자의 병기를 결정하는 것은 일반적으로 종양의 크기, 유형, 위치 및 침입성에 기초하여 질환의 분류를 결정하는 것을 포함한다. 종양 특성에 의해 암을 분류하기 위한 한 가지 분류 시스템은 "TNM Classification of Malignant Tumours" (6판) (L. H. Sobin, Ed.)(본원에서 참고로 인용함)이며, 여기에서는 암의 단계를 T, N, 및 M 카테고리로 분류하는데, 여기서 T는 그 크기 및 위치에 따라 주요 종양을 나타내고, N은 국부 림프절을 나타내고, M은 원격 전이를 나타낸다. 또한, 숫자 I, II, III 및 IV는 단계를 나타내는데 사용되며, 각 수는 TNM 인자의 가능한 조합을 의미한다. 예를 들어, I기 유방암은 TMN 그룹: T1, NO, MO에 의해 정의된다. T1 - 종양의 직경이 2 cm 이하임, NO - 국부 림프절 전이가 없음, MO - 원격 전이가 없음. 또 다른 시스템은 AML의 병기를 결정하는 데 사용되는데, 분류된 아형은 통상적인 처리 및 세포화학적 염색 하에 관찰되는 형태를 이용하는 프렌치-아메리칸-브리티시 시스템에 기초한 것이다.
또한, 최근에 제안된 세계 보건 기구(WHO)의 조혈 및 림프계 조직의 신생물 형성 질환의 병기 결정 및 분류는 (특별히 AML에 대해서), 질병의 전통적인 FAB-형 카테고리 뿐 아니라, 특이적인 세포유전학적 발견 및 골수이형성증과 관련된 AML과 서로 관련이 있는 추가적인 질병 유형을 포함한다. 다른 연구자들 역시 병리학적 분류를 제안하였다. 예를 들어, AML에 특이적인 한 가지 제안은 세포유전학적 전위와 상관성이 있고, 형태학적 평가 및 면역형별에 의해 쉽게 파악될 수 있으며, 관련된 골수이형성적 변화의 중요성을 통합시키는 질병 유형을 포함한다. 이러한 시스템은 세포유전학 또는 분자유전학적 연구에 의해 지지되었으며, 새로운 인식할 수 있는 임상병리학적 실체가 소개됨에 따라 확장될 수 있었다(Arber, Am. J. Clin. Pathol. 115(4): 552-60 (2001)).
본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 항암제, 항신생물제, 항바이러스제, 항전이제, 항염증제, 항혈전제, 항재발협착제, 항응집제, 항자가면역제, 항유착제, 항심혈관질환제, 약제 또는 기타 항질병제에 결합되거나, 접합되거나, 또는 다른 방식으로 회합될 수 있다. 제제란 비제한적으로 인간, 소, 말, 돼지, 쥐, 개, 고양이 또는 기타 다른 온혈동물을 비롯하여 포유동물의 예방적 치료 또는 진단에 유용한 제제를 의미하다.
그러한 제제의 예는 비제한적으로 아시클로비어, 간시클로비어 및 지도부딘을 포함하는 항바이러스제; 실로스타졸, 달테파린 나트륨, 레비파린 나트륨 및 아스피린을 포함하는 항혈전제/항재발협착제; 잘토프로펜, 프라노프로펜, 드록시캄, 아세틸 살리실릭 17, 디클로페낙, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 설린닥, 나프록센, 암톨메틴, 셀레콕시브, 인도메타신, 로페콕시브 및 니메술리드를 포함하는 항염증 제; 레플루노마이드, 데닐루킨 디프티톡스, 수브레움, WinRho SDF, 데피브로타이드 및 시클로포스파마이드를 포함하는 항자가면역제; 및 리마프로스트, 클로크로멘 및 히알루론산을 포함하는 항유착제/항응집제, 및 이의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다.
약제의 예로는 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신, 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 모르폴리노독소루비신, 모르폴리노다우노루비신, 메톡시모르폴리닐독소루비신, 메톡시모르폴리노다우노루비신 및 메톡시모르폴리닐독소루비신 및 이의 치환된 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. 약제의 다른 예로는 시스-백금, 택솔, 칼리체아미신, 빈크리스틴, 시타라빈(Ara-C), 시클로포스파마이드, 프레드니손, 플루다라빈, 이다루비신, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로마이드, 탈리도마이드 및 블레오마이신, 및 이들의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다.
암 세포의 성장 억제는, 예를 들어 (i) 암 또는 전이 성장의 예방, (ii) 암 또는 전이 성장의 속도 저감, (iii) 세포를 무결하게 생존된 상태로 유지하면서 암 세포의 성장 진행 또는 전이 진행을 총체적으로 방지하는 것, (iv) 암 세포와 미소환경의 접촉을 방해하는 것, 또는 (v) 암 세포를 사멸시키는 것을 포함한다.
백혈병 세포의 성장 억제는, 예를 들어 (i) 백혈병 또는 전이 성장의 예방, (ii) 백혈병 또는 전이 성장의 속도 저감, (iii) 세포를 무결하게 생존된 상태로 유지하면서 백혈병 세포의 성장 진행 또는 전이 진행을 총체적으로 방지하는 것, (iv) 백혈병 세포와 미소환경의 접촉을 방해하는 것, 또는 (v) 백혈병 세포를 사멸 시키는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 투여함으로써 ADCC를 유도 또는 활성화시키는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 S15 및 A3R과 실질적으로 동일한 친화도를 가지고 결합하는 공통 항체들은 ADCC를 활성화하고/하거나, 자연 킬러(NK) 세포(예, CD56+), γδ T 세포 및/또는 단핵구를 자극하여 세포 용해를 유도할 수 있다. 일반적으로, 항체의 Fc 영역 또는 부분을 포함하는 항체를 투여한 후, 상기 항체는 효과기 세포, 예를 들어 NK 세포 상에서 Fc 수용체(FcR)에 결합하여 퍼포린 및 그랜자임 B의 방출을 유발하고/하거나 FasL 발현을 유도하며, 이는 후에 아폽토시스를 초래한다.
표적 세포 표면 상에서 Fas 수용체에 대해 효과기 세포 상에서 발현된 FasL의 결합은 Fas 수용체 신호 유발 경로의 활성화를 통해 표적 세포 아폽토시스를 유도할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 공통 서열을 포함하는 IgG 항체는 효과기 세포 상에서 FasL 발현을 유도한다. 관련된 효과기 세포의 형태, 사이토카인(예, IL-2 및 G-CSF), 항온배양 시간, 세포 표면 상에 존재하는 수용체의 수 및 항체 친화도를 비롯한 다양한 인자가 ADCC에 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 항체 및 폴리펩티드가 유용하게 연결될 수 있는 항질병, 항암 및 항백혈병제의 예는 독소, 방사능 동위원소 및 약학 조성물을 포함한다.
독소의 예로는 겔로닌, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소(PE), PE40, PE38, 디프테리아 독소, 리신, 또는 이의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다.
방사능 동위원소의 예로는 병소 위치 확인 및/또는 치료에 사용될 수 있는 감마 방출제, 양전자 방출제 및 x-선 방출제, 및 치료에 사용될 수 있는 베타 방출제 및 알파 방출제를 포함한다. 진단에 유용한 전술한 방사능 동위원소 역시 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
항암제 또는 항백혈병제의 비제한적인 예로는 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신, 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 모르폴리노독소루비신, 모르폴리노다우노루비신, 메톡시모르폴리닐독소루비신, 메톡시모르폴리노다우노루비신 및 메톡시모르폴리닐독소루비신 및 이의 치환된 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다. 약제의 다른 예로는 시스-백금, 택솔, 칼리체아미신, 빈크리스틴, 시타라빈(Ara-C), 시클로포스파마이드, 프레드니손, 다우노루비신, 이다루비신, 플루다라빈, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로마이드, 탈리도마이드 및 블레오마이신, 및 이들의 유도체, 조합체 및 변형체를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 공통 서열의 어느 하나를 포함하는 항체 또는 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 항체 또는 폴리펩티드는 세포 회전, 염증, 자가 면역 질환, 전이, 종양 세포 또는 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제, 또는 종양을 가진 환자의 종양 세포 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포수의 증가를 억제 또는 치료하기에 유효한 양으로 존재할 수 있다. 대안으로, 항체 또는 폴리펩티드는 종양 세포 또는 백혈병 세포의 사멸률을 증가시키는 데 유효한 양으로 존재할 수 있다. 또는, 항체 또는 폴리펩티드는 항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성, 항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포 의 감수성, 또는 항백혈병제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성을 변화시키기에 유효한 양으로 존재할 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 폴리펩티드는 종양을 가진 환자의 종양 세포의 수 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포의 수를 감소시키는 데 유효한 양으로 존재할 수 있다. 또한 대안으로, 항체 또는 폴리펩티드는 공통 항체가 바람직하게 A3R을 포함하는 경우 재협착을 억제하기에 유효한 양으로 존재할 수 있다. 항체 또는 폴리펩티드는 HIV 진입의 억제 및/또는 HIV 감염의 치료에 유효한 양으로 존재할 수도 있다. 대안으로, 항체 또는 폴리펩티드는 치료제를 특정 세포 또는 부위에 직접 전달하는 표적 제제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 적합한 방법에 의해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 방법의 예로는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 기관지내, 포막내, 복강내, 림프선내, 비강, 설하, 경구, 직장, 질, 기도, 협측, 피내, 경피, 또는 늑막내 투여를 포함한다.
정맥내 투여의 경우, 제형은 바람직하게는, 환자에게 투여되는 양이 소정의 조성물 약 0.1 mg∼약 1000 mg의 유효량이 되도록 제조된다. 보다 바람직하게는, 투여되는 양은 소정의 조성물 약 1 mg∼약 500 mg이 될 것이다. 본 발명의 조성물은 광범위한 용량 범위에서 유효하며, 치료되는 질병의 구체적 특징, 환자 신체 내에서의 펩티드 또는 폴리펩티드계 약학 조성물의 반감기, 항체 또는 이의 단편과 복합체를 형성한 제제 및 약학 조성물의 물리 화학적 특성, 약학 조성물의 투여 방식, 치료 또는 진단 대상 환자의 구체적 특징 및 치료의가 중요하다고 판단하는 기타 파라미터에 좌우된다.
경구 투여용 약학 조성물은 임의의 안정한 형태로 존재할 수 있다. 이의 예에는 정제, 액상, 에멀션, 현탁액, 시럽, 환약, 캐플릿 및 캡슐이 포함된다. 약학 조성물의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(예, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (pub) 참고).
약학 조성물은 정기적인 방출, 지속적인 방출, 규칙적인 방출 또는 연속적인 방출을 용이하게 하도록 제제화될 수도 있다. 약학 조성물은 또한 정기적인 장치, 지속적인 장치, 규칙적인 장치 또는 연속적인 장치와 같은 장치로 투여될 수도 있다.
국부 투여용 약학 조성물은 임의의 적합한 형태, 예컨대, 크림, 연고, 로션, 패치, 용액, 현탁액, 동결건조물 및 겔의 형태일 수 있다.
본 발명의 항체 및 폴리펩티드를 가지는 조성물은 종래의 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제, 담체 등을 포함할 수 있다. 정제, 환약, 캐플릿 및 캡슐은 락토즈, 전분 및 스테아르산마그네슘과 같은 종래의 부형제를 포함할 수 있다. 좌제는 왁스 및 글리세롤과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 주사액은 염수와 같은 멸균된 발열원이 없는 매질을 포함하며, 완충제, 안정화제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 종래의 장코팅제도 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 및 폴리펩티드, 및 이의 약학 조성물은 이를 필요로 하는 환자의 질병의 치료 방법(예를 들어, 치료는 질병의 영향을 완화시키는 것, 질병의 예방하는 것, 또는 질병의 진행을 억제하는 것을 포함할 수 있음)에 사용될 수 있 다. 그러한 방법으로는 세포 회전(cell rolling), 염증, 자가 면역 질환, 전이, 종양 세포 또는 백혈병 세포의 성장 및/또는 복제, 또는 종양을 가진 환자의 종양 세포 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포수의 증가를 억제하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법은 종양 세포 또는 백혈병 세초의 생존율, 항질병제에 의한 손상에 대한 질병 세포의 감수성, 항암제에 의한 손상에 대한 종양 세포의 감수성, 또는 항암제에 의한 손상에 대한 백혈병 세포의 감수성을 변화시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 또한 종양을 가진 환자의 종양 세포의 수 또는 백혈병 환자의 백혈병 세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 또한 세포에 HIV 유입을 저해 또는 감소시키는 것, 이러한 저해의 결과로 HIV의 복제를 차단시키는 것, 및 이로써 HIV 감염을 치료하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법은 재협착과 같은 심장혈관 질환을 예방 또는 저해하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 AML, T-ALL, B-백혈병, B-CLL, Pre-B-ALL, 다발성 골수종, 전이, HIV 감염, 심장혈관 질환, 또는 세포 회전, 염증, 면역 반응, 감염, 자가면역 반응, 전이와 같은 세포 기능 또는 작용이 중요한 역할을 하는 기타 질환과 같은 다양한 질병 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 항체 및 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 약제는 본 발명의 항체 및 폴리펩티드를 포함한다.
본 출원을 통해, 다양한 출판물 특허 및 특허 출원이 참고로 인용된다. 이러한 출판물, 특허 및 특허 출원이 나타내는 내용과 이들에 공개된 내용은 그 전체로서 본 출원에 참고 자료로 포함되어, 본 발명이 속하는 기술 분야의 현 상태를 보다 충분히 설명해 준다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕고 본 발명을 추가로 예시하기 위해 기술된 것이나, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하려는 것은 아니다. 특정한 시약 및 반응 조건을 기재하였으나, 본 발명의 범위에 포함되는 변형이 이루어질 수 있다.
실시예 1
본 실시예는 S15 항체 단편의 결합 능력을 비롯한, S15 scFv 항체 단편의 선별, 생산 및 초기 특성 규명에 관한 것이다. 요약하면, 6개의 아미노산으로 된 랜덤 CDR3-VH를 가지는 VH-VL의 특이적 골격(scaffold)에 기초한 파아지 디스플레이 라이브러리를 황산화된 PSGI-1에 결합하는 scFv 항체를 동정하는데 사용하였다. scFv 항체는 성숙한 PSGL-1 분자의 1-17번 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단으로 또는 C-말단부터 N-말단으로)(비성숙한 PSGL-1 분자의 42-58번 아미노산에 대응함, 즉, 시그날 서열을 포함함)을 가지는 합성 황산화된 펩티드에 대해 패닝하여 얻었다. 유세포 계측법, 특히 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 ELISA를 PSGL-1를 발현하는 전체 세포에 결합하거나 또는 합성 황산화된 펩티드에 결합하는 특이적 파아지 클론을 동정하고 특성 분석하는데 사용하였다.
파아지 디스플레이 라이브러리는 pHEN 벡터내 조합(combinatorial) 파아지 항체 라이브러리(CAT)로부터 분리된 클론의 골격으로부터 작제하였다. 이 골격은 VH3(1-3,3-20) 및 VL(11-7)을 포함하였다. 이 라이브러리는 6개의 아미노산 길이의 CDR3 초가변 루프를 무작위화하여 작제하였다. CDR3의 5' 영역에 단일 Eagl 자리를 가지는 작제물을 제공하기 위해(pHEN-Yl의 2개의 Eagl 자리 대신), pHEN-Y1 유래의 Xmal-Notl 단편을 절단하고, 새로운 단편을 Not1 자리의 결찰 부분을 돌연변이시켜 도입시킴으로써((서열번호: 20의 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 21의 올리고뉴클레오티드를 어닐링함으로써), VL의 3' 말단에 Eagl 제한 자리를 돌연변이 시켰다. 2개의 유일한 자리(Eagl 및 Xmal)를 생성시키고, 동일한 크기를 가지나 랜덤화된 CD3를 가지는 PCR 산물을 도입시키기 위해서는 돌연변이가 요구되었다. 결찰 이후, 삽입 영역에서 플라스미드의 서열을 분석하고, 돌연변이를 확인하였다. 새로운 pHEN-Yl-돌연변이체를 Eagl 및 Xmal로 절단하고, 큰 단편을 이후 결찰을 위한 벡터로 사용하였다.
가변 CDR3의 제조를 위한 주형은 서열번호: 22의 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 23의 올리고뉴클레오티드로 PCR을 하여 제조하였다. PCR 산물(주형 A)을 SDS-폴리아크릴아미드 겔로부터 분리하고, 추가적인 증폭을 위해 정제하였다. 주형 A를 서열번호: 24 및 서열번호: 23의 올리고뉴클레오티드로 증폭하기 위해 사용하였으며, 이 산물은 정제되며, 주형 B를 나타낸다. 주형 B를 서열번호: 25 및 서열번호: 23의 올리고뉴클레오티드로 증폭하고, 정제하여, Eagl 및 Xmal 제한 효소로 절단하였다. Eagl 및 Xmal을 가지는 절단된 벡터 pHEN-Yl-mut를 정제하고, 동일한 효소로 절단된 최종 PCR 산물에 결찰시켰다.
결찰 산물을 TG1 세포를 형질전환시키는데 사용하였다. 3개의 결찰 산물에 대한 형질전환 수율은 2.4 x 106 독립적 콜로니-형성 단위(CFU)이다. 이 라이브러리를 10(13 cm) SOBAG(리터당 20g 박토-트립톤, 5g 박토-이스트, 8.5 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.1M 글루코즈, O.1 mg/ml 암피실린; 플레이트 제조를 위해서는 15g 박토-아가) 플레이트에 도말하여 증폭시켰다. 박테리아를 플레이트로부터 SOBAG 배지에 재현탁시키고, 20% 글리세롤 중에서 -70℃에서 저장하였다. 증폭된 라이브러리의 타이터는 1.5 x 109 CFU/ml이었다. 증폭된 라이브러리의 분취액(~108 CFU)을 헬퍼 파아지 M13K07로 감염시켜, 바이오패닝 실험을 수행하기 위해 파아지의 형태로 라이브러리를 얻었다. 이 라이브러리는 2.5 x 106 멤버를 포함하나, 이는 이론적인 라이브러리는 206 또는 6.4 x 107 멤버를 포함한다는 점에서 상이하다.
바이오패닝은 서열번호: 7의 고정화된 펩티드를 파아지 디스플레이 라이브러리와 함께 항온처리시키고, 세척으로 결합하지 않은 파아지를 제거하고, 결합한 파아지를 특이적으로 용출시켜 수행하였다. 용출된 파아지 클론을 임의적으로 증폭시킨 후, 추가적으로 결합 및 임의적인 증폭 사이클을 수행하였으며, 펩티드에 가장 잘 결합하는 항체 단편을 가지는 파아지 클론의 특이적 서열의 풀(pool)을 다량 얻었다. 패닝을 여러 사이클로 반복한 후, 개별적인 파아지 클론에 대해 특성 분석하고, 그 클론의 서열을 결정하였다.
본 발명에서, 서열번호: 7의 비오티닐화 황산화된 펩티드에 결합하는 스트렙타비딘-자기 비드로, 용액내 파아지 디스플레이 라이브러리를 패닝함으로써 S15 항체 클론을 동정하였다. 이 펩티드를 화학적으로 합성하였으며, 이는 PSGL-1 이내의 42-58번 아미노산에서 발견되는 고도 산성 서열(3번째 티로신 잔기의 황산화를 포 함)에 기초한 것이다. 합성 펩티드의 N-말단을 아미노카프로산으로 신장시키고, 황산화된 에피토프의 입체 장애를 피하기 위해 카프로산의 아미노기를 비오티닐화하였다. 서열번호: 7의 합성 황산화된 펩티드를 과량으로 항온처리하고, PBST(PBS + 0.05% Tween-20)로 세척한 후, PBST-M(5% 저지방유가 보충된 PBST)로 블로킹 시킴으로써, 이 펩티드를 스트렙타비딘-자기 비드상에 고정시켰다. 패닝을 위해, 펩티드가 결합된 비드를 2 x 1011개의 파아지와 항온처리하였다. 비황산화된 펩티드에 결합하는 scFv 클론이 분리되는 것을 피하기 위해, 비오티닐화되지 않았거나 황산화되지 않은 동일한 선형 서열(서열 번호: 45)을 가지는 펩티드를 패닝 용액에 첨가하였다.
3 사이클의 패닝을 PBST 내에서 고엄중성(high stringency) 세척 조건을 사용하여 수행하였다(각각 37℃에서 20분씩). 세척 이후, 결합된 파아지를 글리세린 0.2M(pH 2.2)으로 용출시키고, Tris 1M(pH 9.1)로 중화시켰다. 용출된 파아지를 TG1 박테리아에 감염시켜 증폭시키고, 헬퍼 파아지 M13K07로 회수하였다. 3 사이클의 패닝을 반복한 후 5000배 정도를 얻을 수 있었다. 3번째 사이클의 패닝 이후, 개별적인 클론에 대해 CDR3 영역의 아미노산 서열을 분석하였다. 선별된 클론의 CDR3 영역의 아미노산 서열(서열번호: 9, 27-33, 35, 4)을 표 1에 나타내었다.
Figure 112005078607456-PCT00001
표 1에서 나타낸 결과는 강한 컨센서스 서열이 얻어졌음을 나타내 준다: 모든 CDR3 서열에서, 제1번 및 제6번 위치에서의 소수성 잔기, 일반적으로 제2번 위치에서의 염기성 잔기, 및 제4번 위치에서의 프롤린.
PSGL-1의 황산화된 부분에 기초하여, 합성 황산화된 펩티드에 결합하는지를 추가적으로 분석하기 위해, 패닝되어 선별된 클론 유래의 파아지(도 1) 및 비정제된 scFv 상청액(도 2)을 사용하여 ELISA 분석을 하였다. 이러한 실험에는 scFv 항체 Y1 및 L32의 분석이 포함되며, 이들 둘은 이미 PSGL-1에 결합한다는 것이 확인되어 밝혀진 것들이다. Y1은 미국 특허 출원 제10/029,926호 및 국제 특허 출원 제PCT/USO1/49,440호에 서술되어 있으며, L32에 대해서는 미국 출원 제10/189,032호에 서술되어 있다. ELISA 분석은 "테스트" 웰로 서열번호: 7의 합성 황산화된 펩티드를 사용하여, 그리고 "백그라운드" 웰로 서열번호: 26의 합성 비황산화된 펩티드를 사용하여 동시에 수행하였다. 펩티드를 제조자의 추천대로 NH-CovaLink™ 플레이트(NUNC)상에 코팅하였다. 백그라운드 웰로부터 얻은 결합 데이터를 대응되는 테스트 웰에서 얻은 결합 데이터에서 빼주어, 도 1 및 2에 나타낸 결과를 얻었다. 랜덤하게 선택된 파아지 클론을 합성 황산화된 펩티드에 대한 결합을 측정하기 위한 음성 대조군(NC)으로 사용하였다.
도 1은 패닝되어 선별된 파아지 클론 모두가 합성 황산화된 펩티드에 특이적으로 결합함을 보여준다. 도 2는 3 사이클 패닝 이후에 선별된 클론상에서 발현되는 scFV 모두가 합성 황산화된 펩티드에 특이적으로 결합함을 보여준다.
표 2는 실시예 1의 연구에 사용된 모든 클론과 이들의 CDR3 영역의 아미노산 서열에 대한 요약을 제공한다.
Figure 112005078607456-PCT00002
선별된 클론 유래의 scFv를 FACS로 분석하여 PSGL-1을 발현하는 ML-2, AML M4 세포주 상의 PSGL-1에 결합하는지를 평가하였다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 모든 선별된 클론 유래의 scFv 및 L32는 ML-2 세포상의 PSGL-1에 상이한 감도로 결합하였다.
패닝되어 선별된 클론 유래의 비정제된 scFv 상청액을 사용한 ELISA 분석을 수행하여 혈소판상에 발현되는 당단백질인 글리코칼리신(glycocalicin)에 대한 결합을 측정하였다. 그 결과는, 도 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 9의 CDR3 서열을 가지는 하나의 클론(S15로 명명됨)이 다른 선별된 클론들과 이미 동정된 scFv L32에 비교하여 글리코칼리신에 더 낮은 친화도를 가지고 있음을 보여준다.
도 3 및 도 4에 나타낸 결과는 함께, 글리코칼리신에 대한 결합 정도에 기초하여, S15가 PSGL-1를 발현하는 ML-2 세초에 대해 높은 친화도를 보이며, 혈소판에 대해서는 낮은 친화도를 보임을 나타내준다. 이러한 결론은 과립구(PSGL-1을 발현하는 세포임)와 혈소판에 결합하는 scFv의 FACS 분석으로 확인하였으며, 이 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5는 S15이 과립구에 강하게 결합하나, 손상되지 않은(intact) 혈소판에는 약하게만 결합함을 명확히 보여준다.
도 6은 scFv의 과립구/혈소판 결합 비율의 비교 결과를 보여준다. 현저하게, S15는 S11, S9, S1, 520, 3.4, 3.1, Y1 및 L32보다 현저하게 높은 과립구/혈소판 결합 비율을 가지고 있다.
도 7은 PSGL-1에 대한 쥐과 항체인, KPL-1의 존재시와 부존재시, ML-2 세포상의 PSGL-1에 대한 S15의 결합 분석 결과를 보여준다. S15는 KPL-1의 부존재시에는 높은 친화도로 ML-2 세포에 결합하나, 이러한 결합이 KPL-1의 존재시에 본질적으로 감소하지는 않는다. 이러한 결과는 ML-2 세포 상에 PSGL-1에 대한 S15의 결합의 특이성을 확인시켜 준다.
S15를 실시예 2의 추가적인 실험에 사용하기 위해 단백질 A 친화도 컬럼상에서 정제하였다.
실시예 2
본 발명은 유사하게 정제된 L32 및 Yl scFv과 비교하여, 정제된 S15 scFv 항체에 대한 추가적인 특성 분석(결합 능력을 포함)에 대해 서술한다.
FACS 분석을 PBS의 존재하에 정제된 S15, Y1 및 L32 scFv가 ML-2 세포에 결합하는 정도를 분석하기 위해 수행하였다. 이 결과는, 도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, S15가 L32 및 Y1에 비교하여 ML-2 세포에 적어도 100배 더 잘 결합함을 보여준다.
FACS 분석을 50% 혈장의 존재하에 정제된 S15, Y1 및 L32 scFv가 ML-2 세포에 결합하는 정도를 분석하기 위해 수행하였다. 이 결과는, 도 10 및 11에 나타낸 바와 같이, S15에 의한 결합 절대 수치가 L32 및 Y1에 비교하여 현저하게 높음을(적어도 100배) 보여준다.
ML-2 세포에 경합하는 정제된 S15 scFv의 투여량 반응도(dose response)도 분석하여, L32 및 Y1와 비교하였다. 도 12에서 나타낸 바와 같이, S15의 투여량 반응도는 L32 및 Y1보다 적어도 10 나노그램(ng) 정도 현저하게 큰 값이었다.
실시예 3
이 실시예는 GPIb의 268-285번 잔기에 대응되는 합성 펩티드(제1 티로신 위치에서의 황산화를 포함)에 대해 실시예 1에 서술된 라이브러리를 패닝하여 얻어진, 컨센서스 서열을 포함하는 2개의 추가적인 항체를 확인하는 과정을 서술한다.
본 실시예는 D1 및 D3 scFv 항체 단편의 선별, 생산, 및 초기 특성 규명(D1 및 D3 항체 단편의 결합 능력 포함)에 관한 것이다. 요약하면, 6개의 아미노산으로 된 랜덤 CDR3-VH를 가지는 VH-VL의 특이적 골격에 기초한 파아지 디스플레이 라이브러리를 황산화된 GPlb에 결합하는 scFv 항체를 동정하는데 사용하였다. scFv 항체는 성숙한 GPIb 분자의 N-말단으로부터 C-말단으로 268-285번 아미노산(GDEGDTDLY(S04)DYYPEEDTE)(서열번호: 44)의 서열을 가지는 합성 황산화된 펩티드(비성숙한 GPIb 분자의 284-301번 아미노산, 즉, 시그날 서열에 대응됨)에 대해 패닝함으로써 얻었다. 유세포 계측법, 특히 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 ELISA를 GPIb를 발현하는 혈소판 또는 합성 황산화된 펩티드에 결합하는 특이적 파아지 클론을 동정하고 특성 분석하는데 사용하였다.
사용한 파아지 디스플레이 라이브러리는 실시예 1에서 서술한 것이다.
바이오패닝은 서열번호: 44(GDEGDTDLYSDYYPEEDTE)의 고정화된 펩티드를 파아지 디스플레이 라이브러리와 함께 항온처리시키고, 세척으로 결합하지 않은 파아지를 제거하고, 결합한 파아지를 특이적으로 용출시켜 수행하였다. 용출된 파아지 클론을 임의적으로 증폭시킨 후, 추가적으로 결합 및 임의적인 증폭 사이클을 수행하였으며, 펩티드에 가장 잘 결합하는 항체 단편을 가지는 파아지 클론의 특이적 서열의 풀을 다량 얻었다. 패닝을 여러 사이클로 반복한 후, 개별적인 파아지 클론에 대해 특성 분석하고, 그 클론의 서열을 결정하였다.
본 발명에서, D1 및 D3 항체 클론은 자기 비드에 공유 결합되어 있는, 서열번호: 44의 화학적으로 합성된 황산화된 펩티드로 용액 중 파아지 디스플레이 라이브러리를 패닝함으로써 확인하였다. 이 서열번호: 44의 합성 황산화된 펩티드는 성숙한 GPIb 이내의 268-285번 아미노산에서 관찰되는 고도 산성 서열(제1 티로신 잔기의 황산화 포함)에 기초한 것이다. 이 서열번호: 44의 합성 황산화된 펩티드는 제조자의 지시에 따라 EDC/NHS를 포함하는 반응에 의해, 아민-자기 비드(Dynal)에 공유 결합시켰다. 비드를 PBST(PBS + 0.05% Tween-20)로 세척하고, PBST-M(5% 저지방유가 보충된 PBST)로 블로킹하였다. 패닝을 위해, 펩티드가 결합된 비드를 2 x 1011개의 파아지와 항온처리하였다. 동일한 선형 서열(서열번호: 43)을 가지나 황산화가 되지 않은 펩티드를 비황산화된 펩티드에 결합하는 scFv 클론이 분리되는 것을 피하기 위해 패닝 용액에 첨가하였다.
3 사이클의 패닝을 PBST 내에서 고엄중성 세척 조건을 사용하여 수행하였다(각각 37℃에서 20분씩). 세척 이후, 결합된 파아지를 글리세린 0.2M(pH 2.2)으로 용출시키고, Tris 1M(pH 9.1)로 중화시켰다. 용출된 파아지를 TG1 박테리아에 감염시켜 증폭시키고, 헬퍼 파아지 M13K07로 회수하였다. 3 사이클의 패닝을 반복한 후 5000배 정도를 얻을 수 있었다. 3번째 사이클의 패닝 이후, 개별적인 클론에 대해 CDR3 영역의 아미노산 서열을 분석하였다. 선별된 클론의 CDR3 영역의 아미노산 서열(서열번호: 11-16)을 표 3에 나타내었다.
Figure 112005078607456-PCT00003
표 3에서 나타낸 결과는 강한 컨센서스 서열이 얻어졌음을 나타내 준다: 모든 CDR3 서열에서, 제1번 및 제6번 위치에서의 소수성 잔기, 일반적으로 제2번 위치에서의 염기성 잔기, 및 제4번 위치에서의 프롤린.
GPIb의 황산화된 부분에 기초하여, 합성 황산화된 펩티드에 결합하는지를 추가적으로 분석하기 위해, 패닝되어 선별된 클론 유래의 파아지(도 13)를 사용하여 ELISA 분석을 하였다. ELISA 분석은 "테스트" 웰로 서열번호: 44 GPIb 황산화된(GDEGDTDLYSDYYPEEDTE)의 합성 황산화된 펩티드를 사용하여, 그리고 "백그라운드" 웰로 서열번호: 43(GDEGDTDLYDYYPEEDTE)의 GPIb 비황산화된 펩티드를 사용하여, 또한, PSGLI-1 유래의 황산화된 펩티드 및 비황산화된 펩티드(각각, 서열번호: 7(QATEYEYLDYSDFLPETE) 및 서열번호: 26(QATEYEYLDYDFLPETE)에 대응됨)를 사용하여, 동시에 수행하였다. 펩티드를 제조자의 추천대로 NH-CovaLink™ 플레이트(NUNC)상에 코팅하였다. 백그라운드 웰로부터 얻은 결합 데이터를 대응되는 테스트 웰에서 얻은 결합 데이터에서 빼주어, 도 13에 나타낸 결과를 얻었다. 랜덤하게 선택된 파아지 클론을 합성 황산화된 펩티드에 대한 결합을 측정하기 위한 음성 대조군(NC)으로 사용하였다.
도 13은 합성 황산화 펩티드 둘 다, 즉 GPIb 및 PSGL-1에 특이적으로 결합한 선택된 파지 클론 각각을 나타낸다. 상기 클론들은 합성 황산화 펩티드에 대해 일정 범위의 결합 강도를 나타내는 한편, 각각의 클론은 GPIb 및 PSGL-1 둘 다에 대해 거의 동일한 거동을 나타냈다.
선택된 클론으로부터 유래한 scFv는 ELISA로 분석하여 글리코칼리신(혈소판에서 발현되는 GPIb로부터 유도된 외막 부분)에 대한 결합을 평가하였다. 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, scFvs D1 및 D3은 유의적인 결합을 나타내는 반면, D2 및 D16은 약한 결합을 나타냈으며, D5 및 D9는 네가티브 대조군에 유사하였다.
선택된 클론으로부터 유래한 scFv(실험 당 1 ㎍)는 FACS로 분석하여 ML-2, 즉 PSGL-1을 발현하는 AML M4 세포주에 대한 결합을 평가하였다. 하기 표 4로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 모든 scFv는 ML-2 세포에 상이한 감도로 결합하였다. D1 및 D3은 ML-2에 대한 가장 강한 결합을 나타냈으며, 이는 아마도 PSGL-1의 에피토프와의 상호작용에 기인한 것이다.
클론 Geo 평균
네가티브 4.4
D1 26.7
D2 18.7
D3 44.1
D5 5.14
D9 10.5
D16 17.0
실시예 4
본 실시예는 본 발명의 컨센서스 서열 내에 포함되는 CDR3 서열을 보유하는 몇몇 scFv 항체의 결합을 입증한다. 개략적으로, 스캐폴드로서 Y1-scFv의 CDR3 서열을 사용하여, 돌연변이 scFv를 생성하고, 혈소판 및 과립구에 대한 결합에서 이들 돌연변이의 효과를 평가하였다.
Y1-scFv의 중쇄의 CDR3(CDR3H) 내에서 위치 지정 돌연변이유발법을 이용하며, 상기 컨센서스 서열 내에 포함되는 추가의 CDR3 영역을 생성하였다. 이어서, 이들 추가의 scFv를 테스트하여 혈소판 및 과립구에 대한 상대적인 결합을 측정하였다.
Y1-scFv는 혈소판에서 발견되는 음으로 하전된 GPIbα에 결합하는 것으로 공지되어 있다. Y1의 CDR3H를 포함하는 6개의 아미노산 서열 내에는 제2 위치에 아르기닌 잔기, 즉 양으로 하전된 아미노산이 존재한다. 상기 아르기닌 잔기의 가능한 정전 효과를 조사하기 위해, 4개의 돌연변이 scFv를 구성하였다. 돌연변이체 R2A는 알라닌에 의해 치환된 아르기닌 잔기를 보유하며, 돌연변이체 A3R은 알라닌을 치환하는 위치 3에 추가의 아르기닌을 보유하며, 돌연변이체 V5R은 발린을 치환하는 위치 5에 추가의 아르기닌을 보유한다. 제4 scFv는 뒤섞인 돌연변이체(scrambled mutant)였다. 상기 scFv 돌연변이체들은 하기 표 5에 요약하였다.
MAb CDR3 서열 서열 번호
Y1 MRAOVI (서열 번호 4)
R2A MAAPVI (서열 번호 45)
A3R MRRPVI (서열 번호 10)
V5R MRAPRI (서열 번호 46)
뒤섞인 돌연변이체 IPMARV (서열 번호 47)
혈소판에 대한 결합에서 4개의 돌연변이 scFv의 비교 분석은 다음과 같이 FACS 분석에 의해 수행하였다.
항-scFv 항체는 scFv의 혼합물 400 ㎍으로 래빗을 면역화하고, 제조사의 지시에 따라 피코링크(상표명) R-피코에리트린 접합 키트(캘리포니아 샌 린드로 소재의 프로자임)를 이용하여 표지하였다. scFv의 액적(10 ㎍/ml)는 실온에서 1 시간 동안 107의 세척된 혈소판과 함께 항온처리하였다. 이어서, 혈소판은 1% BSA를 함유하는 PBS 중에서 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 R-피코에리트린-항-scFv 항체와 함께 항온처리하였다. 이어서, 혈소판을 세척하고, PBS 중에 재현탁하고, 샘플(104 샘플)은 FACS(캘리포니아 벡톤-디킨슨 소재의 VACScan)으로 분석하였다.
도 15는 상이한 공여체로부터 유래한 혈소판을 이용한 3회의 실험에서 더은 평균 결합 + SEM을 나타낸다. 돌연변이체 R2A는 Y1 모 scFv와 비교하여 혈소판에 대한 결합을 나타내지 않았는데, 이는 CDR3H의 제2 위치 내의 아르기닌이 혈소판 결합 기능에 일정 역할을 수행할 수 있음을 의미하는 것이다. 돌연변이체 V5R은 야생형 Y1-scFv와 유사한 방식으로 1 내지 10 ㎍/ml의 농도 범위에서 혈소판에 결합하였다. 그러나, 20 ㎍/ml의 농도에서, V5R의 결합은 Y1 scFv에 비해 2배 더 높았다(도 15). 대조적으로, 돌연변이체 A3R scFv는 테스트한 모든 농도에서 Y1 scFv와 비교하여 혈소판에 대한 9배 더 높은 결합을 나타냈는데, 이는 위치 2의 아르기닌 잔기에 인접한 추가의 아르기닌 잔가가 혈소판에 대한 결합을 증가시킬 수 있음을 의미하는 것이다. 뒤섞인 scFv는 혈소판에 결합하지 못했는데(도 15), 그 이유는 제2 위치에 아르기닌이 결여된 돌연변이체에게는 예상된 것이었다.
또한, scFv는 ELISA 분석을 이용하여 정제된 글리코칼리신 및 GPIbα 유도된 펩티드에 대한 그들의 결합 능력에 대해 조사하였다. 도 16은 이들 결과를 2회의 실험으로부터 유래한 평균 결합 5 ㎍/ml scFv + STDV로서 나타냈다. 돌연변이체 R2A scFv 및 뒤섞인 scFv는 정제된 GPIbα에 결합하지도 않았고, GPIbα 유도된 펩티드에 결합하지도 않았다. V5R은 정제된 글리코칼리신 및 GPIbα 유도된 펩티드에 Y1과 유사한 방식으로 결합하였다. 돌연변이체 A3R은 Y1과 비교하여 글리코칼리신에 대한 증강된 결합을 나타냈다.
혈소판 응집에 대한 돌연변이 scFv의 효과는 다음과 같이 수행된 연구에 의해 평가하였다. 세척된 혈소판은 발광응집측정기(펜실베니아 하버타운 소재의 크로놀로그)에서 37℃에서 500 rpm에서 교반하였다. 혈소판 현탁액과 현탁 매질을 통한 빛 투과의 차이를 100% 응집으로서 간주하였다. 혈소판 응집에 대한 mAb-scFv의 효과는 작용제를 첨가하기 전 실온에서 2분 동안 상이한 농도의 mAb-scFv와 함께 항온처리하여 평가하고, 4 분 동안 응집에 대해 기록하였다.
혈소판 응집에 대한 A3R scFv의 효과는 그의 증강된 혈소판 결합 능력과 일치하는 것으로 확인되었다. 도 17은 이 돌연변이체가 Y1 scFv와 비교하여 세척된 혈소판에서 리스토세틴-유도된 vWF-의존성 혈소판 응집의 더 효과적인 억제를 나타낸다(각각 0.2 μM 및 0.8 μM의 IC50).
이와 함께 이들 실험은 Y1-CDR3H내 위치 2의 아르기닌 잔기가 혈소판 GPIbα에 대한 결합에 대해 관련이 있을 수 있음을 입증한다. 또한, 이러한 결합은 정전 상호작용과 연루되어 있을 수 있는데, 그 이유는 위치 3에 추가의 잔기를 첨가하는 것이 혈소판 결합 능력 및 항-응집 기능 둘 다를 증가시켰기 때문이다.
실시예 5
A3R 및 Y1 scFv의 생물학적 활성은 Cone 및 Plate(let) Analyzer(CPA) 분석법으로 추가 분석하였는데, 상기 분석법은 고 전단 속도 하에서 폴리스티렌 표면에 대한 전혈 혈소판 부착 및 응집을 임상적으로 평가하고 따라서 생리적인 상태를 모방하는 새로운 방법이다(varon 등, (1997) Thromb. Res. 85(4): 283-294; Shenkman 등, (2000) Thromb. Res. 99(4): 353-361).
이들 실험은 다음과 같이 수행하였다. 혈액 샘플(200 ml)은 비조직 배양 4웰 폴리스티렌 플레이트(덴마크 록킬드에 소재하는 눈크) 상에 위치시키고, 1300 s-1의 전단에서 1분 동안 유동시켰다. 이때 회전 테플론 콘을 사용하였는데, 이는 상기 시스템을 위해 특별히 디자인된 것이다. 상기 콘은 직격이 14 mm이며, 전체적인 플레이트 표면에 걸쳐 일정한 유체 전단 응력을 유도하는 2.45°의 각도를 보유하고 있다. 이어서, 웰은 PBS로 철저히 세척하고, 메이-그룬왈드 염색약으로 염색하고, 상 분석 시스템(이스라엘 미그달 해멕 소재의 갈라이)에 연결된 역광 현미경(일본 도쿄 소재의 올림푸스)으로 분석하였다.
CPA 분석을 수행하여 CPA 분석에서 혈소판 부착에 대한 scFv 항체 1 μM(25 ㎍/ml) 및 2 μM(50 ㎍/ml)의 효과를 평가하였다. 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, A3R 돌연변이체는 표면 커버율의 감소를 나타냈는데, 1 μM 및 2 μM 각각의 농도에서 대조군의 13%에서 7% 및 3%로 감소하였다. 비교에 따르면, Y1-scFv는 표면 커버율에 아무런 영향을 미치지 않았으며, 두가지 농도에서 대조군에서와 같이 유사하였다. 이들 결과는 A3R 돌연변이체가 혈소판 상의 GPIb 수용체에 대한 그의 결합에 의해 CPA에 의한 유동 상태 하에서 폴리스티렌 표면에 대한 혈소판 부착을 억제함을 나타내는 것이다.
두 가지 항체 모두의 평균 크기(AS)는 약간 감소하였다(데이타는 나타내지 않음). 이들 결과는 A3R scFv이 혈소판 상의 GPIb 수용체에 대한 그의 결합에 의해 CPA에 의한 유동 상태 하에서 폴리스티렌 표면에 대한 혈소판 부착을 억제함을 나타내는 것이다.
A3R이 황산화 GPIb에 결합하고, 소 동맥에서 발생하거나 또는 동맥 협착증에 의해 생성되는 것과 같은 고 전단 응력 상태 하에서 전적으로 일어나는 GPIb와 vWF와의 상호작용을 방해한다는 관찰 결과에 기초하면, 이 항체를 동맥경화증의 예방 및/또는 치료를 위한 치료적 용도로 사용할 수 있다.
실시예 6
본 실시예는 건강한 혈소판 풍부한 혈장(PRP)에 대한 S15, A3R 및 Y1의 결합 특성의 비교를 기술한다.
FACS 분석은 2명의 건강한 공여체로부터 제조한 PRP 샘플 상에서 수행하여 혈소판에 대한 상이한 농도의 Y1, A3R 및 S15의 결합을 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타냈다.
PRP 샘플 #1
0.1 ㎍ 0.5 ㎍ 1 ㎍ 2 ㎍
Y1(P03) 네가티브 네가티브 네가티브 18
A3R 네가티브 네가티브 126 측정하지 않음
S15 네가티브 네가티브 30 120
"네카티브"는 Geo 평균이 10 이하임을 의미한다.
PRP 샘플 #2
0.1 ㎍ 0.5 ㎍ 1 ㎍ 2 ㎍
Y1(P03) 네가티브 네가티브 네가티브 13
A3R 네가티브 네가티브 96 측정하지 않음
S15 네가티브 네가티브 23 68
"네카티브"는 Geo 평균이 10 이하임을 의미한다.
상기 표 6-1 및 6-2의 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 1 ㎍의 농도에서, A3R은 Y1 보다 더 강한 친화성으로 혈소판에 결합하는 S15 보다 더 강한 친화성으로 혈소판에 결합하였다. 1 ㎍에서, PAP 샘플 #1 및 #2 둘 다의 평균 geo 평균은 A3R의 경우 116, S15의 경우 26 및 Y1의 경우 네가티브였다.
선택된 scFv(실험 당 0.5 ㎍)은 FACS로 분석하여 GPIb를 발현하는 PRP(혈소판 풍부한 혈장)에 대한 결합을 평가하였다. 하기 표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, D1 및 D3은 PRP에 대한 유의적인 결합을 나타냈는데, D1이 상대적으로 더 큰 정도로 결합하였다. PRP에 대한 D1 결합 수준은 scFv S11(LRYPFF)(서열 번호 31)(USSN 10/611,238)의 실시예 1에 기술된 선택)에 의해 나타난 것과 유사하였다.
클론 Geo 평균
D1 33.0
D2 19.6
D3 36.2
실시예 7
본 실시예는 과립구(G), 림프구(L) 및 단핵구(M)를 함유하는 건강한 전혈 세포에 대한 S15, A3R 및 Y1의 결합 특성의 비교를 기술한다.
FACS 분석은 2명의 건강한 공여체로부터 제조한 PRP 샘플 상에서 수행하여 혈소판에 대한 상이한 농도의 Y1, A3R 및 S15의 결합을 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 8 나타냈다.
전혈 샘플 #1
항체 0.1 ㎍ 0.5 ㎍ 1 ㎍ 2 ㎍
L G M L G M L G M L G M
Y1(P03) neg neg neg neg neg neg neg neg 30 20 30 57
A3R neg neg neg neg 11 30 34 18 56 측정하지않음
S15 36 26 56 81 100 192 120 150 290 포화
neg = 네가티브
전혈 샘플 #2
항체 0.1 ㎍ 0.5 ㎍ 1 ㎍ 2 ㎍
L G M L G M L G M L G M
Y1(P03) neg neg neg neg neg neg neg neg 20 12 20 62
A3R neg neg neg neg 14 30 25 53 120 측정하지않음
S15 18 44 69 78 151 248 112 220 340 포화
표 8의 결과는 전혈 세포에 대한 S15의 결합 친화도가 A3R 및 Y1의 결합 친화도보다 더 큰 것을 나타낸다. 0.1 ㎍의 농도에서, 전혈 샘플의 S15 결합의 평균 geo 평균은 중간 내지 높은 수준이지만, 전혈 샘플 #1 및 #2 둘 다의 A3R 및 Y1의 평균 geo 평균은 0.5 ㎍에서 네카티브 또는 약간 포지티브였다.
scFv D1, D3 및 S11(실험 당 0.5 ㎍)은 FACS로 분석하여 전혈(림프구, 과립구 및 혈소판 상에 게이팅됨)에 대한 결합을 평가하였다. 하기 표 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, D1은 다른 2개의 scFv에 비해 모든 세포 유형에 대해 가장 큰 결합을 나타냈다.
림프구 단핵구 혈소판
D1 23 90 36
D3 3.8 21 6
S11 12 38 17
실시예 8
본 실시예는 상기 컨센서스 서열을 포함하는 항체의 특성을 추가로 연구하기 위한 비인간 생체내 동물 모델 시스템의 개발에 대해 기술한다. 초기 목적은 항체 중 하나(또는 그 이상)이 (a) 혈소판에 결합하고 (b) 혈소판 응집을 억제할 수 있는 비인간 포유류 종을 확인하는 것이었다.
상이한 포유류 종으로부터 분리한 혈소판에 결합할 수 있는 여러 가지 scFv 항체의 능력은 FACS 분석으로 측정하였으며, 상대적인 반응 결과는 하기 표 10에 요약하였다.
혈소판 기원 Y1 A3R S15 S11 S1 D1
인간 + ++++ ++++ +++++++ +++++++ +++++++
개 +++ ND +++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++
돼지 + ND ++ ND ND ND
기니 피그 + ++ ++ ++++ ++++ ++++
원숭이 - ND - ND ND ND
마우스 - ND - ND ND ND
래빗 - ND - ++++ ++++ ++++
ND = 측정하지 않음
테스트한 각각의 종 내에서, scFv Y1은 상기 컨센서스 서열을 포함하는 항체 중에서 가장 약한 상대 결합을 나타냈다. 이 관찰은 돌연변이체(A3R) 및 선택된 라이브러리 (S15, S11, S1 및 D1) scFv 모두가 혈소판 GPIb 상에서 발생하는 것처럼 황산화 에피토프에 대한 증강된 결합 능력을 보유한다는 결론을 지지한다.
예를 들어, scFv A3R 및 S15는 인간 및 기니 피크 혈소판에 대해 5-9배(Y1에 비해) 더 큰 결합 능력을 나타낸 반면, 이들 종에 대한 S11, S1 및 D1의 결합 능력은 Y1 보다 약 25배 더 컸다.
scFv, S11, S1 및 D1의 패널에 의해 결합된 비인간 혈소판의 종 어레이에 관하여, 각각은 개, 돼지 및 기니 피그로부터 유래한 혈소판에 결합하였다. S15는 개 유래의 혈소판(가장 높은 친화도), 기니 피그 유래의 혈소판 및 돼지 유래의 혈소판에 결합하였으나, 래빗, 마우스 또는 원숭이(배분 원숭이 및 사이노말로구스 원숭이) 유래의 혈소판에는 결합하지 않았다. 중요한 것은, 기니 피그는 상기 컨센서스 서열을 포함하는 모든 항체가 혈소판에 결합할 수 있는 것으로 확인된 유일한 비인간 종이었다.
혈소판 응집에 대한 효과
S1, S11 및 D1은 기니 피그 유래의 혈소판에 S15에 비해 훨씬 더 높은 치환도로 결합함에도 불구하고, 이들 모든 scFv는 혈소판 응집 억제에 관해서는 유사한 능력을 나타냈다.
기니 피그 혈소판 억제에 대한 scFv S15의 억제 효과(IC50 80-169 ㎍/ml)는 인간 유래의 혈소판에 대한 그의 억제 효과에 비해 약 8-10배 더 낮았다. 이는 기니 피그 유래의 혈소판에 대한 scFv S15 항체의 상대적으로 더 낮은 결합에 기인하는 것일 수 있다,
인간 및 개 유래의 혈소판에 대한 IgG1 S15 및 IgG Y1 항체의 결합은 유사한 것으로 확인되었다. 상기 두 항체는 같은 농도에서 인간 및 개 유래의 혈소판에서 혈소판 응집을 유도하였다.
기니 피그에서 scFv 의 약물동력학
기니 피그에서 scFv 항체의 약물동력학을 평가하기 위해, scFv A3R 10 mg/kg을 단일 환으로서 기니 피그에게 정맥내 투여하였다. 상이한 시점에서 기니 피그의 혈액내 A3R의 수준은 ELISA 분석으로 측정하였으며, 혈소판 결합된 scFv의 수준은 FACS 분석으로 측정하였다.
3마리의 암컷 기니 피그(체중 ~500 g)는 크실라진(20 mg/kg)과 혼합된 케타민(50 mg/kg)의 복강내 투여를 통해 마취시켰다. scFv A3R은 10 mg/kg(~5 mg/기니 피그)를 정맥내 환 주입하여 투여하였다. 혈액 샘플은 0시(항체 투여 전) 및 항체 투여 후 3분, 10분, 20분, 30분, 60분, 90분, 120분, 180분 및 360분에 수집하였다. 각각의 시점에서, 혈액 0.5 ml를 채취하였다. 3.8% 시트르산나트륨을 항응고제로 사용하였다. 혈액 샘플을 3000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 혈장을 얻고, -20℃에서 저장하고, PRP는 혈액 샘플을 150 x g에서 10분 동안 원심분리하여 얻었다. 혈소판 결합된 A3R scFv는 항-scFv PE-표지된 항체를 이용하여 FACS 분석에 의해 기니 피그 PRP 내에서 테스트하였다. 혈장 scFv A3R 항체 농도는 특이적 ELISA로 분석하였다.
FACS 분석을 이용하여 환 투여후 상이한 시점에서 기니 피그 혈소판에 대한 결합된 scFv-A3R 항체의 수준을 평가하였다. 그 결과(도 19)로부터 확인할 수 있는 바와 같이, scFv-A3R 10 mg/kg의 환 투여후 10분에 혈소판에 결합된 scFv의 수준은 최대 수준의 40-80%였으며, 120분후에 최대 수준에 이르렀다. 혈소판에 대한 scFv-A3R 항체의 결합은 360분(6시간) 동안 높은 상태를 유지하였으며, 환 투여후 24시간에 이르러 90% 감소되었다.
A3R-scFv의 혈장 수준은 Tyr-276(1 μM/웰)의 황산화 티로신을 보유하는 GPIb 펩티드로 코팅된 플레이트를 이용하는 ELISA로 측정하였다. 결합된 scFv는 래빗 항-VL(가변 경쇄) 항체 투여, 이어서 항-래빗 HRP(시그마) 및 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(TMB)(미주리 세인트루이스 소재의 시그마) 기질 첨가에 의해 검출하였다. 발현된 색의 강도는 ELISA 플레이트 리더(잘츠부르크 소재의 안토스)로 OD450에서 판독하였다. 각각의 샘플 내에서 scFv의 혈장 농도는 공지된 양의 이들 항체를 기니 피그 혈장에 투여하거나, 또는 0.05% 트윈 20 및 2% 스킴 밀크를 함유하는 PBS에 첨가함으로써 구성된 표준 곡선으로부터 계산하였다.
결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, scFv A3R의 혈장 농도는 환 주입후 3분에 피크에 이르렀고, 이후 6시간에 걸쳐 점진적으로 감소하였다(도 20). 기니 피그 내에서 A3R의 반감기는 139±9분이었다.
요약하면, 상기 연구는 표적 혈소판에 대한 포화 수준의 신속한 성취 및 상대적으로 긴 반감기에 기초하여 A3R이 바람직한 약물동력학 프로필을 보유한다는 예비적인 정보를 제공한다.
실시예 9
BIA코어 바이오센서는 표면 플라스몬 공명 검출을 사용하며, 2 개의 상호작용 종의 실시간 역학 분석을 가능케 한다. 이러한 시스템은 혈소판 GPIb로부터 유도된 폴리펩티드인 글리코칼리신으로의 scFvs Y1, A3R 및 S15의 결합 역학을 측정하는데 사용한다.
글리코칼리신에 대한 항체의 결합 친화도는 BIA코어 3000 장치 (BIA코어, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 측정한다. 글리코칼리신 (고정된 리간드)는 20 ㎕ 분-1의 유속으로 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.6중의 CM5 칩 (BIA코어)에 공유 고정된다. 모든 결합 실험은 0.005% (v/v)의 비이온성 세제, P20 (폴리옥시에틸렌 소르비탄)을 포함하는 HBS 완충액, pH 7.4 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA)중에서 실시하였다. 글리코칼리신에 대한 항체의 결합 친화도 (KD)는 평균 Ka (결합율) 및 Kd (해리율) 역학으로부터 BIA이밸류에이션 3.1 소프트웨어 (BIA코어)를 사용하여 측정하였다.
A3R-scFv는 더욱 빠른 결합율에 의하여 나타난 바와 같이 Y1-scFv (~7배)보다 더 큰 친화도를 갖는 혈소판 글리코칼리신에 결합한다 (표 11). 이러한 결과는 무상해 혈소판상에서의 FACS 분석에 의하여 얻은 결과에 따른다. S15-scFv는 또한 Y1-scFv보다 친화도가 더 높으나 A3R보다는 낮은 글리코칼리신에 결합한다.
고정 리간드 분석물 겉보기 Ka (μ-1s-1) 겉보기 Kd (s-1) KD (M)
글리코칼리신 Y1-scFv 2.7×105 1.2×10-1 4.5×10-7
글리코칼리신 A3R-scFv 1.99×106 1.3×10-1 6.7×10-8
글리코칼리신 S15-scFv 2.4×106 4.3×10-1 1.8×10-7
실시예 10
본 실시예는 티로신 잔기에서 황산화를 거친 PSGL-1, GPIb 및 CCR5의 부위에 기초한 합성 펩티드에 대한 공통 서열을 포함하는 항체의 직접 결합을 설명한다.
사용한 합성 펩티드는 하기와 같다.
PSGL -1 ( 잔기 42-58) 유도됨
QATEYEYLDYDFLPETE (비황산화) 서열 번호: 26
QATEYS EYLDYDFLPETE (첫번째 티로신 위치에서 황산화) 서열 번호: 48
QATEYEYS LDYDFLPETE (두번째 티로신 위치에서 황산화) 서열 번호: 49
QATEYEYLDYS DFLPETE (세번째 티로신 위치에서 황산화) 서열 번호: 7
GPIb ( 잔기 268-285) 유도됨
GDEGDTDLYDYYPEEDTE (비황산화) 서열 번호: 43
GDEGDTDLYS DYYPEEDTE (첫번째 티로신 위치에서 황산화) 서열 번호: 44
GDEGDTDLYDYYS PEEDTE (세번째 티로신 위치에서 황산화) 서열 번호: 50
CCR5 ( 잔기 1-18) 유도됨
MDYQVSSPIYDINYYTSE (비황산화) 서열 번호: 51
MDYS QVSSPIYDINYYTSE (첫번째 티로신 위치에서 황산화) 서열 번호: 52
MDYQVSSPIYS DINYYTSE (두번째 티로신 위치에서 황산화) 서열 번호: 53
MDYQVSSPIYDINYS YTSE (세번째 티로신 위치에서 황산화) 서열 번호: 54
사용한 scFvs는 N06 (음성 대조군, Y1 (P03), S15, S11, S1, S9, s.c.3.1 및 S11이다.
각종 황산화 및 비황산화 펩티드는 30 분동안 실온에서 설포-NHS (3.48 ㎎/㎖) 및 EDC (3.07 ㎎/㎖)를 사용한 평판의 전처리에 이어서 NH CovaLink (상표명) 미량역가 평판 (Nunc, 덴마크)에 유착시킨 후, 물로 1회 세정하고, 0.05% Tween을 포함하는 PBS로 3회 세정하였다. 평판을 실온에서 1 시간 동안 약하게 교반하면서 5% 탈지유 및 0.05% Tween을 포함하는 PBS 완충액으로 블로킹시켰다. 합성 펩티드(웰당 100 μM)를 첨가하고, 0.05% Tween을 포함하는 PBS 완충액으로 5회 세정하고, 평판을 실온에서 건조시켰다. 결합에 대하여, 단백질-A 정제된 scFv 항체 (0.5 ㎍/웰)를 실온에서 1 시간 동안 배양을 위하여 평판에 첨가하였다. ELISA의 경우, 블로킹 완충액중의 토끼 항-사람 VL 폴리클로날 항체 (항-scFv)를 25℃에서 60 분 동안 배양을 위하여 평판에 첨가하였다. 과량의 항-scFv를 0.05% Tween을 포함하는 PBS 완충액으로 5회 세정하여 제거하였다. 블로킹 완충액중의 염소 항-토끼 HRP-표지된 항체를 1 시간 동안 실온에서 배양을 위하여 첨가하고, 과량을 10 회 세정에 의하여 제거하였다. TMB 현상제를 5 분간 첨가하고, 0.5M H2SO4 (100 ㎕/웰)로 중화시켰다. 450 ㎚ 파장에서 ELISA 평판 판독기에 의하여 색상 반응을 판독하였다. 각각의 샘플을 2중으로 분석하고, 평균치를 계산하였다.
Figure 112005078607456-PCT00004
표 12 및 도 21은 세번째 티로신 위치에서 황산화된 PSGL-1 유도된 펩티드에 대하여서는 유의적으로 결합되지만 첫번째 또는 두번째 티로신 위치에서 황산화된 것에 대하여서는 그러하지 아니한 공동 서열을 포함하는 모든 scFv 항체를 테스트한 것을 나타낸다. 단일쇄 항체 S1, S9 및 3.1은 세번째 티로신 위치에서 황산화된 PSGL-1 유도된 펩티드에 가장 강하게 결합하는 것으로 나타났다. 이러한 항체는 또한 첫번째 티로신 위치에서 황산화된 GPIb 유도된 펩티드에 결합하며, scFvs S1, S9 및 3.1은 가장 강한 결합을 나타내며, scFvs S15 및 S11은 세번째 티로신 위치에서 황산화된 GPIb 유도된 펩티드에 중간 정도로 결합하는 것으로 나타났다. 첫번째 또는 세번째 티로신에서 황산화된 것이 아닌 두번째 티로신 위치에서 황산화된 CCR5 유도된 펩티드에 대한 항체의 유의적인 결합이 관찰되었다. 단일쇄 항체 S11는 두번째 티로신 위치에서 황산화된 CCR5 유도된 펩티드에 대한 결합이 가장 강한 것으로 나타났다. 대조 항체 scFv는 결합하지 않는 것으로 관찰되었다.
두번째 티로신 위치에서 황산화된 CCR5 유도된 펩티드를 사용하여 얻은 결과는 적어도 scFv S11 및 가능하게는 기타의 공통 서열을 포함하는 항체가 사람 세포에서 HIV 면역성의 억제제로서 잠재성이 있다는 것을 시사한다.
실시예 11
본 발명의 공통 서열을 포함하는 IgG 항체가 표적 세포, 특히 환자 샘플로부터 유래한 B-CLL 세포의 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 매개할 수 있다는 것을 예시하기 위하여 실험을 실시하였다. 또한, 2차 항-사람 Fc 항체로 S15-IgG를 과교차결합시키는 것은 세포사멸 메카니즘이 세포 괴사에 기여한다는 것을 예시한다.
항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 실험은 하기와 같다.
단핵 작동체 및 표적 세포를 FICOLL (등록상표)상에서 분리하고, 표적 세포를 PKH26로 표지하고, 이를 세포막의 지질 부위내에서 형광 염료를 안정하게 혼입하였다. 그후, 세포를 세정하고, 다양한 농도의 S15 IgG 또는 대조 항체의 존재 또는 부재하에서 24 시간 동안 다양한 작동체:표적 (E:T) 비율로 작동체 세포로 표지화시킨다. 죽은 세포를 TOPRO(등록상표) (몰레큘라 프로브, 인코포레이티드, 미국 오리건주 유진)로 염색시키고, 게이팅된 표적 세포상에서 FACS로 분석하였다.
건강한 제공자로부터의 단핵 작동체 세포 및 3 명의 환자로부터의 B-CLL 표적 세포를 S15 IgG의 존재 또는 부재하에 24 시간 동안 다양한 E:T 비율로 동시배양한 후, FACS 분석을 실시하였다. 도 22B는 대조예와 비교하여 30-50% ADCC를 갖는 3 개의 샘플 모두에서의 S15 IgG 매개된 작동체 세포 세포 독성을 예시한다.
S15-IgG ADCC는 천연 킬러 및 단핵세포에 의하여 매개된다. 작동체 세포는 B-CLL 세포의 S15 IgG-매개된 ADCC를 작동시킬 수 있는 능력에 대하여 분석하였다. 정상의 제공자 및 B-CLL 환자로부터의 천연 킬러 (CD56+) 및 단핵세포 (CD14+) 세포를 시판중인 자기 비이드를 사용하여 분리하였다. 도 23은 천연 제공자 및 B-CLL 환자로부터의 NK 세포가 ADCC를 작동시킬 수 있으며, 그리하여 각각 약 50% 및 35% 사멸을 나타내는 것으로 도시되어 있다. 정상 제공자 및 B-CLL 환자 모두로부터의 단핵세포는 ADCC (약 5-13%)를 작동시킬 수 있다. 그러나, CD56+ NK 세포는 B-CLL 세포의 S15 IgG 매개된 ADCC의 더욱 유의적인 작동체 세포 모집단을 구성한다.
세포사멸 실험은 하기와 같다. B-CLL 환자로부터의 단핵 세포를 FICOLL(등록상표)상에서 분리하고, 세포를 S15 IgG 또는 대조 항체의 존재 또는 부재하에 10 분간 37℃에서 배양하였다. 항-사람 Fc 항체를 첨가하고, 4∼24 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 병든 세포 (CD19+, CD5+)를 세포사멸 마커인 Annexin 및 TOPOS로 염색시키고, 이를 FACS로 분석하였다.
S15-IgG 유도된 세포사멸. FACS 분석에 의하면, S15-IgG의 존재하에서 배양된 B-CLL 환자로부터의 단핵세포 (CD19+, CD5+)는 5 시간 동안 약 10% 세포사멸을 나타낸다는 것을 알 수 있다. (도 24). S15-IgG를 가교시키는 2차 항체의 첨가는 5 시간 이내에 추가의 50%의 세포사멸을 규명한다. (도 24).
이는 PSGL-1상에서의 황산화 에피토프가 유도된 항체의 가교가 1차 B-CLL 세포의 세포사멸에 대한 시그날을 유발한다는 것을 강력하게 입증한다. 이는 PSGL1이 B-CLL 환자에서의 생체내 세포사멸을 유도하기 위한 표적이 될 수 있다는 것을 함축하며, 여기서 가교 효과는 Fc 수용체 함유 세포, 즉 단핵세포, CD56+ NK-세포 및 γδ+ T-세포에 의하여 매개될 수 있다.
S15-IgG와는 반대로, B-CLL를 포함한 다양한 림프양 악성종양의 치료에 광범위하게 사용되는 인간화 항체 Rituximab는 교차시 세포사멸의 증가가 없는 것으로 나타났다. (도 25).
S15-IgG에 대하여 전술한 바와 같은 세포사멸 및 교차 효과는 PSGL-1에 대하여 유도된 쥐 항체 KPL1을 사용하여 억제할 수 있으며, 그 자체에서는 세포사멸을 유도하지 않는다 (데이타가 제시되지 않음). 이는 세포사멸 시그날이 PSGL-1상에서의 에피토프를 통하여 매개된다는 것을 확인할 수 있다.
또한, FACS 분석은 S15 IgG이 정상의 B-세포에 결합되는 이의 가장자리와는 반대로, 테스트한 모든 B-CLL에 결합된다는 것을 나타낸다. 종합해 보면, 이러한 결과는 S15-IgG가 B-CLL의 치료에서의 치료제로서 유망하다는 것을 암시하는데, 이는 세포독성 및 세포사멸 효과가 이들 병든 세포에서 발현되는 PSGL-1 황산화 에피토프의 특이적 인지에 의하여 매개되는 것으로 보이기 때문이다.
실시예 8
무기 화합물 라이브러리의 스크리닝
특이성 수용체 (단백질)로부터 유래한 합성 황산화 펩티드 (펩티드 서열의 공지의 아미노산내에서의 소정의 특이성 티로신 잔기에서의 황산화)는 카프로산과 같은 단쇄 링커에 의하여 합성 펩티드에 커플링된 비오틴 택 (비오티닐화됨)으로 제조될 수 있다. 동일한 합성 펩티드를 사용한 대조 펩티드는 황산화 없이 그리고 비오틴 택 ("B") 없이 제조될 수 있다. 또한, 기타의 무관한 단백질로부터 유래한 합성 황산화 펩티드는 추가의 대조예로서 비오틴 택 ("C") 없이 제조될 수 있다.
상기 비오티닐화된 펩티드 ("A")는 스트렙타비딘 코팅된 자기 비이드 및 과도한 미결합 비오티닐화된 펩티드에 결합된 후, 이를 세정할 수 있다. 비오틴-스트레타비딘 펩티드 콘쥬게이트 ("D")는 생리학적 조건 (37℃, pH 7.0-7.4, 염 농도, 전도율 등)하에서 "A"에 결합되는 분자에 대하여 상당한 과량의 비황산화 대조 펩티드 ("B")의 존재하에 작은 화학 물질 라이브러리에 대하여 스크리닝할 수 있다. 커플링된 자기 비이드는 완충액으로 2회 세정하고, 매회 원심분리하여 과량의 미결합 분자를 제거하였다. 자기 비이드 ("E")에 결합된 분자를 규명하고, 화학적으로 확인하고, 추가의 스크리닝을 위하여 더 많은 양으로 제조할 수 있다.
선택한 화합물 ("E")에 의하여 비오티닐화된 황산화 펩티드로의 결합의 확인은 추가의 스크리닝 절차에 의하여 실시될 수 있다. 이러한 방법은 비오티닐화된 무관한 황산화 펩티드와의 경쟁 (방법 1) 또는, 비오티닐화된 펩티드, "A"에 특이적으로 결합된 항체 또는 이의 단편 (예, scFv)과의 경쟁 (방법 2)을 포함한다.
무관한 비오티닐화된 황산화 펩티드와의 경쟁에 의한 재스크리닝 (방법 1).
화합물이 "A"에 특이적으로 결합되는 것을 입증하기 위하여, 2차 스크리닝을 실시할 수 있다. 비오틴-스트렙타비딘 펩티드 콘쥬게이트 ("D")는 상당히 과량의 무관한 비오티닐화된 황산화 펩티드, "C"의 존재하에서, 선택한 화합물 "E"를 사용하여 재스크리닝할 수 있다. 그후, 시험관을 원심분리하고, 비오틴-스트렙타비딘 펩티드 콘쥬게이트 커플링된 자기 비이드를 완충액으로 2회 세정하고, 매회 원심분리하여 과량의 미결합 분자를 제거하였다. 자기 비이드에 결합된 화합물은 화합물 확인을 위하여 용출시킬 수 있다. 더 많은 양의 화합물을 추가의 실험, 예를 들면 "A"로의 선택적 결합의 증명 및 시험관내 및 생체내 효능 테스트를 위하여 제조할 수 있다.
특이성 scFv 항-황산화 항체와의 경쟁에 의한 재스크리닝 (방법 2)은 하기와 같다. 특이적으로 인식되며 "A"에 결합되는 상당히 과량의 특이적 scFv 항체의 존재하에서 선택된 화합물 "E" 각각에 비오틴-스트렙타비딘 펩티드 콘쥬게이트 ("D")의 결합을 경쟁시킴으로써 "A"에 대한 바람직한 결합 친화력을 갖는 화합물을 재스크리닝할 수 있다. scFv 항체에 의한 "A"로의 결합으로부터 특이적으로 억제되는 화합물은 추가의 실험, 예를 들면 "A"로의 선택적 결합의 증명 및 시험관내 및 생체내 효능 테스트를 위하여 제조할 수 있다.
상기의 설명 및 실시예는 본 발명의 예시를 위하여서만 제시한 것이며, 이를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 정신 및 물질을 포함한 개시된 구체예의 변형이 당업자에 의하여 이루어질 수 있기 때문에, 본 발명은 첨부한 청구의 범위 및 이의 균등예의 범위내의 모든 것을 포괄하는 것으로 이해하여야 한다.
(서열목록)
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Figure 112005078607456-PCT00006
Figure 112005078607456-PCT00007
Figure 112005078607456-PCT00008
Figure 112005078607456-PCT00009
Figure 112005078607456-PCT00010

Claims (78)

  1. 하기의 컨센서스 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편:
    X1-X2-X3-Pro-X5-X6
    (여기서, X1 및 X6는 소수성 아미노산이고 X2, X3 및 X5는 임의의 아미노산임).
  2. 제1항에 있어서, 소수성 아미노산은 루신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌, 및 이소루신으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항에 있어서, X2는 염기성 아미노산인 항체 또는 이의 단편.
  4. 제3항에 있어서, 염기성 아미노산은 아르기닌 및 라이신으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항체 또는 이의 단편.
  5. 제1항에 있어서, X2 및 X3는 아르기닌인 항체 또는 이의 단편.
  6. 제1항에 있어서, X6는 이소루신인 항체 또는 이의 단편.
  7. 제1항에 있어서, X1은 루신 및 메티오닌으로 이루어진 군 중에서 선택되고 X5는 세린 및 발린으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항체 또는 이의 단편.
  8. 제1항에 있어서, 컨센서스 서열은 항체 또는 이의 단편의 과가변 부위 내에 존재하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  9. 제1항에 있어서, 상보성 결정 부위(CDR)는 컨센서스 서열의 적어도 일부를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  10. 제9항에 있어서, CDR은 중쇄의 항체 또는 이의 단편인 것인 항체 또는 이의 단편.
  11. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 9, 10, 13, 14 28 및 31로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  12. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 17 및 서열 번호 18로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  13. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 9, 10, 13, 14, 28 및 31로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 중쇄 상보성 결정 부위(CDR); 아미노산 서열 번호 17을 포함하는 제2 중쇄 CDR 및 아미노산 서열 번호 18을 포함하는 제3 중쇄 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  14. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 5, 6, 55, 56, 60 및 61로 이루어진 군 중에서 선택된 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  15. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 PSGL-1, GPIb 및/또는 CCR5의 황산화된 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  16. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 2 이상의 에피토프와 교차 반응하고, 각각의 에피토프는 하나 이상의 황산화된 티로신 잔기를 가지는 것인 항체 또는 이의 단편.
  17. 제15항에 있어서, 각각의 에피토프는 2 이상의 산성 아미노산의 클러스터 하나 이상을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  18. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 α-2 안티플라스민; 아미노펩티다제 B; CC 케모카인 수용체; 7개의 경막 세그먼트(7TMS) 수용체; 응고 인자 V, VII, 및 IX; 섬유소원 감마쇄; 헤파린 보조 인자 II; 세크레토그라닌 I 및 II; 비트로넥틴(vitronectin), 아미오이드(amyoid) 전구체, α-2-항플라스민; 콜레시스토키닌; α-융모생식샘자극호르몬; 보체 C4; 데마틴 술파테프로테오글리칸(sulfateproteoglycan); 섬유결합소; 및 카스트린(castrin)으로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질 상에 존재하는 하나 이상의 위치에서 황산화된 하나 이상의 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  19. 제18항에 있어서, CC-케모카인 수용체는 CCR2, CCR5, CCR3, CXCR3, CXCR4, CCR8, 및 CCR2b로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 항체 또는 이의 단편.
  20. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 프리-B-ALL 세포, CLL 세포, 다발성 골수종 세포, 전이 세포, T-ALL 세포, AML 세포, 혈소판, 과립구, 림프구 및 단핵구로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유형의 세포 상의 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  21. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 혈소판 응고에 결합하여 이를 억제하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  22. 제21항에 있어서, 항체 또는 이의 단편 서열 번호 9, 10, 28 및 31의 적어도 일부를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  23. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 지질, 탄수화물, 펩티드, 당지질, 당단백질, 지단백질 및/또는 지다당류 분자 상의 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  24. 제1항의 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제1항의 항체 또는 이의 단편 및 영상화제를 포함하는 진단, 예후 판정 또는 병기 결정 키트.
  26. 제1항의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 단리되거나 정제된 DNA 서열.
  27. 제24항의 단리되거나 정제된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
  28. 제27항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, 재조합 숙주 세포는 항체 또는 이의 단편을 발현하는 것인 재조합 숙주 세포 또는 이의 자손 세포.
  30. 항체 또는 이의 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 제28항의 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체 또는 이의 단편의 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서, 재조합 숙주 세포 또는 재조합 숙주 세포의 배지로부터 항체 또는 이의 단편을 단리하거나 정제하는 것을 더 포함하는 방법.
  32. 하기의 컨센서스 서열을 포함하는 폴리펩티드:
    X1-X2-X3-Pro-X5-X6
    (여기서, X1 및 X6는 소수성 아미노산이고 X2, X3 및 X5는 임의의 아미노산임).
  33. 제32항에 있어서, 폴리펩티드는 실질적으로 원형 또는 루프형인 것인 폴리펩티드.
  34. 제32항에 있어서, 폴리펩티드는 황산화된 PSGL-1, GPIb 및/또는 CCR5이고, 폴리펩티드는 서열 번호 5, 6, 55, 56, 60 또는 61의 항체 또는 이의 단편의 친화도와 실질적으로 유사한 친화도로 결합하는 것인 폴리펩티드.
  35. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 질병의 치료 방법.
  36. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 세포 회전의 치료 방법.
  37. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 감염 치료 방법.
  38. 제37항에 있어서, 감염은 HIV에 의해 유발되는 것인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 투여는 HIV의 세포 진입을 방지하는 것인 방법.
  40. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 염증 치료 방법.
  41. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 자가 면역 질환의 억제 방법.
  42. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 전이의 억제 방법.
  43. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양세포의 증식 및/또는 복제의 억제 방법.
  44. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포의 사멸률을 증가시키는 방법.
  45. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 백혈병 세포의 증식 및/또는 복제의 억제 방법.
  46. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 백혈병 세포의 사멸률을 증가시키는 방법.
  47. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, B-CLL 세포의 증식 및/또는 복제의 억제 방법.
  48. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 백혈병 세포의 사멸률을 증가시키는 방법.
  49. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 항질병제에 의한 손상에 대해 질병 세포의 감수성을 변화시키는 방법.
  50. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 항암제에 의한 손상에 대해 종양 세포의 감수성을 증가시키는 방법.
  51. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 항백혈병제에 의한 손상에 대해 백혈병 세포의 감수성을 증가시키는 방법.
  52. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 항백형병제에 의한 손상에 대해 B-CLL 세포의 감수성을 증가시키는 방법.
  53. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈소판 응집의 억제 방법.
  54. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 재협착의 억제 방법.
  55. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, ADCC는 자연 킬러(NK) 또는 단핵세포를 포함하는 효과기 세포에 의해 매개되는 것인 방법.
  57. 제24항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 백혈병 세포에서의 세포 자멸을 유발하는 방법.
  58. 제24항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 자연 킬러(NK) 세포 또는 T 세포를 자극하는 방법.
  59. 질병 치료를 위한 약제 제조에 있어서 제24항의 약학 조성물의 용도.
  60. 환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및
    제1항의 항체 또는 이의 단편이 환자의 세포에 결합하는지를 결정함으로써, 그 환자가 질병 위험이 있는지 또는 질병을 보유하고 있는지를 나타내는 단계
    를 포함하는, 환자의 질병을 진단, 예후 결정 또는 병기 결정하는 방법.
  61. 환자 유래의 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 및
    환자 유래의 세포와 제1항의 항체 또는 이의 단편을 항온처리하는 단계
    를 포함하는, 환자로부터 종양 세포를 제거하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 퍼지는 체외에서 이루어지는 것인 방법.
  63. (a) 파지 디스플레이 라이브러리를 제공하는 단계;
    (b) 서열 번호 7, 44, 및 53으로 이루어진 군 중에서 선택된 펩티드를 제공하는 단계;
    (c) 서열 번호 7, 44, 50 및 53으로 이루어진 군 중에서 선택된 펩티드에 결합하는 scFv 항체 또는 이의 단편을 선별하기 위하여 상기 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝(panning)하는 단계; 및
    (d) 선별된 scFv 항체 또는 이의 단편을 제조하는 단계
    를 포함하는, 항체 또는 이의 단편의 선별 방법.
  64. 제63항에 있어서, 선별된 scFv 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 7, 44, 및 53으로 이루어진 군 중에서 선택된 펩티드와 결합하는 것인 방법.
  65. 제63항에 있어서, 펩티드는 고정되는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 단계 (c)는
    서열 번호 26, 43, 44, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 57, 58, 및 59로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 가용성 펩티드의 존재 하에 패닝하는 단계를 더 포 함하는 것인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 선별된 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 26, 48, 또는 49에 결합하지 않는 것인 방법.
  68. 제65항에 있어서, 선별된 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 43에 결합하지 않는 것인 방법.
  69. 제65항에 있어서, 선별된 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 51, 52, 또는 54에 결합하지 않는 것인 방법.
  70. 제63항의 방법에 따라 제조된 항체 또는 이의 단편.
  71. 상보성 결합에 대한 가변 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 결합 부위의 라이브러리로서, 상기 라이브러리는 오로지 중쇄 CDR3에서 가변성을 가지는 것인 라이브러리.
  72. 제71항에 있어서, 면역글로불린 결합 부위는 scFv 분자인 것인 라이브러리.
  73. 제71항에 있어서, 면역글로불린 결합 부위는 DP32 유래의 중쇄 상보성 결정 부위(CDR) 1 및 2를 포함하는 것인 라이브러리.
  74. 제71항에 있어서, 면역글로불린 결합 부위는 DP32 유래의 경쇄 가변 부위를 포함하는 것인 라이브러리.
  75. 제71항에 있어서, 면역글로불린 결합 부위는 필라멘트형 박테리오파지 입자의 표면 상에 표시되는 것인 라이브러리.
  76. 제71항의 라이브러리를 제공하는 단계;
    항원 결합 부위에 결합하는 황산화 에피토프에 대한 라이브러리를 패닝하는 단계; 및
    황산화된 에피토프를 단리하는 단계
    를 포함하는 황산화된 에피토프에 대한 선별 방법.
  77. 작은 무기 분자로서, PSGL-1, GPIb, 및/또는 CCR5의 황산화된 에피토프에 결합하는 것인 작은 무기 분자.
  78. 제77항의 작은 무기 분자를 포함하는 약학 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1714978A1 (en) * 2005-04-19 2006-10-25 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Peptides useful for diagnosis and therapy of tumors
WO2007067983A2 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Wyeth Sulfotyrosine specific antibodies and uses therefor
EP2161072A1 (en) * 2008-09-03 2010-03-10 Gambro Lundia AB High cut-off hemodialysis membranes for the treatment of chronic hemodialysis patients
EP2246364A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-03 Pierre Fabre Médicament Anti CXCR4 antibodies for the treatment of HIV
EP2371863A1 (en) * 2010-03-30 2011-10-05 Pierre Fabre Médicament Humanized anti CXCR4 antibodies for the treatment of cancer
HUE041900T2 (hu) * 2012-01-20 2019-06-28 Genzyme Corp Anti-CXCR3 ellenanyagok
JP7240808B2 (ja) * 2014-07-08 2023-03-16 サンフォード バーナム プレビーズ メディカル ディスカバリー インスティテュート Ｐｓｇｌ－１モジュレーターおよびその使用
CA3010601A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 Bioalliance C.V. Tetravalent anti-psgl-1 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002529054A (ja) * 1998-10-30 2002-09-10 エル．ミラー ジョナサン ヒト血小板糖タンパク質ｉｂアルファに対する抗体の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域
EP1406930A4 (en) * 2000-12-29 2007-01-10 Savient Pharmaceuticals Inc "ISOLATED MOLECULES WITH SULFATED GROUPING CONTAINING EPITOPES, ANTIBODIES AGAINST SUCH EPITOPES AND USES THEREOF"

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