CN101300021A - 抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗体或者其片段，所述抗体或者其片段结合癌细胞并且对于诸如细胞滚动和转移的生理现象是重要的。还提供了使用此类抗体或其片段的治疗和诊断方法和组合物。根据本发明的方法和组合物可以用于导向治疗剂和疾病的诊断、预后和分期以及治疗中，所述疾病如癌症，包括肿瘤生长和转移、白血病、自身免疫病和炎性疾病。还提供了免疫球蛋白结合结构域文库，所述结构域具有用于互补结合的多样的抗原结合结构域，其中所述文库仅在重链CDR3中具有多样性。

Description

抗体及其用途
发明领域
本发明涉及结合特定表位的抗体，所述表位存在于细胞，如癌细胞、转移细胞、白血病细胞、白细胞和血小板上并且对于诸如细胞滚动(cell rolling)、转移、炎症和自身免疫病的多种生理现象是重要的。更具体地，所述抗体具有抗癌活性、抗转移活性、抗白血病活性、抗病毒活性、抗感染活性，和/或针对其他疾病的活性，所述其他疾病例如炎性疾病、自身免疫病、HIV感染、心血管病，如心肌梗死、视网膜病，和由依赖硫酸化酪氨酸的蛋白质-蛋白质相互作用导致的疾病。此外，本发明的抗体可以用作靶向剂以将治疗剂导向身体内的特定细胞或者部位。
发明背景
抗体、噬菌体展示和组织导向
治疗剂的组织选择性导向是制药业中正在兴起的学科。已经设计了基于导向的新的癌症治疗用以增加治疗的特异性和效力同时减小毒性，从而增强总的功效。针对肿瘤相关抗原的小鼠单克隆抗体(MAb)已经尝试用于将毒素、放射性核素和化学治疗缀合物导向肿瘤。此外，分化抗原，如CD19、CD20、CD22和CD25已经用作治疗造血恶性肿瘤中的癌特异性靶。
尽管进行了广泛研究，但是该方法仍然具有若干局限。一个局限是难以分离展示选择性结合的适宜的MAb。第二个局限是需要高抗体免疫原性作为成功的抗体分离的前提条件。第三个局限是终产物具有非人序列，其诱导免疫应答；例如，当对人给予小鼠MAb时，将产生人抗小鼠抗体(HAMA)应答。HAMA应答通常导致更短的血清半衰期和妨碍重复治疗，从而降低了抗体的治疗价值。该后一种局限已经激起了在工程改造鼠来源的嵌合或者人源化单克隆抗体和发现人抗体方面的兴趣。该方法的另一个局限是只能够分离仅针对已知和纯化抗原的一种抗体种类。而且，该方法到目前为止还不是选择性的，因为该方法使得能够分离针对存在于正常细胞以及恶性细胞上的细胞表面标记的抗体。
存在许多因素影响用于治疗癌症的MAb的治疗功效。这些因素包括肿瘤细胞上抗原表达的特异性和水平、抗原异质性和肿瘤块的可及性。白血病和淋巴瘤通常比实体瘤，如癌对抗体的治疗更具响应性。MAb快速结合血流中的白血病和淋巴瘤细胞并且容易穿透淋巴组织中的恶性细胞，从而使得淋巴肿瘤是基于MAb的治疗的极好的候选者。理想的系统需要鉴定识别产生恶性后代细胞的干细胞的细胞表面上的标记的MAb。
噬菌体文库用于选择结合分离的、预定的靶蛋白质，如抗体、激素和受体的随机单链可变片段(scFv)。此外，通常抗体展示文库，尤其是噬菌体scFv文库的使用促进了发现导向特异的、还未认识的和未确定的细胞表面部分的独特分子的备选方法。
白血病、淋巴瘤和骨髓瘤是来源于骨髓和淋巴组织并且参与细胞的不受控制的生长的癌。急性成淋巴细胞性白血病(ALL)是由特定临床和免疫学特征定义的异质性疾病。与ALL的其他形式类似，B细胞ALL(B-ALL)的大多数病例的确定原因还是未知的；尽管在许多病例中，该疾病由单个细胞DNA中的获得性遗传改变引起，所述遗传改变导致异常和连续增殖。在儿童和成年人中，患有B-ALL的患者的预后比其他白血病患者的更严重。慢性淋巴细胞性白血病(CLL)是白血病的缓慢发展形式，其特征是淋巴细胞数目增加。急性髓细胞性白血病(AML)是赘生物的异质组，其中祖细胞在正常条件下产生髓细胞系的终末分化的细胞(红细胞、粒细胞、单核细胞和血小板)。与其他形式的瘤形成一样，AML与获得性遗传改变有关，所述遗传改变导致正常分化的髓样细胞被相对不分化的母细胞代替，从而显示出一种或多种类型的早期骨髓分化。AML通常在骨髓中发展，且较低程度地在次级造血器官中发展。AML主要侵袭成年人，在15-40岁的发病率达到峰值，但是还已知AML侵袭儿童和老人。几乎所有AML患者都需要诊断后立即治疗以实现临床减轻，其中没有证据表明循环的未分化的母细胞的异常水平。
迄今，已经开发了诱导针对肿瘤细胞的细胞溶解活性的多种MAb。针对HER2的胞外结构域(P185)产生了鼠MAb  muMab4D5，并且发现其显著抑制超表达HER2的人肿瘤细胞的增殖，已经将muMab4D5人源化以产生药物
Figure A20048002491400101
(司徒曼布)，其得到FDA批准并且当前用于治疗人乳腺癌(美国专利号5,821,337和5,720,954)。结合后，所述抗体能够抑制依赖HER2生长因子受体的肿瘤细胞的生长。此外，FDA最近批准了针对CD20的嵌合抗体
Figure A20048002491400102
(利妥希玛)，其导致外周B细胞(包括与淋巴瘤相关的外周B细胞)的快速耗竭(美国专利号5,843,439)。该抗体对靶细胞的结合导致依赖补体的裂解。该产品当前已经被批准并且当前用于临床治疗低级B细胞非何杰金淋巴瘤。
一些其他人源化和嵌合抗体正处于开发或者临床试验中。此外，将与在正常髓样细胞以及大多数类型髓样白血病细胞上表达的CD33抗原特异反应的人源化免疫球蛋白(Ig)，缀合到抗癌药物加利车霉素CMA-676(Sievers等人，Blood Supp.308：504a(1997))。该缀合物称作药物
Figure A20048002491400103
，最近已经得到FDA批准(Caron等人，Cancer Supp.73：1049-56(1994))。考虑到细胞溶解活性，将当前临床试验的另一种抗-CD33抗体(HumM195)缀合到几种细胞毒性剂，包括白树毒素(McGraw等人，Cancer Immunol.Immunother.39：367-74(1994))和放射性同位素131I(Caron等人，Blood83：1760-68(1994))、90Y(Jurcic等人，Blood Supp.92：613a(1998))和213Bi(Humm等人，Blood Supplement 38：231P(1997))。
抗白细胞抗原CD45的嵌合抗体(cHuLym3)在临床研究中用于治疗人白血病和淋巴瘤(Sun等人，Cancer Immunol.Immunother.48：595-602(2000))。在体外测定中，在ADCC(依赖抗体的细胞介导细胞毒性)测定中观察到特异细胞溶解(Henkart，Immunity 1：343-46(1994)；Squier和Cohen，Current Opin.Immunol.6：447-52(1994))。
已经将治疗性抗体专门改造以使得对它们的靶有更高亲和力、更稳定和最佳的生物分布。见，例如，Presta，Current Pharma.Biotechnol.，3：237-56(2002)；Presta等人，Biochem.SocietyTransactions，30(4)：487-90(2002)。
与小鼠单克隆人源化和嵌合抗体的构建相比，使用噬菌体展示技术使得可以分离具有完整人序列的scFv。最近开发了基于来自噬菌体展示技术的scFv克隆的针对人TGFα-2受体的完全人抗体。该scFv被转化成能够竞争结合TGFα-2的完全人IgG4(Thompson等人，J.Immunol.Meth.227：17-29(1999))，其具有强的抗增殖活性。本领域技术人员已知的噬菌体展示技术在下面的出版物中更具体地描述：Smith，Science 228：1315(1985)；Scott等人，Science249：386-90(1990)；Cwirla等人，PNAS 87：6378-82(1990)；Devlin等人，Science 249：404-06(1990)；Griffiths等人，EMBO J.13(14)：3245-60(1994)；Bass等人，Proteins 8：309-14(1990)；McCafferty等人，Nature 348：552-54(1990)；Niss im等人，EMBOJ.13：692-98(1994)；美国专利号5,427,908、5,432,018、5,223,409和5,403,484。
分离的scFv抗体分子的配体
血小板、血纤蛋白原、GPIb、选择蛋白和PSGL-1(P-选择蛋白糖蛋白配体-1)的每一种都在以下几种致病条件或者疾病状态中起重要作用，如异常炎症或者致病性炎症、异常免疫反应或者致病性免疫反应、自身免疫反应、转移、异常粘连或者致病性粘连、血栓形成和/或再狭窄，和异常聚集或者致病性聚集。从而，与血小板和与这些分子交叉反应的抗体可以用于诊断和治疗与这些和其他致病条件有关的疾病和病症。
血小板
血小板是血液系统的良好表征的成分并且在止血、血栓形成和/或再狭窄中起若干重要的作用。对血管的损伤启动称作止血的过程，其特征是一系列的顺序事件。对损伤血管的最初反应是血小板粘附到血管内表面上受影响的区域。下一步是许多层血小板在前面粘附的血小板上聚集，形成止血栓子并封闭血管壁。通过沉积血纤蛋白聚合物进一步加强止血栓子。仅当损伤被修复时血块或者栓子得到降解。循环的血小板是从巨核细胞的外周释放的细胞质颗粒。从而血小板在止血起重要作用。在血管损伤后，血小板粘附到受损的组织表面并相互附着(粘合)。该事件序列快速发生，从而在血管损伤部位形成无结构的块(通常称作血小板栓子或者血栓)。该粘合现象(也称作聚集)可以由多种物质、或者激动剂，如胶原、腺苷二磷酸(ADP)、肾上腺素、5-羟色胺和利托菌素体外引起。聚集是所进行的多种体外试验之一，用作血小板功能的量度。
转移中血小板的重要性
肿瘤转移可能是限制癌症患者存活的最重要的因素。所积累的数据表明肿瘤细胞与宿主血小板相互作用的能力代表转移中不可缺少的决定因素之一(Oleksowicz，Thrombosis Res.79：261-74(1995))。
已经证明肿瘤细胞聚集血小板的能力与肿瘤细胞的转移潜力相关，并且已经显示抑制肿瘤诱导的血小板聚集与啮齿动物模型中转移的抑制相关。已经证明肿瘤细胞与血小板的相互作用涉及膜粘着分子和激动剂分泌。已经在肿瘤细胞系上鉴定了免疫相关的血小板糖蛋白的表达。还证明在乳腺肿瘤细胞系的表面上表达血小板免疫相关的糖蛋白、GPIb、GPIIb/IIIa、GPIb/IX和整联蛋白αv亚基(Oleksowicz，(1995)，同上；Kamiyama等人，J.Lab.Clin.Med.117(3)：209-17(1991))。
Gasic等人(PNAS 61：46-52(1968))显示抗体诱导的血小板减少显著降低CT26结肠腺癌、Lewis肺癌和B16黑素瘤产生的转移的数目和体积(Karpatkin等人，J.Clin.Invest.81(4)：1012-19(1988)；Clezardin等人，Cancer Res.53(19)：4695-700(1993))。此外，发现在HEL细胞的表面膜上表达单多肽链(60kd)，其与GPIb密切相关并且对应于不完全或者异常O-糖基化的GPIbα亚基(Kieffer等人，J.Biol.Chem.261(34)：15854-62(1986))。
血小板也参与转移过程。当转移性癌细胞进入血流时，形成包被肿瘤细胞的多细胞复合体，它们由血小板和白细胞组成。这些复合体也可以称作微栓塞，它们帮助肿瘤细胞逃避免疫系统。血小板对肿瘤细胞的包被需要血小板表达P-选择蛋白。
GPIb复合体
止血过程中的每一步都需要血小板表面上存在受体。对止血重要的一种受体是糖蛋白Ib-IX复合体(也称作CD42)。该受体介导血小板通过结合内皮下膜中的von Willebrand因子(vWF)在受伤部位粘着血管壁(最初的附着)。它在止血中重要的两种其他血小板功能中也具有重要作用：(a)在动脉狭窄区通过高剪切力诱导血小板的聚集和(b)通过低浓度凝血酶诱导血小板激活。
GPIb-IX复合体是血小板质膜的外表面的主要成分之一。GPIb-IX复合体包含三种跨膜多肽-GPIb的二硫键连接的130kDaα链和25kDa β链和非共价结合的GPIX(22kDa)。为了CD42复合体的有效细胞表面表达和功能，所有亚基都以等摩尔量存在于血小板膜上，表明三种亚基正确装配成复合体是在质膜上的完全表达所需要的。GPIb的α链由三种不同结构域组成，它们是(1)含有富含亮氨酸的重复序列和Cys-结合的侧翼序列的球状N-末端肽结构域；(2)高度糖基化的粘蛋白样大糖肽结构域；和(3)膜结合的C-末端区，其含有连接GPIbα跨膜和细胞质序列的二硫键。
一些证据表明vWF和GPIb-IX复合体的结合凝血酶的结构域存在于球状区，其包括GPIbα的氨基末端的约300个氨基酸。人血小板GPIb-IX复合体是关键的膜受体，其介导血小板功能和反应性。GPIb对内皮下结合的vWF的识别允许血小板粘附到受损的血管。此外，vWF对GPIbα的结合还诱导血小板激活，其可以包括GPIb-IX的细胞质结构域与细胞骨架或者磷脂酶A2的相互作用。此外，GPIbα含有α-凝血酶的高亲和力结合位点，其通过当前还没有较好定义的机制促进血小板激活。
选择蛋白和PSGL-1
P-、E-和L-选择蛋白是粘着分子家族成员，其除其他功能外，介导血管内皮上白细胞的滚动。P-选择蛋白以颗粒储存在血小板中并在由凝血酶、组胺、佛波酯或者其他刺激分子激活后转运到表面。P-选择蛋白也在激活的内皮细胞上表达。E-选择蛋白在内皮细胞上表达，且L-选择蛋白在嗜中性粒细胞、单核细胞、T细胞和B细胞上表达。
PSGL-1(也称作CD162)是P-选择蛋白、E-选择蛋白和L-选择蛋白的粘蛋白糖蛋白配体，其与GPIb具有结构相似性(Afshar-Kharghan等人(2001)，前述)。PSGL-1是二硫键连接的同型二聚体，其具有PACE(配对的碱性氨基酸转化酶)切割位点。PSGL-1的细胞外部分含有三个N-连接的糖基化位点并具有许多唾液酸化、岩藻糖基化O-连接的寡糖分枝(Moore等人，J.Biol.Chem.118：445-56(1992))。大多数N-聚糖位点和许多O-聚糖位点都被占据。已经测定了来自人HL-60细胞的PSGL-1的O-聚糖的结构。这些O-聚糖的亚型是结合选择蛋白所需的核心-2、唾液酸化和岩藻糖基化结构。
PSGL-1在HL60细胞中具有361个残基，其中267个残基为细胞外区、25个残基为跨膜区和69个残基为细胞内区。PSGL-1在细胞表面上形成二硫键结合的同型二聚体或者异二聚体(Afshar-Kharghan等人，Blood 97：3306-12(2001))。编码PSGL-1的序列是单个外显子，因此可变剪接是不可能的。然而，HL60细胞和大多数细胞系中的PSGL-1具有存在于细胞外区的10个残基共有序列的15个连续重复序列，尽管在多形核白细胞、单核细胞和几种其他细胞系(包括大多数天然白细胞)中存在该序列的14和16个重复。
PSGL-1在嗜中性粒细胞中以二聚体表达，具有250kDa和160kDa的表观分子量，而在HL60上，二聚体形式为约220kDa。当在还原条件下分析时，每个亚基减小一半。分子量的不同可能是由于存在不同数目的十聚体重复导致的分子多态性(Leukocyte Typing VI.T.Kishimoto等人编著(1997))。
PSGL-1还表达于大多数血液白细胞，如嗜中性粒细胞、单核细胞、白细胞、B细胞亚群和所有T细胞(Kishimoto等人(1997)，前述)。PSGL-1介导白细胞在激活的内皮、激活的血小板和其他白细胞和炎性部位上的滚动，并介导嗜中性粒细胞在P-选择蛋白上的滚动。PSGL-1也可以通过结合L-选择蛋白介导嗜中性粒细胞-嗜中性粒细胞相互作用，从而介导炎症(Snapp等人，Blood 91(1)：154-64(1998))。
白细胞滚动在炎症中是重要的，且P-选择蛋白(由激活的内皮并且在血小板上表达，其可以在损伤部位固定化)和PSGL-1之间的相互作用对于血管壁上白细胞的粘连和滚动是有帮助的(Ramachandran等人，PNAS 98(18)：10166-71(2001)；Afshar-Kharghan等人(2001)，前述)。细胞滚动对于转移也是重要的，且认为内皮细胞上P-和E-选择蛋白结合转移细胞，从而促进从血流外渗到周围组织中。
从而，已经在所有白细胞：嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、激活的外周T细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板和在一些CD34阳性干细胞和B细胞的某些亚群上发现了PSGL-1。P-选择蛋白在激活的血小板和内皮细胞上选择性表达。P-选择蛋白和PSGL-1之间的相互作用促进血管壁上白细胞的滚动，且白细胞在血管部位的异常积累导致多种病理炎症。PSGL-1上个体硫酸酪氨酸的立体特异贡献对于P-选择蛋白对PSGL-1的结合是重要的。电荷对于结合也是重要的：减少NaCl(从150到50mM)增强了结合(Kd约75nM)。PSGL-1上的酪氨酸硫酸化增强P-选择蛋白上的PSGL-1粘着，但不是所述粘着最终需要的。PSGL-1酪氨酸硫酸化支持在所有剪切率的较慢滚动粘附并且支持在更高剪切率的滚动粘附(Rodgers等人，Biophys.J.81：2001-09(2001))。此外，已经提出血小板上PSGL-1表达为白细胞中的1/100-1/25(Frenette等人，J.Exp.Med.191(8)：1413-22(2000))。
已经产生了针对人PSGL-1的通过商业途径可获得的单克隆抗体KPL1，并且显示其抑制PSGL-1与P-选择蛋白之间和PSGL-1与L-选择蛋白之间的相互作用。将KPL1表位作图到PSGL-1的酪氨酸硫酸化区域(YEYLDYD)(SEQ ID NO：1)(Snapp等人，Blood 91(1)：154-64(1998))。
用O-唾液酸糖蛋白酶对肿瘤细胞的预处理也抑制肿瘤细胞-血小板复合体形成，所述预处理除去了唾液酸化、岩藻糖基化的粘蛋白配体。体内实验表明这些处理的任一种导致单核细胞与循环的肿瘤细胞的更大的结合，表明减小血小板结合增加了免疫细胞对循环肿瘤细胞的接近(Varki和Varki，Braz.J.Biol.Res.34(6)：711-17(2001))。
血纤蛋白原
有两种形式的正常人血纤蛋白原-正常的(γ)和γ’，每一种都在正常个体中发现。正常血纤蛋白原是更丰富的形式(身体中发现的总血纤蛋白原的约90％)，由两条相同的55kDa β链、两条相同的95kDa β链和两条相同的49.5kDa γ链组成。正常的变体血纤蛋白原是较不丰富的形式(身体中发现的血纤蛋白原的约10％)，由两条相同的55kDa β链、两条相同的95kDa β链、一条49.5kDa γ链和一条变体50.5kDa γ’链组成。γ和γ’链由相同基因编码，在3’末端发生可变剪接。正常的γ链由氨基酸1-411组成，且正常的变体γ’链由427个氨基酸组成，其中氨基酸1-407与正常γ链中的氨基酸相同，而氨基酸408-427为VRPEHPAETEYDSLYPEDDL(SEQ ID NO：2)。该区域通常由凝血酶分子占据。
在离子化钙的存在下通过凝血酶的作用将血纤蛋白原转化成血纤蛋白而产生血液的凝固。血纤蛋白也是血栓和急性炎性渗出物的成分。
蛋白质硫酸化
蛋白质硫酸化是广泛的翻译后修饰，其包括硫酸盐酶促共价附着到糖侧链或者多肽主链。该修饰在高尔基体外侧室中发生。此类蛋白质包括分泌性蛋白质、导向颗粒的蛋白质，和质膜蛋白质的细胞外区域。酪氨酸是当前已知经历硫酸化的氨基酸残基。Kehoe等人，Chem.Biol.7：R57-61(2000)。其他氨基酸，例如，苏氨酸，可以也经历硫酸化，尤其在患病细胞中经历硫酸化。
关于GPIb，GIPb的带负电荷N-末端球状结构域含有已知经历硫酸化的三个酪氨酸残基。GPIbα(CD42)由血小板和巨核细胞表达并且通过结合vWF介导血小板附着到内皮下膜和在内皮下膜上滚动，其也含有一簇在Asp-269和Asp-287之间的带负电的氨基酸。认为这种高度酸性和亲水环境是硫酸化的前提条件，因为酪氨酰蛋白质磺基转移酶特异识别并硫酸化与酸性氨基酸残基相邻的酪氨酸(Bundgaard等人，J.Biol.Chem.272：21700-05(1997))。GPIbα的酸性区域的完全硫酸化产生具有显著负电荷密度的区域——在19个氨基酸序列内13个带负电荷，从而使得该区域是与其他蛋白质静电相互作用的候选位点。一些证据表明在表达GPIb-IX复合体的经转染的CHO细胞和血小板GPIbα中，该结构域含有的三个酪氨酸残基(Tyr-276、Tyr-278和Tyr-279)经历硫酸化。
关于PSGL-1，该蛋白质具有三个潜在的硫酸化位点(分子的N-末端结构域中三个酪氨酸残基的每一个上)，接着是10-16个十聚体重复序列，它们富含脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
已知PSGL-1的硫酸化与P-选择蛋白的结合有关，且PSGL-1上个体硫酸酪氨酸的立体特异贡献对于P-选择蛋白对PSGL-1的结合是重要的。然而，有一些迹象表明仅一个酪氨酸残基的硫酸化就足够P-选择蛋白结合(J.Biol.Chem.，卷273，12，7078-87)。PSGL-1的酪氨酸硫酸化支持在所有剪切率的较慢滚动粘附并且支持在高得多的剪切率的滚动粘附(Rodgers  等人，Biophys.J.81：2001-09(2001))。
还认为硫酸化的N-末端酪氨酸影响CC-趋化因子受体如CCR5的作用，所述受体作为人和猿猴免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2和SIV)进入靶细胞的相关的七跨膜片段(7TMS)受体的共同受体。例如，认为硫酸化的N-末端酪氨酸有助于CCR5结合MIP-1α、MIP-1β和HIY-1gp120/CD4复合体并且有助于HIV-1进入表达CCR5和CD4的细胞的能力。CXCR4是另一种重要的HIV-1共同受体，其也被硫酸化(Farzan等人，Cell 96(5)：667-76(1999))。酪氨酸硫酸化在依赖CXCR4的HIV-1进入中的作用没有依赖CCR5的进入中的作用重要；从而证明了酪氨酸硫酸化在CXC-趋化因子家族中的可能作用并且强调了CCR5和CXCR4的HIV-利用中一般性差别(Farzan等人，J.Biol.Chem.，277(33)：29，484-89(2002))。
使用噬菌体文库鉴定了结合PSGL-1和/或GPIb的抗体，并在美国申请号10/032,423、10/032,037、10/029,988、10/029,926、09/751,181、10,189,032和60/258,948和国际申请号PCT/US01/49,442和PCT/US01/49,440中公开。这些申请中公开的抗体的特定实例包括Y1、Y17和L32抗体。从种系(DP32)分离了这些抗体并且发现它们特异结合在造血细胞的蛋白质上发现的表位，该表位在N-末端酪氨酸经硫酸化并且认为其参与细胞迁移，例如，肿瘤转移。
以前鉴定为结合Y1/Y17/L32的硫酸化表位的特征是存在硫酸化部分，如硫酸化酪氨酸残基或者硫酸化糖或脂类部分，所述部分优选在配体和受体中发现的两个或更多个酸性氨基酸的簇内，其中所述配体和受体在诸如炎症、免疫反应、感染、自身免疫反应、转移、粘附、血栓形成和/或再狭窄、细胞滚动和聚集的多种过程中起重要作用。在患病细胞，如T-ALL细胞、B-CLL细胞、AML细胞、多发性骨髓瘤细胞和转移细胞上也发现了此类表位。
这些表位是这些过程(以及导向剂)的治疗性药疗法和诊断方法的有用靶。
目的
本发明的一个目的是提供抗体和多肽，所述抗体和多肽结合在诸如细胞滚动、炎症、免疫反应、感染、自身免疫反应、转移和HIV进入的过程中起作用的多种分子上存在的表位。
本发明的另一目的是提供抗体和多肽，所述抗体和多肽结合参与诸如粘附、血栓形成和/或再狭窄和血小板聚集的过程的表位，并且所述抗体和多肽可以用于治疗心血管疾病，如心肌梗死和再狭窄和用于治疗炎性疾病。
本发明的另一目的是将抗体和多肽用于个体的多种疾病状态的诊断、预后或分期的方法中，所述疾病状态为例如，AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、前-B-ALL、多发性骨髓瘤、转移、HIV感染、心血管疾病或者其他疾病，在所述其他疾病中诸如细胞滚动、炎症、免疫反应、感染、自身免疫反应、转移的细胞功能或者活动起重要作用。此外，本发明的这些抗体可以用作导向剂将治疗剂导向特定细胞或者部位。
本发明的另一个目的是提供治疗多种疾病状态的方法，所述疾病状态为例如AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、前-B-ALL、多发性骨髓瘤、转移、HIV感染、心血管疾病或者其他疾病，在所述其他疾病中诸如细胞滚动、炎症、免疫反应、感染、自身免疫反应、转移的细胞功能或者活动起重要作用。本发明的另一目的是提供清除肿瘤细胞的方法。
本发明的另一目的是提供抗体和多肽用于生产治疗多种疾病状态的药物，所述疾病状态为例如，AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、前-B-ALL、多发性骨髓瘤、转移、HIV感染、再灌注损伤和动脉粥样硬化的心血管疾病，或者其他疾病，在所述其他疾病中诸如细胞滚动、炎症、免疫反应、感染、自身免疫反应、转移的细胞功能或者活动起重要作用。
本发明的一个目的是提供抗体和多肽，所述抗体和多肽刺激T-细胞、NK细胞和/或刺激依赖抗体的细胞毒性和/或细胞凋亡。
本发明的一个目的是提供多肽、表达载体和重组宿主细胞，其表达参与诸如细胞滚动、炎症、免疫反应、感染、自身免疫反应、转移、HIV进入、粘附、血栓形成、再狭窄和血小板聚集的过程的抗体。
本发明的另一目的是提供免疫球蛋白结合结构域，特别是scFv分子的文库。
本文提供了本发明的这些和其他目的。
发明概述
本发明提供了包含共有序列X1-X2-X3-Pro-X5-X6(SEQ ID NO：3)的抗体和多肽，其中X1和X6为疏水氨基酸，且X2、X3和X5为任意氨基酸，其中X2优选为碱性氨基酸，且其中共有序列从N-末端到C-末端排列或者从C-末端到N-末端排列。共有序列优选在抗体的高变区内，更优选在CDR3区内。优选地，共有序列排除包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR3区。本发明还提供了具有SEQ ID NO：5或SEQID.NO：6的s cFv抗体的结合能力的抗体和多肽。
本发明还提供了产生抗体或多肽的方法，其包括如下步骤：提供噬菌体展示文库，提供SEQ ID NO：7的肽，其结合具有SEQ ID NO：4的scFv抗体片段的结合能力的抗体或者多肽，对噬菌体展示文库淘选结合SEQ ID NO：7的肽的s cFv抗体片段，和产生包含结合SEQ IDNO：7的肽的scFv抗体片段的抗体或多肽。
本发明还提供了免疫球蛋白结合结构域，特别是scFv分子的文库，其包含用于互补结合的多样的抗原结合结构域，其中所述文库仅在重链CDR 3中具有多样性。
本发明还提供了包含本发明的抗体和多肽的药物组合物。这些药物组合物可以用于治疗、诊断、预后或者分期多种状况，所述状况涉及或者累及细胞滚动、炎症、自身免疫病、血小板聚集、再狭窄、HIV感染、转移、肿瘤细胞的生长和/或复制；和白血病细胞的生长和/或复制。这些药物组合物可以用于抑制细胞滚动、抑制炎症、抑制自身免疫病、抑制血小板聚集、抑制再狭窄、抑制HIV感染、抑制转移、抑制肿瘤细胞的生长和/或复制、增加肿瘤细胞的死亡率、抑制白血病细胞的生长和/或复制、增加白血病细胞的死亡率、改变患病细胞被抗疾病剂损伤的易感性；增加肿瘤细胞对抗癌剂损伤的易感性；增加白血病细胞对抗白血病剂损伤的易感性；抑制肿瘤患者中肿瘤细胞数的增加；减少癌症患者中肿瘤细胞数目；抑制白血病患者中白血病细胞数的增加；和减少白血病患者中白血病细胞的数目。
本发明还提供了生产用于治疗多种疾病状态的药物的方法，所述疾病状态为例如，AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL细胞、前-B-ALL、多发性骨髓瘤、转移、HIV感染、心血管疾病或者其他疾病，在所述其他疾病中诸如细胞滚动、炎症、免疫反应、感染、自身免疫反应、转移的细胞功能或者活动起重要作用。
本发明还提供了诊断、预后或者分期患者中疾病的方法，通过下述步骤实现：提供含有来自所述患者的细胞的样品，并确定本发明的抗体或者多肽是否结合患者的细胞，从而表明所述患者有危险患有或者已经患有所述疾病。
本发明还提供了从患者清除肿瘤细胞的方法，其通过提供含有来自所述患者的细胞的样品，并将来自所述患者的细胞与本发明的抗体或者多肽温育来实现。
定义
抗体(Abs)或者免疫球蛋白(Igs)是结合抗原的蛋白质分子。天然发生的抗体的每种功能结合单位由通过二硫键连接在一起的四条多肽链(2条重链和2条轻链)的单位组成。每条链具有恒定区和可变区。可以将天然发生的抗体基于它们的重链成分分成几类，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。IgG类包括几种亚类，包括但不限于，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。B-淋巴细胞在体内产生免疫球蛋白，且每种此类分子识别特定外来抗原决定簇并且促进该抗原的清除。
可以以多种形式(包括抗体复合体)产生和使用抗体。文中所用术语“抗体复合体”或“多种抗体复合体”用于指一个或多个抗体与另一种抗体或者与一个或多个抗体片段的复合体，或者两个或更多个抗体片段的复合体。抗体片段的实例包括Fv、Fab、F(ab’)2、Fc和Fd片段。因此，根据本发明的抗体包括抗体或者其片段的复合体。
如本说明书和权利要求中所用的，将Fv定义为由人抗体的重链可变区和人抗体的轻链可变区组成的分子，其可以相同或不同，并且其中重链可变区连接、连结、融合或者共价附着或者结合轻链的可变区。Fv可以是单链Fv(scFv)或者二硫键稳定的Fv(dsFv)。scFv由抗体的每条重链和轻链的可变结构域组成，所述可变结构域通过柔性氨基酸多肽间隔臂或者接头连接。接头可以是分枝或不分枝的。优选地，接头为0-15个氨基酸残基，最优选接头为(Gly4Ser)3(SEQ IDNO：8)。
Fv分子自身由第一条链和第二条链组成，每条链具有第一、第二和第三高变区。轻链和重链的可变结构域内的高变环称作互补决定区(CDR)。每条重链和轻链内有CDR1、CDR2和CDR3。认为这些区形成抗原结合部位并且可以被特异修饰以产生增强的结合活性。实际上这些区的最可变的是重链的CDR3。将CDR3理解为Ig分子的最暴露的区域，并且，如本文所示和提供的，是主要负责所观察到的选择性和/或特异结合特征的部位。
将Fv分子的片段定义为小于最初Fv但是仍然保持最初Fv的选择性和/或特异结合特征的任一分子。此类片段的实例包括但不限于(1)微型抗体(minibody)，其包含仅Fv的重链的片段，(2)微体，其包含抗体重链可变区的小部分单位(国际申请号PCT/IL99/00581)，(3)具有轻链的片段的类似体，和(4)具有轻链可变区的功能单位的类似体。
文中所用术语“Fab片段”是免疫球蛋白的单价抗原结合片段。Fab片段由轻链和部分重链组成。
F(ab’)2片段是通过胃蛋白酶消化得到的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。它含有两条轻链和两条重链的部分。
Fc片段是免疫球蛋白的非抗原结合部分。它含有重链的羧基末端部分和Fc受体的结合部位。
Fd片段是免疫球蛋白重链的可变区和第一个恒定区。
多克隆抗体是免疫应答的产物并且由许多不同的B-淋巴细胞形成。单克隆抗体来自一个克隆B细胞。
疏水氨基酸通常为缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)和甘氨酸(G)。碱性氨基酸通常为精氨酸、组氨酸和赖氨酸。
应用于多肽的并且如本发明定义的，盒指连续氨基酸的给定序列，其作为构架并且被认为是一个单位并且被同样地进行操作。可以替代、插入、除去或者在一端或两端附着氨基酸。同样，可以替代、插入、除去或者在一端或两端附着氨基酸序列。
文中所用的术语“表位”指抗原决定簇或识别位点或者抗原位点，其与抗体、抗体片段、抗体复合体或者具有其结合片段的复合体或者T细胞受体相互作用。术语表位在本文与术语配体、结构域和结合区可以互换使用。
选择性在文中定义为导向分子选择并结合实体或者实体状态混合物中的一个实体或者细胞状态的能力，所有实体或者实体状态可以都对导向分子特异。
文中所用术语“亲和力”是结合分子(例如，抗体上的一个结合部位)和配体(例如，抗原决定簇)之间的结合强度(结合常数)的量度。抗体上单个抗原结合部位和单个表位之间非共价相互作用总和的强度是该抗体对所述表位的亲和力。低亲和力抗体结合抗原弱并且倾向于容易地解离，而高亲和力抗体更紧密结合抗原并且更长时间保持结合。术语“亲合力”与亲和力不同，因为亲合力反映了抗原-抗体相互作用的效价。
抗体-抗原相互作用的特异性：尽管抗原-抗体反应是特异的，但是在一些情况中，一种抗原引起的抗体可以与另一种不相关抗原交叉反应。如果两种不同的抗原共有同源或者类似的结构、表位或者其锚定区，或者如果对一个表位特异的抗体结合具有相似的结构构象或者化学性质的不相关表位，那么发生此类交叉反应。
血小板是巨核细胞的盘状胞质片段，其在骨髓窦中流出并随后在外周血流中循环。血小板具有几种生理功能，包括凝血中的主要作用。血小板含有位于中心的颗粒和外周透明原生质，但是没有确定的核。
文中所用凝集指导致悬浮的细菌、细胞、盘、或者具有类似大小的其他颗粒可以粘附或者形成团的过程。该过程类似于沉淀但是颗粒更大并且处于悬浮液而不是在溶液中。
术语聚集指体外诱导的血小板聚集，以及作为顺序机制的一部分的凝血酶和胶原的聚集，导致形成血栓或者止血栓子。
将保守氨基酸替代定义为通过改变肽、多肽或者蛋白质或者其片段的一个或两个氨基酸改变氨基酸组成。替代是被通常相似性质的氨基酸(例如，酸性、碱性、芳族、大小、带正电荷或负电荷、极性、非极性)所替代的，从而该替代不相当大地改变肽、多肽或者蛋白质特征(例如，电荷、等电点、亲和力、亲合力、构象、溶解性)或活性。可以对此类保守氨基酸替代进行的一般替代可以在如下氨基酸组中：
甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)
天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)
组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)
天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
可以在例如，主要负责分子的选择性和/或特异结合特征的高变区侧翼区域，以及分子的其他部分，例如，可变重链盒中进行保守氨基酸替代。额外或备选地，可以通过重建分子形成完全大小的抗体、双链抗体(diabody)(二聚体)、三链抗体(triabody)(三聚体)和/或四链抗体(tetrabody)(四聚体)或者形成微型抗体或者微体来实现修饰。
启动子是DNA上的一个区域，RNA聚合酶在该区域结合并启动转录。
噬菌体展示文库(也称作噬菌体肽/抗体文库、噬菌体文库或者肽/抗体文库)包含噬菌体的大群体(108或更大)，每个噬菌体颗粒展示一个肽序列。
药物组合物指制剂，其包含本发明的肽或多肽和其药学上可接受的载体、赋形剂或者稀释剂，或者抗体-药物试剂(抗体-试剂)复合体和其药学上可接受的载体、赋形剂或者稀释剂。
试剂指可用于哺乳动物的活动性疾病治疗、预防性治疗或者诊断的试剂，所述哺乳动物包括但不限于，人、牛、马、猪、鼠、犬、猫或者任意其他温血动物。试剂选自放射性同位素、毒素、寡核苷酸、重组蛋白质、抗体片段、药物试剂、抗癌剂、抗白血病剂、抗转移剂、抗肿瘤剂、抗疾病剂、抗粘附剂、抗血栓形成剂、抗再狭窄剂、抗自身免疫剂、抗聚集剂、抗细菌剂、抗病毒剂和消炎药。此类试剂的其他实例包括，但不限于抗病毒剂，包括无环鸟苷、更昔洛韦和齐多夫定；抗血栓形成/再狭窄剂，包括西洛他唑、达肝素钠、瑞维肝素钠和阿司匹林；消炎药包括扎托洛芬、普拉洛芬、哚昔康、乙酰基水杨酸17、双氯芬酸钠、布洛芬、右布洛芬、舒林酸、萘普生、氨托美丁、塞来昔布、吲哚美辛、罗非克西和尼美舒利；抗自身免疫剂包括来氟洛米、昂他克(denileukin diftifox)、subreum、WinRho SDF、去纤苷和环磷酰胺；抗粘附/抗聚集剂包括利马罗斯特、clorcromene和透明质酸，和它们的衍生物、组合和修饰。
抗白血病剂是具有抗白血病活性的试剂。例如，抗白血病剂包括抑制或者终止白血病或者未成熟的前白血病细胞生长的试剂、杀死白血病或者前白血病细胞的试剂、增加白血病或前白血病细胞对其他抗白血病剂的易感性的试剂，和抑制白血病细胞转移的试剂。在本发明中，抗白血病剂还可以是具有防止、抑制、延迟或者终止肿瘤血管化的抗血管生成活性的试剂。
抗癌剂是具有抗癌活性的试剂。例如，抗癌剂包括抑制或者终止癌性或者未成熟前癌细胞生长的试剂、杀死癌性或者前癌细胞的试剂、增加癌性或前癌细胞对其他抗癌剂易感性的试剂，和抑制癌细胞转移的试剂。在本发明中，抗癌剂还可以是具有防止、抑制、延迟或者终止肿瘤血管化的抗血管生成活性的试剂。
通过分析在多种条件、特定时间、多种组织等中产生的基因产物的量可研究基因的表达模式。当基因产物的量高于在正常对照，例如未患病对照中发现的量时，认为基因“超表达”。
给定细胞可以在其表面表达具有给定抗体的结合部位(或者表位)的蛋白质，但是该结合部位可以以隐藏形式(例如，空间位阻的或者封闭的，或者缺少抗体结合所需的特征)在细胞中以一种状态存在，所述状态可以称作第一阶段(阶段I)。阶段I可以是例如，正常、健康的未患病状态。当表位以隐藏形式存在时，它不被给定抗体识别，即，不存在抗体对该表位或者对阶段I的给定细胞的结合。然而，表位可以通过例如经历自身修饰得以暴露，或者因为附近或者结合的分子受到修饰或者因为一个区域经历构象改变而被去封闭从而得以暴露。修饰的实例包括折叠的改变、翻译后修饰的改变、磷脂化改变、硫酸化改变、糖基化改变等等。当细胞进入不同状态时可以发生此类修饰，所述状态可以称作第二阶段(阶段II)。第二状态或者阶段的实例包括激活、增殖、转化，或者处于恶性状态。在被修饰后，表位可以暴露，从而抗体可以结合该表位。
肽模拟物(peptido-mimetics)(肽模拟物)是氨基酸之间不再含有任何肽键，即酰胺键的分子；然而，在本发明上下文中，术语肽模拟物意在包括本质上不再完全是肽的分子，如假肽、半肽和类肽。不管是完全还是部分非肽，根据本发明的肽模拟物提供了反应性化学部分的空间排列，其与肽模拟物所基于的肽中活性基团的三维排列非常类似。这些分子包括小分子、脂类、多糖或者其缀合物。
附图简述
图1描绘用于分析与PSGL-1的结合的根据本发明的所选克隆的噬菌体ELISA的数字数据。
图2描绘了用于分析与PSGL-1的结合的根据本发明的所选克隆的scFv ELISA的数字数据。
图3描绘用于分析与表达PSGL-1的ML-2细胞的结合的来自根据本发明的所选克隆和L32的scFv的FACS分析的数字数据。
图4描绘了用于分析与glycocalicin的结合的来自根据本发明的所选克隆和L32的scFv的ELISA的数字数据。
图5描绘了用于分析与血小板和粒细胞结合的来自根据本发明的所选克隆的scFv的FACS分析的数字数据。
图6显示了根据本发明的所选克隆和L32的粒细胞/血小板结合比的比较。
图7描绘了在KPL-1存在和不存在下S15与ML-2细胞的结合的分析结果。
图8描绘了来自FACS分析的数字数据，提供了PBS中纯化的scFv与ML-2细胞的结合的比较。
图9描绘了来自FACS分析的数字数据，提供了PBS中纯化的scFv与ML-2细胞的结合的比较。
图10描绘了来自FACS分析的数字数据，提供了50％血浆中纯化的scFv与ML-2胞的结合的比较。
图11描绘了来自FACS分析的数字数据，提供了50％血浆中纯化的scFv与ML-2胞的结合的比较。
图12描绘了纯化的scFv对ML-2细胞的剂量反应的FACS分析。
图13描绘了所选噬菌体克隆与GP1b和PSGL-1硫酸化肽的结合。
图14显示了scFv与glycocalicin的结合。
图15是使用流式细胞术确定的不断增加浓度的多种scFv与洗涤的血小板结合的图。
图16描绘了通过ELISA测定法确定的多种scFv与glycocalicin的结合。
图17描绘了A3R scFv对利托菌素诱导的血小板聚集的影响。
图18描绘了使用CPA测定法确定的Y1 scFv、A3R scFv和对照PBS对血小板对聚苯乙烯的粘附的影响。
图19描绘了快速浓注后A3R scFv与豚鼠血小板结合的水平。
图20描绘了快速浓注后豚鼠中A3R scFv的血浆浓度。
图21描绘了scFv与基于PSGL-1、GPIb和CCR5的硫酸化区的肽的直接结合的数字数据。
图22描绘了在B-CLL患者样品中S15 IgG诱导的ADCC。
图23描绘了不同的效应细胞群体参与B-CLL患者样品中S15 IgG诱导的ADCC。
图24描绘了S15 IgG和利妥希玛诱导B-CLL患者样品中细胞凋亡的能力。
发明详述
本发明涉及包含共有序列X1-X2-X3-Pro-X5-X6(SEQ ID NO：3)的抗体或者其片段，其中X1和X6是疏水氨基酸，X2、X3和X5是任意氨基酸，其中X2优选为碱性氨基酸，且其中共有序列从N-末端到C-末端排列或者从C-末端到N-末端排列(这种抗体通常在本文称作共有抗体)。
在本发明的共有抗体的一个实施方案中，X2选自精氨酸和赖氨酸，X1和X6选自亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸。优选地，该实施方案的共有抗体包含选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的共有序列。更优选地，在该实施方案中，共有抗体包含SEQ ID NO：5(CDR3序列是SEQ ID NO：9)并且此类共有抗体在本文命名为并称作S15。备选地，该实施方案中共有抗体更优选为SEQID NO：6(CDR3序列为SEQ ID NO：10)并且此类共有抗体在本文命名为并称作A3R。
在本发明的共有抗体的另一实施方案中，X2和X3为精氨酸和疏水氨基酸，X6优选为异亮氨酸。优选地，该另一实施方案的共有抗体包含选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的共有序列。更优选地，该另一实施方案的共有抗体为A3R和/或S15。
在本发明的共有抗体的另一实施方案中，X1选自亮氨酸和甲硫氨酸，X2和X3为精氨酸，X5选自丝氨酸和缬氨酸，且X6为异亮氨酸。优选地，该另一实施方案的共有抗体包含选自SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10的共有序列。
在本发明的共有抗体的另一实施方案中，X1为亮氨酸、X2选自碱性氨基酸，且X6选自疏水氨基酸。该实施方案的优选的共有抗体包含SEQ ID NO：11到SEQ ID NO：16的D系列抗体。更优选地，该实施方案的共有抗体为D1(CDR3区为SEQ ID NO：14并且完整scFv为SEQ IDNO：55)或者D3(CDR3区为SEQ ID NO：13并且完整scFv为SEQ IDNO：56)。
本发明的共有抗体优选相对于第二表位优先结合第一表位，其中第一和第二表位的至少一个被硫酸化。第一和第二表位的实例包括PSGL-1表位和GPIb表位。更优选地，共有抗体结合PSGL-1和GPIb的表位，并且优选显示出以对PSGL-1表位比对GPIb表位更强的亲和力结合或者以对GPIb表位比对PSGL-1表位更强的亲和力结合。备选地，共有抗体以相似的亲和力结合第一和第二表位(例如，PSGL-1和GPIb)。以相似亲和力结合PSGL-1和GPIb的适宜的抗体的实例包括D1和D3，其为完整scFv或者CDR3区。
在其中共有抗体为A3R的实施方案中，优选地，共有抗体结合硫酸化GPIb的表位比它对硫酸化PSGL-1表位的结合具有更强的亲和力。特别地，关于相似浓度的S15和A3R的结合性质的比较，已经发现A3R比S15以更强亲和力结合健康GPIb血小板。还发现在相似浓度下，S15比A3R以更强亲和力结合健康的全血细胞(含有粒细胞、淋巴细胞和表达PSGL-1的单核细胞)。
从而，本发明提供了抗体，其以与S15的亲和力基本相似的亲和力特异结合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且优选对PSGL-1的结合亲和力大于对GPIb的结合亲和力。更优选地，所述抗体结合在51位第三个N-末端酪氨酸残基硫酸化的硫酸化PSGL-1表位。在另一实施方案中，本发明的抗体特异结合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，其结合亲和力与A3R的基本上相似，并且本发明抗体结合GPIb的亲和力优选强于结合PSGL-1的亲和力。更优选地，该实施方案的抗体结合在46位第一个N-末端酪氨酸残基硫酸化的硫酸化GPIb表位。备选地，本发明提供了特异结合硫酸化PSGL-1(优选在Tyr-51的第三个N-末端酪氨酸残基硫酸化)和硫酸化GPIb(优选在Tyr-276的第一个N-末端酪氨酸残基硫酸化)的抗体，其中结合的亲和力基本上类似于D1和/或D3的结合亲和力。
由于本发明的多种抗体(例如，S15和A3R)对硫酸化PSGL-1和GPIb的亲和力差异，且因为这两种抗体在共有序列的X1和X5位上不同，所以本发明的共有抗体的共有序列的X1和X5有助于共有抗体与酪氨酸硫酸化位点的结合。因此，取决于导向结合的具体硫酸化表位，可以具体选择共有序列的X1和X5位的氨基酸。换句话说，可以改变X1和X5位以使得抗体适合特异结合特定硫酸化表位。此外，因为S15优选结合包含在第三个N-末端酪氨酸的硫酸化修饰的PSGL-1表位，并且A3R优选结合在第一个N-末端酪氨酸具有硫酸化修饰的GPIb表位(而D1和D3相等地结合PSGL-1和A 3R两者)，所以共有序列的X1和X5可能与S15和A3R分别与PSGL-1和GPIb的第三个和第一个硫酸化酪氨酸的结合相关。
使用噬菌体文库鉴定了结合PSGL-1和/或GPIb的抗体，并且所述抗体公开在美国申请号10/032,423、10/032,037、10/029,988、10/029,926、09/751,181、10,189,032和60/258,948和国际申请号PCT/US01/49,442和PCT/US01/49,440中。这些申请中公开的抗体的特定实例包括Y1、Y17和L32抗体。这些抗体分离自种系(DP32)，并且发现它们特异结合在造血细胞的蛋白质上发现的表位，所述表位在N-末端酪氨酸硫酸化并且认为该表位参与细胞迁移，例如，肿瘤转移。
以前鉴定为结合Y1/Y17/L32的硫酸化表位的特征是存在硫酸化部分，如硫酸化酪氨酸残基或者硫酸化糖或者脂类部分，其优选在两个或更多个酸性氨基酸簇内，其发现于在多种过程中起重要作用的配体和受体上，所述多种过程例如炎症、免疫反应、感染、自身免疫反应、转移、粘附、血栓形成和/或再狭窄、细胞滚动和聚集。在患病细胞，如T-ALL细胞、B-CLL细胞、AML细胞、多发性骨髓瘤细胞和转移细胞中也发现了此类表位。
从DP32家族分离的本发明的共有抗体结合具有硫酸化酪氨酸位点的蛋白质。此类蛋白质包括但不限于，PSGL-1、GPIb、α-2-抗纤溶酶；氨肽酶B；CC趋化因子受体，如CCR2、CCR5、CCR3、CXCR3、CXCR4、CCR8和CCR2b；跨膜片段(7TMS)受体；凝血因子，如因子V、VIII和IX；血纤蛋白原γ链；肝素辅因子II；分泌粒蛋白，如分泌粒蛋白I和II；玻连蛋白、淀粉状蛋白前体、α-2-抗纤溶酶；缩胆囊素；α-绒毛膜促性腺激素；补体C4；硫酸皮肤素蛋白聚糖；纤连蛋白；和castrin。在优选实施方案中，本发明的共有抗体结合硫酸化CC趋化因子受体，如CCR5、CXCR4和CCR2b。硫酸化酪氨酸可以有助于CCR5与MIP-1α、MIPβ和HIV-1gp120/CD4的结合和有助于HIV-1进入表达CCR5和CD4的细胞的能力。
此外，本发明抗体的结合取决于细胞的发育阶段(基于法国-美国-英国系统对AML亚型分类，其中使用在常规处理和细胞化学染色下观察到的形态学)。抗体可以结合M3或者以上亚型的AML细胞，但是不结合M0或M1亚型细胞。此外，所述抗体可以结合或不结合M2亚型细胞。因此，本发明的抗体显示出对正常的健康骨髓(例如，CD34+细胞)的低结合。认为此类差异是基于PSGL-1表达和/或硫酸化的改变，以及暴露稍微不同的表位的PSGL-1的可能的构象改变的。
因此，共有抗体不结合骨髓中未分化的细胞，如M0、M1、M2和M3细胞。认为共有抗体结合的PSGL-1在这些未分化细胞上不以显著水平表达或者不硫酸化。本发明的共有抗体还可以不结合健康骨髓细胞(如CD34+细胞)。
在更优选的实施方案中，本发明的共有抗体结合硫酸化PSGL-1。具体地，S15抗体显示出对硫酸化PSGL-1的增强的选择性。参与炎症的白细胞，如单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞主要由疾病(如动脉粥样硬化)炎症过程中的四种粘着分子：PSGL-1、P-选择蛋白、VLA-4和VCAM-1募集(Huo和Ley，Acta Physiol.Scand.，173：35-43(2001)；Libby，Sci.Am.May：48-55(2002)；Wang等人，J.Am.Coll.Cardiol.38：577-582(2001))。共有抗体，尤其S15对这些中心分子任一种前干扰暗示其有抗体在消除相关疾病中的潜在作用。
特别地，P-选择蛋白控制细胞附着和滚动。此外，P-选择蛋白-PSGL-1相互作用激活细胞上的许多其他分子，它们整体与肿瘤发生(当涉及恶性细胞时)和炎症反应(当涉及白细胞时)相关(Shebuski和Kilgore，J.Pharmacol.Exp.Ther.300：729-735(2002))。基于对P-选择蛋白调节细胞过程的能力的理解，显然，共有抗体和S15对硫酸化PSGL-1的增强的scFv选择性使得它们成为治疗多种恶性和炎性疾病的极好的分子。此外，恶性疾病的模型已经表明P-选择蛋白与恶性细胞的结合需要PSGL-1的硫酸化(Ma和Geng，J.Immunol.168：1690-1696(2002))。该需要类似于共有抗体的结合，尤其S15结合的要求。从而，人们可以预期共有抗体，且尤其S15可以消除P-选择蛋白对进行性恶性疾病的促进。
本发明的共有抗体，尤其在其中X2和X3为精氨酸，且X6为异亮氨酸且优选A3R的实施方案中，也显示出对硫酸化GP Ib的增强的选择性。GPIb参与血小板聚集，其涉及动脉狭窄区的高剪切和低浓度凝血酶诱导的血小板激活。基于对GPIb的该理解，显然，共有抗体和A3R对硫酸化GPIb的增强的scFv选择性使得它是治疗多种心血管和炎性疾病的极好的分子。
优选地，本发明的共有抗体结合参与炎症或者肿瘤发生的至少一种细胞类型上存在的表位，所述细胞类型包括T-ALL细胞、AML细胞、前-B-ALL细胞、B-白血病细胞、B-CLL细胞、多发性骨髓瘤细胞和转移细胞。此外，优选地，本发明的共有抗体可以结合脂类、糖、肽、糖脂、糖蛋白、脂蛋白和/或脂多糖分子上的表位。此类表位优选具有至少一个硫酸化部分。备选地，但也是优选地，本发明的共有抗体与两个或更多个表位交叉反应，每个表位都具有一个或多个硫酸化酪氨酸残基，和至少一簇两个或更多个酸性氨基酸，它的一个实例是PSGL-1。本发明的这些抗体或者其片段可以例如，在结合PSGL-1后内化到AML细胞。此类内化可以通过胞吞和主动过程发生，所述主动过程是依赖于过程、时间和温度的。
根据本发明的共有抗体和以与S15、A3R、S1、S11、D1和D3基本上相同的亲和力结合的抗体的高变区参与形成抗原结合部位。抗原结合部位与抗体结合的表位的结构互补，因此，这些结合部位称作互补决定区(CDRs)。在抗体的每条轻链和重链上有三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)，每个CDR都位于连接VH和VL结构域的β链的环上。这些区中最可变的是重链的CDR3区。将该CDR3区被理解为Ig分子的最暴露的区并且，如本文提供的，在决定所观察到的选择性和/或特异结合特征中具有中心作用。
DP32是存在于噬菌体展示文库中的49种种系之一，是噬菌体文库的特异种系，从该种系分离本发明的共有抗体。因此，DP32提供了本发明的抗体，其具有至少重链和轻链构架可变区、轻链CDR1、CDR2和CDR3区，和/或重链CDR1和CDR2。DP32也提供了高变区适应的三维结构。公知抗体的特异性由其三维构象决定。从而，DP32强加的限制性在决定本发明抗体的特异性中具有重要作用。此外，DP32具有多种带电的氨基酸，它们在抗体的抗原识别中具有结构作用。
根据本发明，还可以将CDR插入到盒中以产生抗体。应用于多肽并且如本发明中定义的盒指连续氨基酸的给定序列，其作为构架并且被认为是一个单位并且同样地进行操作。可以替代、插入、除去或者在一端或两端附着氨基酸。同样，可以替代、插入、除去或者在一端或两端附着氨基酸序列。
盒的氨基酸序列可以在表面上看是固定的，而替代、插入或者附着的序列可以高度变化。所述盒可以由几个结构域组成，每一个都包括对最终构建体关键的功能。
本发明的特定实施方案的盒包含(从N端起)构架区1(FR1)、CDR1、构架区2(FR2)、CDR2、构架区3(FR3)和构架区4(FR4)。
在本发明的一个实施方案中，可能替代盒内的不同区。例如，通过非保守，或优选保守氨基酸替代来替代或者修饰盒的CDR2和CDR1高变区。
在本发明中，共有抗体和以与A3R和S15基本相同的亲和力结合的抗体具有重链和轻链，且每条链具有第一、第二和第三高变区，它们分别是CDR3、CDR2和CDR1区。结合选择性和特异性具体通过链的CDR3区，可能通过轻链的CDR3区，且优选通过重链的CDR3区，并且其次通过轻链，且优选重链的CDR2和CDR1区决定。结合选择性和特异性还可以其次受到第一、第二和/或第三高变区侧翼的上游或下游区的影响。
优选地，共有抗体的共有序列在共有抗体的高变区内的。具体地，共有序列可以在共有抗体的CDR 3区、CDR2区或者CDR1区内。所有或者仅一部分共有序列可以在CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。例如，共有序列可以重叠两个高变区或者可以部分位于一个或多个高变区内并且部分位于共有抗体的可变区的另一部分内。优选地，共有序列在CDR3区内。还优选地，共有序列排除包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR3区。
具体地，在一个实施方案中，共有抗体优选包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的一个或多个氨基酸序列。在备选实施方案中，共有序列优选包括SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18的一个或多个氨基酸序列。氨基酸序列优选在共有抗体的高变区内。具体地，氨基酸序列可以在共有抗体的CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。所有或者仅一部分氨基酸序列可以在CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。优选地，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列可以在共有抗体的CDR3区内，SEQ ID NO：17的氨基酸序列在CDR2区内，且SEQ IDNO：18的氨基酸序列在CDR1区内。
本发明还提供了以与S15、A3R、S1、S11、D1和/或D3基本上相同的亲和力结合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb的抗体。在一个实施方案中，抗体以与S15基本上相同的亲和力结合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且在该实施方案中，抗体优选包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的一个或多个氨基酸序列。优选地，这些氨基酸序列在抗体的高变区内。具体地，所述氨基酸序列可以在抗体的CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。所有或者仅一部分氨基酸序列可以在CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。优选地，SEQ ID NO：9的氨基酸序列在抗体的CDR3区内，SEQ ID NO：17的氨基酸序列在CDR2区内，且SEQ ID NO：18的氨基酸序列在CDR1区内。
在另一实施方案中，本发明的抗体以与A3R基本上相同的亲和力结合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且在该实施方案中，该抗体优选包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的一个或多个氨基酸序列。优选地，这些氨基酸序列在抗体的高变区内。具体地，所述氨基酸序列可以在抗体的CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。所有或者仅一部分氨基酸序列可以在CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。优选地，SEQ ID NO：10的氨基酸序列在抗体的CDR3区内，SEQ IDNO：17的氨基酸序列在CDR2区内，且SEQ ID NO：18的氨基酸序列在CDR1区内。
在另一实施方案中，本发明的抗体以与S1基本上相同的亲和力结合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且在该实施方案中，该抗体优选包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的一个或多个氨基酸序列。优选地，这些氨基酸序列在抗体的高变区内。具体地，所述氨基酸序列可以在抗体的CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。所有或者仅一部分氨基酸序列可以在CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。优选地，SEQ ID NO：28的氨基酸序列在抗体的CDR3区内，SEQ IDNO：17的氨基酸序列在CDR2区内，且SEQ ID NO：18的氨基酸序列在CDR1区内。
在另一实施方案中，本发明的抗体以与S11基本上相同的亲和力结合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且在该实施方案中，该抗体优选包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的一个或多个氨基酸序列。优选地，这些氨基酸序列在抗体的高变区内。具体地，所述氨基酸序列可以在抗体的CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。所有或者仅一部分氨基酸序列可以在CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。优选地，SEQ ID NO：31的氨基酸序列在抗体的CDR3区内，SEQ IDNO：17的氨基酸序列在CDR2区内，且SEQ ID NO：18的氨基酸序列在CDR1区内。
在另一实施方案中，本发明的抗体以与D1基本上相同的亲和力结合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且在该实施方案中，该抗体优选包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的一个或多个氨基酸序列。优选地，这些氨基酸序列在抗体的高变区内。具体地，所述氨基酸序列可以在抗体的CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。所有或者仅一部分氨基酸序列可以在CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。优选地，SEQ ID NO：14的氨基酸序列在抗体的CDR3区内，SEQ IDNO：17的氨基酸序列在CDR2区内，且SEQ ID NO：18的氨基酸序列在CDR1区内。
在另一实施方案中，本发明的抗体以与D3基本上相同的亲和力结合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且在该实施方案中，该抗体优选包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的一个或多个氨基酸序列。优选地，这些氨基酸序列在抗体的高变区内。具体地，所述氨基酸序列可以在抗体的CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。所有或者仅一部分氨基酸序列可以在CDR3区、CDR2区或者CDR1区内。优选地，SEQ ID NO：13的氨基酸序列在抗体的CDR3区内，SEQ IDNO：17的氨基酸序列在CDR2区内，且SEQ ID NO：18的氨基酸序列在CDR1区内。
对于本文描述和详述的≤25个氨基酸残基的所有氨基酸序列(例如，CDR、CDR侧翼区)，将下述情形理解并考虑为本发明的另一实施方案：这些氨基酸序列在它们的范围内包括一个或两个氨基酸替代，并且优选地，所述替代是保守氨基酸替代。对于本文描述和详述的＞25个氨基酸残基的所有氨基酸序列，将下述情形理解并考虑为本发明的一个实施方案：这些氨基酸序列在它们的范围内包括与原始序列具有≥90％序列相似性的氨基酸序列(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997))。类似或者同源氨基酸定义为不相同的氨基酸，其显示出相似的性质，即酸性、碱性、芳香性、大小、带正电或负电、极性、非极性。
通过比较两种不同肽或多肽的氨基酸序列确定氨基酸相似性或者同源性或者序列相似性的百分数。通过DNA测序测定抗体序列。比对两条序列，通常使用为该目的而设计的多种计算机程序之一，并比较每个位置上的氨基酸残基。然后确定氨基酸同一性或者同源性。然后应用算法以确定氨基酸相似性的百分数。通常优选比较氨基酸序列，这是因为检测肽、多肽或者蛋白质分子之间精细关系的灵敏性极大地增加。蛋白质比较可以考虑保守氨基酸替代的存在，从而如果不相同的氨基酸具有相似的物理和/或化学性质，那么错配可以产生正得分(Altschul等人(1997)，如前)。
在本发明的一个实施方案中，每条轻链和重链的三个高变区可以在两条链之间和在链内和/或链间的三个高变部位间互换。
根据本发明，共有抗体和以与S15、A3R和/或D1/D3基本上相同的亲和力结合的抗体包括IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体。IgG类包括一些亚类，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
可以以多种形式，如片段、复合体和多聚体形式提供抗体。根据本发明，抗体片段包括Fv、scFv、dsPv、Fab、Fab2和Fd分子。较小的抗体片段，如Fv的片段和Fab的片段也包括在术语“片段”中，只要它们保持原始抗体或者较大片段的结合特征即可。此类片段的实例将为(1)微型抗体，其包含仅Fv的重链的片段，(2)微体，其包含抗体重链可变区的小部分单位(国际申请号PCT/IL99/00581)，(3)具有轻链的片段的类似体，和(4)具有轻链可变区的功能单位的类似体。构建体包括，例如，多聚体，如双链抗体、三链抗体和四链抗体。除非特别指出或基于上下文和/或本领域知识指出，术语“抗体”意在包括所有这些分子，以及它们的衍生物、组合、修饰、同系物、模拟物和变体。
已经确定scFv穿透组织并且比完全大小的抗体更快地从血中清除，因为它们尺寸更小(Adams等人，Br.J.Cancer 77：1405-12(1988)；Hudson，Curr.Opin.Immunol.11(5)：548-557(1999)；Wu等人，Tumor Targeting 4：47(1999))。从而，scFv通常用于涉及放射性标记的诊断、预后或者分期，如肿瘤显像，以允许放射性标记从身体更快地清除。最近许多癌导向scFv多聚体已经经历体内稳定性和功效的临床前评估(Adams等人(1988)，如前；Wu(1999)，如前)。
通常，设计scFv单体，其中VB结构域的C-末端被多肽接头粘连在VL的N-末端残基。任选地，使用相反取向：VL结构域的C-末端通过多肽接头粘连在VH的N-末端残基(Power等人，J.Immun.Meth.242：193-204(2000))。多肽接头通常长为约15个氨基酸。当接头减小到约3到7个氨基酸时，scFv不能折叠成功能Fv结构域而是与第二个scFv结合形成双链抗体。此外，将接头的长度减小到小于3个氨基酸迫使scFv结合成三聚体或四聚体，这取决于接头长度、组成和Fv结构域取向(Powers(2000)，如前)。
最近，已经发现多价抗体片段如scFv二聚体、三聚体和四聚体通常提供了比亲代抗体与靶结合更高的亲和力。该更高的亲和力提供了潜在优点，包括对肿瘤导向应用的改善的药物代谢动力学。此外，在研究P-选择蛋白及其配体PSGL-1(它们参与白细胞的粘连和滚动)中，科学家已经推断表达PSGL-1的二聚体形式的细胞因为该更高的结合亲和力而建立更稳定的滚动粘附。这些粘附更具剪切抗性并且在滚动速度中显示出较小波动(Ramachandran等人，PNAS，98(18)：10166-71(2001))。
这些多价形式的更大的结合亲和力在诊断和治疗方案中是有益的。例如，scFv可以用作结合靶受体的阻断剂并从而阻断“天然”配体的结合。在此类实例中，希望scFv和受体间具有更高亲和力的结合以减小解离的机会，这可能使得天然配体和靶具有不希望的结合。此外，当靶受体参与粘附和滚动或者当细胞上靶受体存在于高剪切流的区域，如血小板中时，该更高的亲和力是有用的。
一旦已经选择和/或开发了具有所希望的结合能力的抗体，本领域技术人员就能够使用本文提供的指导产生保持最初抗体的特征的构建体和片段。例如，可以产生保持最初所选或开发的抗体的所希望的特征的完整抗体分子、Fv片段、Fab片段、Fab2片段、二聚体、三聚体和其他构建体。
如果希望替代氨基酸，但是仍然保持抗体的特征，本领域技术人员则可以进行保守氨基酸替代。也可以对抗体进行诸如缀合多种试剂的修饰而不改变它们的结合特征。也可以对抗体或片段进行其他修饰，如产生更稳定的修饰而不改变它们的特异性。例如，可以进行类肽修饰、半类肽修饰、环肽修饰、N-末端修饰、C末端修饰、肽键修饰、主链修饰和残基修饰。本领域技术人员能够按照本说明书的教导测试经修饰的抗体或者片段以评估它们的结合特征是否已经受到改变。
同样，本领域技术人员能够使用本文提供的教导改变抗体的结合特征，以得到具有更希望的特征的分子。例如，一旦鉴定了具有所希望性质的抗体，就可以用随机或者定向诱变产生抗体的变体，并且可以对那些变体筛选所希望的特征。
使用本领域已知的常规方法，技术人员将能够确定具有共有抗体的结合能力和/或特异结合硫酸化PSGL-1或硫酸化GPIb并且以与S15和A3R基本上相似的亲和力的额外抗体。例如，使用本文描述的生物淘选(biopanning)方法可以分离诸如D1和D3的额外抗体，其中共有抗体结合的分子或细胞用于筛选特定的噬菌体展示文库，尤其从白血病、淋巴瘤和骨髓瘤患者制备的文库。
根据本发明的抗体还可以具有标记，其可以插入或者附着到该抗体以帮助制备和鉴定所述抗体，和用于诊断中。可以以后从所述分子除去所述标记。有用的标记的实例包括：AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、C蛋白、S-
Figure A20048002491400371
、T7、V5和VSV-G(Jarvik和Telmer，Ann.Rev.Gen.，32，601-18(1998))。标记可以优选为c-myc或者KAK。
本发明提供了scFv抗体。文中所用的scFv定义为由人抗体的重链的可变区和人抗体的轻链可变区组成的分子，所述分子可以相同或不同，并且其中重链可变区连接、连结、融合或者共价附着或者结合轻链的可变区。
scFv构建体可以是掺入抗体的一个或多个高变结构域的scFv分子的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体等)。所有scFv来源的构建体和片段都保持增强的结合特征，从而可选择性和/或特异性地结合有利于其他细胞的靶细胞。主要通过高变区确定结合选择性和/或特异性。可以构建本发明的抗体以折叠成多价Fv形式，其可以提高结合亲和力和特异性和增加的血液中半衰期。
别人已经设计和产生了scFv的多价形式。一种方法是用接头连接两个scFv。另一方法涉及使用两个scFv之间的二硫键进行连接。Holliger等人，PNAS 90：6444-48(1993)和Kortt等人，ProteinEng.10：423-33(1997)报导了产生二聚体或三聚体Fv的最简单的方法。设计一种此类方法以用于通过加入FOS和JUN蛋白质区的序列以在它们和scFv的c末端之间形成亮氨酸拉链来产生scFv的二聚体(Kostelny等人，J Immunol.148(5)：1547-53(1992)；De Kruif等人，J Biol Chem.271(13)：7630-34(1996))。设计另一种方法用于通过在scFv的c末端加入链霉抗生物素蛋白编码序列来产生四聚体。链霉抗生物素蛋白由4个亚基组成，从而当scFv-链霉抗生物素蛋白折叠时，4个亚基适应它们而形成四聚体(Kipriyanov等人，Hum Antibodies Hybridomas 6(3)：93-101(1995))。在再一个方法中，为了产生二聚体、三聚体和四聚体，将游离半胱氨酸导入目的蛋白质。用具有可变数目(2到4)的马来酰亚胺基团的基于肽的交联剂将目的蛋白质交联到游离半胱氨酸(Cochran等人，Immunity 12(3)：241-50(2000))。
在该系统中，可以设计噬菌体文库(如上文描述的)以用于展示scFv，其可以折叠成抗体的Fv区的单价形式。此外，并且也在上文中讨论的，所述构建体适于细菌表达。遗传工程改造的scFv包含通过连续编码的15个氨基酸柔性肽间隔臂连接的重链和轻链可变区。优选的间隔臂是(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：8)。该间隔臂的长度以及其氨基酸成分提供了不庞大的间隔臂，其允许VH和VL区折叠成功能性Fv结构域，该结构域提供了对其靶的有效结合。
改变间隔臂的长度是形成二聚体、三聚体和triamers(通常在本领域中分别称作双链抗体、三链抗体和四链抗体)的另一优选方法。在其中连接scFv的两个可变链的间隔臂缩短到通常5-12个氨基酸残基的条件下形成了二聚体。该缩短的间隔臂防止来自相同分子的两个可变链折叠成功能性Fv结构域。相反，所述结构域被迫使与另一分子的互补结构域配对以产生两个结合结构域。在优选方法中，用仅5个氨基酸(Gly4Ser)(SEQ ID NO：19)的间隔臂进行双链抗体构建。可以从两个相同的scFv，或者从scFv的两个不同的群体形成该二聚体，并且所述二聚体保持亲本scFv的选择性和/或特异增强的结合活性，和/或显示出增加的结合强度或亲和力。
以类似方式，在其中连接scFv的两个可变链的间隔臂缩短到通常小于5个氨基酸残基的条件下形成三链抗体，从而防止来自相同分子的两条可变链折叠成功能性Fv结构域。相反，三个分开的scFv分子结合形成三聚体。在优选方法中，通过完全除去该柔性间隔臂得到三链抗体。可以从三个相同的scFv，或者从scFv的两个或三个不同群体形成三链抗体，并且所述三链抗体保持亲本scFv的选择性和/或特异增强的结合活性，和/或显示出增加的结合强度或亲和力。
在其中连接scFv的两个可变链的间隔臂缩短到通常小于5个氨基酸残基的条件下类似地形成四链抗体，从而防止来自相同分子的两条可变链折叠成功能性Fv结构域。相反，四个分开的scFv分子结合形成四聚体。可以从四个相同的scFv，或者从scFv的不同群体的1-4个个体单位形成四链抗体，并且所述四链抗体应该保持亲本scFv的选择性和/或特异增强的结合活性，和/或显示出增加的结合强度或亲和力。在其中间隔臂通常小于5个氨基酸长的条件下形成三链抗体还是四链抗体取决于混合物中具体scFv的氨基酸序列和反应条件。
本发明还提供了包含共有序列：X1-X2-X3-Pro-X5-X6(SEQ ID NO：3)的多肽，其中X1和X6为疏水氨基酸，X2、X3和X5为任意氨基酸。在所述多肽的一个实施方案中，X2选自精氨酸、赖氨酸，且X1和X6选自亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸。所述多肽可以优选包含SEQ ID.NO：5。备选地，所述多肽可以包含SEQ IDNO：6。在根据本发明的多肽的另一实施方案中，X2和X3是精氨酸并且疏水氨基酸X6优选为异亮氨酸。在根据本发明的多肽的另一实施方案中，X1选自亮氨酸和甲硫氨酸，X2和X3是精氨酸，X5选自丝氨酸和缬氨酸，且X6为异亮氨酸。本发明的多肽可以基本上是环状或成环的。
本发明还提供了特异结合PSGL-1的多肽，其中所述多肽以基本上类似S15的亲和力结合。备选地或额外地，所述多肽可以以基本上类似于A3R的亲和力特异性地结合GPIb。
本发明还提供了分离或纯化的多肽，如编码本发明的抗体和多肽的重组核酸。此类分离或纯化的多肽可以在原核或真核表达系统中产生。此类表达系统包括表达载体和用此类表达载体转染的宿主细胞。在原核和真核系统中产生抗体和多肽的方法是本领域公知的，所述方法包括在允许此类抗体表达的条件培养重组宿主细胞，并从重组宿主细胞或者从培养基分离或纯化此类抗体。
如本发明中定义或如所讨论的真核细胞系统指用于通过遗传工程方法产生肽或多肽的表达系统，其中宿主细胞是真核细胞。真核表达系统可以是哺乳动物系统，并且哺乳动物表达系统中产生的肽或多肽经纯化后优选基本上无哺乳动物污染物。有用的真核表达系统的其他实例包括酵母表达系统。
用于产生本发明的肽或多肽的优选的原核系统使用大肠杆菌(E.coli)作为表达载体的宿主。大肠杆菌系统中产生的肽或多肽经纯化后基本上无大肠杆菌污染性蛋白质。原核表达系统的使用可以导致在提供用于本发明的一些或所有序列的N-末端加入甲硫氨酸残基。可以如本领域已知的进行肽或多肽产生后N-末端甲硫氨酸残基的除去，以允许肽或多肽的完全表达，一个实例是在适宜的条件下使用气单胞菌属(Aeromonas)氨肽酶(美国专利号5,763,215)。
本发明还提供了选择结合硫酸化表位的实体的方法，所述实体如抗体或者其片段或备选地小无机化学实体。这些方法包括针对具有硫酸化表位的肽淘选文库(例如，淘选噬菌体展示文库以鉴定抗体或者其片段和淘选组合文库以鉴定小无机化学实体)。用于淘选的适宜的硫酸化表位可以基于或者来源于例如，PSGL-1、GPIb、α-2-抗纤溶酶；氨肽酶B；CC趋化因子受体，如CCR2、CCR5、CCR3、CXCR3、CXCR4、CCR8和CCR2b；七跨膜片段(7TMS)受体；凝血因子，如因子V、VIII和IX；血纤蛋白原γ链；肝素辅因子II；分泌粒蛋白，如分泌粒蛋白I和II；玻连蛋白、淀粉状蛋白前体、α-2-抗纤溶酶；缩胆囊素；α-绒毛膜促性腺激素；补体C4；硫酸皮肤素蛋白聚糖；纤连蛋白；或castrin。此类肽可以在任意位置硫酸化。优选地，包含硫酸化表位的所述肽来源于或基于PSGL-1(特别当在从N-末端51位酪氨酸残基硫酸化时)、GPIb(特别当在276位的酪氨酸残基硫酸化时，且在较低程度上在279位酪氨酸残基硫酸化时)或CCR5(特别当在10位酪氨酸残基硫酸化时)的区。在一个实施方案中，所述方法包括将肽固定在固体支持体上。任选地，所述方法包括使用非硫酸化的可溶肽或者在备选酪氨酸位置硫酸化的可溶肽的竞争性淘选。淘选适宜的组合文库以鉴定小无机化学实体当然可以用于实施这些方法。
在本发明的优选实施方案中，用于产生结合硫酸化表位(例如，本发明的抗体或者多肽)的实体的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供SEQ ID NO：7的PSGL-1的肽；(c)淘选文库以选择结合SEQ ID NO：7的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：7的肽的所选实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的优选实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供PSGL-1(SEQ ID NO：7)的固定化的肽；(c)在可溶性非硫酸化PSGL-1肽(SEQ ID NO：26)的存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：7的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：7的肽的所选实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的优选实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体和多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供PSGL-1(SEQ ID NO：7)的固定化肽；(c)在可溶性硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：44和/或50)的存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：7的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：7的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的优选实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供PSGL-1(SEQ ID NO：7)的固定化肽；(c)在可溶性硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：44和/或50)或非硫酸化PSGL-1肽(SEQ IDNO：26)的存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：7的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：7的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的优选实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供PSGL-1(SEQ ID NO：7)的固定化肽；(c)在可溶性硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：44和/或50)和可溶性非硫酸化GPIb肽(SEQ IDNO：43)的存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：7的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：7的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的优选实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供PSGL-1(SEQ ID NO：7)的固定化肽；(c)在可溶性硫酸化GPIb肽(选自SEQ ID NO：44、50、57和58或它们的组合)和/或非硫酸化PSGL-1肽(SEQ ID NO：43)的存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：7的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：7的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供GPIb肽(SEQ ID NO：44)的固定化肽；(c)对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：44的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：44的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供GPIb肽(SEQ ID NO：44)的固定化肽；(c)在可溶性非硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：43)存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQID NO：44的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：44的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供GPIb肽(SEQ ID NO：44)的固定化肽；(c)在SEQ ID NO：7、48、49或59的一种或多种可溶性硫酸化PSGL-1肽存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：44的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：44的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供GPIb肽(SEQ ID NO：44)的固定化肽；(c)在SEQ ID NO：7、48、49或59的一种或多种可溶性硫酸化PSGL-1肽和可溶性非硫酸化PSGL-1肽(SEQ ID NO：26)存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQID NO：44的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：44的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供GPIb肽(SEQ ID NO：44)的固定化肽；(c)在SEQ ID NO：7、48、49或59的一种或多种可溶性硫酸化PSGL-1肽和可溶性非硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：43)存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ IDNO：44的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQID NO：44的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供GPI b肽(SEQ ID NO：44)的固定化肽；(c)在SEQ IDNO：7、48、49或59前一种或多种可溶性硫酸化PSGL-1肽和一种或多种可溶性硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：44和/或50)存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：44的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：44的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供CCR5(SEQ ID NO：53)的固定化肽；(c)对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：53的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：53的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供CCR5(SEQ ID NO：53)的固定化肽；(c)在可溶性非硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：43)和/或非硫酸化可溶性PSGL-1肽(SEQ IDNO：26)存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：53的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：53的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供CCR5(SEQ ID NO：53)的固定化肽；(c)在可溶性硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：44和/或50)和/或可溶性硫酸化PSGL-1肽(SEQ IDNO：7、48、49和/或59)存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ IDNO：53的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQID NO：53的肽的实体(例如，抗体或包含s cFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供CCR5(SEQ ID NO：53)的固定化肽；(c)在可溶性硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：44和/或50)和/或非硫酸化可溶性PSGL-1肽(SEQID NO：26)存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：53的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：53的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在本发明的另一实施方案中，产生实体(例如，本发明的抗体或者多肽)的方法包括步骤：(a)提供文库(例如，噬菌体展示文库)；(b)提供CCR5(SEQ ID NO：53)的固定化肽；(c)在可溶性硫酸化GPIb肽(SEQ ID NO：44和/或50)和/或非硫酸化可溶性GPIb肽(SEQ IDNO：43)存在下对文库进行淘选，以选择结合SEQ ID NO：53的固定化肽的实体(例如，噬菌体颗粒)；和(d)产生结合SEQ ID NO：53的肽的实体(例如，抗体或包含scFv抗体的多肽)。
在治疗性导向蛋白质如GPIb和PSGL-1上存在的硫酸化酪氨酸表位的备选方法中，通过筛选适宜的组合文库可以鉴定小无机化学实体。此类化学实体相对于基于scFv或者IgG的治疗剂而言具有许多优点。例如，无机化学实体可以经口施用并且具有增强的生物安全性谱，包括减小的免疫交叉反应性。它可以提供针对靶的增强的选择性，尤其按照合理的药物设计以最优化最初选择的先导化合物。其他优点包括更低的生产成本、更长的贮存期间和较不复杂的管理机构批准过程。
因为已经鉴定了例如GPIb和PSGL-1上本发明表位的许多实施方案，所以可以采用配体驱动的方法鉴定无机化学实体，其具有非常窄的特异性，或者备选地，对于诸如再灌注损伤的疾病状态导向一种以上的硫酸化酪氨酸表位，所述再灌注损伤涉及一种以上的不同靶，每种靶都具有此类表位。配体驱动的方法显著缩短了鉴定用于治疗性介入的靶的筛选过程，并且使得可以用引导物最优化同时进行靶确认，可以用一系列聚焦的(focused)文库实施靶确认。
首先通过分析抗体如Y1及其已知靶如GPIb的残基硫酸化Tyr-276和Asp-277之间的三维相互作用可以设计和开发专门用于导向硫酸化酪氨酸表位的无机化学实体的文库。通过计算机辅助组合文库设计可以开发由模拟Y1结合位点并且提供对靶的增加的亲和力的实体组成的化学文库。
本发明还提供了用于鉴定结合硫酸化表位的人抗体的文库。所述文库为免疫球蛋白结合结构域文库，其包含用于互补结合的多种抗原结合结构域，其中所述文库仅在重链CDR3具有多样性。优选地，免疫球蛋白结合结构域为scFv分子。还优选地，免疫球蛋白结合结构域具有来自DP32的重链互补决定区(CDRs)1和2，且更优选地，还具有来自DP32的轻链可变区。本文库的免疫球蛋白结合结构域可以在任意适宜载体，如丝状噬菌体颗粒的表面上展示。在一个实施方案中，本发明的文库可以用于选择硫酸化基序或者表位。
本发明的抗体和其结合片段可以结合、组合、融合或者连接多种试剂，如药物、毒素、药物和放射性同位素与任选地，药学上有效的载体以形成具有抗病和/或抗癌活性的药物-肽组合物、融合物或缀合物。此类缀合物和融合物还可以用于诊断、预后或分期目的。
可以用于本发明的载体的实例包括葡聚糖、HPMA(亲水聚合物)、或者任意其他聚合物，如亲水聚合物，以及其衍生物、组合和修饰。备选地，可以使用经装饰的脂质体，如用scFv Y1分子装饰的脂质体，如Doxil，其是含有大量阿霉素的通过商业途径可得到的脂质体。可以制备此类脂质体以含有一种或多种所希望的试剂，和与本发明的抗体混合以提供高的药物与抗体比。
备选地，抗体或多肽和试剂之间的连接可以是直接连接。两个或更多个相邻分子之间的直接连接可以通过分子中元素或者元素的基团之间的化学键产生。化学键可以是例如，离子键、共价键、疏水键、亲水键、静电键或者氢键。键可以是例如，酰胺、二硫化碳、肽和/或二硫键。为了将抗体附着到试剂或接头，如本领域中已知的，可以使用胺、羧基、羟基、硫醇和酯官能团来形成共价键。
可以通过接头化合物产生肽和试剂之间或者肽和载体之间或者载体和试剂之间的连接。本文所用接头化合物定义为连接两个或更多个部分的化合物。接头可以是直链或分枝的。分枝的接头化合物可以由双分枝、三分枝或者四分枝或更多分枝的化合物组成。可用于本发明的接头化合物包括选自二羧酸、马来酰亚胺酰肼、PDPH、羧酸酰肼和小肽的那些化合物。
根据本发明，接头化合物的更特定的实例包括：(a)二羧酸，如琥珀酸、戊二酸和己二酸；(b)马来酰亚胺酰肼，如N-[马来酰亚胺己酸]酰肼、4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基酰肼和N-[马来酰亚胺十一烷酸]酰肼；(c)(3-[2-吡啶基二硫代]丙酰基酰肼)；和(d)选自2-5个碳原子的羧酸酰肼和其衍生物、组合、修饰和类似物。
使用小肽接头通过直接偶联进行连接也是有用的。例如，使用小肽可以实现例如抗癌药物阿霉素的游离糖和scFv之间的直接偶联。小肽的实例包括AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、C蛋白、S-
Figure A20048002491400461
、T7、V5、VSV-G和KAK。
本发明的抗体和多肽可以结合、缀合、复合或者另外结合显像剂(也称作指示性标记)，如放射性同位素，并且这些缀合物可以用于诊断、预后或分期和显像目的。提供了具有此类放射性同位素-抗体(或片段)缀合物的试剂盒。
可以用于诊断、预后、分期和显像的放射性同位素的实例包括111铟、113铟、99m铼、105铼、101铼、99m锝、121m碲、122m碲、125m碲、165铥、167铥、168铥、123碘、126碘、131碘、133碘、81m氪、33氙、90钇、213铋、77溴、18氟、95钌、97钌、103钌、105钌、107汞、203汞、67镓和68镓。优选的放射性同位素对X射线或者任意适宜的顺磁离子不透。
指示性标记分子还可以是荧光标记分子。荧光标记分子的实例包括荧光素、藻红蛋白或者罗丹明，或者其修饰或缀合物。
缀合指示性标记的抗体和多肽可以用于诊断、预后或分期疾病状态。此外，本发明还提供了从患者清除肿瘤细胞的方法，通过提供含有来自所述患者的细胞的样品并将来自所述患者的细胞与本发明的抗体温育来实现所述方法。可以在体内、体外或者离体(ex vivo)实施此类活动。当在体内或离体实施诊断、预后或分期时，显像剂优选为生理上可接受的，因为它不对患者造成不可接受的水平的伤害。临床医生使用诸如疾病的严重性的标准和其他选择的可用性可以确定伤害的可接受水平。
从而，本发明提供了诊断试剂盒，其用于在治疗之前、期间或之后体外分析治疗功效，所述试剂盒具有显像剂，其具有连接到指示性标记分子或者显像剂的本发明的肽。本发明还提供了使用显像剂用于癌症，更具体地肿瘤的诊断定位和显像的方法，所述方法具有如下步骤：(a)将细胞与组合物接触；(b)测量结合所述细胞的放射性；和因此(c)显示肿瘤。
适宜的显像剂的实例包括荧光染料，如FITC、PE等等，和荧光蛋白质，如绿色荧光蛋白。其他实例包括放射性分子和酶，所述酶与底物反应产生可识别的改变，如颜色改变。
在一个实例中，试剂盒的显像剂为荧光染料，如FITC，并且试剂盒提供了对癌，更具体地，血液相关癌，例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的治疗功效的分析。例如，在诊断后、治疗期间、缓和期间和复发期间，用FACS分析测定通过显像剂染色的细胞百分数和疾病的每个阶段染色的强度。
本发明还提供了诊断、预后或分期患者中的疾病的方法，通过提供含有来自所述患者的细胞的样品并确定本发明的抗体是否结合患者的细胞，从而指出该患者有危险患有或者已经患有所述疾病来实现所述方法。可以在体内、体外或者离体实施此类活动。当在体内或离体实施时，显像剂优选为生理上可接受的，因为它不对患者造成不可接受的水平的伤害。临床医生使用诸如疾病的严重性的标准和其他选择的可用性可以确定伤害的可接受水平。
对于癌症，分期患者中的疾病通常包括基于肿瘤的大小、类型、位置和侵袭力确定疾病的分类。通过肿瘤特征分类癌症的一种分类系统是“TNM Classification of Malignant Tumours”(第六版)(L H.Sobin，编著)，将其引用作为本文参考，并且所述分类系统将癌症阶段分类成T、N和M类，其中T根据其大小和位置描述原发肿瘤，N描述局部淋巴结，且M描述远的转移。此外，数字I、II、III和IV用于指出阶段，并且每个数字指TNM因子的可能的组合。例如，I期乳腺癌由TMN组定义：T1、N0、M0，其指：T1-肿瘤直径为2cm或更小，N0-无局部淋巴结转移，M0-无远的转移。另一种系统用于分期AML，基于法国-美国-英国系统使用在常规处理和细胞化学染色下观察到的形态学对亚型分类。
此外，造血和淋巴样组织的肿瘤疾病的最近提出的世界卫生组织(WHO)分期或分类包括(特别对于AML)疾病的常规FAB型分类以及额外的疾病类型，其与特定细胞遗传学发现和与脊髓发育不良有关的AML相关。其他人也已经提出病理分类。例如，AML特异的一种提议包括疾病类型，其与特异细胞遗传学易位相关并且可以通过形态评估和免疫分型可靠地识别，并且并入相关的脊髓发育不良改变的重要性。该系统将得到细胞遗传学或分子遗传学研究支持并且随着描述新的可识别的临床病理实体而扩大(Arber，Am.J.Clin.Pathol.115(4)：552-60(2001))。
本发明的抗体和多肽可以结合、缀合或者另外结合抗癌剂、抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗转移剂、消炎药、抗血栓形成剂、抗再狭窄剂、抗聚集剂、抗自身免疫剂、抗粘附剂、抗心血管疾病剂、药物试剂或者其他抗疾病剂。试剂指可用于预防性治疗或者诊断哺乳动物的试剂，所述哺乳动物包括但不限于，人、牛、马、猪、鼠、犬、猫或者任意其他的温血动物。
此类试剂的实例包括，但不限于，抗病毒剂，包括包括无环鸟苷、更昔洛韦和齐多夫定；抗血栓形成/再狭窄剂，包括西洛他唑、达肝素钠、瑞维肝素钠和阿司匹林；消炎药包括扎托洛芬、普拉洛芬、哚昔康、乙酰基水杨酸17、双氯芬酸钠、布洛芬、右布洛芬、舒林酸、萘普生、氨托美丁、塞来昔布、吲哚美辛、罗非克西和尼美舒利；抗自身免疫剂包括来氟洛米、昂他克、subreum、WinRho SDF、去纤苷和环磷酰胺；且抗粘附/抗聚集剂包括利马罗斯特、clorcromene和透明质酸，和它们的衍生物、组合和修饰。
示例性药物试剂包括蒽环类抗生素，如阿霉素(阿霉素)、柔红霉素、伊达比星、二乙氧醋酰阿霉素、去甲柔红霉素、表柔比星、去羟阿霉素、吗啉代阿霉素、吗啉代柔红霉素、甲氧基吗啉基阿霉素、甲氧基吗啉代柔红霉素和甲氧基吗啉基阿霉素和它们的取代的衍生物、组合和修饰。其他示例性药物试剂包括顺铂、紫杉醇、加利车霉素、长春新碱、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、泼尼松、氟达拉滨、伊达比星、苯丁酸氮芥、干扰素α、羟基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博来霉素，和它们的衍生物、组合和修饰。
癌细胞生长的抑制包括例如，(i)防止癌性或者转移生长，(ii)减慢癌性或者转移生长，(iii)总体防止癌细胞生长过程或者转移过程，而保持让细胞完整和存活，(iv)干扰癌细胞与微环境的接触，或者(v)杀死癌细胞。
白血病细胞生长的抑制包括，例如，(i)防止白血病或转移生长，(ii)减慢白血病或者转移生长，(iii)总体防止白血病细胞生长过程或者转移过程，而保持让细胞完整和存活，(iv)干扰癌细胞与微环境的接触，或者(v)杀死白血病细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了通过使用本发明抗体诱导或者激活ADCC的方法。因此，本发明的共有抗体和以与S15和A3R基本上相同的亲和力结合的抗体可以激活ADCC和/或刺激自然杀伤(NK)细胞(例如，CD56+)、γδT细胞和/或单核细胞，这可以导致细胞溶解。通常，施用包含抗体的Fc区或者部分的抗体后，抗体结合效应细胞，例如NK细胞上的Fc受体(FcR)，从而引发释放穿孔素和粒酶B和/或诱导FasL表达，其然后导致细胞凋亡。
效应细胞上表达的FasL与靶细胞表面上Fas受体的结合可以通过Fas受体信号转导途径的激活诱导靶细胞的细胞凋亡。在一个实施方案中，包含本发明的共有序列的IgG抗体诱导效应细胞上FasL表达。多种因素可以影响ADCC，包括有关的效应细胞的类型、细胞因子(例如，IL-2和G-CSF)、温育时间、细胞表面上存在的受体数和抗体亲和力。
本发明的抗体和多肽可以有用地连接的抗疾病、抗癌和抗白血病剂的实例包括毒素、放射性同位素和药物。
毒素的实例包括白树毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)、PE40、PE38、白喉毒素、蓖麻毒蛋白或者其衍生物、组合和修饰。
放射性同位素的实例包括可以用于定位和/或治疗的γ-发射体、正电子发射体和X射线发射体，和可以用于治疗的β-发射体和α-发射体。前面描述的用于诊断的放射性同位素也可以用于治疗。
抗癌或者抗白血病剂的非限制性实例包括蒽环类抗生素，如阿霉素(阿霉素)、柔红霉素、伊达比星、二乙氧醋酰阿霉素、去甲柔红霉素、表柔比星、去羟阿霉素、吗啉代阿霉素、吗啉代柔红霉素、甲氧基吗啉基阿霉素、甲氧基吗啉代柔红霉素和甲氧基吗啉基阿霉素和它们的取代的衍生物、组合和修饰。示例性药物试剂包括顺铂、紫杉醇、加利车霉素、长春新碱、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、泼尼松、柔红霉素、伊达比星、氟达拉滨、苯丁酸氮芥、干扰素α、羟基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博来霉素，和它们的衍生物、组合和修饰。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物具有包含本发明的任一共有序列的抗体或多肽和药学上可接受的载体。所述抗体或多肽存在的量可以有效抑制肿瘤细胞或者白血病细胞的细胞滚动、炎症、自身免疫病、转移、生长和/或复制，或者抑制肿瘤患者中肿瘤细胞数目或者白血病患者中白血病细胞数目的增加。备选地，所述抗体或者多肽可以以有效增加肿瘤细胞或者白血病细胞的死亡率的量存在。还备选地，所述抗体或多肽可以以有效改变患病细胞对抗疾病剂伤害的易感性、肿瘤细胞对抗癌剂伤害的易感性或者白血病细胞对抗白血病剂伤害的易感性的量存在。进一步备选地，所述抗体或多肽可以以有效减少肿瘤患者中肿瘤细胞数或者白血病患者中白血病细胞数的量存在。还备选地，所述抗体或多肽可以以有效抑制再狭窄的量存在，在该情况中共有抗体优选包含A3R。所述抗体或多肽还可以以有效抑制HIV进入和/或治疗HIV感染的量存在。备选地，所述抗体或多肽可以用作导向剂将治疗剂导向特定细胞或部位。
可以将本发明的抗体和多肽通过任意适宜的方法施用于需要其的患者。示例性方法包括静脉内、肌内、皮下、局部、气管内、鞘内、腹膜内、淋巴管内、鼻、舌下、经口、直肠、阴道、呼吸道、口的、皮内、经皮或者胸膜内施用。
对于静脉内施用，将优选制备制剂从而施用于患者的量将是所希望的组合物的从约0.1mg到约1000mg的有效量。更优选地，所施用的量将是所希望的组合物的从约1mg到约500mg的范围内。本发明的组合物在宽剂量范围内有效并且取决于多种因素，诸如所治疗的疾病的详情、基于肽或者多肽的药物组合物在患者身体内的半衰期、与抗体或者其片段复合的任何试剂和药物组合物的物理和化学特征、药物组合物的施用方式、待治疗或诊断的患者的详情，以及治疗医生认为重要的其他参数。
用于经口施用的药物组合物可以是任意适宜的形式。实例包括片剂、液体、乳剂、悬浮液、糖浆、丸剂、囊片(caplet)和胶囊。制备药物组合物的方法是本领域公知的(见，例如，Remington，TheScience and Practice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaro(编著)Lippincott，Williams&Wilkins(pub))。
还可以配制药物组合物以便方便定时、持续、脉冲或连续释放。还可以以装置，如定时、持续、脉冲或持续释放装置施用药物组合物。
用于局部施用的药物组合物可以是任意适宜的形式，如乳膏、软膏、洗剂、贴剂、溶液、悬浮液、冻干物和凝胶。
具有本发明的抗体和多肽的组合物可以包含常规的药学上可接受的稀释剂、赋形剂、载体等等。片剂、丸剂、囊片和胶囊可以包括常规赋形剂，如乳糖、淀粉和硬脂酸镁。栓剂可以包括赋形剂，如蜡和甘油。注射液包括无菌无致热原介质，如盐水，并且可以包括缓冲剂、稳定剂或者防腐剂。还可以使用常规肠溶衣。
本发明的抗体和多肽和其药物组合物可以用于治疗需要其的患者中疾病的方法中(例如，治疗可以包括减轻疾病的影响、防止疾病或者抑制疾病进展)。此类方法包括抑制肿瘤细胞或者白血病细胞的细胞滚动、炎症、自身免疫病、转移、生长和/或复制，或者抑制肿瘤患者中肿瘤细胞数或者白血病患者中白血病细胞数的增加。此外，此类方法包括增加肿瘤细胞或者白血病细胞的死亡率，改变患病细胞对抗疾病剂伤害的易感性、肿瘤细胞对抗癌剂伤害的易感性或者白血病细胞对抗癌剂伤害的易感性。此类方法还包括减少肿瘤患者中肿瘤细胞数或者白血病患者中白血病细胞数。此类方法还包括抑制或减少细胞中HIV进入和，由于此类抑制导致的阻断HIV的复制，并从而治疗HIV感染。此类方法还包括预防或抑制心血管疾病，如再狭窄。
本发明还提供了用于生产治疗多种疾病状态的药物的抗体和多肽，所述疾病状态为例如AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、前-B-ALL、多发性骨髓瘤、转移、HIV感染、心血管疾病或者其他疾病，在所述其他疾病中诸如细胞滚动、炎症、免疫反应、感染、自身免疫反应、转移的细胞功能或者活动起重要作用。此类药物包含本发明的抗体和多肽。
在该申请全文中，已经参考了多种出版物、专利和专利申请。这些出版物、专利和专利申请的教导和公开内容在此全文引用作为本申请的参考，以更完整地描述本发明所属的技术水平。
实施例
给出下面的实施例以帮助理解和进一步阐明本发明，但是不意在并且不理解为以任何方式限制本发明的范围。尽管描述了具体试剂和反应条件，但是可以做出修改，它们包括在本发明的范围内。
实施例1
本实施例阐明S15 scFv抗体片段的选择、产生和最初表征，包括S15抗体片段的结合能力。简言之，用基于具有6个氨基酸的随机CDR3-VH的VH-VL的特定支架的噬菌体展示文库来鉴定结合硫酸化PSGL-1的scFv抗体。通过对具有成熟PSGL-1分子的从N-末端到C-末端或者从C-末端到N-末端的氨基酸1-17的序列(相应于不成熟PSGL-1分子的氨基酸42-58，即，包括信号序列)的合成的硫酸化肽进行淘选可以得到scFv抗体。用流式细胞术，尤其荧光激活细胞分类术(FACS)和ELISA鉴定和表征结合合成的硫酸化肽或者表达PSGL-1的完整细胞的特定噬菌体克隆。
从pHEN载体中的组合噬菌体抗体文库(CAT)分离的克隆的支架构建噬菌体展示文库。所述支架含有VH3(1-3，3-20)和VL(11-7)。通过长为6个氨基酸的CDR3高变环的随机化构建文库。为了提供在CDR3的5’区具有单个Eag1位点的构建体(而不是如在pHEN-Y1中发现的两个Eag1位点)，通过从pHEN-Y1切除Xma1-Not1片段并插入具有Not1位点的连接部分突变的新片段(通过SEQ ID NO：20的寡核苷酸与SEQ ID NO：21的寡核苷酸退火)将VL的3’末端的Eag1限制位点突变。为了产生两个独特位点(Eag1和Xma1)和导入具有相同大小但是具有随机化CDR3的PCR产物，需要所述突变。连接后，在插入区对质粒测序并证实了突变。用Eag1和Xma1限制酶切新的pHEN-Y1-mut并且大片段是用于随后连接的载体。
通过PCR使用SEQ ID NO：22的寡核苷酸和SEQ ID NO：23的寡核苷酸制备用于制备可变CDR3的模板。从SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离PCR产物(模板A)并纯化以用于进一步扩增。用寡核苷酸SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：23扩增模板A，纯化产物并将其命名为模板B。用SEQID NO：25和SEQ ID NO：23的寡核苷酸扩增模板B，将其纯化并用Eag1和Xma1限制酶限制酶切。纯化用Eag1和Xma1限制酶切的载体pHEN-Y1-mut并将其连接到用相同酶限制酶切的最终PCR产物。
将连接产物用于转化TG1细胞。从3次连接得到的转化得率得到了2.4×106个独立的集落生成单位(CFU)。通过在10个(13cm)SOBAG(20g细菌用胰蛋白胨，5g细菌用酵母，8.5mM NaCl，10mM MgCl2，0.1M葡萄糖，0.1mg/ml氨苄青霉素/升；15g细菌培养用琼脂用于平板)平板中铺平板扩增文库。将来自平板的细菌重悬浮在SOBAG培养基中并在20％甘油中于-70℃保存。所扩增文库的效价为1.5×109CFU/ml。将扩增文库的等分试样(约108CFU)用辅助噬菌体M13KO7感染以便拯救噬菌体形式的文库以实施生物淘选实验。与含有206或者6.4×107个成员的理论文库相反，该文库含有2.5×106个成员。
通过将SEQ ID NO：7的固定化肽与噬菌体展示文库温育，通过洗涤除去未结合的噬菌体，并特异洗脱结合的噬菌体来实施生物淘选。任选在扩增洗脱的噬菌体克隆后，进行额外轮的结合和任选扩增，富集有利于携带最佳结合所述肽的抗体片段的那些噬菌体克隆的特定序列库。几轮淘选后，表征单个噬菌体克隆，并测定克隆的序列。
在本发明中，通过在溶液中用结合SEQ ID NO：7的生物素化硫酸化肽的链霉抗生物素蛋白-磁珠淘选噬菌体展示文库来鉴定S15抗体克隆。该肽通过化学合成并且基于在PSGL-1内氨基酸42-58中发现的高度酸性序列，其中包括第三个酪氨酸残基的硫酸化。将合成肽的N-末端用氨基己酸延伸并且在己酸的氨基进行生物素化以避免硫酸化表位的空间位阻。通过温育过量肽，然后用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤并用PBST-M(补加5％低脂乳的PBST)封闭，将合成的SEQ ID NO：7的硫酸化肽固定在链霉抗生物素蛋白-磁珠(Dynal)上。为了进行淘选，将肽结合的珠子与2×1011个噬菌体温育。将既没有生物素化也没有硫酸化的相同线性序列(SEQ ID NO：45)的肽加入淘选溶液中以避免分离结合非硫酸化肽的scFv克隆。
在PBST中用高严格洗涤进行三轮淘选(每次在37℃20分钟)。洗涤后，结合的噬菌体用甘氨酸0.2M(pH 2.2)洗脱并用Tris 1M(pH9.1)中和。将洗脱的噬菌体通过感染TG1细菌进行扩增并通过辅助噬菌体M13KO7进行拯救。在三轮淘选后实现了最高达5000倍的富集。在第三轮淘选后，对单个克隆分析CDR3区中的氨基酸序列。那些所选克隆的CDR3区氨基酸序列(SEQ  ID.NOS：9、27-33、35、4)在表1中列出。
表1
表1中所示结果表明得到了强共有序列：在所有CDR3序列中，第一和第六位是疏水残基，通常第二位是碱性残基，且第四位是脯氨酸。
为了进一步基于PSGL-1的硫酸化部分分析对合成的硫酸化肽的结合，实施了ELISA分析，该分析使用来自淘选的和所选克隆的噬菌体(图1)和未纯化的scFv上清液(图2)。这些实验包括scFv抗体Y1和L32的分析，二者都是以前鉴定的，并发现它们都结合PSGL-1。Y1在美国专利申请号10/029,926和国际专利申请号PCT/US01/49,440中描述，L32在美国申请号10/189,032中描述)。用SEQ ID NO：7的合成的硫酸化肽在“测试”孔中并用SEQ IDNO：26的合成的非硫酸化肽在“背景”孔中平行进行ELISA分析。按照生产商推荐的将肽包被在NH-CovaLinkTM平板(NUNC)上。从测试孔中相应系统得到的结合数据减去从背景孔得到的结合数据，以产生图1和2中所示的结果。将随机选择的噬菌体克隆用作与合成的硫酸化肽结合的阴性对照(NC)。
图1表明所测试的所有经淘选和选择的噬菌体克隆都特异结合合成的硫酸化肽。图2表明3轮淘选后选择的克隆上表达的所有scFv都特异结合合成的硫酸化肽。
表2提供了用于实施例1的研究中的所有克隆和它们的CDR3区的氨基酸序列的总结。
表2
Figure A20048002491400551
通过FACS分析了来自所选克隆的scFv以评估对ML-2上PSGL-1的结合，所述ML-2是表达PSGL-1的一种AML M4细胞系。如图3中所示，来自所有所选克隆的scFv以及L32都以不同灵敏性结合ML-2细胞上的PSGL-1。
用来自淘选和所选克隆的未纯化的scFv上清液进行ELISA分析，以分析对表达在血小板上的一种糖蛋白glycocalicin的结合。图4中所示结果表明具有SEQ ID NO：9的CDR3序列并且命名为S15的一个克隆与其他所选克隆和先前鉴定的scFv L32相比对glycocalicin具有低亲和力。
一起考虑，图3和4中所示结果表明基于与glycocalicin的结合，S15显示出对表达PSGL-1的ML-2细胞的高亲和力和对血小板的低亲和力。通过结合粒细胞(其为表达PSGL-1的细胞)和血小板的scFv的FACS分析证实了该结论，结果在图5中显示。图5清楚地表明S15强烈结合粒细胞，但是仅微弱结合完整血小板。
图6显示了scFv的粒细胞/血小板结合比的比较。显然，S15的粒细胞/血小板结合比显著高于S11、S9、S1、S20、3.4、3.1、Y1和L32的所述结合比。
图7显示了在针对PSGL-1的鼠抗体KPL-1的存在和不存在时，S15结合ML-2细胞上PSGL-1的分析结果。不存在KPL-1时，S15以高亲和力结合ML-2细胞，但是存在KPL-1时此类结合基本上被消除。这些结果证实了S15结合ML-2细胞上PSGL-1细胞的特异性。
在A蛋白亲和柱上纯化S15以用于实施例2中描述的进一步实验。
实施例2
该实施例描述纯化的S15 scFv抗体的进一步表征，包括与类似纯化的L32和Y1 scFv相比，S15 scFv抗体的结合能力。
实施FACS分析以分析在PBS存在下经纯化的S15、Y1和L32 scFv与ML-2细胞的结合。图8和9中所示结果表明与L32和Y1相比，S15显示出与ML-2细胞的至少100倍的结合。
实施FACS分析以分析在存在50％血浆时，经纯化的S15、Y1和L32 scFv与ML-2细胞的结合。图10和11中所示结果表明与L32和Y1相比，S15结合的绝对值显著更高(至少10倍)。
还分析经纯化的S15 scFv与ML-2细胞结合的剂量反应并将其与L32和Y1的相比较。如图12中所示，甚至在10纳克(ng)下，S15的剂量反应也显著大于L32和Y1的。
实施例3
该实施例描述包含共有序列的两种额外抗体的鉴定，通过针对相应于GPIb的残基268-285的合成肽(包括第一个酪氨酸位置硫酸化)淘选实施例1中描述的文库得到所述抗体。
本实施例阐明了D1和D3 scFv抗体片段的选择、产生和最初表征，包括D1和D3抗体片段的结合能力。简言之，用基于具有6个氨基酸的随机CDR3-VH的VH-VL的特定支架的噬菌体展示文库来鉴定结合硫酸化GPIb的scFv抗体。针对具有成熟GPIb分子的从N-末端到C-末端的氨基酸268-285的序列(GDEGDTDLY(SO4)DYYPEEDTE)(SEQID NO：44)(相应于未成熟GPIb的氨基酸284-301，即包括信号序列)的合成的硫酸化肽淘选得到了scFv抗体。用流式细胞术，尤其荧光激活细胞分类术(FACS)和ELISA鉴定和表征结合合成的硫酸化肽或者表达GPIb的血小板的特定噬菌体克隆。
在实施例1中描述了所用的噬菌体展示文库。
通过将SEQ ID NO：44(GDEGDTDLYSDYYPEEDTE)的固定化肽与噬菌体文库温育，通过洗涤除去未结合的噬菌体，并特异洗脱结合的噬菌体，来实施生物淘选。在任选扩增洗脱的噬菌体克隆后，进行额外轮的结合和任选的扩增，从而富集有利于携带具有最佳结合所述肽的的抗体片段的那些噬菌体克隆的特定序列库。几轮淘选后，表征单个噬菌体克隆，并确定克隆的序列。
在本发明中，通过在溶液中用共价结合磁珠的SEQ ID NO：44的化学合成的硫酸化肽淘选噬菌体展示文库来鉴定D1和D3抗体克隆。SEQ ID NO：44的硫酸化肽基于在成熟GPIb内氨基酸268-285发现的高度酸性序列，其中包括第一个酪氨酸残基的硫酸化。根据生产商的教导，通过包括EDC/NHS的反应将SEQ ID NO：44的合成的硫酸化肽共价结合到胺-磁珠(Dynal)。将珠子用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤并用PBST-M(补加5％低脂乳的PBST)封闭。为了进行淘选，将肽结合的珠子与2×1011个噬菌体温育。将具有相同线性序列(SEQ ID NO：43)但是缺少硫酸化的肽加入淘选溶液中以避免分离结合非硫酸化肽的scFv克隆。
在PBST中用高严格洗涤进行三轮淘选(每次在37℃20分钟)。洗涤后，结合的噬菌体用甘氨酸0.2M(pH 2.2)洗脱并用Tris 1M(pH9.1)中和。将洗脱的噬菌体通过感染TG1细菌进行扩增并通过辅助噬菌体M13KO7进行拯救。在三轮淘选后实现了最高达5000倍的富集。在第三轮淘选后，对单个克隆分析CDR3区中的氨基酸序列。那些所选克隆的CDR3区氨基酸序列(SEQ ID.NOS：11-16)在表3中列出。
表3
Figure A20048002491400571
表3中所示结果表明得到了强共有序列：在所有CDR3序列中，第一和第六位是疏水残基，通常第二位是碱性残基，且第四位是脯氨酸。
为了进一步基于GPIb的硫酸化部分分析对合成的硫酸化肽的结合，实施了ELISA分析，该分析使用来自淘选的和所选克隆的噬菌体(图13)。用SEQ ID NO：44 GPIb硫酸化(GDEGDTDLYSDYYPEEDTE)的合成的硫酸化肽在“测试”孔中并用SEQ ID NO：43(GDEGDTDLYDYYPEEDTE)的合成的GPIb非硫酸化肽在“背景”孔中以及来自PSGL1-1的硫酸化和非硫酸化肽(分别为SEQ IDNO：7(QATEYEYLDYSDFLPETE)和SEQ ID NO：26(QATEYEYLDYDFLPETE))平行进行ELISA分析。按照生产商推荐的将肽包被在NH-CovaLinkTM平板(NUNC)上。从测试孔中相应系统得到的结合数据减去从背景孔得到的结合数据，以产生图13中所示结果。将随机选择的噬菌体克隆用作结合合成的硫酸化肽的阴性对照(NC)。
图13表明每一个选择的噬菌体克隆都特异结合两种合成的硫酸化肽，即GPIb和PSGL-1。尽管所述克隆显示出对合成的硫酸化肽的一系列结合强度，但是每个克隆对GPIb和PSGL-1都显示出大概相同的行为。
通过ELISA分析来自所选克隆的scFv以评估与glycocalicin(来源于血小板中表达的GPIb的外部膜部分)的结合。如图14中所示，scFvs D1和D3显示出显著结合，而D2和D16显示出弱结合，且D5和D9类似于阴性对照。
通过FACS分析来自所选克隆的scFv(每次实验1μg)以评估与表达PSGL-1的AML M4细胞系ML-2的结合。如表4中所示，所有scFv都以不同灵敏性结合ML-2细胞。D1和D3显示出对ML-2的强力结合，该结合可能是通过与PSGL-1的表位的相互作用。
表4
  克隆   几何平均值
  阴性   4.4
  D1   26.7
  D2   18.7
  D3   44.1
  D5   5.14
  D9   10.5
  D16   17.0
实施例4
本实施例阐明具有本发明共有序列范围内的CDR3序列的几种scFv抗体的结合。简言之，使用Y1-scFv的CDR3序列作为支架，产生突变scFv并评估这些突变对结合血小板和粒细胞的影响。
使用Y1-scFv的重链(CDR3H)的CDR3中的定点诱变，产生落入共有序列内的额外的CDR3区。然后试验这些额外的scFv以确定对血小板和粒细胞的相对结合。
已知Y1-scFv结合血小板上发现的带负电荷的GPIbα表位。在包含Y1的CDR3H的6个氨基酸序列中，在第二位有精氨酸残基，即带正电荷的氨基酸。为了检查该精氨酸残基在与GPIbα结合中的可能的静电影响，构建了四种突变体scFv。突变体R2A用丙氨酸替代精氨酸残基；突变体A3R在第三位具有额外的精氨酸，其替代丙氨酸；突变体V5R在第5位用额外的精氨酸，其替代缬氨酸。第四种scFv为混乱的突变体。在表5中概述scFv突变体。
表5
  MAb   CDR3序列   序列标识号
  Y1   MRAPVI   (SEQ ID NO：4)
  R2A   MAAPVI   (SEQ ID NO：45)
  A3R   MRRPVI   (SEQ ID NO：10)
  V5R   MRAPRI   (SEQ ID NO：46)
  混乱的   IPMARV   (SEQ ID NO：47)
通过如下FACS分析实施四种突变体scFv和Y1 scFv在结合血小板中的比较分析。
用scFv的400μg混合物免疫兔产生抗-scFv抗体，并用PhycolinkTM R-藻红蛋白缀合试剂盒(ProZyme，San Leandro，CA)根据生产商的教导标记所述抗体。室温下将scFv的等分试样(10μg/mL)与107个经洗涤的血小板温育1小时。然后在含有1％BSA的PBS中洗涤血小板并与R-藻红蛋白-抗-scFv抗体在室温温育1小时。然后洗涤血小板，将其重悬浮在PBS中，并通过FACS(VACScan，Becton-Dickinson，CA)分析样品(104个血小板)。
图15显示了使用来自不同供体的血小板的3个实验的平均结合+SEM。与Y1亲代scFv相比，突变体R2A不显示出与血小板的结合，从而表明CDR3H的第二位精氨酸在血小板结合功能中起作用。在1到10μg/ml浓度范围内，突变体V5R以类似于野生型Y1-scFv的方式结合血小板。然而，在20μg/ml浓度下，V5R的结合是Y1 scFv的两倍(图15)。相反，与在所有试验的浓度下的Y1 scFv相比，突变体A3R scFv显示出9倍的与血小板的结合，从而表明在靠近2位精氨酸残基的另一精氨酸氨基可以增加与血小板的结合。混乱的scFv不能结合血小板(图15)，如从该突变体在第2位缺少精氨酸所预计的。
还使用ELISA测定分析了scFv与纯化的glycocalicin和GPIbα衍生肽的结合能力。图16将这些结果显示为来自2个实验的5μg/ml scFv的平均结合+STDV。突变体R2A scFv和混乱的scFv不结合纯化的GPIbα，也不结合任一种GPIbα衍生肽。V5R以类似于Y1的方式结合纯化的glycocalicin和GPIbα衍生肽。突变体A3R与Y1相比显示出与glycocalicin的增强的结合。
在如下进行的研究中评估了突变体scFv对血小板聚集的影响。在生物发光凝集测定仪(Chronolog，Havertown，PA)中37℃下以500转/分钟搅拌经洗涤的血小板。将通过血小板悬浮液和悬浮介质的光投射的差异作为100％聚集。通过将多种浓度的mAb-scFvs在室温下温育2分钟后加入激动剂并记录聚集4分钟来评估mAb-scFvs对血小板聚集的影响。
发现A3R scFv对血小板聚集的影响与其增强的血小板结合能力一致。图17表明与Y1 scFv相比，该突变体显示出更有效抑制经洗涤的血小板中利托菌素诱导的、vWF依赖性的血小板聚集(IC50分别为0.2μM和0.8μM)。
一起考虑，这些实验表明Y1-CDR3H中2位的精氨酸残基可能与对血小板GPIbα的结合有关。此外，此类结合可能涉及静电相互作用，因为在3位加入额外的精氨酸残基增大了血小板结合能力和抗聚集功能。
实施例5
还用Cone and Plate(let)Analyzer(CPA)测定法进一步评估了A3R和Y1 scFvs的生物活性，所述CPA测定法是临床评估在高剪切率，从而模拟生理条件下的聚苯乙烯表面上全血血小板粘附和聚集的新方法(Varon等人，(1997)Thromb.Res.85(4)：283-294；Shenkman等人，(2000)Thromb.Res.99(4)：353-361)。
如下进行这些实验。将血样(0.2ml)置于非组织培养四孔聚苯乙烯平板(Nunc，Kockilde，丹麦)上并在1300s-1的剪切下流动1分钟，其中使用旋转特氟隆锥体，其是为该系统专门设计的。所述锥体具有14mm的直径和2.45°的角，其在整个平板表面产生恒定的流体剪切应力。然后用PBS充分洗涤孔，用May-Grunwald染料染色并用倒置光学显微镜(Olympus，Tokyo，日本)分析，该显微镜连接图像分析系统(Galai，Migdal Haemek，以色列)。
进行CPA测定以评估CPA测定中1μM(25μg/ml)和2μM(50μg/ml)scFv抗体对血小板粘附的影响。如图18中所示，尽管A 3R突变体显示出表面覆盖度从对照中的13％降低到分别在1μM和2μM浓度下的7％和3％。相比而言，Y1-scFv对表面覆盖度没有影响并且在两种浓度下都类似于对照中。这些结果表明在CPA的流动条件下，A3R突变体通过其与血小板上GPIb受体的结合抑制血小板对聚苯乙烯表面的粘附。
两种抗体的平均大小(AS)稍微减小(数据未显示)。这些结果表明在流动条件下，A3R scFv可以通过其与血小板上GPIb受体的结合抑制血小板对聚苯乙烯表面的粘附。
基于如下观察，即在高剪切应力条件(如在小动脉中发生的或者由动脉狭窄产生的)下，A3R结合硫酸化GPIb并且防止GPIb和vWF之间的相互作用，该抗体可以治疗性用于预防和/或治疗动脉粥样硬化病。
实施例6
本实施例描述了S15、A3R和Y1对健康的富含血小板的血浆(PRP)的结合特征的比较。
对从两名健康供体制备的PRP样品进行FACS分析，以分析不同浓度Y1、A3R和S15对血小板的结合，其结果在表6中描绘。
表6
PRP样品#1
  0.1μg   0.5μg   1μg   2μg
  Y1(PO3)   Neg   Neg   Negative   18
  A3R   Neg   Neg   126
  S15   Neg   Neg   30   120
*“Neg”代表阴性并且定义为当几何平均值低于10时。
PRP样品#2
  0.1μg   0.5μg   1μg   2μg
  Y1(PO3)   Neg   Neg   Neg   13
  A3R   Neg   Neg   96
  S15   Neg   Neg   23   68
表6中结果表明在1μg浓度下，A3R以比S15更强亲和力结合血小板，S15以比Y1更强亲和力结合血小板。在1μg时，两种PRP样品的平均几何平均值对于A3R为116，对于S15为26，且对于Y1为阴性。
通过FACS分析了所选scFv(每个实验0.5μg)以评估对表达GPIb的PRP(富含血小板的血浆)的结合。如表7中所示，D1和D3显示出对PRP的显著结合，其中D1以相对更大的程度结合。D1结合PRP的水平类似于scFv S11(LRYPFF)(SEQ ID NO：31)所显示的水平，所述scFv S11的选择在USSN 10/611,238的实施例1中描述。
表7
  克隆   几何平均值
  D1   33.0
  D3   19.6
  S11   36.2
实施例7
本实施例描述了S15、A3R和Y1对含有粒细胞(G)、淋巴细胞(L)和单核细胞(M)的健康全血细胞的结合特征的比较。
对来自两名健康供体的人全血样品进行FACS分析，以分析不同浓度Y1、A3R和S15与全血细胞的结合，结果在表8中描绘。
表8
全血样品#1
  抗体     0.1μgL   G   M     0.5μgL   G   M      1μgL   G   M      2μgL   G   M
  Y1(PO3)   neg neg neg   neg neg neg.   neg neg 30   20∶30∶57
  A3R   neg neg neg   neg 11  30   34  18  56   ND
  S15   36  26  56   81  100 192   120 150 290   饱和的
全血样品#2
  抗体     0.1μgL   G   M      0.5μgL   G    M      1μgL   G   M     2μgL  G  M
  Y1(PO3)   neg neg neg   neg neg，neg.   neg neg 20   12 20 62
  A3R   neg neg neg   neg 14   30   25  53  120   ND
  S15   18  44  69   78  151  248   112 220 340   饱和的
表8的结果表明S15对全血细胞的结合亲和力高于A3R和Y1的结合亲和力。在0.1μg浓度下，S15结合两种全血样品的平均几何平均值为中到高，而在0.5μg下，两种全血样品的A3R和Y1的平均几何平均值为负或者稍微正。
通过FACS分析scFv D1、D3和S11(每个实验0.5μg)以评估对全血(在淋巴细胞、单核细胞和血小板上门控的)的结合。如表9中所示，相对于其他两种scFv，D1显示出对所有细胞类型的最大结合。
表9
  淋巴细胞   单核细胞   血小板
  D1   23   90   36
  D3   3.8   21   6
  S11   12   38   17
实施例8
该实施例描述为了进一步研究包含所述共有序列的抗体的性质，开发了非人体内动物模型系统。最初目标是鉴定非人哺乳动物物种，其中一种(或多种)抗体(a)结合血小板和(b)能够抑制血小板聚集。
通过FACS分析确定多种scFv抗体结合从不同哺乳动物物种分离的血小板的能力，在表10中总结相对结合结果。
表10
  血小板来源   Y1   A3R   S15 S11 S1 D1
  人   +   ++++   ++++ +++++++ +++++++ +++++++
  狗   +++   ND   +++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++
  猪   +   ND   ++ ND ND ND
  豚鼠   +   ++   ++ ++++ ++++ ++++
  猴子   -   ND   - ND ND ND
  小鼠   -   ND   - ND ND ND
  兔   -   ND   - ++++ ++++ ++++
ND＝未确定的。
在所试验的每个物种内，在包含共有序列的抗体中，scFv Y1显示出最弱的相对结合。该观察支持如下结论，即突变体(A3R)和文库选择的(S15、S11、S1和D1)scFv都具有对如血小板GPIb上发生的硫酸化表位的增强的结合能力。
例如，scFvs A3R和S15显示出对人和豚鼠血小板的5-9倍(相对于Y1)的结合能力，而S11、S1和D1对那些种类的结合能力是Y1的约25倍。
对于scFv组结合的非人血小板的种类阵列，S11、S1和D1每种都结合来自狗、豚鼠和兔的血小板。S15结合来自狗(最高亲和力)、豚鼠和猪的血小板，但是不结合来自兔、小鼠或猴(狒狒和猕猴)的血小板。重要的是，豚鼠是所鉴定的其中包含共有序列的所有抗体都能够结合血小板的唯一非人物种。
对血小板聚集的影响
尽管S1、S11和D1相对于S15以高得多的亲和力结合来自豚鼠的血小板，但是所有这些ScFv对于抑制血小板聚集都显示出相似的能力。
发现scFv S15对豚鼠血小板聚集的抑制效果(IC50 80-160μg/ml)为其对人来源的血小板的抑制效果的约1/10-1/8。这可能是由于scFv S15抗体对豚鼠来源的血小板的相对较低的结合。
发现IgG1 S15和IgG Y1抗体对人和对狗来源的血小板的结合是相似的。两种抗体在相同浓度下都诱导人和狗来源的血小板中血小板的聚集。
豚鼠中scFv的药物代谢动力学
为了评估豚鼠中scFv抗体的药物代谢动力学，将10mg/kgscFvA3R以快速浓注静脉内施用于豚鼠。用ELISA测定法测定不同时间点时豚鼠血液中scFv A3R的水平，并使用FACS分析测定血小板结合的scFv的水平。
用氯胺酮(50mg/kg)与甲苯噻嗪(20mg/kg)的混合物腹膜内注射麻醉三只雄性豚鼠(体重约500g)。通过以10mg/kg(约5mg/豚鼠)静脉内快速浓注施用scFv A3R。抗体施用后在时间0(施用抗体前)和3、10、20、30、60、90、120、180和360分钟收集血样。在每个时间点，抽取0.5ml血液。将3.8％的柠檬酸钠用作抗凝剂。通过以3000×g离心血样15分钟得到血浆并将其在-20℃保存，并通过以150×g离心血样10分钟得到PRP。通过FACS分析使用抗-scFv PE标记的抗体在豚鼠PRP中测试血小板结合的A3R scFv。通过特定ELISA测定血浆A3R scFv抗体浓度。
用FACS分析评估快速浓注施用后不同时间点时结合豚鼠血小板的scFv-A3R抗体的水平。结果(图19)表明快速浓注施用10mg/kgscFv-A3R后10分钟，结合血小板的scFv的水平为最大水平的40-80％，并且在120分钟后达到最大水平。scFv-A3R抗体对血小板的结合在快速浓注施用后360分钟(6小时)内保持高水平，且到24小时时降低了90％。
使用用在Tyr-276具有硫酸化酪氨酸的GPIb肽包被的平板(1μM/孔)通过ELISA测量A3R-scFv的血浆水平。通过加入兔抗-VL(可变轻)抗体，然后通过抗兔HRP(Sigma)和3，3’，5，5’-四甲基-联苯胺(TMB)(Sigma，St Louis，MO)底物检测结合的scFv。通过ELISA平板读出器(Anthos，Salzburg)在O.D.450读取产生的颜色的强度。通过将已知量的这些抗体加入到豚鼠血浆或者加入到含有0.05％Tween 20和2％脱脂乳的PBS中构建标准曲线，从标准曲线计算每个样品中scFv的血浆浓度。
结果表明快速浓注后3分钟scFv A3R的血浆浓度达到峰值并且在6小时内逐渐下降(图20)。豚鼠中A3R的半衰期为139±9分钟。
总之，基于靶血小板上饱和水平的快速实现和相对长的半衰期，上面的研究提供了初步指示，即A3R具有有利的药物代谢动力学特征。
实施例9
BIAcore生物传感器使用表面等离子体共振检测并且允许两种相互作用种类的实时动力学分析。该系统用于测量scFv Y1、A3R和S15对来源于血小板GPIb的一种多肽glycocalicin的结合动力学。
用BIAcore 3000仪器(BIAcore，Uppsala，瑞士)测定抗体对glycocalicin的结合亲和力。在10mM乙酸钠溶液(pH 4.6)中，以20μl/分钟的流速，将glycocalicin(固定的配体)共价固定到CM5芯片(BIAcore)上。在包含0.005％(v/v)非离子去污剂P20(聚氧乙烯山梨聚糖)的HBS缓冲液，pH 7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA)中进行所有结合实验。用BIAevaluation 3.1软件(BIAcore)，从平均Ka(结合速率)和Kd(解离速率)动力学测定抗体与glycocalicin的结合亲和力(KD)。
A3R-scFv以比Y1-scFv更高的亲和力(约7倍)结合血小板glycocalicin，如通过A3R-scFv的更快的结合速率所示的(表11)。这些结果符合对完整血小板的FACS分析所得的结果。S15-scFv也以高于Y1-scFv但是低于A3R的亲和力结合glycocalicin。
表11
  固定的配体   分析物  表现Ka(μ-1s-1)   表现Kd(s-1)   KD(M)
  Glycocalicin   Y1-scFv  2.7x105   1.2x10-1   4.5x10-7
  Glycocalicin   A3R-scFv  1.99x106   1.3x10-1   6.7x10-3
  Glycocalicin   S15-scFv  2.4x106   4.3x10-1   1.8x10-7
实施例10
该实施例描述包含共有序列的抗体与基于PSGL-1、GPIb和CCR5的经历酪氨酸残基硫酸化的那些区域的合成肽的直接结合。
所用的合成肽如下。
PSGL-1(残基42-58)衍生的
QATEYEYLDYDFLPETE(未硫酸化)                    SEQ ID NO：26
QATEYSEYLDYDFLPETE(在第1个酪氨酸位置硫酸化)    SEQ ID NO：48
QATEYEYSLDYDFLPETE(在第2个酪氨酸位置硫酸化)    SEQ ID NO：49
QATEYEYLDYSDFLPETE(在第3个酪氨酸位置硫酸化)    SEQ ID NO：7
GPIb(残基268-285)衍生的
GDEGDTDLYDYYPEEDTE(未硫酸化)                   SEQ ID NO：43
GDEGDTDLYSDYYPEEDTE(在第1个酪氨酸位置硫酸化)   SEQ ID NO：44
GDEGDTDLYDYYSPEEDTE(在第3个酪氨酸位置硫酸化)   SEQ ID NO：50
CCR5(残基1-18)衍生的
MDYQVSSPIYDINYYTSE(未硫酸化)                   SEQ ID NO：51
MDYSQVSSPIYDINYYTSE(在第1个酪氨酸位置硫酸化)   SEQ ID NO：52
MDYQVSSPIYSDINYYTSE(在第2个酪氨酸位置硫酸化)   SEQ ID NO：53
MDYQVSSPIYDINYSYTSE(在第3个酪氨酸位置硫酸化)   SEQ ID NO：54
所用的scFv是N06(阴性对照)、Y1(PO3)、S15、S11、S1、S9、s.c.3.1和S11。
将NH CovaLinkTM微量滴定板(Nunc，丹麦)用磺基-NHS(3.48mg/ml)和EDC(3.07mg/ml)在室温预处理30分钟后，将多种硫酸化和非硫酸化肽附着到所述板，然后用水洗涤1次，并用含有0.05％Tween的PBS洗涤三次。用含有5％脱脂乳和0.05％ Tween的PBS缓冲液通过在室温温和振荡1小时封闭板。加入合成肽(每孔100μM)，然后用含有0.05％Tween的PBS缓冲液洗涤5次，并在室温干燥板。对于结合，将A蛋白-纯化的scFv抗体(0.5μg/孔)加入板中在室温温育1小时。对于ELISA，将封闭缓冲液中的兔抗人VL多克隆抗体(抗-scFv)加入板中以在25℃温育60分钟。通过用含有0.05％Tween的PBS缓冲液洗涤5次除去过量抗-scFv。加入封闭缓冲液中的山羊抗兔HRP-标记的抗体以在室温温育1小时，并通过洗涤10次除去过量物。加入TMB显影剂5分钟并用0.5M H2SO4(100μl/孔)中和。通过ELISA平板读出器在450nm波长读出颜色反应。一式两份测定每种样品并计算平均数。
表12
表12和图21表明所试验的包含共有序列的所有scFv抗体都显著结合在第三个酪氨酸位置硫酸化的PSGL-1衍生肽，但是不结合在第一或者第二个酪氨酸位置硫酸化的肽。单链抗体S1、S9和3.1显示出对在第三个酪氨酸位置硫酸化的PSGL-1衍生肽的最强结合。这些抗体还结合在第一个酪氨酸位置硫酸化的GPIb-衍生肽，其中scFv S1、S9和3.1显示出对在第三个酪氨酸位置硫酸化的GPIb衍生肽的最强结合，而scFv S15和S11显示出对在第三个酪氨酸位置硫酸化的GPIb衍生肽的中等结合。也观察到这些抗体与在第二个酪氨酸位置硫酸化的CCR5衍生肽的显著结合，但是不结合在第一或第三个酪氨酸位置硫酸化的CCR5衍生肽。单链抗体S11显示出与在在第二个酪氨酸位置硫酸化的CCR5衍生肽的最强结合。用对照抗体scFv没有观察到结合。
用在第二个酪氨酸位置硫酸化的CCR5衍生肽得到的结果表明至少scFv S11和可能地包含共有序列的其他抗体具有作为人细胞中HIV感染性抑制剂的潜力。
实施例11
进行研究以阐明包含本发明的共有序列的IgG抗体能够介导靶细胞，尤其来自患者样品的B-CLL细胞的依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。此外，S15-IgG与第二抗-人Fc抗体的超交联表明细胞凋亡机制也促进细胞杀伤。
依赖抗体的细胞毒性(ADCC)实验如下。在
Figure A20048002491400682
上分离单核效应细胞和靶细胞，然后用PKH26标记靶细胞，其中PKH26在细胞膜的脂质区稳定掺入荧光染料。然后洗涤细胞并将其与效应细胞以多种效应物∶靶(E∶T)比，在不同浓度的S15 IgG或者对照抗体的不存在或存在下温育24小时。死亡细胞经
Figure A20048002491400691
(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)染色并通过FACS在门控靶细胞上进行分析。
来自健康供体的单核效应细胞和来自三名患者的B-CLL靶细胞以多种E∶T比例在S15 IgG存在和不存在下温育24小时，然后进行FACS分析。图22B表明S15 IgG介导所有三种样品中的效应细胞细胞毒性，与对照相比具有30-50％ADCC。
S15-IgG ADCC由自然杀伤细胞和单核细胞介导。分析效应细胞实现B-CLL细胞的S15-IgG介导的ADCC的能力。用通过商业途径可得到的磁珠分离来自正常供体和B-CLL患者的自然杀伤(CD56+)细胞和单核(CD14+)细胞。图23表明来自正常供体和B-CLL患者的NK细胞能够实现ADCC，从而分别导致约50％和35％杀伤。来自正常供体和来自B-CLL患者的单核细胞也能够实现ADCC(约5-13％)。然而，CD56+NK细胞组成了B-CLL细胞的S15 IgG介导的ADCC的更重要的效应细胞群体。
细胞凋亡实验如下。在上分离来自B-CLL患者的单核细胞并在存在或不存在S15-IgG或者对照抗体的条件下在37℃温育细胞10分钟。然后加入抗人Fc抗体并在37℃温育4-24小时。然后用细胞凋亡标记膜联蛋白和
Figure A20048002491400693
时患病细胞(CD19+，CD5+)进行染色并通过FACS进行分析。
S15-IgG诱导细胞凋亡。FACS分析表明在S15-IgG存在下温育的来自B-CLL患者的单核细胞(CD19+，CD5+)在5小时内显示出约10％细胞凋亡(图24)。加入与S15-IgG交联的第二抗体引起在5小时内额外的50％细胞凋亡(图24)。
这构成了强有力证据证明针对PSGL-1上硫酸化表位的抗体的交联引发了原代B-CLL细胞的细胞凋亡的信号。这暗示PSGL1可以是体内诱导B-CLL患者中细胞凋亡的靶，其中通过具有Fc受体的细胞，例如单核细胞、CD56+NK细胞和Yδ+T细胞可以介导交联效应。
与S15-IgG相反，人抗体利妥希玛在交联后不显示出细胞凋亡的增大(图25)，其中利妥希玛广泛用于包括B-CLL的多种淋巴样恶性肿瘤的治疗。
使用针对PSGL-1的鼠抗体KPL1可以抑制上述对于S15-IgG描述的细胞凋亡和交联效果，PSGL-1自身不诱导细胞凋亡(数据未显示)。这证实细胞凋亡信号通过PSGL-1上的表位介导。
此外，FACS分析表明S15-IgG结合所试验的所有B-CLL样品，这与它仅最低限度结合正常B-细胞形成对照。一并考虑，这些结果表明S15-IgG是作为治疗B-CLL的治疗剂的有希望的候选物，因为它的细胞毒性和细胞凋亡效果通过表达于患病细胞上的PSGL-1硫酸化表位的特异识别介导。
实施例8
无机化合物文库的筛选。用通过诸如己酸的短接头偶联到合成肽的生物素标记(生物素化的)可以制备来自特定受体(蛋白质)的合成的硫酸化肽(在肽的已知氨基酸序列内的给定特定酪氨酸残基上硫酸化)。使用相同的合成肽可以制备没有硫酸化和没有生物素标记(“B”)的对照肽。此外，可以制备来自其他不相关蛋白质的合成的硫酸化肽作为额外对照，其没有生物素标记(“C”)。
可以将上面的生物素化肽(“A”)偶联到链霉抗生物素蛋白包被的磁珠并洗除过量未结合的生物素化肽。可以在大量过量非硫酸化对照肽(“B”)的存在下在生理条件(37℃，pH 7.0-7.4，盐浓度，电导率等等)针对小分子化学实体文库筛选生物素-链霉抗生物素蛋白肽缀合物(“D”)以选择结合“A”的分子。然后用缓冲液洗涤偶联的磁珠两次，每次进行离心以除去过量未结合的分子。结合磁珠的分子(“E”)可以经洗脱、化学鉴定并以更大量制备以用于进一步筛选。
通过其他筛选方法可以证实所选化合物(“E”)对生物素化硫酸化肽的结合。所述方法包括与生物素化的不相关硫酸化肽竞争(方法1)或者与特异结合生物素化肽“A”的抗体或者其片段(例如，scFv)竞争(方法2)。
通过与不相关生物素化硫酸化肽竞争进行再次筛选(方法1)。为了确保化合物特异结合“A”，可以实施第二轮筛选。可以用所选化合物“E”，在过量不相关生物素化硫酸化肽“C”的存在下再次筛选生物素-链霉抗生物素蛋白肽缀合物(“D”)。然后离心所述管，用缓冲液洗涤生物素-链霉抗生物素蛋白肽缀合物偶联的磁珠两次并每次进行离心以除去过量未结合的分子。可以洗脱结合磁珠的化合物用于化学鉴定。可以制备更大量化合物以用于进一步研究，如对“A”的选择性结合的验证，和体外和体内功效试验。
通过与特异的scFv抗-硫酸化抗体的竞争的再次筛选(方法2)如下。在大量过量特异识别和结合“A”的特定scFv抗体的存在下，通过竞争生物素-链霉抗生物素蛋白肽缀合物(“D”)与每种所选化合物“E”的结合可以再次筛选与“A”具有优选结合亲和力的化合物。可以制备特异抑制scFv抗体与“A”的结合的化合物以用于进一步研究，如对“A”的选择性结合的验证，和体外和体内功效试验。
已经给出的前面的描述和实施例仅用于阐明本发明并且不意在进行限制。因为本领域技术人员可以想到整合本发明精神和实质的所公开实施方案的修改方案，所以应该理解本发明包括所附权利要求及其等同方案范围内的任何内容。
序列表
SEQ ID NO：1
YEYLDYD
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SEQ ID NO：3
X1-X2-X3-Pro-X5-X6
SEQ ID NO：4(22)
MRAPVI
SEQ ID NO：5(1)
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly
Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
Arg Leu Arg Arg Pro Ser Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser
Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
SEQ ID NO：6(34)
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly
Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
Arg Met Arg Arg Pro Val Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser
Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
SEQ ID NO：7(11)
QATEYEYLDYSDFLPETE
SEQ ID NO：8
(Gly4Ser)3
SEQ ID NO：9(2)
LRRPSI
SEQ ID NO：10(31)
MRRPVI
SEQ ID NO：11
LVMPVM
SEQ ID NO：12
LWYPFG
SEQ ID NO：13
LRVPFL
SEQ ID NO：14
LRSPFG
SEQ ID NO：15
LSPPIF
SEQ ID NO：16
LLPPYG
SEQ ID NO：17(3)
GINWNGGSTGYADSVK
SEQ ID NO：18(4)
LNPKVKHM
SEQ ID NO：19
Gly4Ser
SEQ ID NO：20(5)
5’-CCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCA
AGCTGACCGTCCTAGGTGG-3’
SEQ ID NO：21(6)
5’-GGCCCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAATACCACA
TGGTTACCACTGCTGTC-3’
SEQ ID NO：22(7)
5’-TGGGGCCAAGGTACCCTGGTC-3’
SEQ ID NO：23(8)
5’-CAC TGC TGT CCC GGG AGT TA-3’
SEQ ID NO：24(9)
5’-AGC TTT CGG CCG TGT ATT ACT GTG CAA GAN NKN NKN NKN NKN NKN
NKT GGG GCC AAG GTA CCC TGG TC-3’N＝G，A，T或C；K＝G或T.
SEQ ID NO：25(10)
5’-TTCAGCTTTCGGCCGTGTATTACTGTGCAAGA-3’
SEQ ID NO：26(12)
QATEYEYLDYDFLPETE
SEQ ID NO：27(13)
LRDPIM
SEQ ID NO：28(14)
LRPPFL
SEQ ID NO：29(15)
LTYPHL
SEQ ID NO：30(16)
LKWPHL
SEQ ID NO：31(17)
LRYPFF
SEQ ID NO：32(18)
LRSPVL
SEQ ID NO：33(19)
VRHPIM
SEQ ID NO：34(21)
LRHPVA
SEQ ID NO：35(20)在文中任何地方均不能发现该SEQ
LRPPVM
SEQ ID NO：36(23)
LRFPIA
SEQ ID NO：37(24)
LRSPVL
SEQ ID NO：38(25)
LRSPPI
SEQ ID NO：39(26)
LAQPFG
SEQ ID NO：40(27)
MRSPYK
SEQ ID NO：41(28)
FSSPHA
SEQ ID NO：42(29)
LPSFRV
SEQ ID NO：43
GDEGDTDLYDYYPEEDTE(非硫酸化)
SEQ ID NO：44
GDEGDTDLYSDYYPEEDTE(在第1个酪氨酸位置硫酸化)
SEQ ID NO：45(30)
MAAPVI
SEQ ID NO：46(32)
MRAPRI
SEQ ID NO：47(33)
IPMARV
SEQ ID NO：48
QATEYSEYLDYDFLPETE(在第1个酪氨酸位置硫酸化)
SEQ ID NO：49
QATEYEYS LDYDFLPETE(在第2个酪氨酸位置硫酸化)
SEQ ID NO：50
GDEGDTDLYDYYSPEEDTE(在第3个酪氨酸位置硫酸化)
SEQ ID NO：51
MDYQVSSPIYDINYYTSE(非硫酸化)
SEQ ID NO：52
MDYSQVSSPIYDINYYTSE(在第1个酪氨酸位置硫酸化)
SEQ ID NO：53
MDYQVSSPIYSDINYYTSE(在第2个酪氨酸位置硫酸化)
SEQ ID NO：54
MDYQVSSPIYDINYSYTSE(在第3个酪氨酸位置硫酸化)
SEQ ID NO：55
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly
Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
Arg Leu Arg Ser Pro Phe Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser
Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
SEQ ID NO：56
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly
Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
Arg Leu Arg Val Pro Phe Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser
Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
SEQ ID NO：57
GDEGDTDLYDYSYPEEDTE
SEQ ID NO：58
GDEGDTDLYSDYSYSPEEDTE
SEQ ID NO：59
QATEYSEYSLDYSDFLPETE
SEQ ID NO：60
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly
Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
Arg Leu Arg Pro Pro Phe Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser
Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
SEQ ID NO：61
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Asn Pro Lys Val Lys His Met
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly
Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
Arg Leu Arg Tyr Pro Phe Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser
Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
SEQ ID NO：62
MDYSQVSSPIYSDINYSYTSE

Claims (78)

1.包含共有序列：X1-X2-X3-Pro-X5-X6的抗体或其片段，其中X1和X6为疏水氨基酸，且X2、X3和X5为任意氨基酸。
2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述疏水氨基酸选自亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸。
3.权利要求1的抗体或其片段，其中X2是碱性氨基酸。
4.权利要求3的抗体或其片段，其中所述碱性氨基酸选自精氨酸和赖氨酸。
5.权利要求1的抗体或其片段，其中X2和X3是精氨酸。
6.权利要求1的抗体或其片段，其中X6是异亮氨酸。
7.权利要求1的抗体或其片段，其中X1选自亮氨酸和甲硫氨酸，并且X5选自丝氨酸和缬氨酸。
8.权利要求1的抗体或其片段，其中所述共有序列在抗体或者其片段的高变区内。
9.权利要求1的抗体或其片段，其中互补决定区(CDR)包含所述共有序列的至少一部分。
10.权利要求9的抗体或其片段，其中所述CDR是所述抗体或者其片段的重链。
11.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段包含重链互补决定区(CDR)，该重链互补决定区包含选自SEQ ID NO：9、10、13、14、28和31的氨基酸序列。
12.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段包含重链互补决定区(CDR)，该重链互补决定区具有选自SEQ ID NO：17和SEQ I D NO：18的氨基酸序列。
13.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段包含选自SEQ ID NO：9、10、13、14、28和31的第一个重链互补决定区(CDR)；包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的第二个重链CDR和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的第三个重链CDR。
14.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段包含选自SEQ ID NO：5、6、55、56、60和61的序列。
15.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段结合PSGL-1、GPIb和/或CCR5的硫酸化表位。
16.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段与两种或更多种表位交叉反应，其中每种表位具有一个或多个硫酸化酪氨酸残基。
17.权利要求15的抗体或其片段，其中每个表位包含两个或更多个酸性氨基酸的至少一簇。
18.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段结合在存在于蛋白质上的一个或多个位置硫酸化的一种或多种表位，所述蛋白质选自：α-2-抗纤溶酶；氨肽酶B；CC趋化因子受体；七跨膜片段(7TMS)受体；凝血因子V、VIII和IX；血纤蛋白原γ链；肝素辅因子II；分泌粒蛋白I和II；玻连蛋白、淀粉状蛋白前体、α-2-抗纤溶酶；缩胆囊素；α-绒毛膜促性腺激素；补体C4；硫酸皮肤素蛋白聚糖；纤连蛋白；和castrin。
19.权利要求18的抗体或其片段，其中所述CC-细胞因子受体选自CCR2、CCR5、CCR3、CXCR3、CXCR4、CCR8和CCR2b。
20.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段结合选自前-B-ALL细胞、CLL细胞、多发性骨髓瘤细胞、转移细胞、T-ALL细胞、AML细胞、血小板、粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的至少一种细胞类型上的表位。
21.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段结合和抑制血小板聚集。
22.权利要求21的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段包含SEQ ID NO：9、10、28和31的至少一部分。
23.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或者其片段还结合脂类、糖、肽、糖脂、糖蛋白、脂蛋白和/或脂多糖分子上的表位。
24.药物组合物，其包含权利要求1的抗体或者其片段和药学上可接受的载体。
25.诊断、预后或分期试剂盒，其包含权利要求1的抗体或其片段和显像剂。
26.分离或纯化的DNA序列，其编码权利要求1的抗体或其片段。
27.表达载体，其包含权利要求24的分离或纯化的DNA序列。
28.重组宿主细胞，其包含权利要求27的表达载体。
29.权利要求28的重组宿主细胞，或者其后代，其中所述重组宿主细胞表达所述抗体或其片段。
30.产生抗体或其片段的方法，其包括在允许表达所述抗体或其片段的条件下培养权利要求28的重组宿主细胞。
31.权利要求30的方法，其还包括从重组宿主细胞或者重组宿主细胞的培养基分离或纯化所述抗体或其片段。
32.包含共有序列：X1-X2-X3-Pro-X5-X6的多肽，其中X1和X6为疏水氨基酸，且X2、X3和X5为任意氨基酸。
33.权利要求32的多肽，其中所述多肽基本上为环状或成环的。
34.权利要求32的多肽，其中所述多肽结合硫酸化PSGL-1、GP1b和/或CCR5，并且其中所述多肽以基本类似于SEQ ID NO：5、6、55、56、60或61的s cFv抗体或其片段的亲和力结合。
35.疾病治疗方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
36.治疗细胞滚动的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
37.治疗感染的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
38.权利要求37的方法，其中所述感染由HIV导致。
39.权利要求37的方法，其中所述施用防止HIV进入。
40.治疗炎症的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
41.抑制自身免疫病的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
42.抑制转移的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
43.抑制肿瘤细胞生长和/或复制的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
44.增加肿瘤细胞的死亡率的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
45.抑制白血病细胞生长和/或复制的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
46.增加白血病细胞的死亡率的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
47.抑制B-CLL细胞生长和/或复制的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
48.增加白血病细胞的死亡率的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
49.改变患病细胞对抗疾病剂的伤害的易感性的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
50.增加肿瘤细胞对抗癌剂的伤害的易感性的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
51.增加白血病细胞对抗白血病剂的伤害的易感性的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
52.增加B-CLL细胞对抗白血病剂的伤害的易感性的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
53.抑制血小板聚集的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
54.抑制再狭窄的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
55.引起依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
56.权利要求55的方法，其中通过由自然杀伤细胞(NK)或者单核细胞组成的效应细胞介导所述ADCC。
57.引起白血病细胞的细胞凋亡的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
58.刺激自然杀伤细胞(NK)或者T细胞的方法，其包括对需要其的患者施用权利要求24的药物组合物。
59.权利要求24的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
60.诊断、预后或分期患者中疾病的方法，其包括：
提供含有来自所述患者的细胞的样品和
确定权利要求1的抗体或者其片段是否结合患者的细胞，从而表明所述患者有危险患有或者已经患有所述疾病。
61.从患者清除肿瘤细胞的方法，其包括：
提供含有来自所述患者的细胞的样品；和
将来自所述患者的细胞与权利要求1的抗体或者其片段温育。
62.权利要求61的方法，其中离体发生所述清除。
63.选择抗体或者其片段或多肽的方法，其包括步骤：
(a)提供噬菌体展示文库；
(b)提供选自SEQ ID NO：7、44和53的肽；
(c)淘选所述噬菌体展示文库以选择结合选自SEQ ID NO：7、44、50和53的肽的scFv抗体或者其片段；和
(d)产生所选的scFv抗体或者其片段。
64.权利要求63的方法，其中所选的scFv抗体或者其片段结合选自SEQ ID NO：7、44和53的肽。
65.权利要求63的方法，其中将所述肽固定化。
66.权利要求65的方法，其中步骤(c)还包括：在选自SEQ IDNO：26、43、44、48、49、50、51、52、54、57、58和59的至少一种可溶性肽的存在下进行淘选。
67.权利要求65的方法，其中所选的抗体或者其片段不结合SEQID NO：26、48或49。
68.权利要求65的方法，其中所选的抗体或者其片段不结合SEQID NO：43。
69.权利要求65的方法，其中所选的抗体或者其片段不结合SEQID NO：51、52或54。
70.根据权利要求63的方法产生的抗体或者其片段。
71.免疫球蛋白结合结构域文库，所述结构域包含用于互补结合的多样的抗原结合结构域，其中所述文库仅在重链CDR3中具有多样性。
72.权利要求71的文库，其中所述免疫球蛋白结合结构域是scFv分子。
73.权利要求71的文库，其中所述免疫球蛋白结合结构域包含来自DP 32的重链互补决定区(CDR)1和2。
74.权利要求71的文库，其中所述免疫球蛋白结合结构域包含来自DP32的轻链可变区。
75.权利要求71的文库，其中所述免疫球蛋白结合结构域在丝状噬菌体颗粒的表面上展示。
76.选择硫酸化表位的方法，其包括步骤：
提供权利要求71的文库；
淘选所述文库以选择结合所述抗原结合结构域的硫酸化表位；和
分离所述硫酸化表位。
77.小无机分子，其中所述小分子结合PSGL-1、GPIb和/或CCR5的硫酸化表位。
78.药物组合物，其包含权利要求77的小无机分子。
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