KR20230042090A - 항-cd22 단일 도메인 항체 및 치료학적 작제물 - Google Patents

항-cd22 단일 도메인 항체 및 치료학적 작제물 Download PDF

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KR20230042090A
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스콧 맥콤
리시니 위라트나
메디 아르바비-가라우디
티나 응우옌
쿤레 우
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내션얼 리서치 카운슬 오브 캐나다
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Abstract

라마를 주요 사람 CD22 동형의 세포외 도메인으로 면역화시킴으로서 제조한 항-CD22 단일 도메인 항체(sdAb)가 본원에 제공된다. 생성된 중쇄 레퍼토리의 라이브러리를 작제함으로써, 면역원에 대해 특이적인 VHH 항체를 단리하였다. 초기에 도입된 27개의 예시적인 항체는 각각 서열 번호: 1 내지 3, 4 내지 6, 7 내지 9, 10 내지 12, 13 내지 15, 16 내지 18, 19 내지 21, 22 내지 24, 25 내지 27, 28 내지 30, 31 내지 33, 34 내지 36, 37 내지 39, 40 내지 42, 43 내지 45, 46 내지 48, 49 내지 51, 52 내지 54, 55 내지 57, 58 내지 60, 61 내지 63, 64 내지 66, 67 내지 69, 70 내지 72, 73 내지 75, 75 내지 78, 및 79 내지 81에 상응하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 관련된 서열을 포함한다. 또한, sdAb 중 어느 하나, 예를 들면, 이특이적인 T-세포 인게이저, 이특이적인 킬러 세포 인게이저(BiKE), 및 삼특이적인 킬러 세포 인게이저(TriKE)를 포함하는 다가 항체가 제공된다. 또한, 전술한 sdAb 중 어느 하나를 포함하는 CAR-T 치료요법용 키메라 항원 수용체(CAR)이 기술되어 있다. 암의 치료에서 이러한 분자의 용도가 또한 기술되어 있다.

Description

항-CD22 단일 도메인 항체 및 치료학적 작제물
관련 출원에 대한 전후 참고
본 출원은 "항-CD22 단일 도메인 항체(single domain antibody) 및 치료학적 작제물(therapeutic construct)"이라는 명칭으로 2020년 7월 29일자로 출원된 미국 가특허원 제63/058,203호의 우선권의 이익을 주장하고, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 개시내용은 일반적으로 항-CD22 항체에 관한 것이다. 보다 특히, 본 개시내용은 항-CD22 단일 도메인 항체에 관한 것이다.
배경
암은 중요한 보건 문제이며 전세계적으로 사망의 두번째 주된 원인이다. 암에 대한 전통적인 치료요법(thearpy)은 수술, 방사선 및 화학치료요법을 포함하였다. 이는 일부 암, 특히 초기 단계에서 진단된 것의 치료에 적당하게 성공적이었다. 그러나, 효과적인 치료요법은 많은 공격적인 암(aggressive cancer)의 경우에는 부족하다. 최근의 기술적 혁신은 면역치료요법(암과 싸우는 환자 자신의 면역계를 자극하거나 회복시킴)이 공격적인 치료하기 힘든 암을 포함하는 많은 암에 대해 강력하고 장기적인 반응을 잠재적으로 제공할 수 있음을 시사하고 있다.
면역치료요법은 혈액 암을 치료하는데 경이적인 성공을 이루어 다수 형태의 이러한 치료요법에 대한 규제 승인을 이끌었다: 치료학적 항체(즉, CD20, CD30, CD33 및 CD52를 표적화(targeting)하는 다수의 승인된 모노클로날 항체), CD22 및 CD33을 표적화하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate), 및 다가 항체(multivalent antibody), 예를 들면, 이-특이적인(bi-specific) T 세포 인게이저(cell engager)(B 세포에서 CD19를 표적화하는 블리나투모맙).
이러한 항체는 또한 치료학적 작제물에서의 용도가 밝혀졌다.
예를 들면, 단일-쇄 가변 단편(scFv)을 혼입시키는 이-특이적인 T 세포 인게이저, 및 이- 및 삼-특이적인 킬러 세포 인게이저(bi- and tri-specific killer cell engager)(BiKE 및 TriKE)를 개발하여 숙주의 면역계가 암 세포를 표적화하도록 지시하였다.
키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR) 작제물은 단일 단백질 로의 T 세포 활성화의 조합된 양상(combined facet)에 대해 생산되었다. 이러한 분자는 세포외 항원 인식 도메인을 세포내 신호전달 도메인(intracellular 신호전달 도메인)에 연결시키며, 이는 항원이 결합되는 경우 T 세포를 활성화시킨다.
키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR) 변형된 면역 세포 치료요법은 암 면역치료요법의 위급한 형태이며, 이에 의해 암 세포 상의 세포 표면 단백질(들)을 특이적으로 표적화하는 항체로부터의 단일 또는 다수의 항원 결합 도메인은 면역 세포 활성화 도메인과 조합하여 표적화 항원(들)을 가지는 특이적인 세포를 찾아서 사멸시키는 "강화된(armored)" 면역 세포를 생성한다. CAR 변형된 T 세포 치료요법(CAR-T)은 B 세포 백혈병(B cell leukemia) 및 림프종(lymphoma)의 불치의, 공격적인 형태를 앓고 있는 환자에 대해 전례없는 반응을 제공함으로써 B-세포 ALL을 지닌 재발되거나 불치의 소아 및 젊은 성인 환자, 재발되거나 불치의 거대 B-세포 림프종(relapsed 또는 refractory large B-cell lymphoma), 예를 들면, 달리 명시되지 않은 광범위 큰 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma; DLBCL), 원발성 가슴세로칸 큰 B-세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), 고-등급 B-세포 림프종(high grade B-cell lymphoma), 및 소포 림프종(follicular lymphoma)으로부터 발생하는 DLBCL을 지닌 성인 환자를 치료하기 위한 CD19-표적화된 CAR-T 세포 생성물, 예를 들면, 티산겐레클류셀(Tisangenlecleucel)(Kymriah®) 및 악시캅타겐 실로유셀(axicabtagene ciloleucel)(Yescarta®)의 FDA 및 캐나다 보건 규제당국 승인(Health Canada approval)을 이끌었다. 이러한 CD19-표적화된 CAR 치료요법은 유의적인 임상 가치를 가지지만, 반응은 항상 장기-지속되지 않으며 CAR-T 후 재발(post CAR-T relapse)은 CAR-T 후 재발의 경우의 대략 1/3에서 발생하는 백혈병 세포에서 CD19-항원의 명백한 손실과 함께, 문제로 남아있다. CD19 이외의 백혈병 항원을 표적화하는 신규한 CAR 수용체의 개발은 CAR-T 치료요법에 대한 대안적인 표적으로서의 강력한 가능성을 나타내는 CD22 또는 CD20과 같은 유사한 B-세포 제한된 항원과 함께, 활발한 연구 영역이다. 또한, CD22-표적화된 CAR-T 수용체의 신호전달 특성의 분자 최적화는 보다 우수한 치료학적 반응 속도를 이끄는 강력한 잠재능을 가지며, 상이한 B-세포 제한된 항원을 표적화하는 다수의 CAR 치료요법의 사용은 치료 결과를 개선시키는 효과적인 전략인 것으로 밝혀졌다.
예를 들면, 현재, 재발된 및 화학치료요법 불치성인 B-세포 악성종양(B-cell malignancy)(다양한 형태의 백혈병 및 림프종을 포함하는 질환의 군집)을 지닌 환자는 CD19-표적화된 CAR-T 치료요법의 후보물이다. 반응 통계학(response statistics)이 CAR-T 치료요법의 구체적인 임상 적용에 따라 변하지만, 성인 환자의 평균 1/2 이상이 CD19-표적화된 치료요법 후에 재발할 것이다.
따라서, 암과 관련된 치료학적 표적에 대해 친화성(affinity)을 지닌 면역원성 분자(immunogenic molecule)를 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
요약
본 개시내용의 목적은 앞서의 접근법의 적어도 하나의 단점을 제거하거나 완화시키기 위한 것이다.
일 양태에서, 사람 CDE22에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일 도메인 항체(isolated single domain antibody; sdAb)가 제공되며, sdAb는:
a) CDR1 아미노산 서열 GX1X2X3DX4YX5(서열 번호: 126)(여기서:
X1는 F 또는 V이고,
X2는 T 또는 S이고,
X3은 L, F, 또는 S이고,
X4는 Y, D, 또는 S이고,
X5는 V 또는 A이다),
CDR2 아미노산 서열 X6X7X8X9X10GX11T(서열 번호: 127)(여기서:
X6는 I 또는 M이고,
X7은 T, R, G, 또는 S이고,
X8은 S 또는 N이고,
X9는 D 또는 S이고,
X10은 D이거나 부재하고,
X11은 V 또는 A이다), 및
CDR3 아미노산 서열 AVDKPFYDGGX12X13YTCPVDFX14S(서열 번호: 128)(여기서:
X12는 I, N, Y, 또는 S이고,
X13은 Q, Y, R, 또는 L이고,
X14는 D 또는 G이다);
b) CDR1 아미노산 서열 GSX1F X2X3X4 X5V(서열 번호: 129)(여기서:
X1은 I 또는 T이고,
X2는 R이거나 부재하고,
X3은 R, S, 또는 I이고,
X4는 I, S, 또는 T이고,
X5는 A, S, 또는 T이다),
CDR2 아미노산 서열 ITSX6GX7X8(서열 번호: 130)(여기서:
X6은 G, S, 또는 A이고,
X7은 E, D, 또는 S이고,
X8은 T 또는 S이다), 및
CDR3 아미노산 서열 NAX9X10GX11X12X13X14(서열 번호: 131)(여기서:
X9는 K 또는 Q이고,
X10은 W 또는 Y이고,
X11은 Q, R, 또는 G이고,
X12는 Y, D, 또는 R이고,
X13은 E 또는 S이고,
X14는 Y, D, 또는 H이다);
c) CDR1 아미노산 서열 GRIX1RSYV(서열 번호: 132)(여기서:
X1은 F 또는 S이다),
CDR2 아미노산 서열 IGX2SDT(서열 번호: 133)(여기서:
X2는 W 또는 C이다), 및
CDR3 아미노산 서열 AX3X4SPPYGPQRDEFX5Y(서열 번호: 134)(여기서:
X3는 A 또는 E이고,
X4는 N 또는 Y이고,
X5는 G 또는 D이다);
d) CDR1 아미노산 서열 G X1TX2SVYX3(서열 번호: 135)(여기서:
X1은 R 또는 G이고,
X2는 S 또는 F이고,
X3은 G 또는 T이다),
CDR2 아미노산 서열 X4X5X6SX7GX8T(서열 번호: 136)(여기서:
X4는 M 또는 I이고,
X5는 S 또는 R이고,
X6은 W 또는 G이고,
X7은 G이거나 부재하고,
X8은 P 또는 G이다),
CDR3 아미노산 서열 AVRIRRTLX9EPLTKETLYDY(서열 번호: 137)(여기서:
X9는 L 또는 V이다);
e) 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
f) 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
g) 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
h) 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
i) 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
j) 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
k) 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
l) 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열; 또는
m) 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
상기에서
그룹 a)는 본원에 hCD221ug-80, hCD22100ng-2, hCD221ug-74, hCD22100ng-66, hCD221ug-6, hCD22pas-10, hCD22pass-33으로 명명된 항체에 의해 정의된 컨센서스 서열(consensus sequence)을 제공하고,
그룹 b)는 본원에 hCD221ug-77, hCD221ug-87, hCD221ug-75, hCD221ug-93, hCD22pas-82, 및 hCD22pas-23으로 명명된 항체에 의해 정의된 컨센서스 서열을 제공하고,
그룹 c)는 본원에 hCD22pas-32, hCD221ug-14, 및 hCD22pas-55로 명명된 항체에 의해 정의된 컨센서스 서열을 제공하고,
그룹 d)는 본원에 hCD22pas-79 및 hCD22pas-72로 명명된 항체에 의해 정의된 컨센서스 서열을 제공하고,
그룹 f)는 hCD22pas-16으로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 f)는 hCD221ug-10으로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 g)는 hCD221ug-13으로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 h)는 hCD221ug-36으로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 i)는 hCD221ug-61로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 j)는 hCD22100ug-62로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 k)는 hCD22pas-24로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 l)은 hCD22pas-48로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 m)은 hCD22pas-64로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의된다.
다른 양태에서, 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 단리된 VHH 단일 도메인 항체(single domain antibody; sdAb)가 제공되고, sdAb는:
A)
서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6),
서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10),
서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13),
서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14),
서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36),
서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61),
서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74),
서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75),
서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77),
서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80),
서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87),
서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93),
서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2),
서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62),
서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66),
서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10),
서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16),
서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23),
서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열 57(hCD22pas-24),
서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32),
서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33),
서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48),
서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55),
서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64),
서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-72),
서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79), 또는
서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82)을 포함한다.
다른 양태에서, 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 단리된 VHH 단일 도메인 항체(sdAb)가 제공되고, sdAb는:
A)
서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6),
서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10),
서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13),
서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14),
서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36),
서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61),
서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74),
서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75),
서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77),
서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80),
서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87),
서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93),
서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2),
서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62),
서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66),
서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10),
서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16),
서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23),
서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-24),
서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32),
서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33),
서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48),
서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55),
서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64),
서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-72),
서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79), 또는
서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82); 또는
B) 부분 A) i) 내지 xxviii) 중 어느 하나에 정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열에 대해 적어도 80% 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 사람 CD22에 특이적으로 결합된, 단리된 VHH 단일 도메인 항체(sdAb)가 제공되고, sdAb는:
A)
서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열, 또는
서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 단리된 sdAb는:
서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열, 또는
서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, CD22에 대한 특이적인 결합(specific binding)에 대해 본원에 기술된 단리된 sdAb와 경쟁하는 VHH 단일 도메인 항체(sdAb)가 제공된다.
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 sdAb를 포함하는 재조합 폴리펩타이드(recombinant polypeptide)가 제공된다.
추가의 양태에서, 본 개시내용은 카고 분자(cargo molecule)에 연결된 본원에 정의된 바와 같은 항-CD22 sdAb를 제공한다.
양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 sdAb, 재조합 폴리펩타이드, 또는 VHH:Fc 융합체를 암호화하는 재조합 핵산 분자가 제공된다.
하나의 양태에서, 허용되는 부형제(excipient), 희석제 또는 담체와 함께; 본원에 정의된 바와 같은 sdAb, 또는 이러한 sdAb를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다.
하나의 양태에서, 암(cancer) 또는 자가-면역 질환(auto-immune disease)의 치료를 위한 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 또는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 VHH:Fc 융합체(fusion)를 포함하는 항체의 용도가 제공된다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료를 위한 의약(medicament)의 제조를 위한, 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 또는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 VHH:Fc 융합체를 포함하는 항체의 용도가 제공된다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 또는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 VHH:Fc 융합체를 포함하는 항체가 제공된다.
하나의 양태에서, 대상체(subject)에게 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 또는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 VHH:Fc 융합체를 포함하는 항체를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암 또는 자가-면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 sdAb를 포함하는 다가 항체가 제공된다.
하나의 양태에서, 제1의 항원-결합 부위(antigen-binding portion), 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지(hinge)를 포함하는 아미노산 링커(linker), 및 제2의 항원-결합 부위를 포함하는 다가 항체가 제공된다.
양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체를 암호화(encoding)하는 재조합 핵산 분자가 제공된다.
하나의 양태에서, 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체를 포함하는 조성물이 제공된다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료를 위한 위한 본원에 정의된 바와 같은, 다가 항체의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액 악성암(hematological malignancy)이다.
하나의 양태에서, 암 도는 자가-면역 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체의 용도가 제공된다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가 면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액 악성암이다.
하나의 양태에서, 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암 또는 자가 면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 VHH를 포함하는, 사람 CD22에 결합하는, 키메라 항체 수용체(CAR)가 제공된다.
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 CAR을 암호화하는 재조합 핵산 분자가 제공된다.
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector)가 제공된다.
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 입자가 제공된다.
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포가 제공된다.
하나의 양태에서, CAR-T에 대한 세포의 제조를 위한 본원에 기술된 바와 같은 핵산, 벡터, 또는 바이러스 입자의 용도가 제공된다.
하나의 양태에서, T-세포를 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하여, CAR-T에 대한 세포를 제조하는 방법이 제공된다.
하나의 양태에서, T-세포 내로 본원에 기술된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 도입시키는 단계를 포함하여, CAR-T에 대한 세포를 제조하는 방법이 제공된다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 또는 가공된 세포의 용도가 제공된다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료용 의약의 제조를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 또는 가공된 세포의 용도가 제공된다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 또는 가공된 세포(engineered cell)가 제공된다.
하나의 양태에서 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 가공된 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암 또는 자가-면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
본 개시내용의 다른 양태 및 특징은 첨부되는 도면과 함께 다음의 구체적인 구현예의 설명의 고찰 시 당해 분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다.
본 개시내용의 구현예를 이제 첨부된 도면을 참고로, 단지 예로서, 기술할 것이다.
도 1은 염색체 19q13.12 상에 위치한 CD22 유전자에 의해 암호화된 사람 CD22 분자의 구조를 나타낸다.
도 2는 비-환원 및 환원 조건 하에서 2개의 상이한 발현 배치(expression batch)로부터 IMAC-정제된 CD22 세포외 도메인(CD22-ECD)의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 3은 음성 대조군으로서 예비-면역 혈청과 함께 CD22-ECD에 대해 최종 출혈로부터의 라마(llama) 중쇄 면역 반응을 나타낸다.
도 4a는 27개의 VHH의 아미노산 서열의 정렬의 제1 부분을 나타낸다. CDR에 걸쳐 식별가능한 서열 유사성을 지닌 CDR 서열 VHH은 박스쳐져 있다.
도 4b는 도 4a로부터 계속되는, 27개의 VHH의 서열의 정렬의 제2 부분을 나타낸다.
도 5는 TG1 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되고 IMAC에 의해 정제된 14개의 항-CD22 VHH 항체의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 6은 CD22를 발현하는 종양 세포 Raji(좌측 패널), Ramos(중간 패널) 또는 CRISPR 유전자 녹아웃(gene knockout)에 의해 CD22 발현이 되지 않는 Ramos 세포에 대한 바이오틴 접합된 항-CD22 VHH의 결합을 나타낸다.
도 7은 표 5 및 6에서의 에피토프 맵핑/비닝(epitope mapping/binning) 결과에 따른 이의 세포 표면 위치와 관련하여 CD22 엑토-도메인(Ecto-domain)에 대한 실시예 1에서 sdAb의 지각되는 결합의 개략도를 나타낸다.
도 8은 CAR-저켓(Jurkat) 검정을 나타내고, 여기서 저켓 세포는 다양한 CD22-단일 도메인 항체 CAR 플라스미드로 일시적으로 전기천공(electroporation)되고 단독으로 배양되거나 CD22-양성(Ramos) 또는 CD22-음성(Ramos-CD22ko) 세포주와 함께 공-배양물(co-culture)로 배양된다.
도 9는 CAR-T 긴장성 활성화 검정(tonic activation assay)을 나타내고, 여기서 1차 공여체 혈액 유래된 T 세포는 다양한 CAR 작제물로 형질도입(transduction)되고 표적-독립적인 확장(target-independent expansion)에 대해 시험되었다.
도 10은 다양한 CD22-단일 도메인 항체 또는 대조군(FMC63) CAR 작제물로 형질도입된 공여체 혈액 유래된 T 세포를 사용하여 수행된 CAR-T 표적-특이적인 활성화 검정의 결과를 나타낸다.
도 11은 본원에 기술된 바와 같은 다양한 CD22-단일 도메인 항체 또는 대조군(FMC63) CAR 작제물로 형질도입된 공여체 혈액 유래된 T 세포를 사용하여 수행된 CAR-T 항원-특이적인 표적 세포 성장 억압 검정(CAR-T antigen-specific target cell growth repression assay)의 결과를 나타낸다. Mock는 유사한 치료 조건에 노출된 CAR 발현이 없는 변형되지 않은 공여체 T 세포를 지칭한다. CAR-T 세포를 cells were placed in co-culture with CD22+ 표적 세포(좌측 그래프 - Raji, 중간 그래프 - Ramos 표적), 또는 CD22-음성 표적 세포(우측 그래프 - Ramos-CD22ko 표적)와의 공-배양물 속에 두고 생 형광 현미경(live fluorescent microscopy)을 통해 시험하였다.
도 12는 본원에 기술된 바와 같이 생성된 다양한 CD22-단일 도메인 항체 CAR 작제물로 형질도입된 공여체 유래된 T 세포를 사용하여 수행된 CAR-T 표적-특이적인 일련의 사멸 검정의 결과를 나타낸다. Mock는 유사한 치료 조건에 노출된 CAR 발현되지 않는 변형되지 않은 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다.
도 13은 일관성 분석(consistency analysis) 및 본원에 기술된 바와 같은 2개의 별개의 공여체로부터 생성된 단일-도메인 항체 표적화된 CAR-T 세포에 대한 벤치마크(benchmark) CD22-표적화된 scFv CAR과의 비교의 결과를 나타낸다.
도 14는 방사활성 크롬(51Cr) 방출 검정을 사용한 직접적인 종양 분석 측정의 결과를 나타낸다.
도 15는 크롬 방출 검정을 사용하여 상이한 효과기(effector) 대 표적 비에서 직접적인 CAR-T 세포 유도된 종양 분해의 결과를 나타낸다.
도 16은 CD22 생성 종양 세포를 사용한 재-자극 후 CAR-T 세포로부터 크롬 방출 검정을 사용한 직접적인 종양 분석 측정의 결과를 나타낸다.
도 17는 생체 내(in vivo) 모델에 대한 실험 프로토콜의 개략도를 나타낸다.
도 18은 다양한 CAR-T 세포의 치료 후 rAmos-Luc를 접종한 NSG 마우스의 생존 분석의 결과를 나타낸다.
도 19는 Ramos-FLUC를 접종하고 다양한 CAR-T 세포로 처리한 마우스에서 종양 버든(tumor burden)의 결과를 나타낸다.
도 20은 Ramos-FLUC를 접종하고 다양한 CAR-T 세포로 처리한 마우스의 말초 혈액 속에서 종양 버든의 결과, 총 CAR-T 세포 집단 및 순환하는 CAR-T 세포 집단의 상이한 표현형을 나타낸다.
도 21은 DNA 작제물의 5' 말단에서 CD22-sdAb 서열에 이어, 다양한 조성일 수 있는 링커 서열에 이어, CD3-특이적인 단일 쇄 가변 단편을 지닌, CD22-특이적인 단일 도메인 항체 이-특이적인 T 세포 인게이저 단백질의 분자 구조를 나타낸다.
도 22는 저켓 세포 이-특이적인 T 세포 인게이저 활성화 검정을 나타내고 여기서 다양한 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자를 함유하는 HEK293T 상층액은 저켓 세포 및 CD22-양성(Ramos) 또는 CD22-음성(U87vIII) 표적 세포를 함유하는 공-배양물의 상부에 위치하였다.
도 23은 CD22-양성 표적 세포(Ramos)와의 공-배양물 속에서 1차 사람 T 세포를 사용한 이-특이적인 T 세포 인게이저 활성 검정의 결과를 나타낸다.
도 24는 CAR-T 작제물의 생체 내 연구를 위한 치료 및 시험의 다이아그램 타이밍(diagram timing)을 나타낸다.
도 25는 도 24에 나타낸 치료 및 시험에 대한 마우스의 생존을 나타낸다.
도 26은 도 24의 치료 및 시험을 위한 마우스내 말초 혈액에서 열거된 CAR-T 세포를 나타낸다.
도 27은 제1의 종양 챌린지(challenge) 및 CAR-T 치료 후 마우스의 생존을 나타낸다.
도 28은 재-챌린지 시 마우스의 생존을 나타낸다.
도 29는 챌린지 후 종양 성장의 그래프를 나타낸다.
도 30은 CD22-특이적인 CAR 분자를 함유하는 다중-결합인자 도메인(multi-binder domain)의 분자 구조를 나타낸다.
도 31은 CAR-저켓 검정의 결과를 나타내고, 여기서 저켓 세포는 단일 및 다중-결합인자를 포함하는, 다양한 CAR 플라스미드로 일시적으로 전기천공되었다.
도 32는 다중-sdAb 함유 CAR 작제물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)로 형질도입된 1차 사람 말초 유래된 T 세포를 사용한 유사한 CAR-활성화 연구의 결과를 나타낸다.
도 33은 CD22-특이적인 CAR(좌측), BCMA-특이적인 CAR(우측), 또는 Tandem-CD22-BCMA-CAR 분자(중앙)의 분자 구조를 나타낸다.
도 34는 CAR-저켓 검정의 결과를 나타내고 여기서 저켓 세포는 다양한 CD22, BCMA, 또는 CD22/BCMA-특이적인 CAR 플라스미드로 일시적으로 전기천공되고 단독으로 배양되거나 BCMA+/CD22+(Ramos), BCMAlow/CD22+(NALM6), 또는 BCMA+/CD22-(Ramos-CD22ko) 표적 세포주와의 공-배양물로 배양되고 활성화 상태(CD69 발현)에 대해 시험되었다.
상세한 설명
일반적으로, 본 개시내용은 라마를 우세한(predominant) 사람 CD22 동형(isoform)의 세포외 도메인으로 면역화함으로써 제조된 항-CD22 단일 도메인 항체(sdAb)를 제공한다. 중쇄 레퍼토리의 라이브러리를 작제함으로써, 면역원에 대해 특이적인 VHH 항체 도메인을 파아지 패닝(phage panning)으로 단리하였다. 관련된 서열을 갖는 항체가 기술되어 있고 포함되어 있다고 해도, 초기 생산된 27개의 예시적인 항체는 각각 서열 번호: 1 내지 3, 4 내지 6, 7 내지 9, 10 내지 12, 13 내지 15, 16 내지 18, 19 내지 21, 22 내지 24, 25 내지 27, 28 내지 30, 31 내지 33, 34 내지 36, 37 내지 39, 40 내지 42, 43 내지 45, 46 내지 48, 49 내지 51, 52 내지 54, 55 내지 57, 58 내지 60, 61 내지 63, 64 내지 66, 67 내지 69, 70 내지 72, 73 내지 75, 75 내지 78, 및 79 내지 81에 상응하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 또한 이특이적인 T-세포 인게이저, 이특이적인 킬러 세포 인게이저(BiKE), 및 삼특이적인 킬러 세포 인게이저(TriKE)를 포함하는, sdAb 중 어느 하나를 포함하는 다가 항체가 제공된다. 또한 전술한 sdAb 중 어느 하나를 포함하는 CAR-T 치료요법에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)가 기술되어 있다.
단일 도메인 항체 및 이를 포함하는 폴리펩타이드
또한 나노바디(nanobody)로서 알려진, 단일 도메인 항체(sdAb)는 단일의 단량체성 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. sdAb는 분자 생물학 기술을 사용하여 낙타과(Camelidae) 종(예를 들면, 낙타(camel), 라마(llama), 단복낙타(dromedary), 알파카(alpaca) 및 구아나코(guanaco))에서 발견된 중쇄 항체로부터 유래되었고, 이는 또한 VHH 단편(본원에서 또한 "VHH" 또는 "VHH")으로 공지되어 있다. 다른 예는 연골 어류(cartilaginous fish), 예를 들면, 상어에서 발견된 중쇄 항체로부터 유래된 VNAR 단편을 포함한다. sdAb는 또한 가공 기술에 의해 통상의 면역글로불린 G(IgG)의 중쇄/경쇄로부터 생성되었다.
VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 더 작다. 이러한 단일 폴리펩타이드는 일반적으로 매우 안정하고, 흔히 통상의 항체 및 항체 단편의 경우 문제가 될 수 있는 극도의 pH 및 온도 조건을 견딘다. 더욱이, VHH는 프로테아제의 작용에 대해 보다 내성인 경향이 있다. 또한, VHH의 시험관 내(in vitro) 발현은 고 수율의 적절하게 폴딩된(folded)/작용성 VHH를 생산하는 경향이 있다. 또한, 낙타과 종에서 생성된 중쇄 항체 및 이의 가공된 단편(즉, VHH)은 달리 항체 라이브러리의 사용을 통해 시험관 내에서 또는 다른 포유동물의 면역화에 의해 생성된 보다 큰 통상의 항체 및 항체 단편에 달리 접근불가능한 애매한(cryptic) 또는 숨겨진(hidden) 에피토프를 인식할 수 있다.
하나의 양태에서, 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일 도메인 항체(sdAb)가 제공되고, sdAb는:
a) CDR1 아미노산 서열 GX1X2X3DX4YX5(서열 번호: 126)(여기서:
X1은 F 또는 V이고,
X2는 T 또는 S이고,
X3은 L, F, 또는 S이고,
X4는 Y, D, 또는 S이고,
X5는 V 또는 A이다),
CDR2 아미노산 서열 X6X7X8X9X10GX11T(서열 번호: 127)(여기서:
X6은 I 또는 M이고,
X7은 T, R, G, 또는 S이고,
X8은 S 또는 N이고,
X9는 D 또는 S이고,
X10은 D이거나 부재하고,
X11은 V 또는 A이다),
CDR3 아미노산 서열 AVDKPFYDGGX12X13YTCPVDFX14S(서열 번호: 128)(여기서:
X12는 I, N, Y, 또는 S이고,
X13은 Q, Y, R, 또는 L이고,
X14는 D 또는 G이다);
b) CDR1 아미노산 서열 GSX1F X2X3X4 X5V(서열 번호: 129)(여기서:
X1은 I 또는 T이고,
X2는 R이거나 부재하고,
X3은 R, S, 또는 I이고,
X4는 I, S, 또는 T이고,
X5는 A, S, 또는 T이다),
CDR2 아미노산 서열 ITSX6GX7X8(서열 번호: 130)(여기서:
X6은 G, S, 또는 A이고,
X7은 E, D, 또는 S이고,
X8은 T 또는 S이다), 및
CDR3 아미노산 서열 NAX9X10GX11X12X13X14(서열 번호: 131)(여기서:
X9는 K 또는 Q이고,
X10은 W 또는 Y이고,
X11은 Q, R, 또는 G이고,
X12는 Y, D, 또는 R이고,
X13은 E 또는 S이고,
X14는 Y, D, 또는 H이다);
c) CDR1 아미노산 서열 GRIX1RSYV(서열 번호: 132)(여기서:
X1은 F 또는 S이다),
CDR2 아미노산 서열 IGX2SDT(서열 번호: 133)(여기서:
X2는 W 또는 C이다), 및
CDR3 아미노산 서열 AX3X4SPPYGPQRDEFX5Y(서열 번호: 134)(여기서:
X3은 A 또는 E이고,
X4는 N 또는 Y이고,
X5는 G 또는 D이다);
d) CDR1 아미노산 서열 G X1TX2SVYX3(서열 번호: 135)(여기서:
X1은 R 또는 G이고,
X2는 S 또는 F이고,
X3은 G 또는 T이다),
CDR2 아미노산 서열 X4X5X6SX7GX8T(서열 번호: 136)(여기서:
X4는 M 또는 I이고,
X5는 S 또는 R이고,
X6은 W 또는 G이고,
X7은 G이거나 부재하고,
X8은 P 또는 G이다),
CDR3 아미노산 서열 AVRIRRTLX9EPLTKETLYDY(서열 번호: 137)(여기서:
X9는 L 또는 V이다);
e) 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
f) 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
g) 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
h) 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
i) 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
j) 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
k) 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열;
l) 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열; 또는
m) 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
상기에서:
그룹 a)는 hCD221ug-80, hCD22100ng-2, hCD221ug-74, hCD22100ng-66, hCD221ug-6, hCD22pas-10, hCD22pass-33으로 명명된 본원의 항체에 의해 정의된 컨센서스 서열을 제공하고,
그룹 b)는 hCD221ug-77, hCD221ug-87, hCD221ug-75, hCD221ug-93, hCD22pas-82, 및 hCD22pas-23으로 명명된 항체에 의해 정의된 컨센서스 서열을 제공하고,
그룹 c)는 hCD22pas-32, hCD221ug-14, 및 hCD22pas-55로 명명된 항체에 의해 정의된 컨센서스 서열을 제공하고,,
그룹 d)는 hCD22pas-79 및 hCD22pas-72로 명명된 항체에 의해 정의된 컨센서스 서열을 제공하고,
그룹 f)는 hCD22pas-16으로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 f)는 hCD221ug-10으로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 g)는 hCD221ug-13으로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 h)는 hCD221ug-36으로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 i)는 hCD221ug-61로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 j)는 hCD22100ug-62로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 k)는 hCD22pas-24로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 l)은 hCD22pas-48로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의되고,
그룹 m)은 hCD22pas-64로 명명된 항체로부터의 CDR에 의해 정의된다.
"CDR" 또는 "상보성-결정 영역"은 (paratope)를 총괄적으로 구성함으로써 항체에 결합 특이성 및 친화성을 부여하는 면역글로불린내 가변 쇄의 부위이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는 IMGT™(국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템)에 의해 설정된 표준 또는 조약에 따라 맵핑된 CDR을 지칭한다.
본원에 기술된 항체는 우세한 사람 CD22-베타 동형의 재조합 세포외 도메인(ECD)에 대해 상승되었다. 이러한 동형에 대한 예시적인 mRNA 서열은 GenBank 도입 번호 제NM_001771.4호에서 찾을 수 있고, 여기서 암호화된 단백질의 아미노산 1 내지 19는 리더 서열에 상응하고, 아미노산 20 내지 687은 ECD에 상응한다(참고: 또한 UniProt 도입 번호 제P20273호).
다른 양태에서, 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 단리된 VHH 단일 도메인 항체(sdAb)가 제공되고, sdAb는:
A)
서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6),
서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10),
서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13),
서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14),
서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36),
서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61),
서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74),
서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75),
서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77),
서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80),
서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87),
서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93),
서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2),
서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62),
서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66),
서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10),
서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16),
서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23),
서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-24),
서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32),
서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33),
서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48),
서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55),
서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64),
서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-72),
서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79), 또는
서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-24)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-72)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82)을 포함한다.
다른 양태에서, 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 단리된 VHH 단일 도메인 항체(sdAb)가 제공되고, sdAb는:
A)
서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6),
서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10),
서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13),
서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14),
서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36),
서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61),
서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74),
서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75),
서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77),
서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80),
서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87),
서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93),
서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2),
서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62),
서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66),
서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10),
서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16),
서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23),
서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-24),
서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32),
서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33),
서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48),
서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55),
서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64),
서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열 75 (hCD22pas-72),
서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79), 또는
서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82); 또는
B)
부분 A) i) 내지 xxviii) 중 어느 하나에 정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열에 대해 적어도 80% 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, B)에서 CDR 1 CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 부분 A) i) 내지 xxviii) 중 어느 하나에 정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열에 대해 적어도 95% 동일하다. 하나의 구현예에서, B)에서 CDR 1 CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 부분 A) i) 내지 xxviii) 중 어느 하나에 정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열과 비교하여 최대 3개의 치환을 갖는다. 하나의 구현예에서, B)에서 CDR 1 CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 부분 A) i) 내지 xxviii) 중 어느 하나에 정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열과 비교하여 최대 2개의 치환을 갖는다. 하나의 구현예에서, iB)에서 CDR 1 CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 부분 A) i) 내지 xxviii) 중 어느 하나에 정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열과 비교하여 최대 1개의 치환을 갖는다. 일부 구현에에서, A)에 설정된 서열에 대한 서열 차이는 보존적 서열 치환이다.
당해 분야에 공지된 용어 "보존적 아미노산 치환"은 본원에서 다음과 같이 정의되며, 보존적인 치환가능한 후보물 아미노산은 괄호 안에 나타낸다: Ala (Gly, Ser); Arg (Gly, Gln); Asn (Gln; His); Asp (Glu); Cys (Ser); Gln (Asn, Lys); Glu (Asp); Gly (Ala, Pro); His (Asn; Gln); Ile (Leu; Val); Leu (Ile; Val); Lys (Arg; Gln); Met (Leu, Ile); Phe (Met, Leu, Tyr); Ser (Thr; Gly); Thr (Ser; Val); Trp (Tyr); Tyr (Trp; Phe); Val (Ile; Leu).
특정의 구현예에 따른 서열 변이체는 결합 친화성 및/또는 특이성이 이것이 유래된 모 분자에 대해 실질적으로 변경되지 않은 분자를 포함한다. 이러한 매개변수는 예컨대, 본원에 기술된 기술 및 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 구현예는 서열 치환, 삽입, 또는 결실을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 단리된 VHH 단일 도메인 항체(sdAb)가 제공되고, sdAb는:
A)
서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열 48,
서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열 51,
서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열 54,
서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열 57,
서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열, 또는
서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
CDR3이 흔히 VHH sdAb에 대한 결합의 주요 결정인자임을 인식하여, 다른 CDR이 돌연변이될 수 있거나 달리는 다양해질 수 있고 수득되는 라이브러리(또는 후보물 분자)는 CD22에 결합하고/하거나 CD22에 대한 결합에 대해 모 분자와 교차-경쟁하는 항체에 대해 스크리닝될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 이러한 구현예는 특히, 이러한 방식으로 확인된 분자를 포함하는 것으로 의도된다.
하나의 구현예에서, 단리된 sdAb는:
서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열, 또는
서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
이러한 구현예는 특히 CDR2의 돌연변이유발/유도체화, 및 CD22에 결합하고/하거나 CD22에 대한 결합에 대해 이들이 정의된 모 분자와 교차-경쟁하는 변이체 분자에 대한 스크리닝 후 회수된 구현예를 포함한다. 상기와 같이, 라이브러리는 스크리닝될 수 있거나 개개 후보물 분자가 시험될 수 있다.
하나의 구현예에서, sdAb는 A) 서열 번호: 85 내지 112 및 120 내지 125 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 B) 이의 정체 길이에 걸쳐 서열 번호: 82 내지 108 및 120 내지 125 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, B)의 아미노산 서열은 따라서 A)의 아미노산 서열 중 하나에 대해 전체 길이에 걸쳐 적어도 85% 동일하다. 하나의 구현예에서, B)의 아미노산 서열은 따라서 A)의 아미노산 서열 중 하나에 대해 전체 길이에 걸쳐 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, B)의 아미노산 서열은 따라서 A)의 아미노산 서열 중 하나에 대해 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 동일하다. 하나의 구현예에서, B)의 아미노산 서열은 따라서 A)의 아미노산 서열 중 하나에 대해 전체 길이에 걸쳐 적어도 98% 동일하다. 일부 이러한 구현예에서, A)의 서열에 대한 서열 차이는 CDR 서열 외부이다.
하나의 구현예에서, sdAb는 A) 서열 번호: 82 내지 108 및 120 내지 125 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 82에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 83에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 84에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 85에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 86에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 87에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 88에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 89에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 90에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 91에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 92에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 93에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 94에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 95에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 96에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 97에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 98에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 99에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 100에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 101에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 102에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 103에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 104에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 105에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 106에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 107에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 108에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 120에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 121에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 122에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 123에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 124에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 125에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 82를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 83을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 84를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 85를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 86을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 87을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 88을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 89를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 90을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 91을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 92를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 93을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 94를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 95를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 96을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 97을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 98을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 99를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 100을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 101을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 102를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 103을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 104를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 105를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 106을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 107을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 108을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 120을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 121을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 122를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 123을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 124를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 125를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 낙타과 VHHsdAb이다.
하나의 구현예에서, sdAb는 라마 VHHsdAb이다.
하나의 구현예에서, sdAb는 사람화된 낙타과 VHH이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람화된"은 돌연변이됨으로써 사람 환자에서 투여시 면역원성이 작거나 존재하지 않음을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 사람화는 폴리펩타이드가 이의 대표적인 특성을 상실하지 않으면서, 낙타과 아미노산 중 하나 이상이 사람 컨센서스 서열에서 발견된 것으로서 이의 사람 대응부로 대체되는 단계를 포함하는데, 즉, 사람화는 수득되는 폴리펩타이드의 항원 결합 능력에 유의적으로 영향을 미치지 않는다. 사람화된 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 CDR-그래프팅(CDR-grafting), 베니어일(veneering) 또는 재표면화(resurfacing), 쇄 셔플링(chain shuffling) 등을 사용하여 생산할 수 있다.
하나의 구현예에서, sdAb는 사람 CD22에 대해 2.5 x 10-7 nm 이하의 친화성(affinity)을 갖는다. 하나의 구현예에서, sdAb는 사람 CD22에 대해 3 x 10-8 nm 이하의 친화성을 갖는다. 하나의 구현예에서, sdAb는 사람 CD22에 대해 9.6 x 10-9 nm 이하의 친화성을 갖는다. 하나의 구현예에서, sdAb는 사람 CD22에 대해 9.3 x 10-10 nm 이하의 친화성을 갖는다. 하나의 구현예에서, sdAb는 사람 CD22에 대해 7 x 10-12 nm 이하의 친화성을 갖는다. 결합 친화성은 예컨대, 본원에 기술된 검정에 따라 측정할 수 있다.
CD22가 막-원위(membrane-distal)로부터 막-근접(membrane-proximal)까지 1 내지 7로 본원에 넘버링된(numbering), 7개의 Ig-유사 도메인(Ig-like domain)을 포함한다(참고: 참고를 위해 도 7). 일부 구현예에서, sdAb는 이러한 Ig-유사 도메인 중 하나 이상에 대해 선택적이거나 우선적인 결합을 나타낸다. 성숙한 사람 CD22 ECD는 UniProt 도입 번호 제P20273호의 아미노산 20 내지 687으로 연장된다. 이러한 서브서열(subsequence) 내에서, 7개의 Ig-유사 도메인은 일반적으로 아미노산 1 내지 119(1), 124 내지 216(2), 223 내지 302(3), 312 내지 397(4), 400 내지 481(5), 486 내지 563(6), 및 574 내지 657(7)의 영역에 상응한다. 어디에서든, IgL-V 및 IgL-1 내지 IgL-6 각각으로서 1 내지 7로 본원에 명명된 도메인을 지칭하는 것이 일반적이다. 단순하게, 도메인은 본원에서 1("제1") 내지 7("제7")의 순수로 번호매김된다. 에피토프 맵핑을 위해, 7개의 단편은 bin(빈) 1 내지 7로서 각각의 Ig-유사 도메인을 함유하고 아미노산 1 내지 135(bin1), 111 내지 230(bin2), (211 내지 317)(bin3), 303 내지 405(bin4), 391 내지 490(bin5), 476 내지 575(bin6), 및 561 내지 668(bin7)의 영역에 상응한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 사람 CD22의 제1의 Ig-유사 도메인에 결합한다. 하나의 이러한 특수한 구현예에서, 제1의 Ig-유사 도메인에 결합하는 sdAb는 서열 번호: 91(hCD221ug-80)을 포함한다. 하나의 구현예에서, sdAb는 사람 CD22의 제4의 Ig-유사 도메인에 결합한다. 하나의 이러한 특수한 구현예에서, 제4의 Ig-유사 도메인에 결합하는 sdAb는 서열 번호: 84(hCD221ug-13)를 포함한다. 하나의 구현예에서, sdAb는 사람 CD22의 제6의 Ig-유사 도메인에 결합한다. 하나의 이러한 특수한 구현예에서, 제6의 Ig-유사 도메인에 결합하는 sdAb는 서열 번호: 84(hCD221ug-13), 서열 번호: 91(hCD221ug-80), 서열 번호: 86(hCD221ug-36), 또는 서열 번호: 105(hCD221pas-64)를 포함한다. 하나의 구현예에서, sdAb는 사람 CD22의 제7의 Ig-유사 도메인을 포함한다. 하나의 이러한 특수한 구현예에서, 제7의 Ig-유사 도메인에 결합하는 sdAb는 서열 번호: 87(hCD221ug-61), 서열 번호: 83(hCD221ug-10), 또는 서열 번호: 100(hCD22pas-24)을 포함한다.
하나의 양태에서, CD22에 대한 특이적인 결합에 대해 상술한 단리된 sdAb와 경쟁하는 VHH 단일 도메인 항체(sdAb)가 제공된다. 본 발명의 sdAb는 시험 항체가 표적 분자 상에서 결합 부위에 대해 본 발명의 공지된 항체와 교차-경쟁할 수 있는지의 여부에 상관없이 평가하는 결합 검정을 포함하는 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 본원 상기에 기술된 항체는 참고 항체로서 사용될 수 있다. 경쟁적 결합 검정을 수행하기 위한 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 이는 본 발명의 공지된 항체 및 표적 분자와 함께 항체가 표적 분자에 결합할 수 있는 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 항체/표적 복합체는 이후에 시험 항체와 접촉될 수 있고 시험 항체가 항체/표적 복합체로부터 본 발명의 항체를 나타낼 수 있는 정도를 평가할 수 있다. 대안적인 방법은 시험 항체를 표적 분자와 항체 결합을 허용하는 조건 하에서 접촉시키는 단계, 이후에 이러한 표적 항체와 결합할 수 있는 본 발명의 항체를 가하는 단계 및 본 발명의 항체가 항체/표적 복합체로부터 시험 항체를 나타낼 수 있는 정도를 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 CD22에 대한 신규한 sdAb를 생성시키고 교차-경쟁에 대해 수득되는 라이브러리를 스크리닝하는 단계에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 항체 중 하나는 다양화(diversification), 라이브러리 생성, 및 스크리닝을 위한 출발 지점으로서 제공될 수 있다. 추가의 대안은 본원에 기술된 항체의 개개 변이체를 시험하는 단계를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 정의된 sdAb는 낙타과 sdAb이다.
하나의 구현예에서, 본원에 정의된 sdAb는 라마 sdAb이다.
하나의 구현예에서, 본원에 정의된 sdAb는 낙타과 sdAb의 사람화된 형태이다.
표 1은 본원에 개시된 다양한 sdAb에 대한 전체 길이의 서열을 나열한다. CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열이 밑줄쳐져 있다. 본원에 사용된 CDR 확인 및 넘버링은 IMGT™ 협약에 따른다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
표 2는 VHH#와 함께 본원에 사용된 항체 명칭과 CDR1, CDR2, CDR3에 대한 서열 번호와 각각의 sdAb에 대한 전체 서열 사이의 상응성을 제공한다.
[표 2]
Figure pct00004
재조합 폴리펩타이드
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 sdAb를 포함하는 재조합 폴리펩타이드가 제공된다. 하나의 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 sdAb를 포함하는 재조합 폴리펩타이드가 제공된다. 하나의 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 2개 이상의 sdAb를 포함하는 재조합 폴리펩타이드가 제공된다. 하나의 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 2개 이상의 sdAb를 포함하는 재조합 폴리펩타이드가 제공된다.
V H H:F c 융합체
하나의 구현예에서, 사람 Fc에 대해 융합된 본원에 정의된 sdAb("VHH:Fc 융합체"로 명명됨)가 제공된다. 예를 들면, the VHH:Fc 융합체는 IgG, IgA, 또는 IgD 동형의 적어도 하나의 CH2 및 CH3를 포함할 수 있다. VHH:Fc 융합체는 IgM 또는 IgE 동형의 적어도 하나의 CH2, CH3, 및 CH4를 포함할 수 있다. 이러한 구현예는 보다 높은 차원의 재조합 분자 내에서 면역계를 활성화시키는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에 따라서, 2개의 이러한 Fc-함유 VHH:Fc 융합체를 조립하여 재조합 단량체성 항체를 형성시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 단량체성 항체는 면역계를 활성화시킬 수 있다. 이러한 단량체성 항체는 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 동형일 수 있다. 하나의 구현예에서, IgA Fc-함유 VHH:Fc 융합체는 또한 재조합 이량체성(분비성) 형태로 조립될 수 있다. 일부 구현예에서 다량체성 형태 또한 예상된다. 예를 들면, 5개의 IgM 단량체를 조립하여 재조합 오량체성 항체를 형성시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 다가 항체는 동일한 VHH:Fc 융합체의 조립(assembly)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 다가 항체는 동일한 결합 표적을 갖는 상이한 VHH:Fc 융합체의 조립일 수 있다. 예를 들면, 이는 동일한 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 예는 상이한 VHH:Fc 융합체의 조립을 포함하고, 각각은 본원에 정의된 바와 같은 상이한 항-CD22 sdAb를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 다가 항체는 본원에 정의된 VHH:Fc의 조립체(본원에 정의된 바와 같은 항-CD22 sdAb를 포함함) 및 상이한 표적에 대해 지시된 파라토프(paratope)를 포함하는 다른 VHH:Fc 융합체일 수 있다.
카고 분자(Cargo Molecule)에 대한 융합체
추가의 양태에서, 본 개시내용은 카고 분자에 연결된 본원에 정의된 바와 같은 항-CD22 sdAb를 제공한다. 카고 분자는 예를 들면, 치료학적 모이어티(moiety), 예를 들면, 세포독성제, 세포정지제(cytostatic agent), 항-암제 또는 방사선치료제를 포함할 수 있다. 개시내용의 특수한 구현에에서, 항체 약물 접합체는 세포독성제를 포함할 수 있다. 개시내용의 다른 특수한 구현예는 방사선치료제를 포함하는 항체 약물 접합체에 관한 것이다.
재조합 핵산 분자
양태에서, sdAb를 암호화하는 재조합 핵산 분자, 재조합 폴리펩타이드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 VHH:Fc 융합체가 제공된다.
조성물
하나의 양태에서, 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본원에 정의된 바와 같은 sdAb, 또는 이러한 sdAb를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 하나의 구현예에서 조성물은 약제학적 조성물이고, 부형제, 희석제 또는 담체는 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체이다.
용도 및 방법
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료를 위한 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 또는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 VHH:Fc 융합체를 포함하는 항체의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 또는 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome)이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoid leukemia: ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphoid leukemia; CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종(multiple myeloma), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소 세포 소포 림프종(small cell follicular lymphoma), 및 거대 세포 소포 림프종(large cell follicular lymphoma)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환(auto-immune disease)은 염증성 질환(inflammatory disease)이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스(lupus)이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종(multiple sclerosis)이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병(autoimmune diabetes)이다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 또는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 VHH:Fc 융합체를 포함하는 항체의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종(multiple myeloma), 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 또는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 VHH:Fc 융합체를 포함하는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
하나의 양태에서, 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 또는 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 또는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 VHH:Fc 융합체를 포함하는 항체를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암 또는 자가-면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
다가 항체 및 관련된 구현예
하나의 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 sdAb를 포함하는 다가 항체가 제공된다.
"다가 항체"는 동일하거나 상이한 표적 분자(들) 내에 하나 이상의 항원(들)에 결합하기 위한 하나 이상의 가변 영역 또는 파라토프를 포함하는 분자를 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
일부 구현예에서, 파라토프는 동일한 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 파라토프는 상이한 표적 분자에 결합할 수 있다. 이러한 구현예에서, 다가 항체는 존재하는 상이한 특이성의 파라토프의 수에 따라서, 이특이적, 삼특이적 또는 다특이적으로 명명될 수 있다. 다가 항체는 본원에 정의된 바와 같은 항-CD22 sdAb 중 하나를 포함하므로, 다가 항체는 CD22 결합 친화성을 포함한다.
예를 들면, 상기 설명한 바와 같이, 일부 구현예에서 다가 항체는 본원에 정의된 VHH:Fc 융합체의 조립(본원에 정의된 바와 같은 sdAb를 포함함) 및 상이한 특이성을 부여하는 상이한 파라토프를 포함하는 다른 VHH:Fc 융합체의 조립일 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 정의된 sdAb, 및 제2의 항원-결합 부위를 포함하는 이특이적 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 제2의 항원 결합 부위는 모노클로날 항체, Fab, 및 F(ab')2, Fab', scFv, 또는 sdAb, 예를 들면, VHH 또는 VNAR을 포함할 수 있다.
"항원-결합 부위"는 이의 가공된 항체 단편을 포함하는, 항원-결합 활성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다.
일부 구현예에서, 제2의 항원-결합 부위는 예컨대, 안정화/반감기 연장의 목적을 위해, 사람 혈청 알부민에 결합할 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 sdAb, 및 제2의 결합 부위, 및 제3의 항원-결합 부위를 포함하는 삼특이적인 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 제2의 항원 결합 부위는 모노클로날 항체, Fab, 및 F(ab')2, 및 Fab', sdFv, 또는 sdAb, 예를 들면, VHH 또는 VNAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3의 항원 결합 부위는 독립적으로 모노클로날 항체, Fab, 및 F(ab')2, 및 Fab', sdFv, 또는 sdAb, 예를 들면, VHH 또는 VNAR을 포함한다.
제2 및/또는 제3의 항원-결합 부위는 예컨대, 안정화/반감기 연장의 목적을 위해 사람 혈청 알부민에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 삼특이적인 항체는 다중특이적일 수 있고 항체는 하나 이상의 추가의 항원-결합 부위(들)을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 추가의 항원-결합 부위(들)은 독립적으로, Fab, 및 F(ab')2, 및 Fab', sdFv, 또는 sdAb, 예를 들면, VHH 또는 VNAR일 수 있다.
하나의 구현예에서, 다특이적인 항체는 본원에 정의된 바와 같은 sdAb, 및 제2의 항원-결합 부위를 포함하는 제1의 항원-결합 부위를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제2의 항원-결합 모이어티는 면역 세포의 세포-표면 마커(cell-surface marker)에 특이적으로 결합한다.
"세포 표면 마커"는 특히 세포형에 대해(또는 풍부한) 세포의 표면에서 발현되고, 항원-결합 부위에 의해 결합되거나 인식될 수 있는 분자이다.
이특이적인 T-세포 인게이저
하나의 구현예에서, 다가 항체는 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 및 T-세포의 세포-표면 마커에 특이적으로 결합하는 제2의 항원-결합 모이어티를 포함하는 이특이적인 T-세포 인게이저이다. 하나의 구현예에서, T-세포 마커는 사람 CD3을 포함한다.
본 발명자가 인식할 사람 CD3은 다중-소단위 항원이며, 이의 다양한 소단위는 CD3 활성화에 관여할 수 있다. 하나의 이러한 소단위는 CD3 엡실론(참고: 예컨대, GenBank NP_000724.1)이다. 다른 비-제한적인 예는 CD3 감마(참고: 예컨대, GenBank NP_000064.1) 및 델타(참고: 예컨대, 델타 동형 A의 경우 GenBank NP_000723.1, 및 예컨대, 델타 동형 B의 경우 GenBank NP_001035741.1)를 포함한다.
일부 구현예에서, T-세포 마커는 CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타를 포함한다. 하나의 구체적인 구현예에서, T-세포 마커는 CD3 엡실론을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이특이적인 T-세포 인게이저"는 2개의 상이한 항체로부터의 2개의 연결된 가변 영역을 갖는 재조합 이특이적 단백질을 지칭하고, 하나는 T 세포 상의 세포-표면 마커(예를 들면, CD3ε)를 표적화하고, 다른 것은 질환이 있는 세포, 전형적으로 악성 세포 상의 항원을 표적화한다. 예를 들면, 이특이적인 T-세포 인게이저는 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 및 scFv를 포함할 수 있다. 이특이적인 T-세포 인게이저는 본원에 정의된 바와 같은 sdAb 및 제2의 VHH/sdAb를 포함할 수 있다. 2개의 가변 영역은 전형적으로 짧은 유연성 링커, 예를 들면, GlySer 링커에 의해 서로 연결된다. 종양 항원 및 T 세포에 동시에 결합함으로써, 이특이적인 T-세포 인게이저는 T-세포 반응 및 종양 세포의 사멸을 매개한다. 이특이적인 T-세포 인게이저에 의해 촉진된 T-세포/표적 세포 부착은 MHC 일배체형(MHC haplotype)과는 독립적이다.
하나의 구현예에서, 이특이적인 T-세포 인게이저는 N-말단에서 C-말단 방향으로:
- 제1의 항원-결합 부위,
- 아미노산 링커, 및
- 제2의 항원-결합 부위를 포함한다.
하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 제1의 항원-결합 부위에 대한 신호 펩타이드 N-말단을 추가로 포함한다.
본원에 지칭된 바와 같은 "신호 펩타이드"는 초기 단백질(nascent protein)이 소포체(endoplasmic reticulum) 및 후속적으로 이것이 발현되는 세포 표면에 지시되도록 한다. 신호 펩타이드의 코어는 단일 알파-나선을 형성하는 경향성을 가진 소수성 아미노산의 긴 스트레치를 함유할 수 있다. 신호 펩타이드는 아미노산의 짧 은 양으로 하전된 스트레치로 개시할 수 있고, 이는 전좌 동안 폴리펩타이드의 적절한 위상을 강화시키는 것을 돕는다. 신호 펩타이드의 말기에는 신호 펩티다제에 의해 인식되어 절단되는 아미노산의 스트레치가 존재한다. 신호 펩티다제는 전좌 동안 또는 전좌의 완료 후에 절단되어 유리된 신호 펩타이드 및 성숙한 단백질을 생성한다. 이후에, 유리된 신호 펩타이드는 특이적인 프로테아제에 의해 소화된다. 신호 펩타이드는 분자의 아미노 말단에 존재할 수 있다.
하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 사람 CD28로부터의 신호 펩타이드이다. 하나의 구현예에서, 사람 CD28로부터의 신호 펩타이드는 서열 번호: 110을 포함한다. 하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호: 110에 대해 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호: 110에 대해 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호: 110에 대해 적어도 95% 동일하다. 하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호: 110에 대해 적어도 98% 동일하다.
이러한 문맥에서 "아미노산 링커"는 이특이적인 T-세포 인게이저가 표적 둘 다를 인게이지(engage)하기에 충분이 기능성이 되도록 하는 충분한 길이, 유연성(flexibility), 및 조성의 서열로 이해될 것이다.
아미노산 링커는 힌지(hinge)를 포함할 수 있다. 힌지는 예컨대, 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 사람 CD8로부터 유래될 수 있다.
하나의 구현예에서, 아미노산 링커는(N- 내지 C-말단 방향으로) 서열 번호: 111 내지 서열 번호: 112 내지 서열 번호: 118; 또는 서열 번호: 111 내지 서열 번호: 112 내지 서열 번호: 118에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 111에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 111에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 111에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 111에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 아미노산 링커는 서열 번호: 112에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 아미노산 링커는 서열 번호: 112에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 아미노산 링커는 서열 번호: 112에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 아미노산 링커는 서열 번호: 112에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 118에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 118에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 118에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 118에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 다가 항체는 서열 번호: 119에 의해 암호화된다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-24)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열 75 (hCD22pas-72)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 82에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 83에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 84에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 85에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 86에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 87에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 88에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 89에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 90에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 91에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 92에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 93에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 94에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 95에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 96에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 97에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 98에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 99에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 100에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 101에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 102에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 103에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 104에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 105에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 106에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 107에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 108에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 120에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 121에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 122에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 123에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 124에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 125에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 82를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 83을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 84를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 85를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 86을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 87을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 88을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 89를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 90을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 91을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 92를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 93을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 94를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 95를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 96을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 97을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 98을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 99를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 100을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 101을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 102를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 103을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 104를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 105를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 106을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 107을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 108을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 120을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 121을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 122를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 123을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 124를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 125를 포함한다.
일부 구현예에서, BiKE는 상술한 BiKE 중 하나에 대해 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 상기 BiKE의 서열 변이체이다. 일부 구현예에서, 변이체는실질적으로 이것이 유래된 모 분자와 동일한 결합 특이성을 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체는 실질적으로 이것이 유래된 모 분자와 동일한 결합 친화성을 보유한다.
BiKE 및 TriKE
하나의 구현예에서, 다가 항체는 이특이적인 킬러 세포 인게이저(bispecific killer cell engager)이다.
용어 "BiKE"는 2개의 상이한 항체로부터의 2개의 연결된 가변 영역을 갖는 재조합의 이특이적인 단백질을 지칭하고, 하나는 천연 킬러(natural killer; NK) 세포(예를 들면, CD16) 상의 세포-표면 분자를 표적화하고, 다른 것은 질환이 있는 세포, 전형적으로 악성 세포의 표면 상의 항원을 표적화한다. 예를 들면, BiKE는 2개의 scFv, 2개의 VHH, 또는 이의 조합을 포함한다. 2개는 전형적으로 짧은 유연성 링커에 의해 함께 연결된다. 종양 항원 및 NK 세포에 동시에 결합함으로써, BiKE는 NK-세포 반응 및 종양 세포의 사멸을 매개한다.
하나의 구현예에서, 면역 세포의 세포-표면 마커는 천연 킬러(NK) 세포 마커를 포함한다. 하나의 구현예에서, NK 세포 마커는 사람 CD16을 포함한다.
하나의 구현예에서, 다가 항체는 삼특이적인 킬러 세포 인게이저(trispecific killer cell engager; BiKE)이다.
용어 "TriKE"는 BiKE에서 다른 기능성을 포함하도록 추가로 변형됨을 나타낸다. 이러한 용어는 다양한 접근법을 포함하도록 사용되었다. 한가지 접근법은 개입하는 면역조절 분자(intervening immunomodulatory molecule)(변형된 사람 IL-15 가교결합제)를 삽입시켜 NK 세포 활성화, 확장, 및/또는 생존을 촉짐하는 단계를 포함한다(Vallera et al. IL-15 Trispecific Killer Engagers (TriKEs) Make Natural Killer Cells Specific to CD33+ Targets While Also Inducing In Vivo Expansion, 및 Enhanced Function. Clinical Cancer Research. 2012 ;22(14): 3440-50). 다른 TriKE 접근법은 3개의 항체 가변 영역을 포함하는 삼특이적인 분자이다: 하나는 NK 세포 수용체를 표적화하고 2개는 종양-관련 항원(tumor-associated antigen)을 표적화한다(Gleason et al. Bispecific and Trispecific Killer Cell Engagers Directly Activate 사람 NK Cells Through CD16 Signaling and Induce Cytotoxicity 및 Cytokine Production. Mol Cancer Ther. 2012; 11(12): 2674-84). 여전히 다른 TriKE 접근법은 2개의 NK 세포 수용체(예컨대, CD16 및 NKp46) 및 1개의 종양-관련 항원(Gauthier et al. Multifunctional Natural Killer Cell Engagers Targeting NKp46 Trigger Protective Tumor Immunity. Cell. 2019; 177(7): 1701-13)을 표적화한다.
하나의 구현예에서, 다가 항체는 NK 세포의 활성화, 확장, 및/또는 생존을 자극하기 위한 사이토킨을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, NK 세포의 확장응 자극시키기 위한 사이토킨은 인터류킨-15(IL15), 이의 변이체, 또는 이의 기능성 단편이다.
하나의 구현예에서, 다가 항체는 제2의 NK 세포 마커에 결합하는 적어도 제3의 항원-결합 부위를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제2의 NK 세포 마커는 사람 NKp46이다.
하나의 구현예에서, 다가 항체는 종양-관련 항원에 결합하는 적어도 제3의 항원-결합 부위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 종양-관련 항원은 사람 CD22와는 구별된다.
하나의 구현예에서, 제3의 항원-결합 부위는 VHH, VNAR, 또는 scVF를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제2의 항원-결합 부위는 VHH를 포함한다.
하나의 구현예에서, 제3의 항원-결합 부위는 사람 혈청 알부민에 결합한다. 이러한 구현예에서, 사람 혈청 알부민에 대한 친화성은 안정화/증가된 반감기에 기여할 수 있다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-24)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-72)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열 77, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 82에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 83에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 84에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 85에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 86에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 87에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 88에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 89에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 90에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 91에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 92에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 93에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 94에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 95에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 96에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 97에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 98에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 99에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 100에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 101에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 102에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 103에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 104에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 105에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 106에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 107에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 108에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 120에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 121에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 122에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 123에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 124에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 125에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 82를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 83을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 84를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 85를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 86을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 87을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 88을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 89를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 90을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 91을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 92를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 93을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 94를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 95를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 96을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 97을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 98을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 99를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 100을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 101을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 102를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 103을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 104를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 105를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 106을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 107을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 108을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 120을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 121을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 122를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 123을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 124를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 125를 포함한다.
일부 구현예에서, BiKE 또는 TriKE는 이에 대해 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 상기 BiKE 및 TriKE 중 하나의 서열 변이체이다. 일부 구현예에서, 변이체는 실질적으로 이것이 유래된 모 분자와 동일한 결합 특이성을 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체는 실질적으로 이것이 유래된 모 분자와 동일한 결합 친화성을 보유한다.
하나의 양태에서, 제1의 항원-결합 부위, 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지를 포함하는 아미노산 링커, 및 제2의 항원-결합 부위를 포함하는 다가 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지는 서열 번호: 112를 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지에 대해 적어도 하나의 G4S N-말단, 및 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지에 대해 적어도 하나의 G4S C-말단을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 길이가 적어도 47aa, 바람직하게는 길이가 적어도 52개 잔기, 바람직하게는 길이가 적어도 57개 잔기, 보다 바람직하게는 길이가 적어도 62개 잔기, 심지어 보다 바람직하게는 길이가 적어도 67개 잔기이다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 서열 번호: 111, 112, 및 118을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제1의 항원-결합 부위는 사람 CD22에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, 제1의 항원-결합 부위는 VHH, VNAR, 또는 scVF이다. 하나의 구현예에서, 제1의 항원-결합 부위는 본원에 기술된 바와 같은 하나의 항-CD22 sdAb이다. 하나의 구현예에서, 제2의 항원-결합 모이어티는 면역 세포의 세포-표면 마커에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, 면역 세포의 세포-표면 마커는 T-세포 마커를 포함한다. 하나의 구현예에서, T-세포 마커는 사람 CD3을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제2의 항원 결합 부위는 VHH, VNAR, 또는 scVF이다.
재조합 핵산 분자
양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체를 암호화하는 재조합 핵산 분자가 제공된다. 하나의 구현예에서, 핵산은 벡터이다.
조성물
하나의 양태에서, 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 하나의 구현예에서, 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 이특이적인 T-세포 인게이저를 포함한다. 하나의 구현예에서, 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 BiKE를 포함한다. 하나의 구현예에서, 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 TriKE를 포함한다. 하나의 구현예에서 조성물은 약제학적 조성물이고, 부형제, 희석제 또는 담체는 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체이다.
용도 및 방법
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료를 위한 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
하나의 양태에서, 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 다가 항체를 투여함을 포함하여, 대상체에서 암 또는 자가-면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
표 3은 특정의 양태 및 구현예에 따라서, 본원에 기술된 다가 항체 및 CAR에 대한 예시적 서열 및 이의 모듈(module)을 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
항체 hCD221ug36(서열 번호: 138)을 포함하는 예시적인 CAR 작제물의 경우:
- 1 내지 54번 위치는 신호 펩타이드에 상응하고,
- 55 내지 396번 위치는 항체 1ug36 ABD에 상응하고(그러나, 대안적으로 본원에 기술된 임의의 다른 항-CD22 sdAb일 수 있다),
- 397 내지 606번 위치는 (G4S)3-사람 CD8a 힌지 및 제한 반흔(restriction scar)에 상응하고,
- 607 내지 702번 위치는 사람 CD28 막관통 도메인에 상응하고,
- 703 내지 828번 위치는 사람 41BB 공-자극성 도메인(co-stimulatory domain)에 상응하고,
- 829 내지 1170번 위치는 사람 CD3-제타 신호전달 도메인(CD3-zeta signaling domain)에 상응한다.
실험 및 시험의 목적을 위해, 이후 작제물은 임의의 프레임 내(in-frame P2A-GFP) 마커를 포함한다.
항체 hCD221ug36(서열 번호: 139)을 포함하는 예시적인 이특이적 T-세포 인게이저 작제물의 경우:
- 1 내지 72번 위치는 신호 펩타이드 및 제한 반흔에 상응하고,
- 64 내지 405번 위치는 항체 hCD221ug36에 상응하고(그러나 대안적으로, 본원에 기술된 임의의 다른 항-CD22 sdAb일 수 있다),
- 406 내지 633번 위치는 (G4S)3-hCD8a-(G4S) 링커 도메인(또한 모듈러 힌지(modular hinge)에 대한 제한 부위를 함유한다)에 상응하고,
- 633 및 634번 위치는 CD3-특이적인 뮤린 scFv에 대한 중쇄에 의해 분리되고,
- 634 내지 678번 위치는 (G4S)3 링커에 상응하고,
- 678 내지 679번 위치는 CD3-특이적인 뮤린 scFv에 대한 경쇄에 상응하도록 분리된다.
실험 및 시험 목적을 위해, 작제물은 이후에 679 내지 699번을 포함하고, 이는 6x His 태그(tag) 및 정지 코돈(stop codon)에 상응한다.
표 3에 나타낸 서열 번호: 120 내지 125에 상응하는 예시적인 항체 서열의 경우, 특히 아미노 말단에 대해 서열 차이가 존재함에 주목할 것이다. 구체적으로, 1, 3, 및 5번 위치는 각각 Q, Q, V이다(표 3에서 서열 번호; 120 및 121 대 표 1 및 3에서 VHH#22(서열 번호: 86) 및 VHH#11(서열 번호: 93)과 비교시). 이론에 얽매이지 않고, 이러한 서열 차이는 안정성 및/또는 프로테아제 내성에 기여할 수 있다(참고: Hussack G et al. Protein Engineering Design & Selection. 2014; 27(6); 191-198). 따라서, 본원에 개시된 구현예 다가 항체 및 CAR 구현예는 1, 3, 및 5번 위치 각각에서 Q, Q, 및 V를 비교하기 위해 변형된 본원에 개시된 sdAb 중 어느 하나를 포함하는 변이체를 포함한다.
키메라 항체 수용체 및 관련 구현예
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 VHH sdAb를 포함하는, 사람 CD22에 결합하는, 키메라 항체 수용체(CAR)가 제공된다.
"키메라 항원 수용체"는 특이적인 단백질을 표적화하는 신규 능력을 T 세포에 제공하도록 가공된 수용체 단백질이다. 수용체는 항원-결합 및 T-세포 활성화 기능 둘다를 단일 수용체 내로 조합시키므로 키메라성이다(참고: Stoiber et al. Limitations in the Design of Chimeric Antigen Receptors for Cancer Therapy. Cells. 2012; 8(5): 472 및 van der Stegen et al. The pharmacology of second-generation chimeric antigen receptors. Nat Rev Drug Discov. 2019; 14(7): 499-509).
하나의 구현예에서, CAR은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
- 제1항 내지 제27항 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 sdAb를 포함하는 CD22 결합 도메인,
- 폴리펩타이드 힌지,
- 막관통 도메인, 및
- 공-자극성 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 세포질성 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드 힌지"는 일반적으로 세포외 리간드-결합 도메인을 막관통 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 특히, 힌지 영역은 세포외 리간드-결합 도메인에 대해 유연성 및 접근가능성을 보다 더 제공하기 위해 사용된다. 힌지 영역은 300개 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개 아미노산 및 가장 바람직하게는 25 내지 50개 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 천연적으로 발생하는 분자 모두 또는 부분, 예를 들면, CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역의 모두 또는 부분, 또는 항체 불변 영역의 모두 또는 부분으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로 힌지 영역은 천연적으로 발생하는 힌지 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 전체적으로 합성 힌지 서열일 수 있다.
하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 힌지는 CD8 힌지 도메인이다. 하나의 구현예에서, CD8 힌지 도메인은 서열 번호: 112를 포함한다. 하나의 구현예에서, CD8 힌지 도메인은 서열 번호: 112에 대해 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 힌지 도메인은 서열 번호: 112에 대해 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 힌지 도메인은 서열 번호: 112에 대해 적어도 95% 동일하다. 하나의 구현예에서, 힌지 도메인은 서열 번호: 112에 대해 적어도 98% 동일하다.
용어 "막관통 도메인"은 세포 막을 확장(span)시키는 능력을 가짐으로써 CAR의 세포외 부위(이는 CD22-결합 부위를 포함한다)를 신호전달에 관여하는 세포내 부위에 연결시키는 능력을 갖는 폴리펩타이드를 나타낸다. CAR에 대해 일반적으로 사용된 막관통 도메인은 CD4, CD8α, CD28 및 CD3ζ로부터 유래되었다.
하나의 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다. 하나의 구현예에서, CD28 막관통 도메인은 서열 번호: 113을 포함한다. 하나의 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 번호: 113에 대해 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 번호: 113에 대해 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 번호: 113에 대해 적어도 95% 동일하다. 하나의 구현예에서, 막관통 도메인은 서열 번호: 113에 대해 적어도 98% 동일하다.
용어 "세포질성 도메인"(또한 "신호 형질도입 도메인(signal transduction domain)"으로 명명됨)은 면역 세포의 활성화 및 면역 반응을 야기하는 표적에 대한 세포외 리간드 결합 도메인의 결합 후 세포내 신호전달에 관여하는 CAR의 세포내 부위를 지칭한다. 다시 말해서, 세포질성 도메인은 CAR이 발현되는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화에 관여한다. 예를 들면, T 세포의 효과기 기능은 세포분해 활성 또는 헬퍼 활성(helper activity), 예를 들면, 사이토킨의 분비일 수 있다. 따라서, 용어 "세포질성 도메인"은 효과기 신호를 형질도입하여 세포가 구체화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부위를 지칭한다. 이러한 세포질성 도메인이 신호전달 도메인 외에 공-자극성 도메인을 포함하는 것은 일반적이다.
용어 "신호전달 도메인"은 효과기 신호를 형질도입하고 세포가 구체화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부위를 지칭한다. CAR에서 사용하기 위한 신호 형질도입 도메인의 예는 T 세포 수용체 및 항원 수용체 관여(engagement) 후 신호 형질도입을 개시하기 위해 함께 작용하는 공-수용체(co-receptor)의 세포질성 서열, 뿐만 아니라 이러한 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능성 능력을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다. 신호 형질도입 도메인은 세포질성 신호전달 서열의 2개의 명백한 부류, 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것, 및 항원-독립적인 방식으로 작용하여 2차 또는 공-자극성 신호를 제공하는 것을 포함한다. 1차 세포질성 신호전달 서열은 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(motif) 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. ITAM은 syk/zap70 부류 타이로신 키나제에 대한 결합 부위로서 제공되는 다양한 수용체의 세포질내 꼬리에서 발견된 잘 정의된 신호전달 모티프이다. 본 발명에 사용된 신호전달 도메인의 비-제한적 예는 TCR제타(zeta), 일반적인 FcR 감마(FCERIG), Fc감마 Rlla, FcR베타(Fc 엡실론 Rib), FcR엡실론, CD3 제타, CD3감마, CD3델타, CD3엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, DAP10, 또는 DAP12로부터 유래된 것을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, CAR의 신호전달 형질도입 도메인은 CD3제타 신호저날 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 신호전달 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인이다. 하나의 구현예에서, CD3-제타 신호전달 도메인은 서열 번호: 115를 포함한다. 하나의 구현예에서, 신호전달 도메인은 서열 번호: 115에 대해 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 신호전달 도메인은 서열 번호: 115에 대해 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 신호전달 도메인은 서열 번호: 115에 대해 적어도 95% 동일하다. 하나의 구현예에서, 신호전달 도메인은 서열 번호: 115에 대해 적어도 98% 동일하다.
용어 "공-자극성 도메인"은 공-자극성 리간드에 특이적으로 결합함으로써 세포에 의한 공-자극성 반응, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 증식을 매개하는 T-세포 상의 동족의 결합 파트너(cognate binding partner)를 지칭한다. 공-자극성 분자는 MHC 제I 부류 단백질, BTLA 및 톨 리간드 수용체(Toll ligand receptor)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 공자극성 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 작용-관련 항원(lymphocyte function-associated antigen)-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDllc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 및 NKG2D 또는 이의 조합을 포함한다.
하나의 구현예에서, 공-자극성 도메인은 4-1BB 공-자극성 도메인이다. 하나의 구현예에서, 4-1BB 신호 형질도입 도메인은 서열 번호: 114를 포함한다. 하나의 구현예에서, 공-자극성 도메인은 서열 번호: 114에 대해 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 공-자극성 도메인은 서열 번호: 114에 대해 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 공-자극성 도메인은 서열 번호: 114에 대해 적어도 95% 동일하다. 하나의 구현예에서, 공-자극성 도메인은 서열 번호: 114에 대해 적어도 98% 동일하다.
하나의 구현예에서, CAR은 sdAb와 폴리펩타이드 힌지 사이에 가요성 아미노산 링커를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 111을 포함한다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 111에 대해 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 111에 대해 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 111에 대해 적어도 95% 동일하다. 하나의 구현예에서, 아미노산 링커는 서열 번호: 111에 대해 적어도 98% 동일하다.
하나의 구현예에서, CAR은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 사람 CD28로부터의 신호 펩타이드이다. 하나의 구현예에서, 사람 CD28로부터의 신호 펩타이드는 서열 번호: 110을 포함한다. 하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호: 110에 대해 적어도 80% 동일하다. 하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호: 110에 대해 적어도 90% 동일하다. 하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호: 110에 대해 적어도 95% 동일하다. 하나의 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호: 110에 대해 적어도 98% 동일하다.
하나의 구현예에서, CAR은 서열 번호: 119에 의해 암호화된다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 86(hCD221ug-36), 서열 번호: 83(hCD221ug-10), 서열 번호: 87(hCD221ug-61), 서열 번호: 82(hCD221ug-6), 서열 번호: 88(hCD221ug-74), 서열 번호: 85(hCD221ug-14), 서열 번호: 102(hCD22pas-33), 또는 서열 번호: 84(hCD221ug-13)를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-24)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-72)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82)을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 82에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 83에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 84에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 85에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 86에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 87에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 88에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 89에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 90에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 91에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 92에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 93에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 94에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 95에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 96에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 97에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 98에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 99에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 100에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 101에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 102에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 103에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 104에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 105에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 106에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 107에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 108에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 120에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 121에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 122에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 123에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 124에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 CDR1, CDR2, 및 서열 번호: 125에 제시된 sdAb 서열의 CDR2를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 82를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 83을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 84를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 85를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 86을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 87을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 88을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 89를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 90을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 91을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 92를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 93을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 94를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 95를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 96을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 97을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 98을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 99를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 100을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 101을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 102를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 103을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 104를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 105를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 106을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 107을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 108을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 120을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 121을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 122를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 123을 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 124를 포함한다.
하나의 구현예에서, sdAb는 서열 번호: 125를 포함한다.
하나의 구현예에서, CAR은 제1의 CD22 결합 도메인과 관련하여 N-말단적으로 또는 C-말단적으로 위치한 제2의 CD22 결합 도메인을 추가로 포함하고 제1의 CD22 결합 도메인으로부터 아미노산 링커에 의해 이격될 수 있다.
하나의 구현예에서, 제2의 CD22 결합 도메인은 제1의 CD22 결합 도메인의 sdAb와 동일한 sdAb를 포함한다. 이러한 구현예는 본원에서 "이중 결합인자(double binder)"로서 지칭된다. 예를 들면, 제1의 및 제2의 CD22 결합 도메인은 둘 다 항체 1ug36을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 제2의 CD22 결합 도메인은 제1의 CD22 결합 도메인의 sdAb와는 상이한 sdAb를 포함한다. 이러한 구현예는 본원에서 "비-파라토픽(bi-paratopic)"으로 지칭된다. 이러한 구현예에서, 제2의 CD22 결합 도메인의 sdAb는 제1의 CD22 결합 도메인의 sdAb에 의해 결합된 것에 대해 CD22의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들면, CAR은 sdAb 1ug36를 포함하는 제1의 CD22 결합 도메인 및 sdAb 1ug74를 포함하는 제2 CD22 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 1ug36는 1ug74에 대해 N-말단적으로 위치할 수 있다(참고: 예컨대, 도 30에서의 반응도식). "상이한 에피토프"는 대안적으로 제1의 CD22 결합 도메인의 sdAb에 의해 결합된 것과 오버랩핑(overlapping)될 수 있다. 대안적으로, sdAb는 제1의 CD22 결합 도메인의 sdAb에 의해 결합된 것과 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
하나의 구현예에서, CAR은 CD22 이외의 표적 분자에 결합하는 추가의 결합 도메인을 추가로 포함한다. 이러한 구현예는 본원에서 "탄뎀 작제물(tandem construct)"로서 지칭된다. 추가의 결합 도메인은 추가의 sdAb를 포함할 수 있다. 추가의 결합 도메인은 CD22 결합 도메인과 관련하여 N-말단적으로 또는 C-말단적으로 위치할 수 있다. 추가의 결합 도메인은 CD22 결합 도메인으로부터 아미노산 링커에 의해 분리될 수 있다. 하나의 구현예에서, 추가의 결합 도메인에 의해 결합된 표적 분자는 CD22를 또한 발현함으로써, 동일한 표적 세포에 대해 이중 친화성을 갖는 CAR을 제공하는 표적 세포에 의해 발현된다. 예를 들면, CD22 이외의 표적 분자는 B-세포 성숙 항원(B-cell maturation antigen; BCMA)이다. CD22 결합 도메인은, 예를 들면, sdAb 1ug36을 포함할 수 있고 추가의 결합 도메인은 항-BCMA sdAb를 포함할 수 있다(참고: 예컨대, 도 33에 나타낸 반응식).
일부 구현예에서, 탄뎀 작제물(tandem construct)은 CD22로부터 구별되고 추가의 결합 도메인에 의해 결합된 것과 구별되는 여전히 다른 표적 분자를 표적화하는 제3의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 작제물은 본원에서 "다중-결합인자"로서 지칭된다.
일부 구현예에서, CAR은 이에 대해 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 상기 CAR 중 하나의 서열 변이체이다. 일부 구현예에서, 변이체는 이로부터 이것이 유래된 모 분자와 동일한 결합 특이성을 실질적으로 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체는 이로부터 이것이 유래된 모 분자와 동일한 결합 친화성을 실질적으로 보유한다.
핵산 및 벡터
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 CAR을 암호화하는 재조합 핵산 분자가 제공된다.
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 하나의 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 하나의 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
바이러스 입자
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 입자가 제공된다. 하나의 구현예에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 렌티바이러스 입자이다.
세포
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포가 제공된다.
하나의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 가공된 세포가 제공된다. 하나의 구현예에서, 가공된 세포는 면역 세포이다. 하나의 구현예에서, 면역 세포는 T-림프구이거나 T-림프구로부터 유래된다.
용도 및 방법
"CAR-T" 세포 치료요법은 암 치료요법을 위해 CAR로 가공된 T 세포를 사용한다. CAR-T 면역치료요법의 전제는 질환이 있는 세포, 전형적으로 암 세포를 인식하도록 T 세포를 변형시켜, 이를 보다 효율적으로 표적화하여 이를 파괴하도록 하기 위한 것이다. 일반적으로, T는 유전적으로 변경되어 CAR을 발현하고, 이러한 세포는 환자 내로 주입되어 이의 종양을 공격한다. CAR-T 세포는 환자 자체의 혈액에서의 T 세포로부터 유래되거나(자가) 다른 건강한 공여체의 T 세포로부터 유래된다(동종이계).
하나의 양태에서, CAR-T를 위한 세포를 제조하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 핵산, 벡터, 또는 바이러스 입자의 용도를 제공한다.
하나의 양태에서, T-세포를 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 입자와 접촉시킴을 포함하여 CAR-T에 대한 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, T-세포는 공여체로부터 유래된다. 하나의 구현예에서, T-세포는 환자로부터 유래된다.
하나의 양태에서, T-세포 내로 본원에 기술된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 도입시킴을 포함하는, CAR-T에 대한 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, T-세포는 공여체로부터 유래된다. 하나의 구현예에서, T-세포는 환자로부터 유래된다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료를 위한 본원에 기술된 바와 같은 CAR 또는 가공된 세포의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급선 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
하나의 구현예에서, 방법은 환자 또는 공여체로부터 세포를 수득하는 초기 단계 및 본원에 기술된 바와 같은, CAR을 암호화하는 재조합 핵산 분자 또는 벡터를 도입시키는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 방법은 환자 또는 공여체로부터 세포를 수득하는 초기 단계 및 세포를 본원에 기술된 바와 같은, 바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 CAR 또는 가공된 세포의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급선 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
하나의 양태에서, 암 또는 자가-면역 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 CAR 또는 가공된 세포가 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급선 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
하나의 양태에서, 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 가공된 세포를 투여함을 포함하여, 대상체에서 암 또는 자가-면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군이다. 하나의 구현예에서, 백혈병은 급선 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 하나의 구현예에서, 림프종은 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 루푸스이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 다발 골수종이다. 하나의 구현예에서, 자가-면역 질환은 자가면역 당뇨병이다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 구현예 및/또는 본 발명에 따라 수행된 연구를 요약한다. 실시예를 나타내었지만, 본 발명은 이후의 예시된 구현예를 결코 제한하지 않는다.
실시예로의 도입
CD22-표적화된 CAR-T를 사용하는 앞서의 시도는 마우스 모노클로날 항체를 기반으로 모든 사용된 단일-쇄 가변 단편(scFv)을 가지고, 이는 도메인 쌍화(VH:VL 쌍화)의 많은 복잡성, 예를 들면, 발현 수준, 안정성 등을 지닌다. 이는 궁극적으로 최종 CAR-T 작제물의 생산성 및 효능응 제한할 수 있다. 본원에 기술된 접근법은 scFv 항체 도메인에 대한 대안으로서 CAR 표적화를 위한 낙타과 단일 도메인 항체(나노바디(nanobody))를 활용한다. 다수의 치료학적 적용을 위한 가용성, 안정성 및 모듈러성 도메인으로서의 낙타과 단일 도메인 항체의 적용가능성은 2018년에 제1의 FDA-승인된 2가 나노바디로 잘 확립되었다. 따라서, 나노바디는 CAR-T 분자내에 탁월한 빌딩 블록을 제시함으로써, 작용적 CAR-T 작제물의 혼주물(pool)을 허용하므로, 비-고형 종양 세포의 치료를 위한 훨씬 보다 효과적인 CAR-T 세포를 스크리닝하는 기회를 증가시킨다.
또한, 이러한 나노바디를 또한 활용하여 네이키드(naked) 또는 약물 접합된 항체 치료요법 또는 이-특이적인 면역 세포 인게이저를 포함하나, 이에 한정되지 않는 추가의 안전하고 효율적인 면역치료요법 요법을 개발할 수 있었다.
본원에 기술된 접근법은 면역화된 라마로부터 유래된 단일 도메인 항체(sdAb)를 사용한다. 이러한 sdAb 서열은 사람 B 세포 및 B-세포 백혈병에서 구체적으로 발현된 CD22 항원에 특이적으로 결합한다. sdAb 서열을 사용하여, CD22 특이적인 sdAb를 T 세포 신호전달 분자를 조합시키는 신규한 키메라 수용체 서열이 생성되었다(41BB, CD28 또는 다른 공-자극 도메인 및 CD3제타 신호전달 도메인의 형태). 키메라 항원 수용체 적용 외에, 이러한 CD22 표적화 항체는 면역치료요법의 다른 형태, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 이-특이적인/삼-특이적인 T 또는 NK 세포 인게이저 적용, 항체-약물 접합체, 또는 네이키드 항체(naked antibody)를 개발하는데 유용할 수 있다.
실시예 1: sdAb 항체 생산
도입
낙타과 중쇄(camelid heavy chain)의 가변 도메인으로부터 유래된 단일 도메인 항체(sdAb)(또한 VHH 또는 나노바디로 공지됨)는 충분히 항원 결합할 수 있는 기능적 N-말단 도메인으로 특징적으로 안정하다. 이의 작은 크기 외에, sdAb는 사람 VH3 계통(family)에 대한 이의 높은 상동성, 미생물, 예를 들면, 이. 콜라이(E.coli) 내에서 높은 발현 수준, 및 고온에서 현저한 안정성, 극도의 pH 및 고 염 농도로 인하여 사람에서 고 친화성, 가용성, 저 면역원성을 지닌다. 이의 최고의 항체 가공 잠재능으로 인하여, sdAb는 이- 및 다-특이적인 치료학적 시약에 대한 이상적인 빌딩 블록으로서 고려된다. 주목가능한 예는 2가-/다가 또는 이-/다-특이적인 양식의 제1의 FDA-승인된 2가 항-vWF 나노바디(Caplacizumab, 2019) 및 10개의 다른 치료학적 나노바디를 포함하고, 이는 Ablynx/Sanofi 및 다른 생물약제학적 회사 등에 의한 전-임상 및 임상 개발로 발전하였다.
sdAb는 또한 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)의 생성을 위한 이상적인 빌딩 블록이며, 이에 의해 통상의 IgG의 암-특이적인 항원 결합 도메인(scFv, Fab)은 면역 세포 활성화 도메인과 함께 표적 항원(들)을 지닌 특이적인 세포를 찾아서 사멸시키는 생성된 "아르모르드(armored)" 면역 T 림프구(Immune T lymphocyte: CAR-T)에 융합된다. CAR-T 작제물에서 sdAb의 적용은 scFv/Fab 단편의 도메인 복잡성을 감소시키고 최종의 CAR-T 작제물의 생산성 및 효능을 유의적으로 증가시킨다. 이는 또한 추가의 특이성(제2의 암 생물마커에 대해)이 CAR-T 작제물에 가해지도록 하므로(즉, 이-특이적인 CAR-T 세포를 생성함), 혈액학적 종양의 치료를 위한 훨씬 보다 효과적인 CAR-T 세포를 스크리닝하는 기회를 증가시킨다. 유사하게, 이러한 sdAb는 면역치료요법의 다른 형태, 예를 들면, 이-, 삼- 및 다-특이적인 면역 세포 인게이저의 개발을 위한 이상적인 후보물이다.
이러한 연구는 면역치료요법, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, CAR-T 치료요법, 이-, 삼- 및 다-특이적인 면역 인게이저 치료요법, 네이키드 치료학적 항체와 적절한 사람 IgG 융합체의 개발을 위한 B-세포 제한된 백혈병 항원인 CD22의 엑토-도메인(ecto-domian)에 대해 기능적인 낙타과 sdAb를 생성하는 것을 목표로 한다. 이러한 치료요법은 암, 자가-면역 및 염증 질환에 대한 치료 양상으로서 사용하기 위해 의도된다. 예는 효과적인 항-종양 활성을 지닌 CART-T 및 이-특이적인 면역 인게이저를 개발하기 위한 이러한 sdAg의 용도를 나타낸다.
물질 및 방법
CD22-ECD의 클로닝 및 발현
사람의 우세한 CD22-베타 동형을 암호화하는 유전자를 pTT5: NRC 등록된 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. NRC CHO-3E7 세포의 형질감염시, 세포를 1L의 플라스크 속에서 성장시키고 C-말단 6xHis 태그를 함유하는 발현된 단백질을 면역친화성 크로마토그래피(Immunoaffinity chromatography; IMAC)에 이어서 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography)로 정제하고 SDS-PAGE 상에서 분석하였다.
라마 면역화
라마를 CD22 항원의 재조합 ECD 도메인으로 면역화하였다. 각각의 주사를 위해, 100 μg의 재조합 사람 CD22 단백질을 0.5 mL의 총 용적으로 동일한 용적의 완전한(제1의 주사) 및 불완전한 프루언드 보조제(incomplete Freund’s adjuvant)(후속적인 주사)와 혼합하고, 피하 주사하였다. 5개의 주사를 적절하게는 2주 간격으로 수행하고 혈액을 제3의 주사 후 및 마지막 주사 후 7일째에 수집하였다.
RNA 단리 및 PCR 증폭
총 RNA를 QIAamp RNA 혈액 미니 키트(blood mini kit)(QIAGEN Sciences, 온타리오주 미시소가 소재)를 사용하여 키트 설명서에 따라 면역화 프로토콜의 49일째로부터 수집한 대략 1 X 107개의 림프구로부터 단리하였다. 약 5 μg의 총 RNA를 제1 가닥 cDNA 합성 키트(Amersham Biosciences, 미국)를 사용하여 올리고 dT 프라이머를 사용한 제1의 cDNA 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 낙타과 및 라마 면역글로불린 데이타베이스를 기반으로, 3개의 가변 도메인 센스 프라이머(MJ1-3) 및 2개의 CH2 도메인 안티센스 프라이머(CH2 및 CH2b3)를 설계하였다(Baral TN et al 2013). 제1의 PCR를 주형으로서 cDNA로 수행하였고 통상의 (IgG1) 및 중쇄 항체(IgG2 및 IgG3) 둘 다의 가변 영역을 2개의 별도의 반응에서 MJ1-3/CH2 및 MJ1-3/CH2b 프라이머의 조합으로 증폭시켰다. PCR 반응 혼합물은 다음의 구성성분을 함유하였다: 2 μL의 cDNA, 5 pmol의 MJ1-3 프라이머 혼합물, 5 pmol의 CH2 또는 CH2b 프라이머, 5 μL의 10X 반응 완충제, 3 μL의 2.5 mM dNTP, 2.5 단위의 Taq DNA 폴리머라제(Roche Applied Science, 인디애나주 인디애나폴리스) 및 50 μL의 최종 용적의 물. PCR 프로토콜은 94℃에서 1분 동안의 초기 단계에 이어 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 72℃에서 1분 동안 및 72℃에서 7분 동안의 최종 연장 단계의 30 주기로 이루어졌다. 증폭된 PCR 생성물을 2% 아가로스 겔 위에서 이동시키고 통상의 IgG1에 상응하는 약 850 bp 및 중쇄 항체에 상응하는 약 600 bp(550 내지 650 bp)의 2개의 주요 밴드로 이루어졌다. 보다 작은 밴드는 겔을 절단하고, QIAquick 겔 추출 키트(QIAGEN Inc.)로 정제하고 1 μL의 정제된 DNA 주형, 5 pmol 각각의 MJ7, SfiI 제한 부위를 지닌 VH 센스 프라이머, 밑줄친, (5' - CAT GTG TAG ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC C-3') 및 MJ8, SfiI 제한 효소 부위를 지닌 안티센스 프라이머, 밑줄친, (5'- CAT GTG TAG ATT CCT GGC CGG CCT GGC CTG AGG AGA CGG TGA CCT GG), 5 uL의 10X 반응 완충제, 3 uL의 2.5 mM dNTP, 2.5 단위의 Taq DNA 폴리머라제(Roche Applied Science, 인디애나주 인디애나폴리스 소재) 및 50 μL의 최종 용적까지의 물을 함유하는 제2의 PCR 반응에서 재-증폭시켰다. PCR 프로토콜은 94℃에서 3분 동안의 초기 단계에 이어서 94℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분 및 72℃에서 7분 동안의 최종 연장 단계의 30회 주기로 이루어졌다. 중쇄 항체의 VHH 단편에 상응하는 증폭된 PCR 생성물(약 400 내지 450bp)을 QIAquick PCR 정제 키트(QIAGEN Inc.)로 정제하고, SfiI(New England BioLabs)로 분해하고 동일한 키트로 재-정제하엿다.
라이브러리 작제
30 μg의 pMED1(Arbabi-Ghahroudi et al. 2009) DNA를 SfiI로 밤새 50℃에서 분해하엿다. 자가-연결의 기회를 최소화시키기 위해서, 분해를 추가로 2시간 동안 37℃에서 20 단위의 XhoI 및 PstI 제한 효소 둘 다를 가함으로써 지속시켰다. 라이브러리 작제를 위해, 10 μg의 파아지미드 DNA를 1.75 ug의 VHH 단편과 연결시키고 2시간 동안 실온에서 LigaFast DNA 연결 시스템(Promega, Corp., 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 추천된 프로토콜에 따라 항온처리하였다. 연결된 생성물을 적격성(competent) 이. 콜라이 TG1 세포(Stratagene, 텍사스주 세다르 크릭 소재)내로 전기천공하였다. 형질전환된 세균 세포를 SOC 배지 속에서 희석시키고 1시간 동안 37℃에서 느리기 진탕하면서 항온처리하였다. 분취량을 LB-Amp 상에 플레이팅함으로써 라이브러리의 크기를 계산하였다. 96개 콜로니로부터의 VHH 단편을 PCR-증폭시키고 다양성 분석을 위해 서열분석하였다. 라이브러리를 분취하고-80℃에서 저장하였다.
라이브러리 패닝(Library Panning) 및 스크리닝
바이오티닐화된 및 수동 흡착의 2개 전략을 CD22-면역 라이브러리의 패닝에 사용하였다:
a) 바이오티닐화된 CD22 ECD 패닝:
크기가 3.3x107인 작제된 LPAR1 라이브러리 2를 파아지-구제(phage-recued)하고 1.4x109 cfu/uL의 파아지 역가를 사용하여 EZ-연결 설포-NHS-LC-LC-바이오틴(Thermoscientific 제품 번호 21338)을 사용함으로써 이미 바이오티닐화된 CD22 ECD 항원에 대해 패닝(panning)하였다 패닝의 4개 라운드를 교호하는 차단 완충제[예컨대, Starter Block(Thermo Fisher 제품 번호 37559))를 1, 3 라운드에 대해 및 바이오틴-유리된 카세인을 2, 4 라운드에 대해 사용하여 수행하였다. 패닝을 PierceTM 스트렙타비딘 코팅된 웰(1, 3 라운드)(Thermoscientific 제품 번호 15501; 로트 번호 TF252884) 및 PierceTM 뉴트라비딘 코팅된 웰(2, 4 라운드)(Thermoscientific 제품 번호 15508; 로트 번호 SK253835) 둘 다 사이에서 교체하였다. 2개의 웰 및 1개 또는 2개의 미세원심분리 튜브를 우선 적절한 차단 완충제 속에서 밤새 4℃에서 항온처리하였다.
다음 날, 라이브러리 투입 파아지(library input phage)(~3x1011)를 차단된 스트렙타비딘 웰 중 하나에 적절한 차단 완충제 속에서 1시간 동안 실온에서 가한 다음 차단된 미세원심분리 튜브로 이전시키고 바이오티닐화된 CD22 항원과 혼합하였다. 순차적인 라운드에서, 증폭된 파아지의 각각의 라운드로부터 ~3x1011의 투입 파아지를 사용하였다. 제1 라운드에서 1ug의 바이오티닐화된 CD22 항원을 사용하였다. 후속적인 라운드에서 1ug 및 100ng 둘 다의 항원을 사용하였다. 실온에서 1시간 항온처리 후, 투입 파아지/바이오티닐화된 CD22 혼합물을 다른 차단된 스트렙타비딘 웰로 이전시키고 30분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이는 세척 단계{3 x 300 μL의 PBS-T(PBS + 0.05% 트윈(Tween) 20)(신속); 2 x 300 μL의 PBS-T + (PBS + 0.05% 트윈 20)(각각의 세척물을 5분 동안 항온처리함); 3 x 300 μL의 PBS(신속); 2 x 300 μL의 PBS(각각의 웰을 5분 동안 항온처리함)} 및 100 μL의 100 mM TEA를 사용한 용출을 수반하였다. 이후에, 파아지를 웰로부터 제거하고 50 μL의 1M 트리스-HCl pH 7.4로 새로운 튜브 속에서 중화시켰다. 37℃, 250 rpm에서, OD600 = 0.5가 될 때까지 2YT + 2% 글루코스 속에서 15 mL의 Falcon 튜브 속에서 이미 성장시킨, 3mL의 대수적으로 성장하는 TG1 이. 콜라이 배양물을 용출된 파아지로 감염시켰다. 100 μL의 감염되지 않은 TG1 이. 콜라이의 분취량을 대조군으로서 따로 설정하였다. 용출된 파아지를 37℃에서 30분 동안 진탕없이 항온처리한 다음 분취량을 역가(102 내지 108의 희석)를 위해 사용하고 2YT 플레이트에 밤새 32℃에서 플레이팅하였다. 남아있는 3 mL의 감염된 TG1 배양물을 M13KO7 헬퍼 파아지(~1x1010 cfu)를 사용한 밤새 파아지 증폭으로 진행시켰다.
다음 날, 용출된 역가를 계산하여 후속적인 라운드에 대한 투입 파아지의 양을 측정하였다. 증폭된 파아지를 함유하는 세포 배양물을 5000rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 0.22uM의 필터 유닛(filter unit)(Millipore)을 통해 여과하고 20% PEG/2.5M 염화나트륨(NaCl) 속에 침전시킨 다음 원심분리하고 PBS(pH 7.5) 속에 재용해시켰다. 증폭된 파아지 역가를 앞서 성장시킨 TG1 이. 콜라이 세포 내에서 측정하였다(104 내지 1012의 희석). 4 라운드의 패닝 후, 파아지 ELISA로부터의 양성 콜로니의 서열을 분석하였다.
b) CD22-ECD의 수동적 패닝(passive panning)
동일한 구제된 파아지를 사용하여 CD22 ECD 항원에 대해 패닝하였다. 4 라운드의 패닝을 교호하는 차단 완충제[예컨대, Starter Block(Thermo Fisher 제품 번호 37559)를 1, 3 라운드에 대해 및 4% 우유 PBS를 2, 4 라운드에 대해 실행하였다. Nunc 웰 상에 수동적으로 흡착된 CD22 ECD의 양은 4개 라운드의 패닝(1 라운드: 40 μg, 2 라운드: 30 μg; 3 라운드: 20 μg; 및 4 라운드: 10 μg)에 걸쳐 40ug으로부터 10ug으로 감소하였다. 웰을 우선 적절한 완충제로 2시간 동안 실온에서 먼저 차단시킨 후 투입 파아지(~3x1011)를 가하였다. 후속적인 라운드에서, 증폭된 파아지의 각각의 라운드로부터의 ~3x1011의 투입 파아지를 사용하였다. 항온처리는 세척 단계{R1: 5x PBS-T; 2x PBS: R2: 5x PBS-T; 5x PBS; R3: 7x PBS-T; 5x PBS; 및 R4: 10x PBS-T; 10x PBS} 및 100 μL의 100 mM TEA를 사용한 용출을 수반하였다. 이후에, 파아지를 웰로부터 제거하고 신규 튜브 속에서 50 μL의 1M 트리스-HCl pH 7.4로 중화시켰다. 15 mL Falcon 튜브 속에서 2YT + 2% 글루코스 속에서 37℃, 250 rpm에서, OD600 = 0.5까지 이미 성장시킨 2mL의 대수적으로 성장하는 TG1 이. 콜라이 배양물을 대조군으로서 따로 설정하였다. 용출된 파아지를 37℃에서 30분 동안 진팅없이 항온처리한 다음 분취량을 역가(102 내지 108의 희석)를 위해 사용하고 2YT 플레이트 상에 밤새 32℃에서 플레이팅하였다. 밤새 파아지 증폭을 M13KO7 헬퍼 파아지(~1x1010 cfu)를 사용하여 진행시켰다. 다음 날, 용출된 역가를 계산하여 후속적인 라운드를 위한 투입 파아지의 양을 측정하였다. 증폭된 파아지를 함유하는 세포 배양물을 5000rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 0.22uM 필터 유닛(Millipore)을 통해 여과하고 20% PEG/2.5M NaCl 속에 침전시키고 원심분리하고 PBS(pH7.5) 속에 재용해시켰다. 증폭된 파아지 역가를 앞서 성장시킨 TG1 이. 콜라이 세포 내에서 측정하였다(104 내지 1012의 희석). 4 라운드의 패닝 후, 파아지 ELISA로부터의 양성 콜로니의 서열을 분석하였다.
결과
재조합 CD22-ECD를 사용하여 라마를 면역화시키고 혈청 역가를 모니터링하고 ELISA로 분석하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, CD22는 라마에서 강력한 중쇄 면역 반응을 유도하였다. 혈청 속의 중쇄 면역 반응을 라마 IgG2b의 힌지-CH2 경계부 및 라마 IgG2c의 Fc 각각에 특이적으로 결합하는, 2개의 모노클로날 항체를 사용하여 측정하였다(Henry KA et al. Llama Peripheral B-cell Populations Producing Conventional and Heavy Chain-Only IgG Subtypes Are Phenotypically Indistinguishable but Immunogenetically Distinct. Immunogenetics 2019 Apr;71(4):307-320).
라마 면역글로불린의 중쇄 레퍼토리를 유전자-특이적인 프라이머로 증폭시키고 파아지미드 벡터(pMED1) 내로 클로닝하였다. 중간 크기 라이브러리(3.3 x107)를 작제하고 이의 복잡성을 서열분석용의 96개 콜로니를 보내어 분석하였다. 서열분석 데이타는 VHH 서열 모두가 반복되는 서열이 없이 충분한 길이를 가졌으므로 라이브러리가 높은 상보성을 가짐을 나타내었다. 라이브러리는 또한 어딘가에 기술된 바와 같이 M13 헬퍼 파아지를 사용하여 파아지-구제하고(Baral TN, MacKenzie R, Arbabi Ghahroudi M. Single-domain antibodies and their utility. Curr Protoc Immunol. 2013 Nov 18;103:2.17.1-2.17.57) 파아지 항체를 2개의 별도의 패닝 실험에서 사용하였다. 4개 라운드의 패닝 후에, 각각의 패닝 전략으로부터의 96개 콜로니를 성장시키고 다른 곳에 기술된 바와 같이 M13 헬퍼 파아지로 초감염(superinfect)시키고(Baral TN et al 2013) 파아지를 ELISA에 사용하였다. 양성 콜로니를 서열분석을 위해 보내고 서열분석 데이타를 분석하였다. OPIG 소프트웨어(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/anarci/) 및 IMGT 넘버링을 사용한 서열의 정렬(참고: 도 4a 및 4b). 27개의 유일한 VHH 서열을 유전자 합성을 위해 선택하고 발현 벡터(pMRO) 내로 클로닝하였다.
도 1은 염색체 19q13.12 상에 위치한 CD22 유전자에 의해 암호화된 사람 CD22 분자의 구조를 나타낸다. CD22 β는 우세한 동형(7개의 도메인을 지님; 847 aa)이다. 4개의 면역 수용체 모티프를 지닌 세포질성 꼬리(140 aa)를 막관통 영역(18 aa)에 의해 세포외 도메인(669 aa)에 연결시킨다.
도 2는 IMAC-정제된 CD22 세포외 도메인(CD22-ECD)의 SDS-PAGE가 비-환원된 및 환원된 조건 하에서 2개의 상이한 발현 배치를 형성함을 나타낸다. 정제된 단백질은 대략 75 kDa의 예측된 분자량을 갖는다.
도 3은 라마 중쇄 면역 반응이 CD22-ECD에 대한 최종 출혈(8월 3일)을 형성함을 나타낸다. 대조군으로서, 라마-에비 면역 혈청을 사용하였다. 중쇄 항체의 결합은 항-라마 mAb(실내(in-house) NRC)에 이어 당나귀-항-마우스-HRP로 검출하였다. 나타낸 바와 같이, 강력한 및 특이적인 항-CD22-ECD 중쇄 면역 반응이 존재한다.
논의
우세한 사람 CD22 동형의 세포외 도메인을 포유동물 CHO 시스템에서 성공적으로 발현시키고 재조합 CD22-ECD는 모든 하부 분석 검정(downstream analytical assay)에서 잘 수행되었다(데이타는 나타내지 않음). 라마를 재조합 CD22-ECD로 면역화한 후, 강력한 중쇄 면역 반응이 중쇄-특이적인 mAb를 사용한 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 생성되었다. 중쇄 레퍼토리에서 라이브러리를 작제함으로써, 면역원(CD22-ECD)에 대해 특이적인 VHH 도메인 항체를 단리하였다.
실시예 2: sdAb 항체 특성화
도입
면역화된 라마의 중쇄 레퍼토리에서 라이브러리 작제를 사람 CD22-ECD에 대한 양성 면역 반응을 수득한 후 수행하였다. 200개 이상의 개개 클론을 바이오티닐화된 및 비-바이오티닐화된 사람 CD22-ECD 단백질을 사용한 2개의 명백한 패닝 전략을 수행한 후 파아지-ELISA에 의해 후속적으로 스크리닝하였다. 개개 VHH 클론을 서열분석하고 이의 CDR1-3 서열을 기반으로 그룹화하여, 27개의 유일한 VHH 서열을 수득하였다. 이러한 VHH를 암호화하는 유전자를 NRC 세균 발현 벡터 내로 클로닝하고 정제된 단백질을 특성화하였다.
물질 및 방법
가용성 V H H의 발현.
파아지 ELISA OD450 >0.8을 지닌 가장 반복된 클론의 DNA 서열을 유전자 합성을 위해 TWIST Bioscience로 보내고 후속적으로 pMRO(pET28a 유도체, Novagen) 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이. 콜라이 TG1 세포를 VHH 작제물로 형질전환시키고 각각의 클론을 0.1% 글루코스가 들어있는 2xYT 배지 + 앰피실린(100 mg·mL-1)의 배양물 0.25리터 속에서 0.8의 OD600까지 성장시켰다. 배양물을 1 mM IPTG로 유도하고 회전 진탕기 속에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. SDS-PAGE 및 웨스턴-블롯팅으로 발현을 확인한 후, 재조합 VHH 단백질을 세균 세포로부터 표준 분해 방법으로 추출하고 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography; IMAC)로 정제하고 어딘가에 기술된 바와 같이 정량하였다(Baral TN, Arbabi-Ghahroudi M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods Mol Biol. 2012;911:257-75). VHH 단백질을 Supdex 75 크기 배제 크로마토그래피 상에서 이동시키고 단량체성 분획을 수집하였다.
SPR 분석
표면 플라스몬 공명을 위해, 21개의 선택된 VHH를 크기 배제 컬럼, superdex 75(GE Healthcare), 각각에, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA를 함유하는 10 mM HEPES, pH 7.4 속에서 통과시키고, 단량체성 sdAb 분획을 수집하고 280 nm(A280)에서 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 분석을 Biacore T200 장치(GE Healthcare)로 수행하였다. 모든 측정은 25℃에서 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 표면활성제 P20(GE Healthcare)을 함유하는 10 mM HEPES, pH 7.4 속에서 수행하였다. 대략 1919 RU의 재조합 단량체성 CD22-ECD(CD22-ECD의 SEC 정제 후 수득됨)를 SA 센서 칩(sensor chip)(GE Healthcare) 상에 5 uL/min의 유동 속도에서 포획하였다. 다양한 농도의 단량체성 VHH를 CD22-ECD 표면 위 각각에, 참고물로서 SA 표면을 사용하여 40 μL/min의 유동 속도에서 주입하였다. 이동 완충제(running buffer)로 세척함으로써 표면을 생성시켰다. 데이타는 BIAevaluation 4.1 소프트웨어로 분석하였다.
SPR에 의한 에피토프 비닝(Epitope Binning)
결합 동역학 데이타를 수득하는 것 외에, Biacore 공-주입 실험(co-injection experiment)을 또한 11개의 선택된 VHH에서 수행하여 이러한 항-CD22 VHH가 CD22-ECD 단백질 표면 상의 유일하거나 오버랩핑된 에피토프에 결합할 수 있는지의 여부를 평가하였다. 요약하면, 80 μL의 제1의 VHH를 HBS-EP 완충제 속에 이의 KD 값의 5배의 농도까지 희석시키고 1919 RU의 고정된 CD22-ECD에 걸쳐 40 μL/min에서 주입하였다. 제1의 VHH의 주입 후, 완충제 또는 제2의 VHH(80 μL의 총 용적, 5xKD에서)를 40 μL/min에서 제1의 VHH로 이미 포화시킨 CD22-ECD 표면 위에 주입하였다. 데이타를 11개의 VHH의 모든 가능한 쌍식 조합에서 양 방향으로(즉, 각각의 VHH는 제1 및 제2의 VHH로서 작용한다) 수집하고 상술한 바와 같이 평가하였다.
효모 표면 디스플레이를 사용한 에피토프 맵핑
hCD22 엑토-도메인(ecto-domain; ECD) 및 이의 유도된 단편을 발현시키고 효모 세포의 표면에 효모 표면 디스플레이로 공유결합적으로 나타내었다(Feldhaus et al., 2003, Nat. Biotechnol. Vol. 21, 163-170). YSD 벡터(pPNL6)는 미국 소재의 The Pacific Northwest National Laboratory로부터 구입하였다. 전체 hCD22-ECD(668aa)를 포함하는 오버랩핑 말단(15 내지 25aa)을 지닌, Bin1 내지 7로 지정된, 7개의 hCD22 단편을, 전체 길이의 hCD22-ECD와 함께 클로닝하고 융합 단백질(Aga2-HA-(hAXL)-MYC로서 효모 세포 표면에서 발현시켰다. 나타낸 hCD22 단편을 사용하여 실시예 1의 항-hCD22 sdAb가 결합된 hCD22의 도메인을 맵핑하였다. 효모 세포에서 CD22 단편에 대한 sdAb(바이오티닐화된)의 결합을 HRP-접합된 스트렙타비딘으로 프로빙(probing)된 전체 효모 세포 ELISA를 사용하여 수행하였다. 항-MYC 항체에 이어, HRP-접합된 제2의 항체를 사용하여 프로빙 한 후 나타낸 융합 단백질의 상대적인 양을 측정하고, 이를 사용하여 sdAb에 대한 결합 신호를 표준화하였다. HRP 활성을 기질 TMB(테트라메틸 벤지딘)를 사용하여 제조업자의 조건에 따라 검정하고 OD450에서 판독하였다. 에피토프의 특성, 선형 대 구조를 측정하기 위해, 나타낸 CD22 단편을 지닌 효모 세포를 80℃에서 30분 동안 가열한 다음, 빙 상에서 20분 동안 급냉시킨 후 항체로 표지하였다.
sdCD22 VHH의 표적 특이성의 평가
바이오티닐화된 VHH를 사용하여 유세포 분석으로 sdCD22의 표적 특이성을 평가하였다. CD22를 발현하는 사람 버킷 림프종 세포주 Raji 및 Ramos 및 CRISRP 유전자 녹아웃을 사용하여 CD22 발현에 대해 결실시킨 Ramos 세포를 7.5 내지 0.06 νg/mL의 바이오틴 표지된 sdCD22 VHH의 5배 희석물과 함께 항온처리하였다. 세포 표면 CD22에 대한 CD22-표적화된 VHH의 결합을 형광단 접합된 스트렙타비딘을 사용하여 유세포 분석으로 검출하였다.
결과
유전자 합성 및 서브-클로닝을 TWIST Bioscience(USA)에 의해 수행하고 플라스미드 DNA를 단백질 발현을 위해, TG1 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. pMRO 벡터 내 히스티딘 태그 및 바이오티닐화 신호 서열의 존재는 IMAC 컴럼에 의한 정제 뿐만 아니라 VHH C-말단에서 바이오틴 모이어티의 특이적인 첨가를 허용한다. 단일 바이오틴 첨가는 이후의 에피토프 맵핑 검정에서 VHH 검출을 촉진시킨다. IMAC-정제된 VHH 단백질을 SDS-PAGE 상에서 이동시켰다(도 5; 14개의 VHH 만이 나타나 있다). 나타낸 바와 같이, VHH 항체는 대략 15 내지 17 kDa의 예측된 분자량을 나타낸다.
정제된 단백질의 응집 상태를 크기 배제 크로마토그래피로 점검하였으며 예측한 바와 같이 모두는 비-응집되는 단량체이었다(데이타는 나타내지 않음). 개개 VHH 단백질의 반응성을 또한 ELISA로 확인하였으며 여기서 HRP에 접합된 토끼 항-His6 항체를 고정된 CD22-ECD에 대한 VHH 결합의 검출을 위해 사용하였다(데이타는 나타내지 않음).
모두 21개의 VHH의 단량체성 분획을 SPR 실험을 위해 사용하였고 여기서 사람 CD22-ECD를 CM5 덱스트란 칩에 고정시키고 다양한 VHH 농도(0.6 내지 400 nM)를 센서 침 위에 통과시켰다. SPR 분석은 모든 21개의 VHH가 hCD22pas-64의 경우 250 nM 내지 hCD221ug-14의 경우 6 pM 범위의 평형 상수로 CD22-ECD에 특이적으로 결합함을 나타내었다. 수집된 데이타 모두는 1:1 결합 모델에 적합하다.
항-CD22 VHH의 에피토프 비닝을 위해, 공-주입 SPR 실험을 VHH의 쌍을 사용하여 양 방향으로 수행함으로써 항체가 CD22-ECD에 동시에 결합하는지의 여부를 측정하였다. 어떠한 2개의 VHH의 공-주입시 반응에서의 증가가 존재하는 경우, 이는 제1의 VHH(포화 농도에서)의 결합이 제2의 것의 비닝을 방해하지 않으므로, 이러한 항체는 독립적인 에피토프를 인식함을 나타낼 것이다. 그러나, 2개의 VHH의 공-주입시 반응에서 최소의 변화가 존재하는 경우, 이는 2개의 VHH가 동일한 영역에 동시에 결합할 수 없으므로 이들이 오버랩핑/동일한 에피토프를 인식함을 나타낼 것이다. 공-주입 SPR 실험을 11개의 항-CD22 VHH에 대해 수행하고 표 5에 나타낸 바와 같이 7개의 결합을 확인하였다. 남아있는 10개의 VHH는 이의 CDR 영역에서 11개의 VHH와 높은 서열 유사성을 가졌다. 따라서, 10개의 VHH를 표 5에 나타낸 바와 같이 가장 근접한 아미노산 유사성을 갖는 bin 내로 위치시켰다.
도 4a 및 4b는 27개의 VHH의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
표 1(상기)은 27개의 VHH의 아미노산 서열을 나타낸다. CDR(밑줄) 및 골격 영역을 IMGT 넘버링 시스템(www.IMGT.com)에 따라 넘버링한다 .
표 2(상기)는 VHH 명칭, 구성원, 및 서열 번호 사이의 관련성을 제공한다.
도 5는 TG1 이. 콜라이에서 발현되고 IMAC에 의해 정제된 14개의 항-CD22 VHH 항체의 SDS-PAGE를 나타낸다. 정제된 단백질은 15 내지 17 kDa의 예측된 분자량을 나타내었고 모든 분자 샘플에서 분해 신호는 없었다.
표 4는 텍스트에 기술된 바와 같이 모든 27개의 VHH의 측정된 친화성을 나타낸다. 친화성 데이타는 pM(hCD221ug-14의 경우 6 pM) 내지 높은 nM(250 nM0; hCD22pass-64의 경우)의 범위이다.
[표 4]
Figure pct00010
표 5는 공-주입 SPR 실험에 의한 에피토프 비닝을 나타낸다. 양 배향에서 VHH의 쌍을 공-주입하고 반응 단위에서의 증가를 11개의 항-CD22 VHH에 대해 측정하였다. 나타낸 바와 같이, 7개의 bin이 1 내지 4개의 구성원을 사용하여 확인되었다. 남아있는 10개의 VHH는 SPR에 의해 비닝된 11개의 VHH와 높은 아미노산 서열 유사성을 가졌으므로, 각각의 bin 내로 위치시켰다.
[표 5]
Figure pct00011
도 6은 바이오틴 접합된 항-CD22 VHH 내지 CD22를 발현하는 종양 세포 Raji(좌측 패널), Ramos(중간 패널) 또는 CRISPR 유전자 녹아웃에 의해 CD22 발현이 결여되도록 가공된 Ramos 세포(우측 패널)의 결합을 나타낸다. 9개의 VHH 서열의 대표적인 패널은 CD22 양성 Raji 및 Ramos 세포에 대한 용량 의존된 결합의 다양한 정도를 나타내는 세포 결합 분석에 포함시켰다. 모든 경우에, 결합의 강도는 CD22 음성 Ramos 세포에서 시험하는 경우 유의적으로 감소되거나 제거되었다.
표 6은 효모 표면에 대해 실시예 1에 나타낸 CD22 sdAb의 물리적 비닝이 세포 ELISA를 사용하여 hCD22 엑토-도메인 단편을 나타내었음을 나타낸다. 나타낸 CD22 단편은 성숙한 CD22의 포함 범위(넘버링에 따른 아미노산 잔기 내)를 나타낸 물리적 Bin으로서 정의한다. 250nM에서 효모 세포 표면 상의 특수한 CD22 단편(들)에 대한 각각의 sdAb(바이오티닐화된)의 결합은 스트렙타비딘 접합된 HRP 효소 활성에 의해 나타난다. 0.25 초과의 OD450을 생성하는 웰을 강조하였고, 이는 유의적힌 항체-항원 상호작용을 나타낸다. hCd22_lug-14를 제외하고 시험한 모든 sdAb를 특이적인 Bin(들)에 대해 지정하였다. hCD221ug-13 및 hCD221ug-80 둘 다는 2개의 Bin으로 지정할 수 있었고, 이는 이러한 sdAb가 CD22에서 하나 이상의 위치에 의해 공유되는 에피토프를 인식함을 시사한다.
[표 6]
Figure pct00012
표 7은 sdAb에 대한 에피토프가 연속적인지(선형) 또는 비-연속적인지(구조)를 측정하기 위한 CD22 sdAb의 에피토프의 특성의 평가를 나타낸다. CD22 도메인의 다양한 단편을 발현시키고 효모 세포 상에 나타내고 표 6에 기술된 바와 같은 세포 ELISA를 사용하여 sdAb에 대한 결합에 대해 기술된 천연(ND) 또는 열 변성된(D) YSD 세포로 평가하였다. 천연 및 변형된 CD22 단편에 대한 각각의 sdAb의 결합은 OD450으로서 측정하였고, 변성된 CD22 내지 비-변성된 CD22에 대한 결합의 비를 계산하였으며, 비 ≥ 0.5는 선형(L)을 나타내고, 비 < 0.5는 구조적(C) 에피토프를 나타낸다.
[표 7]
Figure pct00013
도 7은 표 5 및 6에서 에피토프 맵핍/비닝 결과에 따라 이의 세포 표면 위치와 관련하여 CD22 엑토-도메인의 서브도메인에 대한 실시예 1에서의 sdAb의 인식된 결합의 개략도를 나타낸다. 각각의 서브도메인/Bin이 정의되어 있고 혈장 막과 관련하여 먼 곳에 있는 Bin-1 및 근접한 Bin-7이 있는 타원으로서 나타낸다. 서브도메인/Bin에 대한 sdAb의 결합(특이적인 형태 및 명칭에 의해 나타냄)은 이것이 비닝된 서브도메인/Bin에 대한 이의 근접성으로 나타낸다.
논의
항-CD22-ECD VHH를 이. 콜라이 내에서 발현시키고 단백질을 정제 및 바이오티닐화하였다. 항체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이 비-응집성 및 단량체성 거동을 나타내었다. 21개의 VHH의 결합 동역학은 SPR로 측정하였고 항체는 6 피코몰의 친화성을 가진 1개의 VHH를 제외하고는 낮은 내지 높은 나노몰 범위의 친화성으로 사람 CD22-ECD에 대해 특이적인 결합을 나타내었다. 친화성의 이러한 다양한 세트는 본 발명자가 CAR-T 작제물의 생산성에 있어서 친화성의 효과를 연구하도록 하였다. SPR에 의한 11개의 VHH의 에피토프 비닝은 일부 VHH가 오버랩핑된 에피토프에 결합하지만 다른 것은 유일한 에피토프에 결합함을 나타내었다. 이는 사람 CD22 엑토-도메인 단편의 효모 표면 디스플레이 라이브러리를 사용하고 세포 ELISA를 사용함으로써 항체의 에피토프 비닝을 통해 확인하였다. 1ug-14를 특이적인 Bin(들)에 지정하는 것을 제외하고는 모든 sdCD22 Ab를 시험하였다. 1ug-13 및 1ug-80 둘 다는 2개의 bin에 지정될 수 있었고, 이는 이러한 sdAb가 CD22 상의 하나 이상의 위치에 의해 공유되는 에피토프를 인식함을 제시한다. 이러한 에피토프 비닝 정보는 다수의 sdCD22 VHH 서열을 함유하는 이-파라토프 치료학적 제제에서 활용될 것이다.
실시예 3: CAR-T 시험관 내 시험
도입
상술한 신규의 CD22-결합 단일 도메인 항체(sdAb) 서열을 확인 한 후, 특이적인 표면 항원을 지닌 세포에 대해 사람 T 세포 반응을 재지시하는데 사용될 수 있는 키메라 항체 수용체(CAR) 분자의 맥락 내에서 이의 활성을 시험하도록 설계하였다. 따라서, 이미 기술된 고 처리량 기술(high throughput technique)(Bloemberg, et. al. 2020)을 사용하여 신규의 CD22-sdAb 표적화된 CAR 작제물을 생성하고 후술된 다양한 검정을 통해 이의 각각의 T 세포 활성화 활성을 시험하였다.
물질 및 방법
단일 도메인 항체 항원 결합 서열을 제한 부위를 함유하는 모듈러 CAR 플라스미드 골격[서열 번호: 119]으로 이전시켜 효율적인 재조합을 허용하였으며 여기서 결합 도메인을 제거하고 신규의 CD22-항원 결합 도메인(ABD) 서열로 대체할 수 있다. 사용된 특이적인 CAR 설게는 다음과 같다: 사람 CD28 신호 펩타이드[서열 번호: 110], VHH 항체(ABD)[서열 번호: 82 내지 108] 중 어느 하나, 유연한 링커 도메인[서열 번호: 111], 사람 CD8 힌지 도메인[서열 번호: 112], 사람 CD28 막관통 도메인[서열 번호: 113], 사람 4-1BB 공-자극성 도메인[서열 번호: 114], 및 사람 CD3-제타 신호전달 도메인[서열 번호: 115]. 대조군 작제물을 또한 앞서 입증된 CD19-특이적인 CAR 서열로부터 유래된 서열을 사용하여 생성시켰고, 여기서 ABD는 FMC63-scFv 서열[서열 번호: 117], 또는 CD22-특이적인 CAR 서열이고, 여기서 ABD는 M971-scFv 서열[서열 번호: 116]이다.
신규한 CD22-표적화 CAR 작제물을 이후에 무한증식된 사람 T 세포주(저켓(Jurkat))에서 활성에 대해 문헌: Bloemberg et al 2020에 기술된 바와 같이 시험하였다. 요약하면, 플라스미드를 저켓 T 세포 내로 전기천공시키고 수시간 동안 회복되도록 하였다. 이후에, 저켓-CAR 세포를 다양한 발현 수준의 사람 CD22를 나타내는 표적 세포주의 다양한 용량과 혼합하였다. CD22를 고 발현하는 표적 세포주(Ramos)를 본 연구에 활용하여 저켓 세포에서 CAR 활성화 활성을 확인하였다. CRISPR-게놈 편집을 사용하여 CD22 발현을 제거한 세포를 또한 사용하여 사람 CD22 항원에 대한 신규 CAR 작제물의 특이성을 확인하였다. CAR-발현 저켓 세포 및 표적 세포 공-배양물을 이후에 밤새 표준 포유동물 세포 배양 조건 속에서 항온처리함으로써 CAR 활성화가 일어나도록 하였다. CAR-매개된 저켓 세포 활성화를 정량화하기 위해, CD69의 발현을 특이적인 항체 염색 및 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. CAR-발현 세포를 게이팅(gating)하기 위한 GFP-마커의 발현을 사용하여, CD69-표면 마커를 사용하여 측정된 것으로서 T 세포 활성화의 수준을 측정하였다. CD69 마커는 세포를 CD22를 발현하는 Ramos 세포가 들어있는 공-배양물 속에 두는 경우 다양한 CD22-sdAb 표적화된 CAR 작제물을 발현하는 다양한 저켓 세포내에서 명확하게 상승되었지만, CD22-녹아웃 세포가 들어있는 경우에는 그렇지 않았다(도 8).
이러한 CAR-J 시험 후, 수개의 CD22-CAR 작제물을 1차 사람 T 세포에서 시험하기 위해 선택하였다. 이를 달성하기 위해, CAR 플라스미드를 렌바바이러스 페키징 세포주로 공-형질감염시킴으로써 렌티바이러스를 제조하였다. 세포 상층액 속의 렌티바이러스 입자를 수집하고 초원심분리를 사용하여 농축시켰다. 1차 사람 T 세포를 이후에 공여체 혈액 샘플로부터 자기 비스 분리를 사용하여 단리하고 항-CD3 및 항-CD28 비드를 사용하여 폴리클론성으로 활성화시켰다. 활성화된 사람 T 세포를 이후에 다양한 CD22-표적호된 CAR 작제물을 함유하는 농축된 렌티바이러스로 10 초과의 감염 다중도(multiplicity of infection)에서 형질도입시켰다. 바이러스 형질도입 후, 세포를 확인하여 CAR을 GFP-마커용 유세포 분석을 사용하여 발현시켰다. 바이러스적으로 형질도입된 T 세포(CAR-T 세포)를 이후에 9일 동안 확장시킨 후 CAR 활성에 대해 시험하였다.
바이러스적으로 형질도입된 CAR-T 세포에서 CAR 활성을 실험하기 위해 다수의 검정을 활용하였다. 첫번째로 세포를 추가의 자극없이 제어된 세포 배양 조건에 두고 비-특이적인 세포 확장에 대해 추가로 6일 동안 생체 현미경(live microscopy)을 통해 IncuCyte® S3 장치(미국 마르토리우스 소재)를 사용하여 실험하였다. 총 세포 수를 자동화된 세포 게수를 사용하여 측정하였다. 다양한 CD22-sdAb 표적호된 CAR 작제물로 안정하게 형질도입된 1차 사람 T 세포는 9일 내지 15일 사이의 폴리클로날 활성화 후 자극되지 않은 조건 속에 둔 경우 유의적인 세포 확장을 나타내지 않았다(도 9). 이러한 결과는 시험한 CD22-sdAb 표적화된 CAR 작제물이 1차 사람 T 세포에 대한 표적-독립적인 긴장성(tonic) T 세포 활성화를 부여하지 않음을 나타낸다.
이후에, 1차 CAR-T 세포를 CD22를 발현하거나 발현하지 않는 세포에 대한 반응에서 항원 특이적인 활성화 및 표적 세포 사멸에 대해 시험하였다. CAR-T 세포를 적색-형광성 단백질 태그, Nuclight-Lenti(미국 마르토리우스 소재)를 발현하는 다양한 표적 세포가 들어있는 공-배양물 속에 두고, 6일 동안 IncuCyte S3 생체 현미경 장치를 사용하여 모니터링하였다. GFP-표지된 CAR-T 세포를 시험한 경우, 2개의CAR 작제물(1ug36 및 1ug10)은 CD22+ 세포주(Raji, Ramos)에 대한 반응시 GFP+ 세포의 명확한 확장을 나타내었지만 CD22-녹아웃 세포(Ramos-CD22ko)에 대한 반응시에는 그렇지 않았으며, 이는 항원-특이적인 활성화 및 확장을 나타낸다(도 10). 가장 활성인 CD22-CAR 작제물(1ug36)과의 공-배양물 속에서 Nuclight 표지된 표적 세포의 수를 시험하는 경우, CD22+ 표적 세포 성장의 명확한 회귀(repression)가 CD22+ 표적 세포에서 확인되었고 CD22-녹아웃 세포에서는 효과가 없거나 낮았다(도 11). 이러한 결과를 기반으로 하여, 선도하는 분자(1ug36)를 추가의 시험을 위해 선택하였다.
다음에, 실험을 수행하여 신규의 CD22-sdAb 표적화된 1차 CAR-T 세포에서 일련의 사멸 능력을 입증하였다. 상술한 바와 같이, CAR-T 세포를 공여체 혈액 유래된 T 세포로부터 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 생성시키고 9일 동안 세포 배양물 속에서 확장시켰다. 이후에, CAR-T 세포를 형광성 표지된 Ramos 세포와의 공-배양물 속에 두고 표적 세포 성장에 대해 시험하였다. 유사하게 상술한 바와 같이, 선도 작제물은 시험한 작제물의 가장 효과적인 표적 세포 회귀를 나타내었다(도 12 상단). 공-배양물 속에서 1주 후, CAR-T 세포를 신선한 Ramos 표적 세포로 재-챌린지하고 표적 세포를 지속적으로 사멸시키는 이의 능력에 대해 실험하였다(도 12 하단). 다시, 1ug36-CAR 작제물은 시험한 작제물의 표적 세포 성장의 가장명확한 회귀를 나타내었으므로 추가의 분석을 위해 선택하였다.
신규의 CD22-sdAb 표적화된 CAR 작제물을 사용한 공여체 내 및 공여체 간 다양성을 시험하기 위하여 추가의 CAR-T 세포를 상술한 바와 같이 2개의 상이한 공여체 혈액 샘플로부터 생성시켰다. 당해 실험에서, 신규의 CAR-T 작제물을 또한 벤치마크된 CD22-표적화된 CAR과 비교하였고, 여기서 앞서 입증된 CAR 작제물은 본원에 기술된 신규의 sdAb 작제물을 시험하는데 사용된 것과 유사한 CAR 작제물 내에서 사람 CD22-특이적인 단일 쇄 가변 단편[서열 번호: 116]으로 이루어졌다. 이후에, CAR-T 세포를 CD22-발현 표적 세포(Raji)와의 공-배양물 속에 두고 종양 세포 성장 회귀(도 13 상단) 및 CAR-T 세포 확장(도 13 하단)에 대해 실험하였다. 결과는 선도 CAR 작제물이 다양한 공여체 중에서 벤치마크 CAR 반응에 대해 일관되고 유사한 반응을 나타냄을 입증한다.
다음에, 2명의 공여체로부터의 CD22-sdAb 표적화된 CAR-T 세포를 CD22-확장(Raji) 및 CD22-음성(MCF7) 표적세포의 특이적인 분해에 대해 시험하였다. 상술한 바와 같이 생성된 다양한 CAR-T 세포를 방사활성 크롬 로딩된 표적 세포와 함께 4.5 시간 동안 표준 세포 배양 조건 속에서 공-배양하였다. 공-배양 후, 세포 상층액을 제거하고 크롬 함량에 대해 신틸레이션 계수기(scintillation counter)를 사용하여 열거하였다. 실험은 다양한 CAR 작제물로 2명의 공여체로부터 유래된 CAR-T 세포를 사용하여 단일 효과기 대 표적 비에서 수행하거나(도 14), 상기 확인된 선도 CD22-sdAb CAR 작제물을 다양한 효과기 대 표적 비에서 사용하여 수행하였다(도 15). 결과는 특이적인 표적 세포 분해가 신규의 CD22-sdAb CAR 작제물로 형질도입된 CAR-T 세포에 의해 유도되었음을 입증한다.
최종적으로, CD22-sdAb 표적화된 CAR-T 세포를 CD22-발현 종양 세포(Ramos)로 재-자극되는 이의 능력에 대해 평가하였다. 선도 1ug36-CAR 작제물을 포함하는 다양한 CAR-T 세포를 상술한 바와 같이 생성시키고 9일째의 확장 상 내지 17일째의 증식 정지 전체에서 배양하였다. 이후에, CAR-T 세포를 조사된 CD22 발현 Ramos 세포로 추가로 5일 동안 자극시켰으며 여기서 이를 크롬 로딩된 CD22-발현(Raji) 및 CD22-음성(MCF7) 표적 세포에 대한 이의 세포독성 잠재능에 대해 평가하였다. 다양한 효과기 대 표적 비에서 4.5시간의 공-배양 후, 방출된 크롬을 신틸레이션 게수기를 사용하여 정량하였다(도 16). 결과는 CD22를 지닌 Ramos 세포와 함께 선도 1ug36-CAR 작제물을 포함하는 정지기 CD22 표적화된 CAR-T 세포의 재-자극이 scFv CAR 벤치마크와 유사한 수준에서 CD22를 발현하는 Raji 표적 세포에 대해 특이적인 분해 활성의 보유를 야기하였음을 나타낸다.
결과
도 8은 CAR-저켓(Jurkat) 검정의 결과를 나타내고 여기서 저켓 세포는 다양한 CAR 플라스미드로 일시적으로 전기천공시키고 단독으로 또는 CD22-양성(Ramos) 또는 CD22-음성(Ramos-CD22ko) 세포주와 함께 배양하였다. T 세포 활성화의 수준을 사람 CD69-특이적인 항체 염색 및 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. 그래프는 표적 세포가 없는 배양물(빈 바아(open bar)), Ramos 표적 세포(막힌 바아(closed bar))가 들어있는 배양물, 또는 Ramos-CD22ko 세포가 들어있는 배양물(회색 바아) 속에서 중복의 단일 실험으로 수행한 각각 28개의 단일 도메인 항체 표적화된 car 작제물에 대한 cd68-염색에 대한 평균 형광성 간도를 나타낸다. 오차 바아는 중복 웰에 대한 평균의 표준 오차를 나타낸다. 결과는 시험한 신규의 CAR 작제물의 대략 1/2(15/28)에서 항원-특이적인 반응을 입증한다.
도 9는 CAR-T 긴장성 활성화 검정을 나타내고 여기서 1차 공여체 혈액 유래된 T 세포는 다양한 CAR 작제물로 형질도입되고 표적-독립된 확장에 대해 시험되었다. 모의(Mock)는 임의의 CAR을 발현하는 렌티바이러스의 부재하에서 유사한 처리 조건에 노출된 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. 방법에 기술된 바와 같이, CAR-T 세포를 생체 현미경을 통해 세포 배양물 속에서 증식에 대해 9일 내지 15일째의 폴리클로날 활성화 후에 시험하였다. 그래프는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 측정된 것으로서 당해 검정의 시작시 세포의 수와 관련하여 세포 수에 있어서의 배 변화(fold change)를 나타낸다. 결과는 시험한 CAR 작제물 속에서 항원-독립된 T 세포 확장의 결여를 입증한다.
도 10은 다양한 CD22-단일 도메인 항체 또는 대조군 (FMC63) CAR 작제물을 형질도입시킨 공여체 혈액 유래된 T 세포를 사용하여 수행된 CAR-T 표적-특이적인 활성화 검정의 결과를 나타낸다. 모의는 유사한 처리 조건에 노출된 CAR 발현의 부재하에서 변형되지 않은 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. 상술한 바와 같이, CAR-T 세포는 9일 내지 15일째의 폴리클로날 활성화 후 CD22+ 표적 세포(좌측 그래프 - Raji, 중간 그래프 - Ramos 표적), 또는 CD22-음성 표적 세포(우측 그래프 - Ramos-CD22ko 표적)와의 공-배양물 속에서 증식에 대해 생체 형광성 현미경을 통해 실험하였다. 그래프는 자동화된 계수를 사용하여 측정된 바와 같이 녹색 형광성 단백질 표시된 CAR-발현 세포의 배 확장을 나타낸다. 결과는 CD22-발현 표적 세포에 대한 반응시 CAR-T 세포의 특이적인 확장을 입증하며, 여기서 1ug36-BBz CAR 작제물은 시험한 다른 작제물과 관련하여 가장 큰 활성을 나타낸다.
도 11은 상술한 바와 같이 다양한 CD22-단일 도메인 항체 또는 대조군(FMC63) CAR 작제물로 형질도입시킨 공여체 혈액 유래된 T 세포를 사용하여 수행된 CAR-T 항원-특이적인 표적 세포 성장 회귀 검정의 결과를 나타낸다. 모의는 유사한 처리 조건에 노출된 CAR 발현없이 변형되지 않은 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. CAR-T 세포를 CD22+ 표적 세포(좌측 그래프 - Raji, 중간 그래프 - Ramos targets), 또는 CD22-음성 표적 세포(우측 그래프 - Ramos-CD22ko 표적)와의 공-배양물 속에 두고 생체 형광 현미경을 통해 실험하였다. 그래프는 자동화된 계수를 사용하여 측정된 것으로서 적색 형광성 단백질(Nuclight) 표시된 표적 세포의 배 확장을 나타낸다. 결과는 CD22-발현 표적 세포의 성장의 CAR-T 특이적인 회귀를 입증하며, 여기서 1ug36-BBz CAR 작제물은 시험한 다른 작제물과 관련하여 가장 큰 활성을 나타낸다.
도 12는 상술한 바와 같이 생성시킨 다양한 CD22-단일 도메인 항체 CAR 작제물로 형질도입시킨 공여체 유래된 T 세포를 사용하여 수행된 CAR-T 표적-특이적인 일련의 사멸 검정의 결과를 나타낸다. 모의는 유사한 처리 조건에 노출시킨 CAR 발현이 없는 변형되지 않는 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. CAR-T 또는 모의(Mock)-T 세포를 CD22+ 표적 세포(상단 그래프 - Ramos targets)와의 공-배양물에 두었다. 초기 챌린지 후 6일째에, 세포를 신선한 배지 속에서 1/5로 분할하고 추가의 CD22+ 표적 세포(하단 그래프 - Ramos 표적)로 챌린지하였다. 그래프는 자동화된 계수를 사용하여 측정된 것으로서 적색 형광성 단백질(Nuclight) 표시된 표적 세포의 배 확장을 나타낸다. 결과는 CD22를 발현하는 표적 세포의 성장의 CAR-T 특이적인 일련의 회귀를 나타내며, 여기서 1ug36-BBz CAR 작제물은 시험한 다른 작제물과 관련하여 가장 큰 활성을 나타낸다.
도 13은 상술한 바와 같이 2개의 별개의 공여체로부터 생성된 단일-도메인 항체 표적화된 CAR-T 세포에 대한 일관성 분석 및 벤치마크 CD22-표적화된 scFv CAR과의 비교의 결과를 나타낸다. 모의는 임의의 CAR을 발현하는 렌티바이러스의 부재하에서 유사한 처리 조건에 노출된 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. CAR-T 세포는 CD22+ 표적 세포(Raji)와의 공-배양물 속에서 이중 웰에 두고 생체 형광 현미경을 통해 시험하였다. 그래프는 자동화된 계수를 사용하여 측정된 것으로서 적색 형광성 단백질(Nuclight) 표지된 표적 세포의 배 확장(상단 그래프) 또는 녹색 형광성 단백질 표시된 CAR 세포의 배 확장(하단 그래프)을 나타낸다. 결과는 CD22+ 표적 세포의 성장의 CAR-T 특이적인 회귀 및 벤치마크 CD22-scFv CAR과 유사한 CAR-T 세포의 표적-유도된 확장에 대한 공여체 내 및 공여체간 일관성을 입증한다.
도 14는 방사활성 크롬(51Cr) 방출 검정을 사용한 직접적인 종양 분해 측정의 결과를 나타낸다. 상술한 바와 같이, 다양한 CD22-단일 도메인 항체 및 대조군 CAR-T 세포를 생성시켰다. 모의는 임의의 CAR-발현 렌티바이러스의 부재하에서 유사한 처리 조건에 노출된 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. 렌티바이러스 형질도입 후 9일째에, CAR-T 세포를 방햐활성 크롬과 함께 로딩된 CD22-양성(Raji) 또는 CD22-음성(MCF7) 표적 세포와의 공-배양물 속에 두었다. 그래프는 상층액 내로 크롬 방출의 정량화를 기반으로 단일 효과기 대 표적 비에서 표적 세포의 상대적인 분해를 나타낸다. 오차 바아는 중복 웰로부터의 측정의 표준 오차를 나타낸다. 결과는 벤치마크 CD22-scFv CAR과 비교하여 선도 CD22-sdAb CAR 분자의 비교가능한 직접적인 분해를 입증한다.
도 15는 크롬 방출 검정을 사용하여 상이한 효과기 대 표적 비에서 직접적인 CAR-T 세포 유도된 종양 분해의 결과를 나타낸다. CD22-CAR 작제물 1ug36를 scFv 벤치마크, M971 및 CD19 CAR 작제물 FMC-63 CAR-T 세포와 함께 상술한 바와 같이 생성시켰다. 모의는 임의의 CAR-발현 렌티바이러스의 부재하에서 유사한 처리 조건에 노출된 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. CAR-T 세포의 확장 9일 후에, 세포를 감소하는 효과기 대 표적 비에서 크롬 로딩된 CD22-양성 Raji 또는 CD22-음성 MCF7 표적 세포와 함께 4.5 시간 동안 공-배양하였다. 특이적인 분해를 신틸레이션 게수기를 사용하여 측정된 방출된 크롬을 기반으로 계산하였다. 결과는 1ug36-CAR-T 세포가 scFv 벤치마크와 유사한 수준에서 용량 의존적인 방식으로 CD22를 발현하는 Raji 표적을 특이적으로 분해함을 입증한다. 이러한 CAR 작제물을 CD22 또는 CD19 음성 MCF-7 종양 세포와 함께 공-배양하는 경우 배경(모의 대조군)을 능가하는 표적 세포 사멸을 관찰되지 않았다.
도 16은 CD22를 지닌 종양 세포를 사용한 재-자극 후 CAR-T 세포로부터의 크롬 방출 검정을 사용한 직접적인 종양 분해 측정의 결과를 나타낸다. 상술한 바와 같이, 다양한 CD22-단일 도메인 항체 및 대조군 CAR-T 세포를 생성시켰다. 모의는 임의의 CAR-발현 렌티바이러스의 부재하에서 유사한 처리 조건에 노출된 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. CAR-T 세포를 증식 정지(17일째)까지 배양한 다음 조사된 CD22를 발현하는 Ramos 세포로 자극시켜 표적-특이적인 활성화를 유도하였다. 공-배양 5일 후, 활성화된 CAR-T 세포를 감소하는 효과기 대 표적 비에서 방사활성 크롬으로 로딩시킨 CD22-양성(Raji) 또는 CD22-음성(MCF7) 표적 세포와 함께 혼합하엿다. 그래프는 상층액 내로 크롬 방출의 정량화를 기반으로 표적 세포의 상대적인 분해를 나타낸다. 결과는 특이적인 CD22 항원을 사용한 정지 CAR-T 세포의 효율적인 재-활성하 및 벤치마크 CD22-scFv CAR와 관련하여 선도 CD22-sdAb CAR 분자의 비교가능한 용량 의존적 Raji 종양 분해(CD22 양성)를 입증한다.
논의
전반적으로 이러한 결과는 CD22-특이적인 단일 도메인 결합인자가 표적 세포 사멸 및 일련의 사멸, 장기간 종양 세포 성장 회귀, CAR-T 확장, 및 직접적인 표적 세포 분해를 구동시킬 수 있는 강력한 항원-구동된 T 세포 활성화 신호전달을 생성할 수 있음을 예시한다. 선도 분자가 본원에 제공된 예시적인 데이타에서 확인되었지만, 분자 최적화를 추가의 CD22-특이적인 단일 도메인 항체 서열로 수행하여 고 기능성 CAR 분자를 생성시킬 수 있다. 또한, 단일 분자 내 다수의 CD22-특이적인 단일 도메인 항체 서열의 조합은 표적-특이적인 CAR 활성화 활성을 증가시키기에 효과적인 전략일 수 있다.
실시예 4: CAR-T 생체 내 시험
도입
시험관 내에서 CD22-결합 단일 도메인 CAR-T의 항-종양 효과를 확인하기 위하여, 리포터로서 개똥벌리 루시퍼라제를 발현하는 Ramos 종양 세포를 NOD/SCID/IL2r-감마 쇄null(NSG) 마우스 내로 피하 접종한 후 CD22-결합 단일 도메인 CAR-T 세포를 주입함으로써 함으로써 이종이식체 모델을 확립하였다.
물질 및 방법
생체 내 연구를 위해, 야생형 종양 세포주를 개똥벌레 루시퍼라제(FLUC)를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 안정하게 형질도입한 후 루시퍼라제-양성 세포를 선택 마커로서 푸로마이신 내성을 사용하여 선택함으로써 루시퍼라제-발현 세포주를 생성시켰다. Ramos-FLUC를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청 및 2 mM L-글루타민 및 1 mM 피루브산나트륨이 보충된 RPMI 1640 속에서 유지시켰다. 모든 세포 배양 시약은 Gibco로부터 구입하였다. 세포주를 마이코플라스마 오염 PCR의 부재에 대해 확인하였다.
6 내지 8주령의 암컷 NOD/SCID/IL2Ry-/- (NSG) 마우스를 Jackson Laboratories로부터 구입하고 캐나다의 정부출연연구기관(National Research Council)에서 Animal Resource Group에 유지시켰다. 마우스를 조건 하에 장벽 시스템(barrier system) 내에서 병원체가 없는 개별적으로 환기된 우리에 가두었다. 동물을 보증된 설치류 식이에 접근하도록 하고 멸균수를 물병을 통해 제공하였다. NSG 마우스는 성숙한 T 세포, B 세포 및 천연 킬러 세포를 결여하였으므로; 이는 연구용 nu/nu 마우스보다 더 우수하다. 8주령의 NSG 마우스에게 100 μL의 HBSS 중 5x104 Ramos-FLUC 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. 종양 세포 주사 후 4일째에, 마우스에게 안구 뒤 망상조직(retro orbital plexus)을 통해 CD22-표적화된 단일 도메인 CAR-T 세포, 표적화 도메인이 임상적으로 입증된 CD19 CAR 작제물 Kymriah 및 Yescarta와 유사한 CD19 표적화된 CAR-T 세포 또는 CAR 발현이 없는 모의(Mock) CAR-T 세포를 피하 주사하였다. 마우스에서 종양 성장을 생물발광(IVIS 영상기; PerkinElmer)을 통해 모니터링하고 혈액을 순환하는 CAR-T 세포 및 종양 세포의 모니터링을 위해 주당 1회 수집하였다. 마우스를 질병의 신호에 대해 매일 모니터링하고 이들이 조사 센터의 동물 보호 위원회(Animal Care Committee of the Research Center)에 의해 입증된 것으로서 예비-명시된 사람 종점, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 뒷-다리 마비(hind-limb paralysis), 호흡 곤란증(respiratory distress), 또는 20% 체중 감소(body weight loss)에 충족한 경우 즉시 희생시켰다.
마우스로부터의 혈액 샘플을 PBS/0.1% BSA 속에서 세척하고 50 μl의 Brilliant 완충제(BD Biosciences, 미국) 속에 재-현탁시켰다. 세포를 hCD45-APC-H7, hCD45RA-BV650, hCD45RO-PE-CF594, hCD27-BUV737, hCCR7-PE, hCD4-BUV395, 및 hCD8-PerCP-Cy5.5에 대해 지시된 다음의 항체 형광단 접합체(달리 나타내지 않는 한 모두 미국 소재의 BD Biosciences로부터 구입함)를 사용하여 염색하였다.
CD45는 src-계열 키나제를 조절하는 단백질 타이로신 포스파타제이며, 모든 조혈 세포 상에서 발현된다. 따라서, 항-사람 CD45 항체를 사용하여 마우스에서 사람 조혈 세포를 검출하였다. CD45는 세포외 도메인을 포함하는 엑손의 교호적인 스플라이싱에 의해 수개의 동형 중 하나로 발현될 수 있고; 다양한 동형의 발현은 T 세포 분호 상태의 지표이다. CD45RA는 나이브(
Figure pct00014
) T 세포에서 발현될 뿐 아니라, 효과기 세포는 CD4 및 CD8 둘 다에서 발현된다. 항원 실험 후, 중심 및 효과기 기억 T 세포는 CD45RO의 발현을 획득하고 CD45RA의 발현을 상실하였다. 따라서, 사람 CD45RA 및 CD45RO에 대한 항체를 사용하여 나이브 및 기억 T 세포 집단을 분화시켰다. 중앙과 효과기 기억 집단 사이 및 나이브와 효과기 집단 사이의 분화는 제2의 마커를 가하여 달성할 수 있다. 이러한 목적을 위해 사용된 수개의 마커가 존재하며 이는 중앙으로부터 효과기 기억 세포로 변화하므로 T 세포 내에서 발생하는 것으로 고려되는 분화 경로의 약간 상이한 단계에서 이러한 집단을 표시하는 경향이 있다. 체크포인트 수용체 CCR7은 이러한 2개 집단 사이를 구분하므로 사람 CCR7에 대한 항체를 이러한 목적을 위한 본 연구에 사용하였다. CAR 발현은 플라스미드 내에 혼입된 GFP를 사용하여 검출하였다. 소모(exhaustion)를 평가하기 위해, hPD-1-BV421(BioLegend, 미국)에 대해 지시된 항체를 적용하였다. T 세포 활성화를 hCD25-PE-Cy7 및 hCD69-BV786에 대한 형광성-표지된 항체로 검출하였다. 생체 내 연구를 위해, 마우스 CD45-BV711을 사용하여 뮤리 세포를 게이팅하고 백혈병 세포를 사람 CD19 발현을 사용하여 항-사람 CD19-BUV496 항체를 통해 확인하였다. 샘플을 30분 동안 4℃에서 암실 속에서 항온처리하였다. 이후에, 혈액을 RBC 분해 완충제(Sigma-Aldrich, 미국)를 가하여 분해하였다. 샘플을 약간 혼합하여 세포를 재-현탁시키고 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후에, 세포를 PBS/0.1% BSA 속에서 세척하고 PBS/0.1% BSA 속에 재현탁시켰다. 데이타는 BD Fortessa 세포측정기(BD Biosciences) 상에서 획득하였다. UltraComp™ eBeads(eBiosciences, 미국)을 보상을 위해 사용하였다. 분석을 FlowJo 소프트웨어(FloJo, 미국)를 사용하여 수행하였다.
마우스에서 종양 성장을 모니터링하기 위한 생체 내 생물발광성 영상화를 IVIS Lumina III 영상화 시스템(PerkinElmer, 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재)을 사용하여 수행하였다. 반복된 기준에서, 마우스를 이소플루오란(유도를 위해 3.0% 및 유지를 위해 2.0%로 감소시킴)을 사용하여 마취시키고 털을 제거하였다. 0시째에, 마우스에게 150 mg/kg의 Redi-Ject D-루시페린(Luciferin)(Perkin Elmer, 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재)를 피하 주사로 제공하였다. 이후에 동물을 영상화 시스템에 유지 마취하에 이전시키고 개방 필터(open filter)를 D-루시페린 후 20분 째에 영상을 찍어 D-루시페린이 균질하게 분포하여 신호가 정체기데 도달하도록 하였다. 영상으로부터 루시퍼라제 유전자 발현의 상대적인 양을 계산하기 위해, Living Image 소프트웨어(Perkin Elmer, 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재)를 활용하여 전체 신체의 목적한 부위(region of interest; ROI)에서 스테라디안(steradian) 당 평방 센티미터 당 광자(p/s/cm2/sr)로서 나타낸 총 광채(radiance)를 계산하였다.
결과
도 17은 생체 내 모델에서 이에 대한 실험 프로토콜의 개략도를 나타낸다. 이종 모델(xenogeneic model)에서 CD22-결합 단일 도메인-CAR-T의 활성을 평가하기 위하여, 8주령의 NOD/SCID 마우스에게 0일째에 50,000 Ramos-FLUC 세포를 피하 접종하고 후속적으로 1x107 CD22-표적화된 단일 도메인-CAR-T(1ug13 또는 1ug36), FMC63-CAR-T(임상적으로 입증된 CAR 작제물에서 사용된 바와 같은 동일한 항원 결합 도메인을 사용한 CD19 표적화된 CAR-T), 또는 CAR 발현이 되지 않는 모의(Mock) T 세포를 4일째에 안구 뒤 주사로 처리하였다. 마우스를 생물발광성 생체 내 영상화에 의해 영상화하고 혈액을 마우스로부터 매주 수집하였다.
도 18은 다양한 CAR-T 세포의 처리 후 Ramos-Luc를 접종한 NSG 마우스의 생존 분석의 결과를 나타낸다. 모의는 임의의 CAR을 발현하는 렌티바이러스의 부재하에서 유사한 처리 조건에 노출된 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. 동물 실험 설정은 상기 기술되었다. 그래프는 연구에서 마우스의 생존 일 수를 나타낸다. 결과는 FMC63 및 모의 T 세포로 처리한 마우스와 비교하여 CD22-표적화 단일 도메인 항체1ug13 및 1ug36 CAR-T 세포로 처리된 마우스에서 관찰된 연장된 생존을 입증한다.
도 19는 Ramos-FLUC를 접종하고 다양한 CAR-T 세포로 처리한 마우스에서 종양 부담(tumor burden)의 결과를 나타낸다. 마우스를 IVIS Lumina III을 사용하여 생물발광성을 정량화함으로써 종양 부단(tumor burden)에 대해 모니터링하였다. 그래프는 모든 그룹으로부터의 마우스가 살아있는 최종 실험 시점인, 종양 세포의 주사 후 18일째에 각각의 처리 그룹 내에서 개개 동물에서 총 플럭스(total flux)(광자/초)(어두운 원) 및 그룹 당 평?? 총 플럭스(수평 바아)를 나타낸다. 1ug36 CAR-T 세포 또는 FMC63 CAR-T 세포로 처리한 마우스는 모의 T 세포를 제공받은 마우스와 비교하여 종양 부담에서 유의적인 감소를 나타내었다(각각 p<0.001 및 p=0.0004).
도 20은 Ramos-FLUC를 접종하고 다양한 CAR-T 세포로 처리한 마우스의 말초 혈액에서 종양 부담의 결과, 총 CAR-T 세포 집단 및 순환하는 CAR-T 세포 집단의 상이한 표현형을 나타낸다. 혈액을 종양 세포 챌린지 후 23일째에 수집하고, 적혈 세포를 분해하고 남아있는 세포를 상술한 바와 같이 다양한 형광성 접합된 항체로 염색하였다. 좌측 그래프는 유세포 분석을 통해 분석한 1 백만개의 총 혈액 세포 현상 당 사람 CD19+ 백혈병 세포의 수를 나타낸다. 중간 그래프는 유세포 분석으로 분석한 1 백만개의 혈액 세포 당 검출된 CD45+/GFP+ CAR-T 세포의 수를 나타낸다. 우측 그래프는 T 세포 표면 마커 CD45RA 및 CCR7의 발현을 기반으로 모의 T 세포 그룹에서 게이팅된 CAR-T 세포 또는 게이팅되지 않은 CD45+ 세포의 분화 상태를 나타낸다. 종합적으로, 결과는 1ug36-sdAb 표적화된 CAR-T 세포로 처리한 마우스에서 백혈병적 버든의 전반적인 감소, CAR-T로 처리한 모든 그룹에서 CAR-T 세포의 확장, 및 처리된 마우스에서 밝혀진 명확한 확장, 및 sdCD22 CAR-T 세포로 처리한 그룹에서 보다 중앙 기억 T 세포를 선호하는 균형을 이룬 분화 프로파일을 입증한다.
논의
NSG 마우스를 광범위하게 사용하여 사람 면역계와 암 사이의 상호작용, 사람 면역 세포와 사람 종양의 문맥에서 면역치료요법을 평가하기 위한 실질적인 플랫폼을 연구한다. 전반적으로, 이러한 결과는 시험관 내와 유사하게, 생체 내에서 CD22-표적화 도메인 CAR 변형된 T 세포의 항-백혈병 활성을 명확하게 입증하고 CD22-표적화 단일 도메인 CAR-T 세포의 효능이 CD19(FMC63)-CAR-T 세포의 것과 유사하거나 보다 우수함을 입증하며, 이는 임상에서 임상 반응이 이미 입증되었다.
실시예 5: 이특이적인 T-세포 인게이저 작제
도입
키메라 항원 수용체 기술과 유사하게, 신규 항원 결합 성분을 또한 CD3-인게이징 항체 성분에 연결하여 T 세포 및 세포 표적 분자를 동시에 결합시킬 수 있는 가용성 물질을 생성함으로서, 항원-특이적인 T 세포 활성화 신호를 야기하였다. 이-특이적인 T 세포 인게이저로서 지칭된 이러한 유형의 분자는 블리나투모맙으로 예시되며, 여기서 단일 분자는 사람 CD19 및 사람 CD3을 동시에 인게이징하고; CD19를 발현하는 B-세포 계열 악성종양에 대한 치료요법으로서 사용된다. 본원에서 생성된 사람 CD22-특이적인 단일 도메인 항체가 이러한 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자에서 사용될 수 있는지를 평가하기 위하여, 분자의 한쪽 말단이 CD22-특이적인 단일 도메인 항체에 포함되고 다른 말단이 CD3-인게이저 분자에 포함된 분자를 생성시켰다. 이후에, 이러한 신규의 이-특이적인 T 세포 인게이저를 T 세포 활성화 및 표적 세포의 T 세포 사멸의 비-특이적인 및 항원-특이적인 유도에 대해 스크리닝하였다.
물질 및 방법
단일 도메인 항체 항원 결합 서열을 플라스미드 골격 내 모듈러 이-특이적인 T 세포 인게이저 DNA 서열[서열 번호: 119]로 이전시켰으며; 사용된 DNA 서열은 제한 부위를 함유함으로써 효율적인 재조합을 허용하였고 여기서 항원 결합 도메인은 신규의 CD22-항원 결합 도메인(antigen binding domain; ABD) 서열로 대체될 수 있었다. 사용된 특이적인 이-특이적인 T 세포 인게이저 설계는 다음과 같았다: 사람 CD28 신호 펩타이드[서열 번호:110], VHH 항체 (ABD)(서열 번호: 82 내지 108 중 언 하나), 유연한 링커 도메인[서열 번호: 111], 사람 CD8 힌지 도메인[서열 번호: 112], 짧은 유연한 링커 도메인[서열 번호: 118], 및 CD3-특이적인 단일 도메인 가변 단편 서열. CD22-CD3 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자의 모델이 제공된다(도 21). 작제물을 골든 게이트 조립(golden gate assembly)을 사용하여 생성시키고 하부 시험(downstream testing)으로 진행하기 전에 생거 서열분석(Sanger sequencing)을 사용하여 확인하였다.
이-특이적인 T 세포 인게이저 분자의 정제된 단백질 형태를 생성시키기 위해, 다양한 작제물을 함유하는 플라스미드 DNA를 HEK293T 세포 내로 폴리에틸렌이민을 사용하여 표준 공정을 통해 이전시켰다. 형질감염된 세포를 세포 배양물 속에 두고 상층액을 수일에 걸쳐 수집하였다. 이후에, 상층액을 이-특이적인 T 세포 인게이저 활성에 대해 상층액을 저켓 세포 상에 단독으로 또는 CD22-양성(Ramos) 또는 CD22-음성(U87vIII) 표적 세포와의 공-배양물로 두어 시험하고 표준 조건 하에서 밤새 항온처리하였다. 이후에, 저켓 세포를 T 세포 활성화에 대해 사람 CD69 마커에 대한 항체 염색 및 유세포 분석을 사용하여 시험하였다(도 24). 결과는 용액 속에서 전달된 경우, CD22-sdAb 표적화된 이-특이적인 T 세포 인게이저가 상이한 작제물 사이에 다양한 활성으로, 표적 의존성 T 세포 활성화를 유도할 수 있음을 입증한다.
이러한 결과를 1차 사람 T 세포에서 특이적인 항-종양 반응의 유도로 확장시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 상기 생성된 신규의 이-특이적인 T 세포 인게이저를 함유하는 상층액을 1차 T 세포를 사용하는 검정에서 사용하였다. 구체적으로, T 세포를 사람 공여체 혈액으로부터 단리하고 10일 동안 폴리클론적으로 확장시켰다. 폴리클로날 확장 후, T 세포를 안정한 형광성 단백질(Nuclight; 미국 사토리우스 소재)을 발현하는 표적 세포(Ramos)와의 공-배양물 속에 다양한 이-특이적인 T 세포 인게이저 또는 대조군 상층액(모의(Mock))의 존재하에 두었다. 이후에, 공-배양물을 표적 세포 성장에 대해 IncuCyte(미국 사토리우스 소재) 생 현미경 장치를 사용하여 모니터링하였다. 형광성 표지된 표적 세포의 자동화된 세포 계수를 사용하여, 표적 세포의 상대적인 성장을 3일에 걸쳐 정량하였다(도 25). 결과는 CD22-sdAb를 함유하는 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자가 CD22를 발현하는 표적 세포에 대해 세포분해성 사람 T 세포 반응을 재-표적화할 수 있음을 입증한다.
결과
도 21은 DNA 작제물의 5' 말단에 CD22-sdAb 서열에 이어서, 조성이 다양할 수 있는 링커 서열에 이어, CD3-특이적인 단일 쇄 가변 단편을 지닌, CD22-특이적인 단일 도메인 항체 이-특이적인 T 세포 인게이저 단백질의 분자 구조를 나타낸다.
도 22는 저켓 세포 이-특이적인 T 세포 인게이저 활성화 활성 검정의 결과를 나타내고 여기서 다양한 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자를 함유하는 HEK293T 상층액은 저켓 세포 및 CD22-양성(Ramos) 또는 CD22-음성(U87vIII) 표적 세포를 함유하는 공-배양물의 상층에 위치하였다. 그래프는 유세포 분석으로 측정된 것으로서 저켓 세포의 평균 CD69-특이적인 항체 염색을 나타낸다. 오차 바아는 2개의 중복 공-배양 웰에 걸쳐 평균의 표준 오차를 나타낸다. 결과는 신규의 CD22-sdAb 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자의 존재하에서 T 세포의 CD22-항원 특이적인 활성화를 입증한다.
도 23은 CD22-양성 표적 세포(Ramos) 속에서 1차 사람 T 세포를 사용한 이-특이적인 T 세포 인게이저 활성 검정의 결과를 나타낸다. 상술한 바와 같이 공여체 혈액 유래된 T 세포를 상층액을 함유하는 대조군(모의(mock)) 또는 CD22-특이적인 이-특이적인 T 세포 인게이저의 존재하에서 형광적으로 표지된 표적 세포와의 공-배양물 속에 두고 시간마다 3일에 걸쳐 생 형광 면역검정을 통해 실험하였다. 그래프는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 측정된 것으로서 형광성 표지된 표적 세포의 배 성장을 나타낸다. 오차 바아는 2개의 중복 공-배양물 웰에 걸친 평균의 표준 오차를 나타낸다. 결과는 CD22-sdAb 표적화된 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자의 존재하에서 T-세포 매개된 종양 성장 억제를 입증한다.
특히, 서열 번호: 111, 서열 번호: 112(사람 CD8 힌지 도메인), 및 서열 번호: 118를 포함하는 연장된 링커를 지닌 이러한 작제물은 보다 짧은, G4S 링커 만을 포함하는 유사한 작제물보다 더 높은 활성을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음).
논의
전반적으로, 이러한 결과는 CD22-특이적인 단일 도메인 결합인자가 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자와 조합되는 경우 강력한 항원-구동된 T 세포 활성화를 생성할 수 있음을 예시한다. CD22-sdAb 표적화된 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자는 표적 특이적인 T 세포 활성화를 구동하고 1차 사람 T 세포에 의한 표적 세포 사멸을 지시하는 것으로 입증된다. 예시적인 데이타를 2개의 CD22-특이적인 단일 도메인 항체에 대해 제공하지만, 이러한 데이타는 추가의 고 친화성 CD22-결합인자가 유사한 활성을 갖는 경향이 있음을 나타낸다. 또한, 분자 최적화를 수행하여 이-특이적인 T 세포 인게이저 분자의 기능성을 추가로 증가시킬 수 있다. 또한, 단일 분자 내에 다수의 CD22-특이적인 단일 도메인 항체 서열을 조합시키는 것은 표적-특이적인 활성화 활성을 증가시키는데 효과적인 전략일 수 있다.
실시예 6: CAR-T 작제물의 생체내 연구
순환하는 CAR-T 세포의 생존 분석 및 측정을 1x105 Ramos-Luc 종양 세포를 접종한 다음 2.5x106개의 sdCD22 (1ug13 또는 1ug36) 또는 벤치마크 scFvCD22 CAR-T 세포로 처리한 NSG 마우스에 대해 연구하였다. 모의는 임의의 CAR을 발현하는 렌티바이러스의 부재하에서 유사한 처리 조건에 노출된 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. Tx 마우스에게는 비히클(행크스 균형된 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution))을 제공하지 않았다.
도 24는 처리 및 시험의 도해이다.
도 25는 마우스의 경우 생존을 나타낸다.
도 26은 마우스의 말초 혈액 내에서 열거된 CAR-T 세포를 나타낸다.
결과는 모의 T 세포로 처리하거나 처리하지 않고 둔 마우스와 비교하여 CD22-CAR-T 세포로 처리한 마우스에서 관찰된 CAR-T 세포의 연장된 생존 및 지속성을 입증한다. sdCD22-1ug36 CAR-T 세포로 처리한 마우스는 벤치마크 scFv CAR-T 또는 sdCD22-1ug13 CAR-T와 비교하여 순환하는 CAR-T 세포의 향상된 생존 및 증식/지속성을 나타내었다.
생존 분석 및 종양 성장 동역학을 또한 0.5x105 Ramos-Luc 종양 세포를 접종한 다음 다양한 용량의 sdCD22-1ug36 CAR-T 또는 벤치마크 scFvCD22-m971 CAR-T 세포로 처리한 NSG 마우스에 대해 연구하였다. 모의는 임의의 CAR-발현 렌티바이러스의 부재하에서 유사한 처리 조건에 노출된 공여체 유래된 T 세포를 지칭한다. Tx 마우스에게는 비히클(행크스 균형된 염 용액)을 제공하지 않았다.
도 27은 1차 종양 챌린지 및 CAR-T 처리 후 마우스의 생존을 나타낸다. 모의 T 세포 또는 비히클 대조군을 제공받은 마우스보다 CAR-T로 처리한 마우스의 생존 시간에서 용량 의존적인 증가가 존재하였다. 최대 용량의 CAR-T T 세포로 처리한 마우스의 50% 이상이 장기간 생존하였고 0.5x105 Ramos-Luc 종양 세포로 1차 종양 챌린지한 후 88일째에 재-챌린지하고 생존 및 종양 성장에 대해 모니터링하였다.
도 28은 재-챌린지 시 마우스의 생존을 나타낸다. 비처리된(비히클 대조군) 동물 모두는 질환으로 죽었지만 CAR-T 처리된 마우스의 모두(sdCD22-1ug36) 또는 대부분(benchmark scFvCD22-m971)은 2차 종양 챌린지에 생존하였다.
도 29는 챌린지 후 종양 성장의 그래프를 나타낸다. 미처리된 대조군 마우스 모두는 종양으로 진전되었으나 CAR-T로 처리한 마우스는 재-챌린지를 거부할 수 있었으며 이는 CAR-T의 장기간 지속성 및 따라서 항-종양 반응의 내구성을 입증한다.
실시예 7: 비-파라토픽 및 다-파라토픽 CAR 작제물
도 30은 (좌측) N-말단 CD22-sdAb 서열에 이어 (중앙) 동일한 sdAb 결합인자 서열의 다른 카피 또는 (우측) 상이한 sdAb 결합인자를 함유하는, CD22-특이적인 CAR 분자를 함유하는 다-결합인자 도메인의 분자 구조를 나타낸다. 이는 보다 높은 친화성 및/또는 보다 높은 친화성 CAR 분자를 야기한다.
도 31은 CAR-저켓 검정의 결과를 나타내고 여기서 저켓 세포는 다양한 CAR 플라스미드(단일 결합인자 및 다-결합인자를 암호화함)로 일시적으로 전기천공하고 단독으로 또는 CD22-양성(Ramos) 표적 세포주와의 공-배양물과 함께 배양하였다.
도 32는 다-sdAb를 함유하는 CAR 작제물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 1차 사람 혈액 유래된 T 세포를 사용한 유사한 CAR-활성화 연구의 결과를 나타낸다. 이러한 데이타는 CAR 분자를 함유하는 다-CD22 sdAb가 CD22를 발현하는 표적 세포에 대해 보다 높은 분자 반응을 나타낼 수 있음을 입증한다.
도 33은 CD22-특이적인 CAR(좌측), BCMA-특이적인 CAR(우측), 또는 탄뎀-CD22-BCMA-CAR 분자(중앙)의 분자 구조를 나타낸다. 탄뎀 작제물은 N-말단 CD22-sdAb 서열에 이어, 다른 항원 특이적인 sdAb일 수 있는 링커 서열, 예를 들면, 본원에 나타낸 바와 같은 BCMA를 표적화하는 것을 함유할 수 있다.
도 34는 CAR-저켓 검정의 결과를 나타내고 여기서 저켓 세포는 다양한 CD22, BCMA, 또는 CD22/BCMA-특이적인 CAR 플라스미드로 일시적으로 전기천공되고 단독으로 또는 BCMA+/CD22+(Ramos), BCMAlow/CD22+(NALM6), 또는 BCMA+/CD22-(Ramos-CD22ko) 표적 세포주와의 공-배양물 속에서 배양되고 활성화 상태(CD69 발현)에 대해 실험되었다. 이러한 데이타는 CAR 분자를 함유하는 다-CD22 sdAb가 표적 항원에 대해 반응성을 유지할 수 있고 항원-저 표적 세포에 대한 반응성을 향상시킬 수 있음을 입증한다.
실시예의 논의
이는 CD22 표적화된 CAR-T 처리에서 적용하기 위한 단일 도메인 항체의 증명이다. 단일 도메인 항체는 CAR 작제물의 항원 인식 도메인에서 통상적으로 사용된 단일-쇄 가변 단편 항체보다 유의적인 장점, 예를 들면, 유의적으로 보다 작은 크기, 사람 항체 서열과의 보다 높은 상동성, 향상된 모듈성(modularity), 및 scFv에 접근가능하지 않을 수 있는 에피토프를 표적화하는 능력을 부여한다. 본 발명은 이후에 CD20, CD19 또는 BCMA 표적화된 단일 도메인 항체와 조합하여 다중 B-세포 특이적인 항원에 대해 표적화된 단일 CAR 작제물을 생성할 수 있다.
앞서의 설명에서, 설명의 목적을 위해, 다수의 세부사항이 설정되어 구현예의 완전한 이해를 제공한다. 그러나, 이러한 구체적인 세부사항이 요구되지 않음은 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다.
상술한 구현예는 단시 예인 것으로 고려된다. 변형, 변형 및 변화가 당해 분야의 기술자에 의해 특수한 구현예에 대해 시행될 수 있다. 청구범위의 영역은 본원에 제시된 특수한 구현예에 의해 제한되지 않아야 하지만, 전체로서 명세서와 일치하는 방식으로 구성될 수 있다.
참고문헌
Figure pct00015
본원에 인용된 모든 참고문헌은 이의 전문이 참고로 명확하게 포함된다.
[표 8]
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SEQUENCE LISTING <110> National Research Council of Canada <120> ANTI-CD22 SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND THERAPEUTIC CONSTRUCTS <130> PAT 108623W-90 <140> Not yet received <141> 2021-07-26 <150> 63/058,203 <151> 2020-07-29 <160> 139 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD221ug-6 CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Val 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD221ug-6 CDR2 <400> 2 Ile Ser Ser Ser Asp Gly Val Thr 1 5 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD221ug-6 CDR3 <400> 3 Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Tyr Tyr Tyr Thr Cys Pro 1 5 10 15 Val Asp Phe Asp Ser 20 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD221ug-10 CDR1 <400> 4 Glu Ser Thr Phe Ser Ile Met 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD221ug-10 CDR2 <400> 5 Ile Asn Ser Ala Gly Ser Thr 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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780 gggactcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc 840 tcgcgctagc gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca ggcgacgtgg aagaaaaccc 900 cggtcccatg gtgagcaagg gcgaggagga caacatggcc agcctgcccg ccacccacga 960 gctgcacatc ttcggcagca tcaacggcgt ggacttcgac atggtgggcc agggcaccgg 1020 caaccccaac gacggctacg aggagctgaa cctgaagagc accaagggcg acctgcagtt 1080 cagcccctgg attctggtgc cccacatcgg ctacggcttc caccagtacc tgccctaccc 1140 cgacggcatg agccccttcc aggccgccat ggtggacggc agcggctacc aggtgcacag 1200 gaccatgcag ttcgaggacg gcgccagcct gaccgtgaac tacaggtaca cctacgaggg 1260 cagccacatc aagggcgagg cccaggtgaa gggcaccggc ttccccgccg acggccccgt 1320 gatgaccaac agcctgaccg ccgccgactg gtgcaggagc aaaaagacct accccaacga 1380 caagaccatc atcagcacct tcaagtggag ctacaccacc ggcaacggca agaggtacag 1440 gagcaccgcc aggaccacct acaccttcgc caagcccatg gccgccaact acctgaagaa 1500 ccagcccatg tacgtgttca gaaagaccga gctgaagcac agcaagaccg agctgaactt 1560 caaggagtgg cagaaggcct tcaccgacgt gatgggcatg gacgagctgt acaagcccaa 1620 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gttaaactct cttgcaaagc atccggttat 180 acctttactt cttactggat ccattgggtc aaacaacgcc caggccaggg tctcgaatgg 240 gtgggcaaca tcaacccaaa cagcggctct atcaattata acgaaaagtt taagaataaa 300 gcaactctca cggtggataa gagcagctca accgcttata tgcaattgag tactttgacc 360 agtgaagatt tcgctgtgta ttattgcacg cgcgatacat ccggacagta ttatttcgat 420 tattggggcc aggggacaac cctgacagtg tctagcggcg gtggtgggtc aggcggcggt 480 gggagcggag gaggtggaag cgatatcgta atgagtcaat cccctagcag cttggcggta 540 agtgctgggg aacgcgttac aatgtcctgt aagagctctc aatctttgct gaattccagg 600 actaggaaga attatctggc ctggtatcaa caaaagcccg gacaaagtcc aaagctcctg 660 atttattggg ctagcaccag agagtcagga gtaccagacc ggtttactgg aagcgggtca 720 ggaaccgact ttaccctgac aatatccagc gtccaagcag aagatcttgc cgtgtactat 780 tgtattcagt cctaccactt gcgcactttt ggggggggaa caaaactcga gataaagcac 840 caccaccacc accactag 858 <210> 120 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD221ug-36 Cloned Segment <400> 120 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 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<220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Y, D, or S <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is V or A <400> 126 Gly Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Tyr Xaa 1 5 <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 1 CDR2 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is I or M <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is T, R, or G <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is S or N <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is D or S <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is D or is absent <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is V or A <400> 127 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr 1 5 <210> 128 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 1 CDR3 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is I, N, Y, or S <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Q, Y, R, or L <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa is D or G <400> 128 Ala Val Asp Lys Pro Phe Tyr Asp Gly Gly Xaa Xaa Tyr Thr Cys Pro 1 5 10 15 Val Asp Phe Xaa Ser 20 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 2 CDR1 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is I or T <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is R or is absent <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is R, S, or I <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is I, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is A, S, or T <400> 129 Gly Ser Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Val 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 2 CDR2 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa G, S, or A <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa E, D, or S <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa T or S <400> 130 Ile Thr Ser Xaa Gly Xaa Xaa 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 2 CDR3 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is K or Q <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is W or Y <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Q, R, or G <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Y, D, or R <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is E or S <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Y, D, or H <400> 131 Asn Ala Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 132 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 3 CDR1 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is F or S <400> 132 Gly Arg Ile Xaa Arg Ser Tyr Val 1 5 <210> 133 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 3 CDR2 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is W or C <400> 133 Ile Gly Xaa Ser Asp Thr 1 5 <210> 134 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 3 CDR3 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is A or E <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is N or Y <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is G or D <400> 134 Ala Xaa Xaa Ser Pro Pro Tyr Gly Pro Gln Arg Asp Glu Phe Xaa Tyr 1 5 10 15 <210> 135 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 4 CDR1 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is R or G <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is S or F <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is G or T <400> 135 Gly Xaa Thr Xaa Ser Val Tyr Xaa 1 5 <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 4 CDR2 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is M or I <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is S or R <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is W or G <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is G or is absent <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is P or G <400> 136 Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Gly Xaa Thr 1 5 <210> 137 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Group 4 CDR3 Consensus <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is L or V <400> 137 Ala Val Arg Ile Arg Arg Thr Leu Xaa Glu Pro Leu Thr Lys Glu Thr 1 5 10 15 Leu Tyr Asp Tyr 20 <210> 138 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD221ug36 Example CAR <400> 138 atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggacaggta 60 cagctggtgg agtctggggg aggcttggtg caggctgggg ggtctctgag agtctcctgt 120 gaagcctctg gaatcacgtt cagtcgcgcg gccatgggct ggtaccgcca gcgtccaggc 180 aaggagcgcg aacgagtcgc agttgttaat agtgatagca gtacaatata tgcagactcc 240 gtgaagggcc ggttcaccat ctccagagac aatgccaaga acacagtgta tctgcaaatg 300 aacagcctgg aacctgagga cacggccgtc tattactgtt ggtccccagg gttcgggtcc 360 tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtt tcctcacctt tgcgagacga cggtggcggg 420 ggatcaggtg gtggaggtag cgggggaggg ggctcaggcg gtacaactac gcctgcacct 480 cgcccaccga ccccagcacc aaccatcgct tcacagcctt tgagcctgcg accagaggca 540 tgtcgccctg ctgcgggcgg tgccgttcat actcgcggac ttgattttgc gtgtgacgtc 600 gtctcgcctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 660 agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggaaacgggg cagaaagaaa 720 ctcctgtata tattcaaaca accatttatg cgaccagtac aaactactca agaggaagat 780 ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgct gagagtgaag 840 ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 900 ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agcgacgtgg ccgggaccct 960 gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1020 cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1080 ggcaaggggc acgatggcct ttaccaggga ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1140 gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1170 <210> 139 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD221ug36 Example Bispecific T-cell Engager <400> 139 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgtaca 60 ggacaggtac agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc aggctggggg gtctctgaga 120 gtctcctgtg aagcctctgg aatcacgttc agtcgcgcgg ccatgggctg gtaccgccag 180 cgtccaggca aggagcgcga acgagtcgca gttgttaata gtgatagcag tacaatatat 240 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca atgccaagaa cacagtgtat 300 ctgcaaatga acagcctgga acctgaggac acggccgtct attactgttg gtccccaggg 360 ttcgggtcct actggggcca ggggacccag gtcaccgttt cctcaccttt gcgagacgac 420 ggtggcgggg gatcaggtgg tggaggtagc gggggagggg gctcaggcgg tacaactacg 480 cctgcacctc gcccaccgac cccagcacca accatcgctt cacagccttt gagcctgcga 540 ccagaggcat gtcgccctgc tgcgggcggt gccgttcata ctcgcggact tgattttgcg 600 tgtgacgtcg tctcgcttgg aggaggcgga agtggcggtg gtgggtcagg cggcggtggg 660 agcggaggag gtggaagcca ccaccaccac caccactag 699

Claims (119)

  1. 사람 CDE22에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일 도메인 항체(isolated
    single domain antibody; sdAb)로서, sdAb는:
    a) CDR1 아미노산 서열 GX1X2X3DX4YX5(서열 번호: 126)(여기서:
    X1는 F 또는 V이고,
    X2는 T 또는 S이고,
    X3은 L, F, 또는 S이고,
    X4는 Y, D, 또는 S이고,
    X5는 V 또는 A이다),
    CDR2 아미노산 서열 X6X7X8X9X10GX11T(서열 번호: 127)(여기서:
    X6는 I 또는 M이고,
    X7은 T, R, G, 또는 S이고,
    X8은 S 또는 N이고,
    X9는 D 또는 S이고,
    X10은 D이거나 부재하고,
    X11은 V 또는 A이다), 및
    CDR3 아미노산 서열 AVDKPFYDGGX12X13YTCPVDFX14S(서열 번호: 128)(여기서:
    X12는 I, N, Y, 또는 S이고,
    X13은 Q, Y, R, 또는 L이고,
    X14는 D 또는 G이다);
    b) CDR1 아미노산 서열 GSX1F X2X3X4 X5V(서열 번호: 129)(여기서:
    X1은 I 또는 T이고,
    X2는 R이거나 부재하고,
    X3은 R, S, 또는 I이고,
    X4는 I, S, 또는 T이고,
    X5는 A, S, 또는 T이다),
    CDR2 아미노산 서열 ITSX6GX7X8(서열 번호: 130)(여기서:
    X6은 G, S, 또는 A이고,
    X7은 E, D, 또는 S이고,
    X8은 T 또는 S이다), 및
    CDR3 아미노산 서열 NAX9X10GX11X12X13X14(서열 번호: 131)(여기서:
    X9는 K 또는 Q이고,
    X10은 W 또는 Y이고,
    X11은 Q, R, 또는 G이고,
    X12는 Y, D, 또는 R이고,
    X13은 E 또는 S이고,
    X14는 Y, D, 또는 H이다);
    c) CDR1 아미노산 서열 GRIX1RSYV(서열 번호: 132)(여기서:
    X1은 F 또는 S이다),
    CDR2 아미노산 서열 IGX2SDT(서열 번호: 133)(여기서:
    X2는 W 또는 C이다), 및
    CDR3 아미노산 서열 AX3X4SPPYGPQRDEFX5Y(서열 번호: 134)(여기서:
    X3는 A 또는 E이고,
    X4는 N 또는 Y이고,
    X5는 G 또는 D이다);
    d) CDR1 아미노산 서열 G X1TX2SVYX3(서열 번호: 135)(여기서:
    X1은 R 또는 G이고,
    X2는 S 또는 F이고,
    X3은 G 또는 T이다),
    CDR2 아미노산 서열 X4X5X6SX7GX8T(서열 번호: 136)(여기서:
    X4는 M 또는 I이고,
    X5는 S 또는 R이고,
    X6은 W 또는 G이고,
    X7은 G이거나 부재하고,
    X8은 P 또는 G이다),
    CDR3 아미노산 서열 AVRIRRTLX9EPLTKETLYDY(서열 번호: 137)(여기서:
    X9는 L 또는 V이다);
    e) 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16);
    f) 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10);
    g) 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13);
    h) 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36);
    i) 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61);
    j) 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62);
    k) 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-24);
    l) 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48); 또는
    m) 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64)을 포함하는, 단일 도메인 항체.
  2. 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일 도메인 항체(sdAb)로서, sdAb가:
    A)
    i) 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6),
    ii) 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10),
    iii) 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13),
    iv) 서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14),
    v) 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36),
    vi) 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61),
    vii) 서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74),
    viii) 서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75),
    ix) 서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77),
    x) 서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80),
    xi) 서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87),
    xii) 서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93),
    xiii) 서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2),
    xiv) 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62),
    xv) 서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66),
    xvi) 서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10),
    xvii) 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16),
    xviii) 서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23),
    xix) 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열 57(hCD22pas-24),
    xx) 서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32),
    xxi) 서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33),
    xxii) 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48),
    xxiii) 서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55),
    xxiv) 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64),
    xxv) 서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-72),
    xxvi) 서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79), 또는
    xxvii) 서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82)을 포함하는, 단리된 단일 도메인 항체.
  3. 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일 도메인 항체(sdAb)로서, sdAb가:
    A)
    i) 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6),
    ii) 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10),
    iii) 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-13),
    iv) 서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-14),
    v) 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36),
    vi) 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 17에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-61),
    vii) 서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74),
    viii) 서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-75),
    ix) 서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 26에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-77),
    x) 서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 29에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-80),
    xi) 서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 32에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-87),
    xii) 서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-93),
    xiii) 서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 38에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-2),
    xiv) 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 41에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-62),
    xv) 서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 44에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22100ug-66),
    xvi) 서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 47에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-10),
    xvii) 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 50에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-16),
    xviii) 서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 53에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-23),
    xix) 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-24),
    xx) 서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-32),
    xxi) 서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-33),
    xxii) 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 65에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-48),
    xxiii) 서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 68에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-55),
    xxiv) 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 71에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-64),
    xxv) 서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 74에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-72),
    xxvi) 서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 77에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-79), 또는
    xxvii) 서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호: 80에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD22pas-82); 또는
    B) 부분 A) i) 내지 xxviii) 중 어느 하나에 정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열에 대해 적어도 80% 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단일 도메인 항체.
  4. 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 단리된 VHH 단일 도메인 항체(sdAb)로서, sdAb가:
    A)
    i) 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    ii) 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    iii) 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    iv) 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    v) 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    vi) 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    vii) 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    viii) 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    ix) 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    x) 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xi) 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xii) 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xiii) 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xiv) 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xv) 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xvi) 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xvii) 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xviii) 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xix) 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xx) 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxi) 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxii) 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxiii) 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxiv) 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xv) 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xvi) 서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열, 또는
    xvii) 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단일 도메인 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    A)
    i) 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    ii) 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    iii) 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    iv) 서열 번호: 10에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    v) 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    vi) 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 18에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    vii) 서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    viii) 서열 번호: 22에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 24에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    ix) 서열 번호: 25에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 27에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    x) 서열 번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 30에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xi) 서열 번호: 31에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xii) 서열 번호: 34에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 36에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xiii) 서열 번호: 37에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 39에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xiv) 서열 번호: 40에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xv) 서열 번호: 43에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 45에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xvi) 서열 번호: 46에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 48에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xvii) 서열 번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 51에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xviii) 서열 번호: 52에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 54에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xix) 서열 번호: 55에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 57에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xx) 서열 번호: 58에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 60에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxi) 서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxii) 서열 번호: 64에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 66에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxiii) 서열 번호: 67에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 69에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxiv) 서열 번호: 70에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 72에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxv) 서열 번호: 73에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 75에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열,
    xxvi) 서열 번호: 76에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 78에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열, 또는
    xxvii) 서열 번호: 79에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열, 및 서열 번호: 81에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단일 도메인 항체.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, A) 서열 번호: 85 내지 112 및 120 내지 125 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 B) 이의 전체 길이에 걸쳐 서열 번호: 82 내지 108 및 120 내지 125 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 sdAb.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, A) 서열 번호: 82 내지 108 및 120 내지 125 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 sdAb.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 낙타과(camelid) sdAb인, 단리된 sdAb.
  9. 제8항에 있어서, 라마(lama) sdAb인, 단리된 sdAb.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 사람화되는, 단리된 sdaB.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CD22에 대한 친화성이 2.5 x 10-7 nm 이하인, 단리된 sdaB.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CD22에 대한 친화성이 3 x 10-8 nm 이하인, 단리된 sdaB.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CD22에 대한 친화성이 9.6 x 10-9 nm 이하인, 단리된 sdaB.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CD22에 대한 친화성이 9.3 x 10-10 nm 이하인, 단리된 sdaB.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CD22에 대한 친화성이 7 x 10-12 nm 이하인, 단리된 sdaB.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CD22의 제1의 Ig-유사 도메인(Ig-like domain)에 결합하는, 단리된 sdAb.
  17. 제16항에 있어서, 항체가 서열 번호: 91(hCD221ug-80)을 포함하는, 단리된 sdAb.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CD22의 제4의 Ig-유사 도메인에 결합하는, 단리된 sdAb.
  19. 제18항에 있어서, 항체가 서열 번호: 84(hCD221ug-13)를 포함하는, 단리된 sdAb.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CD22의 제6의 Ig-유사 도메인에 결합하는, 단리된 sdAb.
  21. 제20항에 있어서, 항체가 서열 번호: 84(hCD221ug-13), 서열 번호: 91(hCD221ug-80), 서열 번호: 86(hCD221ug-36), 또는 서열 번호: 105(hCD221pas-64)를 포함하는, 단리된 sdAb.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CD22의 제7의 Ig-유사 도메인에 결합하는, 단리된 sdAb.
  23. 제22항에 있어서, 항체가 서열 번호: 87(hCD221ug-61), 서열 번호: 83(hCD221ug-10), 또는 서열 번호: 100(hCD22pas-24)을 포함하는, 단리된 sdAb.
  24. CD22에 대한 특이적인 결합(specific binding)에 대해 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 단리된 sdAb와 경쟁하는 단일 도메인 항체(sdAb).
  25. 제24항에 있어서, 낙타과(Camelidae) sdAb인, sdAb.
  26. 제25항에 있어서, 라마 sdAb인, sdAb.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 사람화되는, sdAb.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 sdAb를 포함하는 재조합 폴리펩타이드(recombinant polypeptide).
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 sdAb를 포함하는 제1의 항원-결합 부위(antigen-binding portion), 및
    제2의 항원-결합 부위를 포함하는 다가 항체(multivalent antibody).
  30. 제29항에 있어서, 제2의 항원-결합 모이어티(moiety)가 면역 세포의 세포-표면 마커(cell-surface marker)에 특이적으로 결합하는, 다가 항체.
  31. 제30항에 있어서, 면역 세포의 세포-표면 마커가 T-세포 마커를 포함하는, 다가 항체.
  32. 제31항에 있어서, T-세포 마커가 사람 CD3을 포함하는, 다가 항체.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단에서 C-말단 방향으로:
    - 제1의 항원-결합 부위,
    - 아미노산 링커(linker), 및
    - 제2의 항원-결합 부위를 포함하는, 다가 항체.
  34. 제33항에 있어서, N-말단 신호 펩타이드를 추가로 포함하는, 다가 항체.
  35. 제34항에 있어서, 신호 펩타이드가 바람직하게는 서열 번호: 110을 포함하는, 사람 CD28로부터의 신호 펩타이드인, 다가 항체.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 링커가 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지(polypeptide hinge)를 포함하는, 다가 항체.
  37. 제36항에 있어서, 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지가 서열 번호: 112를 포함하는, 다가 항체.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 아미노산 링커가 N-말단에서 C-말단 방향으로, 서열 번호: 111, 112, 및 118을 포함하는, 다가 항체.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 119에 의해 암호화되는, 다가 항체.
  40. 제30항에 있어서, 면역 세포 마커의 세포-표면 마커가 천연 킬러(natural killer; NK) 세포 마커를 포함하는, 다가 항체.
  41. 제40항에 있어서, NK 세포 마커가 사람 CD16을 포함하는, 다가 항체.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, NK 세포의 활성화, 확장, 및/또는 생존을 자극하기 위한 사이토킨을 추가로 포함하는, 다가 항체.
  43. 제42항에 있어서, NK 세포의 확장을 자극하기 위한 사이토킨이 인터류킨(interleukin)-15(IL15)인, 다가 항체.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 NK 세포 마커에 결합하는 제3의 항원-결합 부위를 추가로 포함하는, 다가 항체.
  45. 제44항에 있어서, 제2의 NK 세포 마커가 사람 NKp46인, 다가 항체.
  46. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 종양-관련 항원(tumor-associated antigen)에 결합하는 제3의 항원-결합 부위를 적어도 추가로 포함하고, 바람직하게는 여기서 종양-관련 항원이 사람 CD22와는 구별되는, 다가 항체.
  47. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 종양-관련 항원에 결합하는 제3의 항원-결합 부위를 적어도 추가로 포함하고, 바람직하게는 여기서 종양-관련 항원이 사람 CD22와는 구별되는, 다가 항체.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 제3의 항원-결합 부위가 VHH, VNAR, 또는 scVF를 포함하는, 다가 항체.
  49. 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 항원-결합 부위가 VHH, VNAR, 또는 scVF를 포함하는, 다가 항체.
  50. 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 혈청 알부민에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는, 다가 항체.
  51. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 이특이적인 T-세포 인게이저(T-cell engager)인, 다가 항체.
  52. 제40항 또는 제41항에 있어서, 이특이적인 킬러 세포 인게이저(bispecific killer cell engager; BiKE)인, 다가 항체.
  53. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 삼특이적인 킬러 세포 인게이저(trispecific killer cell engager; TriKE)인, 다가 항체.
  54. 제29항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, sdAb가:
    서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug36); 또는
    서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug13)을 포함하는, 다가 항체.
  55. 제29항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, sdAb가 서열 번호: 86 (hCD221ug36) 또는 서열 번호: 84(hCD221ug13)를 포함하는, 다가 항체.
  56. 제28항에 따른 재조합 폴리펩타이드, 또는 제29항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 다가 항체를 암호화하는 재조합 핵산 분자.
  57. 암(cancer) 또는 자가면역 질환(autoimmune disease)의 치료를 위한, 제29항 내지 제55항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 다가 항체의 용도.
  58. 대상체(subject)에게 제29항 내지 제55항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 다가 항체를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  59. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 VHH sdAb를 포함하는, 사람 CD22에 결합하는, 키메라 항체 수용체(chimeric antibody receptor; CAR).
  60. 제59항에 있어서, N-말단에서 C-말단 방향으로:
    - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 sdAb를 포함하는 CD22 결합 도메인,
    - 폴리펩타이드 힌지,
    - 막관통 도메인(transmembrane domain), 및
    - 신호전달 도메인(signaling domain)을 포함하는 세포질성 도메인을 포함하고, 바람직하게는 여기서 세포질성 도메인이 공-자극성 도메인(co-stimulatory domain)을 추가로 포함하는, CAR.
  61. 제60항에 있어서, 폴리펩타이드 힌지가 CD8 힌지 도메인인, CAR.
  62. 제61항에 있어서, CD8 힌지 도메인인 서열 번호: 112를 포함하는, CAR.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인이 CD28 막관통 도메인인, CAR.
  64. 제63항에 있어서, CD28 막관통 도메인이 서열 번호: 113을 포함하는, CAR.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 신호전달 도메인이 CD3-제타 신호전달 도메인(CD3-zeta signaling domain)인, CAR.
  66. 제65항에 있어서, CD3-제타 신호전달 도메인이 서열 번호: 115를 포함하는, CAR.
  67. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 공-자극성 도메인이 4-1BB 공-자극성 도메인인, CAR.
  68. 제67항에 있어서, 4-1BB 신호 형질도입(transduction) 도메인이 서열 번호: 114를 포함하는, CAR.
  69. 제60항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, sdAb와 폴리펩타이드 힌지 사이에 가요성 아미노산 링커(flexible amino acid linker)를 추가로 포함하는, CAR.
  70. 제69항에 있어서, 가요성 아미노산 링커가 서열 번호: 111을 포함하는, CAR.
  71. 제59항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩타이드를 추가로 포함하는, CAR.
  72. 제71항에 있어서, 신호 펩타이드가 사람 CD28로부터의 신호 펩타이드이고, 바람직하게는 여기서 사람 CD28로부터의 신호 펩타이드가 서열 번호: 110을 포함하는, CAR.
  73. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 119에 의해 암호화되는, CAR.
  74. 제58항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, sdAb가 서열 번호: 86(hCD221ug-36), 서열 번호: 83(hCD221ug-10), 서열 번호: 87(hCD221ug-61), 서열 번호: 82(hCD221ug-6), 서열 번호: 88(hCD221ug-74), 서열 번호: 85(hCD221ug-14), 서열 번호: 102(hCD22pas-33), 또는 서열 번호: 84(hCD221ug-13)를 포함하는, CAR.
  75. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, VHH sdAb가:
    서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-10)을 포함하는, CAR.
  76. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, VHH sdAb가:
    서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-36)을 포함하는, CAR.
  77. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, VHH sdAb가:
    서열 번호: 19에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 20에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-74)을 포함하는, CAR.
  78. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, VHH sdAb가:
    서열 번호: 61에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 62에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 63에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221pas-33)을 포함하는, CAR.
  79. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, VHH sdAb가:
    서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 CDR1 아미노산 서열,
    서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 CDR2 아미노산 서열, 및
    서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 CDR3 아미노산 서열(hCD221ug-6)을 포함하는, CAR.
  80. 제59항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, CD22 결합 도메인과 관련하여 N-말단적으로 또는 C-말단적으로 위치하고, CD22 결합 도메인에 아미노산 링커에 의해 연결된 추가의 결합 도메인을 추가로 포함하는, CAR.
  81. 제80항에 있어서, 추가의 결합 도메인이 CD22에 결합하는, CAR.
  82. 제81항에 있어서, 추가의 결합 도메인이 CD22 결합 도메인의 sdAb와는 상이한 제2의 sdAb를 포함하는, CAR.
  83. 제82항에 있어서, 제2의 sdAb가 CD22 결합 도메인의 sdAb와 비교하여 CD22의 상이한 에피토프(epitope)에 결합하는, CAR.
  84. 제81항에 있어서, 추가의 결합 도메인이 CD22 결합 도메인의 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 sdAb를 포함하는 제2의 sdAb를 포함하고, 바람직하게는 여기서 제2의 sdAb가 CD22 결합 도메인의 sdAb와 동일한, CAR.
  85. 제80항에 있어서, 추가의 결합 도메인이 CD22와는 상이한 분자에 결합하는, CAR.
  86. 제80항에 있어서, 추가의 결합 도메인이 제2의 sdAb를 포함하는, CAR.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, CD22 및 CD22와는 상이한 분자가 동일한 표적 세포(target cell)에 의해 발현되는, CAR.
  88. 제59항 내지 제87항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 CAR을 암호화하는 재조합 핵산 분자.
  89. 제88항에 정의된 바와 같은 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector).
  90. 제89항에 있어서, 바이러스 벡터인, 벡터.
  91. 제90항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  92. 제88항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 입자.
  93. 제92항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 입자인, 재조합 바이러스 입자.
  94. 제88항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포.
  95. 세포 표면 막에서 제59항 내지 제87항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 CAR을 발현하는 가공된 세포(engineered cell).
  96. 제95항에 있어서, 면역 세포인, 가공된 세포.
  97. 제96항에 있어서, 면역 세포가 T-림프구로부터 유래되는, 가공된 세포.
  98. 암 또는 자가면역 질환의 치료를 위한, 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 따른 가공된 세포의 용도.
  99. 제57항 또는 제98항에 있어서, 암이 혈액학적 악성종양(hematological malignancy)인, 용도.
  100. 제99항에 있어서, 혈액학적 악성종양이 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 또는 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome)인, 용도.
  101. 제100항에 있어서, 백혈병이 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia; AML), 만성 림프구성 백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoid leukemia; ALL), 및 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphoid leukemia; CLL)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
  102. 제100항에 있어서, 림프종이 다발 골수종(multiple myeloma), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소 세포 소포 림프종(small cell follicular lymphoma), 및 거대 세포 소포 림프종(large cell follicular lymphoma)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
  103. 대상체(subject)에게 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 가공된 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  104. 제58항 또는 제103항에 있어서, 암이 혈액학적 악성종양인, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 혈액학적 악성종양이 벡혈병, 림프종, 또는 골수이형성 증후군인, 방법.
  106. 제105항에 있어서, 백혈병이 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)인, 방법.
  107. 제105항에 있어서, 림프종이 다발 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소 세포 소포 림프종, 및 거대 세포 소포 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  108. - 제1의 항원-결합 부위,
    - 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지를 포함하는 아미노산 링커, 및
    - 제2의 항원-결합 부위를 포함하는, 다가 항체.
  109. 제108항에 있어서, 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지가 서열 번호: 112를 포함하는, 다가 항체.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, 아미노산 링커가 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지에 대해 적어도 하나의 G4S N-말단, 및 사람 CD8로부터의 폴리펩타이드 힌지에 대해 적어도 하나의 G4S C-말단을 추가로 포함하는, 다가 항체.
  111. 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 링커가, 길이가 적어도 47개 잔기, 바람직하게는 길이가 적어도 52개 잔기, 바람직하게는 길이가 적어도 57개 잔기, 보다 바람직하게는 길이가 적어도 62개 잔기, 심지어 보다 바람직하게는 길이가 적어도 67개 잔기인, 다가 항체.
  112. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 링커가 N-말단에서 C-말단 방향으로, 서열 번호: 111, 112, 및 118을 포함하는, 다가 항체.
  113. 제108항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 항원-결합 부위가 사람 CD22에 특이적으로 결합하는, 다가 항체.
  114. 제113항에 있어서, 제1의 항원-결합 부위가 VHH, VNAR, 또는 scVF인, 다가 항체.
  115. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 항원-결합 부위가 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 sdAb인, 다가 항체.
  116. 제108항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 항원-결합 모이어티가 면역 세포의 세포-표면 마커에 특이적으로 결합하는, 다가 항체.
  117. 제116항에 있어서, 면역 세포의 세포-표면 마커가 T-세포 마커를 포함하는, 다가 항체.
  118. 제117항에 있어서, T-세포 마커가 사람 CD3을 포함하는, 다가 항체.
  119. 제108항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 항원 결합 부위가 VHH, VNAR, 또는 scVF인, 다가 항체.
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