TW201920657A - 藉由細胞表現之調控生物活性的抗體 - Google Patents

Abstract

本發明提供，在計劃性細胞死亡1蛋白質(Programmed Cell Death 1 protein，PD-1)和/或T細胞免疫球蛋白質及含有黏蛋白質域-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3，TIM-3)陽性細胞中，干擾PD-1和TIM-3所介導的抑制的手段和方法。一種方法可包含使所述細胞與抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物接觸，其中前述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至TIM-3的胞外部分的可變域，藉此抑制所述細胞中由PD-1和/或TIM-3所介導的活性。本發明亦提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至TIM-3的胞外部分的可變域的抗體或其變異體。

Description

藉由細胞表現之調控生物活性的抗體

本發明係有關於抗體領域。特別地，其有關於用於治療涉及異常細胞的疾病的治療性抗體領域。更特別地，其有關於結合二或更多種膜相關蛋白質(membrane associated protein)的胞外部分，且藉此調節細胞表現的生物活性的抗體。

僅管在疾病的治療上已有許多進步及導致癌症的分子事件的知識的增長，在世界上癌症仍為死亡的主要原因。舉例而言，大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是全世界第三常見的癌症。在2008年，123萬人被診斷出有此疾病。在歐洲，大腸癌為第二常見的癌症，其中在2012年約診斷出447,000起新案例(佔全部的13%)。大腸癌為第四常見的癌症死因，估計是每年608,000(歐洲148,000)起死亡的原因。雖然一些新的治療在CRC中已有進步，但許多都在臨床試驗中失敗；轉移性CRC大部分用傳統治療仍無法治癒。黑色素瘤(melanoma)是非常頻繁發生的癌症的另一範例。當不夠早偵測到時，此癌症很可能在很難治療的階段轉移。免疫干預治療(immune-intervention treatment)已經顯示出對至少一些有轉移性黑色素瘤的患者是有效的。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)是一種很少在夠早的階段發現，以進行手術的癌症種類。這些種類的癌症也已經成功地用免疫干預治療進行治療。

傳統上，大部分的癌症藥物的發現聚焦於阻斷基本的細胞功能和殺死分裂細胞之試劑。然而，在癌症末期(advanced cancer)的情況下，不論多積極地使用，甚至到了病人因治療而遭受生命威脅的副作用所苦，化學療法很少產生完全的治癒。在大部分情況下，病人中的腫瘤停止生長或暫時性縮小(稱為緩解(remission))，卻又開始增殖，有時候更快速(稱為復發(relapse))，且變得越來越更難以治療。最近，癌症藥物的發展的焦點已從廣效地細胞毒殺化學療法移至較低毒性的標靶細胞抑制療法(targeted cytostatic therapy)。癌症末期的治療已在臨床上於血癌(leukemia)和一些其他癌症中驗證。然而，在大部分的惡性腫瘤中，標靶方法仍證實沒有有效到能完全地清除大部分病人中的癌症。

已經使用各種不同的方法，包含例如導向癌症依賴用於生存及/或生長的訊息傳遞蛋白質的小分子；有腫瘤特異性的蛋白質之疫苗；具有主動地殺死腫瘤細胞的免疫細胞之細胞療法和將腫瘤作為細胞毒殺分子的標靶之抗體；干擾訊息傳遞之抗體及/或將宿主的免疫系統(重)導向至腫瘤細胞之抗體，來實現以癌症為標靶。

本發明提供將免疫系統成分(component)(重)導向之新穎手段及方法。本發明亦有關於調節由細胞表現的生物活性之手段及方法。

本發明提供一種在計劃性細胞死亡1蛋白質(Programmed Cell Death 1 protein，PD-1)和/或T細胞免疫球蛋白質及含有黏蛋白質域-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3，TIM-3)陽性細胞中，干擾PD-1和TIM-3所介導的抑制的方法，此方法包含使所述細胞與抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物接觸，其中前述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含 -可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及 -可結合至TIM-3的胞外部分的可變域，藉此抑制所述細胞中由PD-1和/或TIM-3所介導的活性。

本發明亦提供一種刺激免疫突觸的形成、穩定性和/或活性的方法，包括提供包含至少兩種能夠透過免疫突觸彼此結合的細胞的系統，且對所述系統提供抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中前述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含 -可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及 -可結合至TIM-3的胞外部分的可變域， 藉此刺激免疫突觸在所述至少兩種細胞之間的形成、穩定性和/或活性。

更提供一種抗體或其變異體，其包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及可結合至TIM-3的胞外部分的可變域。

更提供一種抗體或其變異體，其包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及可結合至TIM-3的胞外部分的可變域；其中可結合PD-1的可變域包含具有CDR3區的重鏈可變區，前述重鏈可變區包含第3圖中的MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974或MF6982，較佳地MF6226；MF6256；或MF6930所描述的VH之一的可變重鏈區的CDR3的胺基酸序列。在一較佳實施例中，可結合PD-1的所述可變域包含具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區，前述重鏈可變區包含第3圖中的MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974或MF6982，較佳地MF6226；MF6256；或MF6930所示的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。

更提供一種抗體或其變異體，其包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及可結合至TIM-3的胞外部分的可變域；其中可結合PD-1的可變域包含重鏈可變區，前述重鏈可變區包含(如第3圖中所示的)MF6076；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；或 MF6982，較佳地MF6226；MF6256；或MF6930所示的可變重鏈區的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。

可結合至TIM-3的胞外部分的可變域較佳地包含具有CDR3區的重鏈可變區，前述重鏈可變區包含如第3圖的MF7676；MF7677；MF7678；或MF7679所示的可變重鏈區的CDR3區的胺基酸序列。較佳地為可結合至TIM-3的胞外部分且包含具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區的可變域，前述重鏈可變區包含第3圖的MF7676；MF7677；MF7678；或MF7679所示的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。

可結合至TIM-3的胞外部分的可變域較佳地包含重鏈可變區，前述重鏈可變區包含如(第3圖的)MF7676；MF7677；MF7678；或MF7679所示的可變重鏈區的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。

本發明的抗體較佳地包括包含如第3圖中所示的MF的胺基酸序列的重鏈可變區。在一較佳實施例中，抗體更包含輕鏈可變區，其包含第1圖中所示的輕鏈可變區的胺基酸序列。在一較佳實施例中，輕鏈包含如第1A圖中所示的胺基酸序列。在一較佳實施例中，重鏈包含IgG1抗體的恆定區，較佳為人類IgG1抗體。在一較佳實施例中，將所述IgG1恆定區的CH2區工程化，以降低抗體的ADCC和/或CDC活性。在一較佳實施例中，CH2區包含如第2E圖中所示的序列。在一較佳實施例中，將抗體的CH3區工程化，以促進重鏈的異質二聚體化(heterodimerization)。 在一較佳實施例中，一條重鏈包含如第2F圖中所示的序列，而另一條重鏈包含如第2G圖中所示的序列。

更提供一種包含一或多個本發明的抗體或其變異體的醫藥組合物。

亦提供一種核酸分子或核酸分子的集合(collection)，其編碼本發明的抗體或其變異體的重鏈或重鏈可變區。

亦提供一種編碼本發明抗體的核酸分子或核酸分子的集合。

亦提供一種包含一或多個核酸分子的細胞，前述核酸分子單獨或一起編碼本發明的抗體或其變異體。也提供如所述地，使用細胞產生本發明的抗體或其變異體，較佳地以及從細胞的培養物中收穫抗體或其變異體的方法。

更提供一種包含本發明的抗體或其變異體的細胞系統。

亦提供一種治療具有涉及異常細胞，例如癌症的疾病或具有病毒或寄生蟲慢性感染的個體的方法，此方法包含對有此需要的個體投予本發明的抗體或其變異體，較佳地本發明的雙特異性抗體或其變異體。

本發明更提供一種本發明的抗體或其變異體；較佳地本發明的雙特異性抗體或其變異體，於具有涉及異常細胞，例如癌症的疾病或具有病毒或寄生蟲慢性感染的個體的治療中的用途。

在一較佳實施例中，寄生蟲是胞內寄生蟲。

更提供一種刺激個體中針對所述個體中的異常細胞的免疫反應的方法，此方法包含對所述個體提供(投予)本發明的抗體或其變異體，較佳為雙特異性抗體或其變異體。異常細胞較佳為癌細胞、感染病毒的細胞、寄生蟲或感染寄生蟲的細胞。 在一較佳實施例中，細胞是癌細胞或贅生細胞(neoplastic cell)。

T細胞衰竭(exhaustion)由許多抑制性受體介導，包含計劃性細胞死亡蛋白質1(programmed cell death protein 1，PD1)、TIM-3和淋巴細胞活化基因3蛋白質 (lymphocyte activation gene 3 protein，LAG3)。TIM3是免疫檢查點受體(immune‐checkpoint receptor)。它是一種可存在於Th1細胞上的蛋白質。它是一種可在小鼠中調節巨噬細胞的活化且增強實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis)的嚴重程度的細胞表面蛋白。CD4陽性T輔助淋巴細胞可根據其細胞激素分泌模式，分為幾種類型(包含第1型(Th1)和第2型(Th2))。Th1細胞及其相關細胞激素參與細胞所介導的對胞內病原體的免疫和遲發性過敏(delayed-type hypersensitivity)反應。TIM-3或HAVCR2以許多化名為人所知，例如A型肝炎病毒細胞受體2(Hepatitis A Virus Cellular Receptor 2)；T細胞免疫球蛋白和含有黏蛋白質域的蛋白質3(T-Cell Immunoglobulin And Mucin Domain-Containing Protein 3)；T細胞免疫球蛋白質黏蛋白質家族成員3(T-Cell Immunoglobulin Mucin Family Member 3)；T細胞免疫球蛋白質黏蛋白質受體3(T-Cell Immunoglobulin Mucin Receptor 3); T細胞膜蛋白質3(T-Cell Membrane Protein 3)；HAVcr-2；TIMD-3；Tim-3；TIMD3；T細胞免疫球蛋白質黏蛋白質3(T Cell Immunoglobulin Mucin 3)；T細胞免疫球蛋白質黏蛋白質-3(T Cell Immunoglobulin Mucin-3)；腎損傷分子-3(Kidney Injury Molecule-3)；CD366；和KIM-3。TIM-3的外部身份為HGNC：18437；Entrez Gene：84868；Ensembl：ENSG00000135077；OMIM：606652；和UniProtKB：Q8TDQ0。

半乳糖凝集素-9(Galectin-9)或LGALS9是TIM-3的已知配位體(ligand)。其以許多不同的名稱為人所知，例如凝集素，半乳糖苷結合可溶性9(Lectin, Galactoside Binding Soluble 9)；凝集素，半乳糖苷-結合可溶性，9(Lectin, Galactoside-Binding, Soluble, 9)；腫瘤抗原HOM-HD-21(Tumor Antigen HOM-HD-21)；愛卡凝集素(Ecalectin)；Gal-9；尿酸鹽轉運/通道蛋白質(Urate Transporter/Channel Protein)；LGALS9A；和HUAT。半乳糖凝集素-9的外部身份為HGNC：6570；Entrez Gene：3965；Ensembl：ENSG00000168961；OMIM：601879；和UniProtKB：O00182。

計劃性細胞死亡1蛋白質(Programmed Cell Death 1 protein，PD-1)是屬於受體的CD28家族的細胞表面受體，且在T細胞及前B細胞(pro-B cell)上表現。目前已知PD-1結合兩個配位體，PD-L1及PD-L2。PD-1，作為免疫檢查點，藉由抑制T細胞的活化，在下調免疫系統中扮演重要角色，接著減少自體免疫並促進自身耐受性(self-tolerance)。PD-1的抑制效果被認為是透過促進淋巴結中抗原特異性T細胞中的細胞凋亡(計劃性細胞死亡)，同時減少調節性T細胞(抑制性T細胞)中的細胞凋亡的雙重機制來實現。PD-1亦以許多不同的化名為人所熟知，例如PDCD1；計劃性細胞死亡1；全身性紅斑性狼瘡易感性2 (Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility 2)；蛋白質PD-1；HPD-1；PD1；計劃性細胞死亡1蛋白質；CD279抗原；CD279；HPD-L；HSLE1；SLEB2；及PD-1。PD-1的外部身份為HGNC：8760；Entrez Gene：5133；Ensembl：ENSG00000188389；OMIM：600244；及UniProtKB：Q15116。阻斷PD-1活性的新型藥物，PD-1抑制子，活化免疫系統以攻擊腫瘤，因此成功用於治療某些類型的癌症。

PD-L1為第1型跨膜蛋白質，其在特定事件的期間，例如懷孕、組織異體移植(tissue allograft)、自體免疫疾病及其他疾病狀態例如肝炎，於抑制免疫反應中起作用。PD-L1與PD-1或B7.1 (CD80)的結合傳遞降低表現PD-1的T細胞的增殖的抑制訊號。PD-1被認為能夠透過細胞凋亡，來控制外來抗原特異性T細胞的累積。PD-L1由多種癌細胞表現，且其表現被認為至少部分地負責減緩針對癌細胞的免疫反應。PD-L1是蛋白質的B7家族的成員，且以其他各種名稱聞名，例如CD274分子；CD274抗原；B7同源物1；PDCD1配位體1；PDCD1LG1；PDCD1L1；B7H1；PDL1；計劃性細胞死亡1配位體1；計劃性死亡配位體1；B7-H1；及B7-H。CD274的外部身份為HGNC：17635；Entrez Gene：29126；Ensembl：ENSG00000120217；OMIM：605402；UniProtKB：Q9NZQ7。

PD-L2是PD-1的第二配位體。PD-1之藉由PD-L2的參與抑制了由T細胞受體(TCR)所介導的增殖及由CD4+ T細胞產生的細胞激素。在低抗原濃度時，PD-L2/PD-1的結合抑制B7-CD28訊息。在高抗原濃度時，PD-L2/PD-1的結合降低細胞激素的產生。藉由干擾素gamma的處理，在抗原呈現細胞上上調PD-L的表現。其在一些正常組織及各種腫瘤中表現。PD-L1及PD-L2被認為具有重疊的功能且調控T細胞的反應。此蛋白質以許多其它名稱為人所知，例如計劃性細胞死亡1配位體2；B7樹突細胞分子；計劃性死亡配位體2；嗜乳脂蛋白質B7-DC (Butyrophilin B7-DC)；PDCD1配位體2；PD-1配位體2 (PD-1 Ligand 2)；PDCD1L2；B7-DC；CD273；B7DC；PDL2；PD-1-配位體2 (PD-1-Ligand 2)；CD273抗原；BA574F11.2；及Btdc。PD-L2的外部身份為HGNC：18731；Entrez Gene：80380；Ensembl：ENSG00000197646；OMIM：605723；及UniProtKB：Q9BQ51。

完成涉及序列識別符(sequence identifier)，以識別那個蛋白質被作為標靶。只要被各自的可變域(variable domain)所辨認的抗原決定基沒有受影響，本發明之抗體亦辨認至少其變異體中的一些，例如其對偶變異體(allelic variant)、剪接變異體(splice variant)及突變變異體。一些替代名稱可能或可能也沒用於指其它蛋白質。給予名稱僅用於參考的目的。本發明之抗體結合至在細胞上表現的蛋白質。只要此抗體結合的抗原決定基可用，其亦可結合至此蛋白質的變異體。因此，只要抗原決定基可用，剪接變異體或突變蛋白質(如果有)亦會被結合。抗體結合至指定的蛋白質意指其可作為一種性質，來結合至蛋白質，且不暗示此抗體實際上被目標結合，雖然它可以。這也不意指此抗體不結合至其它蛋白質。

本發明揭露一種結合PD-1成員的胞外部分(第一膜蛋白質)和TIM-3的胞外部分(第二膜蛋白質)的抗體或其變異體，其較佳是雙特異性抗體或其變異體。這種(雙特異性)抗體更亦被稱為「本發明的抗體或雙特異性抗體」。如本文所述，也提供包含二或更多(雙特異性)抗體的組合物和部分套組(kit of parts)。

抗體通常透過所謂的抗原結合位，來結合其目標。未修飾的抗原結合位通常由抗體的可變域形成且存在於其中。可變域含有所述抗原結合位。結合抗原的可變域是包含結合抗原的抗原結合位的可變域。

在一實施例中，抗體可變域包含重鏈可變區(heavy chain variable region，VH)和輕鏈可變區(light chain variable region，VL)。抗原結合位可存在於組合的VH/VL可變域中，或只在VH區或只在VL區中。當抗原結合位存在於可變域的兩個區的一者中時，對應的可變區可有助於結合可變區的折疊及/或穩定性，但不顯著地有助於抗原自身的結合。

如本文所使用，抗原結合是指抗體對其抗原的典型結合能力。可以用各種方式，來評估抗體與抗原的結合。一種方式是將抗體與抗原(較佳地為表現抗原的細胞)一起培養，移除未結合的抗體(較佳藉由洗滌步驟)，且藉由結合至結合的抗體的經標記之抗體，來偵測結合的抗體。

與蛋白質的隨機、非特異性附著不同，通常透過抗體的互補決定區(complementarity determining region，CDR)及抗原和可變域的特定三維結構，從而允許這兩個結構精準地結合在一起(類似鎖和鑰匙的交互作用)，來介導經抗體的抗原結合。由於抗體通常辨認部分抗原，其稱為抗原的抗原決定基，因此這樣的抗原決定基也可存在於其它化合物中，如果這樣的其它化合物含有相同的抗原決定基，根據本發明之抗體也可辨認其它蛋白質。因此，術語「結合」不排除抗體結合至含有相同抗原決定基的另一蛋白質或蛋白質們。這種其它蛋白質較佳地不是人類蛋白質。

本發明之蛋白質，例如抗體，除了在出生後，較佳地為成年人類的細胞膜上的特定目標蛋白質以外，通常不會結合至其它蛋白質。

如本文所使用的術語「抗體」意指蛋白質(proteinaceous)分子，較佳地屬於蛋白質的免疫球蛋白質類型，其含有一或多個結合抗原上的抗原決定基的可變域，其中這樣的結構域(domain)衍生自或與抗體的可變域共有序列同源性(sequence homology)。用於治療用途的抗體較佳地儘可能地接近待治療受試者的天然抗體(例如人類抗體用於人類受試者)。可用特異性(specificity)及親和力(affinity)來表示抗體結合。特異性決定那個抗原或其抗原決定基被結合域(binding domain)特異性地結合。親和力是與特定抗原或抗原決定基結合的強度的度量(measure)。較佳地，根據本發明之抗體的個別手臂的親和力在奈米莫耳範圍內。抗體，例如本發明之雙特異性抗體，通常包含天然抗體的恆定域(Fc部分)，其可如本文其它地方所述地被工程化，例如，以促進異質二聚體化(heterodimerization)或以降低ADCC及/或CDC活性。本發明之抗體通常為雙特異性全長抗體，較佳地為人類IgG次類(subclass)的雙特異性全長抗體。

可變域由重鏈的可變區及輕鏈的可變區所構成。重鏈的可變區通常由重新排列的VDJ區形成。輕鏈的可變區通常由重新排列的VJ區形成。現在也可使用，例如可獲得的功能性抗體的大量序列資訊，來人工產生VDJ/VJ區。

本發明之抗體較佳地為「全長」抗體。根據本發明之術語「全長」被定義為包含基本上完整的抗體，沒有一或多個尺寸大於20個胺基酸殘基的人工添加基團(moiety)，例如額外的抗原結合位或額外的活化位或額外的配位體或額外的配位體結合基團。然而，全長抗體不一定具有完整抗體的所有功能。為避免疑慮，全長抗體含有兩條重鏈及兩條輕鏈。各鏈含有恆定(constant，C)和可變(variable，V)區，其可被拆解成標記為CH1、CH2、CH3、重鏈為VH及CL、VL為輕鏈的結構域。重鏈的結構域較佳地以天然抗體的順序存在(VH-CH1-CH2-CH3；意指VH域鄰近CH1域，接著是CH2域，再接著是CH3域)。輕鏈的結構域亦較佳地以天然抗體的順序存在(VL-CL；意指VL域鄰近CL域)。抗體藉由Fab片段部分中含有的可變域結合至抗原。抗體可透過恆定域，大部分透過Fc部分與免疫系統的分子及細胞交互作用。

在一些實施例中，本發明之抗體為IgG，較佳地為全長IgG。全長IgG抗體是較佳的，因為其通常具有有利的半衰期，且由於為了免疫原性的理由，希望保持靠近完全地自體(人類)分子。在一些實施例中，本發明之抗體為全長IgG1、全長IgG2、全長IgG3或全長IgG4抗體。

根據本發明之全長抗體包含其中可存在提供期望的特性或僅是原始鏈中的那些的替代物的突變的抗體。這樣的突變不應該是任何區的實質部分的缺失。然而，其中一或多個胺基酸殘基為酸插入、缺失、取代或前述之組合，但基本上沒有改變所得抗體的抗原結合特性的抗體被包含在術語「全長抗體」內。舉例而言，IgG抗體可在恆定區中具有1至20個胺基酸殘基插入、取代、缺失或前述之組合。

本發明之抗體或其功能部分、衍生物及/或類似物較佳地為雙特異性抗體或其功能部分、衍生物及/或類似物。在一較佳實施例中，其為具有降低的效應子功能的雙特異性IgG抗體。在一較佳實施例中，本發明之抗體為雙特異性全長抗體。本發明之抗體較佳地為雙特異性全長IgG抗體，較佳在CH2/低鉸鏈區中突變，以降低效應子功能。基於IgG1在人類中的長循環半衰期，在CH2/低鉸鏈區中突變以減少效應子功能的IgG1是有利的。為了防止人類中任何的免疫原性，根據本發明之雙特異性抗體為人類抗體是較佳的。

術語「雙特異性(bispecific，bs)」意指抗體(如以上所定義)的一部分結合至抗原上的一個抗原決定基，而第二部分結合至相同抗原或不同抗原上的不同抗原決定基。不同的抗原決定基通常存在於不同的抗原上。然而，不同的抗原決定基也可存在於相同的抗原上。根據本發明，所述第一和第二抗原事實上為兩個不同蛋白質。較佳的雙特異性抗體為包括兩個不同單株抗體的一些部分的抗體，因此可結合至兩個不同的抗原決定基，較佳地為兩個不同的抗原上的兩個不同的抗原決定基。取決於被雙特異性抗體辨認的這兩個抗原的表現量(expression level)、(次)細胞定位及化學計量，抗體的兩個Fab臂可能或可能不會同時地結合其抗原決定基。雙特異性抗體的一手臂通常含有一抗體的可變域，而另一臂含有另一抗體的可變域(即，雙特異性抗體的一臂藉由一重鏈配對一輕鏈來形成；而另一個臂藉由不同的重鏈配對輕鏈來形成)。本發明之雙特異性抗體的重鏈可變區通常彼此不同，而在本發明之雙特異性抗體中，輕鏈可變區較佳地為相同。其中不同重鏈可變區與相同或共同輕鏈可變區連結(associate)的雙特異性抗體亦被稱為具有共同輕鏈可變區(common light chain variable region，cLcv)的雙特異性抗體。較佳地，輕鏈恆定區也是相同的。這樣的雙特異性抗體被稱為具有共同輕鏈(common light chain，cLc)。因此，更提供根據本發明之雙特異性抗體，其中兩個手臂包含共同輕鏈。

如本文所述的雙特異性抗體較佳地包含共同輕鏈可變域、較佳地為共同輕鏈。根據本發明之術語「共同輕鏈」是指可相同或具有一些胺基酸序列差異，而全長抗體的結合特異性不受影響的輕鏈。舉例而言，在本文所使用的共同輕鏈的定義範圍內，例如藉由導入和測試保守性胺基酸改變、在當與重鏈配對時，沒有或只有部分助於結合特異性的區域中的胺基酸的改變及前述類似方法，來製備或發現不相同但功能上等價的輕鏈是可能的。有或沒有添加術語「重新排列」，術語「共同輕鏈」、「共同LC」、「cLC」、「單一輕鏈」皆可在本文互換使用。有或沒有添加術語「重新排列」，術語「共同輕鏈可變區」、「共同VL」、「共同LCv」、「cLCv」、「單一VL」皆可在本文互換使用。本發明的一較佳面向是雙特異性抗體具有共同輕鏈(可變區)，其可與至少兩個，且較佳為多個不同結合特異性的重鏈(可變區)組合，以形成具有功能性抗原結合域的抗體(WO2009/157771)。共同輕鏈(可變區)較佳地為人類輕鏈(可變區)。共同輕鏈(可變區)較佳地具有生殖序列(germline sequence)。較佳的生殖序列為人類庫(repertoire)中常用且具有良好的熱力學穩定性、產量及可溶性的輕鏈可變區。較佳的生殖輕鏈為O12。共同輕鏈較佳地為重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (第1A圖)。共同輕鏈可變區較佳地為重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01的可變區。共同輕鏈較佳地包含如第1B或1D圖所示的輕鏈可變區，其中具有0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合。共同輕鏈較佳地更包含輕鏈恆定區，較佳地kappa輕鏈恆定區。可針對用來表現共同輕鏈蛋白質的細胞系統，將編碼共同輕鏈的核酸密碼子最佳化(codon optimize)。編碼的核酸可偏離生殖核酸序列(germ-line nucleic acid sequence)。

在一較佳實施例中，輕鏈包括包含如第1A圖所示的O12 / IgVκ1-39*01基因片段的胺基酸序列，其中具有0至10個、較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合的輕鏈區。詞組「O12輕鏈」將在整份說明書中作為「包括包含如第1A圖所繪示的O12/IgVκ1-39*01基因片段的胺基酸序列，其具有0至10個、較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合的輕鏈可變區的輕鏈」的縮寫。IgVκ1-39是免疫球蛋白質可變kappa 1至39基因(Immunoglobulin Variable Kappa 1-39 Gene)的縮寫。此基因也以免疫球蛋白質kappa可變1至39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12為人所熟知。此基因的外部身份為HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。第1E圖給予了IgVκ1-39的較佳胺基酸序列。這列出了V區的序列。V區可與五個J區中的一個組合。第1B和1D圖描述與J區組合的IgVκ1-39的兩個較佳序列。連接的序列被標示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (根據IMGT資料庫全球網站imgt.org命名)。

包含輕鏈可變區的O12/IgVκ1-39*01為生殖序列是較佳的。更佳地，包含輕鏈可變區的IGJκ1*01或IGJκ5*01為生殖序列。在一較佳實施例中，IGKV1-39/jk1或IGKV1-39/jk5輕鏈可變區為生殖序列。

在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含生殖O12/IgVκ1-39*01。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。輕鏈可變區較佳地包含生殖kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或生殖kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ5*01，較佳地生殖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。

相對於生殖序列，即有機體的非淋巴細胞中的正常序列，產生具有O12輕鏈的抗體的成熟B細胞常常產生已經歷一或多個突變的輕鏈。負責這些突變的過程常被稱為體細胞(超)突變(somatic (hyper)mutation)。產生的輕鏈被稱為親和力成熟的輕鏈(affinity matured light chain)。當衍生自O12生殖序列時，這樣的輕鏈是O12-衍生輕鏈。在本說明書中，詞組「O12輕鏈」將包含O12-衍生輕鏈。藉由體細胞超突變導入的突變當然也可在實驗室中人工導入。在實驗室中，其它突變也可被導入，而不影響輕鏈在種類方面，不一定是量方面的性質。如果輕鏈包含如第1A、1B、1D或1E圖中所示的序列，其中具有0至10個，較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合，則輕鏈至少是O12輕鏈。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A、1B、1D或1E圖中所示的序列的輕鏈，其中具有0至9個、0至8個、0至7個、0至6個、0至5個、0至4個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A、1B、1D或1E圖中所示的序列的輕鏈，其中具有0至5個、較佳0至4個、更佳0至3個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A、1B、1D或1E圖中所示的序列的輕鏈，其中具有0至2個、較佳0至1個、最佳0個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A圖或第1B圖中所示的序列的輕鏈，其具有所提及的胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，輕鏈包含第1A圖的序列。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含第1B圖的序列。

共同輕鏈(可變區)可為lambda輕鏈，因此這也在本發明的背景中提供，但是kappa輕鏈是較佳的。本發明的共同輕鏈的恆定部分可為kappa或lambda輕鏈的恆定區。其較佳地為kappa輕鏈的恆定區，較佳地其中所述共同輕鏈為生殖輕鏈，較佳地為包含IgVKl-39基因片段的重新排列之生殖人類kappa輕鏈，最佳地為重新排列之生殖人類kappa輕鏈IgVKl-39*01/IGJKl*01 (第1圖)。術語重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39輕鏈或縮寫huVκ1-39或僅1-39可在整份申請案中交換使用。顯然地，本發明所屬技術領域中具有通常知識者會理解的是，「共同」亦指胺基酸序列不同的輕鏈的功能等價物。存在所述輕鏈的許多變異體，其中存在不影響功能性結合區的形成的突變(缺失、取代、添加)。

IgVκ1-39是免疫球蛋白質可變kappa 1至39基因 (Immunoglobulin Variable Kappa 1-39 Gene)的縮寫。此基因亦以免疫球蛋白質kappa可變 1至39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12為人所熟知。此基因的外部身份為HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。第1圖中給予了IgVκ1-39的較佳胺基酸序列。這列出了V區的序列。V區可與五個J區中的一個組合。第1圖描述與J區組合的IgVκ1-39的兩個較佳序列。連接的序列被標示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (根據IMGT資料庫全球網站imgt.org命名)。

共同輕鏈可變區較佳地連接至kappa輕鏈恆定區。在一較佳實施例中，輕鏈包含kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一較佳實施例中，輕鏈包含IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。

產生共同輕鏈的細胞可產生，例如重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01及包含所提及的與lambda恆定區融合的輕鏈的可變區的輕鏈。

如本文所述的雙特異性抗體或其變異體較佳地具有一個結合PD-1的胞外部分的重鏈可變區/輕鏈可變區(heavy chain variable region/light chain variable region，VH / VL)組合和結合TIM-3的胞外部分的第二VH/VL組合。在一較佳實施例中，在所述第一VH/VL組合中的VL類似於在所述第二VH/VL組合中的VL。在一更佳實施例中，在第一和第二VH/VL組合中的VL是相同的。在一較佳實施例中，雙特異性抗體是全長抗體，其具有一個結合PD-1的胞外部分的重/輕(heavy/light，H/L)鏈組合和一個結合TIM-3的胞外部分的H/L鏈組合。在一較佳實施例中，在所述第一H/L鏈組合中的輕鏈類似於在所述第二H/L鏈組合中的輕鏈。 在一更佳實施例中，在第一和第二H/L鏈組合中的輕鏈是相同的。

已經發表許多方法，以有利於雙特異性抗體或反之亦然，單特異性抗體的產生。在本發明中，細胞有利於雙特異性抗體的產生，而不是各自的單特異性抗體的產生是較佳的。這個通常藉由修飾重鏈的恆定區來達成，如此一來它們有利於異質二聚體化(heterodimerization)(即，與其它重/輕鏈組合的重鏈二聚體化)，而不是同質二聚體化。在一較佳實施例中，本發明之雙特異性抗體包含具有相容的異質二聚體化域之兩個不同的免疫球蛋白質重鏈。本領域中已描述了各種相容的異質二聚體化域。相容的異質二聚體化域較佳地為相容的免疫球蛋白質重鏈CH3異質二聚體化域。當使用野生型CH3域時，兩個不同重鏈(A及B)和共同輕鏈的共表現會產生三種不同的抗體種類AA、AB及BB。AA及BB是兩種單特異性二價抗體的代號，而AB是雙特異性抗體的代號。為了增加期望的雙特異性產物(AB)，可採用CH3工程化，或換句話說，可使用具有相容的異質二聚體化域的重鏈，如下文所定義。本領域描述了可達成這種重鏈的異質二聚體化的各種方式。一個方式是產生「旋鈕入孔(knob into hole)」雙特異性抗體。參見美國專利申請20030078385 (Arathoon等人)。

如本文所用的術語「相容的異質二聚體化域」是指經工程化後，使得工程化的結構域(domain)A’會優先與工程化的結構域B’形成異質二聚體蛋白質域的蛋白質域，反之亦然，而A’-A’及B’-B’之間的同質二聚體化減少。

在US13/866,747 (現在發佈為US 9,248,181)、US14/081,848 (現在發佈為US 9,358,286)及PCT/NL2013/050294 (發佈為WO2013/157954)(藉由引用併入本文)中，揭露了使用相容的異質二聚體化域，來產生雙特異性抗體的方法和手段。這些手段和方法也可有利地用於本發明中。具體而言，本發明之雙特異性抗體較佳地包含產生基本上只有雙特異性全長IgG分子的突變。較佳的突變為在第一CH3域(「KK變異體」重鏈)中的胺基酸取代L351K及T366K (EU編號)和在第二域(「DE變異體」重鏈)中的胺基酸取代L351D和L368E，或反之亦然。先前在我們的US 9,248,181及US 9,358,286專利，還有WO2013/157954 PCT申請中展現出，DE變異體及KK變異體優先配對，以形成異質二聚體(所謂的「DEKK」雙特異性分子)。由於在相同的重鏈之間的CH3-CH3界面中的帶電殘基之間的排斥，幾乎不會發生DE變異體重鏈的同質二聚體化(DEDE同質二聚體)。

可藉由編碼輕鏈及兩個經CH3工程化，以確保有效率的異質二聚體化及雙特異性抗體的形成的不同重鏈的質體的(瞬時)轉染，來產生雙特異性抗體。這些鏈在單一細胞中的產生導致偏向形成雙特異性抗體，而不是形成單特異性抗體。產生基本上只有雙特異性全長IgG1分子的較佳突變為在第351及366位的胺基酸取代，例如第一CH3域(「KK變異體」重鏈)中的L351K及T366K (根據EU編號編號)和在第351及368位的胺基酸取代，例如在第二CH3域(「DE變異體」重鏈)中的L351D和L368E，或反之亦然。

Fc區介導抗體的效應子功能，例如補體依賴性細胞毒殺性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、抗體依賴性細胞毒殺性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)和抗體依賴性細胞吞噬作用(antibody-dependent cell phagocytosis，ADCP)。取決於治療性抗體或Fc融合蛋白質的應用，降低或增強效應子功能可為期望的。在本發明中，效應子功能降低是較佳的。如在本發明的一些實施例中那樣活化、增強或刺激免疫反應時，可能期望降低效應子功能。在其它之中，效應子功能降低的抗體可被用來將免疫細胞的細胞表面分子作為標靶。

發現IgG結合至FcγR或C1q需要位在鉸鏈區及CH2域中的殘基。CH2域(第2D圖)的兩個區域與FcγR及C1q的結合相關。將IgG2殘基於第233-236位與將IgG4殘基於第327、330及331位取代進入IgG1，顯著降低ADCC和CDC (Armour et al., 1999. Eur J Immunol. 29(8):2613-24；Shields et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604)。再者，Idusogie等人展示，在不同位置的丙胺酸取代，包含K322，顯著地降低補體的活化(Idusogie et al., 2000. J Immunol. 164(8):4178-84)。

由於它們效應子功能降低，IgG4抗體代表用於受體阻斷而不消耗細胞的IgG次類。IgG4分子可在稱為Fab臂交換(Fab-arm exchange)的動態過程中交換半分子(half-molecule)。此現象可在治療性抗體及內源性IgG4之間發生。S228P突變是確保Fab臂交換的能力減少的突變的範例。(Labrijn. et al., 2009. Nat Biotechnol. 27(8):767-71)。

具有降低的效應子功能的抗體較佳地為IgG抗體，其包含經修飾的CH2/低鉸鏈域，例如以減少Fc受體的交互作用或減少C1q的結合。在一些實施例中，本發明的抗體是具有突變體CH2及/或下鉸鏈域的IgG抗體，如此一來雙特異性IgG抗體與Fc-gamma受體的交互作用降低。包含突變體CH2區的抗體較佳地為IgG1抗體。這樣的突變體IgG1 CH2及/或低鉸鏈域較佳地包含第235及/或236位(根據EU編號編號)的胺基酸取代、較佳為L235G及/或G236R取代(第2E圖)。

如本文所述的抗體或雙特異性抗體的變異體包含抗體或雙特異性抗體的功能部分、衍生物和/或類似物。變異體維持(雙特異性)抗體的結合特異性。功能部分、衍生物和/或類似物維持(雙特異性)抗體的結合特異性。如本文所述，結合特異性由與PD-1和TIM-3的胞外部分結合的能力來定義。

如本文所述，抗體的功能部分、或較佳地，雙特異性抗體的功能部分是包含結合PD-1的胞外部分的可變域及結合TIM-3的胞外部分的可變域的部分。例如，合適的部分是藉由用胃蛋白質酶(pepsin)消化雙特異性抗體，來創造的F(ab’)2片段。包含所述可變域的其它部分包含於本發明中。

如本文所述，抗體的功能衍生物、或較佳地，雙特異性抗體的功能衍生物為包含藉由接頭(linker)連接的結合PD-1的胞外部分的可變域及結合TIM-3的胞外部分的可變域的蛋白質。可變域可為可變域本身、或Fab片段或類可變域分子(variable domain like molecule)，例如包含藉由接頭連接在一起的VH及VL的單鏈Fv片段。類可變域分子的其它範例是所謂的單域抗體片段。單域抗體片段(single-domain antibody fragment，sdAb)為具有單一單體可變抗體區的抗體片段。如同整個抗體，它能夠選擇性結合至特定的抗原。由於分子重量僅為12至15 kDa，單域抗體片段比由兩個重蛋白質鏈及兩個輕鏈所構成的常見抗體(150至160 kDa)要小得多，甚至小於Fab片段(約50 kDa，一個輕鏈及半個重鏈)及單鏈可變片段(約25 kDa，兩個可變區，一個來自輕鏈而一個來自重鏈)。單域抗體本身並不比正常抗體(通常為90至100 kDa)小得多。單域抗體片段大部分是從在駱駝(camelid)中發現的重鏈抗體工程化；這些被稱為VHH片段(奈米體^® (Nanobodies^® ))。一些魚類亦具有重鏈唯一抗體(IgNAR，「免疫球蛋白質新抗原受體(immunoglobulin new antigen receptor)」)，從中可以獲得被稱為VNAR片段的單域抗體片段。另一種方法是將來自人類或小鼠的普通免疫球蛋白質G(immunoglobulin，IgG)的二聚體可變域分成單體。雖然大部分對單域抗體的研究目前是基於重鏈可變域，但衍生自輕鏈的奈米體也已顯示特異性地結合至目標抗原決定基。類可變域分子的其他非限制性範例為VHH、人類結構域抗體(Human Domain Antibody，dAb)及單體(unibody)。較佳的功能部分為包含可變域的部分，所述可變域包含重鏈可變區及輕鏈可變區。這樣的可變域的非限制性範例為F(ab)片段及單鏈Fv片段。(類)可變域連接的雙特異性形式是例如與兩個不同的scFv結合的人類血清白蛋白質(Human Serum Albumine，HSA)；包含透過二聚體基序(motif)或自我聯結(self-associating)二級結構，例如螺旋束或捲曲螺旋，以引起scFv片段的二聚體化(Morrison (2007) Nat. Biotechnol 25:1233-34)，來結合在一起的兩個不同scFv的雙特異性迷你抗體(bispecific miniantibody)。在WO2009/126920中描述合適的HAS接頭及使scFv偶聯至接頭的方法的範例。

本發明的抗體或其功能部分、衍生物及/或類似物，或較佳地，本發明的雙特異性抗體或其功能部分、衍生物及/類似物較佳地用於人類中。為此，本發明的抗體或其功能部分、衍生物及/或類似物較佳地為人類或人源化抗體。人類對多肽的耐受性受許多不同的面向所支配。免疫力，不論是經T細胞介導、經B細胞介導或其它，皆是包含在人類對多肽的耐受性的變數之一。本發明的雙特異性抗體的恆定區較佳地包含人類重鏈恆定區及人類輕鏈恆定區，前述人類重鏈恆定區較佳地包含如第2圖中所示的序列；前述人類輕鏈恆定區較佳地包含如第1C圖中所示的序列。恆定區可與天然出現的人類抗體的恆定區含有一或多個，較佳不超過10個、較佳不超過5個胺基酸差異。恆定部分完全衍生自天然出現的人類抗體是較佳的。可針對特定目的設計此類衍生序列，例如以促進異質二聚體化或以降低ADCC和/或CDC活性，和其他原因。如WO2009/157771中所述，本文產生的各種抗體衍生自以各自的目標免疫的共同輕鏈小鼠。本文產生的各種抗體衍生自人類抗體可變域庫。因此，這些可變域為人類的。獨特的CDR區可衍生自人類、合成的或衍生自另一有機體。除了CDR區之外，當可變區具有與天然出現的人類抗體的可變區的胺基酸序列相同的胺基酸序列時，可變區至少是人類可變區。在這樣的實施例中，抗體之結合PD-1或TIM-3的胞外部分的可變域的VH，或本發明的抗體中的輕鏈可與天然出現的人類抗體含有一或多個、較佳不超過10個、較佳不超過5個胺基酸差異，不算上CDR區的胺基酸序列中可能的差異。在體細胞超突變的背景下，這樣的突變也在自然界中發生。

至少就重鏈可變區而言，抗體可衍生自各種動物物種。將這樣的例如鼠類重鏈可變區人源化是常見做法。有各種方式可以達成這件事，其中有使用符合鼠類重鏈可變區的三維結構的三維結構，將CDR移植(CDR-grafting)至人類重鏈可變區；鼠類重鏈可變區的去免疫，其較佳地藉由自鼠類重鏈可變區移除已知或疑似的T或B細胞抗原決定基來完成。此移除通常是藉由抗原決定基中的一或多個胺基酸取代為另一胺基酸(通常為保守的)，使抗原決定基的序列受到修飾，從而使其不再是T或B細胞的抗原決定基。

去免疫的鼠類重鏈可變區在人類中比原始鼠類重鏈可變區具有較低的免疫原性。較佳地，本發明之可變區或域進一步被人源化，例如被虛飾(veneer)。藉由使用虛飾技術，容易被免疫系統遇到的外部殘基選擇性地以人類殘基取代，以提供包含弱免疫原性或大致上無免疫原性的虛飾表面的雜交分子。本發明所用的動物較佳為哺乳類、更佳為靈長類、最佳為人類。

根據本發明的抗體或雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含人類抗體的恆定區。根據它們重鏈恆定域的差異，抗體分成五個類型，或同型(isotype)：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。這些類型或同型包含所述重鏈中的至少一個以相對應的希臘字母命名。在一較佳實施例中，本發明提供了根據本發明的抗體，其中所述恆定區係選自IgG恆定區的群組，即選自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4所組成的群組。較佳地，所述恆定區為IgG4或IgG1恆定區(第2圖)，更佳為突變的IgG1恆定區。IgG1恆定區中的一些變異在自然界中發生且/或在不改變所得抗體的免疫學性質的情況下允許那些變異。通常在恆定區中，允許在約1至10個之間的胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。如本文所示，可使恆定區突變，以實現有效率的異質二聚體化，以降低效應子功能或為了包含半衰期、穩定性及其它類似原因的其它原因。

合理的方法已朝最小化人類背景中非人類殘基的含量發展。有各種方法可以成功將一抗體的抗原結合性質移植到另一抗體上。抗體的結合特性可主要位於CDR3區的確切序列中，通常由可變域中的CDR1和CDR2區的序列與可變域的適當結構組合作為一個整體所支持。目前有各種方法可用於將CDR區移植到另一抗體的合適可變域上。這些方法中的一些於J.C. Almagro1 and J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633中回顧，其透過引用包含於本文。

包含如第3圖中所示的可變重鏈序列的可變域的輕鏈可變區較佳為O12的或基於O12的生殖輕鏈，較佳為重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或其片段或功能衍生物(根據IMGT資料庫全球網站imgt.org命名)。使用術語重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39輕鏈或簡稱huVκ1-39。輕鏈可具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。提及的1、2、3、4或5個胺基酸取代較佳為保守性胺基酸取代、插入、缺失、取代或前述之組合，較佳地不在VL鏈的CDR3區中，較佳地不在VL鏈的CDR1、CDR2或CDR3區或FR4區中。第1圖中描繪共同輕鏈的較佳序列。

有各種方法可用於生產雙特異性抗體。一個方法涉及在細胞中表現兩個不同的重鏈和兩個不同的輕鏈並收集此細胞產生的抗體。以這種方式產生的抗體通常會含有具有不同重鏈和輕鏈組合的抗體集合，其中一些是期望的雙特異性抗體。雙特異性抗體之後可從此集合純化。雙特異性抗體與此細胞產生的其他抗體的比例可用各種方式增加。在本發明的一較佳實施例中，藉由在細胞中不表現兩個不同的輕鏈，而是表現兩個基本上相同的輕鏈，來增加比例。這兩個基本上相同的輕鏈可為具有基本上相同的輕鏈可變區和不同的輕鏈恆定區，或較佳地，兩個基本上相同的輕鏈恆定區的輕鏈。這個概念在本發明所屬技術領域中也被稱為「共同輕鏈」方法。當基本上相同的輕鏈與兩個不同的重鏈一起工作，允許具有不同抗原結合位和伴隨不同結合性質的可變域形成時，相較於表現兩個基本上不同的輕鏈，雙特異性抗體與由此細胞產生的其它抗體的比率受到顯著改善。可藉由刺激兩條不同重鏈彼此配對，而不是兩條相同重鏈的配對，進一步改善由此細胞產生的雙特異性抗體的比例。本發明所屬技術領域描述可實現這樣的重鏈異質二聚體化的各種方式。在美國臨時申請案61/635,935中描述了一較佳方法，其已由美國常規申請號13/866,747和PCT申請號PCT/NL2013/050294 (WO2013/157954A1)跟進，這些透過引入本文作為參考。揭露了(自單一細胞)產生雙特異性抗體的方法和手段，由此提供有利於形成雙特異性抗體，而不是形成單特異性抗體的手段。這些方法也可有利地用於本發明中。因此，本發明提供了一種(自單一細胞)產生根據本發明的雙特異性抗體的方法，其中所述雙特異性抗體包含能夠形成界面的兩個CH3域，所述方法包含在所述細胞中提供a) 第一核酸分子，其編碼包含重鏈的第一CH3域，b) 第二核酸分子，其編碼包含重鏈的第二CH3域，其中提供所述核酸分子優先配對包含重鏈的所述第一和第二CH3域的手段，所述方法更包含培養所述宿主細胞並允許表現所述兩個核酸分子並自培養物中收穫所述雙特異性抗體的步驟。所述第一和第二核酸分子可為相同核酸分子、載體或基因遞送載體的一部分，且可在宿主細胞的基因體的相同位置整合。或者，所述第一和第二核酸分子分別提供給所述細胞。宿主細胞包含至少一個輕鏈，及較佳地，共同輕鏈。

一較佳實施例提供一種自單一細胞產生根據本發明的雙特異性抗體的方法，其中所述雙特異性抗體包含能夠形成界面的兩個CH3域，所述方法包含提供： -細胞，其具有a) 編碼重鏈的第一核酸分子，此重鏈包含可結合至PD-1的胞外部分且含有第一CH3域的抗原結合位，以及b) 編碼重鏈的第二核酸分子，此重鏈包含可結合至TIM-3的胞外部分且含有第二CH3域的抗原結合位，其中提供所述核酸分子優先配對所述第一和第二CH3域的手段， 所述方法更包含培養所述細胞且允許表現由所述兩個核酸分子編碼的蛋白質且自培養物收穫所述雙特異性IgG抗體的步驟。在一特別較佳實施例中，所述細胞亦具有編碼共同輕鏈的第三核酸分子。所述第一、第二和第三核酸分子可為相同核酸分子、載體或基因遞送載體的一部分，並可在宿主細胞的基因體的相同位置整合。或者，所述第一、第二和第三核酸分子分別提供給所述細胞。如上所述，較佳的共同輕鏈係基於O12，較佳地，它是重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。優先配對所述第一和所述第二CH3域的手段較佳為重鏈編碼區(heavy chain coding region)的CH3域中的相應突變。產生基本上僅雙特異性抗體的較佳突變是第一CH3域中的胺基酸取代L351K和T366K(根據EU編號編號)和第二CH3域中的胺基酸取代L351D和L368E，或反之亦然(第2圖)。因此，更提供根據本發明的產生雙特異性抗體的方法，其中所述第一CH3域包含胺基酸取代L351K和T366K(根據EU編號編號)，且其中所述第二CH3域包含胺基酸取代L351D和L368E，所述方法更包括培養所述細胞並允許表現由所述核酸分子編碼的蛋白質且自培養物收穫所述雙特異性抗體的步驟。亦提供了根據本發明之產生雙特異性抗體的方法，其中所述第一CH3域包含胺基酸取代L351D和L368E(根據EU編號編號)，且其中所述第二CH3域包含胺基酸取代L351K和T366K，所述方法更包括培養所述細胞並允許表現所述核酸分子且自培養物收穫所述雙特異性抗體的步驟。可藉由這些方法產生的抗體也是本發明的一部分。CH3異質二聚體化域較佳為IgG1異質二聚體化域。包含CH3異質二聚體化域的重鏈恆定區較佳為IgG1恆定區。

「阻斷」PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2的可變域干擾PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2。這樣的可變域可結合PD-1。這樣的阻斷可變域可結合PD-1上的抗原決定基並與PD-L1和/或PD-L2競爭結合至抗原決定基。這樣的阻斷可變域和PD-L1和/或PD-L2也可結合至PD-1上的不同抗原決定基。在這種情況下，阻斷活性可以是例如，由於PD-L1和/或PD-L2的結合減少、當其已經結合至PD-1時，PD-L1和/或PD-L2的置換(displacement)或可透過空間位阻(steric hindrance)防止結合至PD-1所引起。所有這些和其他機制可至少部分地防止所述結合配偶體(binding partner)結合至所述第一膜蛋白質。

「阻斷」TIM-3結合至半乳糖凝集素-9(Galectin-9)的可變域干擾LAG3結合至半乳糖凝集素-9。這樣的可變域結合TIM-3。這樣的阻斷可變域結合TIM-3上的抗原決定基並與半乳糖凝集素-9競爭結合至抗原決定基。這樣的阻斷可變域和半乳糖凝集素-9也可結合至TIM-3上的不同抗原決定基。在這種情況下，阻斷活性可以是例如，由於PD-L1和/或PD-L2的結合減少、當其已經結合至TIM-3時，半乳糖凝集素-9的置換(displacement)或可透過空間位阻(steric hindrance)防止結合至TIM-3所引起。所有這些和其他機制可至少部分地防止所述結合配偶體結合至所述第一膜蛋白質。

與可變域不存在的情況下的結合相比時，如本文所述，阻斷特異性結合配對(即PD-1/PD-L1；PD-1/PD-L2或TIM-3/半乳糖凝集素-9)的結合的可變域通常降低該配對的結合。較佳地在體外測定中測量。通常，這是藉由將可變域與其可結合的膜蛋白質一起培養，隨後將混合物與該配對中的其它成員一起培養來完成。然後比較該配對的結合與該配對在可變域不存在的情況下的結合。可變域可完全地防止第一膜蛋白質與其結合配偶體的結合。它亦可部分地阻止結合配對的結合。與可變域不存在的情況下的結合相比時，阻斷膜蛋白質的特異性結合配對的結合的可變域較佳地使該配對的結合降低至少50%、較佳至少60%、較佳至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%。藉由可變域阻斷結合在本文中定義為使用包含所述兩個相同的所述可變域的二價單株抗體所獲得的阻斷。當存在於包含所述可變域和結合第二膜蛋白質的可變域的抗體中時，可變域當然也阻斷結合。

可結合PD-1的胞外部分且至少部分地阻斷PD-1與PD-L1和/或PD-L2結合的特異性可變域是包含MF6076；MF6226；MF6236；MF6256；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974或MF6982的VH的胺基酸序列的可變域。可結合TIM-3的胞外域且阻斷TIM-3與半乳糖凝集素-9結合的特異性可變域是包含MF7676；MF7677；MF7678；MF7679的VH的胺基酸序列的可變域。在第3圖中描述這些胺基酸序列。

本發明亦提供接合(engage)和/或活化T細胞的方法，此方法包含提供包含T細胞和要被T細胞接合或活化的細胞(第二細胞)的系統，且對所述系統提供至少一個抗體，較佳至少一個雙特異性抗體，此抗體包含可結合PD-1的可變域和可結合TIM-3的可變域，並將所述系統培養於允許T細胞變成被接合和/或活化的條件下。在一些實施例中，所述方法是體外(in vitro )方法。要被T細胞接合或活化的細胞較佳為免疫細胞，例如抗原呈現細胞、巨噬細胞、贅生細胞(neoplastic cell)、病毒感染的細胞或胞內寄生蟲感染的細胞。接合和/或活化的T細胞將T細胞引導至特定的目標。將T細胞活化是將所述T細胞的T細胞受體活化。接合T細胞通常是將T細胞活化。接合也可將已活化的T細胞引導至抗體所指定的目標。允許所述T細胞變為被接合和/或活化的條件通常是培養條件，但也可在非人類動物中培養。這些條件是在抗體不存在下，T細胞不會被接合。如果測量T細胞的集合，其中一些可能已被接合或活化，假使此集合含有足夠的未被接合或活化的T細胞。

本發明的抗體可以將兩個細胞緊密靠近在一起，允許細胞之間的交互作用，此交互作用由被本發明的抗體結合之除PD-1和TIM-3以外的蛋白質所介導。一個這樣的交互作用是一個細胞的T細胞受體與另一細胞上的MHC交互作用。

在一面向中，本發明提供在PD-1和/或TIM-3陽性細胞中，干擾PD-1和/或LAG3所介導的抑制的方法，此方法包含使所述細胞與抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物接觸，其中前述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物接觸包含 -可結合至PD-1的胞外部分的可變域，以及 -其可結合至TIM-3的胞外部分的可變域，從而在所述細胞中，抑制PD-1和/或TIM-3所介導的活性。

TIM-3或PD-1陽性細胞，以通常可藉由於對膜蛋白質有特異性的單株抗體的免疫螢光，而被偵測到的量，在細胞膜上表現膜蛋白質。PD-1陽性細胞是T細胞。TIM-3細胞較佳為T細胞，更佳為所謂的耗盡(exhausted)T細胞。T細胞的耗盡是在許多慢性感染和癌症的期間出現的T細胞失能(dysfunction)的狀態。其被不良的效應子功能、抑制性受體的持續表現和不同於功能性效應或記憶T細胞的轉錄狀態的轉錄狀態所定義。耗盡防止感染和腫瘤的最佳控制。本發明的抗體藉由與各自的膜蛋白質結合且防止藉由蛋白質之各自的結合配偶體的蛋白質刺激，來干擾PD-1和TIM-3介導的抑制。PD-1的已知結合配偶體是PD-L1和PD-L2。TIM-3的已知結合配偶體是半乳糖凝集素-9。抗體阻斷PD-1與PD-L1和/或PD-L2；和/或TIM-3與半乳糖凝集素-9的交互作用，從而至少部分地防止PD-1在PD-1陽性細胞中的抑制活性；和/或TIM-3在TIM-3陽性細胞中的抑制活性。在本發明的一較佳實施例中，所述PD-1結合可變域與PD-1的結合阻斷PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2、較佳PD-L1。在本發明的一較佳實施例中，所述TIM-3結合可變域與TIM-3的結合阻斷了TIM-3與半乳糖凝集素-9的結合。可以各種方式測量所述細胞中由PD-1和/或LAG3所介導的活性之抑制。通常，但不一定，藉由測量CD4⁺ 或CD8⁺ T細胞的活化，來測量活性。這可藉由使用健康的CD4+或CD8+ T細胞來完成，但是通常最好在耗盡的T細胞上測量對耗盡的影響。 例如，這種T細胞對LAG3呈陽性。較佳地在HIV特異性T細胞中測量活性，較佳地從患有進行性疾病(progressive disease)的受試者中收集前述HIV特異性T細胞。增殖是合適的參數。可在抗體存在和不存在的情況下，確定增殖速率。增殖速率的差異是這些細胞中TIM-3和/或PD-1的活性抑制程度的量度。其他合適的T細胞的範例是從患有非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)的受試者收集的TIL。干擾素-gamma的產生是合適的參數。可在抗體存在和不存在的情況下，確定干擾素-gamma的產生。干擾素-gamma的產生的差異是這些細胞中TIM-3和/或PD-1活性抑制程度的量度。增殖和/或干擾素-gamma的產生的增加代表這些細胞中的TIM-3和/或PD-1的活性的抑制。在一較佳實施例中，與抗體不存在時偵測到的程度或速率相比，前述的增加為增加至少10%、較佳至少20%、更佳至少40%、更佳至少80%。

本發明更提供刺激免疫突觸的形成、穩定性和/或活性的方法，此方法包含提供包含至少兩種能夠透過免疫突觸彼此相互結合的系統，且對所述系統提供抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中前述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含 -可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及 -可結合至TIM-3的胞外部分的可變域， 從而刺激免疫突觸在所述至少兩種細胞之間的形成、穩定性和/或活性。抗體藉由結合至細胞膜上含有PD-1或TIM-3的細胞上的PD-1和/或TIM-3，來促進免疫突觸的形成、穩定性和/或活性。此結合抑制PD-1和/或TIM-3的活性。這具有刺激免疫突觸的形成、穩定性和/或活性的效果。可結合PD-1的可變域較佳地阻斷PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2、較佳PD-L1。可結合TIM-3的可變域較佳地阻斷TIM-3與半乳糖凝集素-9的結合。所述兩種細胞是能夠形成免疫突觸的細胞。至少其中一種細胞是T細胞受體陽性細胞。另一細胞通常，但不一定是抗原呈現細胞。免疫突觸由於T細胞與抗原呈現細胞(antigen presenting cell，APC)的緊密並置(apposition)而形成，且它是T細胞受體(T-cell receptor，TCR)被其抗原配位體，存在於APC膜中的胜肽-MHC複合物，所觸發的位置。T細胞膜中的免疫突觸通常具有三個膜受體的同心環(concentric ring)及其底下的細胞骨架和訊息傳遞蛋白質。內環或中央超分子活化集團(central supramolecular activation cluster，cSMAC)濃縮大部分的TCR和CD28，且它被由整合素所形成的週邊SMAC包圍。最後，最外部的環或遠端SMAC(distal SMAC，dSMAC)是具有大的胞外域的蛋白質，例如CD43和CD45，的所在地，其遠離cSMAC。

本發明更提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至TIM-3的胞外部分的可變域的抗體或其變異體。

在方法的一較佳實施例中，抗體(或其變異體)或本發明的用途，結合PD-1的可變域較佳地阻斷PD-1與PD-L1和/或PD-L2的結合。結合TIM-3的可變域較佳地阻斷TIM-3與半乳糖凝集素-9的結合。較佳地，兩個可變域皆阻斷各自的結合配偶體的結合。

結合PD-1的胞外部分的可變域較佳定義為，與在Jurkat細胞上用抗體Nivolumab獲得的抑制相比時，當為包含兩個結合PD-1的所述可變域的二價單特異性抗體形式時，以20至150%的範圍來抑制Jurkat細胞之經T細胞受體介導的活化之由PD-1/PD-L1所介導的抑制的可變域。

與在所述Jurkat細胞上用抗體Nivolumab獲得的抑制相比時，Jurkat細胞之經TCR介導的活化之PD-1抑制的抑制較佳在50至150%、較佳80至150%、更佳100至150%的範圍內。在一較佳實施例中，與在所述Jurkat細胞上用抗體Nivolumab獲得的抑制相比時，抑制至少為100%。PD-1對Jurkat細胞之經TCR介導的活化的抑制較佳是藉由測量Jurkat細胞中PD-1/PD-L1結合的免疫抑制作用來測量，前述Jurkat細胞是培養於若沒有抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物存在的話，會透過T細胞受體來活化的條件下。

本發明更提供包含二或更多抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物的組合物和部分套組，前述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至TIM-3的胞外部分的可變域； 其中第一和第二所述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物結合 -在PD-1上不同的抗原決定基； -在TIM-3上不同的抗原決定基；或 -在PD-1和TIM-3上不同的抗原決定基。包含有關於二或更多具有如本段落中說明之結合PD-1和TIM-3的可變域的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物的方法、用途、組合物或部分套組的實施例也稱為「Oligoclonics」實施例。這種Oligoclonics實施例的範例是具有所述第一和第二抗體的實施例。「Oligoclonics」是註冊商標。製造這種Oligoclonics®產品的一般方法在WO 2013/157953和WO2004/009618中揭露，且在此引入作為參考。

在Oligoclonics實施例中，第一和第二抗體包含結合PD-1和TIM-3的可變域。具有結合相同PD-1或TIM-3的可變域的抗體可以結合相同的個別蛋白質，但這不一定如此。結合至PD-1或TIM-3的本發明抗體結合所述蛋白質上的抗原決定基。抗原決定基是抗原的一部分，在此情況下是抗體辨認的膜蛋白質。 結合膜蛋白質上不同抗原決定基的第一和第二抗體可結合膜上的相同的個別蛋白質。為此，不同的抗原決定基較佳是非重疊的抗原決定基。換句話說，不同的抗原決定基在膜蛋白質上足夠分開，使得兩種抗體可同時結合至相同的個別蛋白質。令人驚訝地發現到，Oligoclonics (第一和第二或更多抗體的組合)可比相同量的單獨各個抗體更有效。

較佳地，二或更多抗體或功能部分、衍生物和/或類似物中的至少一者包含阻斷PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2、較佳地PD-L1的PD-1結合可變域。在一較佳實施例中，二或更多抗體或功能部分、衍生物和/或類似物中的至少兩者包含阻斷PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2、較佳地PD-L1的PD-1結合可變域。

較佳地，二或更多抗體或功能部分、衍生物和/或類似物中的至少一者包含阻斷TIM-3結合至半乳糖凝集素-9的TIM-3結合可變域。在一較佳實施例中，二或更多抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物中的至少兩者包含阻斷TIM-3結合至半乳糖凝集素-9的TIM-3結合可變域。

較佳地，二或更多抗體或功能部分、衍生物和/或類似物中的至少一者包含阻斷PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2、較佳地PD-L1的PD-1結合可變域及阻斷TIM-3結合至半乳糖凝集素-9的TIM-3結合可變域。較佳地，二或更多抗體或功能部分、衍生物和/或類似物中的至少兩者包含阻斷PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2、較佳地PD-L1的PD-1結合可變域及阻斷TIM-3結合至半乳糖凝集素-9的TIM-3結合可變域。

在一面向中，本發明提供如本文所述的方法和用途，其中使用二或更多抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，且其中前述二或更多抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至TIM-3的胞外部分的可變域； 其中第一和第二所述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物結合 -在PD-1上不同的抗原決定基； -在TIM-3上不同的抗原決定基；或 -在PD-1和TIM-3上不同的抗原決定基。藉由結合PD-1的可變域，來阻斷PD-L1和/或PD-L1的結合；和藉由結合TIM-3的可變域，來阻斷TIM-3結合至半乳糖凝集素-9的偏好與Oligoclonics實施例中所述的相同。

抗體或其部分、衍生物或類似物較佳地包含兩個如所述的可變域。這種抗體較佳地為雙特異性抗體或其功能部分、衍生物或類似物。二或更多抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物可連接在一起。各種方法在本領域中是已知的。合適的方法是共軛(conjugation)。此外，製造多特異性抗體的技術已經發展到亦包含具有與正常單特異性抗體相同的整體結構的雙特異性抗體，但其中抗體的兩個臂各自結合不同的目標。雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地具有兩個有相容的異質二聚體化域的重鏈。輕鏈較佳為共同輕鏈。抗體較佳為全長雙特異性抗體，其由兩個有相容的異質二聚體化域的重鏈組成。輕鏈較佳是共同輕鏈。

如本文所使用，術語「共軛物(conjugate)」是指已經共價連接的二或更多分子，其選擇性地透過連接區共價連接。舉例而言，在一些實施例中，共軛物為藉由連接區連接至第二蛋白質或非蛋白質基團(moiety)的第一蛋白質或非蛋白質基團。舉例而言，在本發明之結合分子的一些實施例中，其包含或由已經共價連接的二或更多抗體組成。共軛物不限於第一基團及第二基團，但在一些實施例中，亦可具有藉由另外的連結區連接的第三、第四或更多基團。蛋白質基團的範例包含但不限於：多肽、擬肽(peptidomimetic)或抗體(或如本案其它地方所述的抗體部分、衍生物或類似物)。非蛋白質基團的範例包含但不限於適體(aptamer)。可使用許多類型的接頭(linker)，且根據共軛物中的分子類型及接頭所需的性質(長度、彈性、對蛋白質酶活性的抗性及其它類似的特性)，選擇合適的接頭。這樣的接頭可包含核苷酸(nucleotide)、多肽或適合的合成材料。舉例而言，接頭可為彈性胜肽接頭。在某些實施例中，接頭可為可切割接頭，允許部分的共軛物彼此分離。在其它實施例中，胜肽接頭可為螺旋接頭。用於連接蛋白質和其它分子的各種範例及套組為本領域所習知的。如本文所使用，術語「融合蛋白質(fusion protein)」是指包含二或更多多肽或蛋白質已經在DNA層級藉由重組(recombination)連接在一起，且以單一多肽一起表現的蛋白質。融合蛋白質也可包含亦由DNA編碼且與融合蛋白質一起表現的胜肽連接區。為融合蛋白質的一部分的胜肽接頭可設計為具有特定的特性，例如彈性、親水性、蛋白質酶抗性、可裂性等。所有這些性質都可設計於DNA序列內，且接頭的設計方法亦為本領域所習知的。舉例而言，可藉由本領域所習知的方法，將抗體連接在一起，且如本文所述，形成雙特異性或多目標抗體。再者，可藉由本領域各種習知的方法，例如藉由使用諸如Biclonics®(見，例如WO 2013/157954)的技術，來構築雙特異性抗體。雙特異性單株抗體(bispecific monoclonal antibody，BsMAb、BsAb)通常包含兩個不同的單株抗體的結合域，因此結合至兩個不同的抗原決定基。Biclonics®分子，以及其它全長IgG雙特異性抗體具有兩種不同的抗原結合特異性，其由scFv的Fab的全長IgG分子的兩個不同可變區所編碼。如本文其它地方所詳述的，可藉由用編碼兩個不同的共同輕鏈 (common light chain，cLC)抗體的遺傳構築體(construct)共轉染個別細胞，來生產Biclonics®。CH3工程化確保有效率的異質二聚體化及基本上純的雙特異性抗體的形成。

本發明之抗體較佳地為雙特異性抗體。抗體通常透過所謂的抗原結合位結合其目標。未修飾的抗原結合位通常由抗體的可變域形成並存在於其中。可變域含有抗原結合位。可結合抗原的可變域為包含可結合至抗原的抗原結合位的可變域。

抗體可變域通常包含重鏈可變區(heavy chain variable region，VH)和輕鏈可變區(light chain variable region，VL)。抗原結合位可存在於組合的VH/VL可變域中，或只在VH區或只在VL區中。當抗原結合位存在於可變域的兩個區的一者中時，對應的可變區可有助於結合可變區的折疊及/或穩定性，但不顯著地有助於抗原自身的結合。

如本文所使用，抗原結合(antigen-binding)是指抗體對其抗原的典型結合能力。可以用各種方式，評估抗體與抗原的結合。一種方式是將抗體與抗原(較佳地為表現抗原的細胞)一起培養，移除未結合的抗體(較佳藉由洗滌步驟)，且藉由結合至結合的抗體的經標記之抗體，來偵測結合的抗體。

與蛋白質的隨機、非特異性附著不同，通常透過抗體的互補決定區(complementarity determining region，CDR)及抗原和可變域的特定三維結構，從而允許這兩個結構精準地結合在一起(類似鎖和鑰匙的交互作用)，來介導經抗體的抗原結合。由於抗體通常辨認部分抗原，其稱為抗原的抗原決定基，因此這樣的抗原決定基也可存在於其它化合物中，根據本發明之抗體也可辨認其它蛋白質，如果這樣的其它化合物含有相同的抗原決定基。因此，術語「結合」不排除抗體結合至另一蛋白質或含有相同抗原決定基的蛋白質。這種其它蛋白質較佳地不是人類蛋白質。

通常除了在出生後，較佳地為成年人類的細胞膜上的特定目標蛋白質以外，抗體不會結合至其它蛋白質。

本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物中可結合PD-1的胞外部分的可變域結合至PD-1，且在其他條件相同的條件下，至少低於100倍結合至同一物種的CD28家族的另一成員的胞外部分。抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物中結合PD-1的可變域結合至PD-1，且在其他條件相同的條件下，至少低於100倍結合至同一物種的CD28、CTLA4、ICOS、BTLA、NKp30和TMIGD2。考慮到PD-1是細胞表面蛋白質，通常在細胞表面上表現成員的細胞上評估結合。

本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物中可結合TIM-3的胞外部分的可變域結合至TIM-3，且在其他條件相同的條件下，至少低於100倍結合至同一物種的TIM家族的另一成員的胞外部分。本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物中結合TIM-3的可變域結合至TIM-3，且在其他條件相同的條件下，至少低於100倍結合至同一物種的TIM-1或TIM-4。考慮到TIM-3是細胞表面蛋白，通常在細胞表面上表現成員的細胞上評估結合。

本發明亦提供治療患有癌症的個體的方法，此方法包含對有此需要的個體投予本發明的抗體或功能部分，衍生物和/或類似物或本發明的雙特異性抗體。個體較佳是患有癌症的個體。在一些實施例中，癌症是包含表現膜蛋白質的癌細胞的癌症。在一較佳實施例中，癌症是包含表現PD-L1、PD-L2和/或半乳糖凝集素-9的癌細胞的癌症。

癌症較佳是腺癌(adenocarcinoma)。較佳的癌症是大腸癌(colorectal cancer)；胰腺癌(pancreatic cancer)；肺癌；乳癌；肝癌；前列腺癌；卵巢癌；子宮頸癌(cervical cancer)；子宮內膜癌(endometrial cancer)；頭頸癌；黑色素瘤；睾丸癌；泌尿上皮癌(urothelial cancer)；腎癌；胃癌；或類癌癌症(carcinoid cancer)。在一較佳實施例中，癌症是大腸癌；胰腺癌；肺癌；乳癌；肝癌；前列腺癌；卵巢癌；子宮頸癌；子宮內膜癌；頭頸癌；或黑色素瘤。在一特別較佳實施例中，癌症是大腸癌；胰腺癌；肺癌；乳癌；或肝癌。在一特別較佳實施例中，癌症是胃腸癌。在一較佳實施例中，癌症是大腸癌。在此實施例中，抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳為具有可結合PD-1的可變域和可結合TIM-3的可變域的抗體。PD-1結合可變域較佳地阻斷PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2，較佳地PD-L1。TIM-3結合可變域較佳地阻斷TIM-3結合至半乳糖凝集素-9。較佳地，此方法包含二或更多所述抗體或其功能部分，如Oligoclonics實施例所述。

更提供在個體中刺激針對在所述個體中的異常細胞的免疫反應的方法，此方法包含對所述個體提供本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物。異常細胞較佳為癌細胞、病毒感染的細胞、寄生蟲或寄生蟲感染的細胞。在一較佳實施例中，細胞是癌細胞或贅生細胞(neoplastic cell)。在此實施例中，抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳為具有可結合PD-1的可變域和可結合LAG3的可變域的抗體。在此實施例中，PD-1結合可變域較佳地阻斷PD-1結合至PD-L1和/或PD-L2，較佳地PD-L1。TIM-3結合可變域較佳地阻斷TIM-3結合至半乳糖凝集素-9。較佳地，此方法包括二或更多所述抗體或其功能部分，如Oligoclonics實施例所述。

贅生物(neoplasm)是組織的異常生長，且當它也形成一塊時，通常稱為腫瘤。本發明中的贅生物通常形成一塊。贅生細胞是來自已形成一塊的贅生物的細胞。世界衛生組織(The World Health Organization，WHO)將贅生物分為四大類：良性贅生物(benign neoplasm)、原位贅生物(in situ neoplasm)、惡性贅生物(malignant neoplasm)和有不確定或未知行為的贅生物。惡性贅生物也簡單地以癌症為人所熟知。

刺激免疫反應包含誘導免疫反應及增強已經存在的免疫反應。可藉由，在適用的情況下，測量個體的腫瘤載量；個體的病毒載量；個體的寄生蟲載量，來測量個體中的免疫反應。

所述病毒感染的細胞較佳為感染免疫缺陷病毒、皰疹病毒(herpes virus)，較佳地單純皰疹病毒(herpes simplex virus)，水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus)或愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、乳突瘤病毒(papilloma virus)、肝炎病毒，較佳地A型、B型或C型肝炎病毒，麻疹病毒(measles virus)或腺病毒(adenovirus)。病毒較佳為已知能夠持續存在於個體中的病毒。持續性感染的特徵在於病毒未被清除但仍存在於受感染個體的特定細胞中的那些感染。持續性感染可包含沉默和有生產力感染的階段，而不會迅速殺死或甚至產生宿主細胞的過度損傷。持續性病毒-宿主交互作用可能是潛伏、慢性和/或緩慢的感染。

寄生蟲感染的細胞是感染胞內寄生蟲的細胞。這類寄生蟲是能夠在宿主的細胞內生長和繁殖的寄生性微生物。一些胞內寄生蟲也可以在細胞外生活。這類寄生蟲是所謂的兼性(facultative)胞內寄生蟲。非限制性範例是單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene)、退伍軍人菌(Legionella)、某些種類的分枝桿菌(mycobacterium)和新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)。較佳的胞內寄生蟲是不能在宿主細胞外生長的寄生蟲，較佳的範例是披衣菌(Chlamydia)和緊密相關的物種、某些種類的分枝桿菌，例如麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、某些原生動物，包含：頂複合器蟲(Apicomplexan)(瘧原蟲屬(Plasmodium spp.))、弓形蟲(Toxoplasma gondii)和隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)和錐蟲(trypanosomatid)。

本發明還提供編碼根據本發明的抗體重鏈可變區的核酸分子。核酸分子(通常是體外、單離或重組核酸分子)較佳地編碼第3圖中所示的重鏈可變區的任一個或其中具有1、2、3、4或5個胺基酸的插入、缺失、取代或前述組合之第3圖中所示的重鏈可變區。在一較佳實施例中，核酸分子包含如第3圖中所示的序列。核酸分子較佳地使用針對在待使用的抗體產生細胞中表現而最佳化的密碼子。較佳地，將編碼第3圖中所示的重鏈可變區的核酸或其中具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合之第3圖中所示的重鏈可變區的核酸，針對於人類細胞中表現，較佳地Per.C6TM；或中國倉鼠，較佳地CHO，進行密碼子最佳化。本發明更提供編碼所提及的重鏈可變區和第2圖的重鏈恆定區的核酸分子。

如本發明所用的核酸分子通常但不只是核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)或去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可取得替代核酸。例如，根據本發明的核酸分子包含於細胞中。當所述核酸分子在所述細胞中表現時，所述細胞可產生根據本發明的抗體。因此，在一實施例中的本發明提供包含根據本發明的抗體和/或根據本發明的核酸分子的細胞。當所述細胞產生重鏈和輕鏈時，產生抗體。提供可產生本發明抗體的細胞。細胞較佳地包含編碼包含抗體重鏈可變區的抗體重鏈的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區與常見輕鏈組合時，可結合所述第一膜蛋白質。所述細胞較佳地更包含編碼抗體重鏈可變區的抗體重鏈的核酸分子，其中當所述抗體重鏈可變區與共同輕鏈組合時，可結合所述第二膜蛋白質。所述細胞較佳地更包含編碼共同輕鏈的核酸分子。所述細胞較佳為動物細胞，更佳為哺乳類細胞，更佳為靈長類細胞，最佳為人類細胞。為了本發明的目的，合適的細胞是能夠包含且較佳地生產根據本發明的抗體和/或根據本發明的核酸的任何細胞。

本發明更提供包含根據本發明的抗體的細胞。亦提供包含單獨或共同編碼本發明抗體的一或多個核酸分子的細胞。前述一或多個核酸分子是可表現的核酸分子，意味著它們含有編碼蛋白質的結構域的RNA轉錄和轉譯的順式(in cis)所需的訊息。較佳地，所述細胞(通常是體外、單離或重組細胞)產生所述抗體。在一較佳實施例中，所述細胞是融合瘤(hybridoma)細胞、中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞、NS0細胞或PER-C6TM細胞。在一特別較佳實施例中，所述細胞是CHO細胞。更提供包含根據本發明的細胞的細胞培養物。各種機構和公司已經開發出用於大規模生產抗體的細胞系，例如用於臨床用途。這類細胞系的非限制性範例是CHO細胞、NS0細胞或PER.C6TM細胞。這些細胞也用於其他目的，例如蛋白質的生產。為了蛋白質和抗體的工業規模生產而開發的細胞系，在本文中更稱為工業細胞系。因此，在一較佳實施例中，本發明提供開發用於大規模生產抗體，以用於生產本發明的抗體的細胞系的用途。本發明更提供用於產生包含編碼如第3、1和2圖中所示的VH、VL和/或重鏈的核酸分子的抗體的細胞。較佳地，所述核酸分子包含如所第1和2圖中所示的序列。

本發明更提供生產抗體的方法，此方法包含培養本發明的細胞且自所述培養物中收穫所述抗體。較佳地，所述細胞在無血清培養基中培養。較佳地，所述細胞適於懸浮生長。更提供可藉由生產根據本發明的抗體的方法所獲得的抗體。抗體較佳地自培養物的培養基純化。較佳地，所述抗體是親和純化(affinity purified)。

本發明的細胞為例如融合瘤細胞系、CHO細胞、293F細胞、NS0細胞或本領域已知的任何其它適用於臨床目的的抗體生產的細胞類型，特別是用於生產用於在人類中投予的抗體。在一特別較佳實施例中，所述細胞是人類細胞，較佳為經腺病毒E1區或其功能等價物轉形(transform)的細胞。這類細胞系的較佳範例是PER.C6TM細胞系或其等價物。在一特別較佳實施例中，所述細胞是CHO細胞或其變異體，較佳地為利用穀胺醯胺合成酶(glutamine synthetase，GS)載體系統，來表現抗體的變異體。

本發明更提供了包含一或多個根據本發明的抗體或其變異體的醫藥組合物。此醫藥組合物較佳地包含較佳地醫藥上可接受的賦形劑(excipient)或載體(carrier)。

本發明的抗體或其變異體可更包含標籤(label)，較佳為用於體內(in vivo)成像的標籤。對於治療應用來說，這樣的標籤通常不是必需的。在例如診斷設置中，標籤可以是有幫助的，例如視覺化體內的目標細胞。各種標籤是適合的，且許多在本領域中是眾所皆知的。在一較佳實施例中，標籤是用於偵測的放射性標籤。在另一較佳實施例中，標籤是紅外線標籤。較佳地，紅外線標籤適合體內成像。本發明所屬領域中具有通常知識者可取得各種紅外線標籤。較佳的紅外線標籤是，例如IRDye 800；IRDye 680RD；IRDye 680LT；IRDye 750；IRDye 700DX；IRDye 800RS；IRDye 650；IRDye 700亞磷醯胺(phosphoramidite)；IRDye 800亞磷醯胺(LI-COR USA; 4647 Superior Street; Lincoln，Nebraska)。

待投予至病人的根據本發明的抗體的量通常在治療窗口(therapeutic window)中，意味著使用足夠的量，以獲得治療效果，而此量不超過會導致不可接受的程度的副作用的閾值(threshold)。獲得期望的治療效果所需的抗體量越低，治療窗口通常會越大。因此，在低劑量下發揮足夠治療效果的根據本發明的抗體是較佳的。劑量可以在Nivolumab的給藥方案的範圍內。劑量也可更低。

根據本發明的抗體或其變異體，特別是雙特異性抗體或其變異體可具有比有可變域的二價單特異性抗體的組合更少的副作用。根據本發明之抗體或雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物具有比有可變域的二價單特異性抗體的組合更小的免疫相關毒性。抗體或雙特異性抗體減少了病人的安全責任。阻斷抑制性和/或共刺激分子的抗體的組合有益於對現有免疫療法無反應的病人。然而，免疫調節受體(immune-modulatory receptor，iMOD)的雙重阻斷已顯示增加免疫相關的毒性。根據本發明的抗體或其變異體，特別是雙特異性抗體或其變異體適合解決iMOD的雙重阻斷，因為它們可發揮不能被單株抗體的組合再現的功能活性，且可更選擇性地以特定細胞族群為目標，這減少了病人的安全責任。

藉由將抗體選殖至在驅動重鏈異質二聚體化的CH3區中含有突變的互補表現載體中，作為雙特異性抗體產生抗體。許多雙特異性抗體以小規模生產並在癌細胞系上的結合和功能測定中進行測試。本發明的抗體，特別是本發明的雙特異性抗體可將低毒性輪廓與高效力組合。本發明的抗體可於各種類型和系列的免疫目標治療中是有用的。當與兩臂皆結合相同抗原的抗體相比時，本發明的抗體可具有增加的治療窗口。

更提供根據本發明的雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物在製備用於治療或預防異常細胞、腫瘤和/或轉移形成的藥物中的用途。所述轉移所起源的腫瘤較佳為對PD-L1、PD-L2和/或半乳糖凝集素-9陽性的腫瘤。

在懸浮液293F細胞中瞬時轉染後，可以＞ 50 mg/L的量產生本發明的抗體。可將雙特異性抗體純化至純度大於98%，其中產率＞ 70%。分析特性研究顯示出與二價單特異性IgG1相當的雙特異性IgG1抗體輪廓。

為了清楚的目的和簡要描述，本文描述特徵作為相同或分開的實施例的一部分。然而，應該理解的是，本發明的範圍可包含具有所述特徵的全部或部分的組合的實施例。

亦提供治療患有癌症的個體的方法，此方法包含對有此需要的個體投予本發明的蛋白質或本發明的雙特異性抗體。

本發明更提供本發明的蛋白質或本發明的雙特異性抗體用於治療患有癌症的個體中的用途。

本發明的抗體或其變異體較佳地包含可結合至PD-1的胞外部分且包含具有CDR3區的重鏈可變區的可變域，前述CDR3區包含第3圖中所示的MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972； MF6974；或MF6982，較佳地MF6226；MF6256；或MF6930的VH之一的可變重鏈區的CDR3的胺基酸序列。結合PD-1的所述可變域較佳地包含重鏈可變區包含具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區，前述重鏈可變區包含第3圖中所示的M MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972； MF6974；或MF6982，較佳地MF6226；MF6256；或MF6930的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。

抗體或其變異體較佳地包含可結合至PD-1的胞外部分且包含重鏈可變區的可變域，前述重鏈可變區包含(如第3圖中所示的)MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972； MF6974；或MF6982，較佳地MF6226；MF6256；或MF6930所示的可變重鏈區的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。

抗體或其變異體較佳地包含可結合至TIM-3的胞外部分且包含具有CDR3區的重鏈可變區的可變域，前述重鏈可變區包含如第3圖的MF7676；MF7677；MF7678；或MF7679所示的可變重鏈區的CDR3的胺基酸序列。結合TIM-3的所述可變域較佳地包含重鏈可變區包含具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區，所述可變區包含如第3圖的MF7676；MF7677；MF7678；或MF7679所示的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。

抗體或其變異體較佳地包含可結合至TIM-3的胞外部分且包含重鏈可變區的可變域，前述重鏈可變區包含如(第3圖的)MF7676；MF7677；MF7678；或MF7679所示的可變重鏈區的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。

在以下的實施例中進一步說明本發明。這些實施例並不限制本發明的範圍，而僅僅是為了闡明本發明。

實施例

如本文所使用的，「MFXXXX」，其中X獨立地為數字0至9，是指包含可變域的Fab，其中VH具有由4位數字所鑑定的胺基酸序列。除非另外指出，否則可變域的輕鏈可變區通常具有第1A圖、通常第1B圖的序列。「MFXXXX VH」是指由4位數字所鑑定的VH的胺基酸序列。MF更包含輕鏈的恆定區和通常與輕鏈的恆定區交互作用的重鏈的恆定區。PG是指包含相同重和輕鏈的單特異性抗體。PB是指具有兩個不同重鏈的雙特異性抗體。重鏈的可變區(VH)不同且通常CH3區也是，其中一個重鏈具有其CH3域的KK突變，而另一個具有其CH3域的互補(complementing)DE突變(見參考文獻PCT/NL2013/050294(公開為WO2013/157954)。

實施例： 1

用於選擇和篩選的材料的產生

細胞系的培養

從Invitrogen獲得Freestyle 293F細胞(目錄編號p/n51-0029)並常規維持在293 FreeStyle培養基中。自ATCC購買HEK293T(目錄編號ATCC-CRL-11268)細胞並常規維持在補充L-穀胺醯胺(glutamine)(Gibco)和FBS (Lonza)的DMEM/F12 (Gibco)中，且自Gibco購買CHO-S(目錄編號11619-012)細胞系並常規維持在補充L-穀胺醯胺的Freestyle CHO表現培養基(Invitrogen)中。

用於免疫，和用於穩定細胞系的產生及瞬時轉染的 PD-1 和 TIM-3 表現載體的產生

合成或透過在含有目標cDNA的市售表現構築體(expression construct)上的PCR放大(PCR amplification)，其中目標cDNA具有導入用於選殖的獨特限制位及用於有效率轉譯的科扎克一致序列(kozak consensus sequence)的特定引子，來獲得包含用於選殖的獨特限制位和用於有效率轉譯的科扎克一致序列的每個目標的全長cDNA。透過NheI/ EcoRI，將每個目標的cDNA選殖至真核的表現構築體中，例如pIRES-Neo3 (Clontech；第4圖)或pVAX1 (Thermo Fisher Scientific；第5圖)，分別產生pIRES-Neo3_[目標名]和pVAX1_ [目標名]。藉由比較NCBI參考胺基酸序列，來驗證插入序列。pIRES-Neo3構築體用於穩定細胞系的產生和瞬時轉染。pVAX1構築體用於免疫目的。有關所得的構築體的名稱的概述，請參見表1。

用於在細胞表面上表現的全長huPD-1插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：NP_005009.2相同)： MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL

其中： MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR：訊息胜肽。 PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV：huPD-1的ECD。 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI：預測的TM區。 CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL：胞內尾部。

用於在細胞表面上表現的全長獼猴(食蟹獼猴(macaca fascicularis))PD-1插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：ABR15751.1相同)： MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL

其中： MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR：訊息胜肽。 PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALV：maPD-1的ECD。 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI：預測的TM區。 CSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL：胞內尾部。

用於在細胞表面上表現的全長人類TIM-3插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：AAH63431.1相同)： MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTLQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP

其中： MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRS：訊息胜肽。 SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTLQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIG：ECD。 IYIGAGICAGLALALIFGALI：預測的TM區。 FKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP：胞內尾部。

用於在細胞表面上表現的TIM-3插入物(食蟹獼猴) (均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：EHH54703.1相同)： MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYIAEVGQNAYLPCSYTPAPPGNLVPVCWGKGACPVFDCSNVVLRTDNRDVNDRTSGRYWLKGDFHKGDVSLTIENVTLADSGVYCCRIQIPGIMDEKHNVKLVVIKPAKVTPAPTLQRDLTSAFPRMLTTGEHGPAETQTPGSLPDVNLTVSNFFCELQIFTLTNELRDSGATIRTAIYIAAGISAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKTQNLSLISLANIPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEEDVYEVEEPNEYYCYVSSGQQPSQPLGCRVAMP

其中： MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRS：訊息胜肽。 SEVEYIAEVGQNAYLPCSYTPAPPGNLVPVCWGKGACPVFDCSNVVLRTDNRDVNDRTSGRYWLKGDFHKGDVSLTIENVTLADSGVYCCRIQIPGIMDEKHNVKLVVIKPAKVTPAPTLQRDLTSAFPRMLTTGEHGPAETQTPGSLPDVNLTVSNFFCELQIFTLTNELRDSGATIRTA：ECD。 IYIAAGISAGLALALIFGALI：預測的TM區。 FKWYSHSKEKTQNLSLISLANIPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEEDVYEVEEPNEYYCYVSSGQQPSQPLGCRVAMP：胞內尾部。

表現 PD-1 和 TIM-3 的穩定細胞系的產生

pIRES-Neo3_[目標名]表現構築體(表1)用於產生穩定表現個別之蛋白質的CHO-S或Freestyle 293F選殖體。使用lipofectamine轉染，將構築體在CHO-S和Freestyle 293F細胞中瞬時轉染，並使用與各自的蛋白質反應的抗體，藉由FACS來篩選。確認表現後，將瞬時轉染的細胞以有限稀釋(limiting dilution)接種且培養於與所用的表現構築體相關的選擇壓力下，以獲得穩定的細胞選殖體。在2至3週的選擇之後，藉由FACS篩選選殖體。藉由連續繼代(serial passage)，使所選的選殖體擴張，在FACS中重新測試並冷凍至-150°C。穩定表現異源(heterologous)蛋白質的選殖體的名稱是CHO- S_[目標名]細胞或Freestyle 293F_[目標名]細胞。用於產生穩定細胞系的構築體及其所產生的名稱的概述，請參見表1。

實施例 2

免疫、選擇及篩選

用於免疫的小鼠

為了產生結合至huCD137和huTIM-3的人類抗體，將用於轉基因(transgenic)人類VK1-39輕鏈 (共同輕鏈小鼠，參見WO2009/157771)和人類重鏈(heavy chain，HC)微基因座(minilocus)(包含人類V基因片段、全部人類D和全部人類J的選擇)的小鼠免疫。這些小鼠被稱為「MeMo®」小鼠。用重組蛋白質抗原或編碼蛋白質的DNA，來免疫小鼠，如下文概述。

蛋白質免疫

藉由用重組蛋白質和Gerbu佐劑MM (Gerbu Biotechnik；目錄編號3001)的皮下注射，來將「MeMo®」小鼠免疫。重組huPD-1-Fc (R&D；目錄編號1086-PD)、huTIM-3-Fc (R&D；目錄編號2365-TM)和maTIM-3-Fc (R&D；目錄編號7914-TM)用於免疫。用在總體積為100 μl的混合40 μl佐劑的PBS中的40 μg的重組蛋白質，來免疫小鼠。隨後在第14天和第28天，以在總體積為50 μl的具有20 μl佐劑的PBS中的20 μg的重組蛋白質，來追加小鼠。在第35天收集小鼠血清，以確定血清力價(serum titer)。對人類和/或獼猴目標具有低血清反應性的小鼠接受用重組人類或獼猴蛋白質抗原的追加免疫和血清分析的額外循環。每個循環由兩次的每週使用在50 μl的PBS中的20 μg的重組蛋白質的免疫，接著一週後收集用於力價分析的血清所組成。顯示出對人類和獼猴目標高血清力價的小鼠接受由每日以在50 μl的PBS中的20 μg的重組蛋白質的注射所組成的最終追加免疫，連續三天。最後一次注射後一天，收集小鼠淋巴組織。

DNA 免疫

透過使用微色素沉澱(micropigmentation)裝置的DNA紋身(DNA tatooing)，來免疫「MeMo®」小鼠。用20 μg的編碼目標抗原的質體DNA (pVAX1_ [目標名]，表1)，來執行DNA紋身免疫。用編碼人類目標的DNA，來免疫小鼠。在第0、3、6、14、17、28和31天將小鼠免疫。在第35天收集小鼠血清，以確定血清力價。對人類和/或獼猴目標具有低血清反應性的小鼠接受用人類DNA抗原的追加免疫和血清分析的額外循環。每個循環由兩次的每週DNA免疫，接著一週後收集用於力價分析的血清所組成。顯示出對表現人類和獼猴目標的細胞有強血清反應性的小鼠接受最終追加免疫，接著3天後收集淋巴組織。

血清力價的確定

藉由使用表現人類和獼猴目標抗原的細胞系的FACS分析，來確定血清力價。

合成的噬菌體 Fab 庫的產生

基於在天然全集(repertoire)中被選擇為經常使用的生殖人類VH基因和規範(canonical)序列多樣性的全集，來構築合成庫。使用PCR，將合成的HCDR3區添加至這些VH基因。這是使用黏著(anneal)至VH基因的框架1，且包含用於選殖的SfiI限制位的順向引子來完成。反向引子包含黏著至VH基因的框架3的序列，接著是編碼HCDR3多樣性之隨機化序列與編碼亦含有用於選殖的BstEII和XhoI限制位的序列之框架4。基於在HCDR3內某些位置的胺基酸殘基的使用頻率，合成的CDR3區是完全隨機的或編碼較有限的多樣性。使用前述限制酶且亦含有編碼共同輕鏈的基因，將編碼VH基因的PCR產物選殖至噬菌體展示載體中，與噬菌體M13基因3蛋白質融合。大規模的連接和大腸桿菌TG1的轉形產生在噬菌體上展示的合成Fab片段的大庫，其用於淘選(panning)抗原或細胞，以鑑定抗原特異性Fab片段。

藉由 RT-PCR ，自經免疫的小鼠的組織產生「免疫」噬菌體 Fab 庫

自小鼠移除脾臟和引流淋巴結，對其觀察到對各自目標蛋白質的顯著體液反應。

自脾臟和腹股溝(inguinal)淋巴結產生單一細胞懸浮液，隨後將這些組織裂解於Trizol LS試劑(Thermo Scientific c＃10296028)中並儲存在-80°C直至使用。

從成功免疫的小鼠中，腹股溝淋巴結被用於「免疫」噬菌體抗體全集的構築。從淋巴組織的單一細胞懸浮液中萃取RNA。在使用IgG-CH1特異性引子的RT反應中，使用1 μg的總RNA。基本上如Marks等人所述(J Mol Biol.1991 Dec 5; 222 (3)：581-97)，接著使用內部(in-house)適應的VH特異性引子，將所得的cDNA用來放大編碼VH的cDNA的多株池(polyclonal pool)。然後將所得的PCR產物選殖到噬質體載體(phagemid vector)中(第6圖)，以在噬菌體上展示Fab片段，如de Haard等人(J Biol Chem.1999 Jun 25; 274 (26)：18218-30)所述，除了輕鏈(第1A和1B圖)對於每個抗體是相同的且由載體編碼。連接後，噬質體用於將大腸桿菌TG1細菌轉形，且將經轉形的細菌塗盤至含有安比西林(ampicillin)和葡萄糖的LB-瓊脂盤上。所有的噬菌體庫含有大於 4×10⁵ 個轉形體(transformant)，且具有大於90%的插入頻率。生長隔夜後，收穫細菌並根據已建立的規章(protocol)，用於製備噬菌體(de Haard et al., J Biol Chem.1999 Jun 25; 274 (26): 18218-30)。

使用重組蛋白質，自合成和「免疫」噬菌體 Fab 庫選擇攜帶特異性結合至人類目標蛋白質的 Fab 片段的噬菌體

使用在被直接塗佈的重組蛋白質上的噬菌體展示，使產生的噬菌體Fab庫用於選擇目標特異性Fab。對於PD-1，使用huPD-1-Fc (R&D；目錄編號1086-PD)和huPD-1生物素(BPS bioscience；目錄編號71109)。對於TIM-3，使用huTIM-3-His (CreativeBiomart；目錄編號HAVCR2-3166H)、huTIM-3-Fc (R&D；目錄編號2365-TM)和maTIM-3-Fc (R&D；7914-TM)。

對於以非生物素化的重組蛋白質的選擇(「淘選選擇」)，將蛋白質塗佈至MAXISORP^TM ELISA盤的孔上。用在PBS中的4%乾燥脫脂牛奶 (Marvel)，阻斷MAXISORP^TM ELISA盤。也用4%的Marvel，且當使用Fc標記的重組蛋白質時，在噬菌體庫被添加至經塗佈的抗原之前，也使用過量的人類IgG，以耗盡Fc區結合物(binder)，來阻斷噬菌體Fab庫。

在振盪條件下，噬菌體庫與經塗佈的蛋白質的培養於室溫執行1.5小時。然後用PBS中的0.05% Tween-20洗滌盤子或試管(tube)十五次，接著用PBS洗滌5次。使用胰蛋白質酶(trypsin)洗脫(elute)結合的噬菌體20分鐘，之後用AEBSF胰蛋白質酶抑制劑(Sigma)中和胰蛋白質酶。

對於用生物素化之蛋白質的選擇(「溶液內選擇(in-solution selections)」)，將中性親和素(neutravidin)塗佈在MAXISORP^TM ELISA盤的孔上。用在PBS中的1% 酪蛋白(casein)阻斷MAXISORP^TM ELISA盤。平行地，在含有過量人類IgG的PBS中的0.5% 酪蛋白中，在分開的Eppendorf管中，將生物素化之蛋白質和噬菌體Fab庫在阻斷30分鐘。在那之後，將經阻斷的噬菌體和生物素化之蛋白質混合，且在室溫下培養2小時。在那之後，將混合物加至經中性親和素塗佈的孔中20分鐘，以捕捉結合至生物素化之蛋白質的噬菌體Fab顆粒。然後，用在PBS中的0.05% Tween-20，來洗滌盤子十五次，接著用PBS洗滌5次。用胰蛋白質酶洗脫結合的噬菌體20分鐘，之後用AEBSF胰蛋白質酶抑制劑(Sigma)中和胰蛋白質酶。

將兩種選擇策略(「淘選和溶液內」)的洗脫液(eluate)加到大腸桿菌TG-1，且在37°C下培養，以用於噬菌體感染。隨後，將感染的細菌塗盤至含有安比西林(ampicillin)和葡萄糖的瓊脂盤上，且在37°C下培養隔夜。 根據目標，在ELISA或FACS中篩選來自選擇輸出的單一選殖體的目標結合。

對於用合成的噬菌體Fab庫的選擇，在挽救第一輪選擇輸出後，使用與所述第一輪選擇相同的規章，執行第二輪選擇。第一輪中所使用的三個用於TIM-3的選擇抗體亦都用於第二輪選擇。

使用穩定表現目標蛋白質的細胞，自「免疫」噬菌體 Fab 庫中，選擇攜帶特異性結合至人類目標的 Fab 片段的噬菌體

在表現各自目標的細胞上使用噬菌體展示，來選擇自經目標免疫的小鼠所產生的噬菌體Fab庫。表現PD-1或TIM-3(表1)的穩定細胞系用於第一輪選擇。用PBS中的10% FBS，來阻斷細胞。阻斷之後，將挽救的噬菌體與阻斷的細胞一起培養。細胞加上噬菌體在4°C培養1小時。使用1 ml的在PBS中的10% FBS，來執行洗滌細胞(5次)。用胰蛋白質酶洗脫結合的噬菌體20分鐘，之後用AEBSF胰蛋白質酶抑制劑(Sigma)，來中和胰蛋白質酶。將洗脫液加到大腸桿菌TG-1，且在37°C培養，以用於噬菌體感染。隨後，將感染噬菌體的細菌塗盤在含有安比西林和葡萄糖的瓊脂盤上，且在37°C培養隔夜。

在 ELISA 中篩選出目標特異性 Fab 選殖體

在單一選殖體中，製備可溶性Fab或噬菌體(J Mol Biol.1991 Dec 5; 222 (3)：581-97; J Biol Chem.1999 Jun 25; 274 (26)：18218-30)。於PBS (阻斷緩衝液)中的4%乾燥脫脂奶(Marvel)中稀釋獲得的可溶性Fab或噬菌體樣品(分別為1：5或1:10)，並在ELISA中測試與以用於選擇的相同抗原塗佈的孔的結合。

藉由用在阻斷緩衝液中以1：1000稀釋的抗myc抗體(Roche；目錄編號：11667203001)染色，接著用在阻斷緩衝液中以1:5000稀釋的HRP共軛的抗小鼠IgG抗體(Jackson Immunoresearch；目錄編號： 715-035-150)，來偵測結合的Fab。藉由用在阻斷緩衝液中以1：5000稀釋的HRP共軛的單株抗M13抗體(GE healthcare；目錄編號27-9421-01)染色，來偵測結合的噬菌體。

每次抗體染色後，用PBS-T (PBS-0.05% v/v Tween 20)來洗滌孔。透過TMB/H₂ O₂ 染色，來視覺化結合的二次抗體(secondary antibody)，並且透過OD_450nm 測量來定量染色。當OD_450nm 高於用負對照Fab獲得的背景訊號至少三倍時，認為選殖體結合目標。

對所有目標特異性選殖體之編碼VH的cDNA定序。然後，關於與在細胞上表現的PD-L1的結合，於FACS中分析基於序列相同度(sequence identity)和分子集團分析(cluster analysis)的獨特選殖體的選擇，如下文對從細胞選擇輸出獲得的選殖體的描述。

在 FACS 中篩選目標特異性 Fab 選殖體

在表現各自目標的細胞上所選擇的單一選殖體中，如(J Mol Biol.1991 Dec 5; 222 (3):581-97; J Biol Chem.1999 Jun 25; 274 (26):18218-30)所述，製備可溶性Fab或噬菌體。透過與1：5稀釋的Fab樣品和1：1000稀釋的抗myc抗體(Gentaur；目錄編號04-CMYC-9E10)的混合物一起培養於FACS緩衝液(PBS中的0.5% HI-FBS)中，測試Fab樣品在FACS中與表現人類和獼猴目標 (表1)的細胞的結合。透過與在FACS緩衝液中以1:500稀釋的APC共軛山羊抗小鼠IgG抗體(BD Bioscience；目錄編號550826)一起培養，來偵測結合的Fab/抗myc複合體。

透過在阻斷緩衝液中，以1:3稀釋噬菌體樣品並與目標表現細胞一起培養1小時，來測試噬菌體樣品在FACS中的結合。透過用生物素化之(biotinylated)抗M13抗體(Fitzgerald，目錄編號61R-M101ABTB62-FEZ，在FACS緩衝液中1：125，在冰上30分鐘)和PE標記的鏈黴親和素(streptavidin)(Invitrogen，目錄編號SA1004-4；在FACS緩衝液中1:400，冰上15分鐘)染色，來偵測結合的抗體。每次抗體培養之後，用FACS緩衝液洗滌孔三次。使用FACS Accuri C6儀器(Becton和Dickinson)，來分析經染色的細胞。當平均螢光強度高於用負對照Fab獲得的背景訊號至少三倍時，選殖體被認為是陽性。

實施例 3

對以 IgG 形式的 huTIM-3 及 huPD-1 特異性 Fab 選殖體定性

將人類 TIM-3 及 PD-1 特異性 Fab 再選殖 (recloning) 至 IgG 形式

根據標準化的分子生物學技術，使用Sfi1-BstEII消化和經消化的cDNA池的連接，將基於CDR3序列和VH生殖的差異的獨特選殖體的選擇，其結合在細胞上表現的人類和獼猴目標蛋白質，再選殖到IgG表現質體，例如MV1452 (第7圖)，其含有共同輕鏈(第1圖)。

含有人類 TIM-3 或人類 PD-1 特異性 Fab 和破傷風毒素特異性 Fab 的雙特異性 IgG 的表現

藉由瞬時共轉染兩個編碼具有不同VH域的IgG的質體，來產生雙特異性抗體，使用專有的(proprietary)CH3工程化技術，以確保有效率的雙特異性抗體的異質二聚體化和形成。存在於含有重鏈的兩個質體上的共同輕鏈也在相同的細胞中共轉染。在我們的共同未決的申請中(例如，WO2013/157954和WO2013/157953；透過引用併入本文)，我們已經揭露從單一細胞產生雙特異性抗體的方法和手段，由此提供有利於雙特異性抗體的形成而不是單特異性抗體的形成的手段。這些方法也可有利地用於本發明中。具體而言，產生基本上僅雙特異性全長IgG分子的較佳突變是在第351和366位的胺基酸取代，例如在第一CH3域中的L351K和T366K (根據EU編號編號)(「KK變異體」重鏈)和在第351和368位的胺基酸取代，例如在第二CH3域中的L351D和L368E(「DE變異體」重鏈)，或反之亦然(第2圖)。先前在我們的共同未決的申請中，顯示帶負電荷的DE變異體重鏈和帶正電荷的KK變異體重鏈優先配對，以形成異質二聚體(所謂的「DEKK」雙特異性分子)。由於相同重鏈之間CH3-CH3界面中帶電殘基之間的強烈斥力，幾乎不會發生DE變異體重鏈(DE-DE同質二聚體)或KK變異體重鏈(KK-KK同質二聚體)的同質二聚體化。

將編碼上述結合人類TIM-3和PD-1的抗體的VH基因選殖至編碼帶正電的CH3域的MV1452 IgG表現載體中。將以破傷風毒素(tetanus toxin，TT)為目標的抗體(第8圖)選殖至編碼帶負電的CH3域的MV1377 IgG表現載體(第9圖)中。為了以IgG形式表現TIM-3和PD-1抗體組，整組也被選殖到帶負電荷的CH3域載體中，以能夠產生二價TIM-3或PD-1 IgG。在振盪器平台上，懸浮生長適應的293F Freestyle細胞培養於T125燒瓶中，直至密度為3.0x10⁶ 個細胞/ml。在24深孔盤的每個孔中，以0.3至0.5x10⁶ 個活細胞/ml的密度接種細胞。用兩個編碼不同抗體的質體的混合物，瞬時轉染細胞，選殖到專有載體系統中。轉染後7天，收穫細胞上清液並通過0.22 μM過濾器(Sartorius)來過濾。將無菌上清液儲存在4°C直至抗體的純化。

雙特異性 IgG 的純化

使用蛋白質A親和層析，以小規模(＜500 μg)執行IgG的純化。使用過濾，在24孔過濾盤中，在無菌條件下執行小規模純化。首先，將培養基的pH調整至pH 8.0，隨後將含有IgG的上清液與蛋白質A Sepharose CL-4B珠(50% v/v)(Pierce)一起在25°C、振盪平台上以600 rpm，培養2小時。接下來，透過過濾，來收穫珠子。用pH 7.4的PBS洗滌珠子兩次。然後用0.1M檸檬酸鹽緩衝液在pH3.0洗脫結合的IgG，且立刻使用pH 8.0的Tris，來中和洗脫液。使用多屏Ultracel 10多盤(multiscreen Ultracel 10 multiplate)(Millipore)，藉由離心，來執行緩衝液交換。最後，在pH7.4的PBS中收穫樣品。使用Octet測量IgG濃度。蛋白質樣品儲存於4°C。

使用 Octet 執行 IgG 定量

為了確定純化的IgG的量，使用總人類IgG (Sigma Aldrich，目錄編號No. I4506)作為標準，使用蛋白質A生物傳感器(Forte-Bio，根據供應商建議)，藉由Octet分析，來確定抗體濃度。

huTIM-3 和 huPD-1 IgG 的特異性分析

測試抗體(雙特異性 TIM-3xTT和PD-1xTT抗體)在FACS中，與表現相關的人類和獼猴同源基因(表1)的穩定細胞系及野生型(wt)細胞的結合。因此，收穫細胞並在FACS緩衝液(PBS/0.5% BSA/0.5 mM EDTA)中稀釋至10⁶ 個細胞/ml。將1至2x10⁵ 個細胞加到U底96孔盤中的每個孔。在4°C以300 g，將細胞離心2分鐘。透過將盤子倒置，來丟棄上清液。將50 μl之濃度為10 μg/ml的每個IgG樣品加入，且在冰上培養1小時。將細胞離心一次，移除上清液且用150 μl的FACS緩衝液洗滌細胞兩次。將50 μl的1：400稀釋的山羊抗人類IgG PE (Invitrogen) 加入，且在黑暗中，於冰上培養30分鐘。加入FACS緩衝液後，將細胞離心一次，移除上清液且用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。在HTS設置中，在FACSCanto流式細胞儀(Becton和Dickinson)上分析細胞。藉由測量染色的細胞族群的平均螢光強度(mean fluorescence intensity，MFI)，來評估抗體與細胞的結合。當MFI至少是用(負對照)非結合抗體(針對破傷風類毒素(tetanus toxoid))染色的相同細胞族群的5倍時，抗體被認為結合它們的目標。

以配位體阻斷能力，將存在於 PD-1xTT 雙特異性 IgG 中的 huPD-1 特異性 Fab 臂分類

測試huPD-1結合選殖體的阻斷PD-L1與PD-1的交互作用的能力。因此，以1 μg/ml，將PD1-Fc (R＆D系統；目錄編號1086-PD)塗佈至maxisorp盤。用在PBS中的4% BSA，來阻斷經塗佈的孔。在那之後，在0.15至20 μg/ml的範圍的IgG存在或不存在的情況下，將0.55 μg/ml的生物素化之PD-L1 (BPS bioscience；目錄編號71105)加入。用在阻斷緩衝液中以1:2000稀釋的HRP共軛的鏈黴親和素(BD bioscience；目錄編號554066)，來偵測結合的生物素化之PD-L1。在每次培養步驟之後，用PBS-T (PBS-0.05% v/v Tween 20)洗滌ELISA盤三次。藉由TMB/H₂ O₂ 染色，使結合的鏈黴親和素可視化，且藉由OD_450nm 的測量，來定量染色。相較於將TT特異性競爭抗體加入的對照，當在IgG (PD-1xTT)濃度為10 µg/ml時，ELISA訊號降低超過70%時，選殖體被認為阻斷PD-1與PD-L1的交互作用。參見第10圖的以PD-1xTT雙特異性分子測試的PD-1抗體組的代表性選擇所獲得之結果。

以阻斷 GAL9 和 TIM-3 的交互作用的能力，將存在於 TIM-3xPD-1 IgG 中的 huTIM-3 特異性 Fab 臂分類

用PBS中之5 µg/ml的重組人類半乳糖凝集素-9 (R＆D；目錄編號2045-GA)，來塗佈Maxisorp 96孔盤的孔，且在4°C培養隔夜。用PBS洗滌孔三次，隨後在室溫下，用PBS中的3% BSA(阻斷緩衝液)阻斷1小時。在那之後，在25 µg/ml IgG存在或不存在的情況下，在室溫下，將孔與在阻斷緩衝液中稀釋的0.1875 µg/ml的huTIM-3Fc (R＆D；目錄編號2365-TM)一起培養1小時。用PBST( 在PBS中的0.05% v/v Tween20)洗滌孔三次，且與阻斷緩衝液中以1：2000稀釋的經生物素共軛的抗人類Fc抗體(Invitrogen；目錄編號AHI1309)一起培養1小時。接下來，重複洗滌步驟，且在室溫下，將孔與在阻斷緩衝液中以1：2000稀釋的HRP-共軛的鏈黴親和素(Becton Dickinson；目錄編號554066)一起培養15分鐘。為了偵測結合的鏈黴親和素，用PBST洗滌孔三次，且與TMB基質成分A和B(1：1比例)(Becton Dickinson；目錄編號分別為51-2606KC和51-2607KC)一起培養。10分鐘後，用1M H₂ SO₄ 來中止反應，且使用ELISA盤讀數器，來測量OD450。低於95%的對照的ELISA訊號被認為代表阻斷活性(表2)。

存在於 TIM-3xTT 和 PD-1xTT 雙特異性 IgG 中的 huTIM-3 和 huPD-1 特異性 Fab 臂的親和力排名

在FACS中顯示結合各自的人類和獼猴同源基因的雙特異性抗體，在FACS中排名在兩者同源基因的明顯親和力上。因此，收穫表現各自同源基因(表1)的穩定細胞系，並在FACS緩衝液(PBS/0.5% BSA/0.5 mM EDTA)中稀釋至10⁶ 個細胞/ml。在4°C，以300g將細胞離心2分鐘。藉由將盤子倒置，來丟棄上清液。將50 μl的每個IgG樣品，其為10至0.01 μg/ml的範圍的一11步驟2倍稀釋序列，加入並在冰上培養1小時。將細胞離心一次，移除上清液並用150 μl的FACS緩衝液洗滌細胞兩次。將50μl的1：400稀釋的山羊抗人類IgG PE (Invitrogen)加入，且在黑暗中在冰上培養30分鐘。將FACS緩衝液加入後，將細胞離心一次，移除上清液並用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。在HTS設置中，在FACSCanto流式細胞儀(Becton和Dickinson)上分析細胞。藉由測量染色的細胞族群的平均螢光強度(MFI)，來評估抗體與細胞的結合。當MFI是用(負對照)非結合抗體(針對破傷風類毒素)染色的相同細胞族群的至少5倍時，抗體被認為結合它們的目標。

參考抗體

抑制PD-1的功能的抗體是本領域已知的。根據公開的資訊，構築單株二價抗體且在CHO-S細胞中表現。抗PD-1抗體Nivolumab是基於CA 02607147中所揭露的資訊而產生。

PD-1/PD-L1 阻斷報導者測定 (blockade reporter assay)

所使用的PD-1/PD-L1阻斷報導者測定是由Promega開發，且基於雙細胞系統；表現PD-L1的CHO細胞和過度表現PD-1的T細胞活化子及Jurkat/NFAT-RE報導者細胞系。使用Promega的解凍和使用形式，來執行PD-1/PD-L1阻斷報導者測定。在14.5 ml的細胞恢復培養基(Cell Recovery Medium)(含有10% FBS的DMEM/F12)中解凍表現PD-L1的細胞(目錄編號C187103)。接著，將50 μl的細胞懸浮液加到96孔半區域盤(Corning，目錄編號3688)的內孔。將盤子在37°C、5% CO、95%相對濕度下，培養隔夜。隔天，移除培養基並將以序列稀釋(起始濃度10 μg/ml)的20 μl之在測定培養基(含有4% FBS的RPMI 1640)中的測試抗體加至每個孔。每盤含有作為參考對照之序列稀釋的陰性(Ctrl Ab)和陽性對照抗體(Nivolumab)。在5.9 ml的測定培養基中解凍PD-1效應細胞(目錄編號C187105)，且將20 μl的細胞懸浮液加至每個孔。將盤子在37°C、5% CO、95%相對濕度下培養6小時或隔夜。隔天，加入40 μl的螢光素酶(Bio-Glo螢光素酶測定系統，目錄編號G794L)，並使用BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate 讀取儀，測量螢光素酶活性的量。與負對照抗體相比，測量效力(potency)作為螢光素酶活性。

PD-1 抗體組的篩選

與Nivolumab相比，來自PD-1抗體組的VH以24孔格式產生，且在PD-1/PD-L1阻斷報導者分析中，作為二價抗體以半對數序列滴定(semi log serial titration)(起始濃度10 μg/ml)來測試，以阻斷效力對抗體排名。基於活性數據，從PD-1抗體組中選擇抗體，用於後續的PD1xLAG-3雙特異性篩選。所選的候選物(candidate)在報導者測定中的活性顯示在表3中。PD-1 Fab組由兩個抗體簇(antibody cluster)內，即A和B，的功能活性變異體構成。

將阻斷半乳糖凝集素-9之Fab臂與PD-1 Fab臂組合，且測試其恢復耗盡的抗原特異性T細胞功能的能力。

實施例 4

在混合的淋巴細胞反應中，雙特異性 PD-1 x TIM-3 抗體增強藉由 CD14+ T 細胞的 IFNγ 的產生。

混合的淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)測定通常用於理解抗體對T細胞活化和增殖的影響。此類測定有助於理解這樣的化合物是否會影響T細胞在腫瘤微環境中產生反應的可能。在這裡，我們使用具有未成熟DC的同種異體(allogeneic) MLR規章，來確定雙特異性PD-1 x TIM-3抗體之增強藉由CD14+ T細胞來產生IFNγ的能力，與基準參考抗體的能力相比。藉由測量培養基上清液中的IFNγ的程度，來量化T細胞的反應性。

為此，從膚色血球層(buffy coat)製備來自健康捐贈者的人類周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。藉由使用磁性經活化的細胞分選(magnetic activated cell sorting，MACS)，來分離CD14+細胞(EasySep Stemcell，批號16C69672)且在分化培養基中培養這些細胞7天，來製備未成熟的單核細胞衍生的樹突細胞(monocyte-derived dendritic cell，Mo-DC)。在所需的那天，從冷凍保存的PBMC製備衍生自與用於Mo-DC的捐贈者不同的捐贈者的反應者T細胞(responder T cell)，使用T細胞分離套組(EasySep Stemcell，批號16D70573)，以獲得未經接觸的T細胞。執行六個分開的MLR，以提供生物性重複。

對此測定而言，在10 µg/mL的終濃度的測試抗體存在或不存在下，將1x10⁴ 個未成熟的Mo-DC與1x10⁵ 個CD4+ T細胞共培養4天。以三重複執行培養。在培養期結束時收集上清液，且根據製造商的說明書，藉由ELISA (R＆D BioTechne，批號342687)，在450 nm讀盤來評估IFNγ。

結果

MLR研究包含Tim3/PD1雙特異性(PB16465)和MF6930 (PD1))的實驗組和3個同型對照組(針對TIM-3替代抗體的單特異性抗體、破傷風和mIgG1)。亦包含單一細胞對照和載體對照組。

執行三重複的培養，以提供技術性重複。在4天的培養期結束時，收集上清液，且根據製造商的說明書，在450 nm讀盤，執行ELISA，來評估抗體對IFN-γ的影響。

在第0天，將CD14+細胞分選並培養7天，在第7天使用未成熟的DC，且藉由在成熟培養基中額外培養3天獲得成熟DC。在第0天評估CD14陽性，以確認初始分選的純度，且分別在第7天和第10天的未成熟和成熟的DC中評估CD14陽性，以確認CD14的下調，表示向Mo-DC的分化(未顯示數據)。亦在未成熟和成熟的DC上，評估存活率和活化標記物(CD80、CD83和CD86)，以確認分化和成熟。在收集上清液之前，將Mo-DC (未成熟或成熟)與反應者T細胞一起培養4天，且執行ELISA，以評估測試抗體對IFN-γ產生的影響。在成熟MLR (mMLR)中，捐贈者差異使得每個捐贈者的數據以載體對照標準化(原始數據和標準化)。

在第11圖中顯示測試結果。在MLR中，對PD-1/TIM-3有特異性的雙特異性抗體之藉由CD14+ T細胞的IFN-γ的產生表現顯著優於對照和Tim3替代單特異性抗體的IFN-γ的產生。

表 1 ： 用於DNA免疫之每個目標的表現構築體(基於pVAX1載體)和用於產生穩定的Freestyle 293F或CHO-S細胞系的表現構築體(基於pIRES-neo3載體或類似) hu = 人類，ma = 獼猴(macaque)，ra = 大鼠，NA = 不適用

表 2 與陰性對照抗體(Ctrl mAb)相比，藉由ELISA確定的TIM-3xPD-1雙特異性抗體的半乳糖凝集素-9阻斷活性。指出PB和Fab臂的組成。

表 3

與陽性對照Nivolumab相比，如在PD-1/PD-L1阻斷報導者測定中，作為二價抗體測量PD-1 Fab臂的功能活性。測試了展示不同PD-1阻斷活性的相同簇(B)的變異體。

第 1 圖 顯示出於單和雙特異性IgG中使用的共同輕鏈(common light chain)。第1A圖顯示共同輕鏈的胺基酸序列。第1B圖顯示共同輕鏈可變域(domain)的DNA序列和轉譯(IGKV1-39/jk1)。第1C圖顯示共同輕鏈恆定區的DNA序列和轉譯。第1D圖顯示IGKV1-39/jk5共同輕鏈可變域的轉譯。第1E圖顯示V區IGKV1-39A。第 2 圖 顯示出用於產生雙特異性分子的IgG重鏈。 第2A圖顯示VH基因。第2B圖顯示CH1區。第2C圖顯示鉸鏈區。第2D圖顯示CH2區。第2E圖顯示含有L235G和G236R沉默取代的CH2區。第2F圖顯示含有L351K和T366K (KK)取代的CH3域。第2G圖顯示含有L351D和L368E (DE)取代的CH3域。第 3 圖 顯示出重鏈可變區的胺基酸序列： 第3A圖顯示PD-1特異性選殖體的重鏈可變區， 第3B圖顯示TIM-3特異性選殖體的重鏈可變區。 符號MF指的是含有所示的重鏈可變區和共同輕鏈的fab。於第1A圖中指出輕鏈的胺基酸序列。劃底線的序列分別表示CDR1、CDR2和CDR3區的每個胺基酸序列。第 4 圖 顯示出pIRES-Neo3 (MV1363)的載體圖和特徵。第 5 圖 顯示出pVAX1的載體圖和特徵。第 6 圖 顯示出用來產生「免疫」噬菌體展示庫(phage display library)之噬菌質體載體(phagemid vector)MV1473的載體圖及特徵。第 7 圖 顯示出IgG表現載體MV1452的載體圖與特徵，IgG表現載體MV1452用於在KK變異體重鏈中表現PD-1和PD-L1特異性Fab臂，以產生雙特異性IgG。第 8 圖 顯示出，當VH基因與共同輕鏈組合成為MF1337時，是對破傷風毒素(tetanus toxin)有特異性，且存在於用於產生PD-L1xTT和PD-1xTT雙特異性IgG分子的DE變異體重鏈中的VH基因的胺基酸序列。劃底線的序列分別指出CDR1、CDR2及CDR3區的每個胺基酸序列。第 9 圖 顯示出IgG表現載體MV1377的載體圖及特徵，IgG表現載體MV1377用於在DE變異體重鏈中表現TT特異性Fab臂MF1337，以產生雙特異性IgG。第 10 圖 顯示出PD-1/PD-L1阻斷測定(blocking assay)。 在雙特異性IgG的濃度為10 µg/ml時，評估抗PD-L1抗體組(panel)阻斷PD-L1與經塗佈的PD-1的交互作用的能力。以取自二價基準(benchmark)PD-L1抗體MPDL3280A在濃度為10 µg/ml (100%阻斷)時的數據，將數據標準化。代表性範例顯示於PD-L1組中。藉由與非PD-1/PD-L1特異性人類同型(isotype)抗體一起培養，來建立最大結合(標準化至0%阻斷)。於第3圖所示但未在此表現之包含MF序列的所有PD-L1可變域阻斷PD-1/PD-L1的交互作用大於70%。第 11 圖 顯示出測試抗體對同種異體(allogeneic) mMLR中的IFN-γ的產生的影響。 從培養7天的CD14+單核細胞製備Mo-DC。在第7天使用未成熟的DC，且在與由陰性選擇分離的T細胞和測試抗體一起培養4天(mMLR)之前，藉由在成熟培養基中再培養3天，產生成熟DC。藉由ELISA，來測量培養物上清液中的IFN-γ。以載體對照將數據標準化。進行六個分開的MLR。

Claims (25)

1. 一種在計劃性細胞死亡1蛋白質(Programmed Cell Death 1 protein，PD-1)和/或T細胞免疫球蛋白質及含有黏蛋白質域-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3，TIM-3)陽性細胞中，干擾PD-1和TIM-3所介導的抑制的方法，包括使所述細胞與一抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物接觸，其中所述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包括 -可結合至PD-1的一胞外部分的一可變域以及 -可結合至TIM-3的一胞外部分的一可變域，藉此抑制所述細胞中由PD-1和/或TIM-3所介導的活性。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述PD-1結合可變域與PD-1的結合阻斷PD-1與PD-L1和/或PD-L2的結合。
3. 一種刺激免疫突觸的形成、穩定性和/或活性的方法，包括提供包含至少兩種能夠透過免疫突觸彼此結合的細胞的一系統，且對所述系統提供一抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中所述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包括 -可結合至PD-1的一胞外部分的一可變域以及 -可結合至TIM-3的一胞外部分的一可變域， 藉此刺激免疫突觸在所述至少兩種細胞之間的形成、穩定性和/或活性。
4. 一種抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的一胞外部分的一可變域以及可結合至TIM-3的一胞外部分的一可變域。
5. 如申請專利範圍第4項所述之抗體或其變異體，其中結合PD-1的所述可變域阻斷PD-1與PD-L1和/或PD-L2的結合。
6. 如申請專利範圍第4或5項所述之抗體，其中結合TIM-3的所述可變域阻斷TIM-3與半乳糖凝集素-9的結合。
7. 如申請專利範圍第4至6項中任一項所述之抗體或其變異體，其中結合PD-1的一胞外部分的所述可變域被定義為，與在Jurkat細胞上用抗體Nivolumab所獲得的抑制相比，當為包括兩個結合PD-1的所述可變結構域的二價單特異性抗體形式時，於Jurkat細胞中以20至150%的範圍來抑制PD-1/PD-L1的抑制的可變域。
8. 如申請專利範圍第4至7項中任一項所述之抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的一胞外部分且包括具有CDR3區的一重鏈可變區的一可變域，所述重鏈可變區包括第3圖中的MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；或MF6982；較佳地MF6226；MF6256；或MF6930所示的VH之一的可變重鏈區的CDR3的胺基酸序列。
9. 如申請專利範圍第8項所述之抗體或其變異體，其中結合PD-1的所述可變域包括一重鏈可變區包括具有CDR1、CDR2和CDR3區的一重鏈可變區，所述重鏈可變區包括第3圖中的MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；或MF6982；較佳地MF6226；MF6256；或MF6930所描述的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。
10. 如申請專利範圍第4至7項中任一項所述之抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的一胞外部分且包括一重鏈可變區的一可變域，所述重鏈可變區包括(如第3圖中所示的)MF6076；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；或MF6982；較佳地MF6226；MF6256；或MF6930所描述的可變重鏈區的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。
11. 如申請專利範圍第4至10項中任一項所述之抗體或其變異體，包括可結合至TIM-3的一胞外部分且包括具有CDR3區的一重鏈可變區的一可變域，所述重鏈可變區包括第3圖的MF7676；MF7677；MF7678；或MF7679所描述的可變重鏈區的CDR3區的胺基酸序列。
12. 如申請專利範圍第11項所述之抗體或其變異體，包括可結合至TIM-3的一胞外部分且包括具有CDR1、CDR2和CDR3區的一重鏈可變區的一可變域，所述重鏈可變區包含第3圖的MF7676；MF7677；MF7678；或MF7679所描述的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。
13. 如申請專利範圍第4至10項中任一項所述之抗體或其變異體，包括可結合至TIM-3的一胞外部分且包括一重鏈可變區的一可變域，所述重鏈可變區包含如(第3圖的)MF7676；MF7677；MF7678；或MF7679所示的可變重鏈區的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。
14. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其中所述抗體或其變異體是如申請專利範圍第4至13項中任一項所述之抗體。
15. 如申請專利範圍第4至10項中任一項所述之抗體或其變異體，包括一輕鏈可變區，具有如第1B圖所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3序列，或與第1B圖中所示的輕鏈可變區CDR1和CDR2和CDR3序列的差異不超過三個、較佳不超過二個、更佳不超過一個胺基酸的CDR1、CDR2和CDR3序列。
16. 如申請專利範圍第4至10項中任一項或第15項所述之抗體或其變異體，包括一輕鏈可變區，具有與第1B圖中所示的胺基酸序列至少80%相同的一序列。
17. 一種抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的一胞外部分且包括一重鏈可變區的一可變域，所述重鏈可變區包含第3圖中的MF6076；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；或MF6982；較佳地MF6226；MF6256；或MF6930 (如第3圖中所示)所描述的可變重鏈區的胺基酸序列其中相對於所示的MF的VH胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。
18. 一種抗體或其變異體，包括可結合至TIM-3的一胞外部分且包括一重鏈可變區的一可變域，所述重鏈可變區包括如(第3圖的)MF7676； MF7677；MF7678；或MF7679所示的可變重鏈區的胺基酸序列其中相對於所示的MF的VH胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。
19. 一種如申請專利範圍第4至10項或第15至18項中任一項所述之抗體作為藥物的用途。
20. 一種如申請專利範圍第4至10項或第15至18項中任一項所述之抗體於癌症或致病菌，較佳為病毒或寄生蟲感染的治療方法中的用途。
21. 一種組合物或部分套組，包括至少一個如申請專利範圍第4至10項或第15至18項中任一項所述之抗體或其變異體。
22. 一種醫藥組合物，包括至少一個如申請專利範圍第4至10項或第15至18項中任一項所述之抗體或其變異體以及一醫藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
23. 一種具有長度至少15個核苷酸的核酸分子，編碼如申請專利範圍第4至10項或第15至18項中任一項所述之抗體或其變異體的至少一個CDR區。
24. 如申請專利範圍第23項所述之核酸分子，編碼如申請專利範圍第4至10項或第15至18項中任一項所述之抗體或其變異體的至少一個重鏈可變區。
25. 如申請專利範圍第23或24項所述之核酸分子，編碼如第3圖中所描述的一重鏈可變區。